toxicidad del oxígeno
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Toxicidad del oxgeno Prof.Dr. Hector Coirini
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TOXICIDAD DEL OXGENO Y RADICALES LIBRES
LAS DOS CARAS DEL OXGENO
La mayora de los organismos vivos,
entre ellos nosotros, utilizan el oxgeno
molecular (O2) para respirar y muchos no
podemos vivir sin l. El xito de los organismos
aerbicos reside en el hecho de que gracias al
oxgeno podemos extraer ms energa de los
alimentos que aquella que pueden obtener lo
organismos anaerbicos. Todos estos procesos se
dan en el interior de la clula y se conocen como
beta-oxidacin, gluclisis, ciclo de Krebs y
respiracin celular. En definitiva reducimos el O2
en agua y la energa de esta reaccin, la
utilizamos para formar el trifosfato de adenina
(ATP). Finalmente utilizamos estas molculas
energticas para, sntesis de macromolculas,
para realizar todo tipo de trabajo mecnico o para
transportar iones y metabolitos a travs de las
membranas celulares.
Aproximadamente el 80% del ATP que
utilizamos se forma en las mitocondrias en donde
se consume entre el 85 y el 90% del O2. Es por
ello que no podemos vivir sin respirar y dado que
dependemos del O2, hemos considerado a esta
molcula como sinnimo de vida. Sin embargo
las caractersticas del proceso de reduccin del
O2 en agua, produce intermediarios capaces de
generar importantes alteraciones funcionales.
La gran concentracin del O2 en la
atmsfera y su baja reactividad en condiciones
ambientales ha generado la impresin de que el
O2 es inocuo. Esta concepcin se ha extendido
inclusive entre los mdicos. As, es comn que al
recin nacido, sobre todo si es prematuro, se le
aplique O2. Sin embargo cuando se administra
en exceso, el O2perjudica al nio, causndole,
por ejemplo, una fibropata retrolental oproblemas respiratorios.
Hay muchos datos que indican que el O2
es txico y lo es a cualquier concentracin. As,
por ejemplo, muchos microorganismos se alejan
del O2y se estratifican dentro de un gradiente de
O2 segn sus requerimientos y capacidades
antioxidantes. Las plantas crecen mejor en
ausencia del O2. Las radiaciones ionizantes sonms txicas en presencia de altas concentraciones
de O2, siendo esta particularidad aprovechada en
el tratamiento de algunos tumores cancerosos.
En resumen, la utilizacin de O2por las
clulas es esencial, sin embargo algunos
productos que derivan del proceso fisiolgico
normal del metabolismo del O2 representan una
amenaza para la homeostasis celular. Estosproductos son llamados en trminos generales
especies reactivas del oxgeno o EROs, y son
capaces de provocar injuria celular.
CONCEPTO DE RADICALES LIBRES Y SUFORMACIN
Los electrones de un tomo ocupan
regiones del espacio denominadas orbitales
atmicos. Cada orbital puede tener un mximo de
dos electrones que estn apareados, y que poseen
spines antiparalelos. Los radicales libres son
especies qumicas de existencia independiente
que poseen un electrn no apareado, es decir un
solo electrn en un orbital. La presencia de este
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electrn desapareado hace que los radicales libres
sean altamente reactivos e inespecficos.
En frmulas, los radicales libres se
representan con un punto ubicado en forma
exponencial, que simboliza su electrn no
apareado. Estas especies qumicas pueden
formarse de tres maneras diferentes:
1.- Por ruptura homoltica de un enlace covalente
de una molcula normal, siendo este el
mecanismo mas comn.
X : Y X
. + Y
.
2.- Por la prdida de un electrn de una molcula
normal
A A+. + e-
3.- Por la adicin de un electrn a una molcula
normal.
A + e A-
.
De aqu se puede ver que los radicales
libres pueden ser negativamente cargados,
positivamente cargados o elctricamente neutros.
Tengamos en cuenta que en la fisin heteroltica
de un enlace covalente se forman iones y no
radicales libres
X : Y X : - + Y +
RELACIN ENTRE LA MOLCULA DELOXGENO Y LOS RADICALES LIBRESCELULARES
Como hemos dicho anteriormente, se
consideran radicales libres a aquellas molculas
que en su estructura atmica presentan un
electrn desapareado o impar en el en el orbital
mas externo, dndole una configuracin especial
que genera una alta inestabilidad. Son entonces
entidades qumicas que presentan, contrario a la
normal tendencia espontnea de los electrones
localizados en los tomos y molculas, a la
formacin de parejas con otro electrn
desapareado. Esto los hace muy inestables,
extraordinariamente reactivos y de vida efmera,
con una enorme capacidad para combinarse
inespecficamente, con la diversidad de
molculas integrantes de estructura celular:
carbohidratos, lpidos, protenas, cidos
nucleicos y derivados de cada uno de ellos.
Los orbtales moleculares mas externos
del O2se encuentran ocupados por dos electrones
no apareados, cada uno de ellos, situado en un
orbital (pi) diferente formando lo que se
denomina un bi-radical. Esto es, tiene dos
electrones libres o desapareados, pero estos
electrones tienen el mismo giro o spin, por lo que
slo pueden interaccionar con los electrones de
otros elementos y compuestos que estn libres y
que tengan el giro opuesto. Esto significa que
para aceptar un par de electrones de un sustrato,
el O2 debe invertir el spin o giro de uno de sus
electrones, lo cual requiere una gran cantidad de
energa. Esta es la razn por la cual el O2 no es
muy reactivo y que la materia orgnica no entra
en combustin espontnea en contacto con O2.
La toxicidad del O2se explica entonces debido a
la formacin de especies reactivas del oxgeno
(EROs). Estas especies son derivados del O2que
son ms reactivos que ste en su estado basal.
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Las principales son: las especies que se
producen de la ruptura o de la excitacin del O2,
o sea, el oxgeno atmico, el ozono y el oxgeno
en singulete, y las especies de oxgeno que estn
parcialmente reducidas, esto es, el radical
superxido, el perxido de hidrgeno y el radical
hidroxilo.
El oxgeno singulete (1O2:) es una forma excitada
de oxgeno molecular, que se forma en
determinadas reacciones en el proceso de
peroxidacin de lpidos, que veremos ms
adelante. Esta especie qumica puede
desexcitarse emitiendo una energa dentro del
espectro lumnico (efecto de quimiolumi-
niscencia). En el presente apunte no se ahondar
en el anlisis de esta especie molecular por
escapar de los objetivos del mismo.
Los radicales libres ms importantes
presentes en los sistemas biolgicos son entonces
especies derivadas del oxgeno.
La mayor parte del oxgeno utilizado
por el organismo humano es reducido a agua por
accin del complejo citocromo-oxidasa de la
cadena respiratoria mitocondrial, segn la
reaccin global siguiente:
O2+ 4 H+ + 4e- 2H2O
Como fue explicado en clases anteriores, la
reaccin se hace en cuatro pasos univalentes:
O2 O2.-
H2O2.OH + H2O H2O
e-= electrnH
+= hidrogeniones
O2.-= radical anin superxido
H2O2= perxido de hidrgeno.OH= radical hidroxiloH2O= agua
Por lo tanto la reduccin del oxgeno por la
transferencia de un nico electrn produce el
radical libre anin superxido (O2.- )
O2+ e- O2.-
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La reduccin del oxgeno por la
transferencia de dos electrones da perxido de
hidrgeno. En los sistemas biolgicos, el
perxido de hidrgeno es generado a travs de la
produccin de anin superxido; dos molculas
de superxido reaccionan para dar perxido de
hidrgeno y oxgeno
O2.-+ 2 H+ H2O2 + O 2
Debido a que la reaccin de dos
radicales libres produce productos no-radicales,
esta reaccin se conoce como reaccin de
dismutacin. Puede ocurrir espontneamente
(aunque de manera muy lenta) o puede estar
catalizado por una enzima llamada superxido
dismutasa (SOD). El perxido de hidrgeno no
es un radical libre pero es considerado una
especie reactiva del oxgeno. Las especies
reactivas de oxgeno son un grupo de compuestos
que comprenden a los radicales libres y tambin
a otras especies qumicas no-radicales
involucradas en la produccin de los mismos.
