transformation des obligat biotrophen rostpilzes uromyces

Transformation des obligat biotrophen Rostpilzes

Uromyces fabae

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

Vorgelegt von

Alma Djulić

an der Universität Konstanz

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion

Fachbereich Biologie

Tag der mündlichen Prüfung: 14. Dezember 2012

1. Referent: Prof. Dr. Ralf Vögele

2. Referent: Prof. Dr. Kurt Mendgen

http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-0-265491

„Die Erfahrung hat mich gelehrt, dass das, was man sich

selbst nicht erklären kann, anderen gesagt werden muss.

Ein Selbst kann getäuscht werden, durch Teile der Bilder

die sich aufdrängen, schwer aussprechbarem Gefühl weil

es sich vor der Qual der Erkenntnis versteckt und flüchtet

in den Nebel, in den Rausch der keinen Sinn sucht. Ein

anderer verlangt nach genauem Wort, deshalb suchst du

es, fühlst es irgendwo in dir und jagst es, das Wort oder

sein Schatten, erkennst es am Gesicht des anderen, im

Blick des anderen, wenn er beginnt zu begreifen. Zuhörer

ist die Hebamme bei schwieriger Geburt des Wortes.

Oder noch Wichtigeres. Sollte der andere begreifen

wollen.“

(Bosnischer Schriftsteller) Mesa Selimovic – Die Festung

"Iskustvo me naučilo da ono što se ne može objasniti

samome sebi, treba govoriti drugome. Sebe možeš

obmanuti nekim dijelom slike koji se nametne, teško

izrečivim osjećanjem, jer se skriva pred mukom

saznavanja i bježi u omaglicu, u opijenost koja ne traži

smisao. Drugome je neophodna tačna riječ, zato je i

tražiš, osječas da je negdje u tebi, i loviš je, nju ili njenu

sjenku, prepoznaješ je na tuđem licu, u tuđem pogledu,

kad počne da shvata. Slušalac je babica u teškom

porođaju riječi. Ili nešto još važnije. Ako taj drugi želi da

razumije."

Meša Selimović - Tvrdjava

Folgende Publikation ist aus dieser Arbeit hervorgegangen:

Djulic A., Schmid A., Lenz H., Sharma P., Koch C., Wirsel S. G., Voegele R. T. (2011).

Transient transformation of the obligate biotrophic rust fungus Uromyces fabae

using biolistics. Fungal Biol. 117: 633-642.

VERZEICHNISSE INHALT I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ....................................................................................................................... 1

1.1 Rostpilze ...................................................................................................... 1

1.2 Uromyces fabae ........................................................................................... 2

1.2.1 Sporenarten und Verbreitung ....................................................................... 2

1.2.2 Interaktion mit der Wirtspflanze .................................................................. 3

1.2.3 Bekämpfungsmethoden in der Praxis ........................................................... 6

1.3 Genetische Modifikation obligat biotropher Pilze ......................................... 6

1.3.1 Transformationsmethoden .......................................................................... 7

1.3.1.1 Biolistik ....................................................................................................... 7

1.3.1.2 Agrobacterium vermittelte Transformation .................................................. 9

1.3.1.2.1 Agrobacterium tumefaciens als Pathogen ..................................................... 9

1.3.1.2.2 Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pilzen ........................................ 10

1.4 Zielsetzung ................................................................................................ 11

2. Material und Methoden ............................................................................................... 12

2.1 Chemikalien ............................................................................................... 12

2.2 Verwendete Organismen ........................................................................... 12

2.2.1 Bakterienstämme ...................................................................................... 12

2.2.1.1 Escherichia coli .......................................................................................... 12

2.2.1.2 Agrobacterium tumefaciens ....................................................................... 13

2.2.2 Verwendete Kulturmedien ......................................................................... 13

2.2.2.1 Für E. coli ................................................................................................... 13

2.2.2.2 Für A. tumefaciens ..................................................................................... 13

2.2.3 Pilz- und Pflanzenmaterial .......................................................................... 14

2.2.3.1 Pilzmaterial ............................................................................................... 14

2.2.3.2 Keimung von U. fabae Uredosporen auf künstlichen Oberflächen ............... 14

2.2.3.3 Bestimmung der Uredosporen-Anzahl ........................................................ 15

2.2.3.4 Pflanzenmaterial ........................................................................................ 15

2.2.3.5 Kultivierung und Inokulation von V. faba .................................................... 15

2.3 Verwendete Plasmide ................................................................................ 16

2.3.1 Konstruktion der Plasmide für Biolistik ....................................................... 17

2.3.2 Plasmide für die Agrobacterium-vermittelte Transformation ...................... 18

2.4 Transformationsmethoden ........................................................................ 18

2.4.1 Biolistik ..................................................................................................... 18

2.4.2 Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT) .................................... 19

2.4.3 Ausbringung von Sporen in planta und Selektionsschema ........................... 20

2.5 Molekularbiologische Methoden ................................................................ 21

2.5.1 DNA-Präparation ....................................................................................... 21

2.5.1.1 Aus Pflanzenmaterial ................................................................................. 21

VERZEICHNISSE INHALT II

2.5.1.2 Aus ungekeimten Sporen ........................................................................... 21

2.5.1.3 Aus gekeimten Sporen ............................................................................... 21

2.5.1.4 Amplifikation genomischer DNA mit REPLIg ................................................ 22

2.5.1.5 Plasmidpräparation aus E. coli .................................................................... 22

2.5.1.6 DNA-Konzentrationsmessungen ................................................................. 22

2.5.2 PCR-Methoden .......................................................................................... 22

2.5.2.1 Oligonukleotide ......................................................................................... 23

2.5.2.2 Standard und Nested-PCR .......................................................................... 24

2.5.2.3 Nested-PCR ................................................................................................ 25

2.5.2.4 Kolonie-PCR ............................................................................................... 25

2.5.2.5 SNP-PCR .................................................................................................... 25

2.5.2.6 Reinigung von PCR Produkten und DNA aus Restriktionsansätzen ............... 26

2.5.2.7 Sequenzierung von PCR Produkten ............................................................. 26

2.5.3 Agarosegel-Elektrophorese ........................................................................ 26

2.5.4 Klonierung von DNA ................................................................................... 27

2.5.4.1 DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen........................................................ 27

2.5.4.2 Ligation verdauter DNA .............................................................................. 28

2.5.5 Kompetente Zellen und Transformation ..................................................... 28

2.5.5.1 E. coli SEM-kompetente Zellen ................................................................... 28

2.5.5.2 Hitzeschocktransformation ........................................................................ 29

2.5.5.3 Agrobacterium tumefaciens elektrokompetente Zellen ............................... 29

2.5.5.4 Transformation durch Elektroporation ....................................................... 29

2.5.6 Southern Blot ............................................................................................ 30

2.5.6.1 Herstellung von DIG-markierten Sonden ..................................................... 30

2.5.6.2 32P-markierte Sonden ................................................................................. 30

2.5.6.3 Vorbereitung und DNA-Transfer ................................................................. 31

2.5.6.4 Hybridisierung und DNA Detektion ............................................................. 31

2.6 Mikroskopische Methoden ......................................................................... 32

2.6.1 Durchlichtmikroskopie ............................................................................... 32

2.6.2 Fluoreszenzmikroskopie ............................................................................. 33

2.7 Verwendete Software ................................................................................ 33

3. Ergebnisse .................................................................................................................... 34

3.1 Auswahl der Methoden für die Transformation von Uromyces fabae .......... 34

3.2. Plasmidkonstrukte für die Transformation .................................................. 34

3.3 Biolistische Transformation von U. fabae ................................................... 36

3.4 Detektion der Transformationsereignisse in vitro ....................................... 36

3.4.1 Farbmarker Selektion ................................................................................. 37

3.4.1.1 GUS-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae .................. 37

3.4.1.2 GFP-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae .................. 38

VERZEICHNISSE INHALT III

3.4.1.3 DsRed-Farbmarker für die biolistische Transformation von U. fabae ........... 39

3.4.1.4 Fungizidmarker für die biolistische Transformation von U. fabae ................ 41

3.4.1.5 Kombination der Farb- und Fungizidmarker bei Biolistischer Transformation von U. fabae .............................................................................................. 43

3.5 Etablierung der Selektion in planta ............................................................. 44

3.5.1 Fungizidmarker .......................................................................................... 45

3.5.1.1 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin ................................ 45

3.5.1.2 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps mit Benomyl .................................... 46

3.5.1.3 Selektionsschema in planta ........................................................................ 47

3.6 U. fabae Transformanten-Linien, Selektion und molekulare Analyse ........... 48

3.6.1 Selektion mit Benomyl ............................................................................... 49

3.6.2 Selektion mit Carboxin ............................................................................... 50

3.6.2.1 Biolistische Transformation mit den Plasmidkonstrukten pRV111 und pRV113 ................................................................................................................. 50

3.6.2.2 Biolistische Transformation mit dem Plasmidkonstrukt pRV111::DsRed ...... 52

3.6.2.3 Biolistische Transformation mit Kassette aus pRV111 und pRV113 .............. 54

3.7 Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation von U. fabae ........ 60

3.7.1 Einfluss verschiedener Parameter auf die Transformationseffizienz............. 61

3.7.1.1 Induktion mit Acetosyringon ...................................................................... 61

3.7.1.2 Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen .................................................... 63

3.7.1.3 Weitere Faktoren für die ATMT .................................................................. 64

3.7.1.4 Einfluss der Agrobakterien-Stämme ........................................................... 65

3.7.2 ATMT Transformantenlinien in vitro ........................................................... 65

3.7.3 Selektion der ATMT-Transformanten mit Fungiziden in planta .................... 67

3.7.3.1 Selektion mit Benomyl ............................................................................... 67

3.7.3.2 Selektion mit Carboxin ............................................................................... 68

3.7.4 Molekularer Nachweis der Transformation in den ATMT-Linien .................. 69

3.8 Southern Blot Nachweis der Transformation .............................................. 71

4. Diskussion .................................................................................................................... 72

4.1 Etablierung der Transformation von U. fabae in vitro .................................. 72

4.1.1 Ermittlung der optimalen Parameter für die Biolistik .................................. 73

4.1.2 Regulatorische Elemente ............................................................................ 73

4.1.3 Farbmarker ................................................................................................ 74

4.2 Transformationsansätze für in planta Versuche .......................................... 76

4.2.1 Fungizidmarker .......................................................................................... 76

4.2.2 Selektionsschema ...................................................................................... 78

4.2.2.1 Problematik der ersten Selektion (S1) ......................................................... 78

4.2.2.2 Propagation der Transformantenlinien in planta......................................... 79

4.3 Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation (ATMT) ................... 80

4.3.1 Parameter für die ATMT von U. fabae ........................................................ 80

VERZEICHNISSE INHALT IV

4.4 Mögliche Ursachen der Problematik bei der Propagation von Transformantenlinien ................................................................................ 84

4.5 Analyse der Transformation auf molekularer Ebene .................................... 85

4.5.1 Southern Blot Analyse ................................................................................ 90

4.6 Stabilität der transformierten Uredosporen ................................................ 91

4.7 Vergleich der Transformationsmethoden Biolistik und ATMT ...................... 92

4.8 Ausblick ..................................................................................................... 94

4.8.1 Anwendung weiterer molekulare Methoden .............................................. 94

4.8.2 Modifizierung und Erweiterung der Plasmidkonstukte ................................ 95

4.8.3 Optimierung der Propagation bei der Selektion in planta ............................ 95

5. Zusammenfassung ........................................................................................................ 96

6. Summary ...................................................................................................................... 98

7. Literatur ...................................................................................................................... 100

8. Anhang ........................................................................................................................ 112

8.1 Propagation einzelner Uredia aus S1 für S2 ................................................ 112

8.2 Zählungen einzelner Uredia (Biolistik) aus S1 ............................................. 113

8.3 Zählungen einzelner Uredia (ATMT) aus S1 ................................................ 115

8.4 Abbildungen verschiedener Selektionen in planta ..................................... 118

8.5 Southern Blot Analysen ............................................................................. 120

8.5.1 Verschiedene DNA-Menge und –Präparation für DIG-Markierung .............. 120

8.5.2 Vergleich von DIG und 32P Sonden-Markierung .......................................... 121

8.5.3 32P Markierung.......................................................................................... 122

9. Danksagung ................................................................................................................. 123

VERZEICHNISSE ABBILDUNGEN V

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: U. fabae Lebenszyklus .................................................................................. 3

Abbildung 1.2: Infektionsstrukturen von U. fabae ................................................................ 5

Abbildung 1.3: Biolistik Apparatur ........................................................................................ 8

Abbildung 1.4: Interaktion Agrobacterium – Pflanzenzelle .................................................. 10

Abbildung 2.1: Bombardierungs-Prozess mit PDS-1000/He Particle Delivery System ............ 19

Abbildung 2.2: Selektionsschema in planta......................................................................... 20

Abbildung 3.1: GUS Transformation in vitro ........................................................................ 37

Abbildung 3.2: iGFP Transformanten in vitro ...................................................................... 38

Abbildung 3.3: DsRed Transformanten in vitro ................................................................... 40

Abbildung 3.4: DsRed-NLS Transformanten von U. fabae .................................................... 41

Abbildung 3.5: Keimung von Uredosporen auf angerauter PE-Folie ..................................... 42

Abbildung 3.6: Transformation mit Doppelkonstrukt pRV111::DsRed .................................. 44

Abbildung 3.7: In genomische U. fabae DNA eingeführte Punktmutationen ........................ 45

Abbildung 3.8: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin in planta................... 46

Abbildung 3.9: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps in planta durch das Fungizid Benomyl 47

Abbildung 3.10: Selektionsschema für Transformanten von U. fabae in planta .................... 48

Abbildung 3.11: Aufbringen von Benomyl auf Bohnenblätter ............................................... 50

Abbildung 3.12: Selektion und molekularer Nachweis der biolistischen Transformation ....... 52

Abbildung 3.13: PCR Nachweis von selektionierten Sporenlinien nach Transformation mit pRV111::DsRed .......................................................................................... 53

Abbildung 3.14: Plasmidkassette tPMA1-mut-SucDH1-pPMA1 ............................................. 54

Abbildung 3.15: PCR Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien in der S1 ... 56

Abbildung 3.16: PCR-Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien von S2 bis S9 ................................................................................................................. 57

Abbildung 3.17: Möglichkeiten der Integration von Transgenen in das U. fabae Genom ....... 58

Abbildung 3.18: Nachweis des Einbaus in das Genom von U. fabae mittels SNP-PCR (Single nucleotid polymorphism-PCR) .................................................................... 59

Abbildung 3.19: Nachweis der Punktmutation in den Transformantenlinien ........................ 60

Abbildung 3.20 Einfluss der Induktionsdauer auf die Transformationseffizienz .................... 62

Abbildung 3.21: Einfluss von Acetosyringon (AS) auf die Transformationseffizienz ............... 63

Abbildung 3.22: Einfluss des Verhältnisses von Agrobakterien : Uredosporen auf die Transformationseffizienz ............................................................................ 64

Abbildung 3.23: Einfluss des Agrobacterium-Stammes auf die Transformationseffizienz....... 65

Abbildung 3.24: Mikroskopische Screens nach ATMT von U. fabae in vitro ........................... 66

Abbildung 3.25: ATMT-Transformanten von U. fabae aus S1 und S2 mit Carboxin ................ 69

Abbildung 3.26: ATMT-Linien S2 bis S8 ................................................................................ 69

Abbildung 3.27: PCR-Nachweis des pBIN20-Backbone ......................................................... 70

Abbildung 3.28: Southern Blot-Analyse von Uf-SucDH1 ....................................................... 71

VERZEICHNISSE ABBILDUNGEN VI

Abbildung 4.1: Übersicht über die Propagation von Transformantenlinien während der Selektion in planta ..................................................................................... 83

Abbildung 4.2: Nested-PCR Modell für den Nachweis der transgenen SucDH1 in U. fabae Transformanten ......................................................................................... 86

Abbildung 4.3: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom nach der Biolistik ............................................................................................... 87

Abbildung 4.4: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom bei Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens ................................... 89

Abbildung 8.1: Ausbringung von Einzelrostpusteln auf Ackerbohnenblätter ....................... 112

Abbildung 8.2: Gradient-PCR für SNP-PCR Primer. ............................................................. 114

Abbildung 8.3: Zeitlicher Unterschied in der Keimung zwischen WT und Transformanten ... 118

Abbildung 8.4: Erste Selektion (S1) mit Carboxin ............................................................... 118

Abbildung 8.5: Propagierte Transformationslinien in planta nach ATMT ............................ 119

Abbildung 8.6: Propagierte Transformationslinien in planta nach Biolistik ......................... 119

Abbildung 8.7: Southern Blot mit verschiedenen Mengen und Präparationen von U. fabae WT-DNA ................................................................................................... 120

Abbildung 8.8: Southern Blot-Vergleich der Sonden-Markierung DIG / 32P ......................... 121

Abbildung 8.9: 32P-Markierung von genomischer und Plasmid DNA ................................... 122

VERZEICHNISSE TABELLEN VII

Tabellenverzeichnis

Tabelle 2.1: Herkunft verwendeter Chemikalien ............................................................... 12

Tabelle 2.2: Verwendetes E. coli Stamm ........................................................................... 12

Tabelle 2.3: Agrobakterien-Stämme für Transformation von U. fabae ............................... 13

Tabelle 2.4: Schrittweise Auszählung von Uredosporen nach einzelnen Behandlungsschritten ................................................................................................................. 15

Tabelle 2.5: Plasmide und ihre Verwendung bei Transformation von U. fabae ................... 16

Tabelle 2.6: Parameter für biolistische Transformation von U. fabae ................................. 18

Tabelle 2.7: Verwendete Oligonukleotide ......................................................................... 23

Tabelle 2.8: Standardprotokoll für PCR-Reaktion .............................................................. 24

Tabelle 2.9: PCR Univ Programme..................................................................................... 25

Tabelle 2.10: Verwendete Restriktionsenzyme ................................................................... 27

Tabelle 2.11: Herstellung 32P-markierter Sonden ................................................................ 30

Tabelle 2.12: Auflistung der verwendeten Software............................................................ 33

Tabelle 3.1: Verwendete Plasmidkonstrukte für die Transformation von U. fabae ............. 35

Tabelle 3.2: Parameter für Transformation von U. fabae mittels Biolistik .......................... 36

Tabelle 3.3: Anzahl iGFP Transformanten von U. fabae in vitro .......................................... 39

Tabelle 3.4: Anzahl selektionierten DsRed-Transformanten in vitro ................................... 39

Tabelle 3.5: Anzahl von pRV111::DsRed-Transformanten in vitro....................................... 43

Tabelle 3.6.: Selektion von U. fabae Transformanten durch Benomyl in planta ................... 49

Tabelle 3.7: Selektion von U. fabae Transformanten durch Carboxin in planta ................... 51

Tabelle 3.8: Transformanten-Linien mit pRV111:DsRed in planta ...................................... 53

Tabelle 3.9: Erste Selektion in planta nach Beschuss mit der Kassette aus pRV111 und pRV113 .......................................................................................................... 55

Tabelle 3.10: Zweite Selektion nach biolistischer Transformation ........................................ 55

Tabelle 3.11: Selektionierte Transformantenlinien nach Biolistik in planta .......................... 56

Tabelle 3.12: Parameter für die Agrobacterium-vermittelte Transformation ....................... 61

Tabelle 3.13: Selektionierte Transformantenlinien nach der ATMT in planta ....................... 67

Tabelle 3.14: S1 nach ATMT mit drei Agrobacterium-Stämmen ........................................... 68

Tabelle 3.15: Selektionierte S2- bis S8-Transformantenlinien (ATMT) in planta.................... 68

Tabelle 4.1: Biolistik und Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT) im Vergleich 93

Tabelle 8.1: Biolistische Transformation mit pRV111 und pRV113 .................................... 113

Tabelle 8.2: Biolistische Transformation mit dem Doppelkonstrukt pRV111::DsRed .......... 113

Tabelle 8.3: Biolistische Transformation mit der Kassette tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 113

Tabelle 8.4: Biolistische Transformation mit der Kassette aus pRV111 und pRV113 ........... 114

Tabelle 8.5: Auszählung der Uredosporenlager in der S1 nach Transformation mit pRV101 Plasmid durch ATMT ..................................................................................... 115

Tabelle 8.6: Einfluss von Acetosyringon auf die Induktion der Agrobacterium-Stämme ..... 115

Tabelle 8.7: Einfluss des Verhältnisses Agrobakterien zu Uredosporen bei ATMT .............. 116

Tabelle 8.8: ATMT mit drei verschiedenen Stämmen ........................................................ 117

VERZEICHNISSE ABKÜRZUNGEN VIII

Abkürzungen

ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation

ATPase Adenosintriphosphatase

bp Basenpaar(e)

BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)

CSPD Dinatrium 3-(4-methoxyspiro {l,2-dioxetan-3,2'-(5'chloro)tricyclo[3.3.1.1 3,7]-

decan}-4-yl) phenylphosphat

DIG Digoxigenin

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)

DsRed Red Fluorescent Protein

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraacetat

glm generalized linear model (Generalisierte Lineare Modelle)

GUS β-Glucuronidase

iGFP intron Green fluorescent protein

kb Kilobasen(paare)

OD optische Dichte

PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaktion)

RT Raumtemperatur

SB Southern Blot

Sx Selektionsrunde x

Tx Transformantenlinie x

üN über Nacht

UV ultraviolettes Licht

WT Wildtyp

95%CI 95 % confidence interval

EINLEITUNG 1

1. Einleitung

1.1 Rostpilze

Rostpilze, die durch ihre unterschiedlich großen Pusteln mit rostbraunen bis schwarzen

Sporen auch als „Rost“ bezeichnet werden, sind mit über 7000 beschriebenen Arten (Maier

et al. 2003) die größte Gruppe der Basidiomyceten. Sie bilden die Ordnung Uredinales. Diese

obligat biotrophen Pilze sind wichtige Pflanzenpathogene mit einem breiten Spektrum an

Wirtspflanzen, insbesondere auch an wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen, und

verursachen weltweit dramatische Verluste in der Pflanzenproduktion. Die beiden für die

menschliche Ernährung wichtigsten Pflanzenfamilien Poaceae (Getreide) und Fabaceae

(Leguminosen) sind bedeutende Wirte der Rostpilze (Voegele, 2006). Neben dem im

Ackerbau ständig präsenten Getreiderost Puccinia graminis sind Kaffeerost (Hemileia

vastatrix) und der vor allem in den USA auftretende asiatische Sojabohnenrost Phakopsora

pachyrhizi (Schneider et al. 2005) von großer ökonomischer Bedeutung. Verschiedene

Vertreter der Gattung Uromyces, z.B.: U. appendiculatus (Gemeiner Bohnenrost), U. fabae

(Ackerbohnenrost), U. striatus (Alfalfarost) und U. vignae (Kuhbohnenrost), (Agrios 2005),

haben weltweit große Bedeutung für die Forschung und die Entwicklung neuer

Bekämpfungsstrategien im Leguminosenanbau.

Als Modellorganismen für die Erforschung der Infektionsmechanismen, der biochemischen

und molekularbiologischen Vorgänge während der Wirt-Pathogen-Interaktion Interaktion

sowie der Möglichkeiten der genetischen Modifikation, haben sich hauptsächlich fünf

Vertreter der Rostpilze etabliert (Voegele 2006). Bereits 1956 wurde von Flor für die

Aufstellung der Gen-für-Gen Hypothese (Flor 1956) das Modellsystem Melampsora lini –

Linum usitatissimum genutzt. Zahlreiche der nachfolgenden Erkenntnisse über die Lebens-

weise und Verbreitung der Rostpilze wurden an den Modellsystemen U. fabae – Vicia faba

(Deising et al. 1991; Hahn und Mendgen 1997; Voegele 2006) sowie U. appendiculatus auf

Phaseolus vulgaris (Harder und Mendgen 1982; Mendgen et al. 1996) gewonnen. Des

Weiteren wurde Puccinia gramminis in zahlreichen zytologischen und physiologischen

Arbeiten zur Aufklärung vieler in Rostpilzen vorkommender Prozesse herangezogen (Zhou et

al. 1991; Leonard und Szabo 2005).

EINLEITUNG 2

1.2 Uromyces fabae

Der Ackerbohnenrost U. fabae und seine Wirtspflanze V. faba dienten bereits zur Aufklärung

vieler Vorgänge hinsichtlich der Biochemie, Zytologie sowie Molekularbiologie während der

Wirt-Pathogen Interaktion (Freytag und Mendgen 1991; Deising et al. 1991; Mendgen und

Deising 1993; Mendgen et al. 1996; Hoffmann und Mendgen 1998; Hahn und Mendgen

2001; Voegele et al. 2001; Wirsel et al. 2004; Voegele 2006). Die obligat biotrophe

Lebensweise des Pilzes mit einem Wirtspflanzenspektrum von über 50 anderen Vicia sowie

20 Lathyrus Arten (Conner und Bernier 1982) ist ein wichtiger Aspekt zur Analyse der Wirt-

Pathogen-Interaktionen und Entwicklung möglicher Bekämpfungsstrategien in der Praxis.

Auf seiner bedeutendsten Wirtspflanze V. faba, ist der Ackerbohnenrost autözisch und bildet

alle fünf für Rostpilze bekannte Sporenarten: Basidiosporen, Pyknosporen, Aecidiosporen,

Uredosporen und Teleutosporen (Mendgen 1997).

1.2.1 Sporenarten und Verbreitung

Während einem vollständigen Lebenszyklus werden alle fünf Sporenarten von U. fabae auf

einer Pflanze (autözisch) gebildet. Die als Überwinterungsform gebildeten diploiden

Teleutosporen keimen im Frühjahr mit einem Metabasidium aus, wo unter

Reduktionsteilung vier haploide Basidiosporen entstehen. Diese Basidiosporen besitzen zwei

unterschiedliche Paarungstypen: (plus (B+) und minus (B–, Abb. 1.1)) welche bei

gegenseitigen Paarung das Pflanzenblatt infizieren und die Fruchtkörper Pyknidien, mit

ebenfalls verschieden gepaarten Pyknosporen bilden. Das haploide Myzel durchdringt das

Blatt und bildet auf der Unterseite nach Plasmogamie Aecidiosporenlager mit dikaryotischen

Aecidiosporen. Nach einer Infektion neuer Pflanzenblätter keimen Aecidiosporen aus und es

werden Uredosporenlager (Uredia) mit diploiden Uredosporen gebildet. Diese stellen die

Hauptverbreitungsform dar und werden während der Vegetationsperiode in großer Zahl

produziert. Urdosporen können leicht mit dem Wind und über längeren Distanzen verbreitet

werden. Im Herbst, kommt es unter Umwelteinflüssen wie Tageslänge und niedrigere

Temperatur zur Bildung von Teleutosporenlagern aus der Uredia. Die Zellkerne

verschmelzen während der Sporogenesis und einzellige diploide Teleutosporen werden als

Überwinterungsform gebildet (Voegele 2006). Aufgrund der schnellen und hohen Produktion

von Uredosporen während der Vegetationsperiode, wurden die Uredosporen und die von

EINLEITUNG 3

ihnen ausgehenden Infektionsstrukturen für die meisten biochemischen und

molekularbiologischen Untersuchungen genutzt (Voegele 2006). Auch im Rahmen dieser

Arbeit wurden Uredosporen für die Transformation von U. fabae verwendet.

Abbildung 1.1: U. fabae Lebenszyklus. Teleutosporen (T), Metabasidium (M), Basidiosporen (B),

Pyknidium (P); Aecidiosporen (A) und Uredosporen (U). 2n = diploid; n = haploid. Verändert nach Mendgen 1997.

1.2.2 Interaktion mit der Wirtspflanze

Uredosporen sind die Hauptform der asexuellen Vermehrung von Rostpilzen und werden

durch wiederholte Infektion der Wirtspflanzen während Sommers in großen Mengen

produziert (Voegele 2006). Eine mäßige Infektion resultiert in Produktion von 1012-1013

Uredosporen pro Tag und Hektar (Deising et al. 2002). Die Verbreitung erfolgt mit der

Windströmung über große Distanzen, so dass eine interkontinentale Übertragung, wie am

Beispiel von Hemileia vastatrix (Kaffeerost) beschrieben (Bowden et al. 1971), auch in

anderen Regionen vorkommen kann (Brown und Hovmøller, 2002). Auf der Wirtspflanze

haften sich die Sporen meistens als Cluster (Clement 1994) oder vereinzelt an die

M

B+ B‒ P

A U

T

Frühling

Winter

Herbst

Sommer

EINLEITUNG 4

Blattoberfläche an und bilden bei genügend hoher Luftfeuchtigkeit durch Sekretion

glykolisierter Polypeptide, niedermolekularer Kohlenhydrate (Clement 1993) sowie von

Cuticula-abbauenden Enzymen wie Esterasen und Cutinasen ein Adhäsionskissen (Deising et

al. 1992). Anschließend beginnt die Keimung. Dabei orientiert sich der Keimschlauch an

topographischen Signalen und differenziert bei einer Erhebung welcher der Vorhofleiste der

Spaltöffnung entspricht, zu einem Appressorium und arretiert in diesem Stadium bis das

Stoma sich öffnet. Daraufhin wird eine Penetrationshyphe gebildet, die in die Atemhöhle

eindringt und dort ein substomatäres Vesikel ausbildet. Von den Polen dieser

Infektionsstruktur differenzieren Interzellularhyphen, die benachbarten Zellen des

Blattmesophylls penetrieren. Dabei wird eine Haustorienmutterzelle gebildet aus der das

Haustorium in die Pflanzenzelle eingesenkt wird. Diese Einsenkung erfolgt mittels

Durchdringung der Zellwand und Einstülpung der Plasmamembran wodurch ein sehr enger

Kontakt zwischen pflanzlichem und pilzlichen Zytoplasma entsteht. Diese sind lediglich durch

die pilzliche Zellmembran (Haustorienmembran), die modifizierte Zellmembran der Pflanze

(extrahaustorielle Membran) sowie durch den Zwischenraum, die extrahaustorielle Matrix,

getrennt. Die Ausbildung von Haustorien ist ein komplexer Prozess für den bisher

unbekannte Signale der Wirtspflanze essentiell sind (Mendgen et al. 2000).

Auf künstliche Oberflächen aufgesprüht bilden Uredosporen an befeuchteten Unterlagen

Keimschläuche, die sich in alle Richtungen antasten. Bei Vorhandensein von künstlichen

Erhebungen, z.B. Kratzer auf der Oberfläche einer Polyethylen-Folie, werden diese von

keimenden Uredosporen erkannt und es wird die Bildung von Appressorien eingeleitet. Auf

einem künstlichen Blattabdruck mit dreidimensionaler Struktur können die Uredosporen bis

zur Haustorienmutterzelle differenzieren. Demnach können die Infektionsstrukturen in der

Penetrationsphase bis zur Haustorienmutterzelle auf künstlichen Oberflächen in vitro

induziert werden (Deising et al. 1991), jedoch verhindern fehlende pflanzlichen Signale die

Ausbildung von Haustorien. Verglichen mit Uredosporen besitzen Basidiosporen (Abb. 1.2 B)

eine dünne Zellwand und eine glatte Oberfläche. Es gibt keine Hinweise auf eine

topographische Erkennung der Wirtsoberfläche. Basidiosporen infizieren die Pflanze durch

direkte Penetration der Epidermiszellen (Mendgen 1997). Die Infektionsstrukturen wie das

Appressorium, das substomatäres Vesikel und das Haustorium sind vorhanden, jedoch im

Vergleich zu Uredosporen wesentlich schwächer differenziert (Abb. 1.2).

EINLEITUNG 5

[A] [B]

Abbildung 1.2: Infektionsstrukturen von U. fabae. Ausgehend von Uredosporen (A) und Basidiosporen (B). Spore (S); Keimschlauch (KS); Appressorium (A); Penetrationshyphe (P); substomatäres Vesikel (SV); Interzellularhyphen (I); Haustorienmutterzelle (HM); Haustorium (H).

