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HistologíaMedicina 2015
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HISTOLOGÍA – AGOSTO DE 2015 1
Generalidades de las técnicas utilizadas en histología
La mayor parte de los contenidos se puede formular en los términos de la microscopía
óptica, pero la interpretación más detallada de la microanatomía se fundamenta en la
microscopía electrónica (ME), tanto con el microscopio electrónico de transmisión
(MET) como en el microscopio electrónico de barrido (MEB). Hoy, el microscopio defuerza atómica (MFA), también puede proveer imágenes de alta resolución
comparables con las entregadas por el MET.
Existen técnicas auxiliares de la histología, las cuales incluyen:
Histoquímica y citoquímica.
Inmunocitoquímica y técnicas de hibridación.
Radioautografía.
Cultivo de tejidos y órganos.
Separación de células y orgánulos por centrifugación diferencial.
Microscopios y técnicas microscópicas especializadas.
Preparación del tejido. Tinción con hematoxilina eosina de muestras fijadas
en formalina.
1. Fijación: Conserva la estructura del tejido en forma permanente para permitir
el tratamiento ulterior. Las muestras tienen que sumergirse en el fijador
inmediatamente después de extraerse del organismo. La fijación se utiliza para:
Abolir el mecanismo celular.
Impedir la degradación enzimática de las células y los tejidos por autolisis
(autodigestión).
Destruir los microorganismos patógenos como las bacterias, los hongos o los virus.
Endurecer el tejido como consecuencia de la formación de enlaces cruzados o la
desnaturalización de las moléculas proteicas.
El fijador de uso más común es la formalina, una solución acuosa de formaldehído al
37%, en diluciones variadas y en combinación con otras sustancias químicas y
amortiguadoras. El formaldehído preserva la estructura general de la célula y de los
componentes extracelulares al reaccionar con los grupos amino de las proteínas.Además, como el formaldehído no altera su estructura tridimensional, las proteínas
mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos específicos. Esta propiedad es
importante en los métodos de tinción Inmunocitoquímica. El formaldehído no
reacciona con los lípidos, y por tanto, es un mal fijador de las membranas.
2. Inclusión: Para poder examinar la muestra hay que infiltrarla con un medio de
inclusión que permita realizar cortes muy delgados (5 a 15 micrómetros). Luego
de la fijación, la muestra se lava y se deshidrata con una serie de soluciones
alcohólicas de concentración creciente hasta alcanzar alcohol al 100%.
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3. Aclaramiento: Se utilizan solventes orgánicos como xileno o tolueno, que son
miscibles tanto en alcohol como en parafina, para extraer el alcohol al 100%
antes de la infiltración de la muestra con parafina fundida.
4. Corte: Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endurecido, se empareja
para formar un bloque de tamaño adecuado. Este bloque, llamado taco, se
coloca entonces en una máquina cortadora especial, el micrótomo, que lo cortaen rebanadas finas con una cuchilla de acero. Luego, los cortes se montan sobre
un porta objetos, a los cuales se les añade anteriormente una cantidad pequeña
de albúmina para que sirva de adhesivo.
5. Extracción de la parafina: Se utiliza Xileno o tolueno.
6. Rehidratación de la muestra: Se utiliza una serie de alcoholes de
concentración decreciente.
7. Tinción de la muestra: Primero, el tejido colocado sobre los portaobjetos se
tiñe con hematoxilina en agua. Como el colorante de contraste, eosina, es más
soluble en alcohol que en agua, se vuelve a deshidratar la muestra en solucionesalcohólicas de concentración creciente y después se tiñe con eosina en alcohol.
8. Finalización del preparado: Luego de la coloración de la muestra, se hace
pasar por xileno o tolueno y se le coloca un medio de montaje no acuoso antes
de cubrirla con un cubreobjetos para lograr un preparado permanente.
A) Hematoxilina sola (color morado/azul uniforme). Tinción básica. Se adhiere a los
ácidos. *Cuando algo se tiñe con un colorante básico, se le denomina basófilo.
B) Eosina sola (color rosa/rojizo). Tinción ácida. Se adhiere a los componentes
básicos. *Cuando algo se tiñe con un colorante ácido, se le denomina acidófilo.
C) Hematoxilina Eosina (Núcleos de color morado y citoplasma rosado).
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Otros fijadores
La formalina no preserva todos los componentes de las células y los tejidos. Además,
muchos componentes se pierden durante la preparación de la muestra. Para conservar
estos componentes y estructuras hay que utilizar otros métodos de fijación. Estos
métodos se fundamentan en un conocimiento sólido de la química.Para conservar los lípidos neutros, como los de las células adiposas, deben utilizarse
cortes por congelación de tejido fijado en formalina y colorantes solubles en
grasas; para conservar estructuras de la membrana hay que usar fijadores especiales
con metales pesados, como permanganato y osmio, que se unan a los fosfolípidos.
En las microfotografías electrónicas, el tetróxido de osmio es el responsable del
excelente estado de conservación de las membranas celulares.
Composición química de las muestras histológicas
Los componentes que perduran luego de la fijación son principalmente moléculas
grandes que no se disuelven con facilidad, en especial después de aplicar el fijador.
Estas moléculas grandes, en particular las que reaccionan con otras moléculas
semejantes para formar complejos macromoleculares, son las que suelen conservarse
en un corte histológico. Los siguientes son ejemplos de estos complejos
macromoleculares grandes:
Nucleoproteínas
Proteínas intracelulares del citoesqueleto
Proteínas extracelulares Complejos de fosfolípidos y proteínas (o carbohidratos) en las membranas
Algunos componentes como el glucógeno, proteoglicanos y glucosaminoglicanos
se pierden durante la fijación de rutina en fijadores acuosos.
Fundamentos químicos de la coloración
Un colorante ácido, como la eosina, tiene una carga neta negativa en su parte
coloreada y se describe con la formula general (Na+ anilina-).
Un colorante básico, como la hematoxilina, tiene una carga neta positiva en su partecoloreada y se describe con la fórmula general (Anilina+ Cl-).
Desde el punto de vista estructural, la hematoxilina no es un colorante básico, pero
tiene propiedades de tinción muy semejantes a las de las anilinas básicas.
Los colorantes básicos reaccionan con los componentes aniónicos de las células y
los tejidos. (Grupos fosfato de los ácidos nucleicos, los grupos sulfato de los
glucosaminoglicanos, y los grupos carboxilos de las proteínas).
Sustancias dentro de las células y en la matriz extracelular que presentan basofilia:
Heterocromatina y nucléolos. Componentes citoplasmáticos.
Material extracelular (como los carbohidratos complejos).
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Sustancias dentro de las células y en la matriz extracelular que presentan acidofilia:
Filamentos citoplasmáticos.
Componentes membranosos intracelulares.
Fibras extracelulares.
Metracromasia: Cuando algunos tipos de tejidos (cartílago, gránulos de
heparina de mastocitos, etc.) son teñidos con un colorante básico
(generalmente azul), hacen cambiar su color desde el azul al rojo. Por ejemplo,
el azul de toluidina se verá púrpura o rojo cuando se utilice para teñir los
componentes mencionados.
Reacción del PAS (ácido periódico-reactivo de Schiff): Tiñe carbohidratos y
macromoléculas con abundancia de carbohidratos. Se usa para detectar glucógeno enlas células, moco en varios tipos de células y tejidos, la membrana basal que se
encuentra debajo de los epitelios y las fibras reticulares del tejido conjuntivo. Los
carbohidratos se convierten en aldehídos.
Reacción de Feulgen: Se utiliza para teñir DNA, por medio de una hidrólisis ácida débil
con HCL. Además, esta técnica es útil para cuantificar el DNA en el núcleo celular.
Inmunocitoquímica
Los anticuerpos, también llamados inmunoglobulinas, son glucoproteínas
producidas por células específicas del sistema inmunitario en respuesta a una proteína
extraña o antígeno. En el laboratorio, los anticuerpos pueden purificarse de la sangre
y conjugarse con un colorante fluorescente. En general estos colorantes
(fluorocromos) son sustancias químicas que absorben luz de longitudes de ondadiferentes, y luego emiten luz visible de una longitud de onda específica. La
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fluoresceína, el colorante de uso más
frecuente, absorbe la luz ultravioleta y emite
luz verde.
En la Inmunocitoquímica se utilizan dos
tipos de anticuerpos: anticuerpospoliclonales producidos por animales
inmunizados y anticuerpos monoclonales
producidos por líneas celulares productoras
de anticuerpos inmortalizadas (de
duplicación continua).
Tejido epitelial
El tejido epitelial tapiza la superficie del cuerpo, reviste las cavidades corporales y forma
glándulas. El epitelio es un tejido avascular compuesto por células que recubren las
superficies externas del cuerpo y revisten las cavidades internas cerradas, y los tubos
que comunican con el exterior (aparatos digestivo, respiratorio y genitourinario). El
epitelio también forma la porción secretora (parénquima) de las glándulas y sus
conductos excretores. Además, hay células epiteliales especializadas que funcionan
como receptores sensoriales (olfato, gusto, oído y visión).
Las células que integran los epitelios poseen 3 características principales:
Están dispuestas muy cerca unas de otras y se adhieren entre sí por medio
de moléculas de adhesión célula-célula específicas, que forman uniones
intercelulares especializadas.
Tienen polaridad morfológica y funcional, lo que significa que las
diferentes funciones se asocian con tres regiones superficiales de
morfología distinta: la región apical, la región lateral y la región basal. Las
propiedades de cada región se determina por los lípidos específicos y
proteínas integrales inmersas en esa zona. Su superficie basal está adherida a una membrana basal subyacente, que
es una capa de material acelular, con proteínas y polisacáridos abundantes.
Los epitelios a su vez, cumplen con la tarea de servir como barrera selectiva capaz de
facilitar o inhibir el intercambio de sustancias específicas entre el exterior y el
compartimiento de tejido conjuntivo subyacente.
Clasificación de los epitelios