tgf-beta 1 elisa - ibl international · ed è stato correlato ad una prognosi insoddisfacente. ......

TGF-beta 1 ELISA

Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa

di TGF-beta 1 umano nei supernatanti delle colture cellulari, siero e plasma umani.

BE55041

96

2-8°C

I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H

Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 [email protected] D-22335 Hamburg, GermanyFax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com

Istruzioni per l’Uso

TGF-beta 1 ELISA (BE55041) ITALIANO

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INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE

1. USO PREVISTO 2

2. SOMMARIO 2

3. PRINCIPIO DEL TEST 4

4. REAGENTI FORNITI 5

5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 6

6. PRELIEVO DEI CAMPIONI 6

7. MATERIAL NECESSARI MA NO FORNITI 6

8. PRECAUZIONI PER L’USO 7

9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI 8

10. PROCEDURA DEL TEST 11

11. CALCOLO DEI RISULTATI 14

12. LIMITI DELLA PROCEDURA 15

13. PERFORMANCE 16

14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI 18

15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI 19

16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 20

17 RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 21


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1. USO PREVISTO Il TGF-β1 umano ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo del TGF-β1 umano. Il TGF-β1 umano ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche.

2. SOMMARIO Il fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) è una citochina pleiotropica che esibisce un ampio spettro di effetti biologici e regolatori a livello cellulare ed organico. Gioca un ruolo fondamentale nella crescita, nello sviluppo, nella differenziazione e nella proliferazione cellulare, nella sintesi e degradazione della matrice extracellulare (ECM), nel controllo delle interazioni mesenchimali-epiteliali durante l’embriogenesi, la modulazione immunitaria, l’apoptosi, la progressione del ciclo cellulare, l’angiogenesi, l’adesione, la migrazione e la chemiotassi dei leucociti. Svolge attività sia soppressive dei tumori, sia di sviluppo di questi ultimi ed è altamente regolata a tutti i livelli (ad es.: turnover dell’mRNA, attivazione di proteine latenti o modifiche post-traslazionali). Il TGF-β è la prima proteina riconosciuta della superfamiglia di almeno 40 delle citochine strutturalmente correlate TGF-β. Nei mammiferi sono state descritte tre isoforme (TGF-β 1-3). (Ogni isoforma è codificata da un unico gene su diversi cromosomi. Tutti si legano agli stessi recettori). Sono sintetizzati dalla maggior parte di tipi di cellule e tessuti. Le cellule del sistema immunitario esprimono principalmente il TGF-β 1. Il LTGF-β (TGF-β latente) inizialmente sequestrato ed inattivo necessita di attivazione (clivaggio e dissociazione della regione del suo LAP (peptide latente-associato) prima di poter svolgere l’attività biologica. Il LTGF-β può anche essere legato al LTB (proteina legante TGF-β latente) formando così un grande complesso latente (LLC). Il TGF-β forma omodimeri e le sue subunità, ognuna di 12.5 kDa, sono legate da ponti disulfidici. La trasduzione del segnale TGF-β è mediata tramite i recettori di tipo I e II del TGF-β, la fosforilazione e i cambiamenti do conformazione seguiti da vari pathway: Il reclutamento di SMAD ( - pathway: TGF-β porta infine alla fosforilazione degli SMADs (R-SMADs = SMAD 2, 3) regolati dai recettori ed al legame degli SMAD comuni (coSMAD = SMAD 4). Il complesso R-SMAD / coSMAD entra nel nucleo ed interagisce con vari fattori di trascrizione, coattivatori e corepressori. Il TGF-β induce il pathway di trasduzione del segnale dipendente dalle chinasi MAPK- e MAP/ERK (pathway JNK/MAPK, JNK/SPAK-, p38-, ERK1/2 ) ed il pathway NF-κB. Il TGF-β media l’arresto della crescita del ciclo cellulare tramite il pathway della fosfoinositide 3-chinasi/Akt. La segnalazione del TGFβ è super regolata, ad esempio, tramite l’interazione con proteine SMADs inibenti (I-SMADs = SMAD 6, 7) o il legame degli enzimi della famiglia delle ubiquitina-ligasi Smurf1 and Smurf2 o/e i co-recettori. Il TGF-β1 è il mediatore-chiave nella patofisiologia della riparazione tissutale e nella fibrogenesi umana: l’equilibrio tra produzione e degradazione del collagene di tipo I e la fibrosi e cicatrizzazione negli organi e nei tessuti. Il TGF-β1 presenta importanti caratteristiche immunoregolatrici di carattere parzialmente avverso: Il TGF-β 1 inibisce la proliferazione cellulare, la differenziazione e la produzione di anticorpi e la maturazione e l’attivazione di macrofagi delle cellule B e T. Inibisce l’attività delle cellule NK e delle cellule killer attivate dalla linfochina e blocca la produzione delle citochine. Il TGF-β1 promuove la differenziazione delle cellule Treg, causando la produzione di IL-10 / TGF-β1 e la soppressione di cellule Th1 e Th2. Si è recentemente dimostrato che il TGF-β1, alla presenza di IL-6 o IL-21, nei topi promuove lo sviluppo del Th17 e probabilmente, insieme all’IL-1β, IL-21 and IL-23, ha un ruolo nello sviluppo dell’Th17 umano. In questo contesto, il TGF-β1 è coinvolto nell’induzione e nella mediazione delle risposte proinfiammatorie ed allergiche.