El perxido de hidrgeno reacciona
fcilmente en presencia de metales de transicin,
para producir un radical libre de oxgeno muy
reactivo y daino: elradical hidroxilo (.OH)
H2O2+ Fe2+
.OH + OH- + Fe3+
(Reaccin de Fenton)
Tambin el radical hidroxilo puede
obtenerse a partir de la siguiente reaccin, si bien
ocurre en forma ms lenta en los sistemas
biolgicos
O2.- + H2O 2 .OH + OH-+ O2
(Reaccin de Haber- Weiss)
FUENTES CELULARES DE RADICALESLIBRES
Como fue mencionado, la generacin de
especies reactivas de oxgeno est relacionada
con la respiracin celular y otros procesos de
transferencia de electrones, la regulacin de la
actividad de sistemas enzimticos, la respuesta a
estmulos de clulas especializadas (por ejemplo
fagocitocis) y diversas situaciones de importancia
en patologa y toxicologa. As, la mayor
produccin de radicales libres ocurre en
mitocondrias, retculo endoplsmico y
peroxisomas.
El principal proceso biolgico que lleva
a la generacin de anin superxido es la cadena
de transporte de electrones a nivel mitocondrial
(respiracin celular). Normalmente, la reduccin
de oxgeno a agua en la cadena respiratoria
requiere la transferencia secuencial de electrones,
y generalmente esto se acompaa por la
formacin de radicales libres. Cuando la
concentracin de ADP es baja los intermediarios
de la cadena respiratoria estn en estado
reducido, y en esa situacin hay una gran
produccin de anin superxido. Se ha
establecido que el lugar donde se produce este
radical libre es a nivel de ubiquinona
citocromo-b. La concentracin de anin
superxido en la mitocondrial es del orden de
10-11
M.
Las membranas microsomal y nuclear
tambin contienen sistemas de transporte de
electrones, citocromos P450 y b5, los cuales
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tambin pueden producir radicales libres.
Durante la oxidacin del NADPH, los
microsomas hepticos generan anin superxido
y perxido de hidrgeno.
Numerosas enzimas citoslicas pueden
contribuir a la formacin de O2.- ,. OH y H2O2.
Varias oxidasas estn presentes en altas
concentraciones en peroxisomas. Los
peroxisomas contienen tambin altas
concentraciones de catalasa, enzima que
neutraliza el potencial efecto daino del H2O2.
Otro sitio importante de produccin de
radicales libres se encuentra en clulas
involucradas en la actividad fagoctica:
macr6fagos, neutrfilos y eosinfilos. La
explosin respiratoria durante la actividad
fagoctica (burst) genera especies reactivas de
oxgeno, esenciales para la defensa del husped
contra la bacteria invasora.
Durante la fagocitosis, una oxidasa
unida a membranas es activada en estas clulas,
llevando a un aumento en la captacin de
oxgeno y en la produccin de O2.- y H2O2. Se
cree que las clulas fagocticas activadas generan
importantes cantidades de H2O2y que ste es el
principal compuesto responsable del potencial
citotxico observado en la inflamacin tisular
localizada. Adems de la generacin de perxido
de hidrgeno el radical hidroxilo (.OH) tambin
puede ser generado durante la fagocitosis. Esteradical se produce a travs de la reaccin de
Haber-Wiess o la reaccin de Fenton catalizada
por hierro.
NADPH + H+
NADP+
NADPH oxidasa
O2
O2-O2-
H2O2
HOCl
NADPH + H+
NADP+
NADPH oxidasa
O2
SO D
Cl-
Fe2+
Fe3+
OH
Bacteria
MIELOPEROXIDASA
Reaccin de Fenton
Bacteria
Invaginacin de la membrana de un NEUTROFILO
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La enzima xantino oxidasa representa
otra fuente de radicales libres. Esta enzima
participa en el camino degradativo de las bases
pricas, catalizando la transformacin de
hipoxantina en xantina y esta en cido rico en
dos pasos sucesivos de oxidacin. La amplia
distribucin de esta enzima citoslica, sugiere un
rol importante en las condiciones patolgicas
tales como dao por isquemia de una amplia
variedad de rganos, particularmente en la
mucosa intestinal. La xantino oxidasa es una
flavoprotena que contiene molibdeno, hierro y
azufre.
Fuentes adicionales de formacin de
radical superxido son las reacciones de
autooxidacin no enzimtica de la ubiquinona,
catecolaminas y tioles, y el transporte y captacin
de oxgeno por hemoglobina y mioglobina. El
aporte de radical superxido de todas estas
fuentes es mucho menor que el que corresponde
a la cadena de transporte de electrones
mitocondrial.
REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMASCON OXGENO MOLECULAR COMOSUSTRATO
Las enzimas que utilizan oxgeno corno sustrato
pueden reducirlo de una manera controlada sin
liberar altas concentraciones de radicales libres al
entorno. Estas enzimas utilizan iones metlicos,
flavinas y otros cofactores para superar la barrera
cintica impuesta por la restriccin de spin y la
barrera de energa en el proceso de reduccin
Los intermediarios de oxgeno que se
generan, usualmente se mantienen unidos al sitio
activo de estas enzimas, formando complejos
metal-oxgeno, hasta que la reaccin termina. El
nico que generalmente se libera es el perxido
de hidrgeno. Las enzimas que catalizan
reacciones que involucran oxgeno pueden ser
clasificadas como oxidasas y oxigenasas.
Oxidasas Las oxidasas transfieren electrones al
oxgeno, el cual es reducido a agua o perxido de
hidrgeno. Un ejemplo de este tipo de enzimas es
la Citocromo C oxidasa, el complejo terminal de
la cadena de transporte de electrones. Esta
enzima cataliza la reduccin del oxgeno a agua.
En la reaccin el oxgeno se une al in Cu++y al
Fe++del hemo en el sitio activo, superando as la
restriccin de spin. En una primera etapa se letransfieren dos electrones, dando perxido de
hidrgeno; y luego, con la transferencia de otros
dos electrones, se reduce finalmente a agua. Este
mecanismo permite que la reaccin ocurra de
manera controlada, sin la interaccin entre
radicales libres de oxgeno y otros componentes
de la cadena respiratoria adyacentes.
La mayora de las oxidasas de la clula forman
perxido de hidrgeno en vez de agua. Estasenzimas estn generalmente en peroxisomas o
mitocondrias, donde el perxido de hidrgeno es
removido por catalasas o peroxidasas.
N
NN
HN
O
OH H
O
N
NN
HN
OH H
O -
+
H2O
+
2 H+
MoVI
MoIV
S-Fe2+
S-Fe3+
O2
O2.-
urato
xantina
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Oxigenasas: Las oxigenasas incorporan oxgeno
al sustrato; monooxigenasas son aquellas que
incorporan un solo tomo de oxgeno al sustrato
y reduce el otro a agua mientras que las
dioxigenasas incorporan ambos tomos de
oxgeno.Las monooxigenasas, llamadas tambin
hidrolasas, requieren de un sustrato que done
electrones, como por ejemplo NADPH; una
coenzima como el FAD que puede transferir un
nico electrn, y un metal o compuesto similar
para formar un complejo con el oxgeno.
Citocromo P450: Se llaman as a un conjunto de
monooxigenasas relacionadas estructuralmente,que hidroxilan muchos compuestos fisiolgicos,
tales como esteroides y cidos grasos, y muchos
compuestos xenobiticos tales como drogas o
agentes carcingenos. Como otras mono-
oxigenasas incorporan un tomo de oxgeno en el
sustrato, el cual se hidroxila en este proceso, con
la formacin simultnea de agua. El donor de
electrones usualmente es el NADPH.
Dioxigenasas: Se encuentran, generalmente en el
camino metablico que convierte cido
araquidnico en prostaglandinas, tromboxanos y
leucotrienos. Tambin, catalizan reacciones de
ruptura de enlaces Carbono - Carbono en la
degradacin de aminocidos.
ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO Y DAOA BIOMOLCULAS
En 1954 una investigadora argentina,
Rebeca Gerschman, sugiri por primera vez que
los radicales libres eran agentes txicos y
generadores de enfermedades. Por la alta
inestabilidad atmica de estas sustancias cuando
colisionan con una biomolcula, le sustraen un
electrn, oxidndola, perdiendo de esta manera la
biomolcula su funcin especfica en la clula. Si
se trata de los lpidos (en particular los formados
por cidos grasos polinsaturados), se daan las
estructuras ricas en ellas como las membranas
celulares y las lipoprotenas. En las primeras se
altera la permeabilidad conduciendo al edema y
la muerte celular y en las segundas, las
oxidaciones producidas principalmente sobre las
LDL, resulta en la gnesis de la placa
ateromatosa como veremos mas adelante.
En caso de las protenas se oxidan
preferentemente los aminocidos (fenilalanina,
tirosina, triptofano, prolina, histidina, arginina,
cistena y metionina) y como consecuencia se
forman entrecruzamientos de cadenas peptdicas,
fragmentacin de la protena y formacin de
grupos carbonilos, impidiendo el normal
desarrollo de las funcio-nes de estas protenas
(transportadores inicos de membranas,
receptores y mensajeros celulares, enzimas que
regulan el metabolismo celular, etc.).
Otra molcula que es daada por los
radicales libres es el ADN; el dao a los cidos
nucleicos produce bases modificadas, lo que
tiene serias consecuencias en el desarrollo de
mutaciones y carcinognesis por una parte, o la
prdida de expresin por dao al gen especfico.
Los radicales libres pueden entonces
ejercer efectos tiles o nocivos para elorganismo. As, vimos anteriormente que la
produccin de estos compuestos es fundamental
en el proceso de fagocitosis. Adems, algunas
reacciones del organismo se producen por un
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mecanismo en el que se forman especies
radicales pero que rpidamente son
neutralizados, algunos ejemplos son las
reacciones de la ciclooxigenasa o de latromboxano sintetasa. Sin embargo, son
numerosos los efectos nocivos que estos
compuestos pueden causar en el organismo. Es
por ello, que se han desarrollado diversos
sistemas de defensa contra las especies reactivas
de oxgeno.
Cuando existe un aumento en la
formacin de los radicales libres o una
disminucin de los sistemas de defensa aparece
una situacin metablica denominada estrs
oxidativo. Protenas, lpidos, carbohidratos y
cidos nucleicos estn sujetos a daos causados
por especies reactivas de oxgeno. Son
numerosas las patologas que han sido asociadas
a estrs oxidativo. Este procesoocurre cuando las
especies reactivas de oxgeno son producidas
ms rpido de lo que son removidas por lasdefensas celulares y como veremos mas adelante
estos mecanismos de defensas incluyen a ciertas
enzimas y vitaminas.
FORMACIN DE RADICALES LIBRES DELPIDOS Y LIPOPERXIDOS
Las membranas celulares contienen
fosfolpidos que contienen cidos grasos con
varios dobles enlaces. Estos cidos grasos poli-insaturados son ms sensibles a la oxidacin que
los cidos grasos saturados o los mono-
insaturados porque los metilenos (CH2) entre dos
dobles ligaduras pueden perder fcilmente un
hidrgeno. Las EROs que pueden producir la
prdida de estos hidrgenos son el radical
hidroxilo (.OH) y el radical peroxilo.
Las caractersticas de la oxidacin
lipdica por radicales libres, provoca una
reaccin en cadena en la que el cido graso al
oxidarse, se convierte en un radical de cido
graso con capacidad de oxidar a otra molcula
vecina. Este proceso es conocido como
peroxidacin lipdica, generando numerosos
subproductos, entre ellos el malondialdehdo,
cuya determinacin en tejidos, plasma u orina es
uno de los mtodos de evaluar el estrs
oxidativo.
La formacin de radicales libres
peroxilo requiere la presencia de un iniciador (tal
como el radical hidroxilo) para comenzar la
reaccin en cadena.
La peroxidacin usualmente empieza
con la produccin local del radical hidroxilo a
partir de perxido de hidrgeno, mediada por
Fe2+, este radical libre (.OH), es el responsable
de la extraccin de un tomo de hidrgeno unido
a un carbono entre dobles enlaces conjugados
(presentes en los cidos grasos insaturados) lo
cual da inicio a la reaccin en cadena. La
formacin de un radical lipdico sobre un tomo
de carbono provoca un reordenamiento de la
molcula con cambios en lo dobles enlaces
presentes.Una vez generado un el radical sobre un
tomo de carbono en un cido graso, ste
reacciona con el O2 para formar un radical
peroxilo
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El radical peroxilo puede obtener un
hidrgeno allico proveniente de otro metileno deuna cadena de cido graso cercana lo cual
propaga la reaccin iniciada por el radical
hidroxilo. As la formacin de una ERO puede
generar muchos lipoperxidos.
Los lipoperxidos se pueden reducir
mediante glutatin peroxidasas de fosfolpidos o
ser eliminados por la accin de fosfolipasas como
la fosfolipasa A2, la cual se ha observado
aumentada durante el estrs oxidativo.
Por lo tanto a modo de resumen la
peroxidacin lipdica puede dividirse en los
siguientes procesos:
Iniciacin: La cual consiste en la remocin de un
tomo de hidrgeno de una cadena de cido
graso insaturado por accin del radical hidroxilo
para formar un radical de cido graso centrado en
carbono.
LH +.OH L
.+ H2O
(LH= cido graso, L.= radical libre centrado en
carbono)
Propagacin: Que implica la formacin de
radicales peroxilo (radical de cido graso
centrado en oxgeno) por interaccin del radical
de cido graso centrado en carbono con oxgeno
molecular que contina con la captura por este
radical de un hidrgeno de otro resto de cido
graso dando dos productos, el primero un
hidroxiperxido lipdico (con caractersticas
distintas del cido graso inicial) y un nuevo
radical centrado en carbono que continuar con
la secuencia de reacciones.
L. + O2 LOO
.
LOO
.
+ LH LOOH + L
.
(LOO.= radical peroxilo,
LOOH= hidroxiperxido lipdico)
Terminacin: Consiste en la interaccin de
radicales peroxilo con radicales centrados en
carbono, lo que produce la formacin de
hidroxiperxidos lipdicos y lpidos con mayor
grado de insaturacin (mayor nmero de dobles
enlaces). Tambin es posible la interaccin de
radicales centrados en carbono con las defensasantioxidantes del organismo, lo que regenera el
lpido original con gasto del antioxidante.
LOO.
+L. LOOH + LH con una nueva
insaturacin
L. + vitamina E LH + vitamina E
.
L. + vitamina E. LH + vitamina E oxidada
La descomposicin de lpidos durante el proceso
de peroxidacin lipdica implica la ruptura de lacadena hidrocarbonada del cido graso afectado.
Entre los productos de descomposicin se
encuentran el malondialdehido y el 4-hidroxi-2-
nonenal.
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inactivada de manera irreversible por
concentraciones muy bajas de H2O2 y Fe2+.
Otro ejemplo de dao a protenas es laoxidacin de la glutamina sintetasa. Esta enzima
es oxidada a nivel de histidina y arginina,
localizados en el sitio activo, en forma conjunta
por el Fe2+ y el perxido de hidrgeno.
La oxidacin de algunos restos
aminocidos como arginina, lisina o prolina,
conduce a la formacin de grupos carbonilo. As,
la determinacin de estos grupos funcionales
dentro de la clula puede ser un mtodo para
evaluar el dao a protenas. Otra consecuencia dela oxidacin de protenas es la ruptura de la
cadena peptdica o en entrecruzamiento de
cadenas. Por otro lado, se ha determinado que las
protenas oxidadas son ms fcilmente
degradadas por proteasas
Me++ Fe++C
O=Fe++ H2O2 PROTEASAS
Aminocidos
Se ha demostrado un aumento de
parmetros que indican dao oxidativo a
protenas (aumento de C=O, inactivacin de
glutamino sintetasa o glucosa-6-fosfato-
deshidrogenasa, actividad de proteasas, etc) en
un nmero considerable de patologas:
Envejecimiento normal, enfermedad de
Alzheimer, restriccin calrica-proteica,
isquemia-reperfusin, artritis reumatoidea,
cataratas, etc.
DAO OXIDATIVO A CIDOS NUCLICOS
En el ADN ocurre, a una tasa baja pero continua,
la prdida de bases, la desaminacin de la
citosina en uracilo y de la 5metilcitosina en
timidina y la ruptura de una o las dos hebras del
ADN. Estas alteraciones se incrementan
considerablemente con el estrs oxidativo. En
muchas clulas se generan modificaciones en las
bases del ADN cuando se les aade H2O2. Esto
se debe en gran parte a los metales de transicin,
fundamentalmente al Fe2+, que se encuentranunidos al ADN y que en presencia del H2O2
generan el radical.OH que modifica las bases del
mismo. El.OH puede atacar tanto las purinas
como las pirimidinas, as como la desoxiribosa y
adems generar rupturas en el ADN. La reaccin
de radicales libres con los azcares del ADN
puede traer como consecuencia la fragmentacin
del azcar, la prdida de una base con parte deeste residuo hidrocarbonado y el corte de la
cadena (ver esquema).
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N
NN
NH
NH2
N
NN
N
O
O
H2N
H
H
H
N
NH
H
NH2
NH
CO
N HN
N
O
O
H
HCH3OHOH
N
N
H
CH3
O
O
H H
N
NN
NH
O
H2N
Tim ina Adenina Guanina
Timina glicol formamido pirimidina 8 -oxoguanina
Especies React ivas de Oxgeno
El ataque sobre las bases conduce a una
alteracin de la misma, como puede verse en el
esquema. Puede llegar a observarse rotura de
simple y doble cadena. Timina y citosina son las
bases ms susceptibles al dao por .OH, seguido
por adenina y guanina. La susceptibilidad del
ADN al dao oxidativo depende adems, de la
complejidad de la molcula. Por ejemplo, el
ADN doble hlice es menos susceptible a la
injuria oxidativa que el ADN aislado.
Se sabe que las explosiones atmicas
estn acompaadas por la emisin de radiaciones
ionizantes, las que provocan la formacin en los
tejidos de grandes cantidades de radicales libres.
Estos compuestos, por lo tanto, pueden daar al
ADN.
DAO OXIDATIVO EN LOS HIDRATOS DECARBONO
El avance en la qumica de los radicaleslibres indica que no hay sustancia biolgica que
est exenta del ataque de estos compuestos. Por
lo tanto, no resulta sorprendente el hecho que la
glucosa y otros monosacridos relacionados
pueden sufrir oxidacin en condiciones
determinadas. Se ha demostrado que la glucosa
puede servir como un atrapador de radicales .OH,
siendo as oxidada. Tambin se ha descripto que
el manitol y deoxiazcares reaccionan fcilmentecon radicales libres. El cido hialurnico,
principal proteoglicano que mantiene la
viscosidad del fluido sinovial en las
articulaciones, es un glicosaminoglicano que
contiene unidades repetidas de glucurnico y N-
acetil-glucosamina. Se ha descripto, que luego de
una exposicin a radicales libres, como puede
ocurrir en un proceso inflamatorio, el cido
hialurnico se fragmenta, y en consecuencia hayuna desestabilizacin del tejido conectivo y una
prdida de la viscosidad del fluido sinovial.
Aquellos carbohidratos con una estructura de -
hidroxi-aldehido pueden enolizarse en la
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presencia de iones para transformarse en ceto-
aldehdos. Algunos monosacridos simples
sufren fcilmente autooxidacin bajo condiciones
fisiolgicas para formar compuestos
decarbonilicos y perxido de hidrogeno. La
importancia de la autooxidacin de la glucosa y
compuestos relacionados se centra en el hecho
que estas molculas activadas pueden
interaccionar con otras molculas, formando
nuevas estructuras. Un ejemplo de este caso
podra ser la glicosilacin no especfica de
protenas.
SISTEMAS DE DEFENSA CONTRA EL DAOOXIDATIVO
An bajo condiciones fisiolgicas
normales, la homeostasis celular est
incesantemente atacada o desafiada por
estresores provenientes del medio interno o
externo. Para defenderse de estos estresores, la
clula ha desarrollado mecanismos de proteccin.
La principal amenaza a la homeostasis celular en
los organismos aerbicos deriva del metabolismo
del oxgeno, que genera especies reactivas que
producen dao a las diversas estructuras
(protenas, lpidos y ADN), an en condiciones
fisiolgicas. Evolutivamente, se han desarrollado
sistemas de defensa que son mecanismos que
tienden a neutralizar el efecto oxidativo del
oxgeno y sus metabolitos y que generalmente se
denominan sistemas antioxidantes. Estos
sistemas de defensa se clasifican en primarios y
secundarios, de acuerdo a sus funciones de
prevencin y reparacin del dao producido,
respectivamente.
SISTEMAS PRIMARIOS DE DEFENSA
Antioxidantes
Son sustancias que reaccionan con radicales
libres transformndolos en especies no radicales
y convirtindose en radicales del antioxidante,
que por su estructura qumica suelen ser muy
estables y no propagan la reaccin. Muchas veces
se regeneran por accin enzimtica, volviendo a
adquirir su capacidad antioxidante. Entre ellos se
encuentran:
1- Vitamina E:La vitamina E es el antioxidante
ms ampliamente distribuido en la naturaleza, ya
que se lo encuentra tanto en el reino animal como
vegetal. El trmino genrico vitamina E se refiere
al menos a 8 ismeros estructurales del tocoferol.
Entre estos, el alfa-tocoferol es el ms conocido
dado que presenta la ms potente actividad
antioxidante. Debido a su propiedad lipoflica, la
vitamina E acta fundamentalmente en un
entorno lipdico, por ejemplo en las lipoprotenas
plasmticas (forma parte de las LDL) y en las
membranas.
Altas concentraciones de tocoferol se encuentran
en determinados tejidos como por ejemplo
glndula adrenal, corazn, testculos e hgado. En
el interior de la clula, la vitamina E est
asociada a las membranas mitocondriales y del
retculo endoplsmico. Por lo tanto, la accin
antioxidante de esta vitamina es altamente
efectiva para proteger a las membranas de la
lipoperoxidacin lipdica reaccionando conradicales hidroxilo y peroxilo.
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2- Vitamina C: En contraste a la vitamina E, la
vitamina C o cido ascrbico es hidroflico y
funciona mejor en un ambiente acuoso. Como
agente reductor y antioxidante, la vitamina C
reacciona con O2-. y .OH y varios
hidroperxidos lipdicos. Adems puede
regenerar la propiedad antioxidante de lavitamina E.
La vitamina E y la vitamina C puede actuar enconjunto. Ej:
LOO.+ vitamina E LOOH + vitamina E.
vit E. + ascorbatosemi-dehidro-ascorbato + vitamina E
La vitamina C est ampliamente distribuida en
tejidos de mamferos y se encuentra presente en
cantidades relativamente elevadas en glndulas
adrenales e hipfisis. En menor concentracin, se
la encuentra en hgado, bazo, pncreas y cerebro.
En la mitocondria es posible que la
vitamina E sea regenerada por reaccin con la
ubiquinona
vitamina E.+ CoQH2 vitamina E + CoQH.
La semiquinona puede transformarse nuevamente
en quinona por la cadena de transporte de
electrones.
3- Vitamina A: Durante mucho tiempo los
carotenoides han sido considerados antioxidantes
debido a su capacidad de atrapar radicales libres.
