The microarray data analysis

Ana Deckmann

Carla Judice

Jorge Lepikson

Jorge Mondego

Leandra Scarpari

Marcelo Falsarella Carazzolle

Michelle Servais

Tais Herig

Summary

- Statistics background

- Introduction to microarray

- Pre-processing microarray data

- Statistics analysis

- D-maps

- measurement = truth + error

- error = bias + variance

Error model

Normalization Experimental replicate (techniques and biological) and statistics

Bias describe a systematic tendency of the measurement. Ex: dyes Cy3 and Cy5 don´t have the same efficient

Variance is often normally distributed, ex : instrumentation imperfection and biological variation

Statistics background

Introduction to microarray

-Three different microarray technologies :

- Spotted cDNA microarrays (500 to 2500 bp)

- Spotted oligonucleotide microarrays (30 to 70 bp)

- Affymetrix chips (25 bp)

- Can be used to :

- Differential gene expression studies, gene co-regulation studies, gene function identification studies. time-course studies, dose-response studies, clinical diagnosis, …

Two color architecture

Probes: 30-meros, 90% até 550 bases downstream extremidade 3’ Targets: 10ug cRNA biotinilado

Codelink architecture (one color)

higher frequency, more energy

lower frequency,

less energy

excitation

red lasergreen

laser

emission

overlay images

Scanning

A

B

C

H

G

F

D

E

1 2 3 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11abcdefghijk

Scarpari, Leandra – 2006 – Tese Doutorado

Ludwig flags : (0) Int <= Back

(1) Irregular spots

(3) Spot ok

(4) Saturated

Ludwig scanner

Codelink flags :

(L) near background

(C) contaminated

(S) saturated

(M) masked

(G) good

Codelink scanner

A

B

C

H

G

F

D

E

1 2 3 4

LGE defined flags :

(0) – Spot ok

(1) – Spot Saturado

(2) – Int/Back <= 1.05

(3) – Area <= 110 or 50 (9x9 or 11x11)

Defined intensity :

-Int Cy3 = Area Cy3 * (median(Int Cy3)-median(Bkgd(Cy3))

-Int Cy5 = Area Cy5 * (median(Int Cy5)-median(Bkgd(Cy5))

LGE scanner

Cy3= 3329280; Cy5= 2251624 r=0.67 (fold=-1.49)

(Target median - Bkgd median) * Area = integrated intensity

pixels out pixels in > pixels outpixels in

- * =

Cy3= 222824; Cy5= 15488 r=0.069 fold=-14.5 flag=0

Cy3= 481536; Cy5= 676000 r=fold=1.40 flag=0

Cy3= 293664; Cy5= 485368 r=1.65 flag=0

Cy3= 6400; Cy5= -3584 NA (sinal:ruído<=1) flag=2

Cy3= 8767720; Cy5= 1349296 r=0.15 fold=-6.7 flag=1

Pre-processing microarray data -Bioconductor repository (http://www.bioconductor.org/)

-Log intensities

R=G Log2R=Log2G

Most genes have low gene expression levels. What happens here?

up-regulated genes

down-regulated genes

non-differentially expressed genes are now along the horizontal line:

M = 0

log2R - log2G = 0

R = G

Transformed data {(M,A)i}:

M = log2(R) - log2(G) (minus)

A = ½·[log2(R) + log2(G)] (add)

M vs A plot

log2R = red channel signallog2G = green channel signal

Density plot

1

16

Print-tip box plot

Normalization within slidesExpectation: Most genes are non-differentially expressed, i.e. most of the data points should be around M=0.

Median normalization : which sets the median of log intensity ratios to zero

Median value = 0

Lowess normalization : global lowess normalization

Print-tip normalization : print-tip group lowess normalization

X*ij=(Xij-median(GRIDj))/sd(GRIDj)

Scaled print-tip : scaled print-tip group lowess normalization

Normalization across slides-QUANTILE

QQPlot

Mean between 8 slides

-LOWESS (applied in one color microarray)

Transformed data {(M,A)i}:

M = log2(Int1) - log2(Int2) ; A= ½·[log2(Int1) + log2(Int2)]

Statistics analysis- T statistics test

The T statistics down-weight the importance of the average if the deviation is large and vice versa;

T = mean(x) / SE(x)

where SE(x)=std.dev(x)/N (standard error of the mean)

The blue gene has the lower T-value than red gene.

Top table and volcanoplotp.value F.change GENE1.01E-07 -1.5 interleukin-18 binding protein3.94E-06 -1.3234 Matrix metalloproteinase 30.000734 -1.93895 leukocyte integrin alpha chain7.25E-05 1.960643 azurocidin 1 preproprotein1.38E-09 2.317313 Macrophage-stimulating protein6.82E-05 2.34858 alpha1-antichymotrypsin

Fold change =

ratio; if ratio >=1

or

-1/ratio; if ratio < 1

Cluster data analysis

Automatizar a análise dos dados

Diferentes formatos

●

●

GeneTAC (LGE)

ScanArray (Ludwig)

CodeLink

NimbleGen (Futuro)

Objetivo do Programa

Possibilita a criação de diferentes projetos

●

●

●

●

●

Características do Programa

Estruturado por etapas

Linguagens: cgi, R (análise estatística)Banco de dados: MySql

Português e Inglês

Estrutura do Programa

Submissão dos Arquivos da Lâmina

Seleção de Dados

Normalização

Análises Estatísticas

Definição de um Projeto

Configuração da Lâmina

LGE e Ludwig

CodeLink

Criar / Selecionar um projeto

Definir o padrão

●

●

Estrutura do Programa: Definição do Projeto

Número de Placas funcionais

Estrutura do Programa: Definição do Projeto

Submissão dos arquivos

Definição dos grupos

●

●

●

Estrutura do Programa: Arquivos da Lâmina

Definição dos canais

Estrutura do Programa: Arquivos da Lâmina

Exclusão de spots indesejados●

Estrutura do Programa: Seleção dos Dados

Diferentes formas de exibir os dados

Diferentes filtros

Imagens

Estrutura do Programa: Seleção dos Dados

Métodos diferentes●

●

●

Estrutura do Programa: Normalização

Opções

Visualização

Estrutura do Programa: Normalização

●

●

Estrutura do Programa: Análises estatísticas

Fold Change

Pvalue

Estrutura do Programa: Análises estatísticas

Gráficos: Lâmina

(Fonte: Leandra Scarpari)

Grid

Gráficos: M vs A plot

M = log2(R/G)

A = ½ log2(RG)(Fonte: Leandra Scarpari)

Gráficos: M vs A plot

(Fonte: Ana Deckmann)

Gráficos: Density

(Fonte: Leandra Scarpari)

Gráficos: VolcanoPlot

Fold Change: Escala de comparação entre as razões

Pvalue: Reprodução dos dados(Quanto maior o módulo, mais diferencialmente expresso)

(Quanto menor, mais estão se reproduzindo os dados)

(Fonte: Leandra Scarpari, Ana Deckmann)

Gráficos: Clustering

Busca de padrões

(Fonte: Ana Deckmann)

Fim

Box plot

Comparison of normalization methods for Codelink Bioarray data

Differences between pair of arrays in the technical replicates :

(1) Array 1 vs array 4

(2) Array4 vs array 5

BMC Bioinfomatics 2005, 6:309

- Within slide normalization

Before After

Print-tip normalization

No norm Print tip Scaled print tip

Nucleic Acids Research, 2002, vol 30, No 4