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Cancro: Il TGF-β1 è overespresso in un’alta percentuale di tumori umani (ad es.: seno, prostata, cellule renali, pancreas, ovaie, cancro e melanoma cervicale e gastrico, linfoma di non-Hodgkin, mieloma multiplo) ed è stato correlato ad una prognosi insoddisfacente. Il TGF-β1 agisce in qualità di soppressore tumorale (in particolare allo stadio precoce della carcinogenesi) e in qualità di promotore del tumore (quindi nel progredire del tumore, nell’invasione e nella metastatizzazione tumorale). Le cellule maligne secernono il TGF-β1, sopprimendo le risposte immuni antitumorali e creando tolleranza immunitaria. Le mutazioni del pathway che segnala il TGF-β1 (ad es.: perdita di recettori sulla superficie cellulare, calo dell’espressione delle SMAD) rendono i tumori refrattari agli effetti inibitori della crescita ed apoptotici del TGF-β1. Patologie autoimmuni: TGF-β1 è connesso funzionalmente ad anormalità importanti del sistema immunitario, come il Lupus Eritematoso Sistemico. (SLE). Nella Sclerosi Multipla (MS) l’up-regulation del TGF-β1 sembra essere correlata ad un corso benigno e ad una disabilità da MS di scarsa importanza. Nell’epatite autoimmune (AIH) si è osservato siero TGF-β1 up-regolato. Il rimodellamento patologico del tessuto connettivo nella sclerosi sistemica (SSc)è attribuito all’attivazione del pathway del TGF-β1 / SMAD. Nei topi il trasferimento del gene TGF-β1 nel colon porta a fibrosi intestinale e serve da modello murino per la malattia di Crohn (CD). Fegato: Un aumento dell’espressione del TGF-β1 è stato dimostrato nella fibrosi epatica delle patologie croniche del fegato (epatite cronica, cirrosi alcolica). Il virus dell’Epatite C up-regola la trascrizione nel fegato del TGF-β1 ed eleva i livelli del TGF-β1 circolante. L’interruzione della sintesi del TGF-β1 e/o la segnalazione dei pathway previene la formazione di cicatrici nella fibrosi epatica sperimentale. La rimozione di collagene in eccesso dopo la cessazione della patologia epatica è regolata dal by TGF-β1. Patologie renali: La glomerulonefrite e la nefropatia diabetica dovuta ad accumulo eccessivo di ECM nel mesangium dei glomeruli sono attribuite a livelli alti di TGF-β1. I livelli di TGF-β1 nelle urine di pazienti con queste patologie sono elevati. Diabete: I livelli di espressione e le attività delle chinasi delle componenti del pathway di segnalazione del TGF-β nelle malattie del pancreas sono alterati. Livelli bassi di TGF-β in pazienti con diabete di tipo I possono contribuire ad una mancanza d’immunosoppressione ed al propagarsi e al mantenersi (persistere) della patologia. Patologie Cardiovascolari: Il TGF-β1 è antiaterogenico ed ateroprotettivo, ma perde il suo ruolo protettore ed esibisce effetti patogenici nelle patologie croniche. In campioni clinici aterosclerotici sono stati trovati livelli aumentati di TGF-β1. Cardiomiopatie dilatative, ischemiche ed ipertrofiche sono associate a livelli alti di TGF-β1. Il TGF-β1 induce le cellule endoteliali a sottoporsi all’EndMT (transizione endotelio-mesenchimale), il che contribuisce al progredire della fibrosi cardiaca associata alla patologia cardiaca cronica. Il calo dei livelli di TGF-β1 nel siero, nei pazienti con sepsi o ictus acuto, può riflettere la fase di cambiamento dello stato immunologico-infiammatorio di questi pazienti. Il rimodellamento dopo l’infarto del miocardio è attribuito al TGF-β1. Un’up-regolazione del TGF-β1 è stata descritta come esistente nel sistema nervoso centrale in seguito a danni cerebrali indotti da ischemia. Si è riscontrato un ruolo neuroprotettivo del TGF-β1 contro la morte cellulare indotta da ischemia. Asma, Broncopneumopatia Cronica Ostruttiva(COPD), Fibrosi cistica (CF): TGF-β1 svolge un ruolo importante nelle malattie croniche delle vie respiratorie, in particolare nel rimodellamento delle vie respiratorie. Livelli aumentati di TGF-β1 sono stati descritti in pazienti con gravi infezioni asmatiche ed eosinofiliche delle vie respiratorie e sono stati correlati al grado di fibrosi sub-epiteliale. In modelli murini un calo del TGF-β1 porta ad una fibrosi peribronchiale ridotta, alla proliferazione del muscolo liscio delle vie aeree ed alla produzione di muco. Si è dimostrato che il TGF-β1 induce l’apoptosi delle cellule aeree epiteliali. L’attivazione locale del TGF-β1, mediata dalle integrine, è fondamentale per lo sviluppo dell’edema polmonare nel danno acuto al polmone. Altro: Nella Malattia di Alzheimer (AD) un aumento dell’immunoreattività al TGF-β1 e dei livelli di TGF-β1 mRNA è correlato alla deposizione di beta-amiloide nei vasi sanguigni cerebrali danneggiati. Varie chemiochine proinfiammatorie che comprendono il TGF-β1 risultano essere molto elevate nel cervello di pazienti autistici. Un calo dei livelli di TGF-β1 nel siero è stato descritto in pazienti con malaria acuta. Nella periodontite, nel fluido crevicolare gengivale, si è misurato un aumento dei livelli di TGF-β1.