Haustorien haben eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung der parasitischen Interaktion

durch die Unterdrückung pflanzlicher Abwehr während der biotrophen Phase (Mendgen et

al. 2000). Die meisten biochemischen und molekularbiologischen Untersuchungen an U.

fabae betreffen daher die Aufklärung der Haustorienfunktion (Voegele 2006). Es wurden u.a.

mehrere Aminosäuretransporter in der Haustorienmembran gefunden (Hahn et al. 1997;

Struck et al. 2002). Ebenso konnte eine H+-ATPase identifiziert werden, welche durch das

Zusammenspiel mit einem Hexose-Symporter eine wesentliche Rolle der Haustorien in der

Nährstoffaufnahme offenbart (Struck et al. 1996; Voegele et al. 2001). Die Interaktion mit

der Pflanze und die Unterdrückung der Abwehrreaktion wird auch durch eine Reihe

sekretierter Proteine beeinflusst (Link und Voegele 2008). Die Charakterisierung von Rust

Transferred Protein 1 (RTP1p) zeigte einen Übergang eines pilzlichen Proteins vom

Haustorium in die pflanzliche Wirtszelle, was in Zusammenhang mit der Unterdrückung der

pflanzlichen Abwehr in Zusammenhang stehen könnte (Kemen et al. 2005). Es konnte eine

Reihe von RTPp-Homologen in anderen Rostpilzen identifiziert werden, welche

möglicherweise eine Funktion als Protease-Inhibitor haben (Pretsch 2012). Zudem sind

verschiedene sekretierte Proteine identifiziert worden, die das Potenzial besitzen, die

pflanzliche Abwehr während der biotrophen Interaktion zu beeinflussen (Link 2009).

EINLEITUNG 6

1.2.3 Bekämpfungsmethoden in der Praxis

Beim Befall von V. faba durch U. fabae an handelt es sich um eine kompatible Interaktion,

ein Resistenzmechanismus ist bisher unbekannt, so dass die Züchtung U. fabae resistenter

Bohnensorten bisher nicht erfolgreich war.

Die Ackerbohne (Vicia faba), auch als Saubohne, Dicke Bohne, Faberbohne oder Puffbohne

bekannt, ist der wirtschaftlich bedeutendste Vertreter der Gattung Vicia. Mit einem Ertrag

von 4,1 Millionen Tonnen pro Jahr und 2,5 Millionen ha Anbaufläche weltweit (Akibode und

Maredia 2011) zählt die Ackerbohne zu den 10 ökonomisch wichtigsten Körnerleguminosen.

Die größten Erzeuger im weltweiten Vergleich in den Jahren 2006-2008 waren China (930

000 ha) sowie Frankreich (60 000 ha) und UK (50 000 ha) in Europa (Akibode und Maredia

2011). Der Ackerbohnenrost ist neben dem Falschen Mehltau (Peronospora viciae var.

fabae), der Wurzelhals- und Stängelfäule (Rhizotonia solani), der Schokoladenflecken-

krankheit (Botrytis fabae) und der Weißstängeligkeit (Sclerotonia trifoliorum) eine der

wichtigsten Krankheiten der Ackerbohne. Demnach nimmt die Bekämpfung von U. fabae

eine wichtige Stellung im Pflanzenbau ein. Ein derzeit zugelassenes Fungizid gegen den

Ackerbohnenrost ist Folicur (Wirkstoff Tebuconazol, Bayer, Leverkusen). Gegen andere

Roste im Getreideanbau wird der Wirkstoff Carbendazim (Harvesan, DuPont, Wilmington,

USA) eingesetzt. Die potentielle Gefahr einer Resistenzbildung seitens des Pathogens ist

ständig präsent und stellt eine große Herausforderung in der Fungizidforschung und -ent-

wicklung dar. Die Entwicklung neuer Wirkstoffe, die allen heutigen Anforderungen der

Gesetzgebung gerecht werden, ist mit der Erforschung von essentiellen Stoffwechselwegen

verbunden, die eine Wirt-Pathogen-Interaktion aufrechterhalten. Hierfür ist vor allem die

Etablierung neuer Methoden zur Aufklärung molekularer und genetischen Vorgänge im

Pathogen das primäre Ziel.

1.3 Genetische Modifikation obligat biotropher Pilze

Obligat biotrophe Pilze wie der Fasche Mehltau und die Rostpilze liegen aufgrund einer

Reihe ungeklärter Prozesse während der Wirt-Pathogen-Interaktion, im besonderen

Interesse der Forschung. Die Schwierigkeiten bei der Erforschung der Mechanismen

berühren hauptsächlich auf zwei Tatsachen: 1) die fehlende Möglichkeit zur Erzeugung einer

EINLEITUNG 7

authentischen Wirt-Pathogen-Interaktion in vitro und 2) das Fehlen einer erfolgreichen

Methode zur stabilen Transformation von obligat biotrophen Pilzen.

Es gab zwar bereits Veröffentlichungen über eine stabile Transformation von Erysiphe

graminis (Chaure et al. 2000), bislang jedoch keine weiteren Publikationen über den Erfolg

dieser Methode bei anderen Pilzen. In jüngster Vergangenheit ist es Lawrence et al.

gelungen, ein System für die Transformation von Melampsora lini, den Erreger des Flachs-

rostes, zu etablieren (Lawrence et al. 2010). Dieses System basiert auf einer Agrobacterium

tumefaciens-vermittelten Transformation unter Ausnutzung des RNAi Silencing eines

Avirulenzgens als Selektionsmarker. Demnach ist diese Methode nur in gut charakterisierten

Systemen wie der Flachs-Flachsrost Interaktion anwendbar. Im System Ackerbohnenrost-

Ackerbohne, sowie in zahlreichen anderen Wirt-Pathogen-Interaktionen, bei denen wenig

über Avirulenzgene bekannt ist, ist dieses System bislang nicht anwendbar. Verschiedene

Berichte über die genetische Modifikation der obligat biotrophen Rostpilze beziehen sich auf

eine transiente Transformation. Beispiele für die Transformation von Uromyces

appendiculatus beruhen auf der Mikroinjektion von Antisense Primern (Barja et al. 1998)

oder biolistischem Beschuss mit dem -Glucuronidase (GUS)-Gen als Farbmarker (Bhairi und

Staples 1992; Li et al. 1993). Auch für Puccinia graminis f. sp. tritici wurde eine transiente

Transformation beschrieben (Schillberg et al. 2000). Allen gemeinsam war die Benützung von

in vitro erzeugten Infektionsstrukturen und somit die fehlende Möglichkeit, einen

vollständigen Lebenszyklus oder die Propagation der gewonnenen Transformanten zu

erzeugen. Um das Ziel zu verfolgen, ein System für eine stabile Transformation von U. fabae

zu etablieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Transformationsmethoden gewählt: 1)

Biolistik, die in den meisten Fällen für eine transiente Transformation der Rostpilze als

erfolgreich beschrieben wurde (Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993; Schillberg et al. 2000)

und 2) Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation als bedeutende Methode für

die Transformation zahlreicher filamentöse Pilze (Michielse et al. 2005; Frandsen 2011).

1.3.1 Transformationsmethoden

1.3.1.1 Biolistik

Die Particle oder Gene Gun (Genkanone), ursprünglich für Transformation von Pflanzen

entwickelt (Stanford et al. 1987) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genetische

EINLEITUNG 8

Modifikation nahezu aller Zelltypen und richtet sich nicht nur auf Zellkerne sondern auch

andere Organellen wie Mitochondrien (Johnston et al. 1988) oder Chloroplasten (Boynton et

al. 1988). Diese Methode, meistens als Bioballistik oder Biolistik bezeichnet, fand sehr

schnell ihre Anwendung bei der Transformation von Bakterien und Pilzen (Smith et al. 1992,

Johnston et al. 1988, Armaleo et al. 1990). Der Mechanismus basiert auf einem Beschuss von

Zielzellen oder –Organellen unter hohem Druck mit Partikeln (Microcarrier), meistens Gold

(0,6 µM oder 1,0 µM Durchmesser) oder Wolfram (0,4 µM oder 0,7 µM) die mit Plasmid-

DNA, welche die Zielgene enthält, umhüllt sind. Aufgrund ihrer einheitlichen Größe und

chemischen Inertheit werden als Microcarrier bevorzugt Goldpartikel benutzt. Zusätzlich

werden die Partikel für eine bessere Adsorption der DNA mit Spermidin beschichtet. Für die

Erzeugung des hohen Drucks wird das Gas Helium verwendet. Die Etablierung einer Reihe

von Parametern ist für jeden Zielorganismus notwendig um eine effiziente Transformation

mittels Biolistik (Abb. 1.3) zu erreichen. Dazu gehört der entsprechende Helium-Druck, um

eine Beschädigung der beschossenen Zellen zu vermeiden, die passende Größe und Art der

Microcarrier sowie die Beschussdistanz zwischen „Stopping Screen“ und Zielzellen (s.a. Abb.

2.1 Abschnitt 2.4.1). Die Vorteile der biolistischen Methode sind eine leichtere Handhabung

Abbildung 1.3: Biolistik Apparatur (Manual Bulletin, Bio-Rad Laboratories).

EINLEITUNG 9

und Durchführung im Vergleich zu arbeitsaufwändigeren Methoden, die eine

Protoplastierung der Zellen oder eine Mikroinjektion erfordern. Die beschossenen Zellen

werden nur wenig beschädigt und es sind geringe Mengen an DNA notwendig um sowohl

eine transiente als auch stabile Transformation zu erreichen. Ein Nachteil sind lediglich hohe

Anschaffungskosten der Biolistik Apparatur. Die Patentrechte für Genkanone wurden im Jahr

1990 an die Firma DuPont (Wilmington, USA) verkauft und der Vertrieb wurde an die Firma

Bio-Rad übertragen.

1.3.1.2 Agrobacterium vermittelte Transformation

Agrobakterien sind bodenbürtige gramnegative Bakterien aus der Klasse der

Alphaproteobacteria. Die meisten Agrobacterium-Spezies leben saprophytisch, einige sind

pathogen und verursachen neoplastische Erkrankungen wie Wurzelhalsgallen (A.

tumefaciens) oder die Haarwurzelkrankheit (A. rhizogenes) bei einem breiten Spektrum an

dikotyledonen und manchen monokotyledonen Pflanzen (DeCleene and DeLay, 1976).

1.3.1.2.1 Agrobacterium tumefaciens als Pathogen

Die Bildung von Tumoren wird durch die artübergreifende Genübertragung (horizontaler

Gentransfer) des bakteriellen Ti-Plasmid in die Pflanze verursacht. Die Induktion der

Virulenzmaschinerie von Agrobacterium (vir-Gene) wird durch sekundäre Pflanzenstoffe wie

Acetosyringon und andere phenolischen Verbindungen ausgelöst (Stachel et al. 1986). Die zu

übertragende bakterielle T-DNA (transferred DNA) ist Teil des ca. 200 kb großen Tumor

induzierenden (Ti) Plasmids und kodiert Gene für die Auxin- und Cytokininsynthese, die ein

unkontrolliertes Zellwachstum und schließlich die Tumorbildung in der Pflanze auslösen.

Neben Auxin- und Cytokinin- kodierenden Sequenzen trägt die T-DNA Gene für die Synthese

von Opinen, stickstoffreichen Molekülen, welche von der Pflanze produziert und in die

Umgebung sekretiert werden und von Agrobacterium als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle

genutzt werden. Flankierende kurze, repetitive Sequenzen (25 bp) der T-DNA werden als left

und right border (LB, RB) bezeichnet. Vor einem T-DNA-Transfer wird die ca. 20 kb große T-

DNA durch einen durch Endonukleasen (VirD, Abb. 1.4) verursachten Einzelstrangbruch

innerhalb der RB, für den Transfer vorbereitet. (Lacroix 2006; Citovsky 2007; Frandsen 2011).

Der Transfer der einzelsträngigen T-DNA erfolgt über das bakterielle Typ IV-

EINLEITUNG 10

Sekretionssystem (Christie 2004). In der Wirtszelle entsteht der „mature T-complex“, der mit

Hilfe verschiedener bakterieller und pflanzlicher Faktoren (Tzfira und Citovsky 2002) entlang

des Cytoskeletts in den pflanzlichen Zellkern transportiert wird. Die Integration der T-DNA

ins pflanzliche Genom ist bis heute nicht gänzlich verstanden (Tzfira 2004; Lacroix 2006),

erfolgt jedoch eher unspezifisch, begünstigt durch bestimmte Tandemwiederholungen.

Abbildung 1.4: Interaktion Agrobacterium – Pflanzenzelle. Abbildung aus Citovsky et al. (2007). Dar-stellung der wichtigsten molekularen Vorgänge bei der Übertragung und Integration der T-DNA von Agrobacterium in das Pflanzengenom.

1.3.1.2.2 Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pilzen

Die natürliche Fähigkeit der Agrobakterien zur Übertragung von genetischem Material in die

Wirtspflanze wird in der Forschung seit 1977 gezielt für genetische Modifikation von

Pflanzen zur Erzeugung einer ortsspezifischen oder zufälligen Mutagenese („random

mutagenesis“) und zur heterologen Expression genutzt (Schell und Van Montagu 1977).

Durch die Modifikation des Ti-Plasmids und Konstruktion binärer Vektoren (Bevan 1984),

konnte eine erhöhte Effizienz dieser Transformationsmethode unter Laborbedingungen auch

bei vielen Pilzen (Bundock et al. 1995; de Groot et al. 1998; Michielse et al. 2005; Frandsen

EINLEITUNG 11

2011) erreicht werden. Inzwischen sind eine Reihe von Agrobakterien-Stämmen verfügbar,

die für die Transformation von Pilzen eingesetzt werden, z.B. LBA1100 (Beijersbergen et al.

1992), EHA105 (Hood et al. 1993), GV3101 (Koncz and Shell, 1986) oder AGL1 (Lazo et al.

1991). Die Zahl der mittels Agrobacterium transformierbaren Pilze nimmt ständig zu

(Frandsen 2011). Neben den Ascomyceten: Botrytis cinerea (Rolland et al. 2003), Aspergillus

sp. (Gouka et al. 1999; Michielse et al. 2008; Sugui et al. 2005), Colletotrichum sp. (Münch et

al. 2011; Talhinhas et al. 2008), Fusarium sp. (Mullins et al. 2001; Liu et al. 2009) u.a.,

gehören zahlreiche Vertreter der Basiodiomyceten wie: Agaricus bisporus (de Groot et al.

1998; Chen et al. 2000), Laccaria bicolor (Kemppainen et al. 2008), Melampsora lini

(Lawrence et al. 2010), Rhizoctonia solani (Wu and O’Brien 2009) oder Ustilago maydis (Ji et

al. 2010) zu den durch Agrobacterium transformierbaren Pilzen. Auch die Transformation

von Oomyceten wie Phytophthora infestans wurde mittels Agrobacterium erreicht (Vijn and

Govers, 2003).

1.4 Zielsetzung

Die molekularbiologische Untersuchung des Rostpilzes Uromyces fabae und damit die

Erforschung der biotrophen Lebensweise ist bislang erschwert, da kein System für eine

stabile Transformation verfügbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit sollte mittels zweier

unterschiedlicher Methoden, Biolistik und Agrobacterium tumefaciens-vermittelter

Transformation (ATMT) die Möglichkeit geschaffen werden, U. fabae genetisch zu

modifizieren. Für die Visualisierung der Transformationsereignisse in vitro, sollten die

Farbmarker iGFP, DsRed bzw. GUS verwendet werden, um optimale Parameter für beide

Transformationsmethoden in vitro zu etablieren. Einzelne Punktmutationen in bereits

charakterisierten Genen für Tubulin (Uf-TBB1) und die Succinat Dehydrogenase (Uf-SucDH1),

die eine Resistenz gegenüber den Fungiziden Benomyl bzw. Carboxin vermitteln, sollten als

Marker benutzt werden, um eine Propagation und Selektion der U. fabae-Transformanten in

planta zu ermöglichen. Unter diesen Bedingungen sollten möglichst viele

Transformantenlinien in V. faba Pflanzen unter Selektionsdruck propagiert werden.

Desweiteren sollten molekularbiologische Methoden wie PCR und Southern Blot für die

Analyse der selektionierten Transformanten von U. fabae, etabliert werden.

MATERIAL UND METHODEN 12

2. Material und Methoden

2.1 Chemikalien

Die verwendeten Chemikalien und ihre Herkunft sind im Text angegeben. Die Hersteller-Liste

ist Tabelle 2.1 zu entnehmen.

Tabelle 2.1: Herkunft verwendeter Chemikalien.

Firma Firmenstandort

Becton Dickinson GmbH

Heidelberg

Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe

Chem Service Inc West Chester, USA

GE Healthcare München

Invitrogen Karlsruhe

Merck KGaA Darmstadt

Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH Taufkirchen

SERVA Electrophoresis GmbH Heidelberg

2.2 Verwendete Organismen

Die in dieser Arbeit verwendeten Organismen sowie ihre Kultivierung sind den folgenden

Abschnitten zu entnehmen.

2.2.1 Bakterienstämme

2.2.1.1 Escherichia coli

Für Klonierung und Plasmidvermehrung wurde der in Tabelle 2.2 beschriebene E. coli-Stamm verwendet. Tabelle 2.2: Verwendetes E. coli Stamm.

Stammbezeichnung Genotyp Herkunft

DH5

F-, ϕ80lacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1,

endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44 λ-, thi-1 gyrA96,

relA1

Invitrogen


2.2.1.2 Agrobacterium tumefaciens

Die für die Transformation von U. fabae verwendeten Agrobacterium-Stämme sind in Tabelle 2.3 aufgelistet. Tabelle 2.3: Agrobakterien-Stämme für Transformation von U. fabae.

Stamm Genotyp Referenz

AGL-1 AGL0 (C58 pTiBo542) recA::bla, T-region deleted Mop(+); RifR, CbR Lazo et al. 1991

GV3103 C58-C1 pTiC58; GmR Holsters et al. 1980

LBA1100 C58-C1 with a disarmed octopine-type pTiB6 plasmid; SpR

Beijersbergen et al. 1992

2.2.2 Verwendete Kulturmedien

Im Folgenden wird Zusammensetzungen der Flüssigmedien für Bakterienkulturen

angegeben. Wenn nicht anders angegeben wurden für Kulturplatten Flüssigmedien mit 1,5 %

(w/v) Agar angesetzt.

2.2.2.1 Für E. coli

LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) (Sambrook und Russell, 2001)

Bacto Trypton 1,0 % (w/v)

Hefeextrakt 0,5 % (w/v)

NaCl 171,1 mM

Der pH wurde mit 1 M NaOH auf 7,5 eingestellt.

Zur Herstellung von Selektivmedien wurden nach dem Autoklavieren zusätzlich folgende

Antibiotika zugegeben:

Ampicillin 100 µg/ml

Kanamycin 50 µg/ml

2.2.2.2 Für A. tumefaciens

LBMC-Medium

Zum LB-Medium wurde zusätzlich zugegeben:

MgSO4 2,5 mM

CaCl2 2,5 mM


Antibiotika für die Selektion der entsprechenden Agrobacterium-Stämme:

AGL-1 Rifampicin 10 µg/ml

Carbenicillin 75 µg/ml

LBA1100 Spectinomycin 100 µg/ml

GV3103 Gentamycin 25 µg/ml

Für die Vermehrung von Agrobakterien welche die Plasmide für die Transformation tragen

wurde zusätzlich Kanamycin (25 µg/ml) zugegeben.

Induktionsmedium (AS-Medium)

MgCl2 10 mM

MES/KOH pH5,6 10 mM

Acetosyringon 200 µM

2.2.3 Pilz- und Pflanzenmaterial

2.2.3.1 Pilzmaterial

Für alle Experimente wurde der Ackerbohnenrost, Uromyces fabae (PERS.) SCHROETER

(Rasse I2) verwendet.

2.2.3.2 Keimung von U. fabae Uredosporen auf künstlichen Oberflächen

Wenn nicht anders angegeben wurden die Uredosporen für in vitro Untersuchungen in 0,01

% Tween20 für 2 h unter starkem Rühren hydriert. Nach der Vakuum-Filtration wurden die

trockenen Sporen vorsichtig in einem entsprechenden Flüssigkeitsvolumen aufgenommen

und mit einer Airbrush-Pistole (HP-200, Conrad Electronic GmbH, Hirschau) auf in

Petrischalen eingebettete Objektträger (1976 mm2) mit oder ohne PE Membran gesprüht.

Die luftdichten, feuchten Petrischalen (Ø 9 cm) wurden für 16-22 h bei 24 °C im Dunkeln

inkubiert. Zur Differenzierung der Infektionsstrukturen wurden die PE-Folien zusätzlich

mittels einer Stahlbürste angeraut.


2.2.3.3 Bestimmung der Uredosporen-Anzahl

Bei der Vorbereitung von Sporen für Transformationsansätze wurden mehrere Präparations-

schritte von Hydrierung über Filtration, gefolgt vom Beschuss während der Biolistik und

schließlich dem Aufsprühen notwendig. Dabei entstanden jeweils Verluste an

Sporenmaterial. Um die genaue Sporenzahl bei jeden Schritt zu bestimmen wurden diese vor

dem Aufsprühen in einer Neubauer Zählkammer (BRAND GmbH + Co KG, Wertheim) bzw.

nach Aufsprühen auf dem Objektträger bestimmt. Die Sporenzahlen für jeden Schritt sind in

Tabelle 2.4 dargestellt.

Tabelle 2.4: Schrittweise Auszählung von Uredosporen nach einzelnen Behandlungsschritten. 350 mg Sporen wurden hydriert und filtriert. Pro Beschuss und Objektträger (Pflanzenblatt) wurden 23,3 mg verwendet. Anzahl der Sporen I: nach Hydrierung; II: nach Filtration; III: nach Biolistik; IV: nach Aufsprühen auf Objektträger (1976 mm2).

Sporenmenge I II III IV

350 mg 1,1 x 108 4,6 x 107

-- --

23,3 mg

-- -- 2,67 x 106 4,4 x 105

1 g

3,1 x 108 1,3 x 108 1,1 x 108

1,9 x 107

2.2.3.4 Pflanzenmaterial

Saatgut von Vicia faba 'Witkiem Manita' wurde von agri-Saaten GmbH, Bad Essen bezogen.

Die Aussaat der Ackerbohnen erfolgte in gedämpftem Substrat (Einheitserde Typ T,

Gebrüder Patzer GmbH & Co. KG, Buchenberg) und anschließender Anzucht für 21 Tage bei

21 °C, 90 % rel. Luftfeuchtigkeit und Tag-/Nacht-Periode von 16/8 h in einer Phytokammer

(Heraeus Vötsch Typ VVZPHQ 200/S).

2.2.3.5 Kultivierung und Inokulation von V. faba

Für die Inokulation mit U. fabae Uredosporen wurden für alle Versuche drei Wochen alte

Ackerbohnenpflanzen verwendet. Bei größeren Sporenmengen und für eine Vermehrung in

größerem Maßstab wurden Uredosporen (350 mg/100 ml) in 0,01 % Tween20 für 2 Stunden

unter ständigem Rühren hydriert. Nach Filtration wurde eine Suspension mit einer

Sporendichte von 155 mg/ml in 0,01 % Tween20 angesetzt und mittels der Airbrush Pistole

(HP-200, Conrad Electronic GmbH, Hirschau) auf die Pflanzen gesprüht. Für eine optimale


Sporenkeimung wurden so behandelte Pflanzen für 24 h bei hoher Luftfeuchtigkeit und 21 °C

inkubiert. Anschließend wurden die mit U. fabae infizierte Pflanzen im Gewächshaus bei fol-

genden Bedingungen kultiviert: Heiztemperatur Tag 20 °C / Nacht 16 °C, Lüftung Tag 25 °C /

Nacht 22 °C, Zusatzbeleuchtung 18-22 Uhr. Die Ernte der Uredosporen erfolgte nach 10 bis

15 Tagen durch Schütteln der infizierten Pflanzen. Die Lagerung der Sporen erfolgte bei -70

°C.

2.3 Verwendete Plasmide

Alle für die Transformation von U. fabae verwendeten Plasmide sind in Tab. 2.5 angegeben.

Tabelle 2.5: Plasmide und ihre Verwendung bei Transformation von U. fabae.

Bezeichnung Gen Selektion Verwendung Referenz

pBluescript II KS – AmpR Vektor Short et al., 1988

pBIN20 – KanR Vektor Hennegan und Danna, 1998

pPgpd-DsRed DsRed AmpR DsRed-Marker Mikkelsen et al. 2003

pSW3386 mut-TBB1 (TBB1-E198A)

AmpR Biolistik Stefan Wirsel

pSW3534 GFP AmpR Biolistik Stefan Wirsel

pRV101 (4) mut-TBB1 (TBB1-E198A)

KanR ATMT Heike Lenz

pRV102 GFP KanR ATMT Ralf Vögele

pRV103 GUS AmpR Biolistik Ralf Vögele

pRV111 mut-SucDH1 (SucDH1-H254Y)

AmpR Biolistik Ralf Vögele

pRV112 mut-SucDH1 (SucDH1-H254Y)

KanR ATMT Ralf Vögele

pRV113 mut-SucDH1 (SucDH1-H254L)

AmpR Biolistik Ralf Vögele

pRV114 mut-SucDH1 (SucDH1-H254L)

KanR ATMT Ralf Vögele

pRV115 DsRed AmpR Biolistik Heike Lenz

pRV115-NLS DsRed-NLS AmpR Biolistik Diese Arbeit

pRV116 DsRed KanR ATMT Heike Lenz

pRV116-NLS DsRed-NLS KanR ATMT Diese Arbeit

pRV117 iGFP AmpR Biolistik Ralf Vögele

pRV111-DsRed SucDH1-H254Y-DsRed

AmpR Biolistik Heike Lenz

pRV112::DsRed SucDH1-H254Y-DsRed

KanR ATMT Heike Lenz


2.3.1 Konstruktion der Plasmide für Biolistik

Für die Konstruktion der Plasmide für die biolistische Transformation wurde der pBluescript

II KS-Vektor (X52327) verwendet (Größe 2961 bp, Short et al., 1988).

Für die Kontrolle der Expression der verwendeten Markergene wurden endogene

regulatorische Elemente, die Promoter (p)- und Terminator (t)-Sequenzen der U. fabae

Plasmamembran-ATPase (Uf-PMA1), verwendet, welche in allen von Uredosporen

ausgehenden Infektionsstrukturen konstitutiv exprimiert wird (Struck et al., 1998).

Farbmarker

Insgesamt vier verschiedene Farbmarker, GUS, eGFP, iGFP und DsRed wurden in den

pBluescript II KS Vektor eingefügt. Das erste Konstrukt wurde mit einheitlichen

Restriktionsschnittstellen versehen, die ein späteres Austauschen der einzelnen Markergen-

kassetten erleichterten. So wurden bei tPMA1 Schnittstellen für NotI (5‘) und SacI (3‘)

eingeführt, bei pPMA1 XmaI (5‘) und NcoI (3‘). Der Farbmarker eGFP (aus dem Plasmid

pEFGF-N1, Clontech, Mountain View, CA) wurde in das oben beschriebenen Konstrukt zum

Plasmid pSW3534 ligiert. Für alle anderen Farbmarker wurde von Plasmid pSW3534

ausgehend durch den Austausch der Markergene über die einheitlichen Schnittstellen

gearbeitet und somit die Plasmide pRV103 (GUS), pRV115 (DsRed) und pRV117 (iGFP)

konstruiert. Ein Kernlokalisierungssignal (nuclear localization signal, NLS) basierend auf dem

SV40 Large T-antigen NLS (PKKKKRKV), (Kalderon et al., 1984) wurde mit den

Oligonukleotiden NLS-Rev und NLS-Fwd (Tab. 2.7) amplifiziert. Nach der Dephosphorylierung

wurde die NLS-Sequenz in das mit dem Enzym NcoI linearisiete pRV115 Plasmid ligiert. Das

entstandene Plasmid wurde mit pRV115-NLS bezeichnet.

Fungizidmarker

Die bereits modifizierte Uf-SucDH1 mit jeweils einer Punktmutation in SucDH1-H254Y

(pRV111) und SucDH1-H254L (pRV113), wurde für die Selektion mit dem Fungizid Carboxin

verwendet. Für die Selektion mit Benomyl wurden Plasmide mit dem modifizierten Tubulin

Gen (TBB1-E198A) verwendet (pSW3386, Wirsel et al. 2004).


2.3.2 Plasmide für die Agrobacterium-vermittelte Transformation

Als Ausgangsvektor für die ATMT-Plasmidkonstrukte wurde der binäre Vektor pBIN20

(Hennegan und Danna 1998) verwendet (Größe 12040 bp). Analog zu Plasmidkonstruktion

für die Biolistik wurden die Markergene durch Austausch über einheitliche

Restriktionsschnittstellen zwischen Left- und Right-Border von pBIN20 eingefügt.

2.4 Transformationsmethoden

2.4.1 Biolistik

Für die Transformation von U. fabae mittels Biolistik wurde die PDS-1000/He Particle

Delivery System (Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) verwendet.

Hydrierte Uredosporen (350 mg, 4,6 x 107) wurden in 2,25 ml 0,01 % Tween20 resuspendiert

und 150 µl der Sporensuspension in der Mitte einer Petrischale (Ø 9 cm) pipettiert. Die

Plasmid DNA, linearisiert oder zirkulär, wurde wie folgt mit Goldpartikeln gekoppelt

(Microcarrier) und auf Macrocarrier gegeben: 0,06 g Gold (1 µM Durchmesser) wurden nach

Hersteller Anleitung gewaschen und in 1 ml sterilem 50 % Glycerin resuspendiert. Nach

gründlichen Vortexen wurden 50 µl der Goldsuspension unter weiterem kontinuierlichen

Vortexen mit 5 µl Plasmid-DNA (1 µg/ml), 50 µl 2,5 M CaCl2 und 20 µl 0,1 M Spermidin

gemischt. Die Ansätze wurden kurz zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet

mit 140 µl 70 % Ethanol gewaschen. Dieser Waschschritt wurde mit 100 % Ethanol

wiederholt, das Pellet in 50 µl 100 % Ethanol resuspendiert und 8 µl Aliquots auf die

Macrocarrier pipettiert. Der Beschuss erfolgte unter den in Tabelle 2.6 angegebenen

Parametern.

Tabelle 2.6: Parameter für biolistische Transformation von U. fabae. Optimale Parameter sind hervorgehoben.

Parameter Variation

Microcarrier (Typ und Durchmesser) [µm] Gold, 1 Wolfram 0,4 / 0,7

Heliumdruck [bar] 62, 93, 107, 138, 152

Target-Distanz [cm] 3, 6, 9, 12

Vakuum in der Kammer [bar] 0,153


Für die Veranschaulichung des Bombardierungsprozesses dient Abbildung 2.1.

Abbildung 2.1: Bombardierungs-Prozess mit PDS-1000/He Particle Delivery System. Distanz von Rupture Disk zu Macrocarrier (A, konstant), Macrocarrier-Distanz zum Stopping Screen (B, konstant), Distanz zwischen Stopping Screen und Target Cells (Uredosporen), (C, veränderbar). (Verändert nach Manual Bulletin, Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland)

Nach dem Beschuss wurde die Sporensuspension (3 x 106 Uredosporen) mit 300 µl 0,01 %

Tween20 von der Petrischale gewaschen und zum Aufsprühen auf die Pflanzen oder für in

vitro Versuche verwendet.

2.4.2 Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT)

Transformierte Agrobakterien wurden von Kulturplatten in Flüssigkultur umgesetzt. Dazu

wurde eine Kolonie in 10 ml LBMC Medium überführt und für 24 h bei 28 °C und 250 rpm

inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch eine Zentrifugation (15 min, 4000 rpm, RT)

pelletiert und das Pellet in 5 bis 10 ml Induktionsmedium (AS-Medium) schonend

resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in sterile 50-100 ml Kolben überführt und für 6

Stunden bei 28 °C und 200 rpm inkubiert. Durch eine OD600-Messung wurde die

Bakterienzahl bestimmt und die Zellen mit den hydrierten Uredosporen in gegebenem

Verhältnis (1 : 38,5; 1 : 100 oder 1 : 200 Uredosporen : Agrobakterien) gemischt. Die

Uredosporen-Agrobakterien-Suspension wurde anschließend wie beschrieben (2.2.3.2 und

2.4.3.) auf Objektträger oder Pflanzen wie beschrieben aufgesprüht.


Pflanze 1 Pflanze 2 Pflanze 3

Keine Selektion 1. Fungizid-Selektion 2. Fungizid-Selektion

2.4.3 Ausbringung von Sporen in planta und Selektionsschema

Das Aufsprühen der Sporensuspension auf V. faba Blätter nach der biolistischen

Transformation, richtete sich nach der Sporendichte die für in vitro Screens benutzt wurde (3

x 106 Sporen pro Objektträger). Nach 10 bis 15 Tagen (s. 2.2.2.5) wurden die Uredosporen

durch Schütteln der Pflanzenblätter geerntet, wobei Wildtyp- und potentiell transformierten

Sporen nicht getrennt wurden (Abb. 2.2). Für eine Selektion in einem weiteren Schritt

wurden die zu inokulierenden Ackerbohnenblätter mit Fungizid besprüht und zum

Abtrocknen stehen gelassen. Für eine Selektion mit Carboxin wurden 400 µl (50 µg/ml) und

für Benomyl 400 µl (10 mg/ml) des Fungizids pro Blatt aufgesprüht.

