the spectrum of mitochondrial dna deletions is a ubiquitous marker of ultraviolet radiation exposure...

6
The Spectrum of Mitochondrial DNA Deletions is a Ubiquitous Marker of Ultraviolet Radiation Exposure in Human Skin Amanda J. Ray,* Richard Turner,* Osamu Nikaido,² Jonathan L. Rees,* and Mark A. Birch-Machin* *Department of Dermatology, Medical School, University of Newcastle upon Tyne, Framlington Place, Newcastle upon Tyne, U.K.; ²Kanazawa University School of Pharmacology, Japan We and colleagues have suggested that deletions of mitochondrial DNA may be useful as a biomarker of ultraviolet radiation exposure in skin. In this study using a southwestern approach involving monoclonal antibodies against thymine dimers we provide direct evidence for the presence of ultraviolet-induced damage in mitochondrial DNA puri®ed from any nuclear DNA contamination. Previous studies have been limited, as they have focused on the frequency of a single mitochondrial DNA deletion. Therefore we have addressed the question of the spectrum of mitochondrial DNA deletions in skin and whether this can be used as an index of overall DNA damage. We have used a long polymerase chain reaction tech- nique to determine the mitochondrial DNA deletion spectrum of almost the entire mitochondrial genome in 71 split skin samples in relation to sun exposure. There was a signi®cant increase in the number of deletions with increasing ultraviolet exposure in the epidermis (Kruskal±Wallis test, p = 0.0015) but not the dermis (p = 0.6376). The ®ndings in the epider- mis are not confounded by any age-dependent increases in mitochondrial DNA deletions also detected by the long polymerase chain reaction tech- nique. The large spectrum of deletions identi®ed in our study highlights the ubiquitous nature and the high mutational load of mitochondrial DNA asso- ciated with ultraviolet exposure and chronologic aging. Compared with the detection of single dele- tions using competitive polymerase chain reaction, we show that long polymerase chain reaction is a sensitive technique and may therefore provide a more comprehensive, although not quantitative, index of overall mitochondrial DNA damage in skin. Key words: long PCR/mitochondrial DNA damage/ photoaging/skin cancer. J Invest Dermatol 115:674±679, 2000 T he major determinant of skin cancer in individuals without protective pigmentation is ultraviolet radi- ation (UVR) (reviewed by Weinstock, 1998). An understanding of the genetics of the interaction between skin and UVR is therefore important for the understanding of skin cancer susceptibility. A major limitation of current studies relating genotype to phenotype of human skin cancer is the absence of reliable markers of exposure to UVR. We and colleagues have suggested that deletions of mitochondrial DNA (mtDNA), as opposed to nuclear DNA, may be useful as a biomarker of UVR exposure (Pang et al, 1994; Berneburg et al, 1997; Birch-Machin et al, 1998). The reasons for this are 3-fold. First, in contrast to nuclear DNA, there are no or limited mechanisms in mitochondria for the repair of DNA photoproducts [pyrimidine (6±4) pyrimidone photoproducts or cyclopyrimidine dimers] by the usual process of nucleotide excision (Clayton et al, 1974; Prakash, 1975; LeDoux et al, 1993; Croteau and Bohr, 1997; Pascucci et al, 1997; Sawyer and Van Houten, 1999). Second, mtDNA has a 10-fold higher mutation rate than nuclear DNA (Wallace, 1992). Third, mtDNA is ``very recessive'' as a consequence of there being (i) many mitochondrial genomes (two to ten copies) per mitochondria and (ii) many mitochondria per cell. Consequently, mitochondrial genomes can tolerate very high levels (up to 90%) of damaged DNA through complement- ation by the remaining wild type mtDNA (Chomyn et al, 1992; Sciacco et al, 1994). In addition mutated mtDNA can have a replicative advantage over wild type (Hayashi et al, 1991), and there is clonal expansion of mutated DNA (Moslemi et al, 1996; Brierley et al, 1998). Together these features suggest there may be little selection against cells harbouring mtDNA mutations, unlike most nuclear genes. In this study using a southwestern approach, involving mono- clonal antibodies raised against thymine dimers, we now provide direct evidence for the presence of UV-induced damage of mtDNA. Second, we have addressed the question of the range of mitochondrial deletions in skin. Previous studies have indicated that exposure of human skin to UVR leads to the accumulation of mtDNA harbouring the 4977 bp ``common deletion'' (Pang et al, 1994; Yang et al, 1995; Berneburg et al, 1997, 1999; Birch-Machin et al, 1998). The investigation of the frequency of a single deletion by these studies may not provide a reliable UV biomarker simply because they are identifying only the ``tip of the deletion iceberg'' Manuscript received June 3, 1999; revised April 27, 2000; accepted for publication June 28, 2000. Reprint requests to: Dr. Mark A. Birch-Machin, Department of Dermatology, University of Newcastle upon Tyne, Leech Building, Medical School, Framlington Place, Newcastle upon Tyne NE2 4HH, U.K. Email: [email protected] Abbreviation: mtDNA, mitochondrial DNA. 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 674

Upload: mark-a

Post on 06-Jul-2016

213 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: The Spectrum of Mitochondrial DNA Deletions is a Ubiquitous Marker of Ultraviolet Radiation Exposure in Human Skin

��� ������ �� ������������ ��� ��������� �� ��������� ����� �� ����������� ��������� ������� ����� ����

������ �� ��� ��� ��� ������� ����� �������� ����� �� �� ����� ��� ���� �� ���� ���� �������������� �� ��������� ������� !� ��� "��#����� �� ��$������ ���� ��� %������ ��� &���� ��$������ ���� ��� "�'�(

�'���)�$� "��#����� !� ��� �� & �������� �����

� ��� ������!�� ���� �!!����� ���� ��������� �������������� ��� �" �� ���� �� � �������� ������������ ��������� ������� �� ����# $� ���� ���"���! � ����%������ �������� ��������! ������������������� �!����� ��"��� ����� %� ������� �������������� ��� ��� �������� �� ����������&���������!� �� ������������ ��� ���'�� ��� ��"������ ��� ������������# (������ ������ �������� ������) �� ���" ���� ������ �� ��� �������"�� � ���!�� ������������ ��� ��������# ���������%� ���� ��������� ��� ������� �� ��� ������ �������������� ��� ��������� �� ���� ��� %���������� ��� �� ��� �� �� ����� �� ������� ��� ���!�# � ���� ��� � ���! ���"����� ����� �������� ����&���� �� �������� ��� ������������ ��� �������������� �� ����� ��� ������ ������������ !������ *+ ����� ���� ������ �� �������� �� �� �������#����� %�� � ��!��'���� �������� �� ��� ���� ����������� %��� ���������! ���������� ������� �� ���

�������� ,-�����. ����� ����) �/ 0#00+12 �� ������ ����� ,�/ 0#34*32# ��� '����!� �� ��� ������&�� ��� ��� ��������� �" ��" �!�&������������������ �� ������������ ��� ��������� ������������ �" ��� ���! ���"����� ����� �������� ����&����# ��� ���!� ������ �� ��������� ������'�� ���� ���" ��!���!��� ��� ������� ����� ��� �����!� �������� ���� �� ������������ ��� ����&������ %��� ���������� ������� ��� ��������!���!��!# 5������ %��� ��� ��������� �� ���!�� ����&����� ���! ���������� ���"����� ����� ��������)%� ���% ���� ���! ���"����� ����� �������� �� ���������� �������� ��� �" ��������� ������� ���� ������������) �����!� ��� �����������)����� �� ������� ������������ ��� ���!� �� ����#��� ���� �� � ����������� ���� ��� �������������� ����� �� ���� � � ���� �������� !�"#$%"#&'()))

