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Tierärztliche Hochschule Hannover

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Charakterisierung eines murinen Norovirus –

Auswirkungen des Virus auf die experimentelle chronisch

entzündliche Darmerkrankung bei der Interleukin-10

defizienten Maus

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Marcel Achard

Münster

Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Hans-J. Hedrich

Institut für Versuchstierkunde und

Zentrales Tierlaboratorium

Medizinische Hochschule Hannover

Univ.-Prof. A. Bleich, Ph.D.

Institut für Versuchstierkunde und

Zentrales Tierlaboratorium

Medizinische Hochschule Hannover

Apl.-Prof. Dr. M. Mähler

Labor für biomedizinische Diagnostik - BioDoc

Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Hans-J. Hedrich

2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Ludwig Haas

Tag der mündlichen Prüfung: 24. November 2011

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... V

1 Einleitung ........................................................................................................... 1

2 Literaturübersicht .............................................................................................. 2

2.1 Caliciviridae ................................................................................................... 2

2.2 Genetik und Molekularbiologie von MNV ....................................................... 3

2.3 MNV in der Zellkultur ..................................................................................... 5

2.4 Nachweisverfahren für MNV .......................................................................... 7

2.5 MNV-Prävalenz in Versuchstierhaltungen ..................................................... 8

2.6 Erfassung und Bekämpfung von MNV in der Labortierhaltung ...................... 8

2.7 Infektionsverlauf ............................................................................................. 9

2.8 Untersuchungen zum Einfluss von MNV auf bestimmte Mausstämme und

Tiermodelle .................................................................................................... 9

2.9 Weitere Forschung mit murinen Noroviren .................................................. 12

2.10 Tiermodelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) ............. 12

2.11 Die Interleukin-10 defiziente Maus ............................................................... 15

2.12 Ziele dieser Arbeit ........................................................................................ 17

3 Eigene Untersuchungen ..................................................................................18

3.1 Material ........................................................................................................ 18

3.1.1 Mäuse ................................................................................................ 18

3.1.2 Herkunft ............................................................................................. 18

3.1.3 Haltung im Experiment ...................................................................... 19

3.1.4 Synthetische Oligonukleotide ............................................................ 22

3.1.5 Zelllinie .............................................................................................. 24

3.1.6 Eingesetzter Virusstamm ................................................................... 24

Inhaltsverzeichnis

II

3.1.7 Eingesetzter Bakterienstamm ............................................................ 24

3.1.8 Materialliste ....................................................................................... 24

3.2 Methoden ..................................................................................................... 31

3.2.1 Zellkultur ............................................................................................ 31

3.2.2 Virusisolation ..................................................................................... 31

3.2.3 Virus-Nachweis mittels PCR .............................................................. 32

3.2.4 Nachweis von Helicobacter hepaticus mittels PCR ........................... 35

3.2.5 Sequenzierung .................................................................................. 36

3.2.6 Virus-Anzucht für den Infektionsversuch ........................................... 37

3.2.7 Virus-Titer-Bestimmung ..................................................................... 37

3.2.8 Immunofluorescence Assay (IFA) ...................................................... 39

3.2.9 Virusaufreinigung mittels Ultrazentrifugation ..................................... 40

3.2.10 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ................................. 42

3.2.11 Elektronenmikroskopische Aufnahmen.............................................. 44

3.2.12 Isolation und Anzucht von Helicobacter hepaticus für den

Doppelinfektionsversuch ................................................................... 44

3.2.13 Experimentelle Infektion der Mäuse mit MNV .................................... 45

3.2.14 Experimentelle Infektion der Mäuse mit Helicobacter hepaticus ........ 45

3.2.15 Sterile Aufarbeitung des Mesenteriallymphknotens unter einer

Werkbank .......................................................................................... 48

3.2.16 Vorbereitung und Verwendung der Zellkulturplatten für die

Bestimmung von Interferon γ............................................................. 49

3.2.17 Bestimmung von Interferon γ im Lymphozytenzellkulturüberstand mit

Hilfe eines ELISA .............................................................................. 49

3.2.18 Anfertigung histologischer Präparate ................................................. 50

3.2.19 Histologische Auswertung der Präparate ........................................... 51

Inhaltsverzeichnis

III

3.2.20 Statistische Auswertung .................................................................... 52

4 Ergebnisse ........................................................................................................53

4.1 Anzucht von MNV in der Zellkultur ............................................................... 53

4.2 Virus-Nachweis mittels PCR ........................................................................ 53

4.3 Sequenzierung des Virus ............................................................................. 56

4.4 Virusquantifizierung ..................................................................................... 58

4.5 Indirekte Antikörpernachweisverfahren ........................................................ 58

4.5.1 IFA ..................................................................................................... 58

4.5.2 Antigenaufreinigung und ELISA ......................................................... 60

4.6 Elektronenmikroskopische Aufnahmen ........................................................ 66

4.7 Serologische Untersuchung von Anzeigertieren des zentralen

Tierlaboratoriums auf MNV .......................................................................... 68

4.8 Infekionsversuche ........................................................................................ 68

4.8.1 Klinik .................................................................................................. 70

4.8.2 Sektion ............................................................................................... 70

4.8.3 Serologie ........................................................................................... 70

4.8.4 Lymphozytenstimulation .................................................................... 71

4.8.5 PCR-Nachweis von MNV ................................................................... 78

4.8.6 PCR-Nachweis von Helicobacter hepaticus ...................................... 79

4.8.7 Histologie ........................................................................................... 79

5 Diskussion ........................................................................................................84

5.1 Zellkultur und Quantifizierung ...................................................................... 84

5.2 Sequenzierung ............................................................................................. 84

5.3 Nachweisverfahren ...................................................................................... 85

5.4 Prävalenz ..................................................................................................... 89

5.5 MNV im Tierversuch .................................................................................... 90

Inhaltsverzeichnis

IV

5.6 Ausblick ....................................................................................................... 91

6 Zusammenfassung ...........................................................................................93

7 Summary ...........................................................................................................95

8 Anhang ..............................................................................................................97

9 Literaturverzeichnis .......................................................................................115

Abbildungsverzeichnis .........................................................................................126

Tabellenverzeichnis ..............................................................................................129

Erklärung ................................................................................................................131

Danksagung ...........................................................................................................132

Abkürzungsverzeichnis

V


% Prozent

BHI Brain-Heart-Infusion

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bzw. beziehungsweise

CD Cluster of differentiation

cDNA Complementary DNA

CED Chronisch entzündliche Darmerkrankung

CPE Cytopathischer Effekt

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DNA Desoxyribonucleic Acid

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EL Charles-River-ELISA-Messung

ELISA Enzyme linked immune sorbent assay

FELASA Federation of Laboratory Animal Science Associations

FKS L.E. Fetales Kälberserum low endotoxin

GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor

h Stunde

H. hepaticus Helicobacter hepaticus

H.E. Hämatoxylin-Eosin

HPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase

IFA Immunofluorescence Assay

IFNγ Interferon gamma

IL Interleukin

kb Kilobasenpaare

l Liter

m männlich

MCMV Maus Cytomegalie Virus

MDA Melanoma-differentiation-associated gene

MDR Multiple drug resistance

MEZ Mitteleuropäische Zeit

MFI Multiplex fluorescent immunoassay

MHH Medizinische Hochschule Hannover

min Minute

ml Milliliter

MLK Mesenteriallymphknoten

MNV Murines Norovirus

MNV-h Murines Norovirus/ Hannover1/2007/DEU

MW Mittelwert

NCBI National Center for Biotechnology Information


VI

NEA Nicht essentielle Aminosäuren

ng Nanogramm

NSR Nicht spezifische Reaktion

OD Optical density

ORF Open reading frame

p.i. post infectionem

PBS Phosphate buffered saline

PBSM Phosphate buffered saline ohne Mg2+- und Ca2+-Ionen

PCR Polymerase Chain Reaction

pg Picogramm

RAG Recombination-activating gene

RNA Ribonucleic Acid

RT Raumtemperatur

scid Severe combined immunodeficiency

SD Standardabweichung

SEM Standard Error of the Mean

STAT Signal transducer and activator of transcription

TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer

TCID Tissue culture infectious dose

TEM Transmissionselektronenmikroskopie

Th T-Helfer

TJL The Jackson Laboratory

TLR Toll-like receptor

TNF Tumornekrosefaktor

TRIS Trishydroxymethylaminomethan

U Umdrehung

v.a. vor allem

VK Variationskoeffizient

vs. versus

w weiblich

ZTL Zentrales Tierlaboratorium

Einleitung

1

1 Einleitung

Noroviren sind unbehüllte, sehr umweltresistente RNA-Viren und gehören zur Familie

der Caliciviridae, in der sie ein eigenständiges Genus bilden. Sie wurden erstmals

1968 bei einem Ausbruch akuter Gastroenteritis an einer Schule in Norwalk/Ohio in

den USA entdeckt (DOLIN et al. 1972) und werden für ca. 90% aller nicht-bakteriell

bedingten epidemischen Gastroenteritiden beim Menschen verantwortlich gemacht.

Zu den animalen Noroviren gehören bovine, porzine und murine Noroviren. Bisher

wurde keine Übertragung dieser Viren vom Tier auf den Menschen oder umgekehrt

nachgewiesen.

Der erste Nachweis eines Norovirus bei der Maus wurde 2003 beschrieben (KARST

et al. 2003). Infektionsexperimente mit diesem Virus, dem murinen Norovirus 1

(MNV-1), zeigen, dass Infektionsdauer und Krankheitsmanifestation vom

Mausstamm beeinflusst werden (KARST et al. 2003; HSU et al. 2005; MUMPHREY

et al. 2007). Seit der Erstbeschreibung von MNV-1 wurden viele weitere MNV-

Stämme mit unterschiedlichen biologischen Eigenschaften isoliert (HSU et al. 2006;

THACKRAY et al. 2007). Untersuchungen in Nordamerika (HSU et al. 2005;

PRITCHETT-CORNING et al. 2009) und Westeuropa (MÜLLER et al. 2007;

MÄHLER u. KÖHL 2009) dokumentieren eine hohe Prävalenz von MNV-Infektionen

bei Labormäusen. In der bis dato größten Studie (PRITCHETT-CORNING et al.

2009) wiesen 32,4% von 44.876 getesteten Serumproben MNV-spezifische

Antikörper auf.

Die Bedeutung von murinen Noroviren als mögliche Einflussgröße für

Tierexperimente ist gegenwärtig unklar und Untersuchungsziel verschiedener

Forschergruppen. Ziel dieser Arbeit war es, ein murines Norovirusisolat zu

charakterisieren, direkte und indirekte Nachweisverfahren für MNV zur Erfassung der

Prävalenz in einer Labortierhaltung zu entwickeln, sowie den Einfluss des murinen

Norovirus auf die Interleukin-10 (IL10) defiziente Maus - ein Tiermodell für chronisch

entzündliche Darmerkrankungen (CED) (KÜHN et al. 1993) - zu untersuchen.

Literaturübersicht

2

2 Literaturübersicht

2.1 Caliciviridae

Die Familie der Caliciviridae besteht aus kleinen (27 bis 40 nm) unbehüllten

ikosaedrischen Viren. Ihr Genom ist eine lineare, positiv polare, einsträngige RNA.

Innerhalb der Familie Caliciviridae gibt es vier Genus: Norovirus, Sapovirus,

Vesivirus und Lagovirus. Die am häufigsten auftretenden humanmedizinschen

Krankheitserreger dieser Familie gehören zu den Noro- und Sapoviren, die eine

akute Gastroenteritis hervorrufen. Diese sind auch bekannt als „Norwalk-like“ Viren;

erstmals wurde ein Krankheitsausbruch 1968 an einer Schule in Norwalk/Ohio in den

USA beschrieben und weitergehend untersucht (DOLIN et al. 1972).

Wichtige veterinärmedizinische Erreger sind das feline Calicivirus (FCV, Vesivirus),

das Atemwegserkrankungen bei der Katze hervorruft, und das Virus der

hämorrhagischen Erkrankung beim Kaninchen, abgekürzt RHDV (rabbit hemorrhagic

disease virus), das zu den Lagoviren gehört (FIELDS et al. 2007).

Noroviren bei Labornagern


et al. 2003). Weitere murine Noroviren mit der Bezeichnung MNV-2, MNV-3 und

MNV-4 wurden 2006 isoliert (HSU et al. 2006) und charakterisiert (HSU et al. 2007).

Im gleichen Jahr wurden auch in Berlin drei neu Stämme isoliert und charakterisiert

(MÜLLER et al. 2007). Thackray et al. vergleichen 2007 die Genome 21 neuer MNV-

Isolate mit 5 bekannten und nehmen eine phylogenetische Einteilung in 15 Stämme

vor (THACKRAY et al. 2007). Auch aktuell werden weitere Isolate publiziert (KIM et

al. 2010). Bisher konnten keine Noroviren bei Ratten oder anderen Nagern

nachgewiesen werden (HENDERSON 2008).

Literaturübersicht

3

2.2 Genetik und Molekularbiologie von MNV

Das murine Norovirus besitzt ein lineares, positiv polares, einsträngiges RNA-

Genom, das ungefähr 7,5 kb lang ist und drei offene Leseraster beinhaltet (ORF1,

ORF2 und ORF3; Abbildung 1) (FIELDS et al. 2007). ORF1 kodiert ein Polyprotein,

das durch eine 3C-ähnliche Protease endolytisch in mindestens sechs nicht-

strukturelle Proteine gespalten wird (BLAKENEY et al. 2003). ORF2 kodiert das

Haupt-Kapsid-Protein (Virales Protein 1). ORF 3 kodiert das virale Protein 2, das

eine Rolle bei der Stabilität vom Kapsid-Protein spielt (HSU et al. 2006). Ein viertes

offenes Leseraster, das sich mit ORF2 überlappt, wird von Thackray beschrieben

(THACKRAY et al. 2007). Die verschiedenen murinen Noroviren weisen eine

genetische Diversität von bis zu 13% auf (THACKRAY et al. 2007). Konservierte

Bereiche werden in der „junction region“ zwischen ORF1 und ORF2 beschrieben

(MÜLLER 2009).

Abbildung 1: Schema des MNV-Genoms; unterhalb der Leseraster sind die

verschiedenen Proteinprodukte mit ihrem Gewicht in Kilodalton aufgeführt; N, N

Terminus; 3A, NTPase 3A-like; P, Vpg Protease; RdRp, RNA dependent RNA

Polymerase; VP1, VP2 Hauptkapsidproteine (HENDERSON 2008).

Literaturübersicht

4

Das murine Norovirus ist unbehüllt, hat eine Größe von 28 - 35 nm und weist die

typische äußere Kelchstruktur der Caliciviridae auf (siehe Abbildung 2 und Abbildung

3) (KARST et al. 2003).

Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme von MNV-1 (markiert durch

schwarze Pfeile) (HSU et al. 2005).

Literaturübersicht

5

Abbildung 3: Dreidimensionale Rekonstruktion anhand cryoelektronen-

mikroskopischer Aufnahmen von humanem Norovirus (NV, virus-like particles),

murinem Norovirus (MNV) und dem Virus der hämorrhagischen Erkrankung beim

Kaninchen (RHDV, virus-like particles) im Vergleich (KATPALLY et al. 2010).

2.3 MNV in der Zellkultur

Als erstes Virus des Genus Norovirus ist eine Anzucht von MNV in der Zellkultur

möglich. Das murine Norovirus zeigt dabei einen Tropismus zu Makrophagen und

dendritischen Zellen (WOBUS et al. 2004). Die Anzucht erfolgt in der

Mausmakrophagen-Zelllinie RAW 264.7 (RASCHKE et al. 1978; WOBUS et al.

2004). Das Virus verursacht einen deutlichen cytopathischen Effekt (CPE). Eine

Literaturübersicht

6

Virusquantifizierung erfolgt daher mittels Plaque-Test (WOBUS et al. 2004). Nicht

alle isolierten MNV-Stämme weisen jedoch auszählbare Resultate im Plaque-Test

auf. In diesen Fällen wird ein „tissue culture infectious dose“ (TCID)50-Test

angewandt (MÜLLER et al. 2007; THACKRAY et al. 2007).

Durch Passagieren in der Zellkultur kann es zu einer Attenuierung von MNV kommen

(WOBUS et al. 2004). In einem Fall ließ sich diese Attenuierung auf eine

Aminosäurenveränderung auf Position 296 des Viruskapsid-Proteins zurückführen.

Wird die Veränderung rückgängig gemacht, erreicht der Erreger seine alte Virulenz

im Infektionsversuch mit signal transducer and activator of transcription (STAT) 1-

defizienten Mäusen (KARST et al. 2003; BAILEY et al. 2008). Die erfolgreiche

Anzucht ermöglicht biochemische und molekulare Untersuchungen zum Zelleintritt

und zur Replikation des murinen Norovirus. So untersuchten Perry et al. den

Mechanismus des Zelleintritts von MNV1-Virionen, der im Gegensatz zu felinen

Caliciviren keinen niedrigen pH-Wert im Endosom erfordert (PERRY et al. 2009;

PERRY u. WOBUS 2010). Ein niedriger pH-Wert löst bei felinen Caliciviren die

Freisetzung des Virusgenoms in der Zelle aus (STUART u. BROWN 2006).

Gerondopoulos et al. untersuchten weitere Abhängigkeiten der Virusendozytose bei

MNV-1 (GERONDOPOULOS et al. 2010). Elektronenmikroskopische Aufnahmen der

Virusreplikation zeigen starke Veränderungen der Zellmorphologie. Unter Verlust

eines intakten Golgi-Apparates werden intrazelluläre Membranen extensiv

umgewandelt (WOBUS et al. 2004). Hyde et al. untersuchten die Virus-Replikation

und spätere Proteinlokalisation in der Wirtszelle bei MNV-1 (HYDE et al. 2009; HYDE

u. MACKENZIE 2010). Han et al. analysierten die in vitro RNA-Synthese-Aktivität der

„RNA dependent RNA Polymerase“ (HAN et al. 2010). Die virusbedingte

Zellapoptose mit MNV infizierter Makrophagen erfolgt durch eine Aktivierung von

Kaspase-9 und Kaspase-3. Außerdem wird die Expression von Survivin

herunterreguliert (BOK et al. 2009).

Literaturübersicht

7

2.4 Nachweisverfahren für MNV

MNV kann in der Zellkultur vermehrt und anschließend mittels Ultrazentrifugation per

Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradient aufgereinigt werden. Es ergibt sich eine Bande auf

der Höhe anderer Noroviren (Dichte 1,36 ± 0,04 g/cm³) (KARST et al. 2003). Aus der

entnommenen Bande angefertigte elektronenmikroskopische Präparate zeigen

Partikel mit der für Caliciviren typischen Struktur (KARST et al. 2003).

Das MNV-Genom kann mittels PCR nachgewiesen werden. Hierzu muss die Virus-

RNA zuerst zu cDNA umgeschrieben werden. Dann erfolgt im zweiten Schritt eine

Vervielfältigung der cDNA. Da Noroviren eine hohe Mutationsrate haben, ist ein

Nachweis aller murinen Noroviren mit einem Primerpaar bisher nicht beschrieben.

Bisher werden mehrere Primerpaare für einen diagnostischen Nachweis

herangezogen (HENDERSON 2008). Ein Nachweis ist beschrieben aus Milz, Leber,

Mesenteriallymphknoten, Duodenum, Jejunum, Zäkum und Kotproben (HSU et al.

2005; MANUEL et al. 2008; GOTO et al. 2009). Dabei gelten Kot sowie Organe des

Magen-Darm-Traktes, vor allem Zäkum und Mesenteriallymphknoten, als

zuverlässige Nachweisorte für MNV (GOTO et al. 2009). Auch das „Poolen“ von

mehreren MNV-negativen und einer MNV-positiven Kotprobe sowie das

anschließende Lagern bei Raumtemperatur für 14 Tage führten zu einem positiven

PCR-Ergebnis (MANUEL et al. 2008). Der PCR-Nachweis wird erschwert durch die

variable Ausscheidungsdauer von MNV je nach Virusstamm und infiziertem

Mausstamm (HSU et al. 2006).

Von der Maus gegen MNV gebildete Antikörper können mit serologischen Tests

nachgewiesen werden. Hsu et al. stellten eine Kreuzreaktivität bei Antikörpern gegen

MNV-1, MNV-2, MNV-3 und MNV-4 fest (HSU et al. 2006). Die Antikörper richten

sich dabei gegen das Viruskapsid (CHACHU et al. 2008). Die Kreuzreaktivität

ermöglicht die Anwendung serologischer Testverfahren wie multiplex fluorescent

immunoassay (MFI), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) und

immunofluorescence assay (IFA) (HSU et al. 2005). Murine Noroviren sind

Literaturübersicht

8

Bestandteil einer einzigen Genogruppe und weisen einen Serotyp auf (THACKRAY

et al. 2007).

2.5 MNV-Prävalenz in Versuchstierhaltungen

Die Prävalenz von MNV in Labortierhaltungen in den USA und Kanada wurde 2005

anhand von 12639 Serumproben untersucht. Hierbei ergab sich eine Prävalenzrate

von 22,1% (HSU et al. 2005). Eine von Januar 2007 bis Juni 2008 durchgeführte

Erhebung bei Mäuseseren aus westeuropäischen Labortierhaltungen ergab für MNV

eine Prävalenzrate von 31,8% (MÄHLER u. KÖHL 2009). Die bisher größte Studie

ergab eine Prävalenzrate von 32,4% bei 44876 auf MNV getesteten Mäuseseren, die

aus Versuchstierhaltungen in Nordamerika und Europa stammten (PRITCHETT-

CORNING et al. 2009). Eine koreanische Studie zeigte eine 36,5 prozentige

serologische Prävalenz für MNV bei gentechnisch veränderten Mäusen (YEOM et al.

2009). Goto et al. untersuchten Maus-Zäkum-Proben von verschiedenen

Labortierhaltungen per PCR auf ein Vorhandensein von MNV und ermittelten dabei

eine Prävalenzrate von 13,1% (GOTO et al. 2009).

2.6 Erfassung und Bekämpfung von MNV in der Labortierhaltung

Der Einsatz von Anzeiger-Mäusen zur MNV-Erfassung im Experiment wird in zwei

Studien erläutert. Bei Manuel et al. waren 80% der Anzeiger-Mäuse positiv für MNV

im PCR-Nachweis, nachdem sie Kontakt zur Einstreu von mit MNV infizierten

Mäusen hatten (MANUEL et al. 2008). Eine gegensätzliche Beobachtung schildern

Compton et al. Hier kam es keineswegs immer zu einer MNV-Infektion nach Haltung

von Anzeiger-Mäusen auf der Einstreu von MNV-infizierten Mäusen (COMPTON et

al. 2010).

Die Sanierung eines Haltungsbereichs, in dem Mäuse mit MNV infiziert waren,

gelang nur durch Keulen aller Tiere und anschließende Raumdesinfektion vor der

Neubesiedlung. Eine Testung und Entfernung positiver Tiere allein war nicht

erfolgreich (KASTENMAYER et al. 2008; GOTO et al. 2009). Eine Infektion

neugeborener Mäuse von MNV-positiven Muttertieren konnte durch Transfer der

Literaturübersicht

9

Säuglinge auf MNV-freie Ammen („cross fostering“) in den ersten 24 Stunden nach

der Geburt verhindert werden (ARTWOHL et al. 2008; COMPTON 2008). Eine

andere Studie hatte weniger Erfolg bei der Sanierung von gentechnisch

manipulierten Mäusen durch „cross fostering“ (YEOM et al. 2009). Embryotransfer

und Hysterektomie wurden ebenfalls als erfolgreiche Eradikationsmethoden

beschrieben (PERDUE et al. 2007; GOTO et al. 2009).

2.7 Infektionsverlauf

Die Infektion mit MNV unterscheidet sich in Dauer und klinischer Symptomatik je

nach infiziertem Mausstamm als auch dem für die Infektion verantwortlichen

Norovirusstamm (WOBUS et al. 2004; MUMPHREY et al. 2007; THACKRAY et al.

2007; KELMENSON et al. 2009). Je nach Virusstamm und infiziertem Mäusestamm

kann es zu einer persistenten Infektion oder verlängerten Ausscheidung über den

Kot kommen (HSU et al. 2006). Bei immunkompetenten 129S6 Mäusen wurde eine

Infektionsdauer mit MNV-1 von 7-14 Tagen festgestellt. Bei immunkompetenten

Hsd:ICR Mäusen dauerte die Infektion 5 Wochen und länger. Die Infektion ging nicht

mit klinischen Symptomen einher (KARST et al. 2003; HSU et al. 2005). Bei

bestimmten immundefizienten Mausstämmen [Interferon (INF)-αβγ Rezeptor-

Defizienz und STAT1-Defizienz] konnte die Infektion jedoch zu tödlichen

systemischen Erkrankungen wie Enzephalitis, Vaskulitis, Meningitis, Hepatitis und

Pneumonie führen. Bei anderen immundefizienten Mausstämmen [Recombination-

activating gene (RAG)1- und RAG2-Defzienz] persistierte die Infektion länger als 90

Tage ohne jegliche Krankheitssymptome (KARST et al. 2003).

2.8 Untersuchungen zum Einfluss von MNV auf bestimmte Mausstämme und

Tiermodelle

- Ward et al. erforschten die Pathologie natürlich vorkommender MNV-Infektionen

bei 28 immundefizienten Mäusen verschiedener Genotypen in zwei

verschiedenen Maushaltungen. In der einen Haltung stellten sie bei Tieren mit

verschiedenen kombinierten genetischen Defekten Hepatitis, Peritonitis oder

Pneumonie anhand histologischer Veränderungen fest. Diese kombinierten

Literaturübersicht

10

genetischen Defekte betrafen das RAG1, den IFNγ-Rezeptor, OT-1, OT-2 und

STAT1. RAG2-defiziente Mäuse aus der zweiten Maushaltung waren histologisch

unauffällig. Bei ihnen wurde MNV jedoch per PCR im Mesenteriallymphknoten

nachgewiesen (WARD et al. 2006).