Die vorhydrierten Sporen wurden wie beschreiben auf die mit Fungizid vorbehandelten

Blätter gesprüht. Zur Ausbringung von einzelnen Rostpusteln (Pflanze 2) für eine weitere

Selektion (Pflanze 3) wurden die Sporen trocken auf mit Fungizid vorbehandelte Blätter

gegeben und mit einer Pipettenspitze oder einem Laborlöffel auf dem Blatt verteilt.

Abbildung 2.2: Selektionsschema in planta. Ausführliche Erklärung siehe Abb. 3.10.


2.5 Molekularbiologische Methoden

2.5.1 DNA-Präparation

2.5.1.1 Aus Pflanzenmaterial

Die DNA Isolation aus gesundem oder mit U. fabae infiziertem Blattmaterial wurde mittels

Chelex-Methode durchgeführt. Dafür wurde das Pflanzenmaterial in flüssigem N2 10 min

gemörsert und anschließend mit 500 µl 10 % Chelex100 (Bio-Rad Laboratories GmbH,

München) versetzt. Die Proben wurden für 60 min bei 65 °C inkubiert und anschließend für 5

min auf 95 °C erhitzt. Nach einer Zentrifugation bei 14 000 rpm (Eppendorf-Tischzentrifuge,

Vmax) wurde der Überstand abgenommen und die DNA-Konzentration in BioPhotometer

(Eppendorf, Hamburg) bestimmt. Die Aufbewahrung der Proben für die weitere Verwendung

erfolgte bei 4 °C.

2.5.1.2 Aus ungekeimten Sporen

Bei kleineren Sporenmengen wurden die Sporen in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß

überführt und in einer Kugelmühle homogenisiert. Dafür wurden je 2 Keramikkugeln (5 mm

Durchmesser) pro Reaktionsgefäß verwendet und die Proben für 3 bis 4 min bei maximaler

Geschwindigkeit in einer Kugelmühle (Retch MM, 1/30 S) geschüttelt. Der

Homogenisierungsgrad bzw. das Aufbrechen der Sporen wurde mikroskopisch überprüft. Die

DNA-Präparation aus aufgebrochenen Sporen wurde mit dem InnuPREP Plant DNA Kit

(Analytik Jena) nach dem Standardprotokoll durchgeführt. Die Proben wurden nach der

Elution der DNA in einer SpeedVac eingeengt und eine DNA-Konzentrationsmessung

durchgeführt.

2.5.1.3 Aus gekeimten Sporen

Bei größeren Sporenmengen (> 100 mg) wurde die Präparation genomischer DNA nach der

von Hahn und Mendgen etablierten Methode (1997) durchgeführt.

Nach Hydrierung für mehrere Stunden unter starkem Rühren wurden gekeimte Sporen für

10 min in flüssigem Stickstoff im gekühlten Mörser zu einem feinen Pulver zerrieben und in

SS34 Zentrifugenröhrchen überführt. Nach der Zugabe von 5 ml TES (100 mM Tris-HCl, 10


mM EDTA, 2 % SDS, pH 8) und 50 µg in Wasser gelöster RNAse A wurde die Mischung kräftig

geschüttelt und bei 37 °C für 60 min inkubiert. Danach wurde 75 µg Proteinase K zugegeben

und für 60 min bei 58 °C inkubiert. Die Suspension wurde gemischt und anschließend

zentrifugiert (5 min, 3000 g), der Überstand mit 5 ml Phenol (pH 8) versetzt und die

Phasentrennung durch Zentrifugation (5 min, 3000 g) herbeigeführt. Der Schritt wurde mit 5

ml Phenol/Chloroform (1:1) wiederholt und die obere wässrige Phase zur DNA-Fällung in ein

neues Röhrchen überführt. Die Fällung wurde mit 1/10 Volumen NaOAC (pH 5,2) und 1

Volumen Isopropanol für 30 min bei 4 °C durchgeführt. Durch eine Zentrifugation (5 min,

23000 g, 4 °C) wurde die DNA pelletiert und mit 2 ml 70 % Ethanol gewaschen. Nach dem

Waschschritt wurde die genomische DNA für 15 min bei RT getrocknet und schließlich in 0,2

ml Wasser gelöst. Die Aufbewahrung der DNA-Proben erfolgte bei 4 °C.

2.5.1.4 Amplifikation genomischer DNA mit REPLIg

Konnten nur geringe DNA Mengen aus wenigen Sporen (einer Rostpustel) isoliert werden,

wurde die präparierte DNA mit dem REPLIg-Kit (REPLI-g Mini Kit, QIAGEN GmbH, Hilden)

amplifiziert. Dafür wurden 25 ng genomischer DNA (U. fabae) verwendet und nach

Herstellerangaben (REPLI-g® Mini/Midi Handbook, Qiagen) amplifiziert. Die vervielfältigte

DNA wurde ohne Konzentrationsmessung in einer Verdünnung 1:10 und 1:100 für die PCR

verwendet.

2.5.1.5 Plasmidpräparation aus E. coli

Für Plasmid-DNA Präparationen wurde das E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit II (Peqlab,

Erlangen) verwendet. Die Bakterienkulturen wurden in Selektivmedium bei 37 °C angezogen

und nach Herstellerangaben zur DNA-Präparation verwendet.

2.5.1.6 DNA-Konzentrationsmessungen

Eine Messung der DNA Konzentration erfolgte in einem BioPhotometer (Eppendorf,

Hamburg) bei 260 und 280 nm. Die Reinheit der DNA Proben wurde durch den Quotienten

OD 260/280 bestimmt.

2.5.2 PCR-Methoden

Die Polymerase Kettenreaktion (Saiki et al. 1988; Sambrook und Russel 2001) wurde für den

Nachweis von Gensequenzen in Plasmiden, genomischer DNA von U. fabae sowie


transformierten Bakterien verwendet. Dabei wurden drei Protokolle für Standard-, Nested-

und Kolonie-PCR verwendet, die in folgenden Abschnitten beschrieben werden.

2.5.2.1 Oligonukleotide

Die für diese Arbeit verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 2.7 zusammengefasst

Tabelle 2.7: Verwendete Oligonukleotide.

Name Sequenz (5' – 3') Verwendung

PMA1T.F1 TTG CGG CCG CTA CTT CCC CAG ATG TCC Klonierung

PMA1T.R1 TTT GAG CTC GCT ACA GCC TGG AGT CAC AAT Klonierung

PMA1P.F1 TTT CCC GGG CGC AGA ATT TTG AAA CTT G Klonierung

PMA1P.R1 TTC CAT GGT GAT TAG TAA TTA AGA GAT GAT Klonierung

GUS-5-NcoI CCA TCC ATG GTA CGT CCT GTA GAA ACC CCA AC Klonierung

GUS-3-NotI GGA TGC GGC CGC GAG AGT TGT TGA TTC ATT G Klonierung

GFP-Intron-NcoI CCA TCC ATG GCG GTC AGT ACA CCA CAC AGC Klonierung

GFP-Intron-NotI GAG TCG CGG CCG CTT ACT TGT ACA GCT CGT CC Klonierung

DsRed-Fwd CGC CAC CAT GGC CTC CTC CGA GGA CGT C Klonierung

DsRed-Rev GAG TCG CGG CCG CTA CAG GAA CAG GTG G Klonierung

SucDH-5-BspHI CCA TTC ATG ATC AAC ATT CCG AAT TC Klonierung

SucDH-3-NotI GGT AGC GGC CGC CAT TTC AGG CTG ATG CCA TC Klonierung

SucDH-H254Y-Rev GAA AAT TGT GTA ACA TCT GTA G Mutation H254Y

SucDH-H254Y-Fwd CTA CAG ATG TTA CAC AAT TTT C Mutation H254Y

SucDH-H254L-Rev GAA AAT TGT GAG ACA TCT GTA G Mutation H254L

SucDH-H254L-Fwd CTA CAG ATG TCT CAC AAT TTT C Mutation H254L

NLS-Fwd CAT GGT CGA GCC TCC AAA AAA GAA GAG AAA GGT CGA ATT CGC

Klonierung

NLS-Rev CAT GGC GAA TTC GAC CTT TCT CTT CTT TTT TGG AGG CTC GAC

Klonierung

PGP-F GAT CCT CGA GCG CTA CAG CCT GGA GTC AC Klonierung

PGP-R GAT CCT CGA GCG CAG AAT TTT GAA ACT TGA G Klonierung

3534-3 GAC AAA AAG TAC AAA CCG CCC Klonierung

SucDH4 GAT GGT GTC AAC ACG CTG GC Klonierung

114-F1 CTG AAG ATG GCT GTT TAC C Nested PCR

114-F2 CCC GCA ACC GAT GAC AAC G Nested PCR

114-R2 GTT TTC AAT TTA ATC ACA AG Nested PCR

3534-1 GTG TCT TCT ATT GCT AAA CTT G Nested PCR


SucDH1 GGG TGG CAA AAG AGG ATG AG Nested PCR

pPMA1_rev GTCCATTCCCCATCCGTTG Nested PCR

SucDH3-2 GGT GTC TTC GCT TCA TTT C SB Sonde

H130.R1 CAG TTA CTG GTG GAA TCA AGA TG SB Sonde

Uf-PMA1gen Fwd 1 GAG TAG TTC CGA GTT GGT G Nested PCR

Uf-PMA1gen Rev 1 GTA CTT CAC TGC TTT CTC TGC Nested PCR

Uf-PMA1gen Fwd 2 CAC TTG TCT TGG CGC TCT G Nested PCR

Uf-PMA1gen Rev 2 GCG GAA GGA GAA TCA CAA AG Nested PCR

RB_Fwd_1 GTC GTT TCC CGC CTT CAG Nested PCR

RB_Fwd_2 GAC AGG ATA TAT TGG CGG G Nested PCR

pBIN20 Rev1 CGG ATC ACT GTA TTC GGC TG Nested PCR

pBIN20 Rev2 CAA TCG GAC CAG CGG AGG Nested PCR

SucDH1 nested forward 1 CTT GTT CAA TGT AGA TGG ATG G SNP-PCR

SucDH1 SNPrev1 CAA GAG ACA CCA ATG AAG CC SNP-PCR

SucDH1 SNPrev2 GCT TTA GCA CCA GGC AGT G SNP-PCR

SNP Primer Suc GCT CTC TCT CTA CAG ATG TT SNP-PCR

SNP Suc WT GCT CTC TCT CTA CAG ATG TC SNP-PCR

2.5.2.2 Standard und Nested-PCR

Für einen Nachweis bekannter Sequenzen in Plasmiden, nach Transformationsexperimenten

sowie zur Herstellung von der DNA Amplifikate für Southern Blot-Sonden wurde die

Polymerase Kettenreaktion (Saiki et al. 1988; Sambrook und Russel 2001) angewandt. Die

dafür verwendeten Komponenten sind in Tabelle 2.8 zusammengefasst.

Tabelle 2.8: Standardprotokoll für PCR-Reaktion.

Komponente Endkonzentration

10x Taq-Puffer (100mM (NH4)2SO4) 1x

MgCl2 2,5 mM

BSA 10 µg

dNTPs 0,2 mM

Primer 5 0,5 µM

Primer 3 0,5 µM

Taq-DNA-Polymerase (Fermentas) 0,05 U/µl

H2O Millipore variabel

Template (DNA 20-500 ng) variabel


Die Amplifikation von DNA-Fragmenten wurde in einer Standard PCR-Reaktion mit dem High

Fidelity PCR-Enzyme Mix (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) durchgeführt. Die dazu

verwendeten PCR-Programme (UNIV), variierten in der Annealing-Temperatur abhängig von

der Primer-Hybridisierungstemperatur sowie in der Elongationszeit je nach Größe des zu

amplifizierenden Fragments (30 sec/500 bp). Weitere Faktoren sind Tab. 2.9 zu entnehmen.

Tabelle 2.9: PCR Univ Programme.

Schritt Temperatur [°C] Dauer [min]

1. Denaturierung 95 3:00

2. Denaturierung 95 0:30

3. Annealing 50-65 0:30

4. Elongation 72 0:30-4:00

5. Wiederholung der Schritte 2.-4. (bis 30x)

6. Endelongation 72 3:00

7. Kühlung 8

2.5.2.3 Nested-PCR

Bei geringen DNA-Mengen (< 100 ng) wurde eine geschachtelte Standardreaktion, eine

sogenannte Nested-PCR, durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte aus der ersten PCR

wurden als Template (1:10 bis 1:100 verdünnt) für die zweite Reaktion verwendet. Dabei

wurde Schritt 5. (Tab. 2.9) variiert (19 Zyklen in Reaktion 1 bzw. 29 Zyklen für Reaktion 2).

2.5.2.4 Kolonie-PCR

Für die Überprüfung des Transformationserfolgs bei E. coli bzw. A. tumefaciens wurde eine

Kolonie-PCR durchgeführt. Dafür wurde eine kleine Menge Zellen mittels eines sterilen

Zahnstochers aus einer Bakterienkolonie entnommen und in den PCR-Ansatz (Tab. 2.8)

überführt. Anschließend wurde die PCR Reaktion (Tab. 2.9) durchgeführt.

2.5.2.5 SNP-PCR

Bei Vorliegen eines Einzelnukleotid-Polymorphismus (single nucleotide polymorphism (SNP))

wie bei der mut-SucDH1-Variante, wurde für die Unterscheidung zwischen Wildtyp- und


Transformanten-DNA die SNP-PCR angewandt (Ye et al. 2001). Dabei wurde ein modifiziertes

Protokoll für eine Nested-PCR erarbeitet (s.a. Abb. 3.18), in welchem in der ersten PCR-

Reaktion ein spezifisches Fragment der SucDH1 mit den Oligos SucDH1 nested forward 1 und

SucDH1SNPrev1 amplifiziert wurde. Das Amplikon aus der ersten Reaktion wurde als

Template für den SNP-spezifischen Schritt mit den Oligos für den WT-SucDH1 (SNP_Suc WT

und SucDH1 SNPrev2) sowie mut-SucDH1 in potentiellen Transformanten (Oligos SNP_Suc

und SucDH1 SNPrev2). Die Reaktion wurde als Nested PCR mit modifizierten Standard-

Programmen (Tab. 2.9) durchgeführt. Die amplifizierte DNA aus der PCR 1 wurde für die

zweite Reaktion 1:10 verdünnt und davon 2 µl in die PCR 2 überführt.

2.5.2.6 Reinigung von PCR Produkten und DNA aus Restriktionsansätzen

Für die Aufreinigung der DNA aus PCR-Ansätzen wurde das DNA Clean&Concentrator TM -5

Kit (Zymo Research Corp., Orange, USA) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach

Herstellerangaben.

Die Aufreinigung von größeren Mengen an genomischer DNA nach Behandlung mit

Restriktionsenzymen wurde durch eine NaOAc/EtOH-Fällung (Natriumacetat pH 5,2) üN

durchgeführt.

2.5.2.7 Sequenzierung von PCR Produkten

Die Sequenzierung von PCR Produkten und Plasmiden wurde durch die Firma GATC Biotech

AG (Konstanz) durchgeführt. Die Vorbereitung der DNA-Proben erfolgte nach

Firmenangaben.

2.5.3 Agarosegel-Elektrophorese

Die Größe und das Vorhandensein der amplifizierten DNA Fragmente in einer PCR-Reaktion

wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese überprüft (Sambrook und Russel 2001). Dabei

variierte die Konzentration der Agarose (Agarose NEEO Ultra-Qualität, Carl Roth GmbH + Co.

KG, Karlsruhe) in den Gelen zwischen 0,8 und 2 % (w/v) in 1x TAE Puffer (40 mM TrisBase,

1,14‰ Eisessig, 1 mM Na-EDTA, pH 8). Die PCR-Proben wurden mit 6x Loading Dye

(Fermentas, 10 mM Tris-HCl, 0,03 % Bromphenolblau, 0,03 % Xylencyanol FF, 60 % Glycerin,

60 mM ETDA) versetzt und für die Auftrennung in die Geltaschen pipettiert (0,2x


Probenvolumen), wobei als Größenstandard der GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder (0,5 mg

DNA/ml, Fermentas) oder GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (0,5 mg DNA/ml, Fermentas)

verwendet wurde. Als Laufpuffer wurde 1x TAE verwendet, die Elektrophorese erfolgte bei

einer Stromspannung von 60 V für Southern Blot- bzw. 100 V für Standard PCR Gele. Die

Gele wurden anschließend für 10-20 min in einem Ethidiumbromidbad (2 mg/l) schüttelnd

inkubiert. Nach 10minütigen Waschen der Gele in einem Wasserbad wurden die DNA-

Fragmente unter UV-Anregung mit Hilfe eines Molecular Imager ® GelDoc TM XR-System

(Bio-Rad Laboratories GmbH, München) sichtbar gemacht und dokumentiert.

2.5.4 Klonierung von DNA

2.5.4.1 DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen

Für die Linearisierung der verwendeten Plasmide, das Schneiden von Genomischer DNA für

Southern Blot-Analysen sowie zur Klonierung von PCR Produkten und Plasmidsequenzen

wurde ein DNA-Verdau mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen durchgeführt (Sambrook

und Russell 2001). Die in dieser Arbeit verwendeten Enzyme sind in Tab. 2.10 aufgelistet. Die

Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben. Die Inaktivierung der Enzyme erfolgte durch

eine Inkubation bei 65 oder 80 °C für 20 min. Die verdaute DNA wurde anschließend

aufgereinigt und für weitere Arbeiten verwendet. Bei Plasmiden, die für Klonierungen

linearisiert wurden, erfolgte eine anschließende Behandlung mit SAP (Shrimp Alkaline

Phosphatase, USB Europe GmbH, Staufen) um eine Religation zu verhindern. Die

Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben für 1 h bei 37 °C, gefolgt von einer

Inaktivierung für 20 min bei 65 °C. Die DNA Proben wurden anschließend erneut

aufgereinigt.

Tabelle 2.10: Verwendete Restriktionsenzyme.

Enzym Hersteller

BamHI Fermentas, St. Leon-Rot

EcoRI Fermentas, St. Leon-Rot

EcoRV Fermentas, St. Leon-Rot

HindIII Fermentas, St. Leon-Rot

NcoI Fermentas, St. Leon-Rot


NotI Fermentas, St. Leon-Rot

SacI New England Biolabs GmbH, Frankfurt

XhoI Fermentas, St. Leon-Rot

XmaI New England Biolabs GmbH, Frankfurt

2.5.4.2 Ligation verdauter DNA

Die mit Restriktionsenzymen verdauten DNA-Fragmente und Vektoren wurden mit T4 DNA-

Ligase (1 Weiss-Unit/µl, Fermentas, St. Leon-Rot) ligiert. Die Reaktion wurde nach

Herstellerangaben über Nacht bei 16 °C durchgeführt. Eine anschließende Inhibierung der

DNA Ligase erfolgte bei 65 °C für 20 min. Die hergestellten Konstrukte wurden ohne

Aufreinigung für die Transformation von E. coli verwendet.

2.5.5 Kompetente Zellen und Transformation

2.5.5.1 E. coli SEM-kompetente Zellen

Chemisch kompetente Zellen wurden nach dem SEM-Protokoll hergestellt (Simple and

Efficient Method; Inoue et al. 1990). Dafür wurden 5 ml einer E. coli üN-Kultur in 250 ml

SOB-Medium überführt und bei 18-24 °C und 180 rpm kultiviert bis OD600 von 0,55-0,6

erreicht war. Anschließend erfolgte eine Abkühlung der Zellen für 10 min auf Eis und eine

Zentrifugation für 10 min bei 2500x g und 4 °C. Der Überstand wurde verworfen und das

Pellet in 80 ml eiskaltem Transformationspuffer (TB), (10 mM Pipes-Na2, 15 mM CaCl2 , 250

mM KCl, 55 mM MnCl2, pH 6,7) resuspendiert. Die Zellen wurden erneut 10 min auf Eis

gekühlt und anschließend wie oben beschreiben zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des

Überstandes wurde das Pellet in 20 ml eiskaltem TB aufgenommen und DMSO (7 %

Endkonzentration) zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation auf Eis für 10 min wurden

500 µl-Aliquots in Flüssigstickstoff schockgefroren. Die Lagerung der kompetenten DH5 E.

coli Zellen erfolgte bei -70 °C.


2.5.5.2 Hitzeschocktransformation

SEM-kompetente Zellen (100 µl) wurden in vorgekühlte 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt

und mit 5 µl Ligationsansatz gemischt. Anschließend wurde 15 min auf Eis inkubiert und

danach ein Hitzeschock (90 sec. bei 42 °C) durchgeführt. Erneuert erfolgte eine Inkubation

auf Eis für 5 min und die abschließende Zugabe von 900 µl LB-Medium. Dieser Ansatz wurde

1 h bei 37 °C inkubiert bevor zwischen 100-300 µl Bakteriensuspension auf entsprechende

Selektionskulturplatten ausgebracht und üN bei 37 °C inkubiert wurde.

2.5.5.3 Agrobacterium tumefaciens elektrokompetente Zellen

100 µl einer A. tumefaciens üN-Kultur (28 °C, 270 rpm) wurden in 250 ml LB-Medium mit

dem entsprechenden Antibiotikum gegeben und bei 28 °C und 270 rpm kultiviert bis eine

OD600 = 0,5 erreicht war (üN, jedoch nicht länger als 12 Stunden). Am nächsten Tag wurden

die Zellen für 15-30 min auf Eis gekühlt, in vorgekühlte GSA-Zentrifugenröhrchen überführt

und zentrifugiert (15 min, 4000x g, 4 °C). Alle darauf folgenden Schritte wurden auf Eis

durchgeführt. Nach dem Verwerfen des Überstandes wurde das Pellet wie folgt gewaschen:

Waschschritt 1: 500 ml 1 mM HEPES pH 7,4, Waschschritt 2: 250 ml 1 mM HEPES pH 7,4 und

Waschschritt 3: 10 ml 1 mM HEPES pH 7,4. Zwischen den Waschschritten erfolgte eine

Abnahme des Überstandes und eine Zentrifugation bei 4 °C, 4000x g für 15 min. Nach dem

letzten Waschschritt wurden die Zellen in SS-34-Röhrchen überführt und erneuert wie oben

beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 2 ml eiskaltem 10 %

Glycerin resuspendiert und zu 40 µl aliquotiert. Nach Schockfrieren in flüssigen Stickstoff

wurden die kompetenten Agrobakterien bei -70 °C gelagert.

2.5.5.4 Transformation durch Elektroporation

Elektrokompetente Bakterienzellen wurden auf Eis aufgetaut und 40 µl in eine vorgekühlte

Elektroporationsküvette (Peqlab, Erlangen) pipettiert. Dazu wurde 1 µl des gewünschten

Plasmids gegeben, gemischt und auf Eis gehalten. Die Elektroporation erfolgte mit einem

Elektroporationsgerät (Gene PulserTM, Bio-Rad Laboratories GmbH, München) mit den

Einstellungen: 200 Ω, 2,5 kV und 25 µF. Unverzüglich danach wurde 1 ml LB-Medium

zugegeben, der Ansatz in 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und 1 h bei Raumtemperatur

inkubiert. Die Transformationsansätze wurden danach zu 10 µl bzw. 100 µl auf


entsprechendes Kulturmedium ausgebracht und für zwei Tage bei 28 °C inkubiert. Die

Kolonien wurden mittels Kolonie-PCR getestet.

2.5.6 Southern Blot

Für eine zusätzliche Untersuchung der Integration der transformierten Zielgene in das U.

fabae-Genom wurden Southern Blot Analysen durchgeführt. In dieser Arbeit wurden für die

Detektion der DNA Signale zwei Markierungstechniken verwendet: 1) Labeling durch

Digoxigenin (DIG-11-dUTP, Roche, Mannheim. und 2) radioaktive Markierung mittels [alpha

32P]-dATP (Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig).

2.5.6.1 Herstellung von DIG-markierten Sonden

In einer Standard-PCR wurden 200 ng genomischer DNA mit 25 mM dNPTs amplifiziert, bei

denen 30 % des dTTP durch DIG-dUTP (Digoxigenin-11-2’-deoxy-uridin-5’-triphosphat,

alkalilabil) ersetzt waren. Die Sonden wurden für eine Wiederverwendung bei -20 °C

aufbewahrt.

2.5.6.2 32P-markierte Sonden

Für die radioaktive Markierung der DNA wurde ein modifiziertes Protokoll (Tab. 2.11) für die

Markierung mit dATP, [alpha 32 P]- (Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig) angewandt.

Tabelle 2.11: Herstellung 32P-markierter Sonden.

Komponente Endkonzentration

10x Taq-Puffer (100mM (NH4)2SO4) 1x

MgCl2 2,5 mM

-32P-dATP (3000 Ci/mmol) 50 µCi

dGTC-TP Mix 40 µM

dATP (non radioactive) 20 µM

Primer 5 1 µM

Primer 3 1 µM

Taq-DNA-Polymerase (Fermentas) 0,1 U/µl

H2O Millipore variabel

Template (DNA 200 ng) variabel


2.5.6.3 Vorbereitung und DNA-Transfer

Die für Southern Blot-Analysen verwendete genomische DNA (10-60 µg) wurde mit

Restriktionsenzymen üN verdaut und anschließend aufgereinigt (siehe 2.5.2.6). Vor dem

Auftragen auf Agarose-Gele (0,8 %) wurde den Proben 6x Loading Dye (Fermentas, St. Leon-

Rot, Deutschland) zugegeben und die DNA anschließend bei 60 V für 4 h aufgetrennt. Das

Gel mit der aufgetrennten DNA wurde für 20 min in Ethidiumbromid (2 mg/l) gefärbt und in

Wasserbad für 15 min entfärbt. Eine Dokumentation erfolgte unter UV-Licht mit angelegtem

Lineal. Zur Hydrolyse großer DNA Fragmente wurde ein Waschschritt für maximal 10 min in

0,25 M HCl durchgeführt, wonach eine Denaturierung für zweimal 15 min in 0,5 M NaOH, 1,5

M NaCl folgte. Das Gel wurde dann zum Neutralisieren zweimal bei RT für 15 min in 0,5 M

Tris/HCl pH 7,5, 3 M NaCl inkubiert. Alle Waschschritte erfolgten auf einem

Horizontalschüttler und nach jedem Zwischenschritt wurde das Gel kurz in H2O geschwenkt.

Der DNA-Transfer wurden nach Southern durchgeführt (Southern 1975) wobei in einem

„upward“-Kapillartransfer die DNA aus dem Gel auf eine Hybond N+-Nylonmembran (GE

Healthcare, München) transferiert wurde. Als Transferpuffer wurde 10x SSC (1,5 M NaCl, 150

mM Na-Citrat, pH 7) verwendet. Der Transfer erfolgte üN. Eine Fixierung der DNA auf der

Membran wurde durch backen bei 120 °C für 30 min erreicht. Die Transfereffizienz wurde

unter UV-Licht kontrolliert.

2.5.6.4 Hybridisierung und DNA Detektion

Digoxigenin-markierte Sonden

Vor einer Hybridisierung mit DIG-markierten Sonden wurde eine Prähybridisierung

durchgeführt. Dafür wurde die mit DNA beladene Membran für 2 h in 40 ml

Prähybridisierungslösung (0,25 M Natriumphosphatpuffer, pH 7, 1 mM EDTA, 0,5 % Blocking

Reagenz (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim), 17,5 % SDS) bei 58-65 °C in einem Hybridi-

sierungsofen rollend inkubiert. Die anschließende Hybridisierung erfolgte üN in 10 ml vorher

aufgekochter Hybridisierungslösung (2,5 µl DIG-markierte Sonde in 10 ml

Prähybridisierungslösung) ebenfalls rollend im Hybridisierungsofen mit gegebener

Hybridisierungstemperatur. Am nächsten Tag wurde die Membran gewaschen und für die

Detektion vorbereitet. Hybridisierungslösung wurde für nochmalige Verwendung bei -20 °C

aufbewahrt. Die Waschschritte erfolgten auf einem Horizontalschüttler und wurden wie


folgt durchgeführt. Nach 10 minütigen Waschen in Waschpuffer (0,1 % SDS, 2x SSC) bei

gegebener Hybridisierungstemperatur folgte mehrmaliges Waschen für 20 min und RT im

gleichen Waschpuffer. Danach wurde die Membran für 5 min in MAB (0,1 M Maleinsäure, 3

M NaCl, 0,3 % Tween20, pH 8,0) geschwenkt. Es folgte eine Inkubation für 60 min bei RT in

Blockierungspuffer (MAB, 0,5 % oder 1 % Blocking Reagenz). Durch eine Inkubation (30 min,

RT) in 1:15000 verdünnter Lösung mit Anti-DIG-Antikörper gekoppelter alkalischer

Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim), wurde die DIG-Sonde auf der Membran

markiert. Die Membran wurde anschließend 4x für je 10 min bei RT in MAB gewaschen. Es

folgte eine Inkubation (5 min, RT) in Substratpuffer (0,1 M Tris/HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl). Für

die anschließende Detektion mit CSPD-Lösung (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) wurde

die Membran auf eine Folie gelegt, mit CSPD-Lösung (10 µl CSPD in 10 ml Substratpuffer)

benetzt und abschließend eingeschweißt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 30 min. Im

Dunkeln wurde ein Hyperfilm ECL (GE Healthcare, München) auf die Membran gelegt und für

1 h bis mehrere Tage exponiert. Mit Hilfe eines Entwicklungsautomaten (SRX-201, Konica,

München) wurden die exponierten Filme entwickelt und ausgewertet.

32P-markierte Sonden

Für eine radioaktive Markierung der DNA Proben wurde Protokoll nach Mertz und

Rashtchian, 1994 angewandt. Alternativ wurden verschiedene Variationen von

Hybridisierungspuffer und Waschschritten der Membran ausgetestet.

2.6 Mikroskopische Methoden

Zur Überprüfung der Sporenkeimung in vitro sowie nach Transformation der Uredosporen

mit Farbmarker-Konstrukten wurden Licht- und Fluoreszenzmikroskopie angewandt.

2.6.1 Durchlichtmikroskopie

Die Keimungs- oder Homogenisierungsrate der Uredosporen wurde mit Hilfe von Durchlicht-

mikroskopie überprüft. Dafür wurde ein Zeiss Axioskop 50 Mikroskop ausgestattet mit Plan-

NEUFLUAR 16/0,5 (Zeiss, Göttingen) und F140/1,30 Öllinsen (Leitz, Wetzlar) verwendet. Für


Aufnahmen der Präparate wurde eine MC 80 Kamera (Zeiss) sowie der Diafilm Precisa CT

100 oder 200 ASA (Agfa-Gevaert AG, Leverkusen) verwendet.

2.6.2 Fluoreszenzmikroskopie

Screens für Transformanten, die DsRed- oder GFP-Konstrukte trugen wurden mit einem Zeiss

Axioplan 2 Mikroskop (Karl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen) durchgeführt. Die

verwendeten Filtersätze waren Exciter: HQ 565/30, Emitter: HQ620/60, Beamsplitter: Q581p

für DsRed und der GFP-Filtersatz Excitation: 545/30, Emission: 610/75, Beamsplitter: 565 LP.

Für die Bilddokumentation wurde die Axio Vision LE Release 4.5 Software (Zeiss) verwendet.

2.7 Verwendete Software

Die für Durchführung und Datenauswertung verwendeten Computerprogramme (Software)

sind in Tabelle 2.12 aufgeführt.

Tabelle 2.12: Auflistung der verwendeten Software.

Programm Quelle Verwendung

AdobeAcrobat X 10

Adobe Systems, Mountain View, USA Textbearbeitung

Axio Vision LE 4.5 Karl Zeiss, Göttingen Bildbearbeitung

Corel Draw 12 Corel Corporation, Unterschleißheim Bildbearbeitung

BioEdit Hall 1999; http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html

DNA-Sequenzen

DNASTAR Paket DNAstar Inc., Madison, USA DNA-Sequenzen

EndNoteX Thomson ISI Research Soft, Berkeley, USA Literatur-Datenbank

Gene Runner 3.05 Hastings Software, Inc., Hudson, USA DNA-Sequenzen

GraphPad Prism 3.00

GraphPad Software, San Diego, US Statistik und Grafik

Microsoft Office 2007

Microsoft Corporation, Unterschleißheim Text-/Bildbearbeitung

Mozilla Firefox Mozilla Foundation, Mountain View, USA Web browser

pDRAW32 AcaClone Software, http://www.acaclone.com

DNA-Sequenzen

Quantity One 4.0 Bio-Rad Laboratories GmbH, München Geldokumentation

R 2.15.1 The R Foundation for Statistical Computing, USA Statistik

ERGEBNISSE 34

3. Ergebnisse

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Transformationsmethoden, Biolistik und

Agrobakterien vermittelte Transformation (Agrobacterium tumefaciens-mediated

transformation (ATMT)) erarbeitet, um eine stabile Transformation des obligat biotrophen

Rostpilzes Uromyces fabae zu erzielen. Diesem Vorhaben lag die Tatsache zu Grunde, dass

für diesen Rostpilz bisher keine erfolgreiche stabile Transformation erreicht werden konnte.

3.1 Auswahl der Methoden für die Transformation von Uromyces fabae

Anfängliche Versuche einer Transformation von U. fabae mittels Elektroporation waren ohne

Erfolg, weshalb andere methodische Verfahren ausgewählt werden sollten. Berichte über

eine erfolgreiche transiente Transformation anderer Rostpilze mittels Biolistik (Bhairi, et al.

1992; Schillberg, et al. 2000) führten zu einer Anpassung dieser Methode auf U. fabae. Eine

weitere Methode, die bei vielen filamentösen Pilzen als effizientere hinsichtlich der Anzahl

der Transformanten beschrieben wurde, ist die Agrobakterien-vermittelte Transformation.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit zwei Methoden, Biolistik und ATMT parallel gearbeitet.

Dafür wurde ein Set von Plasmiden konstruiert, die eine Selektion potentieller

Transformanten ermöglichen sollten. Zur besseren Übersicht werden die Ergebnisse nach

diesen zwei Methoden gegliedert.

3.2. Plasmidkonstrukte für die Transformation

Alle in dieser Arbeit benutzten Plasmidkonstrukte wurden wie in 2.3.1 beschrieben

hergestellt. In Tabelle 3.1 sind Plasmidkarten abgebildet, die zur weiteren Verdeutlichung

dienen sollen.

ERGEBNISSE 35

Tabelle 3.1: Verwendete Plasmidkonstrukte für die Transformation von U. fabae. Biolistik (A) und A. tumefaciens-mediated Transformation, ATMT (B). 1)Plasmide pRV111 und pRV112 vergleichbar mit pRV113 und pRV114 (SucDH1(H254L)).

[A] Biolistik [B] ATMT

[A] pSW3386 (7930 bp) pRV103 (6467 bp) pSW3534 (5363 bp) pRV117 (5429 bp) pRV115

(5319 bp) pRV1111)

(5884 bp) pRV111::DsRed (8285 bp)

[B] pRV101 (17009 bp) pRV104 (15360) -- -- pRV116

(14440 bp) pRV1121)

(14777 bp) pRV112::DsRed (17178 bp)

[a-1]

pPMA1 tPMA1

5 TR 3 TR

[b-1; b-2; b-3; b-4; b-5]

RBLB

pBS II KS

2,9 kb

pBIN20

12,0 kb

TBB1(E198A)

GUS

GFP

iGFP

DsRed

SucDH1(H254Y)

[a-1] 2000 bp

[b-1] 1822 bp

[b-2] 718 bp

[b-3] 784 bp

[b-4] 674 bp

[b-5] 1239 bp

[c-1] 1895 bp

ERGEBNISSE 36

3.3 Biolistische Transformation von U. fabae

Alle Versuche mit Biolistik wurden mit dem Standard PDS-1000/He System (Bio-Rad,

München) durchgeführt. 350 mg Uredosporen (4,6 x 107) wurden in 0,01 % Tween20 für 2

Stunden unter starkem Rühren hydriert und wie in 2.2.3.2 beschrieben für den Beschuss

vorbereitet. Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Parameter orientierten sich an den

Ergebnissen von Lenz 2005 (Tab. 3.2).

Tabelle 3.2: Parameter für Transformation von U. fabae mittels Biolistik. Für die Verbesserung der Transformationseffizienz wurden verschiedene Einflussgrößen geprüft (Lenz 2005). Optimale Parameter sind hervorgehoben.

Während bei der Verwendung von Wolfram als Microcarrier keine Transformation der

Uredosporen in vitro beobachtet werden konnte, war die Verwendung von 1 µM Gold bei

einem geeigneten Heliumdruck von 152 bar (2200 psi) erfolgreich. Die verwendete DNA-

Menge die auf einen Microcarrier geladen wurde, betrug 0,8 µg. Die Distanz zwischen

Microcarrier und Petrischale mit den hydrierten Uredosporen (Beschussdistanz) ist in der

Biolistik-Apparatur veränderbar und wurde zwischen 3 und 12 cm variiert. Nur bei einer

Beschussdistanz von 6 cm konnten Transformationsereignisse identifiziert werden (Lenz

2005).

3.4 Detektion der Transformationsereignisse in vitro

Für die mikroskopische Visualisierung der transformierten Uredosporen nach der Keimung

auf Objektträgern, wurde je nach verwendetem Marker die entsprechende Vorbehandlung

zur Mikroskopie durchgeführt. In folgenden werden die Ergebnisse des biolistischen

Beschusses mit Plasmidkonstrukten, die Farb- und Fungizidmarker tragen dargestellt.

Parameter Variation

Microcarrier (Typ und Durchmesser) [µm]

Gold, 1 Wolfram 0,4; 0,7

DNA-Menge pro Beschuss [µg] 0,8

Heliumdruck [bar] 62, 93, 107, 138, 152

Beschussdistanz [cm] 3, 6, 9, 12

Kammer-Vakuum [bar] 0,153

ERGEBNISSE 37

pRV103 (3)6467 bp

pPM A1

GU

S

tP

MA

1

[C]

Abbildung 3.1: GUS Trans-formation in vitro. A: Nach 18 h Keimung der Sporen mit anschließender Färbung für 3 Tage in GUS-Lösung; B: 2 Tage lange Färbung der Sporen in frisch angesetzter GUS-Färbelösung; C: Verwendetes Plasmid. Weißer Balken = 25 µm. Quelle: Lenz 2005.

[A]

[B]

3.4.1 Farbmarker Selektion

Nach dem Beschuss mit den Plasmidkonstrukten, die GUS-Farbmarker trugen (pRV103)

erfolgte eine GUS-Färbung (Schillberg et al., 2000), und für mit iGFP-Konstrukten

beschossenen Uredosporen eine Inkubation der Objektträger für 2 Stunden bei 37 °C vor der

Mikroskopie.

3.4.1.1 GUS-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae

Die Verwendung des ß-Glucuronidase-Nachweises bei erfolgreicher Transformation erwies

sich für das System als mühsam und mit hohem Verlust verbunden. Nach den Vorversuchen

zur Etablierung der optimalen biolistischen Parameter konnten wiederholt erfolgreiche U.

fabae Transformanten selektiert werden, die mit dem Plasmid pRV103 beschossen worden

waren (Lenz 2005). Die GUS-tragenden Transformanten (Abb. 3.1) wurden in vitro

erfolgreich vereinzelt gescreent.

ERGEBNISSE 38

pRV117 (3)5429 bp

tPM

A1

intr

on

GF

P

pPMA1

[A]

[B]

[C]

Die mit der Prozedur der GUS-Färbung verbundenen Verluste an lebendem Sporenmaterial

waren für die Überprüfung der Transformationseffizienz nicht akzeptabel, weshalb diese

Methode als ineffizient betrachtet wurde und auf weniger aufwendige Fluoreszenzfarb-

marker wie GFP und DsRed umgestellt wurde.

3.4.1.2 GFP-Farbmarker bei Biolistischen Transformation von U. fabae

Der Fluoreszenzfarbmarker iGFP in dem Plasmidkonstrukt pRV117 konnte erfolgreich in

keimenden Uredosporen identifiziert werden. Nach Inkubation der Objektträger mit den

gekeimten Uredosporen bei 37 °C für 2 h zeigen die mikroskopischen Aufnahmen (Abb. 3.2)

eine deutliche grüne Färbung der Uredosporen in vitro.

Abb. 3.2: iGFP Transforman-ten in vitro. Mikroskopische Aufnahmen von gekeimten Uredosporen nach einem Be-schuss mit pRV117 und 40x Vergrößerung. (A,B). Ver-wendetes Plasmid (C). Messbalken = 20 µm.

[C]

Abbildung 3.2: iGFP Trans-formanten in vitro. Mikro-skopische Aufnahmen von gekeimten Uredosporen nach einem Beschuss mit pRV117 und 40x Vergrößerung. (A,B). C: Verwendetes Plasmid. Weißer Balken = 20 µm.

ERGEBNISSE 39

Auf einigen gescreenten Objektträgern konnte eine starke Autofluoreszenz der Sporen

festgestellt werden so dass eine sichere Selektion der iGFP-Transformanten nicht in allen

Situationen gewährleistet war. Diese Objektträger wurden für die Bestimmung der

Transformationseffizienz nicht in Betracht gezogen. Eindeutig identifizierbare

Transformationsereignisse wurden auf allen Objektträger ausgezählt (Tab. 3.3)

Tabelle 3.3: Anzahl iGFP Transformanten von U. fabae in vitro. 4,4 x 105 Sporen pro Objektträger wurden gescreent.

Transformations-Ansatz

Anzahl iGFP-Transformanten

Transformationseffizienz

1

2

3

4

5

6 ± 4

13 ± 7

11 ± 5

8 ± 4

9 ± 6

1,4 x 10-5

2,9 x 10-5

2,5 x 10-5

1,8 x 10-5

2,0 x 10-5

3.4.1.3 DsRed-Farbmarker für die biolistische Transformation von U. fabae

Als weiterer Fluoreszenzfarbmarker für die Selektion von U. fabae-Transformanten wurde

DsRed gewählt. Auch wenn die Transformationseffizienz mit der iGFP Transformation

vergleichbar ist, ist ein Vorteil von DsRed, dass keine Vorbeihandlung der Objektträger für

mikroskopische Screens notwendig ist. Wie in Abbildung 3.3 dargestellt, konnte die rote

Fluoreszenz der ausgekeimten Uredosporen, die mit pRV115 beschossen worden waren,

eindeutig von nicht transformierten, farblosen WT-Keimschläuchen unterschieden werden.

Mehrere Objektträger wurden gescreent und die Mittelwerte der einzelnen

Transformationsansätze bestimmt (Tab. 3.4). Daraus ergab sich eine mittlere

Transformationseffizienz aller mit DsRed durchgeführten Ansätze von 2,9 x 10-5 (n = 30).

Tabelle 3.4: Anzahl der selektionierten DsRed-Transformanten in vitro.


Anzahl DsRed-Transformanten


1

2

3

4

5

20 ± 6

5 ± 3

18 ± 10

9 ± 4

12 ± 5

4,5 x 10-5

1,1 x 10-5

4,1 x 10-5

2,0 x 10-5

2,7 x 10-5

ERGEBNISSE 40

[A]

[B] pRV115 (1)

5319 bp

Ds

Re

d

pPM A1

tPM

A1

Um einen endgültigen Nachweis der realen Fluoreszenz in U. fabae-Keimschläuchen zu

erbringen, wurde das Plasmidkonstrukt pRV115-NLS verwendet. Durch die Fusion eines NLS-

Signals an die DsRed Sequenz und die anschließende biolistische Transformation konnte

gezeigt werden, dass die rote Fluoreszenz eindeutig in den Zellkernen lokalisierbar ist (Abb.

3.4).

Die Transformationseffizienz war im Durchschnitt vergleichbar mit den pRV115

Transformanten. Eine ausführliche Auszählung wurde jedoch nicht durchgeführt. Die längere

Exposition der Objektträger, die für Screens mit Fluoreszenzmikroskop und DsRed Filter

notwendig war, führte zum Platzen mehrerer rotleuchtender Zellkerne, was die genaue

Auszählung oder Berechnung der Transformationseffizienz verhinderte. Auch hier konnte

vereinzelt eine schwache Autofluoreszenz der Sporen festgestellt werden, was jedoch die

Screens für die pRV115-NLS Transformanten in keiner Weise beeinflusste.

Abbildung 3.3: DsRed Transfor-manten in vitro. (A,B): Gekeimte Uredosporen auf Objektträger be-schossen mit Plasmid pRV115 (C). Weißer Balken = 20 µm. Quelle: Lenz 2005.

[C]

ERGEBNISSE 41

pRV115-NLS (1)5361 bp

pPMA1

tPM

A1

NLS

Ds

Re

d

3.4.1.4 Fungizidmarker für die biolistische Transformation von U. fabae

Für die Überprüfung der Keimungshemmung von U. fabae wurden hydrierte Uredosporen

auf Objektträger aufgesprüht und für 3 h inkubiert. Anschließend wurden die Fungizide

Carboxin oder Benomyl appliziert und die Ansätze weiter üN inkubiert. Anschließende

mikroskopische Screens zeigten in beiden Fällen eine dosisabhängige Hemmung des

Wachstums der behandelten Sporen (Abb. 3.5), die steigende Wachstumshemmung

korrelierte mit der Erhöhung der Fungizidkonzentration. Phänotypisch konnten bereits

wenige Stunden nach der Applikation von 50 µg/ml Carboxin granulierte Strukturen bzw. ein

Absterben der Keimschläuche beobachtet werden. Bei niedrigerer Fungiziddosis konnten

noch vitale Keimschläuche gescreent werden. Die Benomylapplikation erfolgte in einer

Konzentrationsreihe zwischen 0,1 und 10 mg/ml.

[A]

[B]

Abbildung 3.4: DsRed-NLS Transformanten von U. fabae. (A,B): Kernlokalisierung mittels des NLS-Signals im DsRed-Plasmid (C). Weißer Balken = 20 µm.

[C]

ERGEBNISSE 42

gF

A

gF

A B

C D

E F

S

Erst bei einer Konzentration von 5 mg/ml konnte anhand der Granulierung der

Keimschläuche und der Stagnation des Wachstums eine etwa 10 %ige Hemmung der

Keimung beobachtet werden. Bei den restlichen 90 % der gekeimten Sporen dieser Variante

wurden unverändert Appressorien gebildet (Abb. 3.5, E). Die vollständige Unterdrückung der

Abbildung 3.5: Keimung von Uredosporen auf angerauter PE-Folie. Applikation von Carboxin und Benomyl auf gekeimte Uredosporen. A, B: Erfolgreiche Hemmung der Sporenkeimung nach dem Aufsprühen von 50 µg/ml Carboxin auf angerauter PE-Folie. C, D: mit Wasser behandelte Kontrolle. Behandlungen mit Benomyl E: 5 mg/ml und F: 10 mg/ml. S: Spore mit Keimschlauch; gF: angeraute Folie; A: Appressorium bildet sich auf der Erhebung von gF. Mikroskopische Aufnahmen mit Lichtmikroskop, Vergrößerung 40x.

ERGEBNISSE 43

Keimung mittels Benomyl konnte bei einer Konzentration von 10 mg/ml erzielt werden (Abb.

3.5, F).

3.4.1.5 Kombination der Farb- und Fungizidmarker bei Biolistischer Transformation von U.

fabae

Für eine spätere Selektion von U. fabae-Transformanten auf V. faba Pflanzen wurden

Plasmide konstruiert, die eine Kombination von Farb- (DsRed) und Fungizidmarker

(SucDH1(H254Y), TBB1) trugen. Die mit dem Plasmidkonstrukt pRV111::DsRed beschossenen

Uredosporen wurden auf Objektträgern auf positive Transformanten gescreent (Tab. 3.5.).

Die Transformationseffizienz war im Vergleich zum Einfachkonstrukt pRV115 (DsRed), mit

durchschnittlich 4,5 x 10-6 (zwei transformierten Sporen pro Objektträger bzw. 4,4 x 105

Sporen) niedriger. Unter den identifizierten rotleuchtenden Transformanten konnten vitale

Keimschläuche und die Bildung von Appressorien beobachtet werden (Abb. 3.6, A und B). Bei

einer Anwendung von 50 µg/ml Carboxin spiegelte sich das erwartete Bild aus den

Kontrolluntersuchungen mit Wildtypsporen auf aufgerauter PE-Folie wieder. Zusätzlich

konnten DsRed tragende Keimschläuche identifiziert werden, die bei einer Applikation des

Fungizids ihr Wachstum einstellten (Abb. 3.6 C und D). Nach der Ausbildung relativ kurzer

Keimschläuche waren die granulierten rotleuchtenden Infektionsstrukturen deutlich

erkennbar. Diese Beobachtungen lassen darauf schließen, dass es in den mit pRV111::DsRed

transformierten Uredosporen nur zur einer Expression der Farbmarker kam. Da die

Prozessierung der beschossenen DNA-Konstrukte in diesem Stadium nicht überprüft werden

konnte und die Uredosporen eindeutig DsRed enthielten, wurden diese Transformanten

nicht in die Auszählungen für die Transformationseffizienz einbezogen.

Tabelle 3.5: Anzahl von pRV111::DsRed-Transformanten in vitro. Auflistung der Transformations-effizienz auf den ausgewerteten Objektträgern.


Anzahl DsRed-Transformanten


1

2

3

4

5

1

3

1

2

3

2,3 x 10-6

6,8 x 10-6

2,3 x 10-6

4,5 x 10-6

6,8 x 10-6

ERGEBNISSE 44

pRV111::DsRed8285 bp

Su

cD

H

pPM

A1

tPMA

1

DsRed

pP

MA

1

tPMA1

Abbildung 3.6: Transformation mit Doppelkonstrukt pRV111::DsRed. Rot leuchtende Keimschläuche der Transformanten (A, B): mit ausgebildeten Appressorien an der Erhebung der aufgerauten PE-Folie in vitro nach Applikation von Carboxin. (C, D): Mit Fungizid behandelte Transformanten mit rotleuchtenden granulierten Keimschläuchen. E: Verwendetes Plasmid .Weißer Balken = 20 µm. E: Verwendetes Plasmid.

A B

C D

3.5 Etablierung der Selektion in planta

Die erfolgreiche Transformation von U. fabae in vitro, die bei allen verwendeten Farbmarker

bestätigt wurde, kann aufgrund der obligat biotrophen Lebensweise des Rostpilzes nur als

transient bezeichnet werden. Weil die Reproduktion und Vermehrung der Uredosporen nur

auf der Wirtspflanze V. faba stattfinden kann, wurde ein im folgenden beschriebenes

Schema zur Selektion der transformierten Rostpusteln entwickelt und für alle nachfolgenden

Versuche auf V. faba Pflanzen angewandt.

[E]

ERGEBNISSE 45

3.5.1 Fungizidmarker

Für Etablierung einer Methode zur stabilen Transformation von U. fabae wurden in planta

die Experimente unter Verwendung von Plasmidkonstrukten, welche Marker für die

Fungizide Carboxin (pRV111 und pRV113) und Benomyl (pSW3386) enthalten, durchgeführt.

Abbildung 3.7 zeigt die bei der Plasmidkonstruktion eingeführten Punktmutationen.

Abbildung 3.7: In genomische U. fabae DNA eingeführte Punktmutationen. A: An der Stelle H254Y und H254L mutierte Uf-SucDH1 (Plasmid pRV111 bzw. pRV113) vermittelt die Resistenz gegen das

Fungizid Carboxin. B: Durch Punktmutation in U. fabae -Tubulin (Uf-TBB1) an der Position E198A und Einführung der Sequenz in Plasmid pSW3386 (Wirsel et al. 2004) wurde die Voraussetzung für eine Benomyl-Resistenz gewährleistet.

3.5.1.1 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin

Für die vollständige Unterdrückung der Keimung und des Wachstums von U. fabae-

Wildtypsporen war eine bestimmte Konzentration der Fungizide Carboxin (50 µg/ml) und

Benomyl (10 mg/ml) notwendig um in vitro erzeugten Infektionsstrukturen gänzlich zu

hemmen (3.4.1.4). Es wurde daher für beide Fungizide die Konzentrationsabhängige Wirkung

auf Uredosporen getestet, die in Pflanzen aufgesprüht und zur Keimung gebracht wurden

(Abb. 3.8).

Uf-SucDH1 ~~~~~~~ AAGAGAAACT TCAGAACACG ACAGATGTCA CACAATTTTC ~~~~~~ pRV111 ~~~~~~~ AAGAGAAACT TCAGAACACG ACAGATGTTA CACAATTTTC ~~~~~~ pRV113 ~~~~~~~ AAGAGAAACT TCAGAACACG ACAGATGTCT CACAATTTTC ~~~~~~

*

[A]

[B]

Uf-TBB1 ~~~~~~~ TTATCGATAC AAAAAGTTTC ATCCGAGTTT TCAACCAATT ~~~~~~ pSW3386 ~~~~~~~ TTATCGATAC AAAAAGTAGC ATCCGAGTTT TCAACCAATT ~~~~~~

RTV oder Wirsel fragen nach genauer Mut-PCR wo die mut. ist (E198A)

*

ERGEBNISSE 46

Abbildung 3.8: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps durch Carboxin in planta. A: Darstellung der ausgezählten Uredosporenlager pro Pflanzenblatt in Abhängigkeit der Carboxinkonzentration. B: H2O-Kontrolle; (C): 50 µg/ml Carboxin.

Eine sichere Unterdrückung der von Wildtypsporen ausgehenden Infektion von V. faba

Blättern wurde wiederholt bei 50 µg/ml Carboxin beobachtet. Folglich wurde diese

Fungizidkonzentration für alle weiteren Versuche verwendet.

3.5.1.2 Unterdrückung des U. fabae Wildtyps mit Benomyl

Durch den Entzug der Zulassung von Benomyl für Deutschland, erwies sich die Beschaffung

diesen systemischen Fungizids für Versuchszwecke als schwierig. Schließlich stellte die Fa.

Helm AG aus Hamburg, eine kleinere Charge von 250 mg kostenfrei zur Verfügung.

Wie in Abschnitt 3.6.1 dargestellt wird, erwies sich die Löslichkeit von Benomyl in allen

verwendeten Konzentrationen als schwierig. Beim Aufsprühen der Fungizid-Suspension

bildete sich auf den Blättern ein weißlicher Belag, welcher zusätzlich zur chemischen

Unterdrückung des Uredosporenwachstums, eine künstliche Barriere auf der Blattoberfläche

darstellt, welche die Keimung und Wachstum des Pilzes zusätzlich beeinträchtigen könnte.

Bereits bei niedrigen Konzentrationen (Abb. 3.9) war eine starke Reduzierung der Anzahl von

Uredia pro Bohnenblatt festzustellen. Mit im Durchschnitt 102 verbliebenen

Uredosporenlagern pro Blatt ist eine Diskriminierung von Wildtyp und Transformanten

jedoch nicht akzeptabel. Bei Verwendung von 10 mg/ml des Fungizids konnte der Wildtyp

vollständig unterdrückt werden (Abb. 3.9).

[A] [B]

[C]

[C]

0 5 10 25 500

1000

2000

3000

2033

1110

1310 0

Carboxin [µg/ml]

Ure

dia

pro

Bla

tt

ERGEBNISSE 47

0 1 2,5 5 7,5 100

1000

2000

3000

4000

102

2867

45 22 1 0

Benomyl [mg/ml]

Ure

dia

pro

Bla

tt

1 2,5 5 7,5 100

50

100

150

Benomyl [mg/ml]

Ure

dia

pro

Bla

tt

[A]

[B]

Abbildung 3.9: Unterdrückung des U. fabae Wildtyps in planta durch das Fungizid Benomyl. A: Vergleich mit unbehandelten Kontrollblättern: B: Vergrößerter Ausschnitt der Benomylvarianten.

3.5.1.3 Selektionsschema in planta

Für alle Versuche mit Transformationslinien wurde ein Selektionsschema in planta etabliert,

das eine Selektion zwischen Wildtyp und potentiell transformierten Sporen mit dem

entsprechenden Fungizid ermöglicht (Abb. 3.10). Basierend auf den Erkenntnissen der

Vorversuche, wurde im ersten Vermehrungsschritt kein Fungizid appliziert, um ein

Zeitfenster für die Expression der Transgene zu schaffen. Somit wurde im ersten Schritt auf

der ersten Pflanze, eine Mischung aus Wildtyp- und potentiell transformierten Sporen

vermehrt, geerntet und anschließend für die erste Selektion auf eine zweite Pflanze

ERGEBNISSE 48

Pflanze 1 Pflanze 2 Pflanze 3

Keine Selektion 1. Fungizid-Selektion 2. Fungizid-Selektion

Abb. 3.10: Selektionsschema für Transformanten von U. fabae in planta. Aufsprühen der Transformationsansätze auf ganze Bohnenpflanzen (Pflanze 1) und der hydrierten Uredosporen nach der Ernte von Pflanze 1 auf einzelne, mit Carboxin vorbehandelten Blätter (Pflanze 2). Nach der 1. Fungizid-Selektion Picken von Einzel-Linien und Übertragung auf Pflanze 3. für die nächste Selektionsrunde. Der letzte Schritt wurde für alle folgenden Pflanzen wiederholt.

ausgebracht (erste Selektion, S1, Abb. 3.10). Dies brachte deutliche Fortschritte hinsichtlich

der Anzahl der gebildeten Uredosporenlager in der S1-Generation.

3.6 U. fabae Transformanten-Linien, Selektion und molekulare Analyse

Bei den biolistischen Transformationen wurden folgende Plasmidkonstrukte verwendet und

für eine Selektion auf potentielle Transformanten in planta überprüft. Die

Einfachkonstrukte: pSW3386 (TBB1-E128A), pRV111 (SucDH1-H254Y) und pRV113 (SucDH1-

ERGEBNISSE 49

H254L) sowie das Doppelkonstrukt pRV111::DsRed. Im Folgenden werden Ergebnisse mit

den einzelnen Plasmidkonstrukten dargestellt.

3.6.1 Selektion mit Benomyl

Eine Selektion mit dem Fungizid Benomyl erwies sich als schwierig und brachte kein

eindeutiges Ergebnis. In der ersten Selektionsrunde wurde nur ein geringes

Sporenwachstum festgestellt. Mehrere Wiederholungen des Experiments erbrachten

dasselbe Ergebnis (Tab. 3.6), weshalb die Selektion durch das Fungizid Benomyl als nicht

geeignet für das System betrachtet wurde. Neben der schweren Löslichkeit und

Verteilbarkeit auf den Bohnenblättern, stellte der weise Fungizidbelag (Abb. 3.11) vermutlich

eine zusätzliche Barriere für das Auskeimen potentiell transformierter Sporen dar. Im

Vergleich zu später selektionierten, transformierten Uredosporen, die gegen Carboxin

resistent waren, waren die mit Benomyl selektionierten Rostpusteln kleiner und in deutlich

geringerer Anzahl vorhanden (Tab. 3.6).

Tabelle 3.6.: Selektion von U. fabae Transformanten durch Benomyl in planta. Biolistische Transformation mit dem Plasmid pRV103 und Selektion in Runde 1 (S1) und 2 (S2).

Keine der Transformantenlinien aus der S1 konnte in der nachfolgenden Selektionsrunde

(S2) auf Benomylbehandelten Blätter propagiert werden.


Ausbringung Anzahl Uredosporenlager

in S1 Anzahl

Uredosporenlager in S2

I 1 2

1 0

0 0

II 1 2 3

0 0 2

0 0 0

III 1 2

1 0

0 0

ERGEBNISSE 50

[A]

[B]

[C]

pSW33867930 bp

Tubulin-ch

5'-tub

ulin

reg

ion3'-tu

bu

lin region

Abbildung 3.11: Aufbringen von Benomyl auf Bohnenblätter. A: Die für die Selektion vor-behandelten Pflanzenblätter zeigen einen weißen Belag aus Fungizidrückständen. B: Durchlichtauf-nahme mit sichtbaren Uredosporenlager. C: Verwendetes Plasmid.

3.6.2 Selektion mit Carboxin

3.6.2.1 Biolistische Transformation mit den Plasmidkonstrukten pRV111 und pRV113

Die beiden Konstrukte pRV113 und pRV113 wurden für den biolistischen Beschuss von

Uredosporen verwendet und die Transformanten nach dem oben beschriebenen

Selektionsschema (Abb. 3.10) in V. faba Pflanzen vermehrt. Eine Verbesserung im Vergleich

zu Benomyl war bereits bei der Handhabung des Fungizids Carboxin gegeben. Die Löslichkeit

des Fungizids war besser, Rückstände auf den Blättern traten hier nicht auf. Tabelle 3.7 zeigt

durchschnittliche Anzahl der Uredia pro Blatt nach Ausbringen verschiedener

Transformationsansätze. Eine ausführliche Auflistung der selektionierten Uredosporenlager

der S1 befindet sich im Anhang (Tab. 8.1).

ERGEBNISSE 51

Tabelle 3.7: Selektion von U. fabae Transformanten durch Carboxin in planta. Biolistische Transformation mit den Plasmiden pRV111 und pRV113. Ausbringung und Selektion in den Runden 1 (S1), 2 (S2) und 3 (S3). a) Mittelwert der Uredosporenlager pro Blatt.


Ausbringung Anzahl Urediaa)

Transformations-effizienz S1 S2 S3

A. (pRV111) I II

8 4

2 1

0 0

1,4 x 10-5

B. (pRV111) I II

13 9

3 3

0 0

2,5 x 10-5

C. (pRV111) I II

15 7

4 1

0 0

2,5 x 10-5

A. (pRV113) I II

2 2

0 0

-- --

4,5 x 10-6

B. (pRV113) I II

5 8

0 0

-- --

1,5 x 10-5

Die Transformationseffizienz aus allen Auszählungen der S1 nach Behandlung mit Carboxin

beträgt für pRV111 2,1 x 10-5 bei einer durchschnittlicher Anzahl Uredia von 9 ± 7 (n = 36)

bzw. 9,7 x 10-6 für pRV113 mit 4 ± 5 (n = 24) Uredia im Mittelwert. Auch wenn die Anzahl der

selektionierten U. fabae Transformanten mit modifizierter SucDH1 ein besseres Ergebnis

erbrachte als mit TBB1, konnte keine der Linien nach der dritten Selektion auf Pflanzen

propagiert werden.

Die Menge der Uredosporen, die mit pRV111 und pRV113 transformiert und nach der

Selektion mit Carboxin vermehrt werden konnten (Tab. 3.7) war sehr gering, so dass auch

nur geringe DNA-Mengen extrahiert werden konnten. Für den Nachweis der Transgene

mittels PCR-Reaktion war die DNA-Menge unzureichend, weshalb das REPLI-g Kit (QIAGEN

GmbH, Hilden) zur Amplifikation der vorhandenen genomischen DNA verwendet wurde. Für

den Nachweis der Transformation wurden Primer gewählt, die nur bei einer Kombination

der Sequenzen von SucDH1-tPMA1 ein Amplifikationsprodukt ergab. Beim Wildtyp ist diese

Kombination im Genom nicht vorhanden, weshalb hier auch keine Amplifikation stattfinden

kann. Bei zwei der untersuchten Transformanten-Linien (T1, T2, Abb. 3.12 B) konnte gezeigt

werden, dass im Vergleich zum Wildtyp ein DNA-Fragment in Größe von 758 bp amplifiziert

wurde.

ERGEBNISSE 52

bp

1000 800

500

Pflanze 2 (S1)

M T1 T2 W1 W2 K

pSucDH1 SucDH1(H254Y) tSucDH1

pPMA1 SucDH1(H254Y) tPMA1 T

W

[A] [B]

[C]

T1

T2

Abbildung 3.12: Selektion und molekularer Nachweis der biolistischen Transformation. A: Nach der biolistischen Transformation wurden die ausgebrachten Sporen bestehend aus WT und potentiellen Transformanten geerntet und für die erste Selektion (S1) auf eine zweite Pflanze ausgebracht. B: Schematische Darstellung des PCR-Nachweises, schwarzer Balken zeigt das zu erwartende PCR-

Amplifikationsprodukt. C: Agarosegel mit PCR-Proben. Transformanten-Linien T1 und T2, Wildtyp

W1 und W2 und Wasserkontrolle K.

3.6.2.2 Biolistische Transformation mit dem Plasmidkonstrukt pRV111::DsRed

Die Selektion des Dopplekonstrukts, dass das SucDH1(H254Y)- und DsRed-Gen trägt, erfolgte

in planta mit dem Fungizid Carboxin. Die selektionierten Uredosporen wurden auf

Objektträgern zur Keimung gebracht und mikroskopisch auf ein Vorhandensein der roten

Fluoreszenz gescreent. In keiner der gescreenten Varianten konnte eine Fluoreszenz

detektiert werden. In Tabelle 3.8 sind die ermittelten Mittelwerte aus der Auszählung der

Uredosporenlager auf einzelnen Blättern in S1 (Anhang, Tab. 8.2) dargestellt. Uredosporen,

die mit dem Doppelkonstrukt pRV111::DsRed beschossen worden waren, zeigten in der

ersten Selektion (S1) eine durchschnittliche Anzahl von 14 ± 6 Uredia (n = 16), was eine

Transformationseffizienz von 3,2 x 10-5 ergab. Einzelne selektionierte Linien konnten in der

S2 propagiert werden, keine jedoch konnte nach weiterem Ausbringen mit Carboxin in der

S3 vermehrt werden.

