transferencia génica mediante virus adeno-asociados en un

ORIGINAL

PATOLOGÍA DEL APARATO LOCOMOTOR, 2005; 3 (2): 101-11027 101

Transferencia génica mediante virus adeno-asociadosen un modelo de daño articular en rodilla de rata

Gene transfer mediated by adeno-associated virusvector in a rat knee model of articular damage1 Laboratorio de Ortopedia Experimental. Izal Azcárate I.1

Departamento de Cirugía Ortopédica y Traumatología. Ripalda Cemboráin P.1Clínica Universitaria. Facultad de Medicina. Acosta Olivo C. A.1Universidad de Navarra Zaratiegui Biurrun M.2

2 División de Hepatología y Terapia génica. Centro de Ruiz Echeverría J.2Investigación Médica Aplicada. Universidad de Navarra Forriol Campos F.1

Correspondencia:Dr. Iñigo Izal AzcárateLaboratorio de Ortopedia ExperimentalEdificio Los CastañosIrunlarrea s/n31008 Pamplona - NavarraTel.: 948 42 56 00, ext. 6504Fax: 948 42 56 49e-mail: [email protected]

RESUMENEl cartílago articular es el tejido encargado de disminuir

la fricción entre las superficies articulares durante el mo-vimiento. Su limitada capacidad de regeneración hace quelas lesiones osteocondrales posean un mal pronóstico ypuedan acabar generando una artrosis en la articulación.La terapia génica para este tipo de patologías resulta muyprometedora, puesto que actualmente, no hay ningún pro-cedimiento capaz de restablecer el tejido dañado. En nues-tro estudio hemos puesto a punto un modelo de transfe-rencia génica a los tejidos de la articulación de la rodillade rata, inyectando intraarticularmente vectores derivadosde virus adeno-asociados, capaces de inducir la expresiónde luciferasa. Los resultados muestran cómo la inducciónde la expresión resulta significativa a partir de los dos me-ses de evolución en todos los tejidos articulares (cartílagoarticular, menisco, membrana sinovial y hueso subcon-dral). La presencia de daño, tanto de tipo mecánico comoautoinmune (artritis inducida por colágeno) no modifica laexpresión de proteína por parte del vector.

Palabras clave: Terapia Génica, cartílago, artritis, virusadeno-asociados, luciferasa.

Izal Azcárate I., Ripalda Cemboráin P., Acosta Olivo C. A., Zaratiegui Biurrun M., Ruiz Echeverría J., Forriol Campos F.Transferencia génica mediante virus adeno-asociados en un modelo de daño articular en rodilla de rataPatología del Aparato Locomotor, 2005; 3 (2): 101-110

ABSTRACTArticular cartilage is a tissue that decreases friction on

articular surfaces during movement. Its limited regenera-tive capacity makes osteocondral lessions to extend andgenerate osteoarthritis in the joint. Gene therapy is apromising alternative to these patologies, since there areno proceedings actually, that restablishes damaged tissue.In our study, we have developed a model of gene transferto articular tissues injecting intraarticularly an adeno-asso-ciated derived vector that induces expression of luciferase.Results obtained show a significant induction of proteinexpression two months after injecting vectors, in all artic-ular tissues (articular cartilage, meniscus, synovium andsubcondral bone). The presence of lessions, mechanic orautoimmune (collagen induced arthritis) do not modify theexpression of protein induced by the vector.

Key words: Gene Therapy, cartilage, arthritis, adeno-as-sociated virus, luciferase.

Izal Azcárate I., Ripalda Cemboráin P., Acosta Olivo C. A., Zaratiegui Biurrun M., Ruiz Echeverría J., Forriol Campos F.Gene transfer mediated by adeno-associated virus vector in a rat knee model of articular damagePatología del Aparato Locomotor, 2005; 3 (2): 101-110

INTRODUCCIÓN

El cartílago es un tejido con una estructurabiológica uniforme, densa y con ausencia de va-sos sanguíneos, linfáticos e inervación. Estácompuesto por agua, matriz extracelular y con-drocitos, en baja densidad dentro del tejido. Lamatriz extracelular es una compleja red de fi-bras de colágeno, principalmente de tipo II, yproteoglicanos, capaces de retener el agua en elseno del cartílago. La capacidad para retener es-te fluido determinará en gran medida la capaci-dad del tejido para amortiguar el daño del hue-so con el movimiento de la articulación (1, 2).