- Wobus et al. stellten eine STAT1-abhängige Interferon-Immunantwort im

Zellkultur- und Infektionsversuch fest (WOBUS et al. 2004). Mumphrey et al.

infizierten im Folgeversuch Wildtyp- und STAT1-defiziente Mäuse. Verwandt

wurden zwei verschiedene MNV-Isolate, eines davon war attenuiert.

Neugeborene Wildtyp-Mäuse zeigten weder Diarrhoe noch Gewichtsverlust. Bei

den STAT1-defizienten Mäusen kam es zu einem Gewichtsverlust. Außerdem

wurden milde histologische Veränderungen in Darm und Milz erfasst. Das Virus

wurde in Milz, Leber, Lunge und Lymphknoten nachgewiesen; in der Milz konnte

MNV dauerhaft bis Versuchsende nachgewiesen werden, was für eine

persistente Infektion spricht (MUMPHREY et al. 2007).

- Chachu et al. beobachteten einen längeren Verlauf einer MNV-Infektion bei B-

Zell-defizienten Mäusen. Außerdem versahen sie RAG1-defiziente Mäuse mit

Splenozyten von B-Zell defizienten Mäusen. Dies führte nicht zu einer

Virusclearance. Die Gabe von polyklonalem Anti-MNV-Serum oder monoklonalen

Antikörpern verringerte den systemischen und luminalen Virusgehalt (CHACHU et

al. 2008).

- Lencioni et al. untersuchten den Einfluss von MNV-4 auf die multiple drug

resistance 1α (MDR1α) defiziente Maus, ein Tiermodell für CED. Die Infektion mit

MNV-4 und anschließender Verabreichung von Helicobacter (H.) bilis 7 Tage

danach führte hierbei zu größerem Gewichtsverlust und höhergradigen

histologischen Veränderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe, die nur mit H. bilis

infiziert wurde. Eine alleinige MNV-4-Infektion führte zu erhöhten Serum-

Biomarkern. Mittels Durchflusszytometrie wurden außerdem Veränderungen bei

dendritischen Zellen (CD11c+) und anderen nicht T-Zell (CD4- CD8-)

Literaturübersicht

11

Populationen ermittelt. Dendritische Zellen, gewonnen aus MNV-4-infizierten

Mäusen, sorgten für eine höhere IFNγ-Sekretion bei polyklonalen T-Zellen im in

vitro-Versuch an Tag 2 p.i. Zu späteren Messzeitpunkten wurde keine höhere

IFNγ-Sekretion gemessen. Die akute Infektion mit MNV-4 förderte die Antigen-

Präsentation dendritischer Zellen und wirkte sich immunmodulatorisch auf den

Krankheitsverlauf aus. Es wurden keine klinische Symptome bei Mäusen

beobachtet, die nur mit MNV-4 infiziert waren (LENCIONI et al. 2008).

- McCartney et al. untersuchten den Einfluss von MNV auf melanoma-

differentiation-associated gene (MDA)5- und toll-like receptor (TLR)3-defiziente

Mäuse sowie dendritische Zellen mit dem jeweiligen Defekt. Sowohl bei MDA5-

defizienten Mäusen als auch bei MDA5-defizienten dendritischen Zellen wurde

ein höherer Virustiter im Vergleich zum Wildtyp durch einen Plaquetest ermittelt.

TLR3-defiziente dendritische Zellen hatten keinen höheren Virustiter im in vitro-

Versuch, TLR3-defiziente Mäuse wiesen jedoch einen leicht erhöhten Virustiter

auf. MDA5-defiziente Mäuse eliminierten die MNV-Infektion vollständig

(MCCARTNEY et al. 2008).

- Doom et al. zeigten, dass MNV kaum Einfluss auf die experimentelle Infektion mit

dem Cytomegalievirus der Maus (MCMV) hat. Lediglich die CD8 T-Zell-Antwort

wurde in der akuten Phase der Infektion geringgradig herabgesetzt. Eine MNV-

Infektion führte nicht zu einem Wiederaufblühen einer latenten MCMV-Infektion

(DOOM et al. 2009).

- Hensley et al. stellten keinen Einfluss von MNV auf die adaptive Immunität gegen

das Vaccinia oder Influenza A Virus bei C57BL/6 Wildtyp Mäusen fest (HENSLEY

et al. 2009).

- Compton et al. erforschten den Einfluss von MNV auf die Ausscheidung von

Maus Parvovirus (MPV). Eine MNV-Infektion verlängerte die Ausscheidungsdauer

von MPV über den Kot und erhöhte den MPV-DNA-Spiegel in Organen von

Literaturübersicht

12

BALB/c-Mäusen. Die Serokonversion für MPV erfolgte bei einer Doppelinfektion

von BALB/c-Mäusen innerhalb kürzerer Zeit. Außerdem konnte bei Anzeiger-

Mäusen, die Kontakt mit der Einstreu MNV-infizierter Tiere hatten, nicht in jedem

Fall eine Serokonversion für MNV festgestellt werden (COMPTON et al. 2010).

- Paik et al. stellten keinen Einfluss von MNV auf ernährungsbedingte Fettleibigkeit

und Insulinresistenz bei C57BL/6 Wildtyp Mäusen fest. Bei diesen Mäusen war

vor der Infektion durch eine extrem fettreiche Diät eine Insulinresistenz

herbeigeführt worden (PAIK et al. 2010).

2.9 Weitere Forschung mit murinen Noroviren

Da das murine Norovirus in der Zellkultur anzüchtbar ist, wird es als Ersatz für das

humane Norovirus im Rahmen der Effektivitätsuntersuchung von Desinfektions-

techniken und -mitteln verwendet (BAERT et al. 2008; PARK et al. 2010). Auch für

die Erfassung sowie Reduktion des Eintrags von Noroviren in die Lebensmittelkette

über Muscheln, Fisch, Salat und Gemüse wird MNV als Surrogatmarker eingesetzt

(WEI et al. 2010, 2011).

2.10 Tiermodelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED)

CED sind charakterisiert durch rezidivierende oder kontinuierliche Entzündungen des

Intestinaltraktes (BAUMGART u. CARDING 2007; BAUMGART u. SANDBORN

2007). Zu den häufigsten CED beim Menschen gehören Morbus Crohn und Colitis

ulcerosa (FARROKHYAR et al. 2001). Morbus Crohn ist durch eine transmurale

Entzündung verschiedener Segmente des Gastrointestinaltraktes mit

diskontinuierlicher Ausbreitung und episodischer Progression gekennzeichnet.

Hierbei können Strikturen, Abszesse und Fisteln als Komplikation auftreten

(BAUMGART u. SANDBORN 2007). Colitis ulcerosa weist eine Entzündung der

Mukosa und oberflächlichen Submukosa des Kolons auf, die schubweise

voranschreitet und sich kontinuierlich nach oral ausbreitet. Typische Symptome für

beide Erkrankungen sind blutige bis wässrige Durchfälle, Bauchschmerzen, Übelkeit,

Erbrechen und Fieber (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Die Äthiopathogenese

Literaturübersicht

13

der CED ist bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. Es gibt deutliche Hinweise, dass

durch eine Kombination von immunologischen und umweltbedingten Faktoren eine

unkontrollierte Immunantwort innerhalb des Darms ausgelöst wird, die in einem

genetisch prädisponierten Individuum zu einer chronischen Entzündung führt

(TORRES u. RIOS 2008).

Tiermodelle, zum Beispiel für CED, ermöglichen es, störende Umwelteinflüsse durch

standardisierte Haltungsbedingungen zu kontrollieren. Durch den Einsatz von

Inzuchtstämmen können Studien an genetisch homogenen Populationen

durchgeführt werden. Techniken der Transgenese und der gerichteten Mutagenese

stehen zur Verfügung, um das Genom der Tiere gentechnisch zu verändern. Seit

Anfang der 90er Jahre werden zahlreiche Tiermodelle, v.a. Mausmodelle, für CED

beschrieben, die klinische und histopathologische Analogien zum Morbus Crohn oder

zur Colitis ulcerosa aufweisen.

Einige Tiermodelle für CED

- spontan:

SAMP1/Yit-Maus (MATSUMOTO et al. 1998)

- durch Chemikalien induziert:

Dextran Natriumsulfat (OKAYASU et al. 1990)

Trinitrobenzolsulfonsäure (ELSON et al. 1996)

Oxazolon (BOIRIVANT et al. 1998)

- durch Zelltransfer:

CD4+/CD45RBhigh-Zellen in Prkdcscid-Mäuse (POWRIE et al. 1993)

Knochenmarkszellen in CD3ε transgene Mäuse (HOLLANDER et al. 1995)

- durch genetische Manipulation:

IL2-defiziente Maus (SADLACK et al. 1993)

IL10-defiziente Maus (KÜHN et al. 1993)

MDR1α-defiziente Maus (PANWALA et al. 1998)

Literaturübersicht

14

SMAD3-defiziente Maus (YANG et al. 1999)

Verschiedene Tiermodelle für CED werden durch Umweltfaktoren beeinflusst.

Besonders die Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora sowie spezifische

Keime haben starken Einfluss (siehe Tabelle 1). Der genetische Hintergrundstamm

der Merkmalsträger kann sich ebenfalls auf den Verlauf der CED auswirken (siehe

Tabelle 2).

Tabelle 1: Interaktion verschiedener Umweltfaktoren auf das CED-Modell der IL10-

defizienten Maus

Umweltfaktor Auswirkung Referenz

Haltung unter keimfreien Bedingungen

Keine Kolitis (SELLON et al. 1998)

Haltung unter keimarmen Bedingungen bzw. nach Antibiotikagabe

Reduktion der Kolitissymptome

(KÜHN et al. 1993; MADSEN et al. 2000)

Keim Lactobacillus spp.

Protektiv (MADSEN et al. 1999; SCHULTZ u. SARTOR 2000)

Keim Enterococcus faecalis

Proinflammatorisch (BALISH u. WARNER 2002)

Keim Helicobacter spp.

Proinflammatorisch (CAHILL et al. 1997; KULLBERG et al. 1998; BURICH et al. 2001)

Tabelle 2: Ausprägung der Kolitis bei IL10-defizienten Inzuchtstämmen

Hintergrundstamm Schwere und Verlauf der Kolitis

Referenz

C57BL/6J Mild, protrahiert (BERG et al. 1996; TAKEDA et al. 1999; BRISTOL et al. 2000)

BALB/c Intermediär, progressiv (BERG et al. 1996)

NOD/Lt Intermediär, progressiv (MÄHLER u. LEITER 2002)

NOD.NON-H2nb1 Intermediär, progressiv (MÄHLER u. LEITER 2002)

129/SvEv Schwer, progressiv (TAKEDA et al. 1999)

C3H/HeJBir Schwer, beginnt sehr früh (BRISTOL et al. 2000)

C3H.SW Schwer, beginnt sehr früh (MÄHLER u. LEITER 2002)

Literaturübersicht

15

2.11 Die Interleukin-10 defiziente Maus

Die IL10-defiziente Maus (formal: Il10tm1Cgn; abgekürzt Il10-/-) wurde 1993 am Institut

für Genetik der Universität Köln durch gezielte Mutation entwickelt (KÜHN et al.

1993). Ein Teil des ersten Exons des IL10-Gens (Codon 5-55) wurde mit Hilfe

homologer Rekombination durch ein Stopcodon und ein neo-Gen (Neomycin

exprimierend) ersetzt. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Exon 3 des Gens

eingefügt. Mäuse mit dieser Nullmutation entwickeln nach dem Absetzen eine

spontane Form der CED. Der Entzündungsprozess kann sich über den gesamten

Intestinaltrakt erstrecken. Er tritt dabei segmental, teilweise transmural auf.

Histologisch ist diese Enterokolitis durch Entzündungszellinfiltrate in der Lamina

propria und der Submukosa, Erosionen und Ulzerationen der Mukosa,

Schleimhauthyperplasie, eine abnorme Kryptarchitektur, Becherzelldepletionen

sowie Kryptabszesse gekennzeichnet (KÜHN et al. 1993; LÖHLER et al. 1995;

BERG et al. 1996). Im Spätstadium der Erkrankung können kolorektale Tumoren

auftreten (BERG et al. 1996). Da bei IL10-defizienten Mäusen außer dem

Intestinaltrakt keine weiteren Organsysteme entzündlich verändert sind, eignet sich

dieses Tiermodell besonders für Studien bezüglich der CED. Daher wurde es auch

an der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) bereits häufig untersucht und für

CED-Studien eingesetzt (MOST 2001; BLEICH 2003; BÜCHLER 2010).

IL10 ist ein regulatorisches Zytokin, welches von zahlreichen Immunzellen, wie

Makrophagen, dendritischen Zellen und T-Zellen produziert wird. Innerhalb der T-

Zellen sezernieren fast alle Untergruppen IL10, inklusive Th1-, Th2- und

regulatorischen T-Zellen (MURRAY 2006). Neben Immunzellen sind auch

Epithelzellen und Keratinozyten in der Lage, IL10 freizusetzen. IL10 unterdrückt die

Effektorfunktion von Th1/Th17-Zellen, Natürlichen Killerzellen und Makrophagen. Es

moduliert die zelluläre Immunreaktion (MOORE et al. 1993). Diese modulierenden

Effekte bleiben bei IL10-defizienten Mäusen aus. Ihr Immunsystem reagiert

gegenüber luminalen Antigenen bzw. der intestinalen Bakterienflora mit einer

überschießenden Immunantwort (siehe Abbildung 4) (BERG et al. 1996). Eine

Analyse von konditionalen Knockout-Mäusen, bei denen IL10 nur in T-Zellen

Literaturübersicht

16

inaktiviert wurde, zeigte eine vergleichbare Kolitis wie bei IL10-defizienten Mäusen

(ROERS et al. 2004). Das von T-Zellen produzierte IL10 ist also essentiell für die

Verhinderung einer spontanen CED in diesem Tiermodell. Vermutlich nehmen die

IL23-Th17-Achse und die von Th17-Zellen produzierten Zytokine wie IL17, IL21,

IL22, Tumornekrosefaktor (TNF), granulocyte macrophage colony-stimulating factor

(GM-CSF) und IL6 eine wichtige Funktion bei der Entzündungsreaktion ein (YEN et

al. 2006).

Abbildung 4: Pathogenese der CED bei IL10-defizienten Mäusen, modifiziert nach

Powrie (POWRIE 1995) und Elson (ELSON 1999).

Literaturübersicht

17

2.12 Ziele dieser Arbeit

Ziel dieser Arbeit war es, das bereits isolierte murine Norovirus zu charakterisieren.

Das Virus sollte mit gebräuchlichen Methoden quantifiziert werden. Zusätzlich sollte

eine serologische Diagnostik in Form eines ELISA aufgebaut werden. Mit Hilfe

serologischer Testverfahren sollte die Prävalenz für MNV in einer Labortierhaltung -

dem Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover

(MHH) – ermittelt werden.

Nach der Charakterisierung sollten dann Infektionsversuche durchgeführt werden,

die den Einfluss von MNV auf die IL10-defiziente Maus - ein Tiermodell für CED

(KÜHN et al. 1993) - erfassen.

Eigene Untersuchungen

18

3 Eigene Untersuchungen

3.1 Material

Die Durchführung der Versuche wurde mit den Bescheiden vom 13.03.2008 und

10.04.2008 durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und

Lebensmittelsicherheit mit den Aktenzeichen 08/1443 und 08/1467 genehmigt.

3.1.1 Mäuse

In der Zeit vom 2.4.2008 bis 6.5.2009 wurden die in Tabelle 3 aufgeführten

Mäuseinzucht- und Defektmutantenstämme für den Infektionsversuch mit dem

murinen Norovirus Stamm Hannover eingesetzt. Im Weiteren werden für eine

übersichtlichere Gestaltung nur noch die entsprechenden Abkürzungen für die

Mausstämme benutzt.

Tabelle 3: Verwendete Mausstämme und ihre Abkürzung

Stammbezeichnung Knockout/ Wildtyp

Abkürzung

C3H/HeJBirZtm Wildtyp C3-wt

C57BL/6JZtm Wildtyp B6-wt

C3Bir.129P2-Il10tm1Cgn/JZtm Knockout C3-Il10-/-

B6.129P2-Il10tm1Cgn/JZtm Knockout B6-Il10-/-

3.1.2 Herkunft

Alle im Experiment eingesetzten Mäuse stammten aus Zuchten des ZTL der MHH.

Sie wurden dort regelmäßigen, mikrobiologischen Kontrolluntersuchungen

entsprechend den Empfehlungen der Federation of European Laboratory Animal

Science Associations (FELASA) unterzogen (NICKLAS et al. 2002). Die

Versuchstiere entstammten aus Haltungsbereichen, die frei von bakteriellen, viralen

(inklusive MNV) und parasitären Infektionserregern gemäß der Empfehlungsliste der

FELASA waren.


19

3.1.3 Haltung im Experiment

Die experimentell infizierten Mäuse wurden im S2-Bereich des ZTL der MHH in

einem belüfteten Käfigregalschrank (Scantainer) gehalten. Es wurden jeweils 1-5

Mäuse in Makrolon-Käfigen des Typs II oder III mit Filterdeckeln

getrenntgeschlechtlich gehalten. Die Kontrolltiere wurden bis auf 5 Tiere in der

Haltungsabteilung belassen, um eine mögliche Kontamination mit MNV zu

vermeiden. Die 5 Kontrolltiere, die gesondert mit im Käfigregalschrank saßen,

wurden daher zuerst umgesetzt und versorgt. Futter (Tabelle 4) und autoklaviertes

Trinkwasser (über Tränkeflaschen) wurden ad libitum angeboten. Die Einstreu wurde

ein- bis zweimal in der Woche erneuert. Die Reinigung der Käfige erfolgte

routinemäßig. Die Raumtemperatur betrug 22 ± 2° C, die relative Luftfeuchte lag bei

55 ± 5%. Der Hell-Dunkel-Zyklus wurde automatisch geregelt; es herrschte ein

Lichtrhythmus von 14 Stunden Helligkeit zu 10 Stunden Dunkelheit, wobei die

Hellphase von 7 bis 21 Uhr mitteleuropäischer Zeit (MEZ) dauerte.

Tabelle 4: Zusammensetzung von Altromin 1324 TPF

Inhaltsstoffe Prozent %

Rohprotein 19,0

Rohfett 4,0

Rohfaser 6,0

Rohasche 7,0

Kalzium 0,9

Phosphor 0,7

Zusatzstoffe je Kilogramm

Vitamin A 15000 I.E.

Vitamin D3 600 I.E.

Vitamin E 75 mg

Vitamin C 36 mg

Kupfer 5 mg


20

Verwendete Lösungen

Alle verwendeten Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, über die

Firma Carl Roth in Karlsruhe bezogen.

Phosphate buffered saline (PBS) (pH = 7,2)

Menge

NaCl (Natriumchlorid) 8,00 g

KCl (Kaliumchlorid) 0,20 g

Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) 1,15 g

KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) 0,20 g

Aqua bidest. 1,0 l

CaCl2 (Calciumchlorid) 0,10 g

MgCl2 x 6 H2O (Magnesiumchlorid – Hexahydrat)

0,10 g

PBS Tween (pH = 7,4)

Menge





Aqua bidest. 1,0 l

Tween 20 0,5 ml

PBSM (pH = 7,2)

Menge





Aqua bidest. 800 ml

Evan´s Blue

Menge

Evans blue 5 mg

Glycerin 200 ml

Aqua bidest. 800 ml


21

Coating Buffer (ph = 9,6)

Menge

Na2CO3 (Natriumcarbonat, wasserfrei) 1,59 g

NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat) 2,93 g

Aqua bidest. 1,0 l

Konjugate

Hersteller/ Artikelnummer

Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule)-FITC Sigma / Art. F 0257

Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Peroxidase Sigma / Art. A 4416

10x TBE-Puffer

Menge

TRIS 108 g

Borsäure 53,4 g

EDTA 7,4 g

Aqua bidest. ad 1 l

1x TBE-Puffer

Menge

10x TBE-Puffer 100 ml

Aqua bidest. 900 ml

Orange G-Ladepuffer

Menge

Orange G (Sigma) 0,05 g

Glycerin 99% 30 ml

Aqua bidest. 70 ml

RAW-Medium

Pro Flasche Menge

Dulbecco´s Modified Eagle´s medium (DMEM) 22 ml

Fetales Kälberserum (FKS) Ultra Low Endotoxin (L.E.) 2,5 ml

Penicillin-Streptomycin 0,5 ml


22

Anti-mCD3

Menge

PBS 10 ml

Anti-mCD3 (145-2C11) 1 µg/µl 50 µl

Lymphozyten-Medium

Menge

RPMI 1640 500 ml

FKS Ultra Low Endotoxin 25 ml

NEA (nicht essentielle Aminosäuren) 5 ml

L-Glutamin 5 ml

2-Mercaptoethanol 0,5 ml

Pyruvat 5 ml

Penicillin-Streptomycin 5 ml

Neutrales Formalin nach Sörensen (10%ig)

Puffer A Menge

Kaliumhydrogenphosphat 13,6 g

Aqua bidest. 1 l

Puffer B

Kaliumhydrogenphosphat 17,7 g

Aqua bidest. 1 l

Puffer A 352,8 ml

Puffer B 547,2 ml

35 – 37% Formalin 100 ml

3.1.4 Synthetische Oligonukleotide

Für die Umschreibung der MNV-RNA in cDNA wurden Oligo(dT)18 und Random

Hexamer Primer der Firma Fermentas vergleichend eingesetzt.

Die zur Detektion und Sequenzierung verwendeten Primer wurden von der Firma

Sigma Aldrich bezogen.

Tabelle 5: Primer zur Detektion von MNV

Sequenz von 5´ nach 3´

5205f AATTGACCCCTGGATCTTCC

5388r GACCAGCTGAACCTCCATGT

5469r AGTGGTGAGTGACCCTTTGG


23

Fortsetzung Tabelle 5

5473f CAGATCACATGCTTCCCAC

5659r AGACCACAAAAGACTCATCAC

5580f GGAGGAATCTATGCGCCTGG

5671r GAAGGCGGCCAGAGACCAC

4972f CACGCCACCGATCTGTTCTG

5580r GCGCTGCGCCATCACTC

5004f TTTGGAACAATGGATGCTGA

5219r ATCCAGGGGTCAATTTGGTT

5277r GGTGTTTCGAGGTGAAATGG

Tabelle 6: Primer zur Klonierung von MNV


Noro Hannover for 1 GTGAAATGAGGATGGCAACG

Noro Hannover rev 1 GTGATGACATCTGTGGCCAT

Noro Hannover for 2 ATGGCCACAGATGTCATCAC

Noro Hannover rev 2 GGAAGCATGTGATCTGAGCA

Noro Hannover for 3 TGCTCAGATCACATGCTTCC

Noro Hannover rev 3 GCCAACGACCGGGAGGCCAGCTTTTTTTTTTTTTTTV

Tabelle 7: Primer zur Sequenzierung von MNV


Norosense 1 CCGATCAAGAACCTACTGGCA

Noroantisense 1 AATCATCCCAGAGAACCACC

Norosense 2 ACTTCACCAATGCCGTTA

Noroantisense 2 CAAACTGGTCACCGACTATC

Norosense 3 TTCCTTCCAAGATGAGCTCC

Noroantisense 3 CCCTGAGTAAGACACAGCAA

Norosense 1 CCGATCAAGAACCTACTGGCA

Noroantisense 1 AATCATCCCAGAGAACCACC

Tabelle 8: Primer zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA


RPS9f TGACGTTGGCGGATGAGCACA

RPS9r TTTTTGACAGGGGGAGTGG

Hierbei wurde das Housekeeping Gen RPS-9 nachgewiesen.


24

Tabelle 9: Primer zur Detektion von Helicobacter (H.) hepaticus


H276f CTATGACGGGTATCCGGC

H676r ATTCCACCTACCTCTCCCA

B38 GCATTTGAAACTGTTACTCTG

B39 CTGTTTTCAAGCTCCCCGAAG

3.1.5 Zelllinie

Zur Anzucht von MNV wurden RAW 264.7 Zellen verwendet (ATCC TIB-71™). Es

handelt sich hierbei um eine Mausmakrophagenzelllinie, die vom Deutschen

Krebsforschungszentrum (DKFZ) Heidelberg zur Verfügung gestellt wurde. Die

Zelllinie wurde von der Firma QM Diagnostics (Nimwegen, Niederlande) per PCR

negativ auf Mycoplasmen getestet.

3.1.6 Eingesetzter Virusstamm

Der im Experiment eingesetzte Virusstamm wurde aus NOD-Prkdcscid-Mäusen des

ZTL der MHH isoliert und nach genetischer Charakterisierung als Murines

Norovirus/Hannover1/2007/DEU (MNV-h) bezeichnet.

3.1.7 Eingesetzter Bakterienstamm

Der im Experiment eingesetzte Bakterienstamm H. hepaticus wurde im ZTL der MHH

von Mitarbeitern des mikrobiologischen Labors im Rahmen der wissenschaftlichen

Arbeit von Frau Büchler isoliert und angezüchtet (BÜCHLER 2010).