I pazienti con distrofia muscolare di Duchenne presentano livelli elevati di espressione del TGF-β1 e fibrosi. E’ stato dimostrato un aumento degli eventi segnalatori di TGF-β1 nei fibroblasti dello scleroderma. Il TGF-β1 è un potente stimolatore della produzione di matrici da parte dei condrociti contro la fibrosi del tessuto e può quindi avere un ruolo importante nell’metabolismo osseo (Osteoartrite).


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3. PRINCIPIO DEL TEST I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento TGF-β1 anti-umano.

Figura 1

Il TGF-β1 umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti.

Figura 2

Vi si aggiunge un anticorpo anti-umano TGF-β1 coniugato alla biotina, che si lega con il TGF-β1 umano catturato dal primo anticorpo.

Figura 3

Dopo l’incubazione l’anticorpo TGF-β1 coniugato alla biotina non legato viene rimosso durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-HRP che si lega all’anticorpo TGF-β1 coniugato alla biotina.

Figura 4

Standard o Campione

Streptavidina-HRP -

Standard o Campione

Coniugato di Biotina

Micropozzetto Rivestito

Anticorpo di Rivestimento

Seconda Incubazione

Terza Incubazione

Prima Incubazione


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Dopo l’incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione dei substrato reattiva all’HRP

Figura 5

In proporzione alla quantità di TGF-β1 umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l’acido e l’assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di TGF-β1 umano e si determina la concentrazione del campione di TGF-β1 umano.

Figura 6

4. REAGENTI FORNITI

1 busta d’alluminio con una Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale TGF-β1 umano

1 flaconcino (120 μL) di Coniugato di Biotina anticorpo policlonale TGF-β1 anti-umano

1 flaconcino (150 μL) di Streptavidina-HRP

2 flaconcini di Standard di TGF-β1 umano liofilizzato, 4 ng/mL se ricostituito

1 flaconcino di Controllo alto, liofilizzato

1 flaconcino di Controllo basso, liofilizzato

1 flaconcino (5 mL) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con l’1 % di Tween 20 e 10 % di BSA)

1 bottiglia (50 mL) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con l’1 % di Tween 20)

1 flaconcino (3 mL) 1 N HCl

1 flaconcino (3 mL) 1 N NaOH

1 flaconcino (15 mL) di Soluzione Substrato (Tetrametilbenzidina)

1 flaconcino (15 mL) di Soluzione Bloccante (Acido Fosforico 1M)

1 flaconcino (0.4 mL) di Colorante Blu

1 flaconcino (0.4 mL) di Colorante Verde

1 flaconcino (0.4 mL) di Colorante Rosso

6 Film adesivi

Substrato

Substrato post-reazione

Quarta Incubazione


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5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE – KIT ELISA Conservare i reagenti del kit ad una temperatura tra 2 °C ed 8 °C, eccetto per i controlli. Conservare i controlli liofilizzati a -20 °C. I reagenti rimanenti, immediatamente dopo l’uso, devono essere riposti e conservati al freddo (tra 2 °C ed 8 °C), i controlli rispettivamente a -20 °C. La data di scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La scadenza delle componenti del kit può essere garantita solo se le componenti sono conservate in modo corretto e se, in caso di uso ripetuto di un componente, questo reagente non è stato contaminato nel corso delle manipolazioni precedenti.

6. RACCOLTA DEI CAMPIONI ED ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE Con questo dosaggio sono stati testati il supernatante delle colture cellulari*, il siero ed il plasma (EDTA ed eparina). Altri materiali biologici potrebbero essere idonei all’uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione, rimuovere il siero dal coagulo non appena possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 °C, per evitare la perdita di TGF-β1 umano bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 °C ed 8 °C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev’essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. * In campioni di supernatante delle colture cellulari contenenti componenti del siero (ad es. FCS), prestare attenzione ad un segnale del bianco eventualmente elevato, a causa dei livelli latenti di TGF-β1 nel siero animale.

7. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI - Pipette graduate da 5 mL e 10 mL

- Micropipette adattabili da 5 μL a 1000 μL a canale singolo, con punte usa e getta

- Micropipette adattabili da 50 μL a 300 μL, multicanale con punte usa e getta

- Serbatoio per micropipette multicanale

- Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti

- Dispositivo per dispensare la soluzione di lavaggio (bottiglia di lavaggio multicanale o sistema di lavaggio automatico)

- Agitatore per micropiastre

- Lettore di strip per micropozzetti in grado di leggere a 450 nm (620 nm come lunghezza d’onda riferimento opzionale)

- Acqua distillala in vetro o deionizzata

- Calcolatore statistico con programma che esegua l’analisi di regressione


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8. PRECAUZIONI PER L’USO - Tutte le sostanze chimiche sono da considerarsi potenzialmente pericolose. Raccomandiamo quindi che

il prodotto venga maneggiato esclusivamente da personale debitamente istruito alle tecniche di laboratorio e che venga usato secondo i principi della buona pratica di laboratorio. Indossare indumenti di protezione idonei, come camici da laboratorio, occhiali e guanti di protezione. Evitare il contatto con la pelle o gli occhi. In caso di contatto con pelle o occhi lavare immediatamente con acqua. Consultare lascheda di sicurezza o dichiarazioni di sicurezza del prodotto per indicazioni più specifiche.

- L’uso dei reagenti è inteso solo per uso diagnostico in vitro e non dev’essere usato per procedure terapeutiche.

- Non mescolare o sostituire i reagenti con quelli di altri lotti o di diversa provenienza.

- Non usare i reagenti dei kit oltre la data di scadenza indicata sull’etichetta.

- Durante il magazzinaggio o l’incubazione non esporre i reagenti del kit a luce intensa.

- Non pipettare con la bocca.

- Non mangiare o fumare nelle aree di manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni.

- Evitare il contatto della pelle o delle membrane mucose con i reagenti dei kit o i campioni.

- Durante la manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni indossare guanti di gomma o di lattice usa e getta.

- Evitare il contatto della soluzione di substrato con agenti ossidanti e metalli.

- Evitare schizzi o generazione di vapori (aerosol).

- Usare punte di pipette e/o pipette usa e getta per evitare la contaminazione microbica o la contaminazione crociata dei reagenti o dei campioni, che potrebbero invalidare il test.

- Usare vassoi puliti e dedicati per distribuire il coniugato ed il reagente del substrato.

- L’esposizione agli acidi inattiva il coniugato.

- Per la preparazione del reagente deve essere usata acqua distillata in vetro o deionizzata.

- Prima dell’uso la soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente.

- Decontaminare e eliminare i campioni e tutti i materiali potenzialmente contaminati in quanto potrebbero contenere agenti infettivi. Il metodo preferenziale per la decontaminazione è l’autoclavaggio per minimo un’ora a 121.5 °C.

- I rifiuti liquidi che non contengono acidi e i rifiuti neutralizzati possono essere mescolati con ipoclorito di sodio in volumi tali che la miscela finale contenga l’1.0 % di ipoclorito di sodio. Per una reale decontaminazione sono necessari 30 minuti. I rifiuti liquidi contenenti acidi devono essere neutralizzati prima dell’aggiunta d’ipoclorito di sodio.


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9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Gli Concentrati dei Tamponi di Reagenti devono essere portati a temperatura ambiente e diluiti prima di iniziare la procedura del test. Se si formano cristalli nei Concentrati dei Tamponi, riscaldarli gradualmente al punto che si dissolvano completamente.

9.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare tutto il contenuto (50 mL) della Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 mL. Portare al volume complessivo di 1000 mL con acqua distillata in vetro o acqua deionizzata. Mescolare con cautela per evitare lo schiumaggio. Trasferire in una bottiglia di lavaggio pulita e conservare a temperatura tra 2 °C e 25 °C. Tenere in considerazione che il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Lavaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella:

Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) (mL) Acqua Distillata (mL) 1 - 6 25 475 1 - 12 50 950

9.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare tutto il contenuto (5 mL) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro pulito e graduato da 100 mL. Portare al volume complessivo di 100 mL con acqua distillata. Mescolare con cautela per evitare lo schiumaggio. Conservare a una temperatura tra 2 °C e 8 °C. Tenere in considerazione che la Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Dosaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella:

Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (20x) (mL) Acqua Distillata (mL) 1 - 6 2.5 47.5 1 - 12 5.0 95.0

9.3. Preparazione di Coniugato di Biotina Tenere in considerazione che il Coniugato di Biotina deve essere usato entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Coniugato di Biotina con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella:

Numero di Strisce Coniugato di Biotina (mL) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (mL) 1 - 6 0.06 5.94 1 - 12 0.12 11.88


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9.4. Streptavidina-HRP

Tenere in considerazione che la Streptavidina-HRP deve essere usata entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Streptavidina-HRP con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella:

Numero di Stisce Streptavidina-HRP (mL) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (mL) 1 – 6 0.06 5.94 1 - 12 0.12 11.88

9.5. Standard TGF-β1 Umana Ricostituire lo standard TGF-β1 umana aggiungendo con acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 4 ng/mL). Lasciare lo standard a ricostituire per 10-30 minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato.

