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Análise da expressão gênica em Eucalipto

Aluno- Jorge Lepikson NetoOrientador- Gonçalo Guimarães Pereira

O Eucalipto:

• ~700 espécies e híbridos conhecidos

• Originário da Oceania

• Boa adaptabilidade

• Crescimento rápido

• Madeira de boa qualidade

A madeira:

• Alta demanda econômica

• Derivada do xilema secundário

• Genes expressos em sua formação determinam as propriedades físico e químicas da madeira (Kirst et al 2004)

• Diferenciação e formação do xilema ainda pouco entendidos (Paux et al 2004)

• Demanda nacional de celulose suprida pelas florestas de eucalipto

•6,4 milhões t de celulose.

• Maior produtividade mundial.

• 18,8 milhões m3 em carvão vegetal.

• 558 mil m3 chapa de fibra

• Balanço positivo de carbono – até 14t/hec

• 500.000 empregos diretos.

• 2 milhões indiretos.

• Receita de 13 bilhões de dólares.

• 4% do PIB nacional.

• 14 empresas

• 10 instituições de pesquisa

• Melhoramento genético da espécie

• Aumento da produtividade e qualidade do produto

A madeira do eucalipto:

A madeira do eucalipto é composta basicamente por:

• Celulose 50%

• Hemicelulose 25%

• Lignina 25%

• Esta constituição química varia entre as espécies do mesmo gênero e em menor escala, entre os exemplares da mesma espécie (VITAL, et al., 1977).

Representação da parede lignificada (Boudet AM, et al; 2003)

Objetivo

• Comparar a expressão gênica do xilema de diferentes espécies de

eucalipto, por meio da tecnologia de microarranjos, buscando

identificar genes relacionados com características importantes para o

desenvolvimento da planta e da formação de celulose e lignina.

Biblioteca Genolyptus

• 500 genes!

RNA

• xilema Eucalyptus grandis

• folhas Eucalyptus grandis

• xilema Eucalyptus globulus

• xilema Eucalyptus urophylla

• xilema Eucalyptus pellita

Caracteristícas:

• E.grandis - Crescimento e rendimento volumétrico superiores. 55% dos eucaliptos no Brasil. Madeira leve, fácil de ser trabalhada, de baixa estabilidade e alta permeabilidade.

• E.globulus – Alta qualidade da madeira. Baixa quantidade de lignina, maior relação S/G.

• E.urophylla – Alta resistência à déficits hídricos e a doenças. Madeira medianamente leve e resistência moderada; estabilidade e permeabilidade alta.

• E.pellita- Alta concentração de lignina. Madeira levemente pesada, resistência mecânica elevada alta estabilidade e baixa permeabilidade.

Microarranjos

• A meta dos microarranjos é comparar a transcrição gênica em

tipos diferentes de células ou em células submetidas a

diferentes condições, tentando correlacionar processos

metabólicos com o funcionamento de genes específicos.

• Produtos de PCR (4x96) foram transferidos para uma placa 384.

• Confecção das lâminas.

• RNA é transformado em cDNA, purificado e marcado com fluóforos Cy3 e Cy5.

Figura 1. Amplificações dos clones 1 a 192. Figura 2. Amplificações dos clones 193 a 384.

• Hibridização

• Geração de imagens e análise dos resultados

• Verde = +Cy3

• Vermelho = + Cy5

• Amarelo = Mesma concentração

• As intensidades de luz captadas na imagem podem ser

quantificadas medindo a média das intensidades integradas dos

spots. A taxa de fluorescência de um spot é interpretada como a

taxa de concentração do seu mRNA correspondente na população

de células estudada.

• 15 arrays

• 3 de cada tecido.