El cartílago articular es un tejido de sosténque disminuye la fricción entre las superficiesarticulares y protege el hueso subyacente de lassolicitaciones mecánicas. El mantenimiento delcartílago es esencial para el desarrollo de la ac-tividad física.

Los condrocitos, las células del cartílago, es-tán continuamente sintetizando y degradandolas proteínas componentes de la matriz extrace-lular, consiguiendo un equilibrio que permite elmantenimiento de la misma. Las condicionesque provoquen una disfunción en el comporta-miento de los condrocitos, podrán desequilibrara favor de la degradación del cartílago, lo quecon el tiempo podrá generar una artrosis.

Una consecuencia de la falta de irrigaciónvascular es la limitada capacidad de reparaciónque tiene el cartílago. Los condrocitos próximosa la zona de la lesión pueden responder con unaumento de su proliferación, sin embargo, ladensa matriz que los rodea impide su migraciónal lugar lesionado. Por esta razón las lesiones enel cartílago se pueden extender progresivamente(3-5). Cuando la lesión incluye la capa de huesosubyacente, con vasos y células mesenquimales,se puede producir una respuesta originada por lamigración de células de la médula ósea que ge-nerarán un tejido de relleno en la zona lesiona-da. Este tejido será similar al cartílago duranteunos 6 u 8 meses, pero el contenido en coláge-no de tipo I se incrementará generando fibrocar-tílago, incapaz de suplir las funciones mecánicasdel cartílago articular (5-7).

Actualmente no hay ningún método, farma-cológico o quirúrgico, capaz de restablecer elcartílago dañado. La reparación del cartílagohace necesario el relleno de la lesión con matriz

y células. La ingeniería tisular y la terapia géni-ca podrían constituir una herramienta útil paraproducir un tejido capaz de mantener las fun-ciones mecánicas y biológicas del cartílago ori-ginal.

Los virus adeno-asociados (AAV) son virusmonocatenarios no patógenos, por lo que repre-sentan una estrategia muy prometedora para lostratamientos de terapia génica (8, 9). La elimi-nación del 96% de las secuencias víricas permi-te la construcción de virus recombinantes queno generan respuesta inmune (8, 10, 11). Ade-más, la integración de estos virus en el genomade la célula huésped permiten una expresión deproteína a largo plazo (9, 12), hecho demostra-do en varios tipos de tejido (8, 10, 11).

En nuestro trabajo hemos construido un mo-delo de inducción de expresión de proteína me-diante terapia génica utilizando virus adeno-asociados en rodillas de rata sanas y en rodillasque han sufrido lesiones tanto mecánicas comode tipo autoinmune.

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales

El estudio fue aprobado por el comité éticopara la investigación animal de la Universidadde Navarra. Se utilizaron un total de 64 ratasWistar macho, de 150 a 200 gramos de peso y7 semanas de edad, divididas en 4 grupos de 16animales cada uno. Fueron divididos en 4 jau-las, dependiendo del intervalo temporal utiliza-do. Los grupos fueron organizados de la si-guiente forma:

– Grupo 1. Control– Grupo 2. Inoculación con AAV-Luciferasa– Grupo 3. Inoculación con AAV-Luciferasa.

Artritis inducida por colágeno– Grupo 4. Inoculación con AAV-Luciferasa.