3.1.8 Materialliste

Vorversuche

Zellkultur

Zelllinie RAW 264.7, DKFZ Heidelberg, Deutschland

Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Sicherheitswerkbank MSC 1.8, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Zellkultur-Flaschen 75 cm² Vented Cap, Straight Neck, Sarstedt, Nümbrecht,

Deutschland


25

Zellschaber Cell Scraper, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Medium DMEM High Glucose 4,5 g/l, L-Glutamin, 500 ml, PAA, Parching, Österreich

Antibiotikum Penicillin (5000IU/ml) Streptomycin 5000 µg/ml, MP Biomedicals,

Eschwege, Deutschland

Fetales Kälberserum Ultra Low Endotoxin, PAA, Parching, Österreich

Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Glas-Gewindeflaschen mit flachem Boden und Deckel, Omnilab, Bremen,

Deutschland

Gefrierschrank Premium No-Frost, Liebherr, Biberach an der Riss, Deutschland

-80° C Truhe 6385, GFL, Großburgwedel, Deutschland

Identifizierung, Sequenzierung

Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren Deutschland

Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland

Primer Fermentas, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

PTC Thermocycler-200TM, MJ Research, Watertown, MA, USA

Phusion™ Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase, Finnzymes, Maahantuonti,

Finnland

Stratagene StrataClone PCR Cloning Kit, Agilent, La Jolla, CA, USA

QIAprep Spin Miniprep Kit (50), Qiagen, Hilden, Deutschland

Sequenzierung: MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland

Software zur Analyse der Sequenz:

DNA Dynamo, Blue Tractor Software, North Wales, UK

BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Nachweisverfahren

IFA

Wasserbad 1008, GFL, Großburgwedel, Deutschland

Objektträger Cel-Line Diagnostic Microscope Slides 8 Well 8mm, Thermo Fisher

Scientific, Schwerte, Deutschland

PBS

PBSM


26

Diluter Microlab 500, Hamilton-Robotics, Martinsried, Deutschland

Antikörper Anti Mouse IGG-FITC F0257, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Evans Blue, Fluka, Buchs, Schweiz

Fluoreszenzmikroskop DM2000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland

Lichtquelle EL6000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland

ELISA

Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Ultrazentrifuge L7, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Ultrazentrifugenrotor SW 28, SW 32, SW 55, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld,

Deutschland

Bechereinsätze Centrifuge Tubes Polyallomer 32683; 326819 (SW55), Beckman-

Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland

Sucrose analytical grade, Serva, Heidelberg, Deutschland

Waage LA 2200S, Sartorius, Göttingen

Waage ALJ 120-4, Kern und Sohn, Balingen-Frommern, Deutschland

PBSM

Coating Buffer

Immuno-Modules U8 Maxisorp 475078, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte,

Deutschland

Multikanal-Pipette Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Washer Columbus Pro, Tecan, Männedorf, Schweiz

PBS Tween

Zweitantikörper Anti Mouse IGG Peroxidase, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

ABTS-Substrat Tablets 11 112 422 001, Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland

Photometer Sunrise, Tecan, Männedorf, Schweiz

Laptop Inspiron 6000, Dell Deutschland, Frankfurt, Deutschland

Software Magellan 5.03, Tecan, Männedorf, Schweiz

PCR-Nachweis

Für die RNA-Isolierung: Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren, Deutschland


27

Für die DNA-Isolierung: PSP® Spin Stool DNA Kit, Invitek, Berlin, Deutschland

Photometer Nanodrop 1000, Peqlab, Erlangen, Deutschland

Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland

REDExtract-N-AmpTM PCR ReadyMix, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Taq PCR Core-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland

Primer, Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Primer, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

DNA-Leiter, Biozym Art.-Nr.: 850321 (50321), Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf

PTC Thermocycler-200TM, MJ Research, Watertown, MA, USA

Magnetrührer L81, Kisker Biotech, Steinfurt, Deutschland

Agarose LE Agarose, Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf

DNA-Farbstoff Gelstar Nucleic Acid Gel Stain, Lonza, Basel, Schweiz

10x TBE

Orange G Ladepuffer, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland

Gelschlitten, Gelkammer Eigenkonstruktion der MHH, Hannover, Deutschland

Gleichstromgerät, Omnilab, Bremen, Deutschland

UV-Transilluminator, PC+Kamera, INTAS, Göttingen, Deutschland

Virusquantifizierung

Mikroskop, Zeiss, Jena, Deutschland

Neubauer-Zählkammer 0,1mm Tiefe; 0,0025mm² Fläche, Brand, Wertheim,

Deutschland

Kristallviolett-Indikator, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland

Plaque-Test

Platten Multi Dish 6 Well 140675, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte,

Deutschland

Agarose SeaPlaque, Lonza, Basel, Schweiz

TCID50-Test

96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland


28

Elektronenmikroskopische Darstellung

Tischultrazentrifuge Airfuge® im Institut für Virologie der MHH, Beckman-Coulter

Deutschland, Krefeld, Deutschland

Elektronenmikroskop Elektronenmikroskopie-Labor MHH, Tecnai 20, FEI Europe;

Eindhoven, Niederlande

Hauptversuche

Infektionsversuche

Sicherheitswerkbank Klasse II, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Ventilierter Haltungsschrank, Scantainer, Scanbur Technology, Karlslunde,

Dänemark

Mini-Isolator „Gnotocage“ (Deckel: Eigenkonstruktion der technischen Werkstatt der

MHH; Unterbau: Multifunktionstopf Nalgene DS5300-9212), Hannover, Deutschland

bzw. Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Filterdeckelkäfige Typ II, III, UNO, Roestvaststaal BV, Niederlande

Futter, pelletiertes Altromin© 1324 total pathogen free (TPF) Haltungsfutter, Altromin,

Lage, Deutschland

Autoklaviertes Trinkwasser

Einstreu, Weichholzgranulat, Fichten- und Tannenholz, Hahn & Co, Bredenbeck-

Kronsburg, Deutschland

Spritze, Spritzenkolben, Knopfkanüle/Braunüle zur Gavage, Braun, Melsungen,

Deutschland

Histocassetten, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Eppendorf-Reaktionsgefäße 1,5 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Lymphozytenstimulation

3-Polysterene-Reaktionsgefäße-Gefäße 15 ml, Greiner Bio One, Frickenhausen,

Deutschland

Petrischalen, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Gewebesieb, 40µm BD Falcon M, BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland

Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland


29

Lymphozytenmedium

Zellzählgerät scil Vet ABC, scil animal care company, Viernheim, Deutschland

96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Anti-mCD3 (145-2C11) 1µg/µl

ELISA zur IFNBestimmung (extern: Arbeitsgruppe Detlef Neumann, MHH)

mIFN Antikörper eingesetzt als Fänger (an ELISA-Platte gebunden) und späterer

Detektor, Pierce Antibodies, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

P96 Immuno MaxiSorb Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Beschichtungspuffer: 100 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6

Blockpuffer: PBS mit 4 % BSA

Lymphozytenmedium

Waschpuffer: PBS mit 0,005 % Tween 20

Streptavidin-HRP 0,5 mg/ml

Substrat: 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine (TMB) 1 mg/ml in DMSO

Substratpuffer: 1,36 g Natriumacetat x 3 H2O +

2,1 g Zitronensäuremonohydrat in 100 ml H2O (pH 4,9)

3% H2O2

Isolation und Anzucht von H. hepaticus für den Doppelinfektionsversuch (ZTL)

Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland

Impföse, Omnilab, Bremen, Deutschland

Wattetupfer, Omnilab, Bremen, Deutschland

Polypropylen-Röhrchen, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Brain-Heart-Infusion Medium, Merck, Darmstadt, Deutschland

0,45 µm Weißrandfilter, Schleicher & Schuell, Basel, Schweiz

Petrischale Ø 60 mm, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland

Columbiaagar, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

Amphotericin B, Biochrom, Berlin, Deutschland

Campylobacter-Selektiv-Supplement (nach Skirrow), Oxoid Deutschland, Wesel,

Deutschland


30

Pferdeblut, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

Anaerobiertopf HP0011A, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland

1,5 ml Schraubdeckelgefäß Twist Top Vial und Twist Top Vial Caps, Sorenson

BioScience, Salt Lake City, UT, USA

Stereomikroskop zur histologischen Auswertung

Zur statistischen Auswertung wurden folgende Programme genutzt:

StatView D-4.5, Abacus Corporation

Graphpad Prism 5, Graphpad Software Inc., La Jolla, CA, USA

Excel 2003, 2007, Microsoft, Redmond, WA, USA


31

3.2 Methoden

In den ersten Versuchen mussten grundlegende Erkenntnisse zum Virus gesammelt

werden. Das Virus war bereits isoliert worden, jedoch nicht klassifiziert. Außerdem

mussten direkte und indirekte Nachweismethoden und Virusquantifizierungs-

verfahren für den Infektionsversuch etabliert werden. Im Anschluss erfolgten

Infektionsversuche, die den Einfluss einer MNV-Infektion auf das Tiermodell der

IL10-defizienten Maus erfassen sollten.

3.2.1 Zellkultur

Die RAW 264.7 Zellen wurden in 75 ml Filterdeckel-Zellkulturflaschen mit DMEM, 2%

Penicillin-Streptomycin und 10% low endotoxine fetalem Kälberserum bei 37° C und

5% CO2-Begasung in einem Brutschrank kultiviert. Zum Passagieren wurde der Zell-

rasen mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellen wurden dann in 5 ml vorbereitetem

Medium und anschließend anteilig je nach gewünschter Zelldichte in insgesamt 25

ml Medium pro Zellkulturflasche resuspendiert.

3.2.2 Virusisolation

Die Virusisolation wurde von Mitarbeitern der MHH und der Firma Biodoc (Hannover,

Deutschland) durchgeführt. Aus vorhergehenden wissenschaftlichen Veröffent-

lichungen war bekannt, dass MNV weit verbreitet in versuchstierkundlichen

Einrichtungen ist. Klinische Symptome blieben jedoch abhängig vom infizierten

Mausstamm aus. Mesenteriallymphknoten und Milz waren als Virusreservoir

beschrieben. Eine Virusvermehrung gelang in RAW 264.7 Zellen. Mehrere

genetische Sequenzen von MNV-Isolaten waren bereits beschrieben. Als potentielle

Virusträger wurden NOD-Prkdcscid-Mäuse, die als Anzeigertiere im ZTL verwendet

wurden, eingeschätzt. Von ihnen wurden im Rahmen einer diagnostischen Routine-

Sektion Mesenteriallymphknoten und Milz gewonnen. Diese wurden bei -80° C

eingefroren. Eine kleine Probe der Organe wurde für eine PCR-Untersuchung mit

dem Primerpaar 5004f/5219r verwandt. Die PCR-Untersuchung ergab für Milz und

Mesenteriallymphknoten der Mäuse einen positiven Befund. Daraufhin wurde ein

Viertel der PCR-positiven Milz mit einem Cell-Douncer in DMEM homogenisiert.


32

Nach einer Zentrifugation bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) wurde der Überstand

filtriert. Mit dem aus dem Milz-Isolat gewonnenen Überstand wurde eine zu 75%

besiedelte RAW-Zellkulturflasche beimpft. Nach zwei Tagen trat ein cytopathischer

Effekt >90% auf, der bei einer parallel bebrüteten Kontrollflasche nicht zu

beobachten war. Die beimpfte Zellkulturflasche wurde daraufhin bei -20° C

eingefroren, aufgetaut, erneut eingefroren (-20° C) und dann aufgetaut. Das Medium

inklusive cryolysierter RAW 264.7 Zellen sowie vermeintlicher Viruspartikel wurde bei

6000 U/min für 10 min (2800 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen

und filtriert, das Pellet wurde verworfen. Das Filtrat wurde in 1 ml Portionen

konfektioniert und bei -80° C tiefgefroren.

3.2.3 Virus-Nachweis mittels PCR

3.2.3.1 RNA-Isolation

Da es sich bei Noroviren um RNA-Viren handelt, musste zuerst die Virus-RNA aus

dem Filtrat gewonnen werden. Hierzu wurde das Macherey Nagel Kit NucleoSpin

RNA II mit dem Support-Protokoll zur Isolation von Gesamt-RNA aus

Zellkulturüberstand eingesetzt (siehe Anhang S.97). Bei der RNA-Isolation aus

Organen wurde ebenfalls das vom Hersteller empfohlene Protokoll angewandt (siehe

Anhang S. 97). Zur Isolation von Gesamt-RNA aus Kot wurde erfolgreich ein

modifiziertes Protokoll angewandt, das der Hersteller auf Anfrage übersandte. Es

handelte sich hierbei um die Modifikation eines Kunden, dem es auf diese Art und

Weise gelungen war, RNA aus Kot zu isolieren (siehe Anhang S. 99).

3.2.3.2 Reverse Transkription

Um die isolierte RNA weiter zu analysieren, wurde diese mit Hilfe des Quiagen

Omniscript RT-Kits umgeschrieben. Für den Reaktionsansatz wurde der RNA-Gehalt

der Proben photometrisch bestimmt. Es erfolgte eine Einstellung auf 500 ng RNA pro

10 µl Ansatz.


33

Ansatz pro Probe

RT-Buffer 2 µl

dNTPs 5 µM 2 µl

Oligo(dT)18 20 µM bzw. Random Hexamer 1 µl

RNAse-Inhibitor 1:4 verdünnt 1 µl

Reverse Transkriptase 1 µl

Eingestellte RNA 13 µl

Summe 20 µl

Temperaturprofil für die reverse Transkription

Temperatur Dauer

37° C 60 min

3.2.3.3 PCR

Die gewünschten cDNA-Abschnitte wurden nun entweder mit dem Redextract-Kit

oder dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit vervielfältigt, je nach verwendetem

Primerpaar.

Ansatz pro Probe

Redextract 5 µl

H2O 2,5 µl

Forward-Primer RPS 9 (13,7 µM) 0,25 µl

Reverse-Primer RPS 9 (13,7 µM) 0,25 µl

cDNA 2 µl

Summe 10 µl

Ansatz pro Probe

Q-Solution 2 µl

10x PCR-Buffer 1 µl

dNTPs 2 µM 1 µl

Forward-Primer (13,7 µM) 1,5 µl

Reverse-Primer (13,7 µM) 1,5 µl

Taq-Polymerase 0,05 µl

cDNA 2,95 µl

Summe 10 µl


34

Anhand von bereits publizierten Sequenzen verschiedener MNV-Stämme (MNV 1 -

4) wurden passende Primerpaare in einer genetisch konservierten Region entwickelt,

mit denen möglichst viele Varianten von MNV reagieren; zusätzlich wurden

Primerpaarsequenzen aus Publikationen übernommen.

Tabelle 10: Primmerpaare zum Nachweis von MNV mit Hilfe des Quiagen-Taq PCR

Core-Kit (Primersequenzen siehe S. 22f.)

Name des Primerpaars Länge des Amplikon

5205f/5388r 183 bp

5004f/5219r 215 bp

Nach Sequenzierung getestet:

5004f/5277r 273 bp

5580f/5671r modifiziert (MÜLLER et al. 2007) 91 bp

4972f/5080r (BAERT et al. 2008) 608 bp

5205f/5469r 264 bp

5473/5659r modifiziert (HSU et al. 2006) 186 bp

Die Probenansätze wurden anschließend mit nachfolgendem Temperaturprofil im

Thermocycler zur Reaktion gebracht.

Temperaturprofil für die MNV-PCR

Temperatur Dauer

95° C 4 min

94° C 1 min

55° C 1 min

72° C 2 min

39x Schritt 2-4

72° C 7 min

8° C Bis zur Entnahme

Zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA wurde das Housekeeping-Gen RPS-

9 mit Hilfe des Primerpaares RPS9f/RPS9r nachgewiesen. Hierbei wurde das

Redextract-Kit verwendet.


35

Temperaturprofil für die RPS-9-PCR

Temperatur Dauer

95° C 4 min

94° C 1 min

55° C 1 min

72° C 2 min

24x Schritt 2-4

72° C 7 min


3.2.4 Nachweis von Helicobacter hepaticus mittels PCR

Die Gesamt-DNA wurde aus den im Infektionsversuch gewonnenen Kotproben mit

Hilfe des Invitek PSP® Spin Stool DNA Kit gemäß Herstellerprotokoll isoliert. Für die

Detektion kamen die Primerpaare H276f/H676r und B38/B39 zum Einsatz. Mit dem

Primerpaar H276f/H676r lassen sich 16S rRNA Gensequenzen der Helicobacter spp.

nachweisen (RILEY et al. 1996). Alle Helicobacter spp. ergeben ein 374-

Basenpaarfragment. Das Primerpaar B38/B39 weist eine H. hepaticus spezifische

16S rRNA-Gensequenz nach (SHAMES et al. 1995). Das Basenpaarfragment ist 417

bp groß. Für beide Primerpaare wurde das Redextract-Kit verwendet.

Ansatz pro Probe

Redextract 5 µl

H2O 2,5 µl

Forward-Primer (20 µM) 0,25 µl

Reverse-Primer (20 µM) 0,25 µl

cDNA 2 µl

Summe 10 µl

Temperaturprofil für die Helicobacter spp.- / H. hepaticus - PCR

Temperatur Dauer

94° C 3 min

94° C 0,5 min

53° C 0,5 min

72° C 0,5 min

34x Schritt 2-4

72° C 10 min



36

3.2.4.1 Agarosegel-Elektrophorese

Für ein 1,5%iges Gel wurden 2,25 g Agarosepulver in 150 ml 1x TBE-Puffer gegeben

und in der Mikrowelle erhitzt. Unter ständigem Rühren mittels Magnetrührer wurde

die Agaroselösung auf 50° C abgekühlt. Dann wurden der Lösung 6 µl Gelstar DNA-

Farbstoff zugefügt. Die Flüssigkeit wurde dann bis zu einer Höhe von 0,5 cm in den

mit bis zu zwei 25er-Taschen-Kämmen präparierten Gelschlitten gegossen. Nach

einem Auskühlen von 30 min konnten die Kämme gezogen werden, und das Gel war

einsatzbereit.

Für die Elektrophorese wurde das Gel in die mit 1x TBE-Puffer gefüllte Gelkammer

gelegt. Danach wurden die dem Thermocycler entnommenen Proben mit 4 µl Orange

G Ladepuffer versehen, sofern der PCR-Ansatz mit dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit

erstellt wurde. Ein mit Redextract erstellter PCR-Ansatz enthält bereits Ladepuffer.

Je nach Ansatz wurden pro Tasche 10-14 µl Probenvolumen einpipettiert. Zur

Größendifferenzierung der Basenfragmente wurde in mindestens eine Tasche pro

Kamm 6 µl einer standardisierten Basenleiter gegeben. Die anschließende Laufzeit

bei 180 V 250 mA betrug ca. 45 min. Zur Auswertung wurde das Gel abschließend

mit einem UV-Transilluminator betrachtet und digital fotografiert.

3.2.5 Sequenzierung

Die Klonierung und Vorbereitung für eine externe Sequenzierung wurde durch Herrn

Dr. Nils-Holger Zschemisch vom ZTL durchgeführt. Aus Zellkulturüberstand isolierte

MNV-RNA wurde mit dem Oligo(dT)18-Primer zu cDNA umgeschrieben. Diese cDNA

wurde als Template verwandt. Die Primerpaare für die PCR-Produkte, die kloniert

wurden, sind Tabelle 6 (S.23) zu entnehmen. Der Primer Noro Hannover rev 3

entspricht dem Primer 15T-aTAG (MÜLLER et al. 2007). Die Klonierung und

Transformation erfolgte gemäß Anweisungen und gelieferten Materialien des

StrataCloneTM PCR Cloning Kit von Agilent Technologies. Detaillierte Protokolle sind

zusätzlich in der Dissertation von Herrn Dr. Zschemisch zu finden (ZSCHEMISCH

2004).


37

Die Bakterienkulturen mit erfolgreich klonierten Abschnitten des MNV-Genoms in

Plasmidform wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit gemäß Anweisungen des

Herstellers aufgearbeitet. Abschließend erfolgte eine PCR mit den Primerpaaren, die

in Tabelle 7 (S.23) genannt werden. Die Sequenzierung der drei PCR-Produkte

wurde extern durch die Firma MWG Biotech AG durchgeführt. Eine Analyse der

erhaltenen Sequenzen erfolgte auf einem Macbook mit DNA Dynamo und

internetbasiert mit BLAST (ALTSCHUL et al. 1990).

3.2.6 Virus-Anzucht für den Infektionsversuch

Eine Portion des Virusisolats wurde zweimal mit RAW-Zellen passagiert, von dieser

Passage wurden für Infektionsversuche und weitere Virusanzucht erneut 1 ml

Portionen in sterile Glasfläschchen abgefüllt und bei -80° C tiefgefroren.

3.2.7 Virus-Titer-Bestimmung

3.2.7.1 Plaque-Test

Um den Virus-Titer zu bestimmen, wurde ein Plaque-Test durchgeführt. Hierzu

wurden RAW 264.7 Zellen auf einer 6er-Zellkultur-Platte in einer Dichte von 6 x 105

Zellen/ml ausgesät. Die Zelldichte pro ml wurde durch Auszählung mit einer

Neubauer Zellzählkammer bestimmt. Pro Vertiefung der Platte wurden 2,5 ml

aufgetragen, was einer Gesamtzellzahl von 1,5 x 106 Zellen pro Vertiefung

entsprach. Die Zellen wurden über Nacht im Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C

inkubiert. Am nächsten Tag wurden Zehner-Verdünnungen der Virussuspension für

den Infektionsversuch angefertigt. Das ursprüngliche Zellmedium wurde von den

Platten abgesaugt. Danach wurden pro Verdünnung 2 Vertiefungen als

Doppelbestimmung mit 500 µl der angefertigten Virusverdünnungsreihe beimpft. Die

Platten wurden danach eine Stunde im Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C bebrütet.

Währenddessen wurde eine Lösung aus 2,5% SeaPlaque Agarose und ergänztem

DMEM-Medium (10% FKS LE, 2% Penicillin-Streptomycin) hergestellt. Nach der

einstündigen Inkubation wurde die Virussuspension von den Vertiefungen abgesaugt

und durch 2,5 ml der vorbereiteten Agarose-Medium-Mischung ersetzt. Nachdem die


38

Agarose-Mediummischung bei Raumtemperatur erstarrt war, wurden die Platten bei

5% CO2 und 37° C für 48h bebrütet. Um die Auswertung zu erleichtern, wurden die

Platten mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt.

3.2.7.2 Auswertung eines Plaque-Tests

Die Löcher im Zellrasen werden bei zwei bis drei auszählbaren Verdünnungsstufen

der Virussuspension erfasst und mit dem Kehrwert der Verdünnungsstufe

multipliziert. Hierbei erhält man die Anzahl von plaqueforming units pro inokkuliertes

Volumen der Virussuspension.

3.2.7.3 TCID50-Test

Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen in der Konzentration von 3 x 104 Zellen/Vertiefung

auf eine Reaktionsplatte mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Pro Vertiefung wurden 100

µl Zellsuspension aufgetragen, dies entspricht einer Zellkonzentration der

Suspension von 3 x 105 Zellen/ml. Die Vertiefungen am Plattenrand wurden mit 300

µl Medium befüllt, um einer Verdunstung im Randbereich vorzubeugen. Die Platten

wurden über Nacht bei 5% CO2 und 37° C inkubiert. Am folgenden Tag wurde eine

Verdünnungsreihe der Virussuspension in Zehnerschritten angelegt. Je 200 µl einer

Verdünnungsstufe der Virussuspension wurden pro Vertiefung auf der

Reaktionsplatte zugegeben. Je eine Reihe mit 10 Vertiefungen wurde mit einer

Verdünnungsstufe befüllt. Eine Kontrollreihe bekam statt der Virussuspension 200 µl

Medium. Dies entsprach einem Gesamtvolumen von 300 µl Flüssigkeit pro

Vertiefung. Danach erfolgte eine weitere Bebrütung bei 5% CO2 und 37° C über acht

Tage.

3.2.7.4 Auswertung eines TCID50-Tests

Zur Auswertung wurde der CPE optisch erfasst. Bereits der dem Nährmedium

zugesetzte Indikator Phenolrot ließ eine Unterscheidung zwischen toten (rosa) und

lebenden (gelb) RAW-Zellen in den Vertiefungen zu, zur Erleichterung wurde jedoch

auch hier mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt.


39

Die Berechnung der Viruskonzentration erfolgt mit der Formel nach Spearmann und

Kärber.

Zuerst wurde die Verdünnungsstufe bestimmt, in der noch ein vollständiger CPE in

allen Vertiefungen zu ermitteln ist. Diese Verdünnungsstufe ergab die Variable a (bei

10-6 ist diese gleich -6). Für die Variable b wurden die Anzahl Vertiefungen mit CPE

der niedrigeren Verdünnungsstufen zu der Anzahl Vertiefungen der

Verdünnungsstufe mit vollständigem CPE addiert (10+9+2+1=22). Die Variable c war

gleich der Gesamtzahl an Vertiefungen pro Verdünnungsstufe (in diesem Fall c=10).

Dies entsprach 107,7 TCID50/200 µl oder 2,5 x 108 TCID50/ml.

3.2.8 Immunofluorescence Assay (IFA)

Dieser Test dient dazu, in einem Mausserum möglicherweise vorhandene Antikörper

gegen MNV nachzuweisen. Entwickelt und validiert wurde der Test bei der Firma

Biodoc. Verdünntes Maus-Serum wird hierbei auf Objektträger aufgetragen, die mit

fixierten MNV-infizierten Zellen beschichtet sind. Die Auswertung erfolgt optisch mit

Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops.