Le diluizioni standard si possono preparare direttamente sulla piastra per micropozzetti (vedi 10.d) o, in alternativa, in tubi (vedi 9.5.1).

9.5.1. Diluizione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto standard.

S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Quindi preparare diluizioni seriali 1:2 per la curva standard come segue: Pipettare 225 μL di Tampone di Dosaggio (1x) in ogni tubo. Pipettare 225 μL di standard ricostituito (concentrazione = 4 ng/mL) nel primo tubo, etichettato come S1, e mescolare (concentrazione dello Standard 1 = 2 ng/mL). Pipettare 225 μL di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mescolare accuratamente prima del trasferimento seguente. Ripetere le diluizioni seriali altre 5 volte creando così i punti della curva standard (vedi Figura 7).

Il Tampone di Dosaggio (1x) serve come bianco. Figura 7

Transferire 225 µL

TGF-β1 Umana Standard Ricostituito

S1 S2 S3 S4 - S7

Tampone di Dosaggio (1x) 225 µL

Scartare 225 µL


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9.6. Controlli Ricostituire aggiungendo 200 μL di acqua distillata ai controlli liofilizzati (10-30 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all’etichetta del flaconcino. Conservare i controlli ricostituiti aliquotati a -20 °C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.

9.7. Aggiunta di reagenti coloranti: Colorante Blu, Colorante Verde, Colorante Rosso

Per aiutare il cliente ad evitare errori nel pipettare gli ELISA, la IBL International offre uno strumento di monitoraggio dell’aggiunta di volumi anche molto piccoli di una soluzione al pozzetto di reazione, dando una sfumatura di colore ben distinta per ogni fare della procedura ELISA. Questa procedura è facoltativa, non interferisce in alcun modo con i risultati del test e serve ad aiutare il cliente durante lo svolgimento del test stesso, ma può anche essere omessa limitandosi a seguire le istruzioni del manuale. In alternativa, le soluzioni coloranti fornite (Colorante Blu, Colorante Verde, Colorante Rosso) possono essere aggiunte ai reagenti secondo le linee guida qui di seguito indicate:

1. Diluente: Prima della diluizione dello standard e del campione, aggiungere il Colorante Blu con una diluizione di 1:250 (vedi tabella qui di seguito) al rispettivo diluente (1x) secondo il protocollo del test. Dopo aver aggiunto il Colorante Blu, procedere secondo il manuale d’istruzioni.

5 mL Tampone di Dosaggio (1x) 20 µL Colorante Blu



2. Coniugato di Biotina: Prima di diluire il Coniugato di Biotina concentrato, aggiungere il Colorante Verde con una diluizione di 1:100 (vedi tabella qui di seguito) al Tampone di Dosaggio (1x) usato per la diluizione finale del coniugato. Dopo l’aggiunta del Colorante Verde, procedere secondo il manuale d’istruzioni: Preparazione del Coniugato di Biotina.

3 mL Tampone di Dosaggio (1x) 30 µL Colorante Verde



3. Streptavidina-HRP: Prima di diluire la Streptavidina-HRP concentrata, aggiungere il Colorante Rosso con una diluizione di 1:250 (vedi tabella qui di seguito) al Tampone di Dosaggio (1x) usato per la diluizione finale della Streptavidina-HRP. Dopo l’aggiunta del Colorante Rosso procedere come da manuale d’istruzioni: Preparazione della Streptavidina-HRP.

6 mL Tampone di Dosaggio (1x) 24 µL Colorante Rosso

12 mL Tampone di Dosaggio (1x) 48 µL Colorante Rosso

TGF-beta1 ELISA (BE55041) ITALIANO

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10. PROTOCOLLO DI TEST

a. Preparare i campioni prima di iniziare la procedura di test. Diluire i campioni di siero, plasma e degli supernatanti di cultura cellulari 1:10 con Tampone di Dosaggio (1x) secondo il seguente schema: 20 μL di campione + 180 μL Tampone di Dosaggio (1x) Aggiungere 20 μL di 1N HCI a 200 μL di campione prediluito, miscelare e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Neutralizzare con aggiunta di 20 μL 1N NaOH.

b. Determinare il numero di strip micropozzetti necessario a testare il numero desiderato di campioni,

oltre al numero idoneo di pozzetti necessari per eseguire i bianchi e gli standard. Ogni campione, standard, bianco e campione di controllo opzionale dev’essere dosato in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non usate e conservarle insieme all’essiccante fornito nella bustina metallica, chiusa ermeticamente a una temperatura di 2-8 °C.