Lesión mecánica

El grupo 1 fue inoculado con 50 µL de suerosalino en las dos rodillas. Los grupos 2, 3 y 4fueron inoculados, en ambas rodillas, con 50 µLde virus adeno-asociados recombinantes (1,25� 108 partículas) en suero salino. Las inyeccio-nes intraarticulares fueron realizadas localizan-do el espacio interarticular, bajo sedación conketamina (100 mg/kg) administrada intraperito-

I. Izal Azcárate, P. Ripalda Cemboráin, C. A. Acosta Olivo, et al.

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nealmente. Los modelos de daño articular de losgrupos 3 y 4 fueron realizados el día siguiente,después de inocular el virus.

Los animales fueron sacrificados mediantesobreexposición a CO2, a la semana, a las dossemanas, al mes y a los dos meses de la inter-vención correspondiente (figura 1).

Artritis inducida por colágeno

El modelo de artritis fue inducida por coláge-no (13). Los animales del grupo 3 fueron inocula-dos con una emulsión de colágeno. Para su pre-paración se diluyeron 8 mg de colágeno de pollode tipo II (Sigma®) en 2,5 mL de ácido acético0,05 M. La solución resultante fue añadida gota agota sobre 2,5 mL de adyuvante incompleto deFreund (Difco®). Se mezclaron utilizando un ho-mogeneizador Ultra Turrax® (IKA) hasta que seconsiguió la emulsión en 2 ó 3 minutos.

La inoculación de 0,5 mL de emulsión se in-yectó subcutáneamente en el lomo del animal,el día siguiente a la inoculación del virus. Comodosis de recuerdo se inyectó 0,1 mL de la mis-ma emulsión de colágeno, una semana despuésde la primera dosis y en las mismas condicio-nes.

Lesión mecánica

Al grupo 4 se le provocó una lesión mecáni-ca en la articulación de las dos rodillas. Se in-trodujo una aguja hipodérmica por la cara ante-

rior de la rodilla a través del tendón rotulianocon objeto de dañar el menisco y producir unalesión osteocondral en la superficie tibial. El da-ño se realizó bajo anestesia con ketamina (100mg/kg) y xilacina (10 mg/kg), administradas in-traperitonealmente.

Construcción de los virus adeno-asociados

La construcción de los virus recombinantesse realizó según el método descrito en la litera-tura (14). Brevemente, se cotransfectaron células293T con dos plásmidos, uno de ellos conteníael genoma del virus a excepción de los genesrep y cap y el cDNA que codifica para el enzi-ma luciferasa bajo el control del promotor delcitomegalovirus (CMV). El otro llevaba inserta-dos los dos genes mencionados rep y cap. Lascélulas aportaron los genes del adenovirus ad-yuvante necesarios para la replicación. En el ci-toplasma de las células se produjo la formaciónde las partículas víricas. Las células fueron lisa-das y su DNA y RNA digerido. Finalmente, losvirus fueron purificados mediante cromatografíaen una columna de agarosa y su título estimadomediante PCR cuantitativa.

Obtención y procesado del tejido

Tras el sacrificio del animal, se extrajeron lasdos articulaciones de la rodilla. Las rodillas de-rechas fueron almacenadas a -20ºC hasta su usopara la extracción de proteína total, mientrasque las izquierdas fueron sumergidas en formolal 4% para su procesado histológico.

La fijación de las piezas se efectuó en formol,al 4%, tamponado con fosfatos, durante 24 ho-ras. Una vez fijadas, las piezas fueron decalcifi-cadas en una solución de Polivinilpirrolidona(P.V.P.), al 7,5%, y E.D.T.A., al 10%, en Tris 0,1M y pH 6,95 durante al menos 3 semanas, atemperatura ambiente.

La deshidratación de las piezas se realizómediante alcoholes de gradación creciente (70,80, 96 y 100%), cambiando dichos alcoholescada 12 horas y manteniéndose en agitaciónconstante. Posteriormente se introdujeron en xi-leno durante 4 horas y se incluyeron en parafi-na. Finalmente, se realizaron cortes de 4 µm de

Fig. 1. Esquema de la estrategia utilizada. Los grupos es-tuvieron compuestos por 16 animales divididos en 4 jau-las, cada una utilizada para cada intervalo temporal (1semana, 2 semanas, 1 mes y 2 meses). La inyección delvector se realizó intraarticularmente el día del inicio delexperimento. El día siguiente se iniciaron los modelos dedaño tal y como se explica en la sección Material y Mé-todo. AAV: virus adeno-asociado; CIA: artritis inducidapor colágeno.

grosor con microtomo convencional (Microm®)y se tiñeron con tricrómico de Masson.