3.2.8.1 Herstellung und Anwendung der Objektträger für die Immunfluoreszenz

Für diesen Test wurden RAW-Zellen in der Flasche kultiviert. Bei einer Zelldichte von

75% wurden diese mit 0,5 ml der eingefrorenen Virussuspension infiziert. Nach einer

flexiblen Inkubationszeit von 4 bis 8 Stunden wurde das Medium entfernt, die Zellen

abgeschabt und in 25 ml neuem Medium (DMEM, 2% Penicilin-Streptomycin, 10%

LE-FKS) pro Flasche suspendiert. Diese Zellsuspension wurde in 50 µl-Tropfen auf

teflonbeschichtete 8-Loch-Objektträger aufgetragen. Danach erfolgte eine weitere


40

Inkubation der Objektträger für 4 bis 8 Stunden im Brutschrank, bis die erwünschte

Infektionsrate von 10 - 30% infizierter Zellen im Zellrasen erreicht war. Die

Infektionsrate wurde zwischendurch durch Anfertigen von Probeobjektträgern gemäß

dem Anwendungsprotokoll (siehe weiter unten) kontrolliert. Bei Erreichen der

gewünschten Infektionsrate wurde das Medium von den Objektträgern abgesaugt.

Die Objektträger wurden an der Luft getrocknet und dann in einem Aceton-Bad für 10

min fixiert. Danach erfolgte eine abschließende Lufttrocknung. Die Objektträger

wurden bis zum Gebrauch bei -20° C gelagert.

Anwendungsprotokoll der Objektträger bei Raumtemperatur:

Es wurden 32 µl des 1:20 mit PBS verdünnten Mausserums pro Kavität aufgetragen.

Anschließend folgten 20 Minuten Inkubationszeit. Dann wurde das Serum

abgesaugt, und es wurden 50 µl PBS pro Kavität zum Spülen aufgetragen. Nach

einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde das PBS abgesaugt. Erneut wurden 50

µl PBS pro Kavität zum 2. Spülen aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 10

Minuten wurde das PBS abgesaugt. Jetzt wurden 25 µl des in PBSM 1:3000

verdünnten Fluoreszenz Anti-Maus-IGG-Antikörpers pro Kavität aufgetragen und für

20 Minuten inkubiert. Nachdem die Antikörperlösung abgesaugt worden war, wurden

50 µl PBS pro Kavität zum Spülen aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 10

Minuten wurde das PBS abgesaugt. Pro Kavität wurden erneut 50 µl PBS zum 2.

Spülen aufgetragen und nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten abgesaugt.

Abschließend wurden 50 µl Evan´s Blue pro Kavität zum Anfärben des

Zellhintergrunds aufgetragen, die nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten wieder

abgesaugt wurden. Der Objektträger konnte dann mit einem Fluoreszenzmikroskop

bei 320 facher Vergrößerung optisch beurteilt werden.

3.2.9 Virusaufreinigung mittels Ultrazentrifugation

MNV wurde wie bereits beschrieben angezüchtet. Nach zwei Einfrier-Auftauzyklen

wurde der Flascheninhalt bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) zentrifugiert. Der

Überstand wurde abgenommen, das Pellet verworfen. Die weitere Aufreinigung


41

erfolgte dann mit der Ultrazentrifuge. Zum Einsatz kam hierbei ein SW32-Rotor mit

sechs Bechern. In einem matten Ultrazentrifugenröhrchen wurden 25 ml Überstand

mit 5 ml einer 30% Sucrose-Lösung unterschichtet. Danach wurde für drei Stunden

bei 27000 U/min (89500 x g) und 4° C zentrifugiert. Nach sorgfältigem Abgießen des

Überstandes und der Sucrose-Lösung war ein hauchdünnes Pellet am Boden des

Ultrazentrifugenröhrchens zu sehen, das in je 50 µl PBSM resuspendiert wurde.

3.2.9.1 Weitergehende Aufreinigung über einen CsCl-Gradienten im SW55-

Rotor

Hierfür wurde eine CsCl-Lösung mit einer Dichte von 1,3393 g/cm³ angesetzt (5,15 g

CsCl auf 10 g H2O). In 9,5 ml dieser Lösung wurden 0,5 ml der PBSM-MNV-

Suspension gegeben. Je 5 ml wurden auf zwei klare Ultrazentrifugenröhrchen

verteilt. Die Zentrifugation im SW55-Rotor erfolgte für 18 Stunden bei 35000 U/min

(116000 x g) und 4° C. Die sichtbare Bande wurde im Gegenlicht mit einer Spritze

abgenommen und bei -20° C für eine weitere Verwendung gelagert.

3.2.9.2 Aufreinigung für elektronenmikroskopische Aufnahmen

MNV wurde wie bereits beschrieben angezüchtet. Nach zwei Auftauzyklen wurde der

Flascheninhalt bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) zentrifugiert. Insgesamt 50 ml

des Zellkultur-Überstands wurden abgenommen, das Pellet verworfen. Nun kam ein

anderes Aufreinigungsprotokoll zum Einsatz, da CsCl-Ionen eine elektronen-

mikroskopische Aufnahme erschweren. Je 2 ml Zellkulturüberstand wurden bei

55000 U/min für 32 min (201000 x g) in einem SW-TLS 55 Rotor zentrifugiert. Der

Großteil des Überstandes wurde verworfen. Die Pellets wurden in 20 µl

Restüberstand gelöst. Insgesamt entstanden so 500 µl aus 50 ml. Von der

Pelletsuspension wurden 125 µl mit 1,875 ml steriler Kochsalzlösung aufgefüllt.

Diese Lösung wurden erneut bei 55000 U/min für 32 min im SW-TLS 55 Rotor

zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die hierbei entstandenen Pellets

wurden in 20 µl Restüberstand gelöst. Anschließend erfolgte ein dritter

Zentrifugationsschritt bei 55000 U/min für 32 min im SW-TLS 55 Rotor.


42

3.2.9.3 Gewinnung von RAW-Zellbestandteilen für eine Zellkontrolle

Parallel zur MNV-Anzüchtung wurden Zellkulturflaschen mit geschlossenem RAW-

Zellrasen (Zelldichte ähnlich der zu infizierenden Zellkulturflaschen) bei -20° C

eingefroren. Die weitere Behandlung entsprach den Schritten der Virusaufreinigung

mittels Ultrazentrifugation. Auch hier konnte visuell ein Pellet am Boden des

Ultrazentrifugenröhrchens ausgemacht werden, das in je 50 µl PBSM resuspendiert

wurde.

3.2.10 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Dieser Test dient dazu, in einem Mausserum möglicherweise vorhandene Antikörper

gegen MNV nachzuweisen. Verdünntes Maus-Serum wird hierbei auf mit MNV-

Antigen beschichtete Microtiter-Riegel aufgetragen. Die Auswertung der

enzymatischen Umsetzung des Substrats ABTS durch Peroxidase-markierte Anti-

Maus-IgG-Antikörper erfolgt optisch mit Hilfe eines Photometers. Bei einer

Substratumsetzung färbt sich die Lösung grün.

3.2.10.1 Beschichtung (Coating) und Anwendung der ELISA-Platten

Die durch die Aufreinigung gewonnene Virus-PBSM-Lösung wurde mit

Beschichtungspuffer (Coating Buffer) 1:100 verdünnt. Von der Coating-Lösung

wurden 150 µl pro Vertiefung der 8er-Microtiterriegel aufgetragen. Eine Platte besteht

aus 12 Riegeln mit 8 Vertiefungen. Danach wurden die ELISA-Platten für 24 Stunden

im Kühlschrank bei 8° C inkubiert. Der Inkubation folgten ein Waschen und ein

Blockvorgang mit 200 µl Roche-Blocking Reagent pro Vertiefung über 15 min bei

Raumtemperatur gemäß Gebrauchsanweisung des Herstellers. Zum Abschluss

wurden die Riegel erneut gewaschen. Die Riegel der RAW-Zellkontrolle wurden

genau wie die MNV-Riegel beschichtet und anschließend geblockt. Verdünnt in

Coating-Buffer wurde hier stattdessen das in PBSM gelöste RAW-Pellet. Hierbei

wurde die gleiche Verdünnungsstufe wie beim MNV-Coating (1:100) verwendet. Die

ELISA-Platten wurden dann bis zum Gebrauch bei -20° C gelagert.


43

Das Standardwaschprogramm des Columbus Washer, das sowohl nach dem

Coating als auch beim Elisa-Standardprotokoll zur Anwendung kam, sah 3

Waschschritte mit jeweil 250 µl PBS Tween vor. Das PBS Tween wurde direkt nach

dem Einfüllen in die Vertiefungen wieder abgesaugt.

Beim Standard-Protokoll zur Anwendung der beschichteten ELISA-Riegel wurden

100 µl des 1:50 mit PBS verdünnten Mausserums in je eine MNV- und eine RAW-

Vertiefung pipettiert. Nach einer Inkubation von 45 Minuten bei 37° C im Brutschrank

wurden die Vertiefungen mit PBS Tween im Washer gespült. Anschließend wurden

100 µl Zweitantikörper 1:1000 verdünnt in PBS Tween pro Vertiefung aufgetragen.

Es folgte eine Inkubation über 45 Minuten bei 37° C im Brutschrank. Nach einem

erneuten Waschen mit PBS Tween wurden schließlich 100 µl ABTS-Substrat pro

Vertiefung aufgetragen. Nach 45 Minuten Inkubation bei 37° C im Brutschrank wurde

die Extinktion im Photometer beim Wellenlängenpaar 405 nm vs. 492 nm gemessen.

Die Verdünnungsstufe des Antigens zur Beschichtung wurde durch eine Antigen-

Verdünnungsreihe ermittelt. Virus-PBSM-Lösung wurde in verschiedenen

Konzentrationen mit Coating Buffer verdünnt und in die Vertiefungen gemäß

Beschichtungsprotokoll gegeben. Mit einem positiven Kontrollserum-Pool wurde das

Standardprotokoll zur Anwendung der beschichteten ELISA-Riegel abgearbeitet.

Dieser positive Kontrollserumpool war zuvor aus in der IFA deutlich positiv

getesteten Mäuseseren erstellt worden. Ziel der Verdünnungsreihe war es, mit einer

möglichst hohen Verdünnung des Antigens dennoch einen hohen OD-Wert zu

erreichen.

3.2.10.2 Der korrigierte OD-Wert

Um eventuelle Kreuzreaktionen mit RAW-Zellbestandteilen auszuschließen, wurde

die Zellkontrolle eingeführt. Diese ermöglicht die Bestimmung eines korrigierten OD-

Werts:

OD MNV-Kavität – ODRAW-Kavität = ODkorrigiert


44

3.2.11 Elektronenmikroskopische Aufnahmen

Nach der bereits beschriebenen Virusaufreinigung für elektronenmikroskopische

Aufnahmen wurden durch Jutta Milzer im Institut für Virologie der MHH

elektronenmikroskopische Präparate hergestellt.

Unbeschichtete Trägerplättchen, sogenannte Grids, wurden auf einen Formvarfilm

(Formvarpulver gelöst in Chloroform) auf einer Wasserfläche aufgebracht.

Anschließend wurden sie mit einem Filterpapierstreifen abgenommen und luftfixiert.

Danach erfolgte eine Bedampfung mit Graphit. Auf die vorbereiteten Grids wurden 20

µl der konzentrierten Viruspartikel-Lösung aufgetragen. Nach sechsmaligem

Waschen mit Aqua ad iniectabilia wurden 5 µl 1% Uranylacetat (gelöst in Wasser) für

die Negativkontrastierung aufgetragen. Abschließend wurden die Grids luftfixiert.

Drei Präparate (Grids) wurden im Zentrallabor Elektronenmikroskopie der MHH mit

einem FEI Tecnai 20 Elektronenmikroskop im TEM-Modus bei 80 kV in 62000-facher

und 80000-facher Vergrößerung untersucht und digital gespeichert. Dies geschah mit

Unterstützung von Prof. Dr. Ungewickell, Gerhard Preiß und Jutta Milzer.

3.2.12 Isolation und Anzucht von Helicobacter hepaticus für den Doppel-

infektionsversuch

Der Keim wurde im mikrobiologischen Untersuchungslabor des ZTL isoliert und

identifiziert. Hierzu wurde die Maus Nummer 1240 des Stammes BC-R4-Il10-/- nach

CO2 Betäubung durch Genickbruch getötet. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurde

die Zäkumspitze mit sterilem Besteck entfernt und in ein 5 ml Polypropylen-Röhrchen

mit 2 ml Brain-Heart-Infusion Medium überführt. Nach Homogenisierung wurde die

Suspension durch einen 0,45 µm Weißrandfilter gegeben. Von der gefilterten Lösung

wurden jeweils 200 µl auf eine Petrischale mit Columbiaagar mit Zusatz von

Amphotericin B, Campylobacter-Selektiv-Supplement (nach Skirrow) und Pferdeblut

getropft und mit einer Impföse verteilt. Die Platten wurden unter mikroaerophilen

Bedingungen in einem Anaerobiertopf bei 37° C kultiviert. Zur Erzeugung der

mikroaerophilen Bedingungen wurde die Luft viermalig evakuiert auf -0,2 bar.


45

Danach wurde ein Gasgemisch, bestehend aus 10% CO2, 10% H2 und 80% N2, bis

0,2 bar hinzugefügt. Die Bakterien wurden alle 3 bis 4 Tage auf eine neue Platte

überimpft, indem etwas Bakterienmaterial mit einer Impföse von der alten Platte

abgenommen und auf einer neuen Platte verteilt wurde. Die vierte Passage dieses

Keimes wurde in großem Umfang als Dauerkultur bei -80° C eingefroren, da hieraus

die Bakterien zur Infektion gewonnen wurden. Zum Einfrieren der Bakterien wurde

auf jede Platte 1 ml brain-heart-infusion (BHI)-Medium gegeben. Anschließend

wurden die Bakterien mit Hilfe eines Wattetupfers in das Medium eingerieben. Von

dieser Suspension wurden 800 µl abgenommen und in ein 1,5 ml

Schraubdeckelgefäß mit 100 µl Gycerin und 100 µl FKS überführt. Mehrere gefüllte

Schraubdeckelgefäße wurden bei -80° C eingefroren.

3.2.13 Experimentelle Infektion der Mäuse mit MNV

Die Mäuse wurden anhand ihres Alters in die Infektionsgruppen (siehe Tabelle 11)

eingeteilt, um zum geplanten Sektionstermin ein möglichst gleiches Alter (12-15

Wochen) zu haben. Sie wurden im Alter von 7 bis 12 Wochen zweimal

hintereinander im Abstand von 3 Tagen mit jeweils 0,1 ml virushaltigem

Zellkulturüberstand 2,5x108 TCID50/ml per oraler Gavage und 10 µl per nasaler

Applikation experimentell infiziert. Für die Gavage wurde eine Knopfkanüle

eingesetzt. Die Infektion erfolgte unter einer sterilen Sicherheitswerkbank. Die

Kontrolltiere erhielten 0,1 ml PBS per oraler Gavage und 10 µl PBS nasal. Sie

wurden als Einzelgruppe zusammengefasst und zu einem gesonderten

Sektionstermin getötet und seziert.

3.2.14 Experimentelle Infektion der Mäuse mit Helicobacter hepaticus

Zwei Wochen nach der Inokulation mit MNV wurden Mäuse im letzten Teil

(Infektionsversuch 5) der Versuchsreihe ebenfalls per oraler Gavage mit 0,1 ml einer

H. hepaticus – Suspension (106 KBE, 7. Passage) experimentell inokuliert. Fünf Tage

später erfolgte eine zweite Inokulation. Die Kontrolltiere (infiziert mit MNV) erhielten

zweimal 0,1 ml PBS per oraler Gavage.

46

Tabelle 11: Übersichtsdiagramm der Infektionsversuche

1. Versuch

Stamm

Geschlecht (Tiere pro Sektions-termin) Sektion p.i. Kontrollgruppe Probenverwendung Besonderheit

C3-Il10-/-

m (2+3+3),w (3+4+6) 2, 4, 8 Wochen

m (4), w (2+2) Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation

Lymphozytenstimulation zusammengefasst pro Stamm und Geschlecht B6-Il10

-/- m (5+6+5),w (5+5+4) m (3), w (3+3)

2. Versuch

C3-Il10-/-

m (4+4),w (3+4)

2, 4 Wochen

m (3), w (2)

Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation

Lymphozytenstimulation pro Einzeltier für alle weiteren Versuche B6-Il10

-/- m (6+4),w (6+4) m (4), w (5)

C3-wt m (2+1(1),w (0+0) m (5), w (0)

B6-wt m (4+4),w (6+6) m (4), w (6)

3. Versuch (Ergänzung zum 2. Versuch, sowie Untersuchung des akuten Infektionsverlaufs)

C3-Il10-/-

w (3) 2 Wochen w (3)

Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation

B6-Il10-/-

w (3) 4 Wochen -

C3-wt m (2) 2 Wochen -

B6-wt - - -

B6-Il10-/-

m (4) 7d

m (4) Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation B6-wt m (4), w (4) m (4), w (4)

B6-wt w (4+4+3+3) 3, 6, 9, 12 d 0 Serologie, Histologie, PCR Verlaufsversuch, Darmlymphknoten für PCR verwendet

4. Versuch (Infektion keimfreier Tiere)

C3-Il10-/-

w (5) 4 Wochen m (4) Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation

keimfreie Tiere, im Micro-Isolator gehalten

5. Versuch (Doppelinfektion)

C3-Il10-/-

m (2), w (4) 8 (6) Wochen

m (2), w (4) Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation

Infektion mit MNV, sowie 2 Wochen später mit H. hepaticus

B6-Il10-/-

w (6) w (5) Kontrollen: Infektion nur mit H. hepaticus

m = männlich; w = weiblich; p.i. = post inoculationem; d = Tag


47

3.2.14.1 Tötung

Am Sektionstag wurden die Tiere von der Infektionsabteilung in das mikrobiologische

Untersuchungslabor des ZTL der MHH gebracht. Dort wurden sie durch

Kohlendioxidgasinhalation betäubt und anschließend durch Entbluten getötet.

3.2.14.2 Postmortale Untersuchung

Die Tierkörper wurden gewogen, auf äußerliche Veränderungen untersucht und

anschließend seziert.

3.2.14.3 Sektion

Die Sektion erfolgte mit sterilem Sektionsbesteck. Dabei wurden alle Organe auf

makroskopische Veränderungen untersucht.

3.2.14.4 Probennahme

Serum

Nach Eröffnen des Brustkorbs des Tieres wurde das Herz mit einer Spritze mit

aufgesetzter Kanüle punktiert, um möglichst viel Vollblut zu gewinnen. Das Blut

wurde in sterile Eppendorf-Gefäße gegeben und bei Raumtemperatur bis zum Eintritt

der Gerinnung stehen gelassen. Dann erfolgte eine Zentrifugation bei 6000 U/min

(2800 x g) für 7 min. Der Serumteil wurde abgenommen und für weitere

Untersuchungen bei -80° C gelagert.

PCR

Als PCR-Proben wurden bei jedem Versuch mit sterilem neuen Besteck Lunge,

Leber, Niere, Milz, Mesenteriallymphknoten (nur Versuch 3; Tag 3, 6, 9, 12 p.i.),

proximaler Dünndarm, Ileum, proximales Kolon und Kot genommen. Die Proben

wurden in sterile Eppendorf-Gefäße gefüllt und sofort in flüssigem Stickstoff gekühlt

bis zur anschließenden Lagerung bei -80° C.


48

Histologie

Für die Histologie wurden Zäkum, Kolon, proximaler Dünndarm, distaler Dünndarm,

Magen, Leber, Lunge und Milz entnommen. Die Proben wurden in

Standardeinbettkassetten gelegt und abschließend bis zur Zuschneidung in

10%igem, gepufferten Formalin nach Sörensen gelagert. Das Kolon wurde dabei als

„modifizierte Swiss-Roll“ in die Kassette gebettet (MOOLENBEEK u. RUITENBERG

1981; BLEICH et al. 2004). Hierzu wurde das proximale Kolon in die Mitte der

Kassette verbracht und das restliche Kolon sowie Rektum und Anus in Form einer

Schnecke flach ausgerollt.

3.2.14.5 Präparation des Mesenteriallymphknotens

Der Mesenteriallymphknoten (MLK) wurde mit sterilem Besteck präpariert und in mit

5 ml Lymphozyten-Medium gefüllte verschließbare 15 ml Plastik-Reaktionsgefäße

gegeben und bis zur weiteren Aufarbeitung auf Eis gelagert. In Versuch 1 wurden die

MLK pro Stamm und Geschlecht in einem Gefäß zusammengefasst, in den

folgenden Versuchen wurde jeder MLK pro Tier separat aufgearbeitet.

3.2.15 Sterile Aufarbeitung des Mesenteriallymphknotens unter einer Werkbank

Der MLK wurde mit Lymphozytenmedium auf ein steriles Zellsieb gegeben, welches

in einer sterilen Petrischale lag. Anschließend wurde das Gewebe im Sieb

gleichmäßig mit dem sterilen Stempel einer 1 ml-Spritze homogenisiert. Die

Lymphozyten wurden dabei freigesetzt und konnten durch das Sieb ins Medium

passieren. Nach mehrmaligem Auf- und Abpipettieren wurde das Medium mit den

suspendierten Lymphozyten in ein neues steriles BlueCap gegeben. Dann erfolgte

eine Pelletierung der Lymphozyten durch Zentrifugation bei 4° C und 1100 U/min

(163 x g) für 7 min. Das Medium wurde verworfen, das Pellet erneut in 5 ml Medium

gelöst und in ein neues Reaktionsgefäß übertragen. Nach einer erneuten

Zentrifugation bei 4° C und 1100 U/min (163 x g) für 7 min wurde auch hier das

Medium verworfen, und das gewaschene Pellet in 0,5 ml Medium gelöst. Zur

Bestimmung des Lymphozytengehalts pro Volumen wurde ein scil VetABC


49

eingesetzt, um die Lymphozyten-Konzentration der jeweiligen Mesenterial-

Lymphknotensuspension auf 2 x 106 Zellen/ml einzustellen.

3.2.16 Vorbereitung und Verwendung der Zellkulturplatten für die Bestimmung von

Interferon γ

Am Tag vor der Sektion wurden Reaktionsplatten mit 96 Vertiefungen mit 100

µl/Vertiefung der PBS-anti-mCD3-Lösung [5 µg anti-mCD3 (145-2C11)/ml]

beschichtet. Diese wurden über Nacht bei 4° C inkubiert. Abschließend erfolgte am

Sektionstag ein zweimaliges Waschen mit 200 µl Lymphozytenmedium/Vertiefung.

Danach waren die Platten verwendungsbereit.

Die vorbereitete Platte wurde entleert und 2 x mit Lymphozytenmedium gespült. Die

äußeren Vertiefungen wurden zum Verdunstungsschutz mit 200 µl

Lymphozytenmedium versehen. Jeweils 100 µl der Mesenteriallymphknoten-

suspensionen (2 x 105 Zellen) wurden anschließend in die freien Vertiefungen

aufgetragen, pro Suspension 3 Vertiefungen. Zusätzlich wurden 100 µl Medium

hinzugefügt. Die Platten wurden für 24 h bei 37° C, 5% CO2 und gesättigter H2O-

Atmosphäre bebrütet. Nach der Bebrütung wurden je 100 µl der Plattenüberstände

auf zwei neue unbeschichtete Platten verteilt. Diese wurden bis zur externen INFγ-

Bestimmung durch einen ELISA bei -80° C gelagert.

3.2.17 Bestimmung von Interferon γ im Lymphozytenzellkulturüberstand mit Hilfe

eines ELISA

Die Bestimmung erfolgte durch die Arbeitsgruppe von PD Dr. Detlef Neumann vom

Institut für Pharmakologie der MHH (NEUMANN et al. 2006).

Zuerst wurde der Erstantikörper in der Konzentration 0,5 µg/ml in Coating Buffer

verdünnt. Dann wurden je 100 µl der Verdünnung pro Vertiefung auf die Platten

aufgetragen. Anschließend erfolgte eine Inkubation über Nacht bei 4° C. Am

nächsten Tag wurde die Platte entleert und 3 x gewaschen. Zum Blocken wurden

250 µl Blockpuffer pro Vertiefung für eine Stunde bei Raumtemperatur aufgetragen.


50

Für die Standards wurde die 100 ng/ml Stammlösung IFNγ in Kulturmedium 1:100

auf 1000 pg/ml verdünnt. Für weitere Verdünnungen wurde 1:2 weiterverdünnt bis

zur höchsten Verdünnungsstufe von 16,5 pg/ml, insgesamt 7 Stufen. Im

Doppelansatz wurden 50 µl pro Vertiefung jeder Verdünnungsstufe sowie eine

zusätzliche Blindprobe aufgetragen.

Die Proben wurden ebenfalls mit Medium verdünnt und doppelt aufgetragen. Nach

einer einstündigen Inkubation wurden 50 µl biotinylierter Zweitantikörper in einer

Verdünnung von 1:1000 pro Vertiefung zugegeben. Nach erneuter einstündiger

Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte entleert und 3mal gewaschen. Nach

Zugabe von 100 µl verdünnter Streptavidin-HPRT-Lösung wurde für 30 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Platte entleert und 4mal

gewaschen. Pro Vertiefung wurden 100 µl Substrat zugegeben und unter

Beobachtung bei RT ca. 20 min inkubiert. Dann wurde die Reaktion mit 50 µl 1M

Schwefelsäure gestoppt.

Die Extinktion wurde im ELISA-Reader bei 450 nm vs. 570 nm gemessen. Anhand

einer aus den Standards erstellten linearen Regression wurden danach die

Probenwerte berechnet.

3.2.18 Anfertigung histologischer Präparate

Die histologischen Gewebeschnitte wurden am ZTL von Frau Wiebe angefertigt und

mit Hämatoxilyn-Eosin (HE) gefärbt. Die Organe wurden über Nacht paraffinisiert und

anschließend per Hand eingebettet. Nach Einbettung wurden 3 µm dicke Längs-

schnitte gemacht und im Färbeautomaten HE gefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden

anschließend mit Korbitbalsam eingedeckt.


51

3.2.19 Histologische Auswertung der Präparate

Die Schnitte wurden ohne vorher bekannte Zuordnung beurteilt. Zur Beurteilung der

Entzündungsherde in Zäkum und Kolon kam der The Jackson Laboratory-Schlüssel

zur Anwendung (BLEICH et al. 2004).

Dieser gliedert sich in:

Schweregrad

Der Schweregrad der Entzündung wurde beurteilt als: 0 = keine Entzündung;

1 = mild; 2 = mäßig; 3 = schwer. Milde Läsionen waren kleine, fokale oder weiter

voneinander entfernte multifokale Areale, in denen das Entzündungsgeschehen auf

die Lamina propria beschränkt blieb. Bei mäßigen Veränderungen handelte es sich

entweder um multifokale oder lokal extensive Entzündungsgebiete, in denen das

Entzündungsgeschehen bis in die Submukosa fortschritt. Schwere Läsionen waren

Ulzerationen größeren Ausmaßes (>1 mm der Mukosa betroffen).

Hyperplasie

Der Grad der Hyperplasie wurde beurteilt als: 0 = keine Hyperplasie; 1 = mild;

2 = mäßig; 3 = schwer. Bei einer milden Hyperplasie erschien das Epithel

morphologisch normal als einfaches, hochprismatisches Schleimhautepithel, das

aber im Vergleich zur normalen Mukosa eine mindestens zweifache

Schleimhautdicke aufwies, was durch die Länge der Krypten angezeigt wurde. Eine

mäßige Hyperplasie war durch eine zwei bis dreifache Schleimhautdicke mit

hyperchromatischen Zellen, eine verringerte Anzahl an Becherzellen und vereinzelt

verlängerte und verzweigte Krypten charakterisiert. Bei einer schweren Hyperplasie

war das Epithel deutlich verdickt (vierfach oder mehr) und zeigte eine deutliche

Hyperchromasie der Zellen, sehr wenige bis keine Becherzellen, einen hohen

Mitoseindex der Zellen innerhalb der Krypten und viele Krypten mit verlängerter und

verzweigter Struktur.


52

Ulzeration

Ulzeration wurde beurteilt als: 0 = kein Ulkus; 1 = eine bis zwei Ulzerationen, die

insgesamt maximal 20 Krypten einbezogen; 2 = eine bis vier Ulzerationen, an denen

insgesamt 20-40 Krypten beteiligt waren; 3 = jegliche Ulzeration, die über die vorher

genannten Kriterien hinaus gingen.

Fläche

Der Anteil der entzündlich veränderten Fläche wurde in 10%-Schritten auf einer

Skala von 0-100% geschätzt, bezogen auf die gesamte Fläche des jeweiligen

Darmabschnitts. Für die Analysen wurden die Prozentzahlen folgendermaßen

umgerechnet: 0 = 0%; 1 = 10-30%; 2 = 40-70%; 3 = >70%

Aus den Werten für Schweregrad, Hyperplasie, Ulzeration und Fläche wurde die

Summe gebildet und als Gesamtscore angegeben.

3.2.20 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der INFγ-Bestimmung wurde mit dem Programm

GraphPad Prism auf einem PC durchgeführt. Das Programm StatView wurde für die

statistische Auswertung des MNV-ELISA auf einem Apple Powerbook G4 genutzt.

Für weitere graphische Darstellungen und Berechnungen wurde Microsoft Excel

2007 verwendet.

Ergebnisse

53

4 Ergebnisse

4.1 Anzucht von MNV in der Zellkultur

Eine Anzucht und Vermehrung von MNV war problemlos möglich. RAW-Zellen, die in

einer gleichmäßigen Zellschicht wuchsen, reagierten mit einem deutlichen CPE.

Dieser trat je nach Infektionsdosis innerhalb weniger Stunden bis zu 1,5 Tagen auf.

Die Zellen kugelten sich ab und lösten sich aus dem Zellverband von der

Flaschenoberfläche. Der CPE erfasste vollständig alle Zellen.

4.2 Virus-Nachweis mittels PCR

Zu Beginn wurden die Primerpaare 5205f/5388r und 5004f/5219r erprobt. Die

isolierte RNA wurde mit dem Reverse-Primer des jeweiligen Paares zur cDNA

umgeschrieben. Hierbei erwies sich das Paar 5004f/5219r als geeignet.

Bei den PCR-Untersuchungen des Infektionsversuches kamen Zweifel auf, ob das

Primerpaar 5004f/5219r MNV in Organproben detektieren kann. Das MNV-Isolat

wurde aus einer Milz isoliert (siehe 3.2.2 Virusisolation). Alle im Infektionsversuch

gewonnenen Milzen wurden jedoch negativ getestet. Es erfolgte eine Entwicklung

von weiteren Primerpaaren unter Berücksichtigung der Sequenzierungsergebnisse.

Zur Austestung der Primerpaare wurde RNA verwandt, die aus Zellkulturüberstand,

sowie aus Organ- und Kotproben des Infektionsversuchs isoliert worden war. Die

RNA wurde mit dem OligoDT-Primer zu cDNA umgeschrieben, um mit der gleichen

cDNA auch die RPS9-PCR durchführen zu können (siehe Abbildung 6). Letztlich

zeigte sich, dass das Primerpaar 5004f/5219r weiterhin die besten Resultate brachte,

da eine deutliche Bande auszumachen war. MNV war bei den in den

Infektionsversuchen verwendeten Mausstämmen in keiner Milz nachweisbar (siehe

Tabelle 20 S. 78).

Ergebnisse

54

Abbildung 5: Vergleich verschiedener Primerpaare im Gradienten.

Die PCR in Abbildung 5 wurde mit einer cDNA-Positivkontrolle (gewonnen aus MNV-

positivem Zellkulturüberstand) bei 4 unterschiedlichen Annealingtemperaturen (53°

C, 55,6° C, 58,4° C und 62° C) durchgeführt. Die Primerpaare 5580f/5671r und

5205f/5469r wiesen besonders kräftige Banden auf.

Abbildung 6: Vergleich der Primerpaare 5580f/5671r und 5205f/5469r mit 5

verschiedenen Proben, die aus Organen und Kot isoliert wurden.

Ergebnisse

55

Die PCR in Abbildung 6 wurde mit 3 MNV-positiven cDNA-Proben (gewonnen aus 2

MLK und einer Kotprobe), 2 MNV-negativen cDNA-Proben (gewonnen aus 2 Milzen)

sowie Negativ- und Positiv-Kontrolle durchgeführt. Die 3 Banden der MNV-positiven

Proben in der PCR mit dem Primerpaar 5580f/5671r sind schwer zu unterscheiden

von den negativen Proben. Dies wird beim Primerpaar 5205f/5469r aufgrund eines

größeren Amplikons (265bp) wesentlich erleichtert. Die RPS9-PCR wurde mit der

cDNA, die aus den 2 MNV-negativen Milzen isoliert worden war, sowie Negativ- und

Positiv-Kontrolle durchgeführt.

Abbildung 7: Vergleich der Primerpaare 5205f/5469r und 5004f/5219r.

Das Gel in Abbildung 7 zeigt 8 MNV-positive Kotproben aus einer PCR mit dem

Primerpaar 5205f/5469r, dann eine Lücke gefolgt von Positiv- und Negativkontrolle.

Nach der Basenleiter sind die gleichen 8 MNV-positiven Kotproben mit Positiv- und

Negativkontrolle mit dem Primerpaar 5004f/5219r aufgetragen. Das Primerpaar

5205f/5469r weist bei allen Proben, die aus Kot isoliert wurden, Doppelbanden auf.

Nur die Positivkontrolle, die aus MNV-positivem Zellkulturüberstand isoliert wurde,

hat eine Bande. Bei Probe 3 ist nur eine schwache Bande zu erkennen, Probe 5

zeigt keine Bande. Das Primerpaar 5004f/5219r hingegen zeigt bei jeder Probe eine

starke Bande.

Ergebnisse

56

4.3 Sequenzierung des Virus

Als Template wurde die mit dem OligoDT-Primer umgeschriebene cDNA verwendet.

Um eine reproduzierbare Sequenzierung zu ermöglichen, wurden die RNA-

Abschnitte als cDNA in Bakterienplasmide kloniert. Die Plasmid-DNA wurde per PCR

vervielfältigt, anschließend über ein Gel laufen gelassen und dann ausgeschnitten

und zur externen Sequenzierung verschickt. Die vollständige Sequenz wurde an die

NCBI-Nukleotiddatenbank übermittelt. Sie wurde unter der Zugangsnummer

EU854589 registriert. Das Isolat bekam die Bezeichnung Murine

norovirus/Hannover1/2007/DEU. Der Stammbaum in Abbildung 8 zeigt die

Verwandtschaft des Isolats mit anderen murinen Noroviren. Er wurde mit BLAST

erstellt (ALTSCHUL et al. 1990).

57

Abbildung 8: Verwandschaft vom isolierten MNV-Stamm Hannover1/2007/DEU erstellt durch BLAST (ALTSCHUL et al. 1990).

Ergebnisse

58

4.4 Virusquantifizierung

Im Plaque-Test trat ein CPE auf. Der CPE war bereits an der Verfärbung des

Mediums (Indikator Phenolrot gelb bei pH 0,9-6,4, rot bei pH >6,4) zu erkennen. Bei

den lebenden Kontrollen war das Medium gelb, bei den toten Zellen rosarot. Die

Einfärbung der Zellen mit Kristallviolett zeigte jedoch keine zählbaren Löcher im

Zellrasen, sondern eine schlierige Veränderung des Zellrasens. Dies wird für einige

MNV-Isolate beschrieben (THACKRAY et al. 2007). Daraufhin wurde ein TCID50-Test

durchgeführt. Auch hier zeigte bereits der dem Zellmedium zugesetzte Indikator den

CPE an (Abbildung 9). Abschließend wurde mit Kristallviolett angefärbt.

Abbildung 9: TCID50-Test; der Indikator des Mediums zeigt lebende Zellen (gelb) an;

zweites Bild nach der Anfärbung mit Kristallviolett (lebende Zellen stark lila).

Nach Auszählung der Vertiefungen mit lebenden/toten Zellen und Auswertung nach

Spearmann und Kärber (siehe S. 38) ergab sich für die konfektionierte Viruscharge

eine TCID50 von 2,5 x 108 TCID50/ml. Diese Charge wurde für die Infektionsversuche

verwendet.

4.5 Indirekte Antikörpernachweisverfahren

4.5.1 IFA

Die Untersuchung von Mäuseseren auf Antikörper gegen MNV per IFA wurde bereits

im Labor der Firma Biodoc etabliert und als Goldstandard für die Etablierung des

ELISA sowie zur Untersuchung aller Tiere des Infektionsversuchs genutzt.

Ergebnisse

59

Bei der Herstellung der Objektträger ist eine maximal 25% Infektionsrate des

Zellrasens angestrebt. Abbildung 10 zeigt ein MNV-positives Mausserum in der

Immunfluoreszenz. Die infizierten Zellen zeigen eine cytoplasmatische Fluoreszenz

im Randbereich mit einem „Polkappenphänomen“. Als Bewertung wurde ein

semiquantitativer Schlüssel angewendet. Dazu wurde die Serumprobe mit einem

deutlich positiven Kontrollserum verglichen.

Kennzeichnung Serumreaktion beurteilt anhand der Intensität

+++ Starke Reaktion

++ Mittelstarke Reaktion

+ Schwach positive Reaktion

- Keine Reaktion

+/- Grenzwertige Reaktion

NSR Nicht spezifische Reaktion

Abbildung 10: MNV-positives Mausserum (+++) in der Immunfluoreszenz. MNV-

infizierte Zellen sind grüngelblich markiert.

Ergebnisse

60

4.5.2 Antigenaufreinigung und ELISA

Die Aufreinigung per Ultrazentrifuge erfolgte angelehnt an die Publikation von Wobus

et al. (WOBUS et al. 2004). Ziel war es, MNV-Antigen für einen ELISA und

elektronenmikroskopische Aufnahmen zu gewinnen.

Nach der ersten Kissenzentrifugation war ein Pellet am Boden des

Ultrazentrifugenröhrchens auszumachen, welches in PBSM gelöst wurde.

Probeweise wurden bereits mit dem gelösten Pellet ELISA-Platten beschichtet und

mit diversen Mäuseseren, die in der IFA postiv bzw. negativ für MNV reagiert hatten,

erprobt. Hierbei zeigte sich eine Substratumsetzung bei IFA positiven Seren,

während die meisten IFA negativen Seren nicht reagierten. Die Ausnahmen ließen

eine Verunreinigung vermuten. Daher wurde mit dem gelösten Pellet eine

Aufreinigung über einen Cäsiumchloridgradienten durchgeführt. Am Ende der

Zentrifugation war eine deutliche Bande im Ultrazentrifugenröhrchen zu erkennen,

die abgenommen wurde (Abbildung 11).

Abbildung 11: Kissenzentrifugation; Bande nach der Gradientenzentrifugation.

Eine Dialyse zur Entfernung des Cäsiumchlorids erfolgte nicht, da beim Coating der

ELISA-Platten hoch verdünnt wurde. Doch auch hier reagierten einige negative

Seren. Dies sprach für eine immer noch vorhandene Verunreinigung der Virusbande.

Da es sich bei der RAW-Zelllinie um Mäusezellen handelt, kam die Vermutung auf,

dass die falsch positiven Seren mit RAW-Zellresten reagiert hatten, die trotz

Ergebnisse

61

Aufreinigung durch Zentrifugation und Ultrazentrifugation noch vorhanden waren. Um

dies zu überprüfen wurden RAW-Zellen angezüchtet und nicht infiziert. Die weitere

Behandlung und Aufreinigung entsprach jedoch der Behandlung infizierter RAW-

Zellen. Nach der Kissenzentrifugation war ebenfalls ein Pellet am Boden

auszumachen. Dieses wurde ebenfalls in PBSM gelöst und an ELISA-Platten

gebunden. Hier reagierten die IFA-negativen Seren teilweise ebenfalls mit einer

Substratumsetzung, dies bestätigte die Vermutung, dass einige Mäuse Antikörper

gegen RAW-Zellbestandteile besitzen. Um die Mäuseseren zu erkennen, die mit

RAW-Zellbestandteilen reagieren, wurde entschieden, eine parallele Zellkontrolle

beim ELISA durchzuführen.

Damit die OD-Werte von MNV-Reaktionsvertiefungen, in denen vermutlich auch

noch RAW-Bestandteile gebunden waren, vergleichbar zu Zellkontroll-

Reaktionsvertiefungen waren, wurden gleichzeitig zur MNV-Anzucht RAW-Zellen der

gleichen Passage ohne Infektion angezüchtet. Sobald die zur Infektion vorgesehene

Hälfte der Zellkulturflaschen infiziert wurde, wurde die andere Hälfte (Kontrollcharge)

eingefroren. Beim Coating der ELISA-Platten wurde für MNV-Antigen und RAW-

Antigen die gleiche Verdünnung mit dem Coatingbuffer gewählt.

Zur Einschätzung, ob ein Serum Antikörper gegen MNV enthält, wurde der korrigierte

OD-Wert eingeführt. Dieser ergibt sich aus der Differenz des OD-Werts der MNV-

Antigen-beschichteten Kavität zur RAW-Antigen-beschichteten Kavität. Zur

Bestimmung der Grenzwerte für die Serumbeurteilung und zur Überprüfung der

Robustheit des ELISA wurde eine Validierung durchgeführt. Die einzelnen

Messdaten sind im Anhang zu finden.

Ergebnisse

62

4.5.2.1 ELISA-Validierung

Zuerst wurde ein Positivkontroll- und ein Negativkontroll-Pool aus eindeutig in der

IFA beprobten Seren zusammengestellt. Jeder Pool wurde gründlich durchmischt,

sterilfiltriert und in kleinen Chargen bei -20° C bis zur Verwendung gelagert. Erst eine

große Menge Serum erlaubte eine Validierung in entsprechender Proben-Anzahl.

Außerdem kann anhand dieser Pools eine Orientierung bei der Herstellung von

neuen Chargen des ELISA stattfinden, um vergleichbare OD-Werte zu erhalten.

Beim alltäglichen Gebrauch des ELISA können die Pools genutzt werden, um

Abweichungen beim Anwendungsprotokoll sowie Qualitätsmängel des antigen-

beschichteten Materials aufzuzeigen.

Durch die Verwendung einer Differenz für den korrigierten OD-Wert wurden

korrigierte OD-Werte kleiner null für die Berechnung von Mittelwert und

Standardabweichung gleich null gesetzt und auf die Bildung eines

Variationskoeffizienten verzichtet.

Für die Validierung des ELISA wurden folgenden Messungen durchgeführt:

4.5.2.2 Intraserielle Präzision des Positivkontroll- und des Negativkontroll-Pools

Der Positivkontroll-Pool wurde in einem Reaktionsansatz zehnmal untersucht, der

Negativkontroll-Pool im gleichen Ansatz sechsmal. Hierbei ergab sich aus den

korrigierten OD-Werten des Positivkontroll-Pools ein Mittelwert von 2,76 bei einer

Standardabweichung von 0,07. Der Variationskoeffizient betrug 2,59%. Für den

Negativ-Kontroll-Pool betrug der Mittelwert 0,11 bei einer Standardabweichung von

0,04.

4.5.2.3 Interserielle Präzision des Positivkontroll- und des Negativkontroll-Pools

Der Positivkontroll- als auch der Negativkontroll-Pool wurden an zehn verschiedenen

Tagen als Einzelprobe getestet. Hierbei ergab sich aus den korrigierten OD-Werten

des Positivkontroll-Pools ein Mittelwert von 2,82 bei einer Standardabweichung von

Ergebnisse

63

0,1. Der Variationskoeffizient betrug 3,63%. Für den Negativ-Kontroll-Pool betrug der

Mittelwert 0,04 bei einer Standardabweichung von 0,04.

4.5.2.4 Linearität des Positivkontroll-Pools

Für die Bestimmung der Linearität wurde der Positivkontroll-Pool in den

Verdünnungsstufen 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 und 1:800 als Dreifach-

bestimmung gemessen. Die statistische Prüfung der Linearität erfolgte durch eine

Regressionsanalyse. Die Analyse ergab folgende Gleichung, die in Abbildung 12

graphisch dargestellt ist: y = 2,559 – 0,001x.

Abbildung 12: Beziehung zwischen Extinktionswert und Verdünnung mit

Regressionsgerade.

Das Bestimmtheitsmaß r² betrug 0,882, die ANOVA der Regression ergab einen

p-Wert von <0,0001.

1,4

1,6

1,8

2,2

2,4

2,6

2,8

0 1:100 1:200 1:400 1:800

2,0

Verdünnung

Extinktionswert

Ergebnisse

64

4.5.2.5 Einzelmessungen an IFA positiven und negativen Seren

Um den ELISA als Testverfahren mit der IFA zu vergleichen, wurden 68 negative und

76 positive Seren in einem Versuchsansatz mit dem ELISA getestet. Hierbei ergab

sich eine Verteilung der Messwerte, die in Abbildung 13 zu sehen ist.

65

Abbildung 13: Prozentuale Verteilung der Einzelmessungen von ausgewählten in der IFA positiven (n=76) und negativen (n=68) Mäuseseren.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

1,8

1,9

2,0

2,1

2,2

2,3

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

An

teil i

n %

OD-Wert korrigiert

Negativ

Positiv

Ergebnisse

66

Zusätzlich wurden anschließend weitere 205 Seren, die in der IFA negativ für MNV-

Antikörper beurteilt worden waren, untersucht. Hierbei ergab sich ein Spektrum für

den korrigierten OD-Wert eines MNV-negativen Serums von -0,385 bis 1,4. Die

Verteilung ist in Abbildung 14 dargestellt.

Abbildung 14: Prozentuale Verteilung der Einzel-OD-Wertbestimmung von 205 in der

IFA negativen Mäuseseren mit Hilfe des ELISA.

Anhand der Verteilung wurden folgende Grenzwerte für die hergestellte Charge

festgelegt, um eine Bewertung von Testseren zu ermöglichen:

OD korrigiert < 0 bis 1 negativ

OD korrigiert > 1 bis 1,5 fraglich

OD korrigiert > 1,5 positiv

4.6 Elektronenmikroskopische Aufnahmen

Die Aufreinigung über den CsCl-Gradienten führte nicht zu auswertbaren Grids

(Objektträger für elektronenmikroskopische Aufnahmen). Daher erfolgte wie

beschrieben eine Aufreinigung durch wiederholte Pelletierung. Verschiedene

Aufnahmen sind in Abbildung 15 zu sehen. Das Virus ist ca. 35 nm groß. In

Abbildung 15a ist die Kelchstruktur der Oberfläche auszumachen, Pfeile weisen auf

Virionen hin.

0

5

10

15

20

25

-0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,9 1 1,1 1,4

An

teil i

n %

OD-Wert korrigiert

Negativ

Ergebnisse

67

Abbildung 15: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von MNV-Virionen

(durch schwarze Pfeile gekennzeichnet).

a b

d c

Ergebnisse

68

4.7 Serologische Untersuchung von Anzeigertieren des zentralen

Tierlaboratoriums auf MNV

Um einen Überblick über die Verbreitung von MNV im ZTL zu erhalten, wurden

Seren, die im Rahmen der Jahresuntersuchung 2008 von Anzeigertieren gewonnen

worden waren, zusätzlich mittels IFA auf gegen MNV gerichtete Antikörper

untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst.

Tabelle 12: Überblick über die Verbreitung von MNV im ZTL im Jahr 2008

Haltungssystem Anzahl Tiere

positiv/getestet

Prävalenzrate (%)

Isolator 0/13 0

SPF-Zuchtbarriere 0/6 0

Experimentelle Haltungsbarriere* 121/205 59

Vergleich von zwei Tierräumen der experimentellen Haltungsbarriere,

in denen alle Mäuse getestet wurden

Raum mit offenen Käfigen 174/200 87

Raum mit Filterdeckelkäfigen 104/155 67

*enthält eine Einheit mit einzeln belüfteten Käfigsystemen - individually ventilated

cages (IVC) - mit 22/40 (55%) positiven Anzeiger-Mäusen

4.8 Infekionsversuche

1. Tierversuch

Im ersten Infektionsversuch wurden C3-Il10-/-- und B6-Il-10-/--Mäuse beider

Geschlechter infiziert. Um einen Überblick über den bisher unbekannten

Infektionsverlauf zu bekommen, wurden Sektionen nach zwei, vier und acht Wochen

durchgeführt.

Ergebnisse

69

2. Tierversuch

Im zweiten Infektionsversuch wurden C3-Il10-/-- und B6-Il-10-/--Mäuse sowie der

jeweilige Wildtyp infiziert. Folgernd aus den Daten der INFγ-Messungen des ersten

Versuchs wurden zwei Sektionstermine (zwei und vier Wochen nach Infektion)

festgelegt.

3. Tierversuch

Im dritten Infektionsversuch wurden Mäuse infiziert, um Daten des zweiten Versuchs

zu ergänzen. Außerdem wurden männliche B6-Il-10-/- - Mäuse sowie männliche und

weibliche Mäuse des zugehörigen Wildtyps infiziert und nach einer Woche seziert,

um Erkenntnisse über den Infektionsstatus (vor allem die Stimulation der

Lymphozyten) der Tiere eine Woche nach der Infektion zu bekommen. Eine

zusätzliche Tiergruppe B6-wt Weibchen wurde infiziert und nach 3, 6, 9 und 12

Tagen seziert. Durch diese Gruppe sollte Aufschluss darüber geschaffen werden, wo

und ab wann das Virus per PCR nachzuweisen ist. Daher wurde der

Mesenteriallymphknoten der Tiere für den PCR-Nachweis verwandt.

4. Tierversuch

Im vierten Infektionsversuch wurden keimfreie männliche und weibliche C3-Il10-/-

Mäuse, die aus einem Isolator des ZTL stammten, mit MNV infiziert und vier Wochen

bis zur Sektion in einem Mikroisolator gehalten. Dieser Versuch sollte zeigen, welche

Einflüsse MNV auf Tiere ohne jegliche natürliche mikrobiologische Flora hat.

5. Tierversuch

In fünften Versuch wurden C3-Il10-/-- und B6-Il-10-/--Mäuse zuerst mit MNV infiziert.

Zwei Wochen später erfolgte eine zusätzliche Infektion mit H. hepaticus. Die

Kontrolltiere wurden nur mit H. hepaticus infiziert. Mit diesem Versuch sollte ein

möglicher Einfluss der MNV-Infektion auf die spätere H. hepaticus-Infektion

untersucht werden. Die Sektion erfolgte dann sechs Wochen nach Infektion mit H.

hepaticus.

Ergebnisse

70

4.8.1 Klinik

In Tierversuch 1 bis 4 zeigten die mit MNV infizierten Mäuse bis zum Versuchsende

ein ungestörtes Allgemeinbefinden. Zu den Kontrolltieren war kein Unterschied

festzustellen. In Tierversuch 5 zeigten die Tiere bis 40 Tage nach Infektion mit H.

hepaticus keine Auffälligkeiten. Erst am Sektionstermin war sowohl bei der

Doppelinfektionsgruppe als auch bei der Kontrollgruppe ein leicht aufgekrümmter

Rücken festzustellen. Die Tiere fraßen und tranken noch.

4.8.2 Sektion

Die Sektion der Tiere aus Tierversuch 1 bis 4 ergab keinerlei makroskopische

Hinweise auf ein Infektionsgeschehen. Es bestand kein feststellbarer Unterschied zu

den Kontrolltieren. In Tierversuch 5 waren sowohl bei der Doppelinfektions- als auch

bei der Kontrollgruppe makroskopische Veränderungen feststellbar. Es handelte sich

hierbei um ein geschwollenes Kolon.

4.8.3 Serologie

Die Untersuchung der gewonnenen Seren zeigte in der Immunfluoreszenz bereits

am Tag 7 nach Infektion (Tierversuch 3) eine positive Reaktion. Ab Tag 9 p.i. lag die

Serokonversion aller mit MNV infizierten Tiere (Tierversuch 1 bis 5) bei 100 %. Die

Kontrolltiere hatten keine nachweisbaren Antikörper gegen MNV. Dies galt auch für

die Kontrolltiere, die in einem separaten Filterdeckelkäfig im Käfigregalschrank mit

den infizierten Tieren gehalten wurden.

Ergebnisse

71

4.8.4 Lymphozytenstimulation

4.8.4.1 Versuch 1

Um sicher zu gehen, dass genügend Lymphozyten für eine Stimulation aus den

Mesenteriallymphknoten der Tiere zu Verfügung standen, wurden im ersten Versuch

die Mesenteriallymphknoten nach Stamm und Geschlecht gepoolt. Die Lymphozyten

wurden sechsfach pro Pool aufgetragen. Die IFNγ-Messwerte des ersten

Infektionsversuchs sind in Abbildung 16 graphisch dargestellt. Hierbei zeigte sich,

dass B6-Il10-/--Mäuse im Allgemeinen geringere Werte in der Lymphozyten-

stimulation aufwiesen als C3-Il10-/--Mäuse; ein geschlechtlicher Unterschied

innerhalb der Stämme konnte nicht beobachtet werden. Acht Wochen nach Infektion

war kein weiterer Anstieg von IFNγ festzustellen. Die Lymphozytenstimulation der

weiblichen Kontrolltiere (C3-Il10-/-) war nicht effektiv.

Die Präparation eines einzelnen MLK lieferte genügend Lymphozyten für den

Versuchsaufbau. Um mehr verwertbare Daten bezüglich der Lymphozyten-

Stimulation zu erhalten, wurden ab dem 2. Tierversuch Einzelpräparationen der

Mesenteriallymphknoten pro Tier angefertigt, die dreifach aufgetragen wurden.

Tabelle 13: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von

Infektionsversuch 1 mit Hilfe einer einfaktoriellen ANOVA für die 4 Gruppen:

Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i., 8 Wochen p.i.

Maus-Stamm B6-Il10-/- w B6-Il10-/- m C3-Il10-/- w C3-Il10-/- m

S; p<0,0001 S; p<0,0001 NS; p=07358 S; p<0,0001

S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05

Ergebnisse

72

Tabelle 14: Posthoc-Analyse zum Vergleich der Gruppen von Infektionsversuch 1

untereinander (Bonferroni´s Multipler Vergleichstest)

Maus-Stamm B6-Il10-/- w B6-Il10-/- m C3-Il10-/- w C3-Il10-/- m

Kontrolle vs. 2 Wochen p.i.

S S NS NS


NS NS NS S


NS NS NS n.d.

2 Wochen p.i. vs. 4 Wochen p.i.

S S NS S


S S NS n.d.


NS NS NS n.d.

S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; w: weiblich; m: männlich; n.d.: nicht durchgeführt (keine Messwerte vorhanden, weil Tiere verstorben sind); vs.: versus

Abbildung 16: Infektionsversuch 1, Mittelwert und SEM der IFNγ-Sekretion der in

vitro stimulierten MLK-Zellen (Proben pro Stamm, Geschlecht und Zeitpunkt gepoolt).

Ergebnisse

73

4.8.4.2 Versuch 2

Die IFNγ-Sekretion der Darmlymphozyten aller im 2. Tierversuch mit MNV infizierten

Mäuse war zwei Wochen p.i. erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe (signifikant bei

B6-Il10-/- Mäusen und dem zugehörigen Wildtyp). Vier Wochen p.i. war die INFγ-

Sekretion im Vergleich zur Kontrollgruppe ebenfalls erhöht, signifikant jedoch nur bei

C3-Il10-/--Mäusen.



Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i.

Maus-Stamm B6-Il10-/- B6-wt C3-Il10-/- C3-wt

S; p=0,0094 S; p=0,0012 S; p=0,0221 NS; p=0,2042

S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05


untereinander (Bonferroni´s Multipler Vergleichstest)

Maus-Stamm B6-Il10-/- B6-wt C3-Il10-/- C3-wt

Kontrolle vs. 2 Wochen p.i. S S NS NS

Kontrolle vs. 4 Wochen p.i. NS NS S NS

2 Wochen vs. 4 Wochen p.i. NS S NS NS

S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; vs.: versus

Ergebnisse

74

Abbildung 17 Infektionsversuch 2, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro

stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach Geschlecht)

Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen0

1

2

3

4

5

B6-Il10-/-

INF (

ng

/ml)


1

2

3

4

5

B6-wt

INF (

ng

/ml)


5

10

15

20

25

C3-Il10-/-

INF (

ng

/ml)


5

10

15

20

25

C3-wt

INF (

ng

/ml)

Ergebnisse

75

4.8.4.3 Versuch 3

Die Werte der Lymphozytenstimulation sieben Tage nach der Infektion mit MNV

ergaben eine signifikante Erhöhung der INFγ-Sekretion für männliche B6-Il10-/-

Mäuse im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch beim Wildtyp sind die gemessenen

Werte erhöht, jedoch nicht signifikant.


Infektionsversuch 3 mit einem ungepaarten t-Test

Maus-Stamm B6-Il10-/- B6-wt

Kontrolle vs. 1 Woche p.i. S; p=0,0154 NS; p=0,1346


Abbildung 18: Infektionsversuch 3, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in

vitro stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach

Geschlecht).

Kontrolle 1 Woche Kontrolle 1 Woche0

1

2

3

4

5

B6-Il10-/-

B6-wt

INF (

ng

/ml)

Ergebnisse

76

4.8.4.4 Versuch 4

Die Auswertung der Lymphozytenstimulation aus dem 4. Tierversuch zeigte keine

signifikanten Unterschiede zwischen den keimfreien mit MNV infizierten C3-Il10-/-

Mäusen vier Wochen nach der Infektion und der zugehörigen Kontrollgruppe.



Maus-Stamm C3-Il10-/- (keimfrei)

Kontrolle vs. 4 Woche p.i. NS, p=0,8988




Geschlecht).

Kontrolle 4 Wochen0

1

2

3

4

5

Keimfreie C3-Il10-/-

INF (

ng

/ml)

Ergebnisse

77

4.8.4.5 Versuch 5

Im 5. Tierversuch wurden keine Unterschiede in der INFγ-Sekretion der mit H.

hepaticus infizierten Kontrollgruppe zur Doppelinfektionsgruppe festgestellt.

Tabelle 19 Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von


Mausstamm C3-Il10-/- B6-Il10-/-

Kontrolle (Helico) vs. Doppelinfektion (MNV+Helico)

NS, p=0,5697 NS, p=0,5155

S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; vs.: versus; Helico: H. hepaticus



Geschlecht).

Helico MNV+Helico Helico MNV+Helico0

10

20

30

40

50

60

C3-Il10-/-

B6-Il10-/-

INF (

ng

/ml)

Ergebnisse

78

4.8.5 PCR-Nachweis von MNV

Lunge, Leber, Nieren bis Tag 12 nach Infektion sowie Milzen bis Tag 28 nach

Infektion wurden per PCR negativ auf MNV getestet. Weitere Untersuchungen zu

späteren Zeitpunkten erfolgten nicht. Wie aus Tabelle 20 hervorgeht, wurde MNV im

Mesenteriallymphknoten, Darm sowie Kot bis zu acht Wochen nach Infektion

nachgewiesen. Die zugehörigen nicht infizierten Kontrolltiere wurden negativ auf

MNV getestet.

Tabelle 20: MNV-Nachweis via PCR (positiv getestet / insgesamt getestet)

Organe/Proben Tage p.i. Milz MLK Ileum Kolon Kot

3 0/4 4/4 Nicht getestet Nicht getestet 3/3

6 0/4 4/4 3/3 3/3 2/2



14 0/17 * Nicht getestet Nicht getestet 12/12

28 0/17 * 4/12 12/12 12/12

56 Nicht getestet * 4/8 4/8 4/8

*benutzt für Zytokin-Bestimmung

Ergebnisse

79

4.8.6 PCR-Nachweis von Helicobacter hepaticus

Zum Nachweis einer Infektion mit H. hepaticus wurden Kotproben der Tiere mittels

PCR untersucht. Die Ergebnisse sind Tabelle 21 zu entnehmen.

Tabelle 21: H. hepaticus-Nachweis via PCR (positiv getestet / insgesamt getestet)

positiv

Infektion mit MNV und H. hepaticus

12/12

Infektion mit H. hepaticus (Kontrollen)

9/11

Alle mit H. hepaticus infizierten Mäuse, auch die PCR-negativ getesteten Tiere,

zeigten in der Sektion typische pathologische Veränderungen, die für eine

Erkrankung der Tiere sprachen (siehe 4.8.2).

4.8.7 Histologie

Die infizierten Tiere aus Versuch 1 bis 4 zeigten kaum histologisch auswertbare

Unterschiede im Vergleich zur jeweiligen Kontrollgruppe. Nur bei mit MNV infizierten

C3-Il10-/--Mäusen waren besonders vier Wochen nach der Infektion (Tierversuch 2)

geringgradige fokale entzündliche Läsionen feststellbar (siehe Abbildung 22). In

Tierversuch 4 wurde bei den keimfreien mit MNV infizierten C3-Il10-/--Mäusen

histologisch nur die Anwesenheit einer höheren Anzahl mononukleärer Zellen im

Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt (siehe Abbildung 23). Die Auswertung von

Tierversuch 5 ergab sowohl bei der Doppelinfektions- als auch bei der Kontrollgruppe

eine hochgradige multifokale Dickdarmentzündung (siehe Abbildung 21) ohne

signifikante Unterschiede in der Score-Bewertung (siehe Tabelle 22). Es wurde

jedoch bei einigen Tieren der Doppelinfektionsgruppe ein etwas geringerer

histologischer Score-Wert ermittelt.

Ergebnisse

80

Tabelle 22: Statistische Auswertung der histologischen Scorewerte von


Mausstamm C3-Il10-/- B6-Il10-/-

Zäkum, Helico vs. MNV+Helico

NS; p=0,4105 NS; p=0,0977

Kolon, Helico vs. MNV+Helico

NS; p=0,1102 NS; p=0,3201

S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; vs.: versus; Helico: H. hepaticus

Abbildung 21: Infektionsversuch 5, Mittelwert und SEM des histologischen Score

(Jackson) von Zäkum und Kolon bei der Kontrollgruppe (Helico mit H. hepaticus

infiziert) und der Doppelinfektionsgruppe (MNV+Helico mit MNV und H. hepaticus

infiziert).


5

10

15

20

Zäkum

C3-Il10-/-

B6-Il10-/-

His

tolo

gis

ch

er

Sco

re


5

10

15

20

Kolon

C3-Il10-/-

B6-Il10-/-

His

tolo

gis

ch

er

Sco

re

81

Abbildung 22: Kolonabschnitt einer C3-Il10-/--Maus 4 Wochen p.i. mit MNV (A-C) und die zugehörige Kontrolle (D-F); HE-Färbung, der schwarze

Balken entspricht 100µm. Im Vergleich zur Kontrolle ist eine milde Hyperplasie des Epithels, ein gemischtzelliges Infiltrat in Mukosa und

Submukosa sowie ein geringgradiges Ödem festzustellen.

E

B

C

F

82

Abbildung 23: Kolonabschnitt einer keimfreien C3-Il10-/--Maus 4 Wochen p.i. mit MNV (A-D) und die zugehörige Kontrolle (E-H); HE-Färbung, der

schwarze Balken entspricht 100µm. Im Vergleich zur Kontrolle unterscheidet sich die infizierte Maus nur durch eine leicht vermehrte Anzahl

mononukleärer Zellen. Weitere Entzündungsreaktionen sind nicht feststellbar.

83

Abbildung 24: Kolonabschnitt einer B6-Il10-/--Maus infiziert mit MNV und H. hepaticus (A-D) und die zugehörige Kontrolle (E-H), nur infiziert mit

H. hepaticus; HE-Färbung, der schwarze Balken entspricht 100µm. Doppelinfektion und Kontrolle weisen eine vergleichbare mittel- bis

hochgradige transmurale, gemischtzellige Enteritis mit prominenter Hyperplasie der Enterozyten auf.

Diskussion

84

5 Diskussion

5.1 Zellkultur und Quantifizierung


et al. 2003). Es konnte gezeigt werden, dass MNV-1 in Makrophagen und

dendritischen Zellen repliziert (WOBUS et al. 2004).

An der MHH wurde MNV aus Anzeiger-Mäusen isoliert, die Kontakt zur Einstreu von

Mäusen der Quarantäneabteilung des ZTL hatten. Da die Mäuse eine schwere

kombinierte Immundefizienz hatten, wurde eine mögliche aktive bzw. persistierende

Infektion vermutet. Spätere Studien von Goto et al. untermauern eine langfristige

MNV-Ausscheidung bei Prkdcscid-Mäusen nach einer Infektion mit MNV (GOTO et al.

2009). Klinische Symptome gab es nicht. Ein Antikörpernachweis war zu diesem

Zeitpunkt nicht etabliert. Außerdem war ein serologischer Nachweis aufgrund der

Immundefizienz der Anzeiger-Mäuse ungeeignet.

Mit Hilfe von RAW 264.7-Zellen gelang eine Isolierung und Vermehrung des MNV-

Stammes. MNV-typisch trat ein starker CPE auf. Um Infektionsversuche durchführen

zu können, musste das angezüchtete Virus quantifiziert werden. Ein zuerst

durchgeführter Plaque-Test zur Virusquantifizierung ließ sich nicht auswerten, da das

Virus keine auszählbaren Löcher im Zellrasen verursachte. Daraufhin wurde ein

TCID50-Test durchgeführt, der ausgewertet werden konnte. Ungefähr zeitgleich

wurden ebenfalls Isolate beschrieben, bei denen ein Plaque-Test nicht auswertbar

war (MÜLLER et al. 2007). Nur der TCID50-Test ist geeignet für eine

Virusquantifizierung des vorliegenden Isolats. Für einen Vergleich verschiedener

Isolate sollte daher der TCID50-Test angewandt werden.

5.2 Sequenzierung

Zur Sequenzierung des MNV-Isolats wurde unter anderem der Primer 15T-aTag

eingesetzt (MÜLLER et al. 2007). Aufgrund seines Aufbaus eignet sich dieser Primer

Diskussion

85

sehr gut, um unbekannte Noroviren zu sequenzieren. Er verfügt über einen zum

Poly-Adenin-Schwanz des Virus-Genoms komplementären Anteil von 15 Thymin

kombiniert mit einer variablen Base (V=A+C+G), sowie einer zusätzliche Sequenz,

die als spätere Primerbindungsstelle („Tag“) verwendet wurde.

Das komplette Genom wurde in der Nukleotiddatenbank des NCBI unter dem Namen

Murine norovirus/Hannover1/2007/DEU mit der accession number EU854589

veröffentlicht. Ein Vergleich mittels BLAST (ALTSCHUL et al. 1990) zeigte eine hohe

Übereinstimmung mit MNV-4 (accession number FJ446719). Die Kenntnis der

genetischen Sequenz des MNV-Isolats ermöglichte dann einen Abgleich der bereits

für die Detektion entwickelten Primer, um diese an die vorliegende Sequenz

anzupassen.

5.3 Nachweisverfahren

MNV-PCR

Um MNV isolieren zu können, musste eine direkte Detektionsmethode in Form der

PCR entwickelt werden. Da unterschiedliche MNV-Isolate voneinander stark

abweichende Sequenzen haben können, wurden zuerst anhand bereits

veröffentlichter MNV-Sequenzen Primer zur Detektion entwickelt, sowie Primer aus

anderen Veröffentlichungen erprobt. Das durch die eigenen Untersuchungen

bevorzugte Primerpaar 5004f/5219r ist ohne Abweichung in der Sequenz des Isolats

vorhanden. Im Vergleich zu anderen ausgetesteten Primerpaaren war hier zwar nur

eine mittelstarke Bande zu sehen, jedoch kam es bei aufgearbeiteten Organ- und

Kotproben nicht zu einer Mehrfachbandenbildung, die für einen PCR-Nachweis

unerwünscht ist (siehe Abbildung 7 S. 55).

Da das Isolat aus der Milz einer NOD-Prkdcscid-Maus gewonnen worden war, wurden

im Tierversuch auch die Milzen der infizierten Mäuse entnommen und per PCR auf

das Vorhandensein von MNV-RNA getestet. Hierbei stellte sich heraus, dass alle

Milzen negativ getestet wurden. Es konnte jedoch Erreger-RNA im

Gastrointestinaltrakt der Mäuse nachgewiesen werden. Dies bestätigt die

Diskussion

86

Untersuchungsergebnisse von Goto et al. (GOTO et al. 2009). Auch acht Wochen

nach der Infektion war im Kot der Mäuse noch MNV-RNA nachzuweisen, bei Paik et

al. wurde zehn Wochen p.i. MNV-RNA im Kot nachgewiesen (PAIK et al. 2010). Der

RNA-Nachweis lässt jedoch nicht unbedingt eine Aussage über die Infektiösität zu

(MÜLLER 2009).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich Mäusekot gut für einen Erregernachweis

eignet. Die Mäuse müssen nicht getötet werden. Häufig setzen sie bei einer

Fixierung Kot ab. Dies bedeutet relativ wenig Stress im Vergleich zu einer

Blutentnahme für einen serologischen Nachweis. Bisher wurde aufgrund der

genetischen Variabilität bei murinen Noroviren allerdings kein Universalprimerpaar

zum Nachweis verschiedener bekannter muriner Norovirusstämme gefunden. Es

müssen also mehrere Primerpaare verwandt werden. Ein PCR-Nachweis ist daher

eher für die Überwachung eines Infektionsversuchs mit murinem Norovirus

bekannter Sequenz geeignet (HENDERSON 2008). Im Rahmen dieser Doktorarbeit

kam der PCR-Nachweis zum Einsatz, um die Virusverteilung im Tier und die Dauer

der Ausscheidung zu bestimmen. Das Zäkum wurde im Rahmen der Versuche

immer komplett für die Histologie entnommen. Es sollte bei zukünftigen Versuchen

beprobt werden, da Goto et al. Kot und Zäkum für den PCR-Nachweis von MNV

empfehlen (GOTO et al. 2009).

Serologische Nachweisverfahren

Für den Nachweis einer Infektion mit MNV wurde mit Hilfe des isolierten MNV-

Stammes im Rahmen der Dissertation ein serologisches Testverfahren in Form eines

ELISA entwickelt. Aufgrund der serologischen Kreuzreaktivität verschiedener MNV-

Isolate (HSU et al. 2006; THACKRAY et al. 2007) eignet sich der serologische Test

sehr gut für die Routine-Untersuchung auf eine Infektion mit MNV. Zu beachten ist

beim serologischen Nachweis, ob die Maus in der Lage ist, Antikörper zu bilden, und

ob die Infektion lange genug zurückliegt, dass bereits Antikörper gebildet wurden.

Humane Noroviren haben im Gegensatz zu MNV verschiedene Serotypen. Hinzu

Diskussion

87

kommt eine hohe Durchseuchung beim Menschen, was den serologischen Nachweis

in der Humandiagnostik weniger sinnvoll erscheinen lässt.

MNV-IFA (entwickelt durch die Firma Biodoc)

Die Herstellung der Objektträger, die mit MNV infizierten Zellen beschichtet sind,

erfolgte technisch angelehnt an Kraft und Meyer. (KRAFT u. MEYER 1990).

Dadurch, dass die Auswertung durch einen Untersucher am Mikroskop durchgeführt

wird, können hier Seren mit hohem unspezifischen Hintergrund erkannt werden.

Auch Seren mit niedrigem Titer können durch den Untersucher anhand der typischen

Markierung infizierter Zellen erkannt werden. Oft werden in Veröffentlichungen

positive Befunde aus ELISA und MFI mit der IFA bestätigt bzw. validiert (HSU et al.

2005).

MNV-ELISA

Der ELISA ermöglicht die automatisierte und quantitative Auswertung, da hier mit

einem Photometer der OD-Wert bestimmt wird. Anfangs wichen die Ergebnisse des

im Rahmen dieser Dissertation entwickelten ELISA teilweise von den Ergebnissen

der Immunfluoreszenz ab. Einige Mäuse, die eindeutig negativ in der

Immunfluoreszenz auf MNV getestet wurden, reagierten im MNV-ELISA positiv. Ein

kommerzieller rekombinanter ELISA, hergestellt zu wissenschaftlichen Zwecken

durch Charles River Laboratories, reagierte ebenfalls negativ. Dies sprach für eine

unspezifische Reaktion aufgrund von ungenügender Aufreinigung des Virusantigens.

Eine zusätzliche Aufreinigung über einen CsCl-Gradienten, wie sie in diversen

Veröffentlichungen beschrieben war (HSU et al. 2005), führte nicht zu besseren

Ergebnissen. Daraufhin wurde untersucht, ob die besagten Seren auch mit

Bestandteilen der für die Virusanzucht verwendeten RAW-Zellen reagierten, da es

sich bei der Zelllinie um Maus-Makrophagen handelt. Die Zellen wurden in der

Zellkultur angezüchtet und nicht infiziert. Es erfolgte der gleiche

Aufreinigungsprozess, der zur MNV-Antigenaufreinigung angewandt wurde.

Anschließend wurden Untersuchungskavitäten beschichtet. Wurden nun die IFA-

negativen Seren getestet, so reagierten einige Seren mit einer deutlichen Erhöhung

Diskussion

88

des OD-Werts. Die „falsch“ positiven Seren reagierten also auf einen Bestandteil der

Zellkultur. Andere Veröffentlichungen haben diese unerwünschte Reaktion bisher

nicht beschrieben.

Um falsch positive Seren zu erkennen, wurde daraufhin eine Zellkontrolle dauerhaft

eingeführt. Damit die Kontrollzellkultur vergleichbar zu den infizierten Zellkulturen

war, wurden beide Zellkulturen (nicht infiziert und infiziert mit MNV) parallel möglichst

gleich behandelt inklusive der Aufreinigung. Bewertet für die diagnostische Aussage

wurde die Differenz aus MNV-OD-Wert und RAW-OD-Wert. Durch Einführung des

korrigierten OD-Werts wurde eine hohe Übereinstimmung zu den Testergebnissen

der IFA erreicht. Um falsch positive Ergebnisse zu reduzieren, wurde auch ein

fraglicher Bereich definiert. Im Idealfall ergab der Differenzwert bei einem MNV-

negativen Serum den Wert 0, bei einem MNV-positiven Serum einen Wert >0, der

abhängig von der Verdünnung des Antigens bei der Beschichtung der ELISA-Platte

und dem Antikörpertiter des Serums war.

Um bei der Beschichtung für eine größtmögliche Konstanz zu sorgen, wurde ein

positiver Kontrollserumpool angelegt, aliquotiert und eingefroren. Bei der Erstellung

einer neuen Charge ELISA-Platten sollten ähnliche OD-Werte erreicht werden, wenn

der positive Kontrollserumpool aufgetragen wurde. Der positive Kontrollserumpool

wurde außerdem für die Validierung eingesetzt und als Positivkontrolle bei ELISA-

Tests mitgeführt. Bei korrigierten OD-Werten, die im fraglichen Bereich zwischen 1

bis 1,5 lagen, sollte der OD-Wert der Zellkontrolle getrennt beurteilt werden. Fand

hier eine starke Reaktion (hoher OD-Wert) statt, so konnte von einer unspezifischen

Reaktion ausgegangen werden, die durch nicht gegen MNV gerichtete Antikörper

hervorgerufen wurde. War der korrigierte OD-Wert im fraglichen Bereich, der OD-

Wert der Zellkontrolle jedoch niedrig, so konnte es sich um ein Serum mit

schwachem Antikörpertiter gegen MNV handeln. Es empfahl sich die erneute

Untersuchung des Serums mit einem anderen Testverfahren (z. B. IFA) oder eine

erneute Blutabnahme zur Serumgewinnung, um dieses dann mit dem ELISA zu

testen.

Diskussion

89

5.4 Prävalenz

Mit Hilfe der serologischen Testverfahren wurde das Vorkommen von MNV in

verschiedenen Hygieneeinheiten im ZTL untersucht. Hierbei zeigte sich in der

experimentellen Barriere eine hohe Prävalenz für MNV, die weltweit in vielen

Versuchstierhaltungen festgestellt wurde (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETT-

CORNING et al. 2009). Dagegen waren Zuchttiere aus Isolatoren und SPF-Haltung

MNV-negativ. Die Art der Haltung der Mäuse hatte also einen großen Einfluss auf

das Vorhandensein von MNV-Antikörpern. Dieses Ergebnis lässt sich einerseits

durch eine bereits erfolgte Sanierung von anderen Erregern durch Embryotransfer

und Hysterektomie in der Vergangenheit, sowie andererseits durch die strengen

Hygiene-Auflagen erklären (HENDERSON 2008). In der experimentellen Haltung

sind die Hygiene-Auflagen für Pflegepersonal und Experimentatoren weniger streng

gefasst und überwacht. Hier werden nach Quarantänisierung und Freigabe durch

das mikrobiologische Labor des ZTL auch importierte Tiere gehalten. Die

Prävalenzdaten wurden erfasst, bevor MNV als Problem erkannt wurde.

Werden die Tiere ohne Filterdeckel gehalten, kann sich MNV über kontaminierte

Einstreu noch besser in einem Haltungsraum verbreiten. Dies lässt sich aus dem

Vergleich der Prävalenz der Haltung im offenen Käfig (87%) zur Haltung im

Filterdeckelkäfig (67%) schließen. Eine nochmals niedrige Prävalenz (55%) weist die

Haltung im IVC-Regal auf. Durch die getrennte Belüftung jedes einzelnen Käfigs

kann eine Übertragung über die Zuluft von Käfig zu Käfig verhindert werden. Gerät

der Erreger jedoch beim Experiment oder Umsetzen in den Käfig, so kann von einer

hohen Infektionsrate ausgegangen werden. Nach der Infektion im Tierversuch war

eine Serokonversion bei allen infizierten Tieren festzustellen.

Ein separater Filterdeckelkäfig mit nicht infizierten Kontrolltieren stand zusammen mit

den Filterdeckelkäfigen der infizierten Tiere im gleichen belüfteten Käfigschrank. Die

Haltung in einem Filterdeckelkäfig kombiniert mit der richtigen Reihenfolge der

Tierbetreuung (nicht infizierte Käfige zuerst versorgen) sowie dem Käfigwechsel

unter einer Sicherheitswerkbank haben bei oben genanntem Käfig mit Kontrolltieren

Diskussion

90

erfolgreich eine Kontamination mit MNV verhindert. Sowohl PCR- als auch Serologie-

Diagnostik für MNV waren bei diesen Mäusen negativ.

5.5 MNV im Tierversuch

Bei den immunkompetenten Mäusen, die im Rahmen dieser Dissertation untersucht

wurden, war die Infektion mit dem isolierten MNV-Stamm zu den untersuchten

Zeitpunkten auf den Magen-Darm-Trakt beschränkt. Die Infektion mit dem isolierten

MNV-Stamm führte zu einer verstärkten IFNγ-Sekretion der T-Zellen der infizierten

Mäuse (SPF-Haltung), wenn diese in vitro stimuliert wurden, auch im subakuten

Infektionsstadium 4 Wochen p.i. Die histologische Auswertung zeigte eine

geringfügige Erhöhung des Histologie-Scorewerts auf. So wurde bei einigen C3-

Il10-/--Mäusen 4 Wochen nach der Infektion eine milde Hyperplasie des Epithels, ein

gemischtzelliges Entzündungszell-Infiltrat in Mukosa und Submukosa sowie ein

geringgradiges Ödem festgestellt. Der isolierte MNV-Stamm kann daher einen

kolitogenen Stimulus auf die IL10-defiziente Maus haben. Diese Beobachtungen

(veränderte Histologie und gesteigerte IFNγ-Sekretion) wurden vor allem bei Mäusen

mit dem genetischen Hintergrundstamm C3H/HeJBir gemacht.

Im Infektionsversuch mit keimfreien C3-Il10-/--Mäusen gab es keinen signifikanten

Unterschied bei der Messung der IFNγ-Sekretion zwischen infizierten und nicht

infizierten Mäusen. Histologisch war lediglich eine leicht vermehrte Anzahl

mononukleärer Zellen festzustellen, die für eine Aktivierung der intestinalen

Immunantwort steht. Hieraus lässt sich schlussfolgern, dass murine Noroviren nur in

Kombination mit einer aktiven Darmflora eine verstärkte IFNγ-Sekretion und

histologische Veränderungen hervorrufen.

Die Tötung der keimfreien Mäuse zur Organentnahme für die Histologie sowie zur

Gewinnung von Lymphozyten zur Stimulation wurde 4 Wochen p.i. durchgeführt. In

vorhergehenden Versuchen mit SPF-Mäusen war eine Erhöhung der IFNγ-Sekretion

nach 2 und 4 Wochen gemessen worden. Daher wurde der Zeitpunkt für die Sektion

Diskussion

91

4 Wochen nach der Infektion gewählt. Veränderungen zu einem früheren Zeitpunkt

p.i. können nicht ausgeschlossen werden.

Der Doppelinfektionsversuch zeigte, dass eine vorhergehende Infektion mit MNV

eine 14 Tage später folgende Infektion mit H. hepaticus nicht verstärkte. Anhand der

Befunde der Lymphozytenstimulation aus dem zweiten Infektionsversuch wurde der

Infektionstermin mit H. hepaticus 2 Wochen nach der Infektion mit MNV festgesetzt.

Die histologische Auswertung zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen

Doppelinfektion und Kontrollgruppe, jedoch war der Histologie-Score bei einigen

Mäusen aus der Doppelinfektionsgruppe etwas geringer. Dies könnte für einen leicht

protektiven Effekt der MNV-Infektion sprechen. Dieser ließe sich erklären durch eine

Abschwächung der Immunantwort auf H. hepaticus durch MNV. Da das Virus

antigenpräsentierende Makrophagen befällt und zerstört, könnte die überschießende

Immunreaktion gegen H. hepaticus herabgesetzt sein. Diese Ergebnisse stehen im

Gegensatz zu einer Veröffentlichung von Lencioni et al. (LENCIONI et al. 2008). Hier

wurden jedoch ein anderes Mausmodell (MDR1α-defiziente Maus), ein anderer

Infektionszeitpunkt, ein anderes Norovirus (MNV-4) und eine andere Helicobacter-Art

gewählt. Die Infektion mit H. bilis erfolgte 7 Tage nach der Infektion mit MNV. Die

Tötung der Tiere mit anschließender Sektion erfolgte bei Lencioni et al. variabel nach

Schweregrad der klinischen Symptome.

5.6 Ausblick

Die problemlose Anzucht von MNV ermöglicht neue Erkenntnisse zur Tenazität des

Erregers, was gerade im Bereich Hygieneforschung genutzt werden kann, um gegen

humane Noroviren wirksame Desinfektionsmittel und Hygienestrategien zu

entwickeln (CANNON et al. 2006).

Im Zellkulturmodell lassen sich Pathomechanismen ergründen, wie Noroviren Zellen

schädigen und sich in ihnen vermehren. Dies ermöglicht unter Umständen die

Entwicklung einer Impfung oder Akut-Therapie gegen humane Noroviren. Erste

Diskussion

92

Antikörper wurden durch Müller et al. auf Kreuzreaktivität und Effizienz erprobt

(MÜLLER 2009).

MNV in der Labortierhaltung

Die serologischen Testverfahren ermöglichen eine Routine-Überwachung der

Hygiene in Labortierhaltungen aufgrund der vorhandenen serologischen

Kreuzreaktivität bei verschiedenen murinen Noroviren (HSU et al. 2006). Der

Nachweis per PCR ist möglich, jedoch gibt es bisher kein Primerpaar, mit dem alle

murinen Noroviren detektiert werden können. Dies sollte bei Hygieneuntersuchungen

bedacht werden. Ein negatives PCR-Ergebnis muss nicht zwangsläufig für einen

negativen Bestand stehen (HENDERSON 2008).

MNV hat in der vorliegenden Arbeit keine klinischen Auswirkungen auf das

Tiermodell der IL10-defizienten Maus gehabt. Jedoch kann zum Beispiel eine akute

MNV-Infektion bei IL10-defizienten Mäusen im Tierversuch zu falschen

Vergleichswerten bei einer in vitro Lymphozytenstimulation in der INFγ-Bestimmung

führen. Auch leichte histologische Veränderungen sind möglich. Diese Effekte

können Ergebnisse in Versuchen mit der IL10-defizienten Maus als Tiermodell für

CED verändern. Ein Einfluss von MNV auf andere Mausmodelle kann nicht

ausgeschlossen werden. Weitere Untersuchungen hierzu sind empfehlenswert und

notwendig. Es wurden zudem MNV-Isolate mit unterschiedlichen Eigenschaften

beschrieben. So kann MNV-1 bei schwer immundefizienten Mäusen (RAG2- und

STAT1-defizient) zu tödlichen systemischen Erkrankungen führen (KARST et al.

2003).

Da eine Diagnostik im Rahmen der Routine-Überwachung möglich ist, sollte MNV

daher im Tierbestand langfristig ausgeschlossen werden. Hygienemaßnahmen und

Standardmethoden der Bestandssanierung haben Erfolg gezeigt (ARTWOHL et al.

2008; COMPTON 2008).

Zusammenfassung

93

6 Zusammenfassung

Marcel Achard

„Charakterisierung eines murinen Norovirus – Auswirkungen des Virus auf die

experimentelle chronisch entzündliche Darmerkrankung bei der IL10-defizienten

Maus“

Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein murines Norovirus (MNV), das aus

Anzeiger-Mäusen des Zentralen Tierlaboratoriums (ZTL) der Medizinischen

Hochschule Hannover (MHH) isoliert wurde, charakterisiert. Die genetische Sequenz

wurde bestimmt und wies eine 95% Übereinstimmung zu MNV-4 auf. Sie wurde

unter der Zugangsnummer EU854589 veröffentlicht. Zusätzlich wurden

elektronenmikroskopische Aufnahmen der Virusstruktur erstellt.

Die erfolgreiche Anzucht und Vermehrung von MNV in RAW 264.7-Zellen

ermöglichte die Etablierung diagnostischer Tests in Form von PCR und Serologie

(ELISA). Mit Hilfe der serologischen Diagnostik wurde die Prävalenz für MNV im

Zentralen Tierlaboratorium der MHH für den Überwachungszeitraum 2007/2008

erfasst. MNV-positive Anzeiger-Mäuse wurden nur in der experimentellen Barriere

gefunden. Die Prävalenzrate bewegte sich je nach Tierraum zwischen 8% und 61%.

Die Auswirkung von MNV auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus (Il10-/-)

wurde anhand von zwei genetischen Hintergrundstämmen, C3H/HeJBirZtm (C3)

sowie C57BL/6JZtm (B6), im Infektionsversuch untersucht. Alle infizierten Mäuse

wiesen eine Serokonversion auf. Es kam zu keiner klinischen Beeinträchtigung. MNV

war bei den infizierten Mäusen nur in Organen des Gastrointestinaltraktes per PCR

nachweisbar. Kot, Kolon und Mesenteriallymphknoten waren als Probenmaterial

besonders geeignet für einen PCR-Erregernachweis.

Zusammenfassung

94

Es konnten keine schwerwiegenden histologischen Veränderungen im Vergleich zu

nicht mit MNV infizierten Kontrollmäusen ausgemacht werden. Bei einigen mit MNV

infizierten C3-Il10-/--Mäusen wurden jedoch sehr milde fokale entzündliche

Veränderungen im Kolon festgestellt. Die Interferon (INF)γ-Sekretion in vitro

stimulierter Darmlymphozyten von mit MNV infizierten Mäusen war 2 Wochen nach

der Infektion erhöht im Vergleich zur nicht infizierten Kontrollgruppe. Bei infizierten

C3-Il10-/--Mäusen war die IFNγ-Sekretion 4 Wochen nach der Infektion weiterhin

erhöht.

Keimfrei gehaltene C3-Il10-/--Mäuse, die mit MNV infiziert wurden, wiesen 4 Wochen

nach der Infektion keine entzündlichen histologischen Veränderungen oder eine

gesteigerte IFNγ-Sekretion auf. Demnach kann MNV nur in Verbindung mit einer

endogenen bakteriellen Darmflora einen kolitogenen Stimulus erzeugen.

Ein Doppelinfektionsversuch mit MNV und 14 Tage später mit Helicobacter (H.)

hepaticus sollte zeigen, ob eine vorhergehende Infektion mit MNV eine entzündliche

Darmerkrankung, ausgelöst durch H. hepaticus, verstärken kann. Die Kontrollgruppe

wurde nur mit H. hepaticus infiziert. Alle Mäuse wurden 6 Wochen nach der Infektion

mit H. hepaticus seziert. Die Befunde der Klinik, Histologie und IFNγ-Sekretion

wiesen keine deutlichen Unterschiede auf. Hieraus lässt sich folgern, dass MNV die

Entwicklung einer durch H. hepaticus hervorgerufenen Entzündung bei der IL10-

defizienten Maus nicht verstärkt. Dennoch zeigen die vorhergehenden Versuche,

dass die Interaktion von MNV mit einer endogenen apathogenen Darmflora bei der

IL10-defizienten Maus zu einer milden Entzündungsreaktion im Darm führen kann.

Dies macht MNV zu einem nicht zu vernachlässigenden Faktor im Tierversuch.

Summary

95

7 Summary

Marcel Achard

“Characterization of a murine norovirus – the impact of the virus on experimental

inflammatory bowel disease in IL10-deficient mice”

Aim of this study was to characterize a murine norovirus (MNV) that was isolated

from sentinel-mice of the Central Animal Facility (Ztm) at Hannover Medical School.

Genetic sequencing was performed and showed 95% identity with MNV-4. The

sequence was published under the accession number EU85489. Additionally, the

virus structure of MNV was depicted by electron microscopy.

The successful replication of MNV in RAW 264.7-cells allowed us to establish several

diagnostic tests as PCR and serology (ELISA). Therefore, it was possible to

determine the prevalence of MNV at the Ztm for the years of 2007 and 2008. MNV-

positive mice were only found in the experimental barrier. Prevalence among animal

rooms differed from 8% to 61%.

In order to analyse the influence of MNV on IL10-defficient mice (Il10-/-), Il10-/- mice

on genetic background strains C3H/HeJBirZtm (C3) and C57BL/6JZtm (B6) were

experimentally infected. Although seroconversion could be detected in all infected

animals, no clinical effects were visible. The detection of MNV in infected mice was

solely possible in organs of the gastro-intestinal tract. Faeces, colon and mesenteric

lymph nodes were suitable material for the detection of MNV via PCR.

Histological examinations of MNV-positive mice did not show grave differences in

comparison to control mice. Nevertheless, few individuals belonging to the C3-Il10-/-

group showed mild focal inflammations of the colon. In vitro stimulated intestinal

lymphocytes of MNV-positive mice secreted significantly more interferon (IFN)γ two

Summary

96

weeks post infection (p.i.) than those of the control group. Infected animals belonging

to the C3-Il10-/- group showed an increased IFNγ-secretion up to four weeks p.i.

Sterile housed C3-Il10-/--mice that were infected with MNV neither showed

inflammatory changes of the colon nor an increased secretion of IFN-γ four weeks

p.i. Therefore, MNV is only able to induce a colitogenic stimulus in combination with

an endogenous bacterial intestinal flora.

A dual infection experiment with MNV and Helicobacter (H.) hepaticus (14 days

subsequent to the MNV infection) was intended to clarify the question, whether a

preceding infection with MNV aggravates inflammatory diseases of the bowel. A

control group was only infected with H. hepaticus. All mice were sacrificed six weeks

p.i. with H. hepaticus. No obvious differences in clinical signs, intestinal pathology or

INFγ secretion were observed. Therefore, it is suggested that MNV does not

exacerbate inflammatory diseases resulting from a H. hepaticus infection in IL10-

deficient mice. Nevertheless, the preceding experiments demonstrate the interaction

of MNV with the endogenous, non-pathogenic intestinal flora in IL10-deficient mice.

Thus, an infection with MNV should be considered as a confounding variable in

animal experimentation using mouse models.

Anhang

97

8 Anhang

Protokoll zur Isolation von RNA aus Zellkulturüberstand bzw. Organen (gemäß

Hersteller Macherey-Nagel)

1) Bis zu 30 mg Gewebe werden zerkleinert bzw. homogenisiert und in ein

steriles Eppendorfgefäß gegeben; bei Zellkulturüberstand ist dieser Schritt

nicht nötig.

2) 350 µl RA1-Puffer und 3,5 µl ß-Mercaptoethanol werden hinzugegeben;

anschließend wird die Probe für 1 min gevortext.

3) Ein NucleoSpin®- Filter wird in ein Sammelröhrchen gesteckt;

anschließend wird die Probe auf den Filter aufgetragen und für 1 min bei

11000 x g zentrifugiert.

4) Der NucleoSpin®- Filter wird verworfen, zum Filtrat werden 350 µl 70%

Ethanol gegeben.

5) Nach mehrmaligem Durchmischen mit der Pipette wird das Lysat auf eine

NucleoSpin® RNA II-Säule gegeben und für 30 s bei 11000 x g

zentrifugiert.

6) Das Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in ein neues

Sammelröhrchen gestellt. 350 µl Membrane Desalting Buffer werden auf

die Säule gegeben, dann wird für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert.

7) 95 µl vorbereitete DNase-Reaktionsmixtur werden auf die Säule gegeben,

danach erfolgt eine 15 minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

8) Ein erster Waschschritt erfolgt mit 200 µl RA2-Puffer, der auf die Säule

gegeben wird. Dann wird für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. Die Säule wird

in ein neues Sammelröhrchen gesetzt. Ein zweiter Waschschritt erfolgt mit

600 µl RA3-Puffer für 30 s bei 11000 x g. Die Flüssigkeit im

Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in das Sammelröhrchen

zurückgestellt. Ein dritter Waschschritt erfolgt mit 250 µl RA3-Puffer für 2

min bei 11000 x g. Anschließend wird die Säule in ein nukleasefreies

Sammelröhrchen gesetzt.

Anhang

98

9) Zum Abschluss wird die RNA mit 40 – 60 µl RNase-freiem Wasser eluiert,

das auf die Säule gegeben wird. Es erfolgt ein letzter Zentrifugationsschritt

bei 11000 x g für 1 min.

Anhang

99

Protokoll zur Isolation von RNA aus Kot (gemäß Hersteller Macherey-Nagel,

modifiziert durch Kunden)

1) Zur Kotprobe werden 350 µl des vorbereiteten ß-Mercaptoethanol-RA1

gegeben.

2) Anschließend wird die das Gemisch für 2 min gevortext.

3) Ein NucleoSpin®- Filter wird in ein Sammelröhrchen gesteckt;

anschließend wird das Gemisch auf den Filter aufgetragen und für 1 min

bei 11000 x g zentrifugiert.

4) Der Überstand wird in ein neues Gefäß überführt, das sichtbare Pellet

verworfen.

5) Zum Überstand werden 350 µl 70% Ethanol gegeben.

6) Nach einer Inkubation von 5 min wird das Gemisch nach mehrmaligem

Durchmischen mit der Pipette auf eine NucleoSpin® RNA II-Säule

aufgetragen und für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert.

7) Das Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in ein neues

Sammelröhrchen gestellt. 350 µl Membrane Desalting Buffer werden auf

die Säule gegeben, dann wird für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert.

8) 95 µl vorbereitete DNase-Reaktionsmixtur werden auf die Säule gegeben,

danach erfolgt eine 15 minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

9) Ein erster Waschschritt erfolgt mit 200 µl RA2-Puffer, der auf die Säule

gegeben wird. Dann wird für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. Die Säule wird

in ein neues Sammelröhrchen gesetzt.Ein zweiter Waschschritt erfolgt mit

600 µl RA3-Puffer für 30 s bei 11000 x g. Die Flüssigkeit im

Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in das Sammelröhrchen

zurückgestellt.Ein dritter Waschschritt erfolgt mit 250 µl RA3-Puffer für 2

min bei 11000 x g. Anschließend wird die Säule in ein nukleasefreies

Sammelröhrchen gesetzt.

10) Zum Abschluss wird die RNA mit 40 – 60 µl RNase-freiem Wasser eluiert,

das auf die Säule gegeben wird. Es erfolgt ein letzter Zentrifugationsschritt

bei 11000 x g für 1 min.

Anhang

100

Rohdaten ELISA-Messung

Intraseriell

Serumpool OD MNV OD RAW OD korrigiert MW SD

+ 3,474 0,773 2,701 + 3,348 0,717 2,631 + 3,505 0,69 2,815 + 3,475 0,681 2,794 + 3,524 0,738 2,786 + 3,535 0,806 2,729 + 3,524 0,713 2,811 + 3,492 0,739 2,753 + 3,44 0,726 2,714 + 3,593 0,709 2,884 2,7618 0,071530568

- 0,673 0,591 0,082 - 0,651 0,523 0,128 - 0,757 0,607 0,15 - 0,752 0,592 0,16 - 0,677 0,612 0,065 - 0,7 0,609 0,091 0,11266667 0,03886215

+: MNV-positiv; -: MNV-negativ

Interseriell

Positivserumpool

Tag OD MNV OD RAW OD korrigiert MW SD

1 3,601 0,714 2,887 2 3,671 0,843 2,828 3 3,52 0,706 2,814 4 3,72 0,776 2,944 5 3,737 0,905 2,832 6 3,627 0,8 2,827 7 3,801 0,949 2,852 8 3,594 0,67 2,924 9 3,836 1,133 2,703 10 3,559 0,96 2,599 2,821 0,10247927

Anhang

101

Negativserumpool

Tag OD MNV OD RAW OD korrigiert MW SD

1 0,691 0,612 0,079

2 0,613 0,658 -0,045

3 0,705 0,653 0,052

4 0,809 0,732 0,077

5 0,638 0,656 -0,018

6 0,784 0,773 0,011

7 0,725 0,617 0,108

8 0,503 0,521 -0,018

9 0,726 0,759 -0,033

10 0,903 0,812 0,091 0,0304 0,05721344

Linearität

Serumverdünnung OD MNV OD RAW OD korrigiert MW SD

1:25 3,495 0,874 2,621

3,527 0,885 2,642

3,4 0,938 2,462 2,575 0,09842256

1:50 2,946 0,721 2,225

3,318 0,76 2,558

3,438 0,876 2,562 2,44833333 0,19342268

1:100 2,741 0,527 2,214

3,077 0,534 2,543

3,129 0,549 2,58 2,44566667 0,20148035

1:200 2,74 0,415 2,325

2,624 0,389 2,235

2,647 0,409 2,238 2,266 0,05111751

1:400 2,149 0,332 1,817

2,592 0,321 2,271

2,327 0,335 1,992 2,02666667 0,22897671

1:800 1,826 0,248 1,578

1,725 0,244 1,481

1,693 0,237 1,456 1,505 0,06444377

Anhang

102

Einzelmessungen

Negativ-Seren N=68

Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert

Prozentualer Anteil (von 68 negativen Seren)

11146 - 3,032 3,375 -0,34 4,41

8428 - 1,56 1,883 -0,32 4050 - 2,122 2,434 -0,31 8422 - 0,167 0,402 -0,24 8,82

4053 - 2,146 2,369 -0,22 4052 - 0,414 0,592 -0,18 8423 - 0,207 0,359 -0,15 11144 - 1,171 1,32 -0,15 8418 - 0,235 0,383 -0,15 11145 - 0,478 0,606 -0,13 32,35

4054 - 0,386 0,512 -0,13 8426 - 0,172 0,297 -0,13 11143 - 0,322 0,425 -0,10 4057 - 0,278 0,375 -0,10 8431 - 2,744 2,841 -0,10 4051 - 0,379 0,468 -0,09 4058 - 0,491 0,577 -0,09 10096 - 0,296 0,38 -0,08 4049 - 0,54 0,623 -0,08 11153 - 0,257 0,336 -0,08 4059 - 0,386 0,463 -0,08 11161 - 1,432 1,503 -0,07 10095 - 0,218 0,287 -0,07 8427 - 0,2 0,265 -0,07 11158 - 0,274 0,336 -0,06 8420 - 0,164 0,222 -0,06 11156 - 0,236 0,288 -0,05 10098 - 0,298 0,35 -0,05 10089 - 0,331 0,382 -0,05 10093 - 0,287 0,334 -0,05 8430 - 0,178 0,223 -0,05 8421 - 0,23 0,273 -0,04 42,64

10097 - 0,303 0,345 -0,04 8425 - 0,154 0,187 -0,03 4055 - 0,381 0,414 -0,03 8419 - 0,272 0,305 -0,03 8429 - 0,175 0,203 -0,03 11149 - 0,235 0,26 -0,03 4769 - 0,456 0,481 -0,03 10088 - 0,372 0,395 -0,02 11150 - 0,226 0,244 -0,02 4048 - 0,411 0,423 -0,01 4056 - 0,393 0,403 -0,01 8424 - 0,185 0,194 -0,01 11147 - 0,212 0,221 -0,01

Anhang

103

Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert Prozentualer Anteil

(von 68 negativen Seren)

10083 - 0,577 0,586 -0,01 10099 - 0,265 0,273 -0,01 11152 - 0,26 0,267 -0,01 10084 - 0,258 0,26 0,00 10092 - 0,31 0,305 0,01 11155 - 0,146 0,126 0,02 10090 - 0,31 0,286 0,02 11151 - 0,324 0,298 0,03 10087 - 0,212 0,181 0,03 10086 - 0,611 0,578 0,03 11159 - 0,214 0,18 0,03 11154 - 0,296 0,26 0,04 10081 - 0,267 0,23 0,04 11160 - 0,217 0,177 0,04 10082 - 0,228 0,186 0,04 10085 - 0,303 0,253 0,05 11148 - 0,312 0,255 0,06 10100 - 0,319 0,231 0,09 4771 - 0,525 0,433 0,09 11157 - 1,54 1,441 0,10 1,47

10094 - 1,306 1,155 0,15 4,41

10091 - 0,822 0,653 0,17 4770 - 0,535 0,324 0,21

Anhang

104

Positiv-Seren N=76

Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert

Prozentualer Anteil (von 76 positiven Seren)