c. Lavare le strip micropozzetti due volte con un Tampone di Lavaggio di circa 400 μL per ogni

pozzetto; aspirare completamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l’altro. Prima di aspirare, lasciare il Tampone di Lavaggio all’interno dei pozzetti per circa 10–15 secondi prima dell’aspirazione. Fare attenzione a non scalfire la superficie dei pozzetti. Dopo l’ultima fase di lavaggio, svuotare i pozzetti e picchiettare le strip micropozzetti su carta assorbente o su una salvietta di carta per rimuovere il Tampone di Lavaggio in eccesso. Usare le strip micropozzetti immediatamente dopo il lavaggio. In alternativa, le strip micropozzetti possono essere collocate capovolte su una carta assorbente bagnata per non oltre15 minuti. Non lasciar asciugare i pozzetti.

d. Diluizione standard sulla piastra per micropozzetti

(In alternativa, la diluzione standard si può preparare in tubi - vedi 9.5.1): Aggiungere100 μL Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti degli standard. Pipettare 100 μL di standard preparato (vedi Preparazione dello Standard 9.5, concentrazione = 4000 pg/mL), in duplicato, nei pozzetti A1 ed A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 aspirando ed espellendo ripetutamente (concentrazione dello standard 1 S1 = 2000 pg/mL) e trasferire 100 μL rispettivamente nei pozzetti B1 e B2 (vedi Figura 8). Fare attenzione a non scalfire la superficie interna dei pozzetti. Ripetere la procedura 5 volte creando due serie di diluizioni standard di TGF-β1 umano con un range da 2000 a 31 pg/mL. Scartare 100 μL del contenuto degli ultimi micropozzetti (G1, G2) usati.

Figura 8

Transferire 100 µL

TGF-β1 Umano Standard Ricostituito

S1 S2 S3 S4 - S7

Tampone di Dosaggio (1x) 100 µL

Scartare 100 µL


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Nel caso di una diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1), pipettare 100 μL di queste diluizioni dello standard (S1 to S7) nei pozzetti dello standard, come da Tavola 1.

Tavola 1 La tavola descrive un esempio dell’organizzazione dei bianchi, degli standard e dei campioni nelle strisce dei micropozzetti.

1 2 3 4

A Standard 1 (2000 pg/mL)

Standard 1 (2000 pg/mL) Campione 1 Campione 1

B Standard 2 (1000 pg/mL)


C Standard 3 (500 pg/mL)


D Standard 4 (250 pg/mL)


E Standard 5 (125 pg/mL)


F Standard 6 (63 pg/mL)


G Standard 7 (31 pg/mL)


H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8


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e. Aggiungere 100 μL di Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) in duplicato ai pozzetti del bianco. f. Aggiungere 60 μL di Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) ai pozzetti del campione. g. Aggiungere 40 μL di ogni campione pretrattato in duplicato ai pozzetti del campione. h. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 2 ore; se è disponibile un

vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.)

i. Preparare il Conjugato di Biotina (vedi 9.3 Preparazione del Coniugato di Biotina).

j. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 5 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente.

k. Aggiungere 100 μL Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti.

l. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.)

m. Preparare la Streptavidina-HRP (fare riferimento alla preparazione della Streptavidina-HRP 9.4).

n. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 5 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente.

o. Aggiungere 100 μL di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco.

p. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.)

q. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 5 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente.

r. Pipettare 100 μL di Soluzione di SubstratoTMB in tutti i pozzetti.

s. Incubare le strip dei micropozzetti a temperatura ambiente (18-25 °C) per circa 30 minuti. Evitare l’esposizione diretta a luce intensa.

Lo sviluppo cromatico sulla piastra dev’essere monitorato e la reazione del substrato dev’essere bloccata (vedi prossimo punto di questo protocollo) prima che i valori dei pozzetti positivi non siano più correttamente registrabili. Il periodo ideale di tempo necessario per lo sviluppo del colore dev’essere determinato individualmente per ogni dosaggio.

Si raccomanda di aggiungere la soluzione bloccante quando lo standard più alto ha raggiunto un colore blu scuro. In alternativa, lo sviluppo del colore può essere monitorato con il lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato dev’essere bloccata non appena lo Standard 1 ha raggiunto un DO di 0.9 – 0.95.

t. Bloccare la reazione dell’enzima pipettando velocemente 100 μL di Soluzione Bloccante in ogni pozzetto. E’ importante che la Soluzione Bloccante venga distribuita velocemente ed uniformemente su tutti i pozzetti per inattivare completamente l’enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l’aggiunta della Soluzione Bloccante, o entro 1 ora se le strip dei micropozzetti sono conservate al buio e ad una temperatura di 2-8 °C.

u. Leggere l’assorbanza di ogni micropozzetto con uno spettrofotometro usando 450 nm. come

lunghezza d’onda primaria (in alternativa, 620 nm. come lunghezza d’onda di riferimento; da 610 nm a 650 nm. il valore è accettabile). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e usando i pozzetti del bianco. Determinare l’assorbanza sia dei campioni, sia degli standard.


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11. CALCOLO DEI RISULTATI

- Calcolare i valori medi dell’assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio.

- Creare una curva standard segnando l’assorbanza media di ogni concentrazione standard sull’ordinata contro la concentrazione di TGF-β1 umano sull’ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri).

- Per determinare la concentrazione di TGF-β1 umano circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull’ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d’intersezione estendere una linea verticale fino all’ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di TGF-β1 umano.

- Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione di 1:30 (20 μL di campione + 180 μL Tampone di Dosaggio (1x) + 20 µL 1 N HCl + 20 µL 1 N NaOH e 40 µL campione pretrattato + 60 µL Tampone di Dosaggio (1x)), la concentrazione letta dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 30).

- Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di TGF-β1 umano. Questi campioni richiedono un’ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati dell’ TGF-β1 umano, con un Tampone per Dosaggio (1x) in modo da quantificare con precisione i livelli reali di TGF-β1 umano.

- Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di TGF-β1 umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi.

- La Figura 9 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.

Figura 9 Curva standard rappresentativa per il TGF-β1 umano ELISA. Lo TGF-β1 umano è stato diluito in 2 fasi seriali nel Tampone di Dosaggio (1x). Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev’essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.


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Tavola 2 Dati tipici relativi all’uso del TGF-β1 umano ELISA Lunghezza d’onda: 450 nm Lunghezza d’onda di riferimento: 620 nm

Standard Concentrazione di

TGF-β1 umano (pg/mL)

D.O. (450 nm)

D.O. Media

C.V. (%)

1 2000 2.005 1.995

2.000 0.2

2 1000 1.151 1.060

1.105 4.1

3 500 0.668 0.663

0.665 0.4

4 250 0.388 0.392

0.390 0.6

5 125 0.243 0.244

0.244 0.2

6 63 0.171 0.166

0.168 1.6

7 31 0.131 0.131

0.131 0.2

Bianco 0 0.097 0.098

0.098 0.3

I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l’attività enzimatica e quindi l’intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi.

12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva

standard per ogni esecuzione del test.

- La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei.

- Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell’uso.

- Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati.

- L’uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione.


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13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE

13.1. Sensibilità Il limite di rilevamento del TGF-β1 umano umana definito come la concentrazione dell’analita, risultante in un’assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 9 pg/mL (media di 6 dosaggi indipendenti).

13.2. Riproducibilità

13.2.1. Intra-dosaggio La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di TGF-β1 umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di TGF-β1 umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 5.1 %. Tavola 3 La concentrazione media di TGF-β1 umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione

Campione Esperimento Concentrazione Media TGF-β1 umano (pg/mL)

Coefficiente di Variazione (%)

1 1 2 3

45241 41522 42803

3.3 4.5 3.5

2 1 2 3

24734 22431 22822

10.6 1.8 2.0

3 1 2 3

10409 11284 13140

6.2 1.9 5.6

4 1 2 3

6903 5919 5673

8.2 8.0 4.0

5 1 2 3

8313 9488 9559

7.2 2.5 2.6

6 1 2 3

12299 10982 13200

6.8 4.7 2.5

7 1 2 3

5861 5427 5984

10.6 4.5 2.0

8 1 2 3

2953 3543 3808

8.0 6.9 5.6


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13.2.2. Inter-dosaggio La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell’ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero e plasma contenenti diverse concentrazioni di TGF-β1 umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di TGF-β1 umano ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato era del 8.4 %. Tavola 4 La concentrazione media di TGF-β1 umano ed il coefficiente di variazione di ogni campione:

Campione Concentrazione Media di TGF-β1 umano (pg/mL)

Coefficiente di Variazione (%)

1 43189 4.4 2 23329 5.3 3 11611 12.0 4 6165 10.6 5 9120 7.7 6 12160 9.2 7 5757 5.1 8 3435 12.7

13.3. Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato addizionando 2 livelli di TGF-β1 umano al siero, plasma e supernatanti di colture cellulari. I recuperi sono stati determinati nel corso ognuno con 4 replicati. La quantità di TGF-β1 umano endogeno in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori del test. Vedi Tavola 5 per i dati di recupero. Tavola 5

Matrice del Campione* Test Alto (%) Test Medio (%)

Siero 84 83 Plasma (EDTA) 74 110 Plasma (Citrato) 91 97

Plasma (Heparina) 97 90 Supernatanti di colture cellulari 124 141

* A causa di livelli elevati di TGF-β1 endogeno, i dati per i concentrazioni addizionati bassi non sono indicati.