Diferenciais:Fold Change > 2P-value < 0,05

Northern Eletronico

• 131 reads

• 84 contigs

• 21 singlets down

• 26 singlets up

Folha Xilema ChipRead ID Contig Gene ID Fold Change

ml xy total Globulus Grandis Urophylla PellitaEUUR-XY-000-011-A12-BA.RContig11442 0.0442087 0.0529234 766 gi|50345920|gb|AAT74878.1| cinnamoyl CoA reductase [Eucalyptus globulus] 2,6EUUR-XY-000-030-D08-BA.RContig3117 3.37288 47.9484 122 gi|62087121|dbj|BAD91881.1| transcription factor lim1 [Eucalyptus camaldulensis] 2,1EUSP-FX-001-011-G09-BA.RContig3117 3.37288 47.9484 122 gi|62087121|dbj|BAD91881.1| transcription factor lim1 [Eucalyptus camaldulensis] 2EUUR-XY-000-029-G05-BA.RContig3117 3.37288 47.9484 122 gi|62087121|dbj|BAD91881.1| transcription factor lim1 [Eucalyptus camaldulensis] 2EUUR-XY-000-091-D09-BA.RContig3117 3.37288 47.9484 122 gi|62087121|dbj|BAD91881.1| transcription factor lim1 [Eucalyptus camaldulensis] 2,9 2,2EUUR-XY-000-010-G05-BA.RContig221 0 46.9385 91 gi|57336886|emb|CAH60718.1| putative plasma membrane intrinsic protein [Populus tremula x Populus2 2,2EUGR-ML-001-086-B02-BA.RContig11754 8.07979 6.04533 68 gi|11036950|gb|AAG27431.1| QM-like protein [Elaeis guineensis] 3,5EUUR-XY-000-077-G11-BA.RContig11754 8.07979 6.04533 68 gi|11036950|gb|AAG27431.1| QM-like protein [Elaeis guineensis] 2EUSP-FX-001-007-A08-BA.RContig7255 5.02075 4.88351 38 gi|82623409|gb|ABB87119.1| NtK-1-like [Solanum tuberosum] 2,5EUUR-XY-000-023-B10-BA.RContig3665 0 7.31804 33 gi|83584406|gb|ABC24973.1| BTF3-like transcription factor [Lycopersicon esculentum] 2,5 2,1EUUR-XY-001-096-D07-BA.RContig3665 0 7.31804 33 gi|83584406|gb|ABC24973.1| BTF3-like transcription factor [Lycopersicon esculentum] 2,2EUGR-ML-000-033-G10-BA.RContig8912 8.85218 19.8697 31 gi|62526569|gb|AAX84670.1| ethylene response factor [Manihot esculenta] 2,2EUUR-XY-000-058-C02-BA.RContig8912 8.85218 19.8697 31 gi|62526569|gb|AAX84670.1| ethylene response factor [Manihot esculenta] 3,2EUUR-XY-000-008-G10-BA.RContig10319 0 41.3836 30 gi|33324614|gb|AAQ08018.1| endo-1,4-beta-glucanase [Gossypium hirsutum] 2EUGR-ML-000-009-C11-BA.RContig1316 14.6192 17.501 28 gi|27752377|gb|AAO19652.1| cysteine protease inhibitor cystatin [Malus x domestica] 2EUUR-XY-000-007-D11-BA.FContig1391 0 31.1363 28 gi|2388689|gb|AAB70005.1| GH1 protein [Glycine max] 2,3EUGR-ML-000-074-E05-BA.RContig6952 16.6369 14.9374 27 gi|82623431|gb|ABB87130.1| putative transcription factor BTF3-like [Solanum tuberosum] 2,3EUUR-XY-000-027-C11-BA.RContig6952 16.6369 14.9374 27 gi|82623431|gb|ABB87130.1| putative transcription factor BTF3-like [Solanum tuberosum] 2 2,7EUUR-XY-000-025-D11-BA.RContig8835 1.73417 2.59503 23 gi|1632831|emb|CAA89698.1| orf [Ricinus communis] 2,9EUUR-XY-000-032-D09-BA.RContig8835 1.73417 2.59503 23 gi|1632831|emb|CAA89698.1| orf [Ricinus communis] 2,1 2EUSP-FX-001-009-E07-BA.RContig7356 12.4048 20.4189 22 gi|15425733|dbj|BAB64344.1| EIN3-like protein [Cucumis melo] 2,1 2,2EUUR-XY-000-045-E04-BA.RContig16317 0 29.8655 20 gi|22597162|gb|AAN03468.1| bZIP transcription factor ATB2 [Glycine max] 2,3EUUR-XY-001-003-A10-BA.RContig11226 13.3385 13.9718 17 gi|15234298|ref|NP_195336.1| structural constituent of ribosome [Arabidopsis thaliana] 2 -2EUUR-XY-000-071-D10-BA.RContig14272 0 39.9357 17 gi|15235712|ref|NP_195493.1| HAT22 2,2EUUR-XY-000-042-G09-BA.RContig10820 29.1736 15.2795 16 gi|15239706|ref|NP_200279.1| DNA binding / transcription factor [Arabidopsis thaliana] 2EUUR-XY-000-020-H01-BA.RContig275 19.2179 25.882 15 gi|2493132|sp|Q40079|VATB2_HORVU Vacuolar ATP synthase subunit B isoform 2 (V-ATPase B subunit 2)2,9EUGR-ML-000-019-H06-BA.RContig3893 18.1262 21.6993 15 gi|60327631|gb|AAX19055.1| class III HD-Zip protein 6 [Populus trichocarpa] 2,6 3,3EUGR-ML-000-074-H10-BA.RContig224 34.4404 15.4611 13 gi|23476313|gb|AAN28287.1| myb-like transcription factor 6 [Gossypium raimondii] 2,6