� � ��*�� ����������� �� ���� ������ �� ����#������$�� ��� ��������#� �� ��������� �� �����#����� ���������� +",�- +��#��$�� . /�������� 0112-� �������������� �� � � ������� �� � � �����������.��$��� ���� ��� ",� �� � ������� ��������� ��� � �

������������ �� ���� ������ ��������.����� � ��*�� ���������� ��������� ������� ������� ������ �� � ������ �� ���� ���������� �� � � �.����� �� �����.�� ������� �� �3������ �� ",�� /���� ������ ��� �#� �� ����� � �� ��������� �� ����� ������� ���+�����- �� ������� �� ������� ��� �� .� ������ �� �.�������� �� ",� �3������ +&�� �� �� 0114( �����.�� �� ��0115( ���� ���� �� �� �� 0112-� � � ������� ��� � �� ��� 6������%���� �� �������� �� ������� ��� � ��� ��� �� �� ���������� ������ �� ����� ������ ��� � � ������ �� ��� � �����������7��������� +894- ��������� � ����������� �� �������������������: . � � ����� ������� �� ���������� �3������ +;����� �� ��0154( &����� 015<( �����3 �� �� 0116( ;������ ��� �� � 0115(

&������� �� �� 0115( !�$�� ��� ,�� =����� 0111-� !���������� �� � 0>����� � �� �������� ���� � �� ������� ���+/������ 011?-� � ��� ����� �� @@#�� �������#�AA �� ������B����� �� � ��� .��� +�- ��� ����� ������� ������+�$� �� ��� ������- ��� ����� ������ ��� +��- ��� ����� ��������� ����� ;����B����� ����� ������� ������ ��� �������� #�� � ��#��� +�� �� 1>C- �� ���� �� ��� � ��� ���������������� . � � �������� $��� ��� ����� +; ��� �� �� 011?(!������ �� �� 0114-� D� �������� ������� ����� ��� �#� ����������#� ��#���� � �#�� $��� ��� +=��� � �� �� 0110- ��� � ����� ������ �3������� �� ������� ��� +������� �� �� 0118( ��������� �� 0112-� �� �� �� � ��� �������� �� ��� � ��� �� .� ��������������� � ����� ����� ��.����� ����� ��������� ������ ����������� �����

D� � �� ���� ���� � ���� $������ ������� ��#��#�� ����������� ����.����� ������ � ����� � ���� ������ $� ��$ ���#��������� �#������ ��� � � �������� �� ",�������� ���� � �������� !����� $� �#� ��������� � � B������� �� � � ��� � ������� ������� ��������� �� ����� &��#���� ������� �#� ���������� �� �3������ �� ���� ���� �� ",� ����� �� � � ������������ ������� ��.����� � � 4155 .� @@������ ��������AA +&�� �� ��0114( E�� �� �� 011<( �����.�� �� �� 0115 0111( ���� ���� ���� �� 0112-� � � ��#���� ����� �� � � ���B���� �� � ��� �� ��������. � ��� ������� �� ��� ���#��� � �����.�� ", .�������� �����.������ � � ��� ��������� ��� � � @@��� �� � � �������� ���.�� AA

���������� �����#�� ���� 6 0111( ��#���� ����� ?5 ?>>>( �������� �����.�������� ���� ?2 ?>>>�

������� ��B����� ��F ��� ���� �� ���� ���� �� ���������� ����������� "��#����� �� ��$������ ���� ��� ���� ������� ������� !� ��� %������ ��� &���� ��$������ ���� ��� �G? 4=="�'� G����F ����.��� ���� ��H��$������������

�..��#������F ����� ����� ������� ����

>>??�?>?IJ>>JK0<�>> L ;���� � � ?>>> . � � !����� ��� D�#���� ���#� ��������� D���

3*6

Page 2: The Spectrum of Mitochondrial DNA Deletions is a Ubiquitous Marker of Ultraviolet Radiation Exposure in Human Skin

+;��������� �� �� 011?( ����# �� �� 011<-� /� �#� � ��������3������ � ��� ������� . ���� � ��� ��������� � ��� ��������+&;�- ��� ��B�� �� ������ ������ � � ������ 08<81 .� ������ ������� ����� �� ����� �� ��������� � � ����� ���������������� �������� �� ", �3������� � � ���� �� � � �������� ����� ��������� �� ������� �� � ��� �� �������� �� ���#��� � ���������� ����#� ������� �� ",�������� ����� ���� ��

������� ����� ������ �#� .��� ���������� �� � � ������� ����������� .������ �� � ��� ���� �� ��������� ��� �� �� ������� �� �����.���� +��#��$�� . ;�#���� ��� ���� 0112( M���� ��� ����0112-� %��� ������ ���������� ����� ��������� +���� 0>>C������� �����- �#� ������� .��� �.���#�� �� ���� ������������� ������ ������ +=�.��� �� �� 0112( &���� �� �� 0112( �������� �� 0111-� � ��� N���� � �� �� �� $�� � � ���� � �� ",� ����������� �� � � ������ �� � � ������ ���� ������� +��#��$�� .M��� ���� ��� E��� 011?( ���� �� �� 0115- ��� � � ������ ���������� ������� ���� ��������� ��������� ������ ��� �� �� ���� � ��������� �� ����� ��������� �� .�� ����� ��� ��*����� ����������� ����� D� �� ������� �� ���#��� ���� � ���� � � ��� ����� ������� ��������� $� �������� +�- � ������#� �������� ��������� ��� �� �����3����� ������� �� $��� �� +��- � � ����� ���������� ���������� �3������ ������ ������� +���� �������� $�� 3���������� ��������-�

���G�D��! ��� �G�=��!

5��� ����� � ������������ ���������)�� ����������� ���� ����+=�;��- +������� �� �� 0122- $�� ��$� �� ���.����A� ����N��G� ��A� ������ ��������� 0>C ����� .�#��� ����� < D" ����� ������������� < ����� ������������

$���"���������" ;���� $��� ��$� �� .���� ���� ��#�������� �� �� .��� ������ �� 0>>��? ������ ������� ������� ��� ��� � � ���������� �� �� � � ��#������� �����$�� �#���� � ����.����� ��� $��� ��$��� �����3������ <>C ���O���� ��� �������� ;���� $��� $�� �� �$��� ��� ��� ����.������� ������ +&�!- ��� $��� � �� ���������� �� &�! $�� <?1�� ��� ��? �� ",� 7=������� 4>/ ���� +/���� �0�>0-F ?1>94>> ������ �������� �� 6?< ��:� � �� ����������� �� � � ����� ��$�� ��� ", ������������ . ��� &� %��� ��� &�������� �� ����� +"��#����� �� ��$������-���� � ����.����� ���������� D�05>>� � � /���� =������� ���� �������� ���� ���� �� ���� 8> �� ", O��������� ������ !�#����N#� ��� ���� �� � ������� �� � �� ���� ���� $�� �� � � ",� ��� � ��� .���� ����� �� ��N����������� �� ",; ��� ��� ������� +%��� �� �� 0125-� � � ����� $��� N3�� ��� � ��#������� ���� ��� ����F������ ���� +6F0- �� ��� ��� 69<��� $�� ���� 0>>C �� ���� ��� ������ ;���� $��� ������� $�� >�>5� ���=J5>C�� ���� �� ��� ��� ?��� �� �������� ��� ��� $��� $�� �� $�� &�! +N#������-� ;���� $��� ����.���� $�� 0C .�#��� ����� ��.���� +�!�- �� &�!��� 6>��� ��� � �� $�� � 0F0< �������� �� � � ����? ��������������.�� ������ � ����� � ���� ������ �� &�! $�� >�0C �!� +��)����� �� 0110- +� ���� ��� ���� &�������� �� ������� '���)�$� �����-� �����$�� �� $�� &�! ����� $��� ����.���� �� � 0F0>> �������� �� .���������� ��� ��������� D M +P���- �� &�! $�� >�0C �!�� ����.�� ���������$�� � �� ������� ��� ���� � � !�������; ;�����3J=�& ����� +�����J! �������-�

�7 ����������� �� ��5�� ����� ��� ���������� �� 88���99���� ;���� $��� ��$� �� ��#������� �� �����3������ 5>C91>C���O���� �� 0>>��? ������ ������� ������� ��� �� $�� �� �� &�! ���� �� ���������� �� &�! $�� <?1 �� ��� ��? �� ",� 7=������� 4>/ ����+/���� �0�>0- �� ������.�� �� � � ������� �������� �������-� ;���� $���� �� �������� �� � 65�; ����.���� +<C ;�?- ��� 6>��� .����� .��� ��#����� . �������)������ &��� ����� $�� �������� . �������������������� ����� �� � � �������� ���������� �����$�� . ����� D ��������� �������� ����� ������ .����� ���� ��� ����N������ �� ����� +;�����.���� �� 0115-� � �� ��� ����� �#� #�� ���� ����� �� ���N���� .� � �.����� �� � 6?& �� ��� +�� � � �������� �� � ������#� ������� ����������- �� � ���� ��� .��� ������� ���� � �������� ���.� +��� ��3� ���������� ���.� �������- ��� ������� ������������� +���� ��� � �$�-�

����%������ ���� ����"��� ��� �3������� ���� N�� 0>>��? &������� �� $�� �� ����� $�� ���=D ��� � �� ��������� �� � >�5C � ����� ����������� �� � � ��� �� ���� ���.���� +M���!����� &��� �G� ����!������� ������ ��- $�� ������� ��� �������� �� � � ������������A�������������� � � ��� $�� N3�� �� � � ���.���� . ���� �� � #������� 2>�; ��� ? � � � ���.���� $�� � �� ������ �� � 0>C ���� �������� ��

�����.������� ������ +��!- �#���� � �� 4�;� � � �����$�� �� � ����.���� $�� $�� �� �� ��! +N#� �����- ��� � �� ����.���� �� � 0F0>>>�������� �� ����? �� ���� ����������� ��� 0 � � ���� �� � ��� $�� ��$��� ������� ��� �� >�?C �$��� ?> �� ��! .����� ����.����� $�� �0F0>>> �������� �� .���������� ��� ��������� D M +P���- ��� 6>����/�� �� $�� �������� ��� � � ���.���� $�� ����.���� �� � 0F0>>>>�������� �� �������#��������*� ���� ��������� ����3����� ��� 0 � � ����.���� $�� $�� �� �� >�?C �$��� +N#� �����- ��� � �� ��������� $��������� ��� ���� !����!� ��� � �������������� ��.������ +&�����; ������ ; ����� "�'�-� %����$�� � ��������������� ��������� .����)����� $�� ��������� ���� 6?&��������.���� ���.�� ������������ �� � � � ���� �� ��� �� � � ����� ������� ����� +����������� 0<1559084?> .�- ��� � �������� ���.� �� .����)� �� ������� ���� � ��������� ���.� +/���$�� � �� �� 011<- $�� ���� . &;� �� 0>>����������� ��������� �� >�0 �� +���MMM-< ��� +;;;���-<��� ������������ <>�� ';� 0>�� �����=;� +�= 2�6- 0�� � ;�??>> �� �� ��� ���& ��� ? ����� �� ��� ���������� � � &;� ���N����������� �� 0> ����� �� 0��� �� 14�; 6> � �� 8>�; 1> � �� 5?�; ��� ���N��� ���� �� <��� �� 5?�;� ������� �� � � .����)������ $�� ������� ������� � � & ��� ��D�� �� ��� D�� �Q���� ����$��� +���������������� ; �� �� "�'�-

5������� ������ !������������ ���� +.������ ��� ���- $�� ����� �������������� ������� +��������� � R 1 � � ��� � 8192< ���� � � 55 (������ � R 8 � � ��� � 81924 ���� � � 5< -� !����3����� ���� +���� ���� .��� ����� ��� �� �- $�� ����� ���� ��������� ������ ���������������� �� �������� �������� ��� ���� ������ �3������� � ��� �����3������������ $��� ���������#�� ������� �� ����� ���� ����� �� � �3������+���� ��� ����- +��������� � R ?2 � � ��� � ?8910 ���� � � 82 (������ � R 06 � � ��� � 40910 ���� � � 5? - ��� ���� ��$ �������������� �����3����� ����� +.��� ����� ��� �� �- +��������� � R 2 � ���� � ?4926 ���� � � <4 ( ������ � R 8 � � ��� � ?4926 ���� � �8? -� ���� �� � � �������� ���� ��� � �� ���� �� � ����� ������� ���������� G�������� ��� ������ $��� ��������� ���� >�?<C ������� �� 4�;�#���� � ��� ��� $�� �3������� �� ������.�� . ������� �� �� +011?-� %��� � ���� �� ��������� ������ ��� ������ ��*����� ���� ��*����� ����������� +� R 2- $��� ��������� ���� �������� �������� ��� ������ �3��������� $��� ������N�� �� �.�#�� � � ���� ����� ���� 6> 3���������� �������� �������� $��� ������N�� ���� � � �����$�� ���������������� �����F I&� +�R 8-( I&� +�R 4-( I&; +�R 4-( I&% +�R 6-(I&M +�R <-( I&, +�R 2-�

:��! (5� �� ��� ������������ !���� ����� ������� ��� $�������N�� ���� � � G3���� ��� �������� &;� !���� +��� ��� ������ ��� !$��)������-� �����N������� $��� ��������� �� <> �� ������������������ 08 ���� �� ��� ������ ��� <>9?>> � �� ����� ���� �$�&;� ��������� $��� ������� ��� ��� ��� ��� ������ �� ��#�� 00>1< .���� <4>1 .� �� � � ����� ������� ������ � � &;� ������� ���� $���� ��� ������.�� . '������ �� �� +0115- ��#���� � � �����$�� �� ���� �� � �;��.��� � ��B����� +�������� �� �� 0120-F �D� +����������� +��- 6689686- �D� +�� ?2?9?<<- ��� +�� <5<89<520- ��� +�� <54<9<5?0-� � �&;� �������� ��������� �� � ��������� ��� � �� 14�; ��� ?��� ��� � ��0> ����� �� 14�; ��� 0> � 8<�; ��� 6> � ��� 8>�; ��� 290?��� �����$��. � ���� �� ?> ����� �� � � ���� ���N�� $�� �� ���������� ?> � ����� ��� � ���� ����� ���� �#�� ���� ��� � N��� ���� $�� 5��� ����� �� � ����� ����� ����� �� ������ ���������.���� � ���$� ������ �� ��� $����������� �� ��� �� ��� ��� ������� � �� �� �� ����� � � ���� ������ ����� $��� �������� �� � � ��������

�G!"��!