13.4. Parallelismo della Diluizione Campioni di siero, plasma e supernatanti di colture cellulari con diversi livelli di TGF-β1 umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l’uno. Vedi Tavola 6 per i dati di recupero. Tavola 6

Matrice di Campione*

Recupero dei Valori Attesi Intervallo (%) Media (%)

Siero 88-107 97 Plasma (EDTA) 108-150 125 Plasma (Citrato) 109-151 132

Plasma (Heparina) 52-81 67 Supernatanti di colture cellulari 90-115 106


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13.5. Stabilità del Campione

13.5.1. Stabilità a Congelamento-Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionato o addizionati) sono state conservate a -20 °C e scongelate 5 volte e sono stati determinati i livelli di TGF-β1 umano. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello TGF-β1 umano.

13.5.2. Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionate o non addizionate) sono state conservate a -20 °C, 2-8 °C ed a temperatura ambiente (TA) ed il livello di TGF-β1 umano ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del TGF-β1 umano.

13.6. Specificità Il test rileva TGF-β1 umano sia naturale, sia ricombinante. La reattività crociata del TGF-β2 e TGF-β3, e dei TNF-β, IL-8, IL-6, IL-2, TNF-α, IL-1β, IL-4, IFN-γ, IL12p70, IL-5 e IL-10 è stata valutata da addizionando queste proteine a concentrazioni fisiologicamente rilevanti nel siero. Non è stata rilevata alcuna reattività crociata.

13.7. Valori Attesi Per il TGF-β1 umano è stato testato un pannello di campioni di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). Per i livelli di TGF-β1 umano misurati vedi la Tavola 7. Tavola 7

Matrice di Campione

Numero di Campioni Esaminati

Intervallo (pg/mL) Media (pg/mL) Deviazione Standard

(pg/mL) Siero 40 4639-14757 8225 2218

Plasma (Citrato) 40 2404-25558 6479 3778 Plasma (EDTA) 40 6518-31737 16942 5762

Plasma (Heparina) 40 3081-15879 6580 2882

14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare:

e-mail: [email protected] www.IBL-International.com


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15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI

15.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 mL) a 950 mL di acqua distillata.

Numero di Strisce

Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (mL)

Acqua Distillata (mL)

1-6 25 475 1-12 50 950

15.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 mL) a 95 mL di acqua distillata.

Numero di Strisce

Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (mL)

Acqua Distillata (mL)

1-6 2.5 47.5 1-12 5.0 95.0

15.3. Coniugato di Biotina Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x):

Numero di Strisce

Coniugato di Biotina (mL)

Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1-6 0.06 5.94 1-12 0.12 11.88

15.4. Streptavidina-HRP Fare una diluizione 1:100 di Streptavidina-HRP nella Soluzione Tampone di Dosaggio (1x):

Numero di Strisce

Streptavidina-HRP (mL)

Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1-6 0.06 5.94 1-12 0.12 11.88

15.5. Standard TGF-β1 Umano Ricostituire il standard TGF-β1 umana liofilizzato con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull’etichetta del flaconcino dello standard.)

15.6. Controlli Aggiungere 200 μL di acqua distillata ai controlli liofilizzati.


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16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST

1. Pretrattamento: 1:10 prediluizione (20 μL campione + 180 μL Tampone di Dosaggio (1x)), agguingere 20 μL 1N HCI a 200 μL campione prediluito, mescolare ed incubare per 1 ora a temperatura ambiente, aggiungere 20 μL 1N NaOH.

2. Determinare il numero di strip di micropozzetti richiesto.

3. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio.

4. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 μL di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 μL di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 μL da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 μL dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 9.5.1.): Pipettare 100 μL di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti.

5. Aggiungere 100 μL di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, ai pozzetti del bianco.

6. Aggiungere 60 μL Tampone di Dosaggio (1x) ai pozzetti dei campioni.

7. Aggiungere 40 μL di campioni in duplicato ai pozzetti per i campioni designati.

8. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 2 ore. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.)

9. Preparare il Coniugato di Biotina.

10. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 5 volte con il Tampone di Lavaggio.

11. Aggiungere 100 μL di Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti.

12. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.)

13. Preparare la Streptavidina-HRP.


15. Aggiungere 100 μL di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti.

16. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.)


18. Aggiungere 100 μL di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti.

19. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C).

20. Aggiungere 100 μL di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti.

21. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l’intensità del colore a 450 nm.

Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione 1:30 (20 μL di campione + 180 μL Tampone di Dosaggio (1x) + 20 µL 1 N HCl + 20 µL 1 N NaOH e 40 µL campione pretrattato + 60 µL Tampone di Dosaggio (1x)), la concentrazione letta dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x30).


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17. Riferimenti Bibliografici Sul Prodotto

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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer

Symbols Version 3.5 / 2012-01-20

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:

Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από:

No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων:

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα

LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο

IVD In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.

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Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.

Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.

Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.

Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.

Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.

Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.

tgf-beta 1 elisa - ibl international · ed è stato correlato ad una prognosi insoddisfacente. ......

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