ERGEBNISSE 53

P1 + P2 P3 + P4

kb

1000 750

500

M1 ‒1 ‒2 WT S2 S2 + S1 S1 S1 S1 S1 M2

T

W

701 bp

pPMA1 SucDH1(H254Y) tPMA1

P1 P3

P4 P2


P4 P2

[A]

[B]

Tabelle 3.8: Transformanten-Linien mit pRV111::DsRed in planta. a) Mittelwert der Uredosporenlager pro Blatt.


Ausbringung Anzahl Urediaa)

Transformations-effizienz S1 S2 S3

pRV111::DsRed I II

15 13

2 2

0 0

3,2 x 10-5

Die Überprüfung auf das Vorhandensein des tPMA1-SucDH1-Konstrukts im U. fabae Genom

wurde in allen Linien der zweiten Selektion (S2) wie in der dazugehörigen Vorselektion (S1)

durchgeführt. In allen getesteten Ansätzen konnte das Amplifikationsprodukt nachgewiesen

werden (Abb. 3.13). Zwei von vier Linien aus der S1, die nicht weiter in der S2 propagiert

werden konnten, zeigen ebenfalls das Vorhandensein des tPMA1-SucDH1-Konstukts. Alle

Versuche, mit dem gleichen PCR-Verfahren das Vorhandensein von DsRed in Uredosporen

die mit pRV111::DsRed transformiert wurden waren nachzuweisen, waren ohne Erfolg. Auch

nach Aufsprühen von selektionierten Sporenlinien auf Objektträger konnte kein Fluoreszenz-

Signal detektiert werden. Demnach war anzunehmen, dass keine Integration von DsRed aus

dem Konstrukt pRV111::DsRed nicht erfolgt war. Keine der Linien konnte in der S3

propagiert werden.

Abbildung 3.13: PCR Nachweis von selektionierten Sporenlinien nach Transformation mit pRV111::DsRed. A: Amplifikation von Transformantenlinien mit P1 (pPMA1_rev) und P2 (114-F1) Primer in der zweiten Reaktion der Nested PCR. Plasmid-Kontrolle (+), Wildtyp U.f. (WT), Wasserkontrolle aus Reaktionen 1. und 2 (‒1 und ‒2), 100 bp (M1) und 1 kb Marker (M2). B: Schematische Darstellung des PCR-Nachweises.

ERGEBNISSE 54

3.6.2.3 Biolistische Transformation mit Kassette aus pRV111 und pRV113

Während in den in vitro Versuchen die Plasmidkonstrukte entweder zirkulär oder linearisiert

für den biolistischen Beschuss verwendeten wurden, wurde bei in planta Versuchen nur die

linearisierte Form der Plasmide verwendet. Auch wenn keine signifikanten Unterschiede in

der Transformationseffizienz festzustellen waren, war eine leichte Tendenz zu einer höheren

Anzahl transformierter Uredosporen bei vorrangegangener Linearisierung der DNA gegeben.

Der Einfluss des Plasmid-Backbone auf die Transformationseffizienz wurde durch folgenden

Ansatz überprüft. Aus den Plasmidkonstrukten wurde die Genkassette tPMA1-

SucDH1(H254Y)-pPMA1 bzw. tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1 ausgeschnitten und für einen

biolistischen Beschuss verwendet, um festzustellen, ob es zu einem leichteren Einbau in das

Genom kommt, da potentiell störende flankierende Sequenzen fehlen (Abb. 3.14). Im ersten

Selektionsschritt wuchsen auf allen inokulierten V. faba Blättern vereinzelte

Uredosporenlager, die potentiell SucDH1(H254Y) bzw. SucDH1(H254L) trugen und dadurch

Carboxinresistent waren. Aus jedem Transformationsansatz mit pRV111 und pRV113 wurden

mehrere Linien aus der S1 (Tab. 3.10) für die weitere Vermehrung unter Carboxin-

Selektionsdruck ausgewählt. Die Anzahl der Linien mit der dazugehörigen Auszählungen der

Uredosporenlager ist in Tabelle 8.4. (Anhang) dargestellt.

Abbildung 3.14: Plasmidkassette tPMA1-mut-SucDH1-pPMA1.

Bereits in der ersten Selektion (S1) zeigte sich eine deutlich höhere Zahl von

Uredosporenlagern bei den Plasmidkassetten pRV111 bzw. pRV113 (Tab. 3.9) im Vergleich

zur Verwendung ganzer Plasmide (durchschnittlich ca. 12 (n = 16) bzw. 10 Uredia pro Blatt (n

= 20)).

ERGEBNISSE 55

Tabelle 3.9: Erste Selektion in planta nach Beschuss mit der Kassette aus pRV111 und pRV113. a: Zahl der selektierten Linien b: Mittelwert aus der Zahl der Uredosporenlager pro Blatt; c: Anzahl der behandelten Blätter und d: Transformationseffizienz.

Transformations-Ansatz a b c d

tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 188 12 16 7,1 x 10-5

tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1 195 10 20 5,3 x 10-5

Jeweils ausgesuchte Linien aus der S1 wurden auf weiteren Pflanzen für eine zweite

Selektionsrunde unter Selektionsdruck mit Carboxin ausgebracht. Dieser Schritt wurde an

zwei zeitlich unabhängigen Terminen wiederholt (I und II, Tab. 3.9). Bei der Transformation

mit tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 wurden von insgesamt 17 (I) bzw. 13 (II) ausgebrachten

S1-Linien 7 bzw. 9 Linien in der nächsten Selektion (S3) propagiert. Vergleichbare Werte für

die Propagation in der S3 wurden mit den tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1-Linien erzielt (Tab.

3.10). Die durchschnittliche Zahl der Uredosporenlager variierte für beide Konstrukte

zwischen 1 und 29. Eine ausführliche Tabelle mit allen ausgezählten Uredia aus allen

Selektionsrunden ist dem Anhang (8.4) zu entnehmen.

Tabelle 3.10: Zweite Selektion nach biolistischer Transformation. (A): Zahl der ausgebrachten Linien von der S1 auf die S2. (B): Davon selektionierte Linien. C: Mittelwert der Zahl der Uredosporenlager pro Blatt.

Transformations-Ansatz Ausbringung A B C

tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 I 17 7 4,3

II 13 9 8,6

tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1 I 17 6 2,5

II 12 5 3,4

Alle weiteren Selektionsrunden sind in Tabelle 3.11 zusammengefasst. Es konnten insgesamt

bis zu 10 Selektionsrunden (10 Generationen) mit einzelnen Transformantenlinien von U.

fabae erzielt werden.

ERGEBNISSE 56

[A]

[B]

M T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 WT + –1 –2 M bp

1000 700 500

bp

1000

700

500

Tabelle 3.11: Selektionierte Transformantenlinien nach Biolistik in planta. Selektionsrunden 3 bis 10 (Sx) und dazugehörige Anzahl ausgebrachter Linien (a) sowie Anzahl der selektierten/weiter propagierten Linien (b).

Transformations-Ansatz S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10

a b a b a b a b a b a b a b a b

tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 9 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 0

tPMA1-SucDH1(H254L)-pPMA1 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1

Die Beständigkeit der einzelnen Transformationslinien bei Verwendung von Plasmid-

kassetten zeigte sich in einer hohen Anzahl von Selektionsrunden im Vergleich zu einer

geringeren Selektionsrundenzahl bei Beschuss mit ganzen Plasmiden in zirkulärer oder

linearisierter Form. Diese Beständigkeit bis zur 10. Selektionsrunde deutete auf eine stabile

Integration des mutierten SucDH1 in das U. fabae Genom. Um dies zu überprüfen, wurde die

aus U. fabae Transformanten isolierte DNA mittels Nested-PCR analysiert. Die

Standardüberprüfung wurde mit dem Konstrukt-spezifischen Nachweis durchgeführt (s. Abb.

3.13 (B), 3.6.2.2). Alle überprüften Linien zeigten ein spezifisches Amplifikationsprodukt für

die Kombination pPMA1-SucDH1, welche beim WT nicht vorkommt (Abb. 3.15).

Abbildung 3.15: PCR Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien in der S1. A: pRV111 und B: pRV113 Transformanten von U. fabae, selektioniert in S1 in planta. Reaktion II der Nested PCR mit dem Primerpaar P1 (pPMA1_rev) und P2 (114-F1), 701 bp (Vgl. Abb. 3.13 B).

ERGEBNISSE 57

Die Analyse der einzelnen Linien aus weiteren Selektionsrunden zeigt ebenfalls das

spezifische Amplifikationsprodukt für die pPMA1-SucDH1 Kombination (s. Abb. 3.16)

Abbildung 3.16: PCR-Nachweis von pRV111- und pRV113-Transformationslinien von S2 bis S9. Zweite Reaktion der Nested-PCR mit dem Primerpaar P1 (pPMA1_rev) und P2 (114-F1). A: pRV111- und pRV113-Transformationslinien aus den Selektionsrunden 2, 3 und 4 die in der S5 nicht weitergewachsen sind. B: Transformationslinie die über 9 (pRV111) bzw. 8 (pRV113) Selektionsrunden in planta propagiert wurde.

Bei dem oben beschriebenen Nested-PCR-Nachweis zeigte die analysierte Transformanten-

DNA ein spezifisches Signal (701 bp). Es kann jedoch nicht mit Sicherheit davon ausgegangen

werden, dass die nachgewiesenen Sequenzen tatsächlich in das U. fabae Genom integriert

wurden. Aufgrund der geringen Sporenmenge und der daraus resultierend ungenügenden

Menge an DNA für einen Southern Blot-Nachweis (s.a. 3.8 und Anhang 8.5.1) war die

Notwendigkeit für weitere PCR-Analysen gegeben. Dabei wurden zwei unterschiedliche

Möglichkeiten zum Einbau von Transgenen in das U. fabae Genom über homologe

Sequenzen analysiert (Abb. 3.17). Zum einen kann der Einbau der mut-SucDH1 aus beiden

verwendeten Konstruktkassetten durch homologe Rekombination in die WT-SucDH1

erfolgen (Abb. 3.17, 1). Im zweiten Fall kann der Einbau durch die Rekombination homologer

Sequenzen der regulatorischen Elemente tPMA1 und pPMA1 in der Uf-PMA1-Region (Abb.

3.17, 2) erfolgen.

[A]

[B]

bp

1000

700 500

M1 S2 S3 S4 WT1 S2 S3 S4 WT2 + ‒1 ‒2 M2

pRV111 pRV113

bp

1000

700 500

M1 S2 S4 S6 S8 S9 WT1 S2 S4 S6 S8 WT2 + ‒1 ‒2 M2

pRV111 pRV113

ERGEBNISSE 58

Abbildung 3.17: Möglichkeiten der Integration von Transgenen in das U. fabae Genom. Unterschiedliche Vorbereitung der Plasmid-DNA vor dem biolistischen Beschuss. A: Linearisierung durch Restriktionsenzyme; B: Zirkulär, unbehandelt; C: Ausschneiden und Beschuss mit der Kassette tPMA1-SucDH1(254Y)-pPMA1. Farbcode: Gelb (Vektor pKS II); Weiß (regulatorische Elemente); Braun (SucDH1(H254Y)); Orange (WT-SucDH1); Grau (Uf-PMA1).

Die Analyse der Uf-PMA1 Region erfolgte in Wildtyp- und Transformanten-DNA mit den

Primer Uf-PMA1_Fwd2- und Uf-PMA1_Rew2. Nach Einbau der mut-SucDH1 in die WT-PMA1

über regulatorische Elemente (tPMA1, pPMA1) sollte mit diesen Primerpaar ein Fragment

von ca. 3,3 kb entstehen. Im Vergleich dazu sollte sich für die WT-PMA1-Region ein

Fragment mit ca. 5,5 kb ergeben. Dieser Größenunterschied konnte in keiner der

analysierten Transformantenlinien gefunden werden, weshalb ein Einbau über homologe

Sequenzen der Uf-SucDH1 vermutet werden konnte. Um diese Vermutung zu überprüfen,

wurde eine Analyse mittels SNP-PCR (Single nucleotide polymorphism, Yang et al, 2006)

durchgeführt. Dabei sollte das Vorhandensein der Punktmutation H254Y im Wildtyp

nachgewiesen werden (Abb. 3.18). Eine spezifische Unterscheidung der

Amplifikationsprodukte aus der Reaktion mit den Primern P1 + P2 kann in der zweiten

[A]

[B]

[C]

[1]

[2]

ERGEBNISSE 59

Reaktion der Nested PCR durch die unterschiedlichen Schmelztemperaturen (Tm) der

spezifischen Primer P4 und P5 erreicht werden.

Abbildung 3.18: Nachweis des Einbaus in das Genom von U. fabae mittels SNP-PCR (Single nucleotid polymorphism-PCR). (Verändert nach Yang et al. 2006). Primer: SucDH1 nested for (P1); SucDH1 SNPrev1 (P2); SucDH1 SNPrev2 (P3); SNP Primer Suc (P4); SNP Suc WT (P5). Temperatur Tm 65,9 oder 66,5 °C.

Drei Linien aus der Transformation mit tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 aus den Selektionen

S9 (T1, T2, Abb. 3.19) und S4 (T3) wurden für die SNP-PCR verwendet. Im Vergleich zum WT

konnte bei spezifischer Tm eine Punktmutation in der Uf-SuDH1(H254Y) der getesteten

Transformations-Linien nachgewiesen werden (Abb. 3.19, A). Nach der Amplifikation des

SucDH1-Abschnitts mit P1- und P2-Primern (786 bp) wurde diese als Template für die zweite

PCR-Reaktion verwendet. Die Allel-spezifischen Primer P3 und P4 amplifizieren in der

zweiten PCR-Reaktion bei einer Tm von 65,9 und 66,5 °C nur in Uf-SucDH1(H254Y) und nicht

in Uf-SucDH1 ein 506 bp großes Fragment (Abb. 3.19, A). Dagegen können die Primer P3 und

P5 bei den verwendeten Tm in beiden Varianten ein Amplifikationsprodukt ergeben (Abb.

PCR-Produkt mut-SucDH1 WT-SucDH1

P1 + P2

P3+P4 (65,9-66,5 °C)

P3 + P5 (65,9-66,5 °C)

mut-SucDH1

WT-SucDH1

G

T

C G

P1

P2

P4

P5

T A

P1

P2

P4 T

P5 G

PCR

P3

P3

ERGEBNISSE 60

bp

1000

700 500

T1 T2 T3 +1 +2 WT –1 –2 M T1 T2 T3 +1 +2 WT –1 –2

Tm 1 [°C] Tm 2 [°C]

[A]

[B] bp

1000

700 500

3.19, B). Die spezifische Tm der Primer wurde mittels Gradienten-PCR ermittelt (s. a. Anhang

Abb. 8.2).

Abbildung 3.19: Nachweis der Punktmutation in den Transformantenlinien. (T1, T2 und T3) mittels SNP-PCR mit den Primern P3 + P4 (A) und P3 + P5 (B). Kontrollen: –1 und –2 entsprechen H2O-

Kontrollen aus den Reaktionen I und II der Nested-PCR; Plasmid pRV111: +1 (50 ng) und +2 (10 ng), WT (ca. 200 ng). Es wurde jeweils die gleiche Menge an DNA (ca. 200 ng) bei Transformantenlinien verwendet. Tm 1 = 65,9 °C; Tm 2 = 66,5 °C.

Mit dem SNP-PCR-Nachweis konnte somit endgültig eine Integration der Uf-SuDH1(H254Y)

in das Genom der selektionierten U. fabae-Transformationslinien, die aus der biolistischen

Transformation mit tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 Kassette (Plasmid pRV111) stammen

nachgewiesen werden.

3.7 Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation von U. fabae

Für die Agrobakterien-vermittelte oder Agrobacterium tumefaciens-mediated

Transformation (ATMT) von U. fabae wurden die drei Agrobakterien-Stämme: AGL-1,

GV3103 und LBA1100 verwendet, mit denen bereits andere Pilze erfolgreich transformiert

wurden (Frandsen 2011). Alle drei Stämme wurden mit Plasmiden pRV112 bzw. pRV114 für

eine Selektion der U. fabae-Transformanten mit Carboxin sowie mit pRV101 für eine

ERGEBNISSE 61

Selektion mit Benomyl, transformiert. Es wurden verschiedene Parameter getestet, um

einen optimierten Transformationsansatz für U. fabae zu etablieren (Tab. 3.12). Die

Überprüfung der Transformationseffizienz wurde durch Veränderung der verschiedenen

Faktoren durchgeführt. Zunächst wurde der Einfluss der Anzahl verwendeter Bakterien im

Verhältnis zur Zahl der Uredosporen ermittelt. Hierfür wurden die für erfolgreiche

Transformationen anderer filamentösen Pilze beschriebenen Verhältnisse verwendet (1 :

100 und 1 : 200). Desweiteren wurde ein Verhältnis von 1 : 38,5 getestet. Die Versuche

erfolgten nach Einstellen der Agrobakterien-Zelldichte auf OD600 = 0,25. Der Einfluss von

Acetosyringon im Induktionsmedium wurde ebenfalls getestet. Die Unterscheidung erfolgte

in zwei Varianten: Vorkultur im Induktionsmedium mit 200 µM Acetosyringon

Induktionsmedium ohne Acetosyringon. Nach der Durchführung der Experimente wurden

die optimalen Parameter: 1 : 100 (Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen), 200 µM

Acetosyringon und 6 Stunden Induktion, für weitere Transformation verwendet.

Tabelle 3.12. Parameter für die Agrobacterium-vermittelte Transformation. Die hervorgehobenen Parameter wurden bei weiteren Versuchen verwendet.

Parameter Variation

Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen 38,5 / 100 / 200

Acetosyringon-Konzentration [µM] 0 / 200

Kultivierung von A. tumefaciens in Induktionsmedium [h] 0 / 6 / 24

Kokultivierung A. tumefaciens mit Uredosporen Konstant (unveränderbar)

3.7.1 Einfluss verschiedener Parameter auf die Transformationseffizienz

Die wichtigsten Parameter für die ATMT, die für das U. fabae System eine maximale Effizienz

liefern, wurden in den Vorversuchen ermittelt. Im Folgenden wird die Ermittlung der

einzelnen Faktoren (Tab. 3.12) dargestellt.

3.7.1.1 Induktion mit Acetosyringon

Die Zugabe von 200 µM Acetosyringon zum Kulturmedium der Agrobakterien

(Induktionsmedium) aktiviert die Virulenzmaschinerie der Bakterien. Um einen Einfluss der

Kultivierungsdauer von Agrobakterien im Induktionsmedium zu überprüfen, wurde eine

ERGEBNISSE 62

Zeitreihe von 6, 12 und 24 Stunden im Induktionsmedium mit dem Stamm AGL-1pRV111

durchgeführt (Abb. 3.20). Die induzierten Agrobakterienkulturen wurden anschließend mit

Uredosporen gemischt und auf V. faba Pflanzen aufgesprüht. Die Selektion mit Carboxin

erfolgte in der S1 auf der zweiten Pflanze.

Abbildung 3.20: Einfluss der Induktionsdauer auf die Transformationseffizienz. Zahl der Uredosporenlager in der S1 auf Ackerbohnenblättern. Mit AGL-1pRV112 transformierte Uredosporen wurden mit Carboxin in der S1 selektioniert und die durchschnittliche Anzahl der auf Ackerbohnenblättern (n = 16) wachsenden Uredia dargestellt. Standardabweichung in 95%CI angegeben. Signifikanten Unterschiede sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet (glm poisson; p < 0,05).

Nach 6 Stunden zeigten die Bakterien die signifikant höchste Virulenz auf Uredosporen,

gezeigt weshalb für weitere Versuche die verwendeten Agrobacterium-Stämme für 6

Stunden induziert wurden.

Zusätzlich wurde in Vorversuchen auch der Einfluss von 200 µM Acetosyringon im

Kulturmedium auf Virulenz der Agrobakterien überprüft. (Abb. 3.21 und Anhang 8.6).

AGL-1 Stamm zeigte die Tendenz zur höchsten Effizienz mit einem durchschnittlichen

Urediazahl pro Pflanzenblatt von 3,6 x 10-5 (16 Uredia) gefolgt von GV3103 mit 2,5 x 10-5 und

1,4 x 10-5 bei LBA1100 Stamm. Als Kontrolle wurde U. fabae zusätzlich mit AGL-1

transformiert dass keinen pRV-Vektor enthielt transformiert. Erwartungsgemäß ergab diese

Kontrollvariante keine Uredia auf den mit Carboxin behandelten Blätter (n = 14).

6 h 12 h 24 h0

10

20

14

8

5

a

b

c

Induktionsdauer mit AS

Mit

telw

ert

Ure

dia

pro

Bla

tt

ERGEBNISSE 63

Abbildung 3.21: Einfluss von Acetosyringon (AS) auf die Transformationseffizienz. A: Vorkultur (6 h) von verschiedenen Agrobakterium-Stämmen die das Plasmid pRV112 tragen, im Induktionsmedium mit AS (200 µM) oder ohne AS. Kontrollpflanzen infiziert mit WT U. fabae auf vorbehandelten Blättern (n = 16) mit Carboxin (50 µg/ml) oder Wasser (0 µg/ml). B: Transformationskontrolle mit AGL-1 Stamm (mit pRV112 transformiert) im Vergleich zu AGL-1 (ohne Vektor für U. fabae Transformation). Standardabweichung in 95%CI angegeben.

3.7.1.2 Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen

Ein optimales Verhältnis von Sporen und Agrobakterien ist für jedes Transformationsystem

für eine effiziente Transformation entscheidend (Michielse et al. 2005). Um die höchste

Transformationseffizienz für das U. fabae-System zu ermitteln, wurden verschiedene

Verhältnisse getestet. Das Verhältnis 1 : 38,5 ergab sich durch Einstellen des OD600-Wertes

der Agrobakterienkulturen in Induktionsmedium auf einen Wert von 0,5. Die Bakterien

wurden mit der maximal ausbringbaren Menge an Uredosporen für die Ausbringung auf eine

ganze Ackerbohnenpflanze gemischt. Bei den Verhältnissen 1 : 100 und 1 : 200 wurde eine

definierte Anzahl von Uredosporen mit den induzierten Agrobakterien gemischt. Alle drei

Agrobakterien-Stämme, die das Plasmid pRV112 tragen, wurden für die Untersuchung

benutzt. Während beim niedrigsten Verhältnis von Agrobakterien zu Uredosporen nur

wenige Rostpusteln selektioniert werden konnten, hob sich das Verhältnis 1 : 100 deutlich

hervor. Es ergab sich eine signifikant höhere Anzahl von Uredosporenlager in der S1, wenn

dieses Verhältnis von Sporen und Agrobakterien verwendet wurde. Eine höhere Anzahl von

Agrobakterien in Bezug auf eine Uredosporen (1 : 200) ergab eine signifikant niedrigere

Agrobacterium-Stamm Transformationskontrolle

[A] [B]

AGL-1pRV111 AGL-10

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

18

0

Variante

AGL-1pRV111 AGL-10

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

18

0

Variante

LBA1100 AGL1 GV31030

5

10

15

20

25

6

16

11

1 1 1

+ AS - AS

Mit

telw

ert

Ure

dia

pro

Bla

tt

ERGEBNISSE 64

Anzahl der Uredia pro Pflanzenblatt. Das niedrigste Verhältnis von 1 : 38,5 ergab die

niedrigste Anzahl der Uredosporenlager in der S1 (Abb. 3.22 und Anhang Tab. 8.7). Folglich

wurde ein Verhältnis von 100 Agrobakterien auf eine Uredospore (1 : 100) als optimaler

Parameter für die Transformation von U. fabae für alle weiteren Versuche verwendet.

Abbildung 3.22: Einfluss des Verhältnisses von Agrobakterien : Uredosporen auf die Transfor-mationseffizienz. Anzahl der Uredia in der ersten Selektion mit Carboxin (n = 32-40). Die jeweiligen Mittelwerte sind in Zahlen oberhalb der Diagrammbalken dargestellt. Standardabweichung in 95%CI angegeben. Signifikanten Unterschiede sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet (Tukey's Multiple Comparison Test; p < 0,05).

3.7.1.3 Weitere Faktoren für die ATMT

Durch den Einsatz verschiedener Agrobakterien-Stämme und Plasmide ergab sich eine

unterschiedliche Transformationseffizienz bei den jeweiligen Varianten. Dieser Einfluss wird

im Abschnitt 3.7.1.4 dargestellt. Ein weiterer essentieller Parameter einer effizienten ATMT

ist die Dauer der Kokultivierung von Uredosporen und Agrobakterien. Dieser Schritt kann für

U. fabae nur in planta durchgeführt werden, was gleichzeitig einen limitierenden Faktor

darstellt. Die Zeit zwischen dem Ausbringen und der Keimung bzw. Penetration der

Uredosporen in das Pflanzenblatt ist begrenzt und beträgt unter optimalen Bedingungen

etwa 6 Stunden. Diese Tatsache ist ohne zusätzlichen Behandlung mit keimungshemmenden

Substanzen nicht veränderbar und wurde auch so belassen.

1 : 38,5 1 : 100 1 : 2000

5

10

15

20LBA1100pRV112

AGL-1pRV112

GV3103pRV112

1 1 1

1

6

14

Verhältnis Uredosporen : Agrobakterien

Mit

telw

ert

Ure

dia

pro

Bla

tt

8

3 34a

b

c

ERGEBNISSE 65

LBA1100pRV112 AGL-1pRV112 GV3103pRV1120

5

10

15

20

a

b

c

5

15

10

Agrobacterium-Stamm

Mit

telw

ert

Ure

dia

pro

Bla

tt

3.7.1.4 Einfluss der Agrobakterien-Stämme

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Agrobakterien-Stämme verwendet: LBA1100, AGL-1

und GV3103, die mit Plasmiden für Farb- und Fungizidmarker transformiert wurden. Nach

anfänglichen Arbeiten mit LBA1100 zeigten die beiden anderen Stämme ein tendenziell

zufriedenstellenderes Bild nach der ersten Selektion mit Carboxin. Die statistische

Auswertung (ANOVA) und das Diagramm in Abbildung 3.23 zeigen, dass die Anzahl der

einzelnen Uredosporenlager in der S1 bei allen drei Stämmen signifikant unterschiedlich

waren. Demnach ist die Transformationseffizienz mit AGL1pRV112 (n = 70) signifikant höher

im Vergleich zu den anderen verwendeten Stämmen LBA1100 (n = 70) und GV3103 (n = 66).

Die Ergebnisse aller Auszählungen sind im Anhang (Tab. 8.8) dargestellt.

Abbildung 3.23: Einfluss des Agrobacterium-Stammes auf die Transformationseffizienz. Darstellung der Mittelwerte ausgezählter Uredosporenlager selektioniert in der S1 mit Carboxin. Alle Stämme tragen das Plasmid pRV112. Standardabweichung in 95%CI angegeben. Signifikanten Unterschiede sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet (Tukey's Multiple Comparison Test; p < 0,05).

3.7.2 ATMT Transformantenlinien in vitro

Auch wenn das primäre Ziel der Agrobakterien-vermittelten Transformation die Etablierung

einer stabilen Transformation in planta war, wurden auch in vitro Untersuchungen mit den

DsRed-Farbmarkerkonstrukten durchgeführt, um einen Vergleich zu den erfolgreichen

biolistischen in vitro Experimenten zu haben. Es wurden zahlreiche Screens durchgeführt, es

konnte jedoch nur vereinzelt eine schwache Fluoreszenz der Keimschläuche beobachtet

werden. Weder mit pRV116 noch mit pRV116-NLS transformierte Uredosporen konnten für

eine Auszählung bzw. die Bestimmung der Transformationseffizienz herangezogen werden.

ERGEBNISSE 66

A B

C D

Auch erschwerte die starke Autofluoreszenz der Sporen die Unterscheidung der potentiellen

Transformanten vom Wildtyp. Die Transformation von Uredosporen mit

LBA1100pRV112::DsRed ergab schließlich identifizierbare Transformanten mit schwach

leuchtenden, roten Keimschläuchen (Abb. 3.24 A, B). Die Überprüfung der Konstrukte

pRV116 und pRV116-NLS erfolgte durch biolistischen Beschuss von Uredosporen mit diesen

Plasmiden. Bei diesen Experimenten konnten sowohl eindeutig eine rote Fluoreszenz der in

vitro keimenden Uredosporen identifiziert werden (Abb. 3.24, C) wie auch eine subzelluläre

Lokalisierung der Expression von pRV116-NLS in den Zellkernen (Abb. 3.24., D) festgestellt

Abbildung 3.24: Mikroskopische Screens nach ATMT von U. fabae in vitro. (A,B): LBA1100pRV112::DsRed-Transformanten, Pfeile zeigen eine schwache aber deutlich sichtbare rote Fluoreszenz der Keimschläuche. C: Mit pRV116 und D: pRV116-NLS beschossene Uredosporen zur Überprüfung der Plasmid-konstukte. Pfeile zeigen jeweils die Transformations-Ereignisse. Weißer Balken: 20 µM. E: Verwendetes Plasmid.

[E]

ERGEBNISSE 67

werden. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass die Größe der ursprünglich für die ATMT

konstruierten Plasmide von ca. 17,2 kb kein Hindernis für eine biolistische Transformation

darstellt.

3.7.3 Selektion der ATMT-Transformanten mit Fungiziden in planta

Analog zur biolistischen Transformation wurden auch für die ATMT die beiden Fungizide

Benomyl und Carboxin für die Selektion der potentiellen U. fabae Transformanten in planta

verwendet.

3.7.3.1 Selektion mit Benomyl

Alle drei Agrobakterien-Stämme (AGL-1, LBA1100 und GV3103) die das Plasmid pRV101

(TBB1-E198A) tragen, wurden mit Uredosporen wie in 2.4.2. beschrieben gemischt und für

eine Selektion mit Benomyl auf die Pflanzen ausgebracht. Die Ergebnisse aller Auszählungen

der Uredosporenlager sind im Anhang dargestellt (Tab. 8.5).

Auch bei dieser Transformationsmethode wurden nur wenige U. fabae-

Transformantenlinien in der zweiten Selektionsrunde propagiert, weitere Selektionsschritte

waren nicht erfolgreich (Tab. 3.13). Von den Ausgebrachten einzelnen Uredosporenlager aus

der ersten Selektion (S1), wuchsen nur einige wenigen Uredia in der nachfolgenden

Selektionsrunde (S2). Keine der weiter propagierten Sporenlinien wuchsen in der S3.

Auszählungen der Uredosporenlager aus der S1 sind im Anhang (Tab. 8.5) dargestellt. In

keiner der analysierten Transformantenlinien konnte ein eindeutig positives PCR-

Amplifikationsprodukt identifiziert werden und wird daher nicht gezeigt.

Tabelle 3.13: Selektionierte Transformantenlinien nach der ATMT in planta. a) Mittelwert der Uredosporenlager pro Blatt.

Agrobacterium-Stamm


Anzahl Urediaa)

S1 S2 S3

LBA1100pRV101 I II

2 23

0 1

0 0

AGL-1pRV101 I II

3 43

0 1

0 0

GV3103pRV101 I II

3 83

0 1

0 0

ERGEBNISSE 68

3.7.3.2 Selektion mit Carboxin

Die Agrobakterien-Stämme AGL-1, LBA1100 und GV3103 wurden mit den Plasmiden pRV112

und pRV114 transformiert und für eine Selektion mit dem Fungizid Carboxin wie in 2.4.2

beschrieben mit Uredosporen gemischt. Schon in den Vorversuchen war die Zahl von

potentiell transformierten Uredosporenlager in der ersten Selektion (S1) größer. Die

Propagation ausgewählter Uredia aus der S1 konnte in einzelnen Linien bis zur S8 fortgeführt

werden. Die Transformationseffizienz der verschiedenen Agrobakterium-Stämme ist in

Tabelle 3.14 dargestellt, eine Übersicht über die Zahl der Selektionsrunden findet sich in

Tabelle 3.15. Auszählung einzelner Uredia ist in der Tabelle 8.8 des Anhangs gezeigt. Die

höchste Transformationseffizienz (3,4 x 10-5) wurde mit dem AGL-1 Stamm erreicht.

Tabelle 3.14: S1 nach ATMT mit drei Agrobacterium-Stämmen. Erste Selektion in planta (S1) nach Transformation mit 3 verschiedenen Agrobacterium-Stämmen, die entweder pRV112 oder pRV114 trugen. a: Anzahl selektierter Linien b: Mittelwert der Anzahl der Uredosporenlager pro Blatt; c: Anzahl behandelter Blätter; d: Transformationseffizienz.