������ �������� ���%��! �7&������ ��"��� ����� �����'�� ���� �� ����� �� .� � �� ��N���� ��� �� ��",� � � ������ ������ �� ",� �� ����� $�� ��#���� ���� .������ �� � ���� ����� ���������� ���� � �����N� ��������������.�� ����? +���� �� �� 0110( '������ �� �� 0115-� %���� � �����? ����.�� $�� ���� �� � �$ ", ��������� �� � ���������� �� $ ��� ������ � �� $�� ���� �� ��������� ������� ������� ��=�;�� ����� � �� �� .��� �3����� �� <?1 �� ��� ��? ��",� +?1>94>> ��- �������� $�� ��������� ����� +;�! +� *��������#��-� !����� � � ���� ",� ���� $�� � �� ���� �� �����=�;�� ����� ���� $ �� ����� $�� �������� ��� ��.��B���������N�� ���� �� �������.�� ������� ������������� +��� ������������ �����-� � �� ����N�� ����� $�� �������)�� . �� ������$�� ���=D ����� �� �������� ������ ��� ���.�� $�� � � ����?����.�� �� � ���.���� ���� $������ .������ ������� +;�! <�-�

,��� 00< ��� 4 �;���G� ?>>> ����� �G�G�D�� !&G;��"� ��� ",� GI&�!"�G 3*1

Page 3: The Spectrum of Mitochondrial DNA Deletions is a Ubiquitous Marker of Ultraviolet Radiation Exposure in Human Skin

� � ������� ������ � �$ �� �������� +�����3������ <90>�����- ��� � ��#�� �� � ���� ������ �� ����N�� ����� ���� ",����������� =�;�� ����� �������� $�� ������������� ������ � ����� .��� $�� ���.�� $�� �� ����� ���.� +� ���� �� ���- ��� �$ �B��� ������ .�� �� ���N�� ���� � �� � � 08 �. .��������������� �� �������� � ����� +;�! <*-�

���� ������ �3��������� $��� ���� ��������� �� ��#���� ��� � ������� � �� ������ �� ",�������� � ���� ������ �� �.���� ������� ������ +;����� �� �� 0154( &����� 015<( �����3 �� ��0116( ;������ �� �� 0115( &������� �� �� 0115( !�$�� ��� ,��=����� 0111-� � ���� ����� ��������� $�� ������� �� =�;������� $ �� $��� ��#����� 6>��� ?4 ��� 42 �����$�� ",����������� 7<?1 �� ��� ��? �� ",� +?1>94>> ��-:� � � �.������� ������ ����� ��� .� ���������� ���B��#����� .������ �����N������� ����������� � ��� � � ���� �� ",����� ���� ����� ����� � �� �������� �� � � ���� �� � ���� ������ ���� � �������� ������ +���� ��� � �$�-�

�� �������� �� ��� ���� �� ���� ��������� ���������� �� ��!��'�����" ���������� %��� ���������! �7�������� � � ��� &;� ��� ��B�� �� $���� ���� �� ��#���� ���� � �������� �� ����� ��������� �� ����� ������� �������� ���� �� ������� +'������ �� �� 0115( '�#������ �� �� 0115( �� �� ���/�� 0112( ' ����� �� �� 0111-� � ������� ����� ��������� $���������N�� �� ���� ���� ����� ������ � ��� �����N������ �������� � � ������ ����� ������� ����� �� �$� �������� +���� <�4�. ��� 00�0 �.- . ��� &;�� � � �������� �� ��������� �� � ������ ������� ����� �� #������)�� �� � � ���� �� � ��� ������ ��&;� �������� �� �� � ����� �� +;�! 4�-� � � ��������� ������.��. ����# �� �� +011<- $�� ���� �� ���N�� � �� ��� � � ��� &;��������� �.���#�� $��� �� ����� ��� ��� � ������� � � ���

��� ����� ���� ;�! 4+�- $��� ��������� ��� ����������� �� ����N����� . ���� ��� .������ ��� .����)�� $�� � 6?&���.���� �������� � ����� ���.� +;�! 4*-� D� � ������� $�� � � ������� ������# �� �� ��� �� � � &;� �������� ���� . �� ����� .������������� $��� ���� ����� �� .����)� �� � � ����� ���.����N���� � �� � � ��� ����#�� ���� � � ����� ������� ������

D� �� ������� �� ������� � ",������N� ������� �� ��������� ��� &;� $�� ���� �� �3����� ����� �� 50 ����� ���� ������� ��������� .�� ����� $�� � ��� ������������ ��� �3������ ��� ����������������� .�� ������ %�� � � 00�0 �. &;� � � �������� ��)����� �� ���� 4�> �� 0>�< �. ��� ��� � � <�4 �. &;� � � ����������)�� ��� �� ���� ?�6 �� <�> �.� G�� ����#����� ������ �� ����������#� ���� �� ����� ���������� &��#���� ������� �� ������������ ������ �� � �� �#� ����)�� � � ���� �� �������������� .��$��� ������� �� � B��������#� ������ . ������.�� � ��������� �� ����� ���� � �� �� �������� �� � � ���.�� ����������� +��� �� �� �� 0115( /�� 0112-� � �� ��� ����� $��� ������� ���� �� ������ � � ����������� �� � � ���� �� �������������� �������� ���� � � ������ ��� ��������� �� �����3����������� ������������� �������� �� �3������ � � 00�0 �. &;� ������������ � ��� ������ ���� �� ����� ��������� �������� $�� � � <�4 �. &;� .������ �� ����������� � � �� ��� �� ����� ��$ �� � � ��*���� �� ��������� ��� ����� +'������ �� �� 0115-� /�� ������� ���������� ��� ������� �� ������� �� � ��� ���#���� . � �00�0 �. &;� �����

� ��� $�� � �� ��N���� �������� �� � � ���.�� �� ��������� $�� ��������� ",� �3������ �� � � ��������� +'������9/����� ����� R >�>>0< ;�! 6�- .�� ��� � � ������ +� R >�8658 ;�! 6*-� D� �����$� ���� ���#���� ������� +��#��$�� . �� �� ��� /�� 0112-� �� � � �������� �� ����� ��������� ��������� $�� � � ��� �� ��� ������� �����.�� � �� � �� �� �������� ��� �.���#������ �� ;�! 6��� ���� � �� $� ��������� ���� �� ����������� ������� �� ��� �������� ��������� � $� ������N�� �� � ������������ �������� �� � ��������� �� ��������� �� .�� � � ������ +!�������A� ��������������� ���� � R >�>4- ��� ��������� +��� �� � �� ������ ������ ������ �� ��N����� � R >�><2- ��� ���� $�� �� ", �3������ ����� �� � � ��������� +!�������A� ���� ����������� ����F � R >�>>6�������� �3������( � R >�>46 �������������-� � ��� ���� �� ����������� ��� �.���#������ �� ;�! 6 �$�#�� .������ � � �������� �$�� � �� �� � � ��������� � ��� $�� � �� ��N���� �������� �� � ������� � � �� � � �� ��� �� ",� �3������ �� � � ������ �������������� +'�������/������ ���� � R >�>410 ;�! 1�- $ �� �� ���#����� �� � � ����� �� ;�! 6+�-� D� ���� � � ������� ������ �� � ������� �.���#�� �� ;�!� 6+�- ��� 1+�- �� ���� � �� � � � ��

;�!�� +# $�������� ������ �������! ��� ��"��� ����� �� �7&���������� ��5�� �����# D��������� ������ �� =�;�� ����� $�� � �����? ���������� ����.�� ��� � ���� ������F +�- �������������( +�-���������� $�� <?1 �� ��� ��? ",� +?1>94>> ��-�

;�!�� <# $�������� ����� �� ��"��� ����� �� ���� ���'����� �7&���������� ��5�� �����# !��� $������ +�- ��� ���� ��� +�-������� �� ����� ������� ��� ����N�� ���� =�;�� ����� �3����� ����� �� > �� <?1 �� ��� ��? �� ",� +?1>94>> ��- +9 ���S �������������#��- ��� ���.�� +�- $�� � � ����? ���������� ����.�� ������� ���� ������ ��� #������)�� $�� �� �� ����� � ������������������������ ����� �� +�- � 6?&��������.���� 45> .� &;� ������� ���� � � ����� �� ��� �� � � ����� ������� ����� +��� ��������� ��� �����-�

3*3 ��E �� �� �=G ��"���� �% D�,G!�DM��D,G �G�������ME

Page 4: The Spectrum of Mitochondrial DNA Deletions is a Ubiquitous Marker of Ultraviolet Radiation Exposure in Human Skin

���������� �������� �� ����� ��������� $��� ������.��� �� ����������������� �� � � ���� �������� �� ��������� $�� ��������� ",� �3������� �� ���� � �� $� ��������� ��� ���� ���� ;�! 6 ���� ��� � � � ������ �� ������ �������� �� �3������ � ��� ������ ������������� � � �� ��� �� �� ��N����� �.���#�� �� � � �������� �� � ��������� ���.�� $�� ��������� ",� �3������ �� � � ���������+���� � R >�>>>6- � ���. ���N���� � � ����������� �������������.���#�� �� ;�! 6+�-�

�� �������� �� ��������� ���� ��������� �� � ���!� ���������� �������� ������� %��� ��������!������������ �������� � � N���� � �� ����� ��������� �� ���� ������ +=�.��� �� �� 0112( &���� �� �� 0112( ������ �� ��0111- �� �� �� $�� � � ���� � �� ",� �� ��������� �� � � ������ �� � � ������ ���� ������� �������� �� �� ���� � � �������� ������� ��������� �� ��������� ������ ��� � � ��*����� ���������������� ��� &;� ������� $�� ��������� �� � ��� � ����������� ��������� +�B������ ���� ���������� � R 4( ��$��A�������� � R 0( ��� .���� ���� ���������� �R 6- ����� ���� ����������� ������������ �����3����� .�� ����� ��� ������������� ������ ���3������ ���� ��� ������� ������� �� ;�! 6 � � ��������� �������� �$�� �� �������� �� � � ������ ���.�� �� ��������� $�� ��������� ��� �3������� �� ��������� $��� �������� �� ������������� ��� ������������ �����3����� ������� .�� ������ #������� ?�< ��� 4�> $��� �.���#�� �� �������� �����3����� ������� ���������� ��������� ��� ����� ��������#��� � � ���������� �� � ������� #����� .��$��� � � ����� ��� � � ������������ ���������$�� ��� ������������ �� ��N���� +�$�������� �����/ ���� ����� R >�5124>-�

��� ������� �� ��� ���� ������� D� �� ������� �����#��� ���� � ���� � � ��� ����� �� ����� ��������� $��������� +�- � ������#� �������� ������� �� ��� �� �����3������������ �� $��� �� +��- � � ����� �������� �� ���������� �3������������ ������� +���� �������� $�� 3�������� �� ��������-�

� ������ � � ������� �� ����� �������� �� � �������� ������� �� ������ $��� �� � �$� � ",�������� ������������������ �� � ����� �� ��� �� ����� ������� $�� �� � �

������� ��� +&������� �� �� 0115-� ���������� ������� $��� ������� ���� �� ��#���� ��� � ?25 .� &;� ������� ���� ���� ��� � ���� ��� +���� �����N���� � � �������J08 � ���� ���.������- �� � �����3����� ������ ������ ���$� �� ��.��� � � ��#�� +?5C- �� ������ ��������� ;������� ��� ��B������ �� ���� ������ � �$�� ��� $��� ��� ��B����� +�������� �� ��0120- ����� ���� ��� ����� �� $ �� � ���$� ������� ��� +� ��; ���������� �� �������� 6015- $�� ������N�� +=��� �� �� 011<-�

����� �������� �� !������� �� ������� ��� �� ��� ����� "�� ������������ ��� � � ����� �������� �������� $����#���� ���� �� �������� $�� 3�������� �� �������� ��� ��#������������ ����� ���� � �$�� � ��N����� �� ���������� �3������������ ������� ��������������� ����� ����.� ���� � ��� ������ � ������ �3���� ���� � +��#��$�� . '������ �� �� 0114-�3 �.�� � � ���� ������� ��������� �� �� ����� �� ����� ��������������� $ �� ��� ���������� $�� ���#���� ��#��� �� � � ����������� �������� +/������ 011?-� D� � ���� .� ����� � �� ��� �� ���������� �3������ ������ � ���� ��� .� ��#��#�� $�� ������� ������ � � ������� �� ����� ��������� .��$��� ������������������������ ����� �� �#� ���� ���� � ���� � � ����������� ����� ���J�� ������9����� ������� ������������� ��� &;�������� �� ��� ���� 6> N.��.���� ���� ����� ���� 3���������� �������� �������� +� ��� ���� &�������� ;���� ����� ��;

;�!�� 4# ��� ������������ ���!�� �� ��� ���! (5� ������� %������'��� �" ������� ���� ����"���# � � �������� �� �������������� ���� ��3 ������� +����� #9$F $ ��� ���� �������( ����� % ��� &F������ �������( ���� 'F ��������� ������- $�� #������)�� �� � � ��� &;����� +���� ������� ������� � � 00�0 �. ����� �� ���- �� � ������ ����� �������� �� �� � ����� �� +�-� � ���� ��� .��� �� � ��� �������� $�����.�� $�� � 6?&��������.���� 45> .� &;� ������� ���� � � � ������ ��� �� � � ����� ������� ����� +�-� ��� �� � � &;� �������� ���� .�� ����� .������ ������� �� +�- $��� ���� ����� �� .����)� �� � ������ ���.� �� +�- ���N���� � �� � � ��� ����#�� ���� � ������ ������� ������ � � ��� &;� ���� $�� #�������� . � � ����������� ��#���� �������� � �� �������� $��� ��� ����� ��� +� ���.�������� ��� �� � � 00�0 �. �� <�4 �. ������� �����- ��� ����� ����� '����� !��� ������� ������� � �� ��.���� 5<C �� � � �������������� +� ��� ���� &�������� �� ����.��� "��#����� �� ��$������ "�'�-+������� ��� � �$�-(