Protege a los lpidos contra la peroxidacin
inducida principalmente por la xantino oxidasa.
4- Glutation: El tripptido glutation (GSH)
(gamma glutamil-cisteinil-glicina) es el tiol de
bajo peso molecular ms abundante en casi todas
las clulas de mamferos. La concentracin
intracelular varia entre 0,5 mM y 5 mM pero en
ciertas ocasiones puede alcanzar una
concentracin de l0 mM. El glutation reducido se
caracteriza por su grupo tiol (-SH) muy reactivo
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y su enlace gamma glutamilo que lo hace
resistente al ataque por peptidasas. Sus
propiedades fsico-qumicas le permiten servir
como nuclefilo y como reductor interactuando
con numerosos compuestos electroflicos y
oxidantes tales como O2-
H2O2y .OH.
El glutation contribuye a mantener
reducido los grupos sulfhidrilos de protenas y es
una defensa contra la accin de las especies
reactivas del oxgeno teniendo un rol de
importancia en una variedad de procesos de
detoxificacin. Adems es capaz de regenerar la
vitamina E a su forma activa
L. + vitamina E LH + vitamina E.
vitamina E. + GSH vitamina E + GS.
2GS. GSSG
GSSG + NADPH + H+
2 GSH + NADP+
5- Bilirrubina: Es el principal producto del
catabolismo del hemo. Como se ver masadelante (Metabolismo del Hemo), la bilirrubina
se produce por accin de la hemo-oxigenasa, que
transforma el hemo en monxido de carbono,
Fe3+ y biliverdina, la cual por accin de la
biliverdina reductasa, es convertida en bilirrubina
hemo + O2 + NADPH + H+
Fe3+ + CO + NADP+ + biliverdina(hemo-oxigenasa)
bili verdina + NADPH + H+bilirrubina + NADP+
(biliverdina reductasa)
Dada la gran actividad de biliverdina
reductasa en la mayora de los tejidos,
prcticamente no se encuentra biliverdina, sino
bilirrubina. Siempre se consider a la bilirrubina
como un producto de desecho, cuya acumulacin
en ciertas regiones cerebrales puede producir
transtornos graves en el recin nacido
(kemicterus), dado que el sistema de conjugacin
de la bilirrubina es inmaduro. Por ello la mayor
parte de la bilirrubina se elimina del organismo,
sin embargo pequeas cantidades quedan en el
organismo. Recientemente se ha comprobado que
esas pequeas cantidades de bilirrubina,
constituyen una defensa muy efectiva contra las
EROs. En el cerebro, la bilirrubina resulta un
agente protector contra la lipoperoxidacin
desencadenada por el H2O2. Durante la reaccin
con el agente oxidante, la bilirrubina se oxida a
biliverdina, pero teniendo en cuenta la alta
actividad de la biliverdina reductasa, se vuelve a
transformar en bilirrubina inmediatamente,
permitiendo de esta manera controlar el proceso
de oxidacin desencadenado por grandes
cantidades de EROs a pesar de que la bilirrubina
se encuentra en concentraciones muy bajas.
bilirrubi na + agente oxidante
biliverdina + agente oxidante inactivado
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bili verdina + NADPH + H+
bilirrubina + NADP+
6- Melatonina: Este compuesto es la principal
hormona sintetizada por la glndula pineal
Adems de cumplir funciones
relacionada con los ritmos circadianos, se ha
demostrado que la melatonina tiene propiedades
antioxidantes, que se ejercen a dos niveles: En
primer lugar acta como atrapador de radicales
libres en forma directa permitiendo la
regeneracin de la vitamina E. En segundo lugar,
se comprob que la melatonina es capaz de
inducir en el cerebro a una de las enzimas que
metabolizan EROs la glutation peroxidasa (ver
mas adelante). Tambin la melatonina presenta la
capacidad de aumentar la produccin de NADPH
por activacin de la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa. Recordemos que el NADPH es
cofactor en la generacin de bilirrubina a partir
de biliverdina y en la reduccin del glutation.
Adems, la melatonina inhibe la produccin de
otro radical libre de importancia biolgica, el
xido ntrico (NO).
7- cido rico: Tradicionalmente, el cido rico
se lo considera un producto del metabolismo de
degradacin de purinas. Sin embargo
actualmente se ha reconocido su capacidad como
antioxidante, ya que se ha demostrado que capta
.OH. El mecanismo de accin no est an
totalmente aclarado, se cree que acta
preservando el ascorbato plasmtico,
probablemente debido a la formacin de
complejos con metales de transicin como hierro
y cobre. Otros investigadores han propuesto que
el cido rico activa la sntesis de
prostaglandinas iniciada por el araquidnico.
Sistemas enzimticos que intervienen en elmetabolismo de las EROs
1- Superxido dismutasa (SOD): La superxidodismutasa es una metalo-enzima que cataliza la
dismutacin del radical superxico (O2-.)
O2-. + O2-. H2O2 + O2
Se conocen tres clases distintas de enzimas
intracelulares las cuales dependen del ion
metlico que asociado: Cu/Zn SOD; Mn SOD y
Fe SOD. La mayor actividad se localiza en la
mitocondria (Mn SOD, tetrmero) y en el
citoplasma (Cu/Zn SOD, dmero). La actividad
de SOD presenta diferencias entre los diferentes
tejidos. La mayor actividad se encuentra en
hgado, glndula adrenal, rin y bazo.
2- Catalasa: Esta enzima cataliza la conversin
de perxido de hidrgeno en agua
2 H2O2 2 H2O + O2
El hgado, rin y glbulos rojos poseen
altas concentraciones de catalasa. Esta enzima se
encuentra predominantemente en peroxisomas,
pequeas organelas que adems contienen
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oxidasas que producen perxido de hidrgeno.
Existe una rara alteracin gentica denominada
acatalasemia, caracterizada por el dficit casi
completo de la enzima catalasa. La
sintomatologa es casi nula, indicando que
presumiblemente otros mecanismos de defensa
compensan la falta de esta enzima.
3- Glutation Peroxidasa: Esta enzima cataliza la
reduccin del perxido de hidrgeno y de
hidroperxidos orgnicos, utilizando al gutatin
como agente reductor.
2 GSH + H2O2 GSSG + 2 H2O
2 GSH + LOOH GSSH + H2O + LOH
La enzima esta localizada tanto en citoplasma
como en la mitocondria. Hay dos tipos de
glutation peroxidasa: dependiente y no
dependiente de selenio. Poseen diferente
especificidad de sustrato. La peroxidasa
dependiente de selenio es citoslica y tiene una
baja capacidad para la reduccin de H2O2. La
enzima independiente de selenio utiliza
hidroperxidos orgnicos preferentemente.
Esquema que resume las defensas enzimticas
contra la injuria por radicales libres:
2 O2-.
Superxido
Dismutasa
H2O2
Fe2+
Fe3+
.OH
2 H+
2 GSH
GSSG
NADP+
NADPH
2 H2
O + O2
Glut at ion
PeroxidasaGlutation
ReductasaCatalasa
O2
SISTEMAS SECUNDARIOS DE DEFENSA
1- Enzimas Lipolticas: Las clulas estn
equipadas con varias enzimas responsables para
la reconstruccin de los constituyentes de
membranas daados o alterados. Se ha sugerido
la eliminacin mediada por fosfolipasas de los
cidos grasos de los lpidos de membrana pueden
ser un medio efectivo para mantener la integridad
de membrana y al mismo tiempo proveer un
medio para regular el recambio ('turn-over') de
los lpidos de membrana. Algunos investigadores
han demostrado que la peroxidacin de los
lpidos de membrana puede estimular la actividad
lipoltica de la fosfolipasa A2 e igualmente, los
lpidos peroxidados son los sustratos preferidos
de la fosfolipasa A2. Esto tiene una gran
importancia fisiolgica, ya que representa un
mecanismo eficaz en la reparacin del dao a
membranas
2- Enzimas Proteolticas: Varias enzimas
proteolticas pueden actuar como mecanismos de
defensa contra el dao oxidativo, al degradar
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protenas oxidadas alteradas. Este proceso puede
es de gran importancia en el envejecimiento,
donde la acumulacin de protenas daadas
puede no ser ventajoso para el organismo. La
estrategia celular para combatir la injuria
oxidativa a protenas por enzimas proteoliticas
sera anlogo al descripto para lpidos y otros
constituyentes, es decir cumplir una funcin dual
de proteccin y reparacin.