Agrobacterium-Stamm a b c d

LBA1100 377 5 70 1,1 x 10-5

AGL1 1026 15 70 3,4 x 10-5

GV3103 648 10 66 2,3 x 10-5

Tabelle 3.15: Selektionierte S2- bis S8-Transformantenlinien (ATMT) in planta. Selektionsrunden 2 bis 8 (Sx) und dazugehörige Linien aus der Transformation mit drei Agrobakterien-Stämmen, die das Plasmid pRV112 oder pRV114 trugen. a: Anzahl ausgebrachter Linien und b: Anzahl selektierter/weiter propagierter Linien. Angaben der jeweiligen Prozentzahl der Transformantenlinien, die aus der Vorrunde in der nächsten Selektion propagiert wurden.

Agrobacterium-Stamm S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8

a b a b a B a b a b a b a b

LBA1100 100 45 40 26 20 3 3 0 -- -- -- -- -- --

45 % 65 % 15 % 0 % -- -- --

AGL-1 100 63 50 24 20 8 8 3 3 1 -- -- -- --

63 % 48 % 40 % 38 % 33 % 0 % --

GV3103 100 58 45 23 20 14 14 6 6 3 3 1 1 0

58 % 51 % 70 % 43 % 50 % 33 % 0 %

ERGEBNISSE 69

M T1 T2 T3 T4 T5 T6 WT ‒1 + ‒2 M

bp 1000

700 500

300 100

S1 S2 S1 S2 S1 S2 S1 S2 S1 S2 S1 S2

Abbildung 3.25: ATMT-Transformanten von U. fabae aus S1 und S2 mit Carboxin. Nested-PCR mit Transformanten DNA (Tx) mit den Primern 3534-1 (P3) und SucDH1 (P4) in der Reaktion II. Die Reaktion I wurde mit pPMA1_rev (P1) und 114-F1 (P2) durchgeführt. M: DNA Ladder; WT: Wildtyp; H2O-Kontrollen der PCR I und II; (+): Plasmidkontrolle pRV112.

T

W

701 bp

pSucDH1 SucDH1(H254Y) pSucDH1

P4 P2


P1 P3

P4 P2

Die Propagation der ausgewählten Transformantenlinien der S1 konnte mit GV3103pRV114

bis zur S7, mit AGL-1pRV112 bis zur S6 und mit LBA1100pRV112 bis in die S5 fortgeführt

werden. Die prozentualen Angaben in Tabelle 3.15 stellen den Anteil der in der nächsten

Selektionsrunder weiter propagierten Linien dar.

3.7.4 Molekularer Nachweis der Transformation in den ATMT-Linien

Analog zu den Nachweisen nach der biolistischen Transformation wurde auch für die ATMT

der Nested-PCR-Nachweis zur Überprüfung der tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1-Abschnitte

durchgeführt. Bei ungenügender Menge oder Qualität der Template-DNA konnten keine

positiven PCR-Signale für die S1 oder S2 detektiert werden (Bsp. T3, T4 und T5, Abb. 3.25),

auch wenn die selektionierten Transformantenlinien bis zur S5 mit Carboxin propagiert

werden konnten. Der molekulare Nachweis ausgewählter Linien der U. fabae ATMT-

Transformanten aus weiteren Selektionsrunden ist in Abbildung 3.25 dargestellt.

Abbildung 3.26: ATMT-Linien S2 bis S8. Nested-PCR Reaktion II (vgl. Abb. 3.25).

M1 S3 S3 S4 S4 WT1 S3 S4 S5 S5 WT2 S3 S5 S6 S7 + ‒1 ‒2 M2

LBA1100pRV112 AGL-1pRV112 GV3103pRV114 bp

1000

700 500

ERGEBNISSE 70

pRV114 (2)14777 bp

==> pBIN20_Rev_1 - 1977 - Tm=60,2°C

==> pBIN20_Rev_2 - 2076 - Tm=62,1°C

Right Border - 2357<== RB_Fwd_2 - 2459 - Tm=56,7°C

<== RB_Fwd_1 - 2496 - Tm=58,9°C

Left Border - 8735

pPMA1 SucDHtP

MA

1

RB

LB

pRV114 (2)14777 bp

==> pBIN20_Rev_1 - 1977 - Tm=60,2°C

==> pBIN20_Rev_2 - 2076 - Tm=62,1°C

Right Border - 2357<== RB_Fwd_2 - 2459 - Tm=56,7°C

<== RB_Fwd_1 - 2496 - Tm=58,9°C

Left Border - 8735

pPMA1 SucDHtP

MA

1

RB

LB

[A]

[B] [C]

bp

1000

500 400 300

100

M 1 2 3 4 5 WT ‒1 ‒2 + M

Die nach der S2 unter Carboxindruck gebildeten Uredosporenlager wurden ebenfalls durch

PCR analysiert (Abb. 3.26).

Neben der Übertragung von T-DNA auf Zielzellen, besteht auch die Möglichkeit, dass bei der

Transformation mittels Agrobakterien ganze Plasmide übertragen werden (Bundock et al.

1995). Um zu überprüfen, ob U. fabae ATMT-Transformanten durch Übertragung

vollständiger Plasmide entstanden sind, welche sich dann autonom in U. fabae replizieren

und eine Fungizidresistenz aufrechterhalten, wurden mehrere Transformantenlinien einer

Nested-PCR Analyse unterzogen. Die gewählten Primer amplifizierten ausgehend von der RB

der T-DNA einen Teil des pBIN20-Backbone. Einzelne Transformantenlinien aus

verschiedenen Selektionsrunden wurden mit unterschiedlicher DNA-Menge geprüft (Abb.

3.27). In einigen Proben konnte mittels Nested-PCR die Plasmid-Backbone detektiert werden

(Abb. 3.27, Probe 3).

Abbildung 3.27: PCR-Nachweis des pBIN20-Backbone. A: EtBr-gefärbtes Agarosegel mit DNA-Proben aus der zweiten Reaktion der Nested PCR. Primer Reaktion 1: RB_Fwd_1 + pBIN20 Rev1 (555 bp) und Reaktion 2: Fwd_2 + pBIN20 Rev2 (418 bp). M: DNA Ladder, Transformantenlinien (Tx) aus verschiedenen Selektionsrunden, transformiert mit AGL1pRV114. 1,2: S3; 3,4: S5, (T1); 5: S7, (T2). Wildtyp (WT); H2O-Kontrollen (‒1 und ‒2) und Plasmid-Kontrolle pRV114 (+). B: Für die Transformation verwendetes Plasmid mit Primer-Region für (A). C: Vergrößerter Ausschnitt aus der Primer-Region im Plasmid pRV114.

ERGEBNISSE 71

kb

10

6

4

3

2

1

a b

3.8 Southern Blot Nachweis der Transformation

Parallel zu den PCR Analysen wurde eine Southern Blot-Analyse zum Nachweis der

Transformation etabliert. Aufgrund der nur geringen DNA-Menge, die aus einzelnen

Uredosporenlagern isoliert werden konnte, erwies sich der Southern Blot-Nachweis als

problematisch. Für einen eindeutigen Nachweis der Uf-SucDH1 war eine DNA-Menge von

mindestens 30 µg notwendig (Abb. 3.28 und Anhang, Abb. 8.7). Die Amplifizierung der DNA

mit dem Repli-g Kit brachte keine Verbesserung des Nachweises (Abb. 8.7). Nach zahlreichen

Versuchen mit DIG-markierten Sonden wurde versucht durch einen radioaktiven Nachweis

mit 32P eine sensitivere Methode zu etablieren. Es zeigte sich jedoch im direkten Vergleich

zur DIG-Markierung, dass die radioaktive Methode für dieses System keine Verbesserung

bringt (Anhang, Abb. 8.8). Die verfügbare DNA-Menge aus einer Probe war bedingt durch

nur wenige propagierte Uredosporenlager in planta auf unter 10 µg beschränkt.

Abbildung 3.28: Southern Blot-Analyse von Uf-SucDH1. a: Jeweils 30 µg genomischer DNA verdaut mit den gekennzeichneten Restriktions-enzymen wurden aufgetragen. b: Plasmid-Kontrolle (pRV112, 20 ng). Die verwendete Sonde wurde mit den Primern SucDH3-2 und H130.R1 hergestellt.

DISKUSSION 72

4. Diskussion

Obligat biotrophe Organismen wie Rostpilze und die Erreger des Falschen Mehltaus stellen

weltweit eine wichtige Gruppe von Phytopathogenen speziell von wirtschaftlich

bedeutenden Kulturpflanzen dar. Molekularbiologische Untersuchungen der Rostpilze

wurden bisher dadurch erschwert, dass kein universell funktionierendes System für eine

stabile Transformation existiert. Moderne genetische Methoden wie Überexpression,

Silencing oder Tagging von Genen sind daher nicht anwendbar. Für Rostpilze wurden bisher

hauptsächlich transiente Transformationsereignisse in der Literatur beschrieben. Für eine

genetische Modifikation zahlreicher filamentösen Pilze, die auf künstlichen Medien

kultivierbar sind, existieren dagegen zahlreiche Berichte über erfolgreiche Transformation.

Die meisten früheren Versuche nutzten die Inkubation von Protoplasten mit CaCl2 / PEG

oder die Elektroporation intakter Zellen (Hynes 1996). Diese Methoden sind jedoch

zeitaufwändig und in vielen Systemen ohne Erfolg geblieben vor allem aufgrund der

schwierigen Protoplastierung pilzlicher Zellen (Goosen et al. 1991). Bei filamentösen Pilzen,

die auf diese Weise erfolgreich transformiert wurden, zeigte sich zudem eine niedrige

Transformationseffizienz (Leung et al. 1990; Durand et al. 1991; Marmeisse et al. 1992). In

den letzten 15 Jahren wurden die meisten Erfolge mittels zweier Methoden erreicht, der

Biolistik und der „Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation“. Es lag demnach

nahe, diese zwei Methoden für das U. fabae System zu etablieren. Für beide Methoden

wurde ein Set von Plasmiden konstruiert, welches es ermöglichen sollte, sowohl die

optimalen Parameter für die Transformation von U. fabae in vitro mittels Farbmarkern zu

ermitteln, als auch die spätere Selektion stabiler Transformanten in planta zu ermöglichen.

4.1 Etablierung der Transformation von U. fabae in vitro

Die meisten Publikationen über die transiente Transformation (in vitro) von Rostpilzen

schließen einen Gentransfer mittels Genkanone ein (Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993;

Schillberg et al. 2000). Auch wenn in allen Fällen die gleiche Biolistik-Apparatur verwendet

wurde, variieren die verwendeten Parameter wie der Heliumdruck oder die Beschussdistanz

(Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993). Die Gemeinsamkeit in diesen Arbeiten war, dass als

Zielzellen für den Beschuss die Uredosporen verwendet wurden oder wie im Fall von Barja et

al. 1998 die von Uredosporen ausgehenden Infektionsstrukturen (Mikroinjektion), auch

DISKUSSION 73

wenn die transformierten Rostpilzarten makrozyklisch waren. Basidio- und Pyknosporen sind

haploid und wären ein ideales Target für Transformation, jedoch sind diese im Vergleich zu

anderen Sporenarten nicht robust und können darüber hinaus nicht in ausreichender Menge

produziert werden. Uredosporen dagegen sind sehr robust und werden in großen Mengen

während der Vegetationsperiode produziert (Deising et al. 2002). Ein weiterer bedeutender

Grund, Uredosporen für die Transformation von U. fabae zu nutzen ist, dass die meisten

biochemischen, molekularen und zytologischen Arbeiten über Rostpilze mit Uredosporen

und deren Infektionsstrukturen durchgeführt wurden (Heath 2000; Szabo und Bushnell

2001; Voegele 2006; Ellis et al. 2007).

4.1.1 Ermittlung der optimalen Parameter für die Biolistik

Die Ermittlung der optimalen Parameter für die biolistische Transformation richtet sich nach

der Natur der Zielzellen (Konidien, Myzel usw.) und der physikochemischen Intensität der

Zellwand. Die gründliche Ermittlung der Faktoren für Biolistik bei U. fabae (Lenz 2005) hat

sich bereits am Anfang dieser Arbeit als positiv bestätigt. Als Microcarrier wurden 1 µM

Goldpartikeln bei einem Heilumdruck von 2200 psi (152 bar) und einer Beschussdistanz von

6 cm verwendet. Bei Uromyces appendiculates z.B. waren ein Heliumdruck von 1550 psi und

eine kürzere Beschussdistanz von 2,5 cm bereits ausreichend für eine transiente

Transformation (Li et al. 1993). Bei allen in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten

wurden Uredosporen von U. fabae benutzt. Auch die Hydrierung der Sporen vor dem

Beschuss und eine optimale Verteilung durch das Aufsprühen auf Objektträger mittels einer

Airbrush HP-200 nach der Biolistik, haben wichtige Voraussetzungen für die optimale

Vereinzelung und Keimung der Uredosporen geschaffen.

4.1.2 Regulatorische Elemente

Ein wichtiger Faktor für die erfolgreiche Expression von Transgenen stellt die Auswahl von

Promotor und Terminator dar. Die Expression der Fremd-Gene in anderen Rostpilzen wurde

unter Kontrolle von, entweder endogenen regulatorischen Elementen (Bhairi und Staples

1992; Schillberg et al. 2000), regulatorischen Elementen von nahe verwandten Pilzen (Webb

et al. 2006) oder dem CaMV 35S Promotor-Fragment (Li et al. 1993) durchgeführt. In

Anbetracht möglicher Schwierigkeiten bei der Benutzung von heterologen regulatorischen

DISKUSSION 74

Elementen (Christiansen et al. 1995) und der Tatsache, dass Informationen über genetische

Elemente in U. fabae zur Verfügung standen (Voegele 2006), wurden für die Transformation

von U. fabae endogene Promotor- und Terminator-Sequenzen gewählt. Für Uf-TBB1(E198A)

wurde der gesamte genomische Bereich mit den eigenen regulatorischen Elementen

verwendet. Für die Expression aller anderen Transgene wurden die Promotor- und

Terminatorsequenzen aus Uf-PMA1 (Struck et al. 1996) gewählt. Für die Plasmamembran

ATPase (PMA1) konnte gezeigt werden, dass sie in allen Stadien der von Uredosporen

ausgehenden Infektionsstrukturen, diese konstitutiv exprimiert wird (Wirsel et al. 2001).

Dies ergab eine gute Voraussetzung für die Transformation von U. fabae.

4.1.3 Farbmarker

Bei Uromyces appendiculatus (Bhairi und Staples 1992; Li et al. 1993), Puccinia graminis f. sp.

tritici (Schillberg et al., 2000) sowie Puccinia triticina (Webb et al. 2006) wurde mittels

Biolistik das Gen für die β-Glucuronidase (GUS) in vitro transformiert. Anfangs wurde auch

bei der biolistischen Transformation von U. fabae mit dem GUS-Farbmarker gearbeitet (Lenz

2005). Die Arbeiten waren zwar erfolgreich, jedoch sprachen die zeitaufwändige GUS-

Färbung auf Objektträgern für die anschließenden Screens, die großen Verluste an

gekeimten Sporen sowie die Tatsache, dass dieses System nicht für ein in vivo-Markierung

geeignet ist, für die Verwendung weiterer Farbmarker. Fluoreszenzproteine wie GFP oder

DsRed haben den wesentlichen Vorteil, dass keine Vorbehandlung zur Visualisierung

notwendig ist und die Möglichkeit zur in vivo-Markierung ohne Beeinflussung der Vitalität

der Infektionsstrukturen besteht. Die erste Transformation von filamentösen Pilzen mit GFP

wurden bei dem Basiodiomyceten Ustilago maydis durchgeführt (Spellig et al. 1996). Dieser

Marker wird weiterhin z.B. für Puccinia graminis f. sp. tritici erfolgreich eingesetzt (Fehser

und Moerschbacher 2010). Varianten des Green fluorescent protein wie eGFP (Enhanced

GFP) und iGFP (Intron GFP), die sich durch eine stärkere Fluoreszenz und dadurch leichtere

Visualisierung im Vergleich zu GFP auszeichnen, wurden auch für U. fabae in Betracht

gezogen. Für GFP (Lenz 2005) und eGFP wurde festgestellt, dass bei der

Anregungswellenlänge für GFP gleichzeitig eine starke Autofluoreszenz der Sporen auftritt.

Für iGFP konnte gezeigt werden (Lugones et al. 1999, Burns et al. 2005), dass Einführung

eines Introns in GFP notwendig ist um die Fluoreszenzstärke zu erhöhen. Durch diese Intron-

Einführung wird die Effizienz der RNA 3‘ Prozessierung erhöht und in Folge auch die Menge

DISKUSSION 75

an cytoplasmatischer RNA (Huang und Gorman, 1990), was die Erhöhung der

Fluoreszenzintensität bei iGFP erklärt. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit das

Plasmidkonstrukt pRV117 mit iGFP als Marker in der biolistischer Transformation geprüft. Es

war schnell festzustellen, dass auch in diesem System die Einführung eines Intron in die GFP-

Sequenz eine wesentliche Verbesserung für die Screens der Transformanten darstellt, da nur

eine deutlich schwächere Autofluoreszenz der Sporen auftritt. Eine zusätzliche Verbesserung

der Fluoreszenz wurde durch eine Inkubation der Objektträger vor der Mikroskopie bei 37 °C

für 2 h erzielt (Abb. 3.2).

Parallel dazu wurde mit einem zweiten Fluoreszenzfarbmarker, DsRed, gearbeitet. Eine

etwas höhere Transformationseffizienz von 13 ± 10 (2,9 x 10 -5) im Vergleich zu iGFP mit 10 ±

7 (2,4 x 10-5) Transformanten im Mittelwert der 4,4 x 105 gescreenten Sporen pro

Objektträger, sowie die leichtere Identifizierung der Transformationsereignisse während den

Screens sprachen für DsRed als Farbmarker. Auch eine höhere Stabilität von DsRed bezüglich

der Ausbleichung der Fluoreszenz während der Anregung im Fluoreszenzmikroskop (Baird et

al., 2000) hat sich als positive Eigenschaft gegenüber iGFP in U. fabae Transformanten

hervorgehoben und auch in unseren Screens bestätigt. Beispiele für die Transformation

anderer Pilze mit DsRed sind Saccharomyces cerevisiae (Rodrigues et al. 2001) oder Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici (Nahalkova und Fatehi 2003). Mehrere Ascomyceten wurden mit

einer Variante von DsRed von Mikkelsen et al. 2003 erfolgreich transformiert. Nach

erfolgreicher Transformation von U. fabae mit pRV115 Plasmid (DsRed, Abb. 3.3), ein

weiterer Schritt sollte gemacht werden um zu zeigen, dass die transiente Transformation

von U. fabae mit DsRed in vitro tatsächlich ein reelles Transformationsereignis ist und die

identifizierten rotleuchtenden Keimschläuche das DsRed Protein exprimieren. Dafür wurde

dem Plasmid pRV115 ein Kernlokalisierungssignal (NLS) hinzugefügt und die Uredosporen

mit diesem Plasmid (pRV115-NLS) beschossen. Die Transformation war erfolgreich (Abb.

3.4). In allen transformierten, auf Objektträgern gekeimten Uredosporen konnte eine

subzelluläre Lokalisierung von DsRed in den Kernen festgestellt werden. Die rote Fluoreszenz

war eindeutig den Zellkernen zuzuordnen, so dass eine DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindol)–

Gegenfärbung nicht notwendig war. Zudem wurde eine weitere Behandlung der

Objektträger durch DAPI-Färbung die Vitalität der gekeimten Sporen stark beeinflussen und

einen Verlust der Fluoreszenz beifügen. Somit konnte mit dem pRV115-NLS-

DISKUSSION 76

Plasmidkonstrukt eindeutig gezeigt werden, dass die rote Fluoreszenz dem Farbmarker

DsRed zuzuordnen ist und die selektionierten Uredosporen tatsächlich transformiert sind.

Zu den Einfachkonstrukten, die nur einen Farbmarker trugen wurden anschließend die

beschriebenen Fungizidmarker (Abschnitt 4.2) hinzugefügt, um eine Doppelselektion mit

zusätzlicher Fungizidapplikation für eine Vermehrung in planta zu ermöglichen.

Doppelkonstrukt pRV111::DsRed wurde bereits in vitro untersucht und es konnte festgestellt

werden, dass so transformierte Sporen beim Besprühen auf Objektträger und zusätzlichen

Behandlung mit Carboxin den Wachstum mit rot fluoreszierenden Keimschläuchen einstellen

und schließlich absterben (Abb. 3.6). Ohne Fungizidapplikation konnten diese Sporen

ungehindert weiterwachsen und sich auf einer strukturierten Unterlage (aufgeraute PE-

Folie) unter Bildung von Appressorien differenzieren.

4.2 Transformationsansätze für in planta Versuche

4.2.1 Fungizidmarker

Die Auswahl der Marker für eine Selektion der transformierten Uredosporen in planta war

einer der wichtigsten Punkte für diese Arbeit. Auch wenn bereits Versuche für eine

Transformation von V. faba durchgeführt worden sind (Böttinger et al. 2001), konnten keine

Hygromycin B-resistenten Bohnenpflanzen erzeugt werden, womit diese Selektions-

möglichkeit nicht zur Verfügung steht. Aufgrund der Hygromycin B-Sensibilität von V. faba

Pflanzen wurde daher auf dieses Antibiotikum als Marker für die Transformation verzichtet.

Es war daher naheliegend, die Auswahl der Marker auf Fungizide zu beschränken, welche die

Wirtspflanze nicht schädigen. Für andere Systeme war bekannt, dass die Einführung von

Punktmutationen in das -Tubulin- bzw. Succinat-Dehydrogenase-Gen eine Resistenz

gegenüber den Fungiziden Benomyl bzw. Carboxin vermittelt. Der Wirkort des Fungizids

Benomyl sind die Mikrotubuli, was dazu führt, dass wichtige Prozesse wie der intrazelluläre

Transport und die Zellteilung nicht mehr ablaufen. Benomyl wirkt dabei selektiv und bindet

bevorzugt an Mikrotubuli pilzlichen Ursprungs (Ohkawa et al. 2007). Benomyl wurde 1968

von Fa. DuPont entwickelt und erfolgreich gegen pathogene Pilze im Pflanzenbau

angewandt. Für dieses Benzimidazol wurde im Jahr 2003 vom Bundesamt für

Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) die Zulassung widerrufen

(www.bvl.bund.de/infopsm). Ein gezielter Aminosäureaustausch im -Tubulin-Gen bewirkt

DISKUSSION 77

eine Resistenz gegen Benomyl (Jung et al. 1992; Reijo et al. 1994). Bei der Succinat-

Dehydrogenase handelt es sich um einen Enzymkomplex aus dem Citratzyklus, der aus

mehreren Einheiten besteht und in die Elektronentransportkette der inneren

Mitochondrienmembran eingebunden ist. Als Angriffspunkt von Carboxin wird eine Eisen-

Schwefel-Untereinheit (Fe-S) beschrieben (Ackrell et al. 1977, Skinner et al. 1998).

Punktmutationen im dritten Cystein-reichen Cluster der Fe-S Untereinheit bewirken eine

Resistenz gegen das Fungizid Carboxin (Broomfield und Hargreaves 1992; Matsson et al.

1998; Honda et al. 2000). Durch die Charakterisierung der Gene Uf-TBB1 und Uf-SucDH1

(Wirsel et al. 2004) konnten die entsprechende Punktmutationen eingeführt werden (Abb.

3.7) und die Gensequenzen für die Plasmidkonstruktion benutzt werden. In der Handhabung

waren deutliche Unterschiede zwischen den beiden verwendeten Fungiziden für die U. fabae

Transformanten festzustellen. Für Carboxin und Benomyl. wurde zunächst eine

Konzentrationsreihe in vitro und anschließend in planta durchgeführt, um die notwendige

Menge zu ermitteln, die eine sichere Unterdrückung der Keimung des Wildtyps

gewährleistet. Dabei standen bereits erste Erfahrungswerte aus den von Wirsel et al. 2004

durchgeführten Experimenten zur Verfügung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass

eine Konzentration von 250 µg/ml Carboxin notwendig ist, um die Bildung von WT-Uredia in

inokulierten V. faba Pflanzen vollständig zu unterdrücken, wenn die Fungizidapplikation

durch Aufsprühen 3 Stunden nach der Inokulation durchgeführt wird. Im Gegensatz dazu

zeigt die vorliegende Arbeit, dass bereits 25 bis 50 µg/ml Carboxin völlig ausreichend sind,

um den WT in planta vollständig zu unterdrücken (Abb.3.8). Auch die in vitro Ergebnisse mit

Carboxin lieferten ein ähnliches Bild (Abb. 3.5 A, B). Für Benomyl präsentierte sich ein

anderes Verhältnis, hier waren deutlich höhere Konzentrationen notwendig, um den Wildtyp

zu unterdrücken. Die von Wirsel et al. als ausreichend beschriebene Konzentration von 2,5

mg/ml (in planta) und 5 mg/ml (in vitro) von Benomyl, führte nur zu einer unzureichenden

Unterdrückung der Keimung der WT-Sporen. Sowohl in vitro (Abb. 3.5 E, F) als auch in planta

(Abb. 3.9) konnte festgestellt werden, dass mindestens 10 mg/ml Benomyl notwendig sind,

um eine vollständige Unterdrückung der Sporenkeimung zu erzielen. Zudem stellte sich die

Löslichkeit von Benomyl bei höheren Konzentrationen problematisch dar. Bereits ab 5

mg/ml war eine sichtbare kristalline Ausfällung in der Benomyllösung feststellbar. Die 10

mg/ml konzentrierte Fungizidlösung hinterließ zusätzlich einen Belag auf den behandelten

Blättern, was eine zusätzliche Barriere für die Keimung potentieller Transformanten

DISKUSSION 78

darzustellen schien (Abb. 3.11). Die insgesamt unzufriedenstellende Handhabung, die nur

wenigen selektionierten Uredosporenlager als potentielle Träger des Uf-TBB1(E198A) und

die Tatsache, dass dieses Fungizid europaweit nicht mehr zugelassen und damit schwierig zu

beschaffen ist, führte dazu, den Schwerpunkt der Experimente in dieser Arbeit auf die

Carboxin-Selektionen zu legen.

4.2.2 Selektionsschema

Das Ausbringen der Transformationsansätze auf V. faba Pflanzen mit einer Airbrush HP-200

führt zu einer optimalen Verteilung der Sporen und einer gezielten Inokulation der einzelnen

Blätter. Ebenso ergibt sich durch das Versprühen der Fungizide für die Selektion der

transformierten Uredosporen mittels Airbrush eine gleichmäßige Benetzung der Blätter, die

wichtig für eine lückenlose Behandlung aller ausgebrachten Sporen ist. Anfänglich wurde die

Fungizidbehandlung der Pflanzen für die Diskriminierung von Wildtyp- und potentiell

transformierten Sporen, analog zu den in vitro Versuchen, drei Stunden nach der

Ausbringung der Transformationsansätze durchgeführt. Es konnte wiederholt festgestellt

werden, dass gar keine oder nur vereinzelt Uredosporenlager gebildet werden. Erst nach

dem Verzicht auf eine Selektion in diesem ersten Schritt der Uredosporenvermehrung

konnten erste Erfolge erzielt werden. Auch die Beobachtung, dass bei unter Selektionsdruck

wachsenden potentiellen Transformanten das Durchbrechen durch die Blattoberfläche und

das sichtbare Öffnen der Uredia im Vergleich zum WT mit einer Verzögerung von ca. 2 Tagen

auftritt (Anhang, Abb. 8.3), unterstützten die Entscheidung, die erste Selektion erst auf der

zweiten Pflanze durchzuführen, um für alle potentiellen Transformanten die notwendige Zeit

zur vollständigen Entwicklung auf der ersten Pflanze zu gewährleisten. Somit wurde nach 10-

14 Tagen von der Pflanze eine Mischung aus WT- und transformierten Uredosporen

gesammelt und im nächsten Vermehrungsschritt auf der „zweiten Pflanze“ für eine erste

Selektion (S1) erneut ausgebracht.

4.2.2.1 Problematik der ersten Selektion (S1)

Der Schritt der ersten Selektion auf der zweiten Pflanze stellte sich als kritischster Schritt des

gesamten Selektionsschemas in planta dar. Die einzelnen Uredia stellen in der S1 jeweils

einen Genotyp dar und wurden einzeln gesammelt, um für spätere Selektionsrunden jeweils

DISKUSSION 79

eine Transformationslinie zu bilden. Aufgrund der geringen Sporenmenge und der

schwierigen Handhabung, vor allem aufgrund der starken Hydrophobizität der

Sporenoberfläche auf. Desweiteren ist die Wiederausbringung der einzelnen Uredia im

nächsten Selektionsschritt problematisch. Mehrere methodische Verbesserungen wurden

erprobt, um möglichst wenig Verlust zu verursachen und optimale Bedingungen dafür zu

schaffen, dass im nächsten Selektionsschritt (S2) möglichst viele Uredosporenlager gebildet

werden (Anhang, Abb. 8.1). Kerosin eignet sich aufgrund der polaren chemischen

Eigenschaft als ideales Medium für Aufnahme und Verteilung von Sporen, jedoch verursacht

es bei einem Volumen von > 50 µl pro Blatt eine starke Nekrotisierung der Pflanze und die

teilweise oder ganze Zerstörung des Blattes. Bei der Anwendung von weniger als 50 µl

reichte die Flüssigkeitsmenge nicht aus, um alle aufgenommenen Sporen mittels Airbrush

auf das Blatt zu sprühen, womit inakzeptable Verluste auftraten. Eine andere Möglichkeit

ergibt sich, wenn die einzelnen Uredia aus dem Zentrifugengefäß auf die befeuchteten

Pflanzenblätter gegeben wurden und die Sporen dann mit einem Laborlöffel (oder einem

Gegenstand mit glatter Oberfläche) verteilt wurden (Abb. 8.1, C). Diese Methode wurde,

sofern die Sporenmenge nicht für eine Vorhydrierung ausreichte, bei allen weiteren

Selektionsschritten angewandt.

4.2.2.2 Propagation der Transformantenlinien in planta

Nach der Ausbringung einzelner Uredosporenlager aus der S1 mit Carboxin war eine

Vermehrung in der Größenordnung von durchschnittlich ca. 50 Uredia zu erwarten, wie

bereits für den WT und bei der selben Art der Ausbringung ermittelt (Abb. 8.1). Dies war

jedoch nicht der Fall. In der zweiten Selektionsrunde (S2) zeigte sich ein sehr heterogenes

Bild der Urediadichte pro Blatt. Die Transformationslinien, die unter Carboxindruck weiter

gewachsen waren, ergaben eine Streuung in der Anzahl der Uredia pro Blatt von 1 bis 100

wobei die meisten im Bereich zwischen 1 und 20 propagierten Uredosporenlager lagen.

Wurden diese Sporen geerntet, um sie anschließend in einem weiteren Selektionsschritt (S3)

zu propagieren, ergab sich ein ähnliches Bild wie bei der Propagation mit einzelnen

Uredosporenlager. Die Anzahl der propagierten Uredia stieg nur gering an, blieb gleich oder

reduzierte sich von 20 auf z.B. 1 bis 2. Diese Beobachtung ergab sich in allen in planta

Experimenten, unabhängig von Transformationsmethode und Selektionsschritt. Daraus lässt

sich vermuten, dass im ersten Selektionsschritt bei der Vermehrung einzelner Uredia in der

DISKUSSION 80

S2, nicht alle potentiell transformierten Uredosporenlager propagierbar waren, bedingt

durch Ausbringungsart und Selektionsbedingungen. Ein Aussetzen des Selektionsdrucks zum

Beispiel in der vierten Selektion (S4) auf die S5 und eine Anreicherung der Sporen als

Zwischenschritt, um eine größere Menge erneut für die S5 ausbringen zu können, resultierte

meistens im Ausfall aller getesteten Ansätze. Die erneut mit Carboxin behandelten

Uredosporen keimten in drei von vier Fällen nicht wieder aus. Demnach schienen die U.

fabae Transformanten die potentiell in das Genom eingebaute SucDH1(H254L) bzw.

SucDH1(H254Y) herunter zu regulieren oder auszuschalten.