Para la extracción de proteína, las articula-ciones fueron congeladas en CO2 y trituradasutilizando un mortero. Posteriormente fueronhomogeneizadas con un homogeneizador, aña-diendo 1,5 mL del buffer RLB (Reporter LysisBuffer) correspondiente al sistema Luciferase As-say System (Promega®). El homogeneizado fuecentrifugado, durante 10 minutos, a 15000 x gen una centrífuga de sobremesa, obteniendo unsobrenadante que constituyó el extracto de pro-teína de cada rodilla. De este extracto,100 µLfueron añadidos a 100 µL del sustrato para la lu-ciferasa. Para la lectura de los resultados a 562nm, se utilizó un luminómetro (BertholdSystems®). Se determinó la concentración deproteína total de cada muestra utilizando el mé-todo de Bradford (Bio-Rad®) y el resultado fueutilizado para normalizar los datos correspon-dientes a la luciferasa.

Inmunohistoquímica

Para realizar la inmunohistoquímica, se des-parafinaron los cortes en xilol y posteriormentese bloqueó la peroxidasa endógena con un tra-tamiento de 30 minutos de peróxido de hidró-geno, al 3%, en metanol y en oscuridad. Tras re-hidratar las preparaciones con alcoholes degradación decreciente, se realizó el bloqueo uti-lizando suero normal de conejo (dilución 1/20),durante 30 minutos.

El anticuerpo específico anti luci-ferasa (Sig-ma®) fue diluido 100 veces e incubado durantela noche a 4ºC en una cámara húmeda. Tras la-var los cortes con TBS (Tris 0,05 M; NaCl 0,5 M;pH 7,36), se incubaron con el anticuerpo puen-te (IgG de cerdo biotinada contra fracción Fc deIgG de conejo, de Dako®), diluido 200 veces,durante 30 minutos, a temperatura ambiente.

A continuación y tras lavar con TBS se aña-dieron los complejos avidina-biotina (Dako®) yse incubó durante 30 minutos. Finalmente, seprocedió a lavar nuevamente con TBS y a revelarlas preparaciones. Para ello se utilizó una solu-ción de 3,3’-diaminobencidina tetrahidroclorada(DAB) (0,3 mg/mL) a la que se añadió una gota deH2O2. Tras un lavado final, se contrastaron conhematoxilina de Harris durante 10 segundos, yse analizaron en el microscopio óptico.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos en el luminómetro paradetectar la presencia de luciferasa fueron com-parados utilizando los tests no paramétricos deKruskal-Wallis y U de Mann-Whitney. El prime-ro se utilizó para determinar las diferencias en-tre todos los tratamientos dentro de cada inter-valo temporal y el segundo para las diferenciasentre cada tratamiento. Se consideró un valorinferior a 0,05 como significativo. Para el análi-sis se empleó el programa SPSS 9.0 para Win-dows®.

RESULTADOS

Expresión de luciferasa

Los resultados obtenidos en el luminómetrose muestran en la figura 2. En los animales sa-crificados a la semana y a las dos semanas no seobservó un aumento significativo de la reacciónde la luciferasa (p>0,05). En los animales sin lesión (grupo 2) correspondientes a 1 mes detratamiento se apreció un aumento en el pará-metro obtenido en el luminómetro, que sin em-bargo, no resultó significativo. Ese aumento fuemás acusado y resultó significativo en los ani-males de 2 meses (p=0,029). El mismo compor-tamiento se produjo en animales con artritis in-ducida (grupo 3), adquiriendo también caráctersignificativo a los dos meses (p=0,029). En losanimales a los que se les produjo una lesión me-cánica (grupo 4), no aumentó el nivel de lucife-rasa al mes de tratamiento, sino que se vio re-trasado hasta los 2 meses (p=0,029). En losniveles de expresión a los dos meses correspon-dientes a los dos grupos de animales lesionados(grupos 3 y 4), no se encontraron diferencias sig-nificativas (p>0,05) con respecto al grupo deanimales sanos infectados con virus (grupo 2).