3- Enzimas reparadoras del ADN: Las clulas
poseen mecanismos para reconocer y reparar
defectos generados por las alteraciones de bases
nitrogenadas del ADN, que actan durante los
procesos de replicacin o bien luego de daos
generados por factores fsicos o de agentes
oxidantes. Entre las enzimas involucradas existen
endonucleasas, ADN polimerasas beta y epsilon,
ADN ligasas y fosfatasas que eliminan las
secuencias defectuosas remplazndolas por
secuencias correctas.
4- Sustancias exgenas atrapadores de radicales
libres Existen sustancias que atrapan radicales
libres (en ingls: 'scavengers'). Entre ellas se
encuentran sustancias vegetales del grupo de los
flavonoides o de los antocianos. Estos
compuestos estn presentes, por ejemplo, en el
vino tinto produciendo un efecto protector contra
los radicales libres. Estudios realizados en
Francia determinaron que el vino Cabenet
Sauvignon y el vino tinto tienen una
concentracin elevada de flavonoides; mientras
que la grapa y el vino blanco poseen
concentraciones muy bajas de los mismos.
En resumen, las defensas primarias estn
formadas por antioxidantes y enzimas captadoras
de radicales libres que disminuyen marcadamente
los niveles de radicales libres. Sin embargo, en
ciertas circunstancias algn dao celular puede
ocurrir, entonces las defensas secundarias,
eliminan entonces, las molculas daadas o bienlas reparan.
ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO Y SURELACIN CON PATOLOGAS
Cual es el rol exacto que cumplen las
especies reactivas de oxgeno en diversas
patologas? En primer lugar, algunas
enfermedades pueden ser causadas por un estrs
oxidativo. Por ejemplo, la radiacin ionizante
genera .OH por ruptura de molculas de agua.
Muchas de las consecuencias biolgicas de la
exposicin a un exceso de radiacin pueden
deberse a dao causado por los radicales libres
sobre el ADN, lpidos y protenas. Los signos
producidos por una deficiencia dietaria crnica
en selenio (ej. la enfermedad de Keshan) o en
tocoferoles (alteraciones neurolgicas observada
en pacientes con defectos en la absorcin
intestinal) pueden estar mediadas por el estrs
oxidativo (recordar que el selenio es un
componente esencial de la glutation peroxidasa).
En el infante prematuro, la exposicin de la
retina incompletamente vascularizada a altas
concentraciones de oxgeno, pueden llevar a la
retinopata del prematuro, que en los casos ms
severos conduce a la ceguera
Produccin de especies reactivas de oxgenocomo eventos secundarios en patologas
El dao tisular causado por diversas
enfermedades, trauma, toxinas u otras causas,
conduce usualmente a un aumento en la
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formacin de "mediadores de la injuria" como
son las prostaglandinas, leucotrienos,
interleukinas, interferones y factores de necrosis
tumoral. Dentro de este listado de "mediadoresde injuria" podramos incluir a las EROs. En la
mayora de las patologas el estrs oxidativo es
un efecto secundario. Por ejemplo, los neutrfilos
activados producen anin superxido, perxido
de hidrgeno y cido hipocloroso para destruir
los agentes patgenos. Sin embargo, si
comienzan a activarse un gran nmero de
fagocitos en un rea localizada, puede llegar a
producirse dao tisular.
Otro ejemplo seria el caso de un
paciente con artritis reumatoidea, en el cual en el
fluido sinovial de la rodilla se observan grandes
cantidades de neutrfilos activados.
Otro ejemplo se presenta cuando por daos
mecnicos, qumicos o isqumicos se produce la
ruptura de la clula con la consecuente liberacin
de su contenido al entorno. Este contenido puede
incluir metales de transicin como el hierro.
Algunas reas del cerebro humano son ricas en
hierro, pero el lquido cefaloraqudeo no tiene
capacidad para captar este hierro, ya que su
contenido en transferrina es muy bajo. Entonces
si hay dao cerebral producido por medios
mecnicos (trauma) o por deprivacin del
oxgeno (infarto), puede haber liberacin de
hierro, el cual a su vez contribuye a acelerar el
dao, por un aumento en la formacin de
radicales libres catalizada por este metal. Es por
ello que, la administracin teraputica de
antioxidantes que atraviesen la barrera hemato-
enceflica es de gran valor en estos casos.
El hierro se acumula en la sustancia
nigra y otras zonas del cerebro en pacientes quepadecen Parkinson, y se ha especulado que la
formacin de radicales libres por reacciones
dependientes de hierro podran ser importantes
en esta patologa. En pacientes con dao heptico
fulminante se ha demostrado un aumento de la
disponibilidad de hierro y cobre presentes en
plasma.
Una deficiencia en la enzima glucosa-6-
fosfato deshidrogenasa, afecta a los eritrocitos.
Esta enzima que forma parte de la va de las
pentosas-fosfato, genera NADPH, el cual es
utilizado por la glutation reductasa para generar
glutation reducido.
Cuando los niveles de NADPH se
encuentran disminuidos por dficit de glucosa-6-
fosfato deshidrogenasa, la glutation peroxidasa
carece de un sustrato necesario para prevenir laacumulacin de lpidos peroxidados. Como
consecuencia de esto las membranas del
eritrocito se vuelven ms frgiles y la vida media
de estas clulas disminuye, causando anemia. Por
otro lado, en esas condiciones el hierro presente
en la hemoglobina, tiende a mantenerse en forma
oxidada, provocando un aumento en
metahemoglobina, que no transporta oxgeno, lo
que exacerba el cuadro.
La injuria tisular frecuentemente
produce hemorragias con la consecuente
liberacin de hemoglobina por lisis de los
eritrocitos. La exposicin de hemoglobina a
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niveles altos de perxido de hidrgeno causa la
degradacin del grupo hemo con liberacin de
iones hierro. Como recordaran, el hierro puede
catalizar la formacin de otras EROs capaces deestimular la peroxidacin de los lpidos de
membranas. Afortunadamente, existen defensas
contra estos procesos dadas por protenas
plasmticas ligadoras de hemoglobina
(haptoglobina) y de hemo (hemopexinas),
adems la accin de compuestos antioxidantes el
cido ascrbico usualmente inhibe la
peroxidacin acelerada por hemoprotenas en
presencia de limitadas concentraciones de
perxido de hidrgeno, debido a que el ascorbato
acta como un sustrato alternativo para la
oxidacin y temporariamente protege a otras
molculas.
Muchos infantes prematuros presentan
distrs respiratorio, lo cual se debe a la falta de
maduracin pulmonar con la consecuente
incapacidad de sntesis de surfactante pulmolar(este ltimo impide la correcta reduccin de la
tensin superficial dentro del alvolo pulmonar,
que previene el colapso durante la espiracin). La
hipoxia que se genera por esta situacin, causa
acidosis que debe ser corregida, siendo el
tratamiento empleado, la administracin de aire
enriquecido en oxgeno. Sin embargo, un exceso
de oxgeno provoca alteraciones pulmonares y en
la retina.Desde hace algunos aos, se ha tratado
de explicar las causas de la ateroesclerosis
basndose en la hiptesis de la modificacin
oxidativa de las lipoprotenas. Actualmente se
acepta que un aumento en los niveles plasmticos
de lipoprotenas de baja densidad (LDL) y un
aumento en los niveles de colesterol causan un
aumento en los depsitos grasos en la pared
arterial, formando la lesin primaria aterognica.
En este mecanismo, la modificacin oxidativa de
LDL juega un rol fundamental. Las LDL
oxidadas son captadas por monocitos y
macrfagos, los cuales son transformados en
clulas espumosas. Por otro lado, las LDL
oxidadas daan la ntima de la arteria,
contribuyendo al proceso aterognico por
disrupcin del endotelio. Muchos productos
derivados de la lipoperoxidacin,
fundamentalmente los hidroxiperxidos, 4-
hidroxinonenal y malondialdehido, ejercen su
efecto citotxico participando en el
entrecruzamineto de protenas estructurales y en
la modificacin de molculas de ADN que llevan
a la mutagnesis. Tambin se ha demostrado que
la LDL oxidada estimula en las clulas
endoteliales la produccin de prostaglandinas,
que son compuestos que promueven la
agregacin plaquetaria con la consiguiente
exacerbacin de la alteracin vascular.
La anoxia (falta de oxgeno en los
tejidos) provoca la formacin de cantidades
importantes de anin superxido. En principio, se
podra pensar, que en los tejidos privados de
oxgeno no deberan formarse radicales libres. Lo
que sucede es que estos compuestos se forman en
el momento en que el tejido recibe nuevamente
oxgeno (reperfusin). La enzima responsable de
dicho proceso parecera ser la xantino
deshidrogenasa. En condiciones normales esta
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enzima deshidrogena la xantina para formar
cido rico mediante la siguiente reaccin
xantina + H2O + NAD+
cido rico + NADH + H+
Pero en condiciones de anoxia tisular, la xantino
deshidrogenasa es transformada, probablemente
por accin de proteasas en una enzima con
actividad de xantino oxidasa, catalizando la
reaccin:
xantina + H2O + O2
cido rico + 2 O2-.
+ 2 H+
La transformacin de la enzima no es reversible,
de modo que cuando el oxgeno vuelve al tejido,
se forman grandes cantidades de anin
superxido que estara involucrado en el dao
oxidativo.
O2
ATP
AMP
AdenosinaInosina
Hipoxantina Acido Urico
XANTINA OXIDASA
O2-O2-+
En la mayora de las patologas las
especies reactivas de oxgeno son producidas en
mayor cantidad a consecuencia de la injuria
tisular, por lo tanto es lgico preguntarse:
Las especies reactivas de oxgeno
Aportan una contribucin significativa aldesarrollo de la patologa o su formacin tiene
poca o ninguna consecuencia?
La respuesta probablemente sea
diferente para cada patologa. Para afirmar que
estos compuestos son importantes en una
patologa en particular, es necesario demostrar
que:
- Las especies reactivas de oxgeno son
formadas en el lugar de la injuria
-El tiempo de su formacines tal, que
estas especies podran participar de
algn modo en la patologa (correlacin
temporal).
- La eliminacin de las especies
reactivas de oxgeno o la prevencin de
su formacintiene efectos beneficiosos-La aplicacin directa de las especies
reactivas de oxgenoen concentraciones
equivalentes a las encontradas in vivo,
reproduce el dao celular.
Como puede entenderse, estas demostraciones no
son muy fciles de realizar en todos los casos.
XIDO NTRICO
El xido ntrico (NO) es una molcula
compuesta slo por dos tomos, uno de nitrgeno
y otro de oxgeno, lo que determina un nmero
total de 15 electrones. Al tener un nmero impar
de electrones, uno de ellos, ubicado en el orbital
ms externo, est desapareado. y esto es
justamente lo que le da su carcter de radical
libre. Sin embargo, este compuesto es
relativamente estable y tiene una vida media de
1-60 segundos. El NO es una molcula no polar y
por lo tanto es soluble en medio hidrfobo. Esta
propiedad le permite difundir fcilmente a travs
de las membranas biolgicas y as cumplir un rol
de mensajero intercelular. En los ltimos aos se
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ha avanzado de manera significativa en el
conocimiento de la bioqumica del NO y su
participacin en un nmero importante de
procesos. As, actualmente se considera que el
NO es un importante regulador de los sistemas
nervioso, inmune y cardiovascular. Adems de su
funcin como mediador de las funciones
normales, el NO est involucrado en el shock
sptico, hipertensin, infarto y enfermedades
neurodegenerativas.
El NO es sintetizado enzimticamente
por una grupo de enzimas llamadas NO-sintasas
(NOS), ampliamente distribuidas en tejidos de
mamferos. Todas las NOS son dimricas, con un
peso molecular de 130 - 150 kDa por monmero,
poseen en su sitio activo flavina y hemo, as
como un sitio de unin para el complejo calcio-
calmodulina. Muchas de las NOS requieren la
presencia de tetrahidrobiopterina como cofactor
para su accin. El NO se sintetiza por la siguiente
reaccin:
L-arginina + O2+ NADPH + H+
NO + citrul ina + NADP+
Las NOS fueron clasificadas en un
principo de acuerdo a su localizacin en:
endotelial (eNOS), macrofgica (mNOS
iNOS) y neuronal (nNOS). Las eNOS y la
nNOS son variedades constitutivas de la NOS, y
su actividad se regula por activacin calcio-
calmodulina dependiente. En cambio, la mNOS
es inducible por determinados compuestos tales
como citoquinas y endotoxina.
FUNCIONES BIOLGICAS DEL XIDONTRICO
En el endotelio vascular, el NO participa
como factor de relajacin. Una serie demediadores (bradiquinina, ATP, acetilcolina e
ionforos del calcio) estimulan la sntesis de NO
a nivel del endotelio, el cual difunde a travs de
las membranas hasta llegar a las clulas del
msculo liso subendotelial, donde activa la
guanilato ciclasa, que a su vez incrementa los
niveles de GMPc. El GMPc participa en la
activacin de las bombas de calcio que acumulan
el mismo en el sarcoplasma, por lo que el calcio
citoplasmtico disminuye y el msculo se relaja.
De esta manera el NO estara cumpliendo un rol
de mensajero intercelular. El NO difundido al
espacio intravascular es rpidamente eliminado
por la oxihemoglobina eritrocitaria.
El NO cumple un rol fisiolgico en el
sistema nervioso. Uno de los neurotransmisores
excitatorios de numerosas neuronas del sistemanervioso central es el glutamato. Mediante la
unin del glutamato a receptores NMDA (N-
metil-D-aspartato, agonista selectivo de este tipo
de receptor) se produce la apertura de canales
para calcio. Este in penetra en la neurona
postsinptica, y se une a calmodulina, activando
la NOS neuronal, con la consecuente produccin
de NO, que seria un intermediario ms en la
transmisin del estmulo.
El NO tambin puede participar como
molcula efectora citotxica sobre bacterias,
virus y clulas tumorales a nivel los de
macrfagos y neutrfilos del sistema inmune.
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El NO ejerce sus acciones biolgicas a
travs de reacciones con diferentes compuestos,
uno de ellos son las metaloproteinas.
Como vimos anteriormente el suprincipal rol fisiolgico es mediante la
interaccin con la guanilato ciclasa (que es una
hemo-protena) pero el NO tambin se une a
otras hemo-protenas, como por ejemplo
citocromo oxidasa mitocondrial, citocromo P-450
microsomal y a protenas que contienen hierro
como la aconitasa del ciclo de Krebs. Debido a
su interaccin con metaloprotenas el NO que
difunde al espacio intravascular luego de la
relajacin de la musculatura lisa de los vasos
sanguneos (vasodilatacin) puede ser eliminado
mediante su unin con oxihemoglobina
formando metahemoglobina y nitrito mediante la
siguiente reaccin:
hemoglobina Fe2+- O2 + NO
NO3- + hemoglobina Fe3+
En cambio la desoxihemoglobina sufre otro tipo
de reaccin, generando nitrosil hemoglobina, que
produce un complejo estable:hemoglobina Fe2+ + NO
hemoglobina Fe2+- NO
El NO puede reaccionar tambin con grupos
sulfhidrilos de protenas conduciendo a la
formacin de nitrosotioles (RSNO), lo cual
produce una alteracin en la estructura de la
misma, con una posible prdida en su actividad o
funcin. El NO puede oxidarse en presencia de
oxgeno molecular a dixido de nitrgeno (NO2)
que tambin es un radical libre muy reactivo.