;�!�� 6# � ��!��'���� �������� �� ��� ���� �� ��������� %������������! �7� ������� �� �������� �� ��� �������� �� ��� ��������# � � ���.�� �� ��������� �� +�- ��������� ��� +�- ������ �������$�� #������ ��#��� �� ",� �3������� "��� � � '������9/����� ���� � �������� $��� � �$� �� #�� �� ��N����� .��$��� ��� �3������ ���� ��� � ��������� +� R >�>>0<- .�� ��� �� � � ������ +� R >�8658-�

,��� 00< ��� 4 �;���G� ?>>> ����� �G�G�D�� !&G;��"� ��� ",� GI&�!"�G 3**

Page 5: The Spectrum of Mitochondrial DNA Deletions is a Ubiquitous Marker of Ultraviolet Radiation Exposure in Human Skin

��� ��� "�'�( ��� ��������� ��� ����� ��� ������� �� � ���������������� �����- � �$�� ��� �������� � $��� �������� ����������#� �� � � ��������������� �����

�D!;"!!D��

����� �� � �� ��N���� ��� �� �� ",� ��� � � �������� ������� ��������� �� ������ �� � ������ �� �#����� ����� ���� ��� � � �����

"��� ���������� ����.����� ������ � ����� � ���� ������ ���������� ���#��� ������ �#������ �� � ���������� ��������������N���� �� ������ � �� �� ���� � �� ����� �� � �� ��N������� �� �� ",� .�� �� ���� .� ��������#� �� � � $���� ����������� ���� � �� � � ����� &��#���� ������� +E�� �� �� 011<(�����.�� �� �� 0115 0111( ���� ���� �� �� �� 0112- �#�������� �� � � ��������� �� � ��� �� �������� $ �� �� ����� �������� �� � ��������� ���������#� �� � � �#����� ������� ������������� ������������ +;��������� �� �� 011?( ����# �� �� 011<-�� ��� ������� �#� � ������� ��#���� ���� ��� � ����� ������� �� ���� ��� �� ���� �� ������� ������� D� � �� ���� $� �#��3������ � ��� ���#���� ��#���� ������ . ���� � ��� &;���� ��B�� �� ������ ������ � � ������ ����� ������� ����� ������� �� ��������� � � �������� �� ����� ��������� �������� ��", �3������� � ��� $�� � �� ��N���� �������� �� � � ���.�� ��

��������� $�� ��������� ",� �3������ �� � � ���������� � ��N���� �� ��� ��������� ��� . �� � ����������� ��������� ������� ��������� ���� �������� . � � ��� &;� ��� ��B��+��#��$�� . �� �� ��� /�� 0112-�

!������)�� � �� ��� �� ���� �� ���.������� �� � �$� . � ����������.�� ��.��� �� � � ������� �������N� ���������� ���������� � � � ���� �� ��� ����� ��� ���������� � � ��#��� �� �������������� +������� #��$������ ��� ��#��$�� �� ������ �� )����� �. �� �� ��� /�� 0112 ��� �� ��$���� �� �� 0111-� � � ��*����#���� � �� � � ��� &;� ��� ��B�� �� ��� ��������� �������#���������� �� � � �� �� ��� ����� ��� � �� �#� .��� ���� ���3����� � � ��������� �� � ��� �� �������� ����� 7�� � ��� ���#�������� +���� ���� �� �� �� 0112- ��� � � ������� �� ������ ���+E�� �� �� 011<( �����.�� �� �� 0115-:� %�� �3����� ������#���� ���� ������N�� � � ������ ����� �������� ��� �� � ������� ���� �����3����� ����� $ ����� � � ��� &;� ����������N�� � � ������ �������� �� ����� ��������� ��� ��� ��� � ��������� ��� � � ������ .�� ���� �� ���� ���� ������������� ��$��� �� �����3����� ������ %��� ������ � ��� $�� �� �#������ ����� ���#���� ���� ��� � � ������ �������� �� ��������� ������$ ����� � � ������� $��� ������ � �$� ����� ��������� �� �������� ��� � �� ��������� ���������� %����� � ���������� �� � ��.���#�� �������� ���B������� �� �����3����� ����� � �$� � �� � ���� &;� ���� +���B���� �� 18C- �� ���� �������#� � �� � �B�����N������ �� � ��� �� �������� ����� +���B���� �� ?5C- �� ������#���� �����

� � ��*�� �����#���� � �� � � ��� &;� ���� �� � �� �� ���������������� ������ ������� ������ +������� ��� � �$�( ���� $���. ������ �� �� 0112( ����# �� �� 011<( ��� ��#��$�� .�� ��$���� �� �� 0111- � ���. �#�� � B��������#� ��� �� � �� �B���������#� ���N�� �� ����� ���������� D� � �� ������� � � ��� &;� ���� �� ������� �� �� �� ����B���������#� &;� ��� ��B���$ ��� � � �.������ ��#�� �� ������� ����� ������ .� #���N�� .���� ��� ������� +&�� �� �� 0114( �����.�� �� �� 0111-� � ������ ��� ��#������� � � ��� �� ��� &;� �� � .�������� �� �#���������� ���� � �� ���� �$�#�� ����������� �� ��������� ��� �$� . � �� �����

/ �� �� � � ���������� �� ��N����� �� � ��� ����� ���������T� �� �� ���N���� �� ���$�� �� � � �#������ ��� � ���������� ��N��� ������� ������� ����������� ������� �� ����� ��������� �� ������� +����#��$�� . �� ��$���� �� �� 0111-� � �� �� ���� �� ����������� .� � �������#� ������ �� ����� ������� ��� +; ��� �� �� 011?(!������ �� �� 0114- ��� � � � ��� ��� �� ����� ���� � � �� ����B����� �� �#� � .��� ������ �����B����� +&������� �� �� 0112-�%����� �#�� � � � ���� ���� ���� �� ����� ��� ���� ����� ����#���� ��� ��� ���������� ������.����� �� ����� ������� .�� ���������� ����������� D� �� �� ���� �$�#�� � �� �#�� ���� � ������������� ������� ����� � ��� �� .��� �� ����� ��������������� � ���������� ��N��� �� ����� ������� ����������� �� � �� �������+�� ��$���� �� �� 0111-� / ���#�� � � ���������� �����B������ ��� � �������� �� ����� ��������� �������� . ��� &;� � ��� ������ ��� ������� ���� ��� ������ ��� �� � .�������� �� �#���������� ���� ��

(������ ������� �� ���� ��������� �� ���#��� ���� ����� � � ��� ����� �� ����� ��������� $� �������� � ������#��������� ������� �� ��� +&������� �� �� 0115- �� �����3������������ �� $��� �� � � ����� �������� �� �������� $�� 3���������� ��������� ��� ������� �� ������ �� ���#��� �� �#������ ���������� �$�#��� ������ ������� �#� � �$� ��������������� ��������� �� �� �� ����� ��� �������� �� ���� ������� �� ���� ���������� ��� ������ ������ ��� ���� �����+=�.��� �� �� 0112( &���� �� �� 0112( ������ �� �� 0111- ���� ��� �� .� $��� �� ������ ��#���� ����� �� ����� � ���� ����� �3������� ��� �.���#������ �� ���� �� ������� .�������� �� ",� �3������ ����� ��� �� ������� �� ��������� +.��������� �� ���� �������� ��� �����.�� �� �� 0111- ����������������� ��.��� ����� �� � � ����� +=�� ��� /�� 0118-$ �� $���� �� ���� ����� ������ �����.������� � ���.�������� �� �������� �� ���������� D�������� �� � �� ������� �� �

;�!�� 1# ��� ����� �!� ��������� ��!��'�����" %��� ���������!�7� ������� �� ��� ����� !���� �� ��� �������� �� ��� ��������# � � � �� �� ��� ��������� +�- ��� ������ +�- ������ ��� ����������� ��� ",� �3������ ����� "��� � � '������9/����� ���� � �������� $��� � �$� �� #�� �� ��N����� .��$��� �3������ ����� �� � ���������� +�R >�>410- .�� ��� �� � � ������ +� R >�5666-�

3*= ��E �� �� �=G ��"���� �% D�,G!�DM��D,G �G�������ME

Page 6: The Spectrum of Mitochondrial DNA Deletions is a Ubiquitous Marker of Ultraviolet Radiation Exposure in Human Skin

���� � �� �� ������N�� � ��*�� ����� �� ���� �� � ����� ���� .J����� � *������� $�� ����� ��������� ����������� ��������� $ �� �� .��� ���������� �� �����3������<>C �� � � �������� �������� �� ��#���� ������� ���� � �� ���� +,������ �� �� 0118-�

D� ���������� $� ���#��� � � N��� ������ �#������ ��� � ���������� �� � ���� ������ �� ����� . ",�� D� �������� $� �#� ���� ��� &;� �� � �$ � �� �� �������� �� � � �������� ������� ��������� �� � � ��������� �� �� ��N����� ���������� $�� ��������� ",� �3������ �� ���� ����� � � ��� � �������� ����������� ������N�� �� ��� ���� � �� �� � � �.�B������ ��������� � � � ���������� ���� �� ����� ���������� $�� ",��3������� ;������� $�� � � ��������� �� ��� �� ��������� ���� ���������#� &;� $� � �$ � �� ��� &;� �� � �������#� ��� ��B����� �� � ������� ���#��� � ���� ������ ����#� ��� �� ���B���������#� ����3 �� ������ ����� ���� � �� ����� /�� ������� ������ � � ��������� �� .��$��� � � ����� ���������������.�� ��� �� ������#� ���������� ���������� ������� ������#�� +�� ��$���� �� �� 0111-�

*� � +�"��� � �� ,��� ��� ������ � �� -��� . ���� /�0��1 ��� ��

*������ ��� 2�������� ����� /3�-1( �- �� � ��� ���� ���� ����"(

�G%G�G�;G!

�������� ! ������� �� ������� �M �� ��F !�B����� ��� �� ���)����� �� � � ��������� ������� ������ ������ ?1>F4<5948< 0120

�����.�� � M��������� � !�� � = M��$� � ,� ����� ' ��)���� �'������� �F ; �������� �����#�������3����� ���� ���� � �$� � � ���������� ���B���� �� ����� ������� ��� �� �������� �� ���3����� ���� ���� � ������������ ������ 4� �� 4���� 88F?509?5< 0115

�����.�� � M��� ������� ! '�U���� , ��)���� � ���#�.� ' !��� = '��������F !�� ��� �3 �� �������� � � ",��������� ��������� �� � � � ���� �� ����������� ����� ������� ������ ��������� 3 0�� 2�� ?54F0<64<90<6410111

���� ���� �� �� ������� � ������ � =������ % ���� �F ����� ������� ������������ �� ���� ���� ��O��� � ���� ��� �� � �� � ������ �� � �� � 3 ������������� 00>F04190<? 0112

������� & &�������#��� �� ����������) � =����� � ���� �� � %����� �GF������ ��������)����� �� � ������������ ���������)�� ��������� ��������������� ���� ����� 3 2��� 0�� 0>8F5809550 0122

������� G� �� ���� �� �� ��$���� �� ����� �%/ ����.��� ��F ���� ������� ������� ��� ��������� �� ���� � �� F ������������ ��� � � ����������#��� ����� ��� ������� ��� ����� 46F?059??6 0112

;�#���� �� ���� �;F ���� ������ ������ ������ ��� ���������F ��� � ������ ������ ��#��#��T ������� -�� 612F019?8 0112

; ��� � �������))� � E����� � �� ��F �G��! �������� �� ����� .����� ���� ��� ������������� ����������� ������ ������ ������� �� ������� ��� ���� ��� ������������� .�� �� � �� � �� ��#��� �� �������� ��� ��$������� ������������������ 4� ���� � �� . � �.� 21F4??094??< 011?

;����� �� ���� �� %����.�� G;F � � �.����� �� � ��������� ����� ��������� ����� �� ��������� ����� ������� 4� ���� � �� . � �.� 50F?5559?520 0154

;�����.�� �� / ����� ,; ,� �� % ;������� ;F D����������� �� ������� ������� �������� ����� ������ . ���������������� 3 0�� 2�� ?5?F<64?9<6450115

;��������� M� ! �.��� � !��� ��/ ��� �� �F � ������� �� ������������ �� �������� �������� �� ����� ������� ��� �� � �� ���� �������� 4� ���� � ��. � �.� 21F565>95654 011?

;������ �� �� � ,�F ������ �� �3�����#� ���� � �� ������� ��� ����� ���������� �� ��������� ������ 3 0�� 2�� ?5?F?<4>19?<40? 0115

%��� &� ����� �� ����� ��F & ���� ���� ��� ��� ����� ��������� �� ���������F��$ ����� ��� ���� 0� ��� 3 ?14F?><9?>5 0125

M��� ���� �� E��� �F � ��� ��� � ���� ��� �� � � ����F �.���#������ �� � ��������� ��� ��������� ��#��� 0� 3 ������� 0?5 +!����� 40-F?<96> 011?

