Testes pré-transfusionais

Profa. Alessandra Barone Prof. Archangelo Fernandes

www.profbio.com.br

Imunohematologia

• Antígenos eritrocitários

Importância do estudo dos antígenos

• Incompatibilidades transfusionais

• Incompatibilidades Materno fetal

• Transplantes

Reações hemolíticas transfusionais

• RHT

– Definida como a diminuição da sobrevida da hemácia

após transfusão de sangue devido a incompatibilidade imunológica entre o doador e receptor

RHTs

• Ocorrem quando o paciente foi previamente sensibilizado por algum antígeno, não possuindo anticorpos detectáveis no seu plasma no momento da realização das provas pré-transfusionais.

• Maior incidência em pacientes politransfundidos.

RHTs

• Processo de aloimunização:

– Aloimunização primária contra ag eritrocitários- IgM

• Semanas e meses após transfusão

– Segunda exposição: produção de IgG

• Detectáveis em um a dois dias.

RHTs

• As reações hemolíticas transfusionais podem ser de dois tipos:

– Imediata: acorrem durante ou algumas horas após a transfusão

– Tardia: ocorrem dias ou semanas após a transfusão

RHTs

• Podem ser classificadas em :

– Intravascular :

• Mediadas por ac que ativam o sistema complemento com formação do MAC

• Presença de hemoglobinemia e hemoglobinúria

RHTs

– Extravascular :

• Mediados por ac que não ativam completamente o sistema complemento

• Fixação do C3b na membrana

• Reconhecimento da porção Fc dos ac e do fragmento C3b do sistema complemento pelos macrófagos do SMF.

• Aumento da bilirrubina

RHTI RHTT

Extravascular Mediadas pela

Fc e c3b

Intravascularmediadas por

complemento

ABO Rh

Imediata

Tardia

Imune Não imune

Reação febril não hemolítica Contaminação bacteriana

Reação hemolítica imune Hipotensão por inibição da ECA

Reação alérgica Sobrecarga de volume

Hemólise não imune

Aloimunização eritrocitária Hemossiderose

Aloimunização por HLA Doenças infecciosas

Reação enxerto hospedeiro

Púrpura pós transfusional

Reação hemolítica imediata

• Por ABO:

– Reação hemolítica grave com alto índice de mortalidade.

– Ac presentes no plasma do receptor hemolisam as hemácias do doador

– Possibilidade de desenvolvimento de CIVD pela liberação de estroma celular com ativação do fator XII.

Reação hemolítica imediata

• Sintomas de dor no tórax, no local de infusão, abdome e/ou flancos, hipotensão grave, febre e hemoglobinúria.

• O quadro pode evoluir para insuficiência renal aguda por vasoconstrição , por liberação de catecolaminas, hipotensão sistêmica e formação de trombos intravasculares .

Reação hemolítica tardia

• Ocorre devido à produção de anticorpos antieritrocitários (exceto ABO) após transfusão ou gestação prévias

• Sintomas de febre, icterícia, diminuição da hemoglobina ou aproveitamento transfusional inadequado.

Provas de compatibilidade transfusionais

• Tipagem ABO – doador e receptor – Direta – Prova reversa

• Tipagem Rh – Pesquisa de D fraco

• Pesquisa de anticorpos irregulares – Teste de coombs direto- TAD – Teste de coombs indireto – TAI

• Painel de hemácias

• Prova cruzada maior e menor

Testes laboratoriais para tipagem ABO

• Testes diretos – ABO e Rh

– Verificam a presença do antígeno eritrocitário

– Utilização das hemácias do doador e receptor

– Podem ser realizados em :

• Tubo

• Lâmina

• Gel de centrifugação

Testes laboratoriais para tipagem ABO

• Testes indiretos – ABO reverso

– Verificam a presença de anticorpos anti antígenos eritrocitários

– Utilização do soro/plasma do paciente

– Podem ser realizados em :

• Tubos

• Lâminas

• Gel de centrifugação

Testes laboratoriais para tipagem ABO

•Tipagem direta –

–Hemácias a 5% (paciente) x soro comercial (anti-A; anti-B e anti-AB )

– Anti-A = cor azul

– Anti-B = cor amarela

– Anti-AB = cor de plasma

Testes laboratoriais para tipagem ABO

•Tipagem reversa –

– Plasma ou soro (paciente) x hemácias a 5% fenotipadas (A1 e B)

– Nome comercial das hemácias A1 e B (Fresenius HemoCare Brasil Ltda) = REVERCEL

TIPAGENS PARA O SISTEMA ABO

A

B

A,B

O

Tipagem direta = pesquisa a presença de antígenos na membrana dos eritrócitos

Tipagem Reversa = pesquisa a presença de anticorpos naturais

Tipagem em gel

Sistema de cartões • Maior sensibilidade

• Utilização de ac monoclonais (murino) e humanos

• Padronização na intensidade de aglutinação no momento da leitura do resultado

• Testes estáveis por 2 dias

• Realização de teste de Coombs sem lavagens de hemácias

• Menor contato do profissional com o sangue (biossegurança)

Positiva

++++ Positiva

+++ Positiva

++ Positiva

+ Negativa

-

Escala de aglutinação

Tipagem em gel

• Tipagem direta e reversa: testes devem ser concordantes

• Casos de discrepância do sistema ABO: – Presença dos subgrupos ABO

• 1-8% indivíduo A2 –produz anti-A1

• 22-35% A2B –produz anti-A1

– imunossupressão,

– redução de expressