Reporte: Influencia de el pH en fermentaciones alcoholicas con la levadura Saccharomyces

Cerevisiae.

Control Estadístico del Proceso

Argil Hernández Denisse AlejandraArias Carrillo Alejandro

Moreno Muñóz Luis Adrián

04/12/2015

Introducción

Los métodos de análisis potenciomètricos se basan en la medición del potencial de celdas electroquímicas sin el paso de corriente apreciable. Por casi un siglo, las técnicas potenciomètricas han sido utilizadas para encontrar puntos finales en las valoraciones o titulaciones. El número de mediciones potenciomètricas que se realizan en un solo día es asombroso. Las empresas manufactureras miden el pH de muchos productos de consumo, los laboratorios clínicos determinan gases en sangre como indicadores importantes de muchas enfermedades, los efluentes municipales e industriales son monitoreados continuamente para determinar su pH y las concentraciones de contaminantes en ellos, y los oceanógrafos determinan el dióxido de carbono y otras variables relacionadas en el agua de mar. Las mediciones potenciomètricas también se utilizan en estudios fundamentales para determinar constantes de equilibrio termodinámicas como Kb y Kps, así como para los medios de cultivo, donde para el cual se requieren condiciones adecuadas como temperatura, grado de humedad, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Estos son solo unos cuantos ejemplos de las miles de aplicaciones de las mediciones potenciomètricas.

Objetivos Específicos

Determinación de pH óptimo para crecimiento de la levadura Saccharomyces Cerevisiae en el proceso de la fermentación alcohólica

Objetivos generales

Hacer una comparación del rendimiento fermentativo a través del pH, usando un medio de control y un medio sometido a factores físicos o químicos.Determinar cuál sería el pH óptimo para un medio fermentativo, sometido a factores físico, químicos que permitan un control aséptico en un biorreactor. Generar un análisis estadístico a partir de cartas de control “X,” “R” barra, e índices de capacidad, con los datos de pH obtenidos del medio de control y el medio sometido a factores físico o químicos para su comparación.

Marco Teórico.

Los biorreactores, ordinariamente llamados también fermentadores, son recipientes de reacción, en los que se crean técnicamente las condiciones óptimas para el cultivo y la multiplicación de microorganismos. Bacterias, hongos y algas constituyen el grupo de microorganismos más importantes en los procesos de microbiología industrial, su multiplicación permite la obtención de su biomasa o de los productos de su metabolismo. Las condiciones necesarias para el mejor crecimiento de los microorganismos determinan la forma de construcción de los biorreactores.

Fermentación alcohólica

En la levadura y en otros microorganismos que fermentan la glucosa y la transformación de etanol y CO2, en lugar de producir lactato, la ruta enzimática de la degradación de la glucosa es idéntica a la que se ha descrito para la glucolisis anaerobia, solo se diferencia en la etapa catalizada por el lactato deshidrogenasa.En la levadura, que no contiene lactato deshidrogenasa, como la del tejido muscular, tiene lugar dos reacciones enzimáticas que la sustituyen.En la primera, el piruvato procedente de la degradación de la glucosa, pierde su grupo carboxilo por acción de la piruvato descarboxilasa. Esta reacción es una sencilla descarboxilaciòn en la que no produce una oxidación neta del piruvato

La descarboxilacion precisa de Mg2+ y se halla unida íntimamente con la coenzima pirofosfato de tiamina, cuya función es la de transportador transitoria del grupo acetaldehído.En la segunda etapa, el acetaldehído se reduce a etanol por el NADH en presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa. El NADH produce de la deshidrogenasa del gliiceraldehido 3-fosfato y porta el poder reductor a la reacción que cataliza la deshidrogenasa del etanol. Los productos finales son, etanol y Co2 en la fermentación alcohólica, en lugar de lactato. La ecuación global de la fermentación alcohólica puede escribirse como se expone a continuación.

Levadura Saccharomyces Cerevisiae

El género de Saccharomyces son unicelulares, más comúnmente llamados levadura. Aunque algunas levaduras y hongos pueden causar problemas a las plantas y las personas, los Saccharomyces juegan una función importante en las cindustrias de la y elaboración de alcohol.

ClasificaciónReino: Hongos, Filo: Ascomycota, Clase: Hemiascomycetes, Orden: Saccharomycetales, Familia: Saccharomycetaceae, Género: Saccharomyces. La especie más común es la Saccharomyces cerevisiae, que es la levadura del horneado o cerveza.

Descripción Los hongos son organismos parecidos a las plantas, que no contienen clorofila. Para sobrevivir, deben obtener su viviendo en fuentes orgánicas. Las saccharomyces tienen una pared celular hecha de quitina y sus lípidos son vinculados por ésteres. Usan una plantilla de ADN para la síntesis de proteínas, lo que hace que el Saccharomyces sea un organismo ideal para los investigadores que estudian acerca del daño y la reparación del ADN. Los Saccharomyces se reproducen en ciernes, una forma de reproducción asexual.

Función Saccharomyces significa "hongos de azúcar", que ofrece una clave a la función de su levadura. Los Saccharomyces tienen la capacidad de fermentar los azúcares, queriendo decir que pueden convertir el azúcar en dióxido de carbono y alcohol. La Saccharomyces cerevisiae hace esta función de forma tan eficiente que puede fermentar su propio peso en glucosa en no más de una hora.

Ciclo de vidaEl ciclo de vida de este organismo simple ha ofrecido información útil a la biología molecular, incluyendo la especialización celular y la expresión genética en eucariotas. Los Saccharomyces crecen mediante ciernes. Esto quiere decir que la célula "madre" da lugar a una célula hija elipsoidal con una nueva superficie celular. Sin embargo, los Saccharomyces pueden sobrevivir y crecer en un estado haploide y diploide. Los haploides pueden aparearse y formar una célula diploide.

RasgosLos Saccharomyces, cuando crecen en ambientes controlados, maduran en tres días. Forman colonias húmedas, planas y suaves que varían de color crema a bronceado. Las saccharomyces no pueden utilizar nitrato, deben tener pseudohifas; sin embargo, las hifas encontradas en muchos hongos no están presentes. Los Saccharomyces formarán ascosporas cuando crecen en algunos medios. Éstas son esporas contenidas en un asca.

Desarrollo de una fermentación alcohólica a pH regulado y temperatura de 25ºC en el biorreactor bioflo 3000 M1227 y estudio inicial de

fermentaciones en sistema continuo

Activación e inoculación de la levaduraLa levadura Saccharomyces cerevisiae se activó previamente antes de ser inoculada en cada cultivo. Esta preparación es necesaria para 1 litro de medio. Se pesó 5 gramos de sacarosa comercial y se depositaron en el balón aforado de 100 ml completando el volumen con agua destilada. Se colocó en el baño termostatizado hasta que llego a una temperatura de 35 ºC. Se pesó .6 gramos de levadura y se colocó en el vaso de precipitado de 100 ml. Se añadió 6 ml de la solución azucarada y se dejó en el baño termostatizado a 35 ºC hasta que se notara la presencia de gas CO2. (Alba y Sierra 1997).

La inoculación de la levadura se realizó tomando en consideración los procedimientos para el manejo estéril de cultivos. Para ello todas las inoculaciones se realizaron en la cámara de flujo laminar CAE ET utilizando material previamente esterilizado (pipetas, Erlenmeyer) y utilizando el mechero para flamear todo el material que tuviera contacto con los medios.

Resultados de fermentaciones preliminares

Se presenta las siguientes tablas de resultados para las fermentaciones en Erlenmeyer empleando medio natural.

Tabla 4.10 Resultados de calibración para método de determinación de azucares reductores.

El porcentaje de error total del método es el promedio de los cinco puntos determinados y es de .6 %.Discusión de resultado.Selección de medio de cultivo con mayor rango fluctuación de pH.Para lograr observar el funcionamiento continúo del sistema de regulación de pH en el bioflo y facilitar el desarrollo de la guía de manejo del sistema de bombas peristálticas, es necesario que de manera preliminar se determine qué medio de cultivo presenta mayor fluctuación de pH a lo largo de una fermentación.

Metodología del proceso fermentativo del alcohol etílico.Diagrama de actividades

1.- INICIO2.- SELECCIÓN Y LAVADO

3.- EXTRACCIÓN DEL LÍQUIDO4.- FILTRACIÓN

5.- ESTANDARIZACIÓN6.- AJUSTE DE Ph

7.- DESTILACIÓN Y RECUPERACIÓN

Cronograma de actividades

Diagrama de Ishikawa

Etapas del proceso fermentativo

Etapa 1: Elección de fruta y pelado

1.-Se seleccionaron naranjas que físicamente se

observaran de buena calidad y sin oxidación

predominante en la fruta

2.- Se pelo y obtuvo zumo de naranja

(aproximadamente 3 litros)

Etapa 2: Ensamblado de biorreactor

3- Se adaptó a un envase de 6 Lt una llave para

muestreo

4.- Se ajustó e instalo un airlock para mantener

las condiciones de CO2 y O2 en óptimas

condiciones (se usó un set de venoclisis para

armar el airlock)

Etapa 3: Fermentación

5.-Se pesaron 700 gr de azúcar de caña haciendo

uso de la balanza analítica y 1.5 gr de levadura

por litro de Zumo de naranja (3 litros)

6- Traspasar los 3 lt de zumo de naranja al

biorreactor (2 min)

7- Se agregó cada reactivo dentro del biorreactor

8- Se tomó medición inicial de Ph y grados brix

9-Se selló herméticamente el biorreactor

10- se dejó reposar a temperatura ambiente

Muestreos

Se realizaron 2 muestreos diarios durante 9 días, en caso de disminución de pH debajo del optimo se ajustó haciendo uso de carbonato de calcio únicamente agregando la sustancia hasta llegar al punto óptimo de Ph.El pH se mantuvo cercano al óptimo y la temperatura por las condiciones del laboratorio se mantuvo siempre constante en 24 °C, por el material del biorreactor se nos dificulto mantenerlo a una temperatura más alta.

Filtrado11.- En esta etapa se tomaron aprox. 1 litro y medio el cual por medio de un embudo con filtros se separó el mosto del fermentado de esta manera obteniendo 1L del producto del biorreactor de fermentaciónDestilación12.-Se montó un equipo de destilación tradicional en el cual pusimos los 1L de fermentado, tomando en cuenta las temperaturas de ebullición procedimos a realizar la destilación, recordando que la temperatura de ebullición del alcohol es de 78.37 °C y del agua es de 100 °C.Se obtuvieron 100 mL de alcohol a los 48 min de comenzar la destilación

NOTA: debido a que los mecheros están un poco barridos y sumándole a esto que la temperatura no era constante se tuvo que bajar a la temperatura y/o retirar el mechero para así mantenerse en la temperatura deseada.

También que solo destilamos 100 mL ya que tomo muchísimo tiempo y recursos

por parte de la universidad, aunado a esto se hace mencionar que pudimos

obtener más.

Resultados

Se obtuvieron 100 ml de alcohol destilando 1 L de

fermentado de naranja con aproximadamente 10

días de fermentación, haciendo uso de 700 gr de

Azucar, 3 lt de jugo de naranja y 1.5 gr de

levadura por litro de jugo utilizado.

El alcohol poseía las propiedades organolépticas

pertenecientes a esta sustancia, por lo que se

podía asegurar que se obtuvo lo que se

esperaba.

Cabe mencionar que no se destilo la cantidad

completa de jugo ya que el matraz balón solo

tenía una capacidad de 1 L de volumen y por

cuestión de tiempo se decidió solo destilar 1 L del

fermentado.

Conclusión

Se concluye que se cumplió con el objetivo del

proyecto y la hipótesis que se tenía en la misma,

la producción de alcohol haciendo uso de azúcar

en frutas resulta satisfactoria, podemos observar

que la obtención de alcohol por este método es

adecuado y nos permite obtener una cantidad de

alcohol en buena proporción.

Cálculos estadísticos del proceso fermentativo.

Se revisaron bibliografías para establecer límites de especificidad, a continuación se citara el párrafo del libro microbiología.

El pH óptimo de desarrollo de las levaduras se encuentra entre valores de 4.0 a 6.0 con un valor mínimo de 2.6 a 2.8 por debajo de los cuales la fermentación alcohólica es imposible. Teniendo en cuenta que los mostos tiene un pH que oscila entre 3.0 y 3.8 la fermentación alcohólica se desarrolla sin dificultad, conviniendo los valores más bajos posibles de pH, para evitar los desarrollos bacterianos peligrosos en el caso de una parada de fermentación

Después de la investigación bibliográfica, se tomaron los datos de pH del articulo “Desarrollo de una fermentación alcohólica a pH regulado y temperatura de 25ºC en el biorreactor bioflo 3000 M1227 y estudio inicial de fermentaciones en sistema continuo” para hacer la carta de control X doble y Rango que son los que se muestran a continuación en la siguiente imagen:

Nota: los valores de pH en el artículo muestra las variaciones en los días que cambiaron, no de todos los días en general, por lo tanto se asume que los datos faltantes no se expusieron por el hecho de que no había cambiado el pH muestreado y así tener una mayor cantidad de datos, en la captura hecha en Excel se tomaron todos los datos y se capturaron los faltantes por la razón ya mencionada. Que se mostrara en la tabla de la siguiente página.

A continuación se muestra la tabla de datos del artículo capturada en Excel. Donde se realizara a los datos de pH expuestos en el artículo, las cartas de control X doble barra y R. a continuación se cita el muestro del artículo. “En este estudio se tomaron dos muestras de pH por día, los días 0, 1, 4, 5, 6, 8 y 11 del crecimiento de la levadura Saccharomyces Cerevisiae en el mosto. “ Se capturaron al igual los datos no expuestos en el artículo.

Los datos definidos por las formulas se tomaron de la tabla de coeficiente, de acuerdo al número de muestra, los datos obtenidos son los siguientes:N (muestra)=2, A2=1.880, D4=3.267, D3=0De los cuales se obtuvieron los siguientes resultados:

Una vez obtenidos los limites, se realizaron las gráficas de cada una de las cartas de control.

En la gráfica de X barra, se realizó una tabla para establecer cada dato de acuerdo al número días, en el que se muestreo así como los límites de especificidad que se obtuvieron de acuerdo a la bibliografía consultada

Gráfica X barra

En la gráfica se puede observar que tanto los límites de control así como las medias obtenidas de acuerdo al muestro por día, sobre pasan los LEI y LES que son los establecidos por la bibliografía para que la fermentación del mosto sea eficiente. Y no pase a un pH menos a 3 que pueda propiciar el crecimiento de agentes extraños que puedan impedir el desarrollo de las levaduras en la fermentación.

Gráfica de Rangos

En la gráfica de rangos se observa la variación que hubo en cada media en

la que se muestreo.

Intervalo de confianza al 95%

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