M���� �� ���� �;F ����� ������ ��� ���������� . ��� � ?20F06>19060? 0112=�.��� / �������� ! !� �� �F �������������� �����.���� �� � � ����� �������

��� �� ���������� ����������F �#������ ��� ������� ������ ������ ������� ������� ������ 5� ��� 05F016090165 0112

=��� � � � �� ! '���� � � ��������� � M��� E ������ DF D����������� ����������������� ����� ������� ��� ��������� ���� =��� ����� ������ ����� ������� ��� ������� �� ����� ������� ����������� 4� ���� � �� . ��.� 22F0>80490>802 0110

=��� � ���� ��� & ������ � ������� � ���� & =���� �� �F D�� ����� ���������� �� ����� ������� ������ � ��� �� 648F021901> 011<

=�� �= /�� E=F � � ������� ���������� �� � � ����� ���� O����� ��� ���������������� �� ���� ����� ������� ���� 0� �� 3 602F0>8<90>5> 0118

������� �& =���� �� Q����� &� G3�������� �� ������� ���� ���� ���� ��� ��� �#����������� D�F ��& ������ �� Q����� & ����� M ���� 42-� � 4�� �� ������� � �3���� "��#����� &���� �3���� +"'- 011?F �� ?19<>

' ����� ' ����� � � ��� /M �� ��F ;����.����� ������� �� $ �������� ������� ������ �� � �� ���� ���� ��#���� � �� ��N���� �������� �������� $�� ������� �3������ ���������� �� � � ��� -�� ?5F?4649?440 0111

'������ ! /������� " !�������%�� � � '��U ��.�U � ! ����� ����� G ���� �� ����� ���M������ !F ��������� ��� � ��������)����� �� ����� ������� ���������� ������ �� &������ ��� '�����9!��� �������� . ��� &;�� 6��)���� 0>>F84698<> 0115

'������ E ���*��� � !�)��� � ������� � � ����� GF ���� �� ������������B��������� ��� ���� ������ . � ����.����� � ���� �����������N����������� ����.��� �� � � ��� -�� ?<F622196214 0115

'�#������ !� '������� M '���� �� ������� �/F ������� ���� ������ ������� �3�����#�� ������� �� �� ��� � � ��.*����� 0� �� 0���� -�� 2���?6?F04590<? 0115

'������ '= ��# �� &����� ;� M�)����� G� ����$��� ! ����.�� !!������ ��F I�������� �� �������� ��� ������� ���������F �3������ � ������ � .��$��� �������#� ��� ������ ��� ������� 3 ������ ������� 0>6+!�����-F1890>0 0114

�����3 !& /����� �� DDD �� � ,�� ����� ������� ��� ������ ��� ���� ��*��� D���� �= ����� �& ���� ��� ������ ������ ���7 ����� �� �!� � ���������� &���� ��$ E��� � ����� 62 0116 �� 4809455

�� ��$���� �� ����.� =� '�*����� ��F ����� ������� ��� � ��� � �� � .��T������ )���� 0<F10916 0111

����# ! ! ������ �� '������ � /������ �;F ������ �������� �� � � ���.�� ���#����� �� ����� ������� ��� ������� ������ �� � �� ���� �������� ��������� � � ��� -�� ?6F40??940?8 011<

��)��� � ������� � � D ��� � ������� �F G���.��� ���� �� � ��������������.�� ���� ��)�� ����.��������� � ���� ������ �� ���� ����������#� ���� $�� 84��0 ����.�� �����N� ��� +894- � ������������������� -�� ?<4F05<9024 0110

���� � ������ � =������ � ������� � � D ��� � ������� �F !���������������.��� ���� �� ���������� ����.����� �����N� ��� ��� �� ����.�������������� ����� �� +894- � ���������� ���� � � ���� ����� ������)��$�� �����#���������������� ���� 4� �� 4���� <4F??<9?6? 0110

������� �� ���.�� � =���� G ������� �F ;����� �3������� �� ����� ���������� $�� �������� ��������� �� ��������� �������� ��� �����#� �3�������� � ������� ��� ��� ����� 4>F5>59506 0118

�� �� & /�� E�=F � ��� ��� ��������� ����� ������� �������� ������ )����04F<069<05 0112

&�� ;E ��� =; E�� �= /�� E=F =���� ���� ����� ������� ��� ������������������� $�� �� � �3������� �� 0� �� 0���� 60?F<649<62 0114

&������� � ,������ � ,�� =����� � ,�� P������ �� ���������� �=%�� ������ GF ��� ������ �� ", � ����������� ��� ���� ������ �� ��������� ������� ���� 3 �� 0�� ?56F40594?5 0115

&���� ' �� E� P � = �� ��F !������ ��������� �� � � ����� ������� ����� �� ���� ���������� �������� ������ )���� ?>F?109?16 0112

&������� /' ����� �� ! ���� &/ �� ��F ������� ���� �����B������ ������������� � � ������ 4155�.� ����� ������� ��� ��������� ��� 30� �� ?<5F01?9?>0 0112

&����� �F ������ �� ��������� ������ �� ������� ��� ����� ������� ��� �� �������������� $�� ��$ ����� �� �����#����� �� �� 3 �� 0�� 12F520951< 015<

���� ��F !��� ������� D�F !���#�� ;� ������� �� !� /! ,���� � ���� ������� ��� ��� ���� 0���� � �������� ��������� ��$ E���F ��M��$�=��� 0115

������ & ; ��V���� �% !�#� ��� % ���� �� M �� ��� , ������W�� & ���� ��W�EF ��� &;� ������� �� ���� ����� ����� �� ���� �������#������ ������� ����������� �� ��������)�� ��� �������� � � .���������� ��� ��� ������� 0� �� 0���� -�� 2���� ?<?F6569655 0112

!�$�� G ,�� =����� �F ������ �� ��� ���� � �� ����� ������� ������� -��8��� -����� 464F0809058 0111

!������ � ������� G !� �� G� ������� ! ������ ;�F ������.����� �� $��� ������ ������ �������� ����� �� ����� �� ������ ��� ��������������N����������� N.��� ���� �������� $�� ����� ������� ����� � 6�� �� )����6F06901 0114

������ ! ��� �)��� ; �����$� E �� ��F ��������� �� ����� ������� ������� �� ������ �� ������ ������� �� �������� ��������� ��� 3 2�� �� 9�: 6<F6089601 0111

��� �� ;= M�..�� �� ! ����� ! P�#���� � ������ ;�F �3�����#�� ��� �������� ���������� ���� ��� �������� � � ���� �� ������������ ��� ��������� ����� ��������� �� �������� ������� ������� -�� 651F0900 0115

,�� ���� M; M������� �& =��� ,� ������ �� ����� ;�F �������� ��� ���������� �� ��� ����� ������� ���� G#������ ��� � ��*�� �� ����� ����� -��;����� �� �� ���� �� 641F1<90>5 0118

/���$�� � �� ��������� &M ���� ��F ; �� �� �� ���� �������� ��� � �� .�������� ���������� �� � � ����� )����7 2������ 2�� �� 0?F4<941 011<

/������ �;F �������� �� � � ����� ������� ���� ���� -�� 0� �� 80F005<90?0?011?

/�� E=F �3�����#� ������ ��� ����� ������� ��� ��������� �� ���� � �� � 4� . �!� 0�� ��� ?05F<6986 0112

/�������� ��� G��������� �� �����#����� ���������� D�F M��. �� !���� �! �������� /�������� �� ���� �������� �7 2����� ��� 4�������� � .+�� �������������$��� �3���� 0112 �� 0?090?2

E�� �= ��� =; /�� E=F & ���� ��� ����������� ����� ������� ��� ��� � ��������� �� ���� ����� �� ������� -�� ?25F8409842 011<

,��� 00< ��� 4 �;���G� ?>>> ����� �G�G�D�� !&G;��"� ��� ",� GI&�!"�G 3*>