1

2

3

4

5

67a 7b

7c

upregulated (E. pellita)

upregulated (E. globulus)

upregulated (E. grandis)

upregulated (E. urophylla)

downregulated (E. pellita)

downregulated (E. globulus)

downregulated (E. globulus & pellita)

D3.A2 - Cyclin A - Cell division and expansion! Fold Change 5,1 em glo/folha Cell Division and Expansion

D3.A7 - Chaperonin - Protein synhtesis and processing Fold Change 4,0 D3.b2- no hit 3,4 uro/fol

Furthermore,interesting lessons have been provided by functionalstudies of these new cyclins, notably that they associateto variant CDKs and that particular cyclin/CDKcomplexes can have functions beyond cell cycle control.Actually, some of these cyclin/CDK complexesproved to be active in regulating gene transcription orgeneral cell metabolism, such as phosphate or sugarmetabolism, thereby contributing to cell cycle progressionwithout being essential for the cell cycle(Andrews and Measday, 1998).

ChipFold Change Globulus Grandis Urophylla Pellita

cyclin A Pl1/F6 5,1 -4,2 -3,9 -2,1 Cell division and expansioncyclin-dependent kinase (CDK) 2,5 2,2 2,3 1,9 Signal transduction

The rates of maize growth and lignin biosynthesischange after root-applied chalconeWEIJUN CHEN,1,2†* MIN-SOO YUN,1,2 FAN DENG1‡ and YASUHIRO YOGO1§1Upland Weed Laboratory, Department of Field Environment, National Agricultural Research Center, Tsukuba, Ibaraki,Japan and 2Japan Society for the Promotion of Science, Tokyo, Japan

“The flavonoids, chalcone and naringenin, are intermediates in phenylpropanoidmetabolism in plants. Naringenin is synthesized from chalcone isomerase”

“It was reported that 4CL activity was inhibited by some flavonoids, such as naringenin”

“Consequently, the results suggest that chalcone suppressed maize growth byinhibiting monolignol biosynthesis.”

Síntese de lignina:

• Polímero de natureza aromática.

• Constituida por três monômeros que diferem entre si pelo grau de metilação: coumaryl alcohol, coniferyl alcohol e sinapyl alcohol.