4.3 Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation (ATMT)

Zusätzlich zu den ersten Erfolgen nach der biolistischen Transformation von U. fabae und der

Etablierung einer transienten Transformation in vitro wurde als eine zweite Methode, für

eine stabile Transformation, die Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation

verwendet. In der Literatur finden sich zunehmend Berichte über eine erfolgreiche

Transformation von filamentösen Pilzen durch ATMT, dabei gliedern sich die Ziele in drei

Gruppen: 1) „Forward genetics“ (z.B. zufällige Mutagenese), 2) „Reverse genetics“ (z.B.

gezielte Modifikation des Genoms und zufällige Integration in das Genom) und 3) Einführung

von Reportergenen wie GUS, GFP oder RFP für ein in situ Monitoring (Frandsen 2011). Seit

dem ersten Bericht über die ATMT (de Groot et al. 1998) wurde diese Methode bis heute für

mehr als 125 verschiedene Pilzarten angewandt, die aus verschiedenen Klassen stammen,

von den Ascomyceten, Basidiomyceten bis den Zygomyceten sowie Vertretern der Abteilung

Glomeromycota und Oomycota (Frandsen 2011). Für diese Arbeit wurde eine Kombination

der Protokolle aus verschiedenen Systemen geprüft. Dabei wurden insbesondere die

Auswahl des Agrobacterium-Stammes, die Induktionsdauer der Agrobakterien für die

Transformation sowie das Verhältnis von Agrobakterien und Uredosporen zur Kokultivierung

geprüft.

4.3.1 Parameter für die ATMT von U. fabae

Insgesamt drei Agrobacterium-Stämme wurden für diese Arbeit verwendet: LBA1100

(Beijersbergen et al. 1992), AGL-1 (Lazo et al. 1991) und GV3103 (Holsters et al. 1980). Die

optimale Kultivierungstemperatur für Agrobakterien liegt bei 28 °C, jedoch wird die

DISKUSSION 81

Temperatur für Kokultivierung mit Pilzen und die Übertragung der T-DNA mit 22-25 °C als

optimal beschrieben (Michielse et al. 2005; Ando et al. 2009). Die mikroskopische

Auswertung der Versuche zur Keimung von U. fabae in vitro bei verschiedenen

Temperaturen zeigten, dass 96-98 % der Sporen bei Temperaturen zwischen 20 und 24 °C

Keimschläuche ausbilden und somit die optimale Temperatur in diesen Bereich liegt. Bei 24

°C beginnt eine stressbedingte Verzweigung der Keimschläuche, die Keimungsrate wird

jedoch nicht beeinflusst. Oberhalb von 27 °C kommt es mit durchschnittlich 84 % zur

deutlichen Abnahme der Anzahl gekeimter Sporen und zur Reduzierung der

Keimschlauchlänge. Bei 29 °C keimen nur noch 34 % der Sporen auf den Objektträgern.

Darüber hinaus wird bei Temperatur höher als 28 °C die T-DNA-Maschinerie der

Agrobakterien negativ beeinflusst (Fullner und Nester 1996). Bei 24 °C für Kokultivierung

liegt somit das Optimum für die Kultivierung beider Organismen vor. Problematisch dagegen

ist die Dauer der Kokultivierung von Agrobakterien und Uredosporen, die in U. fabae System

nicht veränderbar ist. Bei nicht obligat biotrophen Pilzen ist die Kokultivierung in

Kulturmedium, um die höchste Transformationseffizienz zu erzielen, unbegrenzt möglich

und variiert bei verschiedenen transformierten Pilzen zwischen einem und mehreren Tagen

(Michielse et al. 2005). Für eine Propagation von U. fabae müssen die Experimente zur

stabilen Transformation jedoch in planta durchgeführt werden. Etwa 6 Stunden nach

Inokulation der Pflanzen haben sich die Keimschläuche mit Appressorien gebildet und der

Pilz beginnt die Pflanze zu penetrieren (Deising et al. 1991). Diese Zeitspanne muss für die

Agrobakterien ausreichen, um eine Übertragung der T-DNA in U. fabae zu vollziehen.

Narasimhulu et al. 1996 konnten für BY2 Tabakzellen die mit Agrobacterium transformiert

wurden zeigen, dass nur 2 Stunden für einen T-DNA Transfer und die erfolgreiche

Transformation ausreichend sind.

Die Zugabe von Acetosyringon (AS) von bis zu 500 µM in der Vorkultur der Agrobakterien

erhöht in den meisten Fällen die Transformationseffizienz, was darauf deutet, dass die

Induktion der vir-Gene in Agrobacterium notwendig für eine T-DNA Übertragung ist. Dies hat

sich jedoch nicht in jedem System bestätigt. So ergab sich bei Hebeloma cylindrosporum und

Colletotrichum trifolii keinen Unterschied in der Transformationseffizienz, wenn die

Agrobakterien mit AS im Kulturmedium vorkultiviert worden waren (Combier et al. 2003;

Takahara et al. 2004). Eine deutliche Erhöhung der Anzahl transformierter Zellen konnte

dagegen in Magnaporthe grisea, Fusarium oxysporum, Beauveria bassiana, Aspergillus

DISKUSSION 82

awamori oder Mortierella alpina bei Induktion mit AS erzielt werden (Rho et al. 2001;

Mullins et al. 2001; Leclerque et al. 2003; Michielse et al. 2008; Ando et al. 2009). Bei U.

fabae konnte eine deutliche Erhöhung der Transformationseffizienz festgestellt werden,

wenn 200 µM AS zum Vorkulturmedium gegeben wurde (Abb. 3.21).

Die Dauer der Induktion mit Acetosyringon wurde mit AGL-1pRV112 in drei Varianten

getestet, 6, 12 und 24 Sunden der Inkubation im Induktionsmedium. In der Literatur sind

unterschiedlich lange Zeiten für Induktion der Agrobakterien vor der Kokultivierung mit den

Zielzellen beschrieben. Die meisten Protokolle beziehen sich auf eine Induktionszeit von 6

Stunden (Rho et al. 2001; Mullins et al. 2001; Degefu und Hanif 2003; Meyer et al. 2003;

Rogers et al. 2004; Talhinhas et al. 2008; Kemppainen und Pardo 2011). In anderen Arbeiten

wurde die Dauer der Agrobakterien-Induktion mit AS zwischen 0 und 24 Stunden variiert

(Leclerque et al. 2004; Ando et al. 2009). In U. fabae System wurde bestätigt, dass Induktion

von Agrobakterien für 6 Stunden signifikant höchste Transformationseffizienz erweist (Abb.

3.20). Die stark zurückgegangene Aktivität der vir-Gene in anderen Varianten (12 und 24 h)

könnte auf eine Stressreaktion der Agrobakterien während der andauernden Induktion mit

Acetosyringon hindeuten.

Ein weiterer Faktor, der entscheidend für eine erfolgreiche Transformation sein kann, ist das

Verhältnis der Anzahl verwendeter Agrobakterien zu Uredosporen in einem

Transformationsansatz. Verschiedene andere Studien haben gezeigt, dass für jeden Pilz eine

optimale Anzahl von Agrobakterien besteht, mit der Tendenz, dass bei einer größeren Zahl

der Bakterien pro Empfängerpilzzelle auch eine höhere Transformationseffizienz eingeht

(Michielse et al. 2005). Es existiert jedoch eine Obergrenze für dieses Verhältnis und eine zu

hohe Anzahl von Agrobakterien kann die Transformationseffizienz reduzieren. Bei U. fabae

konnte mit einem Verhältnis von 1 : 100 im Vergleich zu 1 : 200 eine signifikant höhere

Anzahl potentieller Transformanten erzielt werden (Abb. 3.22). Bei Aspergillus giganteus

wurde eine vergleichbare Tendenz festgestellt. Bei einem Verhältnis von über 1 : 120 wurde

hier eine sinkende Anzahl von Transformanten gezählt (Meyer et al. 2003).

Die Auswahl der Agrobakterien-Stämme für die Transformation von U. fabae richtete sich

nach Literaturhinweisen. Nach den ersten Experimenten in vitro und in planta, wurden

neben dem Stamm LBA1100 auch die Stämme GV3103 und AGL-1 mit Plasmidkonstrukten

für U. fabae transformiert. Deutlich hervorgehoben hat sich in den Versuchen in planta der

Stamm AGL-1 mit einer signifikant höheren Effizienz (3,6 x 10-5) im Vergleich zu

DISKUSSION 83

Transformation mit LBA1100 (1,4 x 10-5) und GV3103 (2,5 x 10-5). Die Darstellung in Tabelle

3.14 gibt die Anzahl der erzeugten Transformationslinien von U. fabae mit allen drei

Stämmen wieder. Um die relativen Zahlen zu verdeutlichen dient die Abbildung 4.1 mit einer

Übersicht zum Anteil der weiter propagierten Linien von der ersten Selektion bis zum Verlust

der Transformanten.

Abbildung 4.1: Übersicht über die Propagation von Transformantenlinien während der Selektion in planta. Die Darstellung bezieht sich auf Tabelle 3.15.

Von jeweils 100 ausgebrachten einzelnen Uredosporenlager aus der ersten für die zweite

Selektion (S2), nach Transformation mit LBA1100pRV112 (Abb. 4.1), wurden 45 Linien

propagiert, 55 von 100 Linien fielen während der Selektion mit Carboxin in der S2 aus. Für

die nächste Selektionsrunde wurden 40 von vorhandenen 55 Linien ausgebracht. Die 40

ausgebrachten Linien wuchsen in der S3 zu 65 % weiter (26 Transformationslinien) und 14

Linien fielen aus. Diese Verluste traten in allen Versuchen und Selektionsrunden in planta

mit verschiedenen Stämmen und Plasmidkonstrukten auf. Analog zu der Erfahrung mit den

biolistischen Transformanten in planta war auch bei der ATMT nur eine geringe Anzahl an

Uredosporenlager in der jeweilig nächsten Generation, unter Selektionsdruck propagiert, zu

finden. Schließlich fielen die einzelnen Linien nach 3 bis 8 Selektionsrunden ganz aus. Die

Ursache für diese Verluste ist nicht vollständig klärbar. Mehrere Gründe können hierzu

beigetragen haben. Einerseits die Art und Bedingungen während der Propagation in planta,

S1 S2

S3

S4

S5

S6 S7

S8

S1 S2

S3

S4

S5

S6 S7

S8

LBA1100pRV112 AGL-1pRV112 GV3103pRV114

100

45 55

26 14

3 17

100

63 37

24 26

8 12

3 5

1 2

100

58 42

23 22

14 6

6 8

3 3

1 2

DISKUSSION 84

anderseits die Prozessierung auf molekularer Ebene, die nicht vollständig verfolgt werden

kann.

4.4 Mögliche Ursachen der Problematik bei der Propagation von Transformantenlinien

Für die beiden verwendeten Methoden zur Transformation von U. fabae trat die gleiche

Problematik bei der Propagation bzw. Fortführung der gewonnenen Transformantenlinien

aus der ersten Selektion (S1) auf. Obwohl zahlreiche Optimierungsschritte zur Ausbringung

der potentiell transformierten Uredosporen durchgeführt wurden, schien das Verfahren

einen negativen Einfluss auf die Anreicherung der Uredosporenlager unter Selektionsdruck

mit Carboxin zu haben. Nachdem Wildtyp-Sporen, die auf gleicher Weise gehandhabt

wurden, jedoch mit Wasser statt Fungizid behandelt worden waren, die zu erwartende

Propagationsrate aufwiesen (Abb. 8.1), ist zu vermuten, dass die Ursache in der

Carboxinkonzentration liegt. Anfänglich wurde anhand der Konzentrationsreihe festgestellt

(Abb. 3.8), dass 25 bis 50 µg/ml Carboxin notwendig sind, um eine Keimung der WT-Sporen

in planta zu unterdrücken. In vitro Experimente zeigten, dass 50 µg/ml für eine vollständige

Keimungshemmung benötigt werden, da in den mit 25 µg/ml behandelten Varianten immer

wieder vereinzelt ausgekeimte Sporen zu finden waren die Ihr Wachstum fortgesetzt haben.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Wirsel et al. 2004, bildeten einige Uredosporen in

dieser Arbeit auch bei Konzentrationen oberhalb von 50 µg/ml (bis 500 µg/ml) Carboxin in

vitro Keimschläuche, die jedoch sichtbar abstarben und nicht weiter wuchsen. Die

Verwendung von weniger als 50 µg/ml Carboxin in Selektionsschritten nach der S1 könnte

eventuell Abhilfe verschaffen. Dies muss jedoch experimentell ermittelt werden und wurde

aus Zeitgründen im Rahmen dieser Arbeit nicht getestet. Ein zweiter Grund, warum

transformierte Uredosporen nicht mit einer höheren Keimungsrate in planta propagieret

werden konnten, ist auf molekularer Ebene zu suchen. Die Integration der Transgene in das

U. fabae-Genom ist nur begrenzt nachweisbar und die Lokalisierung der Geninsertion kann

aufgrund der fehlenden Genomsequenz nur schwer analysiert werden. Auch ist unbekannt,

welcher Mechanismus der Integration der mutierten Succinat-Dehydrogenase im jeweiligen

Fall vorliegt.

DISKUSSION 85

4.5 Analyse der Transformation auf molekularer Ebene

Die Analyse der DNA transformierter Uredosporen wurde primär mittels PCR durchgeführt.

Die Versuche, in vitro Transformanten, die mit Farbmarker (DsRed, iGFP) beschossen wurden

zu analysieren, erwiesen sich als schwierig. Nach Abnehmen der gekeimten Sporen, die

DsRed-Transformanten enthielten, von den Objektträgern und einer anschließende DNA-

Präparation ergaben sich in der PCR-Analyse keine Unterschiede zwischen DsRed

Transformanten und dem Plasmid pRV115. Nach dem Beschuss von Uredosporen mit den

Farbmarkerplasmiden (pRV115; pRV117) befanden sich im Transformationsansatz, der zur

Keimung und für die spätere mikroskopische Auswertung auf Objektträger aufgesprüht

wurde, Plasmidreste bzw. ganze Plasmide, die nicht in die Zellen gelangt waren. Die PCR-

Analysen mit einem DsRed spezifischen Primerpaar haben gezeigt, dass nicht zwischen

transformierten Uredosporen, die DsRed tragen und dem schwachen, aber präsenten

Hintergrundsignalen der DsRed-Plasmide die sich auf dem Objektträger befanden,

unterschieden werden kann (Ergebnisse nicht gezeigt). Somit wurden alle Analysen des

Genoms von U. fabae mit DNA aus Uredosporen, aus in planta Experimenten durchgeführt.

Für die Untersuchung der potentiellen Transformaten in der ersten Selektion konnte nur auf

die limitierte Sporenmenge aus einzelnen Uredosporenlager zurückgegriffen werden. Die

DNA Präparation ergab in vielen Fällen eine Konzentration und Gesamtmenge, die nicht

ausreichend für die PCR war. Amplifikation des gesamten Genoms mittels REPLI-g Kit brachte

zunächst Erfolge (Abb. 3.12), konnte aber aufgrund der hohen Kosten nicht bei allen zu

prüfenden angewandt werden. Der nächste Schritt war deshalb die Etablierung einer Nested

PCR-Analyse zum Nachweis der transgenen Succinat-Dehydrogenase in den selektionierten

Sporen. Mit spezifischen Primern, die nur bei einer Kombination von regulatorischen

Elementen der Plasmidkonstrukte (pPMA1-SucDH1(H254Y) ein Amplifikationsprodukt

ergeben, kann eine eindeutige Unterscheidung zum Wildtyp getroffen werden (Abb. 4.2).

Somit konnte mit dieser Methode eine große Anzahl von Transformantenlinien auf das

Vorhandensein der transgenen Succinat-Dehydrogenase überprüft werden. So konnte

gleichzeitig auch eine Auswahl der Transformantenlinien erfolgen, die mittels Southern Blot

analysiert werden sollten (s. Abschnitt 4.5.1). Für die Analyse der Transformanten-DNA

wurden zudem andere PCR Methoden erprobt. Den zuverlässigsten Nachweis lieferte die

SNP-PCR-Analyse für die biolistische Transformanten (Abb. 3.18 und 3.19).

DISKUSSION 86

P1 + P2 P3 + P4

T

WT

P1 P3

P4 P2



P4 P2

Abbildung 4.2: Nested-PCR Modell für den Nachweis der transgenen SucDH1 in U. fabae Transformanten. Mit der verwendeten Primerkombination kann aufgrund der Kombination der Gene mit regulatorischen Elementen nur in U. f. Transformanten-DNA ein Amplifikationsprodukt in der erwarteten Größe entstehen.

Nachdem ein Unterscheid in den Integrationsprozessen von Transgenen nach Biolistik bzw.

ATMT vorliegt, wurde diese Methode nur für die biolistischen Transformanten verwendet.

Nach ATMT wurde jedoch zusätzlich eine Untersuchung zum Vorhandensein der ganzen

Plasmide durchgeführt (Abb. 3.27). Einen Überblick über die verwendeten Methoden geben

die Abbildungen. 4.3 und 4.4.

Biolistik

Es besteht die Möglichkeit, dass die transgene SucDH1 über die homologen Sequenzen der

Uf-PMA1 und/oder der Uf-SucDH1 integriert wird (Abb. 4.3). Die Länge der homologen

Abschnitte in den Plasmidkonstrukten (ca. 600 bp und ca. 1100 bp in den regulatorischen

Elementen sowie homologe Sequenzen der Gene Uf-TBB1 und Uf-SucDH1) stellt eine gute

Voraussetzung für die Integration über eine homologe Rekombination dar. Im Fall A (Abb.

4.3) findet eine Rekombination über die regulatorischen Elemente der WT-PMA1 statt, was

eine mittels PCR-Analyse feststellbare Größenänderung der Gensequenz zur Folge hat. Die

verwendeten Uf-PMA1-spezifischen Primer amplifizieren ein Fragment von 5,5 kb im WT und

von 3,3 kb in den Transformanten.

Keine der analysierten Transformanten zeigte Abweichung in der Größe des 5,5 kb-

Amplifikationsproduktes, das der Wildtyp-PMA1 entspricht. Die SNP-PCR-Analysen brachten

dagegen klare Hinweise auf das Vorhandensein einer Punktmutation in der SucDH1 (Abb.

3.18 und 3.19) und damit auf die Integration der transgenen SucDH1(H254Y). Somit konnte

gezeigt werden, dass in den analysierten Transformantenlinien der Einbau in das U. fabae

Genom bevorzugt über homologe Sequenzen der Succinat-Dehydrogenase erfolgte.

DISKUSSION 87

PCR Nachweis (Unterscheidung der Größe)

1. Nested-PCR Nachweis der Plasmidkassette

2. SNP-PCR

A: Integration über Uf-PMA1 B: Integration über Uf-SucDH1

Abbildung 4.3: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom nach der Biolistik. Integration über A: homologe Sequenzen der Uf-PMA1 und B: Uf-SuDH1.

Aufgrund der Tatsache, dass die mit SNP-PCR positiv getesteten Transformanten auch ein

Signal in der Nested-PCR lieferten, besteht dennoch eine Unklarheit. Wenn die Integration

der SucDH1(H254Y) über die Uf-SucDH1 erfolgt, kann es keine Kombination der Elemente

pPMA1-SucDH1 in der Integrationsstelle geben. Es könnte jedoch zur Integration multipler

Kopien der transgenen Succinat-Dehydrogenase ins Genom von U. fabae gekommen sein,

sowohl durch homologe Rekombination als auch durch zufällige Integration in das Genom.

Beide Ereignisse können dann mit den zwei unterschiedlichen PCR Analysen identifiziert

werden.

ATMT

Bei Agrobacterium-vermittelten Transformation sind die komplexen Vorgänge und die

Integration der T-DNA in das Genom der Wirtszellen bis heute wenig verstanden. Mehrere

Modelle für die ATMT wurden entwickelt, hauptsächlich basierend auf Untersuchungen in

Pflanzen (Tzfira 2006; Lacroix et al. 2006b; Citovsky et al. 2007; Dafny-Yelin et al. 2008). Die

pilzliche Transformation mittels Agrobacterium wurde in Bezug auf Hefe (Saccharomyces

cerevisiae) tiefgehender berichtet als in filamentösen Pilzen. Während es in Pflanzen primär

zur zufälligen Integration der T-DNA in verschiedenen Loci im Genom über nichthomologe

Rekombination (non-homologous recombination, NHR) kommt, geschieht die Integration der

T-DNA in Hefe bevorzugt über homologe Rekombination (homologous recombination, HR),

DISKUSSION 88

(van Attikum und Hooykaas 2003). Frandsen et al. haben die unterschiedliche Möglichkeiten

und Verläufe der Rekombinationsereignisse in Pilzen, die durch Mitwirkung von DNA-

Reparaturmechanismen oder Schutzsystemen der Wirtszelle geschehen (anhand Berichten

für Hefe) zusammengefasst: 1) Integration über HR via Doppel-Crossover; 2) Degradation

durch Exonukleasen; 3) Bildung zirkulärer doppelsträngiger DNA und autonome Replikation;

4) zufällige Integration im Genom via „non-homologous end joining“ (NHEJ); 5) Integration

über HR via Single-Crossover zwischen „upstream“ oder „downstream“ der homologen

Sequenzen in T-DNA und Target Locus (Zielort im Genom); 6) Kombination der aufgezählten

Ereignisse (Frandsen et al. 2012). Bezogen auf U. fabae, wo es sich um eine Transformation

mit Genkonstrukten mit zum „target locus“ homologen Sequenzen handelt, kann die erste

Möglichkeit als unwahrscheinlich angenommen werden, weil es sich bei der Vermehrung der

potentiell transformierten Uredosporen um eine asexuelle Reproduktion bzw. mitotische

Teilung handelt. Der bei Pilzen beschriebene parasexuelle Zyklus, in dem eine

Rekombination nicht während der Meiose, sondern im Verlauf der mitotischen Teilung

stattfindet, hat nur bei den Fungi Imperfecti, die Ihre Fähigkeit zur sexuellen Vermehrung

verloren haben oder deren sexuelle Form noch nicht gefunden wurde, größere Bedeutung.

Folglich bleiben, abgesehen von der möglichen Degradation der in die Uredosporen

gelangten Transgene und damit dem Verlust der T-DNA, die Möglichkeiten 3), 4) und 5),

sowie die Kombination aus diesen. Die Abbildung 3.4. soll diese möglichen Ereignisse

verdeutlichen.

Die meisten Analysen der ATMT in dieser Arbeit wurden mittels Nested-PCR mit für das

Fragment pPMA1-SucDH1(H254Y) spezifischen Primern (Abb. 4.3; 3.25 und 3.26)

durchgeführt. Dieser Nachweis kann nur eine Aussage über das Vorhandensein der T-DNA in

der analysierten genomischen DNA und nicht über den Integrationsort oder ein mögliches

extrachromosomales Vorliegen der Transgene liefern. Aufgrund der Tatsache, dass das U.

fabae Genom noch nicht sequenziert wurde, ist ein genaueres Bestimmen der

Integrationsorte sehr schwierig. Der Versuch, eine SiteFinding-PCR (Tan et al. 2005) für das

System zu etablieren, erwies sich als schwierig, da die nur in geringer Zahl entstandenen

Amplifikationsprodukte aufgrund der zu geringen DNA-Menge nicht erfolgreich sequenziert

werden konnten. Die Schwierigkeiten bei der Anwendung dieser Methode in U. fabae

könnten durch die Spezifität der SiteFinder-Primer begründet sein, die in Kombination mit

den Right Border-spezifischen Primern ein Amplifikationsprodukt bilden sollten. Die mittels

DISKUSSION 89

1. Übertragung der T-DNA

a)

b)

2. Übertragung ganzer Ti-Plasmide

a) Homologe Rekombination (HR)

b) Zufällige Integration im Genom (NHEJ)

Ti-Plasmid

Uredospore

RB SucDH1(H254Y) LB

Ti-Plasmid

T-DNA

Uf-SucDH1 SucDH1(H254Y)

Abbildung 4.4: Möglichkeiten der Integration von SucDH1(H254Y) in U. fabae Genom bei Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens.

Nested-PCR analysierten Transformantenlinien zeigten dennoch ein Vorliegen der T-DNA

und die Uredosporen wuchsen in planta über mehrere Selektionsrunden mit Carboxin. Es

kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass es zu Bildung zirkulärer doppelsträngigen

DNA oder zur Übertragung ganzer Ti-Plasmide durch die Agrobakterien und somit zur

autonomen Replikation der T-DNA in den Uredosporen kommt. Untersuchungen in Hefe

haben gezeigt, dass ein unterschiedlicher Anteil an ganzen Ti-Plasmiden durch

DISKUSSION 90

Agrobacterium in die Wirtszellen übertragen wird (Bundock et al. 1995;). Neueste

Untersuchungen in der Pflanzen-ATMT zeigen, dass die Bildung komplexer

extrachromosomaler T-DNA sowie, deren Zirkularisierung und autonome Replikation viel

häufiger auftreten als bisher angenommen (Singer et al. 2012). Zur Überprüfung der U.

fabae Transformanten hinsichtlich des Vorliegens des verwendeten Ti-Plasmids wurden in

einer Nested-PCR spezifische Primer für das pBIN20-Backbone und die RB-Sequenzen

verwendet. In einigen analysierten Transformanten konnten schwache, aber eindeutige

Signale für die spezifischen Amplifikate identifiziert werden (Abb. 3.27), was darauf

schließen lässt, dass auch in U. fabae teilweise eine extrachromosomale Vermehrung und

Expression der mutierten Succinat-Dehydrogenase vorkommt und die Degradation der

extrachromosomalen DNA eine eventuelle Erklärung für den Verlust der einzelnen

Transformantenlinien in frühen Selektionsrunden darstellt. Ob es in einigen Fällen zur

späteren Integration ins Genom gekommen ist und welchen prozentualen Anteil diese

Transformanten an der Gesamtzahl aller selektionierten Linien einnehmen, konnte aus

Zeitgründen im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr überprüft werden.

4.5.1 Southern Blot Analyse

Zum endgültigen Nachweis einer stabilen Transformation und der Integration von

Transgenen in U. fabae sollte die Southern Blot Analyse dienen. Aus früheren Experimenten

war bekannt, dass für U. fabae eine Menge von mindestens 30 µg DNA benötigt wird, um

klare Signale in der Southern Blot Analyse zu bekommen (Abb. 3.28). Diese DNA-Menge war

bei Präparation potentiell transformierten Uredosporen aufgrund der geringen

Sporenmenge nicht zu gewinnen. Verschiedene Mengen und Präparationen der

genomischen DNA wurden getestet, es konnte jedoch in keiner der analysierten

Transformanten eine eindeutige Markierung der SucDH1 bei der verwendeten DNA-Menge

erreicht werden. Durch die Amplifikation der gesamten genomischen DNA durch das Repli-g

Kit ist es möglich, die verfügbare DNA Menge zu erhöhen, jedoch nach Herstellerangaben

auf maximal 10 µg pro Ansatz, für U. fabae lag der Wert bei maximal 6 µg. Da die DNA-

Konzentration in den amplifizierten Ansätzen aus einzelnen Repli-g Reaktionen mit der

herkömmlichen photometrischen Messungen nicht zu bestimmen sind, wurde die

Bestimmung der vorhandenen DNA im Rahmen dieser Arbeit mit dem Fluoreszenzfarbstoff

SYBR Green (Bindung an doppelsträngige DNA, Adsorption λmax = 494 nm, Emission λmax =

DISKUSSION 91

521 nm) durchgeführt und DNA-Mengen von weit unter 10 µg pro Ansatz gemessen. Auch

die Agarosegel-Analyse zeigte eine nicht gleichmäßig gute Ausbeute an Repli-g-amplifizierter

DNA, so dass auch das Vereinigen mehrerer Ansätze keine entscheidende Verbesserung für

die Southern Blot Analyse brachte (Abb. 8.7). Aus diesen Gründen wurde versucht, mit der

radioaktiven Markierung der Sonden (32P) eine sensitivere Southern Blot-Analyse zu

etablieren. Es zeigte sich jedoch, dass eine Markierung der verwendeten Sonden mit [alpha

32P]-dATP für die Detektion der Succinat-Dehydrogenase keine sensitivere Methode für

unseren System darstellt (Abb. 8.9). Dies konnte im direkten Vergleich mit der DIG-

Markierung festgestellt werden. Die mit 32P markierte Sonde band bevorzugt an Plasmid

DNA und die Expositionszeiten für die Erzeugung einer vergleichbaren Signalstärke waren

deutlich länger als bei der CSPD-Detektion (Abb. 8.8). Die Southern Blot-Analyse stellt somit

keine adäquate Methode zum Nachweis der Transformation in U. fabae dar.

4.6 Stabilität der transformierten Uredosporen

Sowohl bei der biolistischen wie auch bei der Agrobacterium-vermittelten Transformation

konnten die selektionierten Linien nach einer unterschiedlichen Zahl von Generationen in

planta unter Selektionsdruck mit Carboxin nicht weiter propagiert werden. Welche

Mechanismen hier zu Grunde liegen, ist unklar. Die Transformation von dikaryotischen

Uredosporen bedeutet, dass einer oder beide Kerne die Transgene empfangen können. Dies

ist bei der ATMT wahrscheinlicher als bei der Biolistik, weil eine große Anzahl von

Agrobakterien pro Uredospore zur Verfügung steht und diese die Möglichkeit haben, eine

unterschiedliche Anzahl von Kopien der T-DNA in einen oder beide Kerne zu übertragen.

Somit können beide Kerne als Integrationsort dienen. Ein Beschuss mittels Biolistik dagegen

ist auf das gezielte Treffen der Spore bzw. Zellkerne angewiesen.

Im Falle einer stabilen Integration in das Genom von U. fabae ist unklar, warum die

Propagation der selektionierten Uredosporen nicht länger als 10 Generationen möglich ist.

Bei der Integration der SucDH1(H254Y) oder SucDH1(H254L) in nur einen der zwei Zellkerne

kommt es eventuell nicht zu einer signifikanten Dominanz des Resistenz-Allels über das

Wildtyp-Allel was dazu führt, dass eine Selektion mit Carboxin schwierig ist. Falls es sich

jedoch um Transformanten handelt, die extrachromosomale T-DNA tragen, kann es zu

unbestimmten Zeitpunkten in verschiedenen Generationen zu einer Degradation dieser

Strukturen kommen, wodurch die Resistenz verloren geht. Nachdem im U. fabae-System

DISKUSSION 92

bezüglich des genauen Locus der Transgene keine Aussage getroffen werden kann, sind

beide Situationen vorstellbar. Ob es sich bei den biolistischen Transformanten ebenfalls um

eine Degradation handelt, ist nicht sicher. Die höchste Transformationseffizienz wurde bei

Beschuss mit der Plasmid-Kassette tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 erzielt. Die Ausbildung

extrachromosomaler Strukturen aus den für Beschuss verwendeten DNA-Abschnitten, die

über mehrere Generationen die Resistenz vermitteln, ist aufgrund der fehlenden

Mechanismen für die Autoreplikation, unwahrscheinlich.

Die Überprüfung einiger biolistischer Transformantenlinien auf die mitotische Stabilität der

eingebrachten Gene wurde durch Aussetzen der Selektion mit Carboxin in einer Generation

durchgeführt. Eine von vier geprüften Transformantenlinien erzeugte neue

Uredosporenlager bei Wiederapplikation des Fungizids. Dies wiederspricht der Theorie einer

stabilen Transformation, es müssten jedoch mehrere Wiederholungen mit verschiedenen

Transformantenlinien durchgeführt werden um eine definitive Aussage treffen zu können.

Eine während der Propagation von potentiell transformierten Uredosporen in planta

aufgetretene Mutation im SucDH1 Gen, die eine natürlich erworbene Resistenz gegen das

Fungizid Carboxin vermitteln würde, kann mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen

werden. Zum einen gibt es keine vergleichbaren Literaturberichte und zum anderen wurden

einige U. fabae Transformanten analysiert. Das Auftreten spontaner Punktmutationen in der

Uf-SucDH1 wurde überprüft. Es wurden Primer verwendet, die spezifisch die WT-Succinat-

Dehydrogenase amplifizieren und die in PCR amplifizierten Sequenzen anschließend

analysiert. Keine der analysierten Proben zeigte eine Abweichung der Sequenz zum WT.

4.7 Vergleich der Transformationsmethoden Biolistik und ATMT

Mit beiden verwendeten Methoden für die Transformation von U. fabae wurden Erfolge

erzielt. Während sich die Biolistik vor allem bei Verwendung von DsRed als Farbmarker gut

für ein in vivo Monitoring von Infektionsstrukturen der Uredosporen eignet, ist die

transiente Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens für diesen Zweck im U. fabae-

System nicht geeignet. Für die Etablierung des Selektionsschemas in planta mit dem Ziel der

stabilen Transformation, diente die Agrobacterium-vermittelte Transformation, weil sich bei

dieser Methode, verglichen mit den anfänglichen biolistischen Arbeiten eine deutlich höhere

Transformationseffizienz zeigte. Erst nachdem für den biolistischen Beschuss die Plasmid-

Kassette tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1 verwendet wurde, ergab sich eine sehr gute

DISKUSSION 93

Transformationseffizienz und eine deutlich höhere Anzahl der Generationen propagierter

Uredosporen. Der Vorteil dieser Methode verglichen mit der anfänglichen Benutzung von

ganzen Plasmiden ist zudem, dass extrachromosomale, selbstreplizierende Strukturen kaum

auftreten können und es sich dadurch bei den gewonnenen Linien, die mit der Genkassette

biolistisch transformiert wurden, höchstwahrscheinlich um eine Integration der Transgene in

das U. fabae Genom handelt. Tabelle 4.1 gibt ein Gesamtbild der Charakteristika beider

Transformationsmethoden bezogen auf die Anwendung im U. fabae-System.

Tabelle 4.1: Biolistik und Agrobacterium-vermittelte Transformation (ATMT) im Vergleich. Unterschiede und Ähnlichkeiten beider Methoden bei der Transformation der Pilze mit einem Bezug auf das U. fabae-System.

Biolistik ATMT

Empfänger:

Sporen, Myzel

Sporen

Donor:

Plasmid-DNA

Agrobacterium (T-DNA)

Vorbehandlung:

Plasmid-DNA Präparation (1 h)

Evtl. Keimung von Sporen (Hydrierung)

Beschuss und Ausbringung

Agrobacterium Vorkultur u. Induktion (ca. 3 d)

Hydrierung von Uredosporen

Mischung und Ausbringung (Kokultivierung)

Kosten

Ca. 22000 EUR (Biolistik-Apparatur)

Niedrig (Agrobakterien Kultivierung)

Integration ins Genom:

Homologe Rekombination (HR) Illegitime Rekombination (NHEJ)

HR (Single-Crossover) Illegitime Rekombination (NHEJ)

Autonome Replikation der T-DNA

Transformationseffizienz in planta

Beschuss ganzer Plasmide 4,5 x 10-6 – 3,2 x 10-5 Beschuss mit Plasmid-Kassette 5,3 x 10-5 – 7,1 x 10-5

Agrobacterium-Stämme:

3,6 x 10-5 (AGL-1)

2,5 x 10-5 (GV3103)

1,4 x 10-5 (LBA1100)

Anzahl Generationen (Selektionsrunden)

2 (bei Beschuss mit ganzen Plasmiden) 10 (bei Beschuss mit Kassette)

6 (AGL-1)

8 (GV3103)

4 (LBA1100)

DISKUSSION 94

Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, konnte mit beiden benutzten Methoden,

Biolistik und ATMT eine transiente Transformation von U. fabae erzielt werden. Bei der der

biolistischen Transformation mit den Fluoreszenzfarbmarkern DsRed und iGFP ist ein System

für in vivo Monitoring von Infektionsstrukturen der Uredosporen von U. fabae geschaffen

worden. Das Fungizid Carboxin wurde erfolgreich für Biolistik und ATMT für die Selektion

und Propagation der U. fabae-Transformanten unter Selektionsdruck in planta etabliert.

Darüber hinaus konnten durch molekulare Analysen, konkrete Hinweise auf eine Integration

der Transgene in das U. fabae Genom, als Voraussetzung für eine stabile Transformation,

gezeigt werden.

Die im Rahmen dieser Arbeit für U. fabae etablierten Transformationsmethoden können

zudem auf andere Rostpilze übertragen werden, womit ein wichtiges Werkzeug für

zukünftige Charakterisierung von Genen, Proteinen und Reaktionen, welche die obligat

biotrophe Interaktion steuern, auf molekularen Ebene benutzt werden kann.

4.8 Ausblick

Die vorliegende Arbeit umfasst umfangreiche Untersuchungen und Möglichkeiten, den

obligat biotrophen Rostpilz U. fabae mittels zweier Methoden, Biolistik und ATMT, genetisch

zu modifizieren. Gleichzeitig liefert es eine breite Basis für weitere Untersuchungen der

molekularen Vorgänge in den erzeugten Transformantenlinien sowie für die Herstellung und

Prüfung weiterer Plasmidkonstrukte für die Agrobacterium-vermittelte bzw. biolistische

Transformation. Es sind weitere Arbeiten notwendig, um eine Integration der Transgene zu

bestätigen und den Integrationsort im Genom zu identifizieren. Darüber hinaus ist es von

großer Bedeutung, die Propagation der gewonnenen Transformantenlinien zu überprüfen,

um genügend Sporenmaterial für weitere Analysen zu gewinnen.

4.8.1 Anwendung weiterer molekulare Methoden

Die bereits erprobte SFP-PCR Methode könnte optimiert werden, um Integrationsereignisse

bei der ATMT zu bestätigen. Von der Right Border (RB) der T-DNA ausgehend sollte weiter

versucht werden, entsprechende unspezifische Primer zu finden um den Integrationsort

nach der ATMT von U. fabae zu identifizieren. Auch weitere PCR-Methoden wie die Uneven-

PCR nach Chen und Wu (1997) oder die vor kurzem patentierte Methode der LAM-PCR

DISKUSSION 95

(lineare amplifikationsvermittelte Polymerasekettenreaktion, Schmidt et al. 2007) wären

dafür geeignet. Eine Sequenzierung des Genoms von U. fabae wäre von entscheidender

Bedeutung für den molekularen Nachweis der Transformanten.

4.8.2 Modifizierung und Erweiterung der Plasmidkonstukte

Die Plasmidkonstruktion sollte in Richtung der Erweiterung der vorhandenen Plasmide um

Sequenzen für relevanten Gene, die Proteine wie RTP1p exprimieren, die von einer hohen

Bedeutung in der U. fabae – V. faba Interaktion sind, verfolgt werden. Um eine mögliche

Übertragung ganzer Ti-Plasmide bei der ATMT zu verhindern, könnte versucht werden, die

verwendeten Plasmidkonstrukte zu modifizieren. Eine sehr gute Zusammenstellung

verschiedener Möglichkeiten der Plasmidkonstruktion für die ATMT wurde vor kurzem

veröffentlicht (Frandsen et al. 2012).

4.8.3 Optimierung der Propagation bei der Selektion in planta

Durch Biolistik und ATMT gewonnene Transformationslinien sollen als Basis für Experimente

in planta dienen, mit dem Ziel eine größere Anzahl propagierter Uredosporenlager nach der

ersten Selektion zu erhalten. Es sollte untersucht werden, ob dies mit einer niedrigeren

Konzentration des Fungizids Carboxin wie z.B. 25 µg/ml besser funktioniert, gleichzeitig

sollte Überprüft werden, ob die Unterdrückung von Wildtypsporen die durch eine eventuelle

Kontamination im Gewächshaus möglich ist, gewährleistet wird. Darüber hinaus sollte die

Propagation der einzelnen Uredia aus der S1 für die S2 überdacht werden. Um die

Unterscheidung einzelner Genotypen zu gewährleisten, wurden in Rahmen dieser Arbeit

einzelne Uredosporenlager aus der ersten Selektion geerntet und weiter propagiert. Es gibt

Berichte, dass bei Verwendung bestimmter ATMT-Protokolle für Fusarium graminearum

keine Notwendigkeit der „single spore cultures“ besteht (Frandsen et al. 2006; Frandsen et

al. 2012). Mittels PCR und Southern Blot-Analyse wurde dort festgestellt, dass die

Gesamtheit der stabil transformierten Pilzsporen den gleichen Genotyp aufweist.

Nach der Optimierung dieses Schritts wird es möglich sein, mit den so in einzelnen

Generationen gewonnenen, größeren Sporenmengen, die molekularen Methoden wie

Southern Blot-Analyse anzuwenden.

ZUSAMMENFASSUNG 96

5. Zusammenfassung

Rostpilze, die Hauptvertreter der Basidiomyceten, sind obligat biotrophe Parasiten und

stellen weltweit eine wichtige Gruppe von Phytopathogenen an wirtschaftlich bedeutenden

Kulturpflanzen dar. Der Rostpilz Uromyces fabae wurde als Modellorganismus intensiv

erforscht, um zytologische, biochemische und molekulare Vorgänge während der Interaktion

mit der Wirtspflanze Vicia faba aufzuklären. Die Untersuchung wichtiger molekularer

Vorgänge in obligat biotrophen Pilzen wird jedoch aufgrund der Tatsachen erschwert, dass

erstens diese Organismen in künstlichen Medien nicht kultivierbar sind und keine

authentische Wirt-Pathogen-Interaktion in vitro hergestellt werden kann sowie zweitens

kein universell funktionierendes System für eine stabile Transformation von obligat

biotrophen Pilzen existiert. Moderne genetische Methoden wie Überexpression, Silencing

oder Tagging von Genen sind daher nicht anwendbar.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden, Biolistik und

Agrobacterium tumefaciens mediierter Transformation (ATMT), eine transiente

Transformation von U. fabae erreicht und eine Basis für ein stabiles Transformationssystem

geschaffen. Es wurde ein Set von Plasmiden erstellt, welche Farb- und/oder Fungizidmarker

zur Selektion tragen, die unter die Kontrolle von endogenen regulatorischen Elementen

gesetzt wurden. Promotor- und Terminator-Elemente von Uf-PMA1 (U. fabae

Plasmamembran ATPase) wurden benutzt, um die Expression der Farbmarker iGFP (intron

green fluorescent protein) und DsRed (red fluorescent protein) sowie des Fungizidmarkers

mut-SucDH1 (mutierte Succinat-Dehydrogenase) zu kontrollieren.

Die erfolgreiche Transformation mit den Fluoreszenzfarbmarkern iGFP und DsRed in vitro

wurde durch die subzelluläre Lokalisierung der DsRed-NLS Expression in den Zellkernen

eindeutig bewiesen.

Als Fungizidmarker wurden Punktmutationen in die Uf-SucDH1 (H254Y für Plasmidkonstrukt

pRV111 und H254L für pRV113) und Uf-TBB1 (E198A) eingefügt, welche die Resistenz gegen

die Fungizide Carboxin und Benomyl vermitteln. Für die Expression von Uf-TBB1(E198A)

wurde der gesamte genomische Bereich mit endogenen regulatorischen Elementen

verwendet. Die beiden Fungizide konnten erfolgreich für eine Selektion der Transformanten

in planta etabliert werden. Mit dem angepassten Selektionsschema konnten wichtige

Parameter für die ATMT ermittelt werden, sowie durch Verwendung von drei

ZUSAMMENFASSUNG 97

Agrobacterium-Stämmen die Faktoren optimiert werden, die eine Erhöhung der

Transformationseffizienz gewärleisten. Mittels Biolistik oder Agrobakterien transformierte

Uredosporen konnten somit in großer Anzahl als Transformantenlinien erzeugt und über

mehrere Generationen in planta propagiert werden.

Bei der Biolistik wurde für die Plasmide pRV111 (tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1) und

pRV113 (H254L) eine Transformationseffizienz von 7,1 x 10-5 bzw. 5,3 x 10-5 erreicht. Bei der

ATMT konnte mit dem gleichen Transgen je nach verwendetem Agrobacterium Stamm eine

Effizienz von 3,6 x 10-5 (AGL-1), 2,5 x 10-5 (GV3103) und 1,4 x 10-5 (LBA1100) erzielt werden.

Molekulare Analysen der potentiell transformierten Uredosporen ergaben unterschiedliche

Nachweise der Transformation, basierend auf der Amplifikation der Gen-Kassette und

schließlich dem Nachweis der Punktmutation und damit einer wahrscheinlichen Integration

der transgenen SucDH1(H254Y).

SUMMARY 98

6. Summary

Obligate biotrophic fungi like the rust- and the powdery mildew fungi are important plant

pathogens and consequently of high economical interest. The rust fungus Uromyces fabae

and the interaction with its host plant Vicia faba have been an important model system for

biochemical, molecular and cytological studies for several years. However, the analysis of

the molecular details underlying obligate biotrophic host-parasite interactions has proven

difficult. The challenge is mainly based on two facts: 1) the impossibility of producing

authentic host-parasite interface in vitro and 2) the lack of a universal system to stably

transform obligate biotrophs. This excludes them from the application of a variety of

modern techniques successfully used with other pathogens, such as gene overexpression,

silencing or gene targeting.

This work presents the transformation of the obligate biotrophic rust fungus Uromyces fabae

using two methods, biolistics and Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation

(ATMT), the establishment of transient transformation and a basis for a stable

transformation system. A set of plasmids was used for expressing color and/or selection

markers under control of endogenous genetic elements. Promoter and terminator elements

which stem from the U. fabae gene Uf-PMA1 were used to drive expression of the color

markers iGFP (intron green fluorescent protein) and DsRed (red fluorescent protein) as well

as the selection marker mut-SucDH1 (succinate dehydrogenase). Biolistic bombardment of

urediospores with iGFP and DsRed in vitro and a DsRed-NLS variant targeted to the nucleus

resulted in successful transient transformation of U. fabae. Similar numbers of

transformants were obtained in vitro with constructs carrying carying the fluorescent marker

genes iGFP (2,4 x 10-5) and DsRed (2,9 x 10-5).

Additionally, we were able to show that the fungicides Benomyl and Carboxin can be

successfully used for in planta selection of potential transformants. The genes encoding the

targets for Benomyl, ß-tubulin (Uf-TBB1), and Carboxin, Succinate Dehydrogenase (Uf-

SucDH1) were used and single point mutations responsible for conferring resistance to these

fungicides in other organisms were introduced into the respective U. fabae genes obtaining

plasmids pRV111 (SucDH1(H254Y) and pRV113 (H254L). Endogenous regulatory elements of

the Uf-TBB1 were used to drive expression of the Uf-TBB1(E198A) construct.

SUMMARY 99

After establishment and optimization of the selection procedure in planta, important

parameters for ATMT and higher efficiency were determined using three different

Agrobacterium strains. Hence, using both, biolistic and ATMT approach, a large number of

transformant urediosporelines were generated and propagated with the selective agent

Carboxin.

Transformation efficiency in planta was highest by biolistic bombardment with tPMA1-

SucDH1(H254Y)-pPMA1 (7,1 x 10-5) and H254L (5,3 x 10-5). Using the same tPMA1-

SucDH1(H254Y)-pPMA1 gene in ATMT, different efficiencies were found depending on the

used strain: 3,6 x 10-5 (AGL-1), 2,5 x 10-5 (GV3103) and 1,4 x 10-5 (LBA1100). Molecular

analysis of potential transformants resulted in different proofs of transformation, based on

amplification of the transformation cassette and finally the proof of the point mutation in

the SucDH1(H254Y) gene. The latter is the best evidence so far for a possible integration of

the used transgenes in the U. fabae genome.

LITERATUR 100

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ANHANG 112

8. Anhang

8.1 Propagation einzelner Uredia aus S1 für S2

Abbildung 8.1: Ausbringung von Einzelrostpusteln auf Ackerbohnenblätter. (A): Resuspendieren in 50 µl Kerosin und Aufsprühen mittels Airbrush-Pistole HP-200; (B): In 50 µl resuspendierte Sporen wurden auf Pflanzenblätter pipettiert und mit gewöhnlichen Laborlöffel verstrichen; (C): Einzelrospustel wurde auf mit Wasser angefeuchteten Pflanzenblätter gegeben und mit einem Laborlöffel verstrichen. Die Uredosporenlager wurden ausgezählt, (n = 8 pro Variante), dabei ergaben sich folgende Mittelwerte: A = 6, B = 17, C = 51 Uredia pro Blatt. Demnach hat die Ausbringungsmethode (C) die besten Ergebnisse und wurde für alle weiteren Versuche verwendet.

[A] [B] [C]

a

ANHANG 113

Tabelle 8.1: Biolistische Trans-formation mit pRV111 und pRV113. Anzahl der Uredo-sporenlager in S1 mit Carboxin. Jeweils sechs Blätter entsprechend sechs biolistischen Beschüssen mit den Plasmiden pRV111 und pRV113.

A B

B1 1 2 B2 0 0 B3 1 1 B4 11 1 B5 12 3 B6 25 5 B7 0 1 B8 0 2 B9 9 1 B10 11 4 B11 1 0 B12 0 1 B13 2 12 B14 5 9 B15 20 3 B16 13 0 B17 20 1 B18 17 2 B19 6 0 B20 12 6 B21 11 7 B22 5 15 B23 10 1 B24 8 18 B25 26

B26 12 B27 9 B28 18 B29 15 B30 7 B31 6 B32 5 B33 14 B34 11 B35 5 B36 2

Tabelle 8.3: Biolistische Trans-formation mit der Kassette tPMA1-SucDH1(H254Y)-pPMA1. Verwendete Plasmide für Präparation A: pRV111 (n = 16) und B: pRV113 (n = 20), Zahl der selektionierten Uredia in der S1 mit Carboxin.

Tabelle 8.2: Biolistische Trans-formation mit dem Doppelkon-strukt pRV111::DsRed. Anzahl der Uredia aus S1 mit Carboxin für zwei Transformations-ansätze mit je 10 Beschüssen.

8.2 Zählungen einzelner Uredia (Biolistik) aus S1

A B

B1 0 10 B2 9 0 B3 42 1 B4 1 0

B5 3 6 B6 0 17 B7 100 29 B8 41 0

B9 6 28 B10 31 19

B11 7 10

B12 1 0 B13 25 3 B14 1 2 B15 14 1 B16 7 0

B17

50 B18

0

B19

19 B20

0

C

B1 11 B2 12 B3 25

B4 9 B5 11 B6 13 B7 20

B8 17

B9 14 B10 10 B11 6 B12 23 B13 19 B14 4 B15 11

B16 15

ANHANG 114

Abbildung 8.2: Gradient-PCR für SNP-PCR Primer. U.f. WT-DNA aus verschiedenen Präparationen: (a) Kugelmühle mit ungekeimten Sporen und (b) Präparation aus gekeimten Sporen; Proben 1: 87 ng (a); 2: 174 ng (a); 3: 86 ng (b); 4: H2O-Kontrolle. A: Primer SNP Suc WT + SucDH1 SNPrev2 (P3 + P5); B: Primer SucDH1 SNPrev2 + SNP Primer Suc (P3 + P4). Vgl. Abb. 3.18.

bp

1000

700 500

bp

1000

700 500

[A]

[B]

65,1 °C 65,5 °C 65,9 °C 66,5 °C

65,1 °C 65,5 °C 65,9 °C 66,5 °C

M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Tabelle 8.4: Biolistische Transformation mit der Kassette aus pRV111 und pRV113. Anzahl der Uredosporenlager aus den einzelnen Selektionsrunden in planta. L: Transformanten-Linie; Sx: Selektionsrunde X.

pRV111 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 L1 3 0

L2 2 0 L3 2 0 L4 27 2 L5 17 0 L6 10 6 42 3 10 9 9 0

L7 4 0 L8 2 1 6 1 1 8 4 10 0

L9 11 0

pRV113 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 L1 2 0

L2 1 2 11 23 3 10 50 5 23 L3 3 0

L4 8 0 L5 3 0

Oligos:

SNP Suc + SucDH1 rev2

ANHANG 115

8.3 Zählungen einzelner Uredia (ATMT) aus S1

Tabelle 8.5: Auszählung der Uredosporenlager in der S1 nach Transformation mit pRV101 Plasmid durch ATMT. Agrobakterien Stämme (links) und dazugehörige Auszählungen auf den Pflanzenblättern sind gekennzeichnet mit B1 (Blatt 1) bis B30 (Blatt Nr. 30).

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30

AGL-1pRV101 1 35 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 4 0 0 0

LBA1100pRV101 1 0 1 10 3 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0

GV3103pRV101 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 25 0 3 0 0 0 1 0 0 25 15 0 0

Tabelle 8.6: Einfluss von Acetosyringon auf die Induktion der Agrobacterium-Stämme. Anzahl von Uredosporenlagern in der ersten Selektionsrunde mit Carboxin. Varianten (Var.): Induktionsmedium mit 200 µM Acetosyringon (+ AS) und ohne Acetosyringon-Zugabe (- AS); n = 16 Blätter (B1-B16).

Stamm Var. B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16

LBA1100 + AS 3 5 8 0 10 6 5 1 0 5 8 18 13 7 5 0

‒ AS 0 0 0 1 0 2 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0

AGL-1 + AS 24 6 13 10 4 1 0 19 21 25 18 29 19 20 26 16 ‒ AS 0 1 0 0 0 3 1 2 1 3 1 0 1 1 0 0

GV3103 + AS 6 7 0 0 1 0 8 16 18 23 24 1 21 16 14 20

‒ AS 0 0 0 0 0 1 2 0 1 0 1 1 1 0 2 1

ANHANG 116

Tabelle 8.7: Einfluss des Verhältnisses Agrobakterien zu Uredosporen bei ATMT. Anzahl der Uredosporenlager in der ersten Selektion (S1) mit Carboxin. Mit pRV112 transformierte Agrobacterium-Stämme: AL112 (LBA1100); AA112 (AGL-1) und AG112 (GV3103). Verhältnis Agrobakterien : Uredosporen 1 : 38,5 (a), 1 : 100 (b) und 1 : 200 (c) mit errechneten Mittelwerten (MTW) und Standardabweichung (STDEV).

AL112 a b c

AA112 a b c

AG112 a b c B1 0 26 3

B1 0 15 1

B1 1 13 2

B2 0 7 1

B2 1 1 3

B2 1 2 4 B3 0 5 1

B3 0 24 5

B3 1 9 12

B4 0 1 2

B4 0 3 0

B4 0 0 6 B5 0 1 1

B5 2 8 0

B5 1 18 7

B6 1 1 0

B6 0 16 0

B6 2 0 1 B7 1 3 0

B7 0 6 8

B7 0 19 0

B8 1 16 0

B8 1 12 1

B8 0 5 0 B9 3 0 1

B9 0 0 0

B9 0 1 0

B10 0 1 6

B10 3 1 7

B10 1 4 2 B11 1 15 4

B11 0 15 6

B11 4 15 5

B12 1 23 8

B12 1 24 2

B12 1 8 3 B13 1 13 5

B13 0 0 5

B13 0 17 1

B14 1 9 2

B14 0 9 1

B14 0 0 0 B15 2 1 1

B15 9 0 0

B15 1 13 0

B16 1 2 1

B16 0 29 16

B16 0 12 2 B17 0 0 0

B17 0 0 3

B17 5 2 3

B18 0 1 1

B18 0 24 5

B18 1 16 5 B19 3 21 0

B19 1 19 2

B19 0 14 7

B20 4 14 3

B20 0 31 0

B20 1 1 11 B21 1 6 5

B21 1 8 2

B21 2 0 5

B22 1 17 4

B22 0 27 11

B22 1 13 4 B23 1 5 9

B23 6 18 1

B23 0 0 1

B24 0 2 12

B24 1 0 0

B24 0 1 0 B25 2 0 2

B25 0 35 0

B25 0 2 6

B26 0 0 1

B26 5 4 6

B26 1 19 3 B27 0 1 1

B27 1 11 0

B27 1 0 9

B28 1 0 0

B28 0 23 7

B28 2 6 2 B29 0 2 0

B29 1 18 0

B29 1 1 7

B30 0 0 1

B30 2 0 9

B30 0 11 13 B31 1 6 3

B31 0 25 17

B31 0 8 3

B32 1 17 0

B32 4 1 14

B32 0 17 0 B33 1 0 5

B33 0 6 1

B33 -- 0 0

B34 3 1 5

B34 0 19 0

B34 -- 16 0 B35 4 3 13

B35 0 22 2

B35 -- 12 1

B36 5 16 10

B36 2 16 7

B36 -- 5 1 B37 2 2 6

B37 0 0 --

B37 -- -- 5

B38 2 0 1

B38 0 38 --

B38 -- -- 0 B39 -- 0 2

B39 -- 19 --

B39 -- -- 0

B40 -- 1 1

B40 -- 26 --

B40 -- -- 1

MTW 1 6 3

MTW 1 14 4

MTW 1 8 3 STDEV 1,3 7,4 3,4

STDEV 1,9 11,0 4,7

STDEV 1,1 6,7 3,5

ANHANG 117

Tabelle 8.8: ATMT mit drei verschiedenen Stämmen. Auszählungen der selektionierten Uredia in S1 nach Selektion mit Carboxin. Bezeichnungen AL112: LBA1100pRV112 (n = 70); AA112: AGL-1pRV112 (n = 70) und AG112: GV3103pRV112 (n = 66).

AL112

AA112

AG112 B1 26 B36 16

B1 15 B36 16

B1 13 B36 5

B2 7 B37 2

B2 1 B37 0

B2 2 B37 21

B3 5 B38 0

B3 24 B38 38

B3 9 B38 15

B4 1 B39 0

B4 3 B39 19

B4 0 B39 11

B5 1 B40 1

B5 8 B40 26

B5 18 B40 6

B6 1 B41 2

B6 16 B41 18

B6 0 B41 2

B7 3 B42 1

B7 6 B42 7

B7 19 B42 13

B8 16 B43 1

B8 12 B43 22

B8 5 B43 9

B9 0 B44 3

B9 0 B44 10

B9 1 B44 15

B10 1 B45 12

B10 1 B45 8

B10 4 B45 20

B11 15 B46 23

B11 15 B46 6

B11 15 B46 18

B12 23 B47 6

B12 24 B47 12

B12 8 B47 32

B13 13 B48 0

B13 0 B48 16

B13 17 B48 12

B14 9 B49 21

B14 9 B49 29

B14 0 B49 26

B15 1 B50 3

B15 0 B50 38

B15 13 B50 5

B16 2 B51 1

B16 29 B51 6

B16 12 B51 3

B17 0 B52 0

B17 0 B52 17

B17 2 B52 11

B18 1 B53 6

B18 24 B53 1

B18 16 B53 10

B19 21 B54 2

B19 19 B54 5

B19 14 B54 9

B20 14 B55 5

B20 31 B55 36

B20 1 B55 6

B21 6 B56 1

B21 8 B56 29

B21 0 B56 25

B22 17 B57 1

B22 27 B57 16

B22 13 B57 14

B23 5 B58 0

B23 18 B58 18

B23 0 B58 12

B24 2 B59 1

B24 0 B59 2

B24 1 B59 5

B25 0 B60 14

B25 35 B60 9

B25 2 B60 4

B26 0 B61 5

B26 4 B61 21

B26 19 B61 1

B27 1 B62 0

B27 11 B62 25

B27 0 B62 0

B28 0 B63 18

B28 23 B63 26

B28 6 B63 12

B29 2 B64 4

B29 18 B64 16

B29 1 B64 27

B30 0 B65 1

B30 0 B65 11

B30 11 B65 23

B31 6 B66 0

B31 25 B66 15

B31 8 B66 1

B32 17 B67 5

B32 1 B67 18

B32 17 B67 --

B33 0 B68 0

B33 6 B68 9

B33 0 B68 --

B34 1 B69 1

B34 19 B69 12

B34 16 B69 --

B35 3 B70 1

B35 22 B70 15

B35 12 B70 --

MTW 5

MTW 15

MTW 10 STDEV 7

STDEV 10

STDEV 8

ANHANG 118

T

WT

[A] [B]

Abbildung 8.4: Erste Selektion (S1) mit Carboxin. Transformiert mit A: Biolistik; B: ATMT Methode.

8.4 Abbildungen verschiedener Selektionen in planta

Abbildung 8.3: Zeitlicher Unterschied in der Kei-mung zwischen WT und Transformanten. Bildung von Uredosporenlagern bei U. fabae Transformanten (links, T) und Wildtyp (rechts, WT). Das um einige Tage verzögerte Wachstum konnte bei jeder Transfor-mantenlinie festgestellt werden.

ANHANG 119

[A]

[B]

[A] [B]

Abbildung 8.5: Propagierte Transformationslinien in planta nach ATMT. Gleiche Linie propagiert in A: S2 und B: S3.

Abbildung 8.6: Propagierte Transformationslinien in planta nach Biolistik. Gleiche Linie propagiert in A: S6; B: S7.

ANHANG 120

DNA-Präparationen und Behandlung:

(a): Aus gekeimten Sporen

(b): Aus ungekeimten Sporen

(c): mit Präparation- Kit

(d): mit REPLI-g amplifiziert

Probenauftragung:

1: 60 µg (a)

2: 6 µg (a)

3: 0,6 µg (a)

4: 6 µg (c)

5: 6 µg (c)

6: 6 µg (b)

7: 6 µg (b)

8: (c) + (d)

9: (c) + (d)

10: (b) + (d)

11: (b) + (d)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 kb

3

2,4

1

[A]

[B]

8.5 Southern Blot Analysen

8.5.1 Verschiedene DNA-Menge und –Präparation für DIG-Markierung

Abbildung 8.7: Southern Blot mit verschiedenen Mengen und Präparationen von U. fabae WT-DNA. A: UV Aufnahme des Agarose-Gels mit EcoRI verdauter DNA. B: Southern Blot (Autoradiographische Aufnahme).

ANHANG 121

Probenauftragung:

1: U.f. x EcoRI 60 µg



4: pRV112 x EcoRI 10 ng

[A]

[B] [C] [D]

kb 2,4

kb 2,4

kb 2,4

M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M

8.5.2 Vergleich von DIG und 32P Sonden-Markierung

Abbildung 8.8: Southern Blot-Vergleich der Sonden-Markierung DIG / 32P. A: UV Aufnahme des Agarose-Gels mit EcoRI verdauter DNA. B: Autoradiographische Aufnahmen des Southern Blot, DIG- Markierung, Exposition für 3 h; C: 32P-Markierung, Exposition 3 h und D: 32P-Markierung, Exposition 60 h.

ANHANG 122

8.5.3 32P Markierung

Abbildung 8.9: 32P-Markierung von genomischer und Plasmid DNA. A: UV Aufnahme des Agarose-Gels mit EcoRI verdauter DNA. B, C: Autoradiographische Aufnahmen.

kb

4 3

2,4

1

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

Probenauftragung:

1: 60 µg U.f.

2: 30 µg U.f.

3: 15 µg U.f.

4: 10 µg U.f. (unverdaut)

5: 10 ng pRV112

6: 20 ng pRV112

7: 50 ng pRV112

8: 100 ng pRV112

9: 20 ng pRV112

[A]

[B] [C]

texp.

2 h

5 h

DANKSAGUNG 123

9. Danksagung

Mein Dank gilt vielen Personen der Arbeitsgruppe Prof. Mendgen und Prof. Voegele sowie

der ganzen Universität Konstanz und der Universität Hohenheim. Natürlich möchte ich

einige Personen hier hervorheben denen mein besonderer Dank gilt.

Prof. Mendgen danke ich sehr für die Möglichkeit zur Promotion an seinem Lehrstuhl und an

seinem stetigen Interesse an meiner Arbeit und hilfreichen Anregungen und Diskussionen.

Prof. Vögele möchte ich besonders danken für die Betreuung, Unterstützung, Diskussionen,

Geduld und darüber hinaus offenem Ohr für alle Angelegenheiten. Trotz seinem turbulenten

Karriereverlauf und zahlreichen Verpflichtungen war es stets immer da wenn man ihn

wirklich gebraucht hat.

Prof. van Kleunen Danke ich für die Möglichkeit, meine Arbeit in seinem Labor fortzusetzen

und für eine sehr nette Atmosphäre in seinem Labor.

Großer Dank gilt Dipl.-Ing. Heinz Vahlenkamp für seine überaus hilfreiche, pragmatische,

sehr engagierte und freundliche Art die mich in allen Schritten meiner Arbeit begleitet hat.

Annette Schmid gilt an dieser Stelle besonderer Dank für die gemeinsame Zeit im Labor und

für Ihre große Unterstützung in experimentellen und vielen anderen Angelegenheiten.

Christine Giele Danke ich für Erweiterung meiner Mikroskopischen Fähigkeiten und Arbeiten

mit Uredosporen, und Elisabeth Rehn für ihre große Unterstützung in organisatorischen

Fragen und Antworten.

Verena Geyer und besonders Otmar Ficht danke ich für die Betreuung von Pflanzen im

Gewächshaus und vielen Hilfestellungen und praktischen Lösungen.

Allen Kollegen die mich mit Diskussionen, Anregungen, Ermunterung und Grillabenden

begleitet haben vor allem Klara Pretsch, Tobias Link, Jan Nechwatal, Stefan Kunz, Carolin

Bogs und Michael Ernst, ein großer Dank sowie allen anderen Mitgliedern der AG Mendgen,

für die sehr schöne Zeit in und außerhalb des Labors.

Mitarbeitern der AG Cook: Dr. David Schleheck, Sabine Lehmann und anderen sowie der AG

van Kleunen danke ich für Ratschläge und Unterstützung in allen Fragen.

transformation des obligat biotrophen rostpilzes uromyces

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