Este NO2 es transformado a compuestos mas
estables y menos reactivos como nitrato (NO3- )
y nitrito (NO2-).
H2O
2 NO2-
+ NO2-NO 3
-
H2O
1/2 NO + O2 NO2.
NO.
NO2.
N2O3
N2O4
La reaccin del NO con el radical
superxido conduce a la formacin del anin
peroxinitrito (ONOO-) que es una especie no
radical. Sin embargo, es un compuesto poco
estable, que rpidamente se transforma en nitrato.
El peroxinitrito es una especie altamente reactiva
oxidante capaz de reaccionar con sulfhidrilos,
metaloprotenas, lpidos, azcares y ADN.
El NO reacciona con radicales orgnicos
con gran velocidad, entre ellos puede interactuar
con el radical peroxilo (LOO.) que se forma en la
peroxidacin de membranas. En este caso el
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mecanismo resulta ser beneficioso, ya que
detiene la etapa de propagacin de la
peroxidacin de lpidos por un mecanismo de
dismutacin.
PARTICIPACIN DE NO EN PROCESOSPATOLGICOS
La sobreproduccin de NO resulta ser
txico para la clula. Dicha toxicidad puede
basarse en una sobrestimulacin de la guanilato
ciclasa, como se observa en la sepsis con
hipotensin refractaria, donde una vasodilatacin
persistente genera la cada sostenida de la presin
arterial en la periferia. Por otro lado, se ha
demostrado que un exceso de NO conduce a una
inhibicin de la respiracin celular, debido a que
este compuesto compite por el sitio de fijacin
del oxgeno a nivel de la oxidasa terminal de la
cadena de transporte de electrones. Esta
inhibicin conduce a una disminucin en los
niveles de ATP y una alteracin de lahomeostasis del calcio. El peroxinitrilo tambin
puede tener acciones txicas. Este compuesto
puede inactivar los componentes de la cadena
respiratoria, a enzimas con grupos sulfhidrilos
como la gliceraldehido fosfato deshidrogenasa, o
a enzimas con centros ferro-sulfurados como la
aconitasa. A su vez, el peroxinitrilo puede
reaccionar con los restos tirosinas de ciertas
protenas que son sustratos de quinasas y de este
modo alterar el mecanismo de transduccin de
seales, crecimiento y diferenciacin celular.
MTODOS DE DETERMINACIN DEESPECIES REACTIVAS DE OXGENO
Mediante tcnicas de laboratorio es
posible determinar la produccin de EROs, ya
sea en una forma directa o bien indirectamente
evaluando los efectos producidos por estos
agentes sobre las diferentes biomolculas.
Para el caso de la determinacin directa existen
ensayos especficos para cada tipo de agente. Por
ejemplo, es posible determinar los niveles de
perxido de hidrgeno por la capacidad de ste,
de oxidar al cido p-hidroxifenilactico
(sustancia dadora de hidrgeno) en presencia de
la peroxidasa de rbano, produciendo un
producto fluorescente relativamente estable, cuya
fluorescencia puede ser determinada. Los
radicales libres, hidroxilo, aquellos centrados en
carbono, ascorbilo, ubisemiquinona y el xido
ntrico, presentan concentraciones bajas y una
vida media muy corta, por lo que para su
determinacin es necesario generar una especie
mas estable. Para ellos se utilizan agentes
especficos denominados sustancias atrapadoras,
cuya funcin es generar una sustancia con una
vida media mas prolongada y con una
concentracin mayor. La presencia de esta
especie se determina aplicando un campo
magntico externo a la muestra que la contiene.
El campo magntico genera la alineacin de los
electrones no apareados con este campo y los
cambios de energa producidos por esta
alineacin pueden ser determinados mediante un
detector, generndose una curva de energa
caracterstica. En todos los casos se utilizan
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muestras patrn con el radical a determinar a fin
de comparar las curvas de cambios energticos
producidos. La tcnica utilizada se denomina
resonancia paramagntica electrnica o EPR.Para el caso del radical superxido se determina
su presencia por espectrofotometra, produciendo
la reaccin de este radical con un reactivo
indicador (por ej. citocromo c, adrenalina,
formazan) que va a generar un compuesto
coloreado. El grado de peroxidacin lipdica
puede determinarse por quimioluminiscencia,
dado que las especies excitadas formadas durante
la reaccin en cadena (entre ellos el oxgeno
singulete) vuelve a su correspondiente estado
fundamental liberando energa en forma de
fotones (luz).
En resumen las EROs pueden ser
determinadas en forma directa mediante tcnicas
de fluorescencia, resonancia paramagntica
electrnica, espectrofotometra y quimioluminis-
cencia. Otra forma de evaluar la presencia deEROs en un sistema biolgico es evaluar el dao
producido sobre las biomolculas. As para el
caso de los lpidos, se puede determinar el
consumo de oxgeno utilizando un electrodo
sensible a dicho gas, en suspensiones de
niitocondrias, microsomas, ncleos, etc., dando
una medida del avance en el proceso de
peroxidacin. Tambin puede determinarse la
cantidad de dienos conjugados mediante
espectrofotometra en el rango de luz ultravioleta
(longitud de onda de 230nm). Los
hidroperxidos lipdicos pueden determinarse
mediante cromatografa lquida de alta presin
(HPLC) o por espectrofotometra. El
malondialdehido, producto de la descomposicin
de los lpidos peroxidados, reacciona con el cido
tiobarbitrico dando un compuesto coloreado quepuede cuantificarse por espectrofotometra.
En cuanto a las protenas, la
modificacin por oxidacin, genera grupos
carbonilo, que pueden ser determinados.
Tambin pueden determinarse la desaparicin de
grupos sulfhidrilos, que son altamente
susceptibles de ser oxidados a puentes disulfuros.
La formacin de ditirosinas puede dar un ndice
del entrecruzamiento intramolecular de dos
cadenas peptdicas. La fragmentacin de
protenas, puede ser evaluado por tcnicas de
western blot, mientras que la formacin de
agregados proteicos, por unin de zonas
hidrofbicas, pueden ser monitoreadas por
tcnicas electroforticas.
Otro ndice de accin sobre protenas
activas es la determinacin de la prdida total oparcial de actividad enzimtica.
Con respecto al ADN puede
determinarse la cantidad de bases modificadas,
especialmente la formacin de 8-hidroxi-2'-
deoxiguanosina. Alternativamente se puede
evaluar el grado de fragmentacin del ADN por
medio de electroforesis en geles de agarosa.
EVALUACIN DE DEFENSAS ANTIOXIDANTES
Una forma alternativa de evaluar el
estrs oxidativo es estudiar las condiciones de los
sistemas de defensas antioxidantes Los
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procedimietos a seguir para la evaluacin de
stos son:
a) La determinacin de la actividad de enzimas
tales como la superoxido dismutasa (SOD),catalasa , glutation peroxidasa (GP) por tcnicas
espectrofotomtricas
b) Determinacin de los niveles de antioxidantes
hidrosolubles como la vitamina C y cido rico,
que se miden por tcnicas que utilizan
cromatografa liquida de alta presin (HPLC) o
bien el glutation se determina por tcnicas
espectrofotomtricas
c) Determinacin de compuestos antioxidantes
liposolubles como la vitamina E, carotenoides,
ubiquinoles, que pueden medirse por HPLC.
La mayora de las determinaciones en
los laboratorios, se efectan en lquidos
biolgicos, como sangre tota, suero, plasma,
orina, lquido sinovial, lquido cefalorraqudeo,
saliva, exudado pleural y plasma seminal.
Tambin pueden utilizarse clulas (eritrocitos,clulas de la serie blanca, espermatozoides) e
incluso material proveniente de biopsias y
necrosis.