Alguns genes importantes: • CCoAOMT- transforma caffeoyl-CoA em feruloyl-CoA

• COMT- metilação do synapyl alcohol

• CAD- NADPH dependent reduction of cinnamyl aldehydes into cinnamyl alcohols

• CCR- monolignol byosynthesis

• 4Cl- phenylpropanoid pathway

• PAL- mediates the influx from primary metabolism into the phenylpropanoid path

• C3H- operates on p-coumarate esters

C4h

0,00E+00

5,00E+00

1,00E+01

1,50E+01

2,00E+01

2,50E+01

3,00E+01

3,50E+01

Grandis Globulus Urophylla Pellita Folha

Série1

Caffeate Methyltranferase

0,00E+00

1,00E-02

2,00E-02

3,00E-02

4,00E-02

5,00E-02

6,00E-02

7,00E-02

Grand

is

Globulu

sUro

phyll

a

Pellita

Folha

CaffeateMethyltranferase

Chalcone Isomerase

0,00E+005,00E-01

1,00E+001,50E+002,00E+002,50E+003,00E+003,50E+004,00E+004,50E+00


Série1

CAD

0,00E+001,00E+002,00E+003,00E+004,00E+005,00E+006,00E+007,00E+008,00E+009,00E+00


Série1

Coumarate CoA

0,00E+00

5,00E+01

1,00E+02

1,50E+02

2,00E+02

2,50E+02


Série1

F5h

0,00E+00

5,00E-03

1,00E-02

1,50E-02

2,00E-02

2,50E-02

3,00E-02


Série1

Laccase

0,00E+005,00E-021,00E-011,50E-012,00E-012,50E-013,00E-013,50E-014,00E-014,50E-01


Série1

PAL

0,00E+00

5,00E+00

1,00E+01

1,50E+01

2,00E+01

2,50E+01

3,00E+01


Série1

P-cou

0,00E+00

5,00E+001,00E+01

1,50E+01

2,00E+01

2,50E+013,00E+01

3,50E+01

4,00E+01


Série1

Peroxidase

0,00E+00

5,00E+001,00E+01

1,50E+01

2,00E+01

2,50E+013,00E+01

3,50E+01

4,00E+01


Série1

Phenylamino Transferase

0,00E+00

2,00E+004,00E+00

6,00E+00

8,00E+00

1,00E+011,20E+01

1,40E+01

1,60E+01


Série1

Prephenate

0,00E+00

1,00E+01

2,00E+01

3,00E+01

4,00E+01

5,00E+01

6,00E+01


Série1

Phenylpropanoid Pathway

PL4F2

0,00E+001,00E-012,00E-013,00E-014,00E-015,00E-016,00E-017,00E-018,00E-01


Série1

ELF3

0,00E+00

1,00E+00

2,00E+00

3,00E+00

4,00E+00

5,00E+00

6,00E+00

7,00E+00


Série1

Nos arrays:

PL4f2- up 3,4 uro

ELF3- up 4,9 grandis

•Boudet A.M (2000). “Lignins and lignification: Selected issues” Plant physiol. Biochem 38(1/2): 81-96

• Darley C.P et al (2001). “The molecular basis of plant cell wall extension” Plant molecular Biology 47: 179-95

• Kirst, M., A. A. Myburg, et al. (2004). "Coordinated genetic regulation of growth and lignin revealed by quantitative trait locus analysis of cDNA microarray data in an interspecific backcross of eucalyptus." Plant Physiol 135(4): 2368-78.

• Mathysse et al (1995b) “Genes required for cellulose synthesis in Agrobacterium tumefaciens” Jornal of Bacteriol. 177, 1069-75

• Paux, E., M. Tamasloukht, et al. (2004). "Identification of genes preferentially expressed during wood formation in Eucalyptus." Plant Mol Biol 55(2): 263-80.

análise da expressão gênica em eucalipto aluno- jorge lepikson neto orientador- gonçalo...

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