8338 +/- EL + 1,509 0,447 1,06 1,32

4131 + 1,824 0,608 1,22 1,32

10180 NSR EL+ 3,347 2,087 1,26 1,32

4454 +++ 2,26 0,828 1,43 2,63

10176 NSR EL+ 2,861 1,428 1,43 10181 NSR EL+ 3,313 1,83 1,48 3,95

4130 ++ 2,126 0,611 1,52 8725 ++ 3,348 1,812 1,54 8727 + 2,356 0,767 1,59 2,63

8344 + 2,188 0,578 1,61 4125 ++ 2,257 0,611 1,65 3,95

4453 + 2,41 0,683 1,73 8339 + 2,336 0,6 1,74 10173 +++ 2,66 0,879 1,78 6,58

8666 + 2,16 0,369 1,79 4451 ++ 2,884 1,061 1,82 8658 + 3,502 1,675 1,83 4126 ++ 2,641 0,781 1,86 4127 + 2,373 0,476 1,90 3,95

8718 ++ 3,019 1,099 1,92 4132 ++ 2,563 0,625 1,94 8723 + 2,487 0,525 1,96 3,95

8343 +++ 2,993 1,017 1,98 8676 ++ 3,073 1,057 2,02 4450 +++ 3,473 1,407 2,07 5,26

10191 + 3,339 1,259 2,08 4124 ++ 2,812 0,725 2,09 10174 ++ 2,723 0,596 2,13 8711 ++ 2,807 0,638 2,17 5,26

8677 ++ 2,882 0,71 2,17 10172 NSR EL+ 3,547 1,344 2,20 8648 + 3,119 0,913 2,21 8341 + 2,597 0,348 2,25 11,84

10178 + 2,851 0,593 2,26 8674 ++ 3,38 1,115 2,27 8675 + 3,283 1,007 2,28 4129 +++ 3,092 0,808 2,28 MAG03 +++ 2,675 0,386 2,29 8724 + 2,549 0,23 2,32 8669 +++ 3,342 1,021 2,32 MAG02 ++ 2,912 0,569 2,34 10175 +++ 3,122 0,776 2,35 15,79

8679 + 3,202 0,84 2,36 8719 +++ 3,155 0,792 2,36 4452 ++ 3,236 0,858 2,38 10171 NSR EL+ 3,512 1,123 2,39 8671 + 3,215 0,822 2,39

Anhang

105


(von 76 positiven Seren)

8656 + 3,5 1,101 2,40 8650 ++ 3,223 0,82 2,40 8667 + 3,341 0,934 2,41 MAG04 ++ 2,849 0,438 2,41 MAG05 ++ 2,869 0,458 2,41 8668 + 3,104 0,686 2,42 8678 + 3,09 0,613 2,48 5,26

8716 ++ 2,955 0,478 2,48 8665 + 3,322 0,803 2,52 MAG01 ++ 3,029 0,487 2,54 8663 ++ 3,485 0,923 2,56 11,84

8680 +++ 3,263 0,685 2,58 8722 +++ 3,396 0,815 2,58 10177 ++ 3,079 0,497 2,58 10190 +++ 3,332 0,742 2,59 10189 +/- EL + 3,464 0,864 2,60 10004 +++ 3,386 0,773 2,61 10001 +++ 3,152 0,537 2,62 8662 + 3,233 0,596 2,64 10185 +++ 3,083 0,427 2,66 5,26

8661 + 3,307 0,638 2,67 8660 + 3,442 0,736 2,71 10002 +++ 3,293 0,585 2,71 8681 ++ 3,163 0,417 2,75 5,26

8657 ++ 3,403 0,61 2,79 8720 ++ 3,557 0,758 2,80 8670 ++ 3,392 0,587 2,81 4503 +++ 3,116 0,276 2,84 1,32

10003 +++ 3,431 0,436 3,00 1,32

+: schwach positive Reaktion; ++: Mittelstarke positive Reaktion; +++: Stark positive Reaktion NSR: Nicht spezifische Reaktion; +/-: Grenzwertige Reaktion; EL+: Charles-River-ELISA positiv

Anhang

106

Negativ-Seren N=205


(von 205 Seren)

3786 - 0,782 1,167 -0,385 0,98

3830 - 0,93 1,284 -0,354

2276 - 1,711 2,048 -0,337 2,44

3122 - 0,162 0,48 -0,318

3118 - 1,232 1,517 -0,285

3559 - 0,352 0,622 -0,27

3567 - 0,507 0,776 -0,269

3563 - 0,66 0,892 -0,232 4,88

3551 - 0,602 0,828 -0,226

3555 - 0,804 1,021 -0,217

3787 - 1,378 1,579 -0,201

3782 - 0,957 1,15 -0,193

4835 - 1,416 1,608 -0,192

3547 - 0,45 0,614 -0,164

3778 - 0,898 1,058 -0,16

3837 - 0,567 0,719 -0,152

3557 - 0,426 0,578 -0,152

3036 - 0,505 0,652 -0,147 8,78

2275 - 0,839 0,984 -0,145

3794 - 0,548 0,688 -0,14

3790 - 0,689 0,823 -0,134

2343 - 0,599 0,732 -0,133

2994 - 0,673 0,8 -0,127

2530 - 0,353 0,464 -0,111

2154 - 0,658 0,755 -0,097

2212 - 0,657 0,737 -0,08

3017 - 0,829 0,898 -0,069

3014 - 1,006 1,075 -0,069

3793 - 0,505 0,573 -0,068

2995 - 0,823 0,888 -0,065

2494 - 0,512 0,575 -0,063

3561 - 0,306 0,365 -0,059

2204 - 0,476 0,534 -0,058

2496 - 0,376 0,432 -0,056

3834 - 1,717 1,772 -0,055

3554 - 0,747 0,793 -0,046 22,44

2274 - 1,63 1,675 -0,045

3549 - 0,321 0,365 -0,044

2550 - 0,964 1,006 -0,042

3562 - 0,75 0,792 -0,042

3813 - 0,687 0,727 -0,04

3833 - 1,02 1,056 -0,036

2528 - 0,344 0,378 -0,034

2344 - 0,784 0,815 -0,031

3801 - 0,551 0,582 -0,031

3553 - 0,71 0,739 -0,029

2384 - 1,323 1,348 -0,025

Anhang

107


(von 205 Seren)

2551 - 0,433 0,458 -0,025

3016 - 0,56 0,584 -0,024

3548 - 0,39 0,412 -0,022

4833 - 0,776 0,796 -0,02

3029 - 0,725 0,742 -0,017 3119 - 1,342 1,359 -0,017

2532 - 0,43 0,445 -0,015

3032 - 0,544 0,558 -0,014

2524 - 1,253 1,26 -0,007

3564 - 1,457 1,464 -0,007

2200 - 0,846 0,851 -0,005

3781 - 0,868 0,873 -0,005

3797 - 0,599 0,602 -0,003

3010 - 0,617 0,615 0,002

2529 - 0,417 0,407 0,01

2999 - 0,942 0,93 0,012

2805 - 0,142 0,128 0,014

3550 - 0,56 0,544 0,016

3809 - 0,518 0,502 0,016

neg.Kontrolpool - 0,879 0,862 0,017

3802 - 1,029 1,01 0,019

2192 - 0,492 0,47 0,022

4836 - 0,292 0,267 0,025

3005 - 0,937 0,911 0,026

2385 - 0,82 0,791 0,029

3006 - 0,635 0,604 0,031

2194 - 0,523 0,49 0,033

3818 - 1,004 0,968 0,036

3817 - 0,732 0,692 0,04

2672 - 0,832 0,791 0,041

3565 - 0,331 0,288 0,043

2195 - 0,891 0,845 0,046

3024 - 0,727 0,678 0,049

3810 - 0,837 0,788 0,049

3560 - 0,612 0,562 0,05 22,93

3821 - 0,772 0,719 0,053

3015 - 0,941 0,887 0,054

2197 - 0,576 0,521 0,055

2998 - 0,66 0,604 0,056

3030 - 0,443 0,385 0,058

4834 - 0,341 0,283 0,058

3558 - 0,497 0,437 0,06

3025 - 0,912 0,852 0,06

3803 - 0,648 0,587 0,061

3000 - 0,515 0,446 0,069

2341 - 1,088 1,019 0,069

2996 - 0,614 0,542 0,072

2342 - 0,685 0,613 0,072

2340 - 1,28 1,206 0,074

Anhang

108


(von 205 Seren)

2160 - 0,679 0,604 0,075

3038 - 0,545 0,47 0,075

2673 - 0,716 0,638 0,078

2552 - 0,871 0,792 0,079

3556 - 0,778 0,699 0,079 2193 - 0,498 0,418 0,08

2671 - 0,499 0,414 0,085

3783 - 0,939 0,852 0,087

3779 - 1,259 1,168 0,091

2196 - 0,812 0,714 0,098

2152 - 0,693 0,59 0,103

3039 - 0,838 0,735 0,103

3785 - 0,892 0,789 0,103

3808 - 0,689 0,585 0,104

3566 - 0,499 0,394 0,105

3026 - 1,089 0,983 0,106

3028 - 0,405 0,295 0,11

2958 - 0,783 0,671 0,112

2993 - 0,739 0,626 0,113

2526 - 1,004 0,883 0,121

2670 - 0,948 0,826 0,122

2153 - 0,708 0,578 0,13

3796 - 0,851 0,718 0,133

3806 - 0,859 0,724 0,135

3805 - 0,593 0,457 0,136

2203 - 0,642 0,504 0,138

3791 - 0,946 0,804 0,142

3018 - 1,309 1,166 0,143

3013 - 0,933 0,789 0,144

3033 - 0,887 0,741 0,146

2213 - 0,863 0,716 0,147

3001 - 0,689 0,541 0,148

3829 - 0,989 0,836 0,153 12,68

3835 - 0,951 0,797 0,154

3121 - 0,302 0,147 0,155

2527 - 1,757 1,595 0,162

3003 - 0,73 0,568 0,162

2531 - 0,47 0,306 0,164

3799 - 0,961 0,794 0,167

2188 - 0,594 0,417 0,177

3811 - 0,596 0,411 0,185

3815 - 0,758 0,573 0,185

3812 - 0,936 0,748 0,188

3820 - 0,739 0,55 0,189

3011 - 0,971 0,78 0,191

3552 - 0,733 0,539 0,194

3819 - 0,966 0,77 0,196

4943 - 0,639 0,442 0,197

3031 - 0,722 0,523 0,199

Anhang

109


(von 205 Seren)

2273 - 2,05 1,847 0,203

3807 - 0,792 0,585 0,207

3795 - 0,843 0,634 0,209

2523 - 1,456 1,244 0,212

3784 - 1,721 1,495 0,226 2522 - 1,52 1,293 0,227

2201 - 0,902 0,665 0,237

3035 - 1,161 0,924 0,237

2495 - 0,605 0,366 0,239

3814 - 1,11 0,86 0,25 10,73

3034 - 0,803 0,537 0,266

3792 - 0,85 0,577 0,273

3827 - 0,984 0,71 0,274

3831 - 1,056 0,778 0,278

2497 - 0,688 0,409 0,279

3823 - 0,694 0,415 0,279

3826 - 1,061 0,776 0,285

3544 - 0,675 0,39 0,285

3800 - 0,686 0,4 0,286

2997 - 2,061 1,774 0,287

3648 - 3,094 2,805 0,289

2954 - 0,785 0,495 0,29

2525 - 1,165 0,873 0,292

4946 - 0,751 0,456 0,295

3023 - 0,828 0,531 0,297

3789 - 1,497 1,19 0,307

3004 - 0,969 0,661 0,308

3825 - 1,224 0,904 0,32

3009 - 1,199 0,877 0,322

3027 - 0,991 0,666 0,325

3804 - 0,829 0,488 0,341

3816 - 0,993 0,643 0,35 3,9

3836 - 1,048 0,696 0,352

3022 - 1,483 1,123 0,36

3020 - 1,297 0,935 0,362

3822 - 1,713 1,333 0,38

3002 - 1,281 0,893 0,388

3019 - 1,331 0,933 0,398

2151 - 1,608 1,18 0,428

4830 - 1,412 0,951 0,461 2,44

3012 - 1,381 0,907 0,474

3788 - 1,516 1,006 0,51

2211 - 1,143 0,614 0,529

3546 - 1,684 1,153 0,531

3037 - 1,494 0,913 0,581 3,41

3824 - 1,361 0,774 0,587

3021 - 2,079 1,459 0,62

3832 - 1,861 1,228 0,633

4832 - 2,26 1,623 0,637

Anhang

110


(von 205 Seren)

3007 - 1,482 0,845 0,637

3545 - 1,78 1,131 0,649

3120b - 1,515 0,854 0,661 2,44

3780 - 1,877 1,194 0,683

2966 - 1,802 1,117 0,685 3649 - 2,998 2,276 0,722

3008 - 3,578 2,832 0,746

3650 - 1,365 0,482 0,883 0,49

3647 - 4,636 3,653 0,983 0,49

3828 - 2,185 1,078 1,107 0,49

3798 - 2,428 1,006 1,422 0,49

Anhang

111

Werte der Interferon γ-Messung (ng/ml) nach in vitro Stimulation

Infektionsversuch 1

B6-Il10-/- m

B6-Il10-/- w

Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen 8 Wochen Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen 8 Wochen

21,002 162,35 27,691 1,804 11,481 179 10,3 2,093

40,778 164,02 25,914 1,6 10,358 172 22,539 1,974

24,267 119 20,508 1,6 13,52 78,676 18,599 1,6

43,129 81,62 15,981 1,6 6,696 52,232 17,027 1,6

22,279 84,952 19,176 1,6 9,89 66,46 16,575 1,6

52,36 89,109 27,472 3,06 12,541 48,36 32,708 1,6

27,089

38,835

15,756

9,782

10,59

18,992

C3-Il10-/- m

C3-Il10-/- w

Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen 8 Wochen

0,3 79,938 395 216 103 188 117

0,3 61,699 292 321,004 121 184 315

0,472 99,934 443 278,172 144 276 134

0,3 112 382 199 205 202 128

0,3 60,732 160 104 237 122 176

0,3 117 342 356,347 167 171 109

64,899

201

128

402

67,924

99,694

Anhang

112

Infektionsversuch 2

B6-Il10-/-

B6-wt

Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen

2,973333 3,035 5,729 0,469 3 1

2,075 4 6,951334 0,63 4 1

0,7683333 3,369333 1,065 0,336 6 2

2,113 2,861333 1,858 0,3836667 4 1

1,545667 3,317 1,369333 0,39 2,045667 1,265333

0,9803333 5,724667 1,910667

2,636333 0,9276667

0,7946666 2,797 2,543333

1,611333 0,4786667

0,2743333 2,458667 2,001667

2,554 3,642333

0,4215 3,029 2,399333

3,100333 3,239667

1,141667 0,755

1,194667 2,242333

7,518667 1,182

5,492

C3-Il10-/-

C3-wt

Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen

0,356 11,80267 13,99133 8,830667 8,487667 31,18133

6,646333 21,56933 21,15 3,773 24,67033 6,955

6,281333 19,142 38,412 2,569667 3,464667 9,635667

3,556667 17,75833 25,58133 2,814667 11,23733 3,849333 8,013 12,546 5,164667

4,597333 7,662 5,067

15,22533 4,452333

12,60533

Infektionsversuch 3

B6-Il10-/-

B6-wt

Kontrolle 7d p.i. Kontrolle 7d p.i.

0,9536667 3,396667 1,747 0,5966667

0,4835 2,374333 1,092333 1,172333

0,7356667 4,499 0,5336667 10,182

6,007 0,705 0,463

0,5565 3,774

0,429 1,819

2,051

3,633667

Anhang

113

Infektionsversuch 4

C3-Il10-/- ( keimfrei)

Kontrolle 4 Wochen

0,9279273 0,756581

0,969763 1,001276

1,777933 1,445699

1,157028 0,830935

1,817827

Infektionsversuch 5

C3-Il10-/-

B6-Il10-/-

H.hepaticus MNV + H.hepaticus H.hepaticus MNV + H.hepaticus

33,9378 26,05871 38,18218 46,39897

48,97928 50,26017 42,69127 9,08253

38,03638 45,06061 57,02307 24,43101

53,10282 54,62005 16,87314 12,40349

36,76929 55,69619 40,08938 36,34947

51,71358 50,76093

61,21308

Anhang

114

TJL-Histologie-Werte für Infektionsversuch 5

Zäkum C3-Il10-/-

B6-Il10-/-

Helico Helico+MNV Helico Helico+MNV

5 4 8 6

6 4 6 5

5 5 7 5

6 6 5 5

5 5 7 7

7 7

5

Kolon Helico Helico+MNV Helico Helico+MNV

11 10 15 18

14 7 14 12

11 10 14 6

12 12 11 12

10 7 17 13

10 11

12

Helico: Infektion mit H. hepaticus; Helico+MNV: Doppelinfektion mit MNV und H.

hepaticus

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Abbildungsverzeichnis

126


Abbildung 1: Schema des MNV-Genoms; unterhalb der Leseraster sind die

verschiedenen Proteinprodukte mit ihrem Gewicht in Kilodalton aufgeführt; N, N

Terminus; 3A, NTPase 3A-like; P, Vpg Protease; RdRp, RNA dependent RNA

Polymerase; VP1, VP2 Hauptkapsidproteine (HENDERSON 2008). .................. 3

Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme von MNV-1 (markiert durch

schwarze Pfeile) (HSU et al. 2005). .................................................................... 4

Abbildung 3: Dreidimensionale Rekonstruktion anhand cryoelektronen-

mikroskopischer Aufnahmen von humanem Norovirus (NV, virus-like particles),

murinem Norovirus (MNV) und dem Virus der hämorrhagischen Erkrankung

beim Kaninchen (RHDV, virus-like particles) im Vergleich (KATPALLY et al.

2010). .................................................................................................................. 5

Abbildung 4: Pathogenese der CED bei IL10-defizienten Mäusen, modifiziert nach

Powrie (POWRIE 1995) und Elson (ELSON 1999). .......................................... 16

Abbildung 5: Vergleich verschiedener Primerpaare im Gradienten. ......................... 54

Abbildung 6: Vergleich der Primerpaare 5580f/5671r und 5205f/5469r mit 5

verschiedenen Proben, die aus Organen und Kot isoliert wurden. .................... 54

Abbildung 7: Vergleich der Primerpaare 5205f/5469r und 5004f/5219r. ................... 55

Abbildung 8: Verwandschaft vom isolierten MNV-Stamm Hannover1/2007/DEU

erstellt durch BLAST (ALTSCHUL et al. 1990). ................................................. 57

Abbildung 9: TCID50-Test; der Indikator des Mediums zeigt lebende Zellen (gelb) an;

zweites Bild nach der Anfärbung mit Kristallviolett (lebende Zellen stark lila). .. 58

Abbildung 10: MNV-positives Mausserum (+++) in der Immunfluoreszenz. MNV-

infizierte Zellen sind grüngelblich markiert. ........................................................ 59

Abbildung 11: Kissenzentrifugation; Bande nach der Gradientenzentrifugation. ...... 60

Abbildung 12: Beziehung zwischen Extinktionswert und Verdünnung mit

Regressionsgerade. .......................................................................................... 63

Abbildung 13: Prozentuale Verteilung der Einzelmessungen von ausgewählten in der

IFA positiven (n=76) und negativen (n=68) Mäuseseren. .................................. 65


127

Abbildung 14: Prozentuale Verteilung der Einzel-OD-Wertbestimmung von 205 in der

IFA negativen Mäuseseren mit Hilfe des ELISA. ............................................... 66

Abbildung 15: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von MNV-Virionen (durch

schwarze Pfeile gekennzeichnet). ..................................................................... 67

Abbildung 16: Infektionsversuch 1, Mittelwert und SEM der IFNγ-Sekretion der in

vitro stimulierten MLK-Zellen (Proben pro Stamm, Geschlecht und Zeitpunkt

gepoolt). ............................................................................................................ 72

Abbildung 17 Infektionsversuch 2, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro

stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach

Geschlecht) ....................................................................................................... 74



Geschlecht). ...................................................................................................... 75



Geschlecht). ...................................................................................................... 76



Geschlecht). ...................................................................................................... 77

Abbildung 21: Infektionsversuch 5, Mittelwert und SEM des histologischen Score

(Jackson) von Zäkum und Kolon bei der Kontrollgruppe (Helico mit H. hepaticus

infiziert) und der Doppelinfektionsgruppe (MNV+Helico mit MNV und H.

hepaticus infiziert). ............................................................................................ 80

Abbildung 22: Kolonabschnitt einer C3-Il10-/--Maus 4 Wochen p.i. mit MNV (A-C) und

die zugehörige Kontrolle (D-F); HE-Färbung, der schwarze Balken entspricht

100µm. Im Vergleich zur Kontrolle ist eine milde Hyperplasie des Epithels, ein

gemischtzelliges Infiltrat in Mukosa und Submukosa sowie ein geringgradiges

Ödem festzustellen. ........................................................................................... 81

Abbildung 23: Kolonabschnitt einer keimfreien C3-Il10-/--Maus 4 Wochen p.i. mit MNV

(A-D) und die zugehörige Kontrolle (E-H); HE-Färbung, der schwarze Balken

entspricht 100µm. Im Vergleich zur Kontrolle unterscheidet sich die infizierte


128

Maus nur durch eine leicht vermehrte Anzahl mononukleärer Zellen. Weitere

Entzündungsreaktionen sind nicht feststellbar. ................................................. 82

Abbildung 24: Kolonabschnitt einer B6-Il10-/--Maus infiziert mit MNV und H. hepaticus

(A-D) und die zugehörige Kontrolle (E-H), nur infiziert mit H. hepaticus; HE-

Färbung, der schwarze Balken entspricht 100µm. Doppelinfektion und Kontrolle

weisen eine vergleichbare mittel- bis hochgradige transmurale, gemischtzellige

Enteritis mit prominenter Hyperplasie der Enterozyten auf. ............................... 83

Tabellenverzeichnis

129

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Interaktion verschiedener Umweltfaktoren auf das CED-Modell der IL10-

defizienten Maus ............................................................................................... 14

Tabelle 2: Ausprägung der Kolitis bei IL10-defizienten Inzuchtstämmen ................. 14

Tabelle 3: Verwendete Mausstämme und ihre Abkürzung ....................................... 18

Tabelle 4: Zusammensetzung von Altromin 1324 TPF ............................................. 19

Tabelle 5: Primer zur Detektion von MNV ................................................................ 22

Tabelle 6: Primer zur Klonierung von MNV .............................................................. 23

Tabelle 7: Primer zur Sequenzierung von MNV ........................................................ 23

Tabelle 8: Primer zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA ........................... 23

Tabelle 9: Primer zur Detektion von Helicobacter (H.) hepaticus ............................. 24

Tabelle 10: Primmerpaare zum Nachweis von MNV mit Hilfe des Quiagen-Taq PCR

Core-Kit (Primersequenzen siehe S. 22f.) ......................................................... 34

Tabelle 11: Übersichtsdiagramm der Infektionsversuche ......................................... 46

Tabelle 12: Überblick über die Verbreitung von MNV im ZTL im Jahr 2008 ............. 68



Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i., 8 Wochen p.i. ..................................... 71


untereinander (Bonferroni´s Multipler Vergleichstest) ....................................... 72



Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i.............................................................. 73


untereinander (Bonferroni´s Multipler Vergleichstest) ....................................... 73


Infektionsversuch 3 mit einem ungepaarten t-Test ............................................ 75



Tabellenverzeichnis

130

Tabelle 19 Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von


Tabelle 20: MNV-Nachweis via PCR (positiv getestet / insgesamt getestet) ............ 78

Tabelle 21: H. hepaticus-Nachweis via PCR (positiv getestet / insgesamt getestet) 79

Tabelle 22: Statistische Auswertung der histologischen Scorewerte von


Erklärung

131

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Disseration

„Charakterisierung eines murinen Norovirus – Auswirkungen des Virus auf die

experimentelle chronisch entzündliche Darmerkrankung bei der IL10-defizienten

Maus“

selbständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

Die Sequenzierung von MNV wurde von der Firma MWG Biotech AG durchgeführt.

Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen erfolgten im Zentrallabor

Elektronenmikroskopie der MHH mit freundlicher Unterstützung von Prof. Dr.

Ungewickell, Gerhard Preiß und Jutta Milzer (Institut für Virologie, MHH). Die

Messung der IFNγ-Sekretion erfolgte durch die Arbeitsgruppe PD Dr. Neumann im

Institut für Pharmakologie der MHH.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat

von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die

im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen

Hochschule Hannover angefertigt. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine

Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig

und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.

Hannover, den

_____________________________

Marcel Achard

Danksagung

132

Danksagung

Mein Dank gilt

Herrn Prof. Dr. Hedrich MHH Herrn Prof. Bleich, Ph.D. MHH Herrn Prof. Dr. Mähler MHH, Firma Biodoc

am ZTL der MHH

Herrn Dr. Zschemisch Frau Smoczek Frau Wehling Frau Wiebe Frau Janus, Ph. D. Frau Büchler, Ph. D.

in der Firma Biodoc

Frau Dr. Köhl & dem gesamten Labor-Team

im Institut für Virologie der MHH

Frau Milzer

im Zentrallabor Elektronenmikroskopie der MHH

Herrn Prof. Ungewickell Herrn Preiß

im Institut für Pharmakologie der MHH

PD Dr. Neumann & seiner Arbeitsgruppe

im Institut für Virologie der TiHo Hannover

Prof. Dr. Haas Frau Winter, Ph.D.

und ganz besonders

meinen Eltern und Freunden, die mich unterstützt haben.

tierärztliche hochschule hannover charakterisierung eines ... · ihr genom ist eine lineare,...

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