Las articulaciones fueron analizadas median-te inmunohistoquímica utilizando un anticuer-po específico para luciferasa. Los resultados dela figura 3 nos muestran la localización de la ex-presión inducida por el virus adeno-asociado.Observamos inmunorreactividad para luciferasaen todos los tejidos articulares. El cartílago arti-cular se vio teñido de forma específica, así co-mo el hueso epifisario hasta la zona de contac-to con el cartílago de crecimiento, donde no se



produjo expresión de proteína. El menisco y lamembrana sinovial, esta última de forma espe-cialmente intensa, también resultaron positivospara la inmunohistoquímica, indicando que lainfección por el virus adeno-asociado y la in-ducción de expresión también afectó a estos te-jidos (figura 3).

Modelo de daño articular

Obtuvimos resultados significativos para lapresencia de luciferasa a los dos meses. El esta-do de la articulación de los animales inoculadoscon suero salino (grupo control) no presentó nin-gún tipo de alteración. Mostraron un articulaciónsin lesiones, un cartílago sano, con un grosorapropiado y una superficie uniforme (figura 4).

En las articulaciones correspondientes al gru-po de ratas inoculadas con los virus adeno-aso-ciados recombinantes (grupo 2), el estado delcartílago femoral fue similar al del grupo control.

En el caso de los animales del grupo 3, el car-tílago articular presentó un grosor inferior al delgrupo control. En algunas zonas, el cartílago ha-bía desaparecido, dejando el hueso subcondralde la tibia, en contacto directo con la articula-ción. La superficie del tejido era rugosa y poco

uniforme (figura 4). La estructura del menisco sevió alterada y rodeada de tejido fibroso.

Similares resultados se encontraron en losanimales lesionados de forma mecánica (grupo4). La superficie del cartílago articular apareciócomprometida, aunque en menor medida queen los correspondientes al grupo 3 (figura 4).

DISCUSIÓN

Los virus adeno-asociados constituyen unaterapia muy ventajosa para la inducción de ex-presión de proteína en sistemas in vivo. Esta es-trategia ha sido ya descrita en varios tipos de te-jido. Utilizando estos vectores, se ha logrado lainducción in vivo en condrocitos de conejo conlesiones de tipo mecánico (15) y la expresión encartílago articular sano y con artrosis tanto in vi-tro como in vivo (16). Los trabajos de Cottard etal., Watanabe et al., Apparailly et al. y Zhang etal. consiguen además la introducción de genescon capacidades terapéuticas, como la IL-4, laIL-10 y el receptor para el factor TNF-� (17-20).Zhang y Goater utilizan una inyección intraarti-cular en animales transgénicos que sobreexpre-san el mismo factor TNF-� (18, 19). Esta mismaestrategia de administración fue utilizada en el



Fig. 2. Expresión de luciferasa. Los extractos de proteína fueron sometidos al sistema LuciferaseAssay System, tal y como se describe en la sección Material y Método, y analizados en un lu-minómetro. Se presenta la media y la desviación estándar de las unidades relativas de luz (RLU)por miligramo de proteína, para cada grupo de animales y cada tiempo de evolución utilizado(n=4). Se consideró significativa una probabilidad inferior al 0,05 (*).



modelo de Pan et al. de artritis mediada por li-popolisacárido en rata (22) y en el de Watanabeet al, en ratones con artritis inducida por colá-geno (18). Estos modelos sin embargo no descri-ben el estado de la articulación en conjuntoanalizando la inducción de la expresión porparte de los virus adeno-asociados.

En nuestro trabajo, hemos realizado y com-parado dos modelos de daño articular. Uno deartritis inducida por colágeno (13) y el otro le-sionado de forma mecánica. Si bien resulta mássevero y generalizado el daño producido por elcolágeno, los dos modelos producen una des-trucción del cartílago que desaparece en algu-

Fig. 3. Localización de la expresión de luciferasa. Análisis mediante inmunohistoquími-ca de los animales del grupo 2, infectados con virus adeno-asociados recombinantes pa-ra luciferasa (izquierda), y del grupo 1, control (derecha). Se aprecia la inmunorreactivi-dad positiva en las fotografías correspondientes al grupo de animales infectados.Fotografías a 4 (A) y 10 aumentos (B y C). F.: fémur; M.: menisco; T.: tibia; S: membranasinovial; C.A.: cartílago articular; C.C.: cartílago de crecimiento.



Fig. 4. Evaluación del daño articular. Fotografías representativas del análisis mediante tricrómico de Masson de los 4 gruposa 2 meses de evolución. A: grupo control; B: grupo infectado con AAV; C: grupo infectado con AAV y con artritis inducidapor colágeno y D: grupo infectado con AAV y con lesión mecánica en la articulación. Se aprecia la aparición de daños enlos grupos con lesión autoinmune (C) y mecánica (D). La primera fotografía de cada grupo a 4 aumentos, el resto a 10. F.:fémur; M.: menisco; T.: tibia.



milar al de los animales infectados pero no da-ñados.

En algunos estudios con virus adeno-asocia-dos, se ha llegado a describir cómo la apari-ción de citoquinas proinflamatorias en los teji-dos articulares dañados acelera la expresión delas proteínas víricas (18, 23, 24). Pan et al, ob-servaron un adelanto significativo en la expre-sión en rodillas que han sufrido un modelo deartritis utilizando lipopolisacárido (LPS) (22).En su modelo, este hecho también podría serdebido a la potenciación de la expresión quees capaz de inducir el LPS sobre el promotorCMV utilizado (24), así como a la inducción deproliferación sobre las células de la articula-ción que ejercería el mismo LPS. Las células enproliferación han demostrado ser más potentesen la inducción producida por virus adeno-asociados (25, 26). En nuestro modelo no se re-produce este comportamiento. Por el contrario,obtenemos un retraso en la aparición de luci-ferasa en el grupo de animales lesionados deforma mecánica, debido probablemente a lapérdida de células causada por esta lesión, conun número inferior de células infectadas en lasrodillas lesionadas. De esta forma el daño noafecta al inicio de la expresión en el interior delas células infectadas sino al número de lasmismas. El trabajo de Goater et al., tambiéndescribe una inducción de la expresión acele-rada en rodillas dañadas mediante TNF-� conrespecto a rodillas no lesionadas (21). La so-breexpresión de este mismo factor, que no seproduce en los animales utilizados en nuestrotrabajo, podría ser la causa de la aceleraciónproducida en el modelo.

El análisis de las articulaciones mediante in-munohistoquímica para luciferasa nos muestralos tejidos en los que se consigue una inducciónde expresión por parte del virus adeno-asociadorecombinante. Se ha conseguido expresión en elcartílago articular, así como en el menisco, elhueso subcondral y la membrana sinovial. Enestos dos últimos tejidos, la expresión resulta es-pecialmente intensa, superando a la producidaen el cartílago y el menisco. Tanto en el huesocomo en la membrana sinovial, las células estánsujetas a una mayor tasa proliferativa. Ya se hamencionado el fenómeno según el cuál las cé-lulas en proliferación resultan más susceptiblesen la inducción de expresión por parte de virus

nas zonas, dejando expuesto el hueso subcon-dral de la tibia. En el modelo de artritis induci-da por colágeno, sin embargo, los daños osteo-condrales no se produjeron en el cartílagoarticular del fémur.

Utilizando estos dos modelos, analizamos lainducción de la expresión génica en rodillas sa-nas y dañadas mediante una estrategia de tera-pia génica (figura 1). Se han empleado virusadeno-asociados recombinantes capaces de in-ducir la expresión de la proteína luciferasa. Elaumento en el nivel de la reacción producidapor la enzima nos indica que la infección convirus recombinantes logra un aumento de la ex-presión de proteína en rodillas sanas a partir delprimer mes, si bien no resulta estadísticamentesignificativa hasta el segundo mes de tratamien-to. Durante este periodo de tiempo se produjo lainfección e integración del virus en el genomade las células de los tejidos articulares dondepermaneció latente, como han descrito algunosautores (9, 12). Esto nos permite sugerir que lainducción de la expresión en nuestro modelo seiniciaría a partir del mes de la infección, consi-guiendo unos niveles significativos a partir delos dos meses.

A pesar de los daños producidos en los ani-males lesionados, el virus adeno-asociado tam-bién logra una expresión del gen de luciferasa.En el caso de animales con artritis inducida, laexpresión se inicia, también, a partir del primermes, sin resultar estadísticamente significativahasta el segundo. En las rodillas lesionadas deforma mecánica, la expresión no se detecta has-ta los dos meses de estudio. El inicio se ve portanto retrasado con respecto a rodillas de ratasno lesionadas o con daños de tipo artrítico. Po-siblemente, los daños producidos por la lesiónmecánica, que se realizó el día después de la in-fección con los virus adeno-asociados causenuna pérdida de células infectadas. Este hechoconlleva una disminución de la carga viral delas articulaciones y retrasaría el tiempo necesa-rio para conseguir niveles de luciferasa similaresa las rodillas de los otros grupos, sin retrasar ne-cesariamente el inicio de la expresión. Los da-ños en los animales inoculados con colágeno seproducen de forma paulatina, permitiendo queel virus realice la infección sobre tejidos todavíasanos, y mostrando así un comportamiento si-



adeno-asociados (25, 26). Probablemente éstasea la causa de las diferencias de tinción en lostejidos articulares, resultando en una expresiónmás elevada en el hueso subcondral y en lamembrana sinovial. Únicamente el trabajo deGoater et al., ha logrado una inducción de pro-teína utilizando virus adeno-asociados, admi-nistrados intraarticularmente en toda la articula-ción, pero en animales transgénicos quesobreexpresan el factor TNF-� (21). Sin embar-go, no detectan la expresión en estos tejidos enlos controles sanos correspondientes a ratonesde cepas normales. En nuestro estudio logramosuna inducción que no se ve modificada por laaparición de daño en la articulación. Esta estra-tegia, por tanto, podría lograr expresión de pro-teínas terapéuticas en estadíos iniciales de dañoarticular, lo que permitiría la reparación del teji-do dañado de forma muy temprana e impediríala extensión de la lesión que se produce en elcartílago.

Existen estudios que realizan terapia génicaex vivo utilizando sinoviocitos infectados conretrovirus, sin embargo la eficacia es relativa-mente baja y la técnica laboriosa (27). Así mis-mo, se han utilizado adenovirus recombinantesmediante inyección intraarticular consiguiendouna inducción de expresión de forma más sen-cilla (28, 29). Estos vectores, sin embargo, gene-ran una expresión transitoria en los tejidos dia-na, así como inflamación en rodillas queúnicamente fueron inoculadas con los virus (30,31). La ventaja de los virus adeno-asociados esla expresión a largo plazo que son capaces deconseguir.

Nuestro estudio describe, por tanto, el uso devectores víricos adeno-asociados en la rodillamediante una administración intraarticular. He-mos conseguido una expresión de proteína re-combinante a los dos meses de tratamiento y ex-tendida a toda la articulación, tanto en animalessanos como en animales con daño artrítico omecánico. El daño no es capaz de eliminar laexpresión de proteína recombinante. En estesentido, sería necesario el planteamiento de ex-perimentos del mismo tipo utilizando virus recombinantes que induzcan la expresión deproteínas capaces de ejercer algún efecto tera-péutico sobre las diferentes estructuras de la ar-ticulación.

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transferencia génica mediante virus adeno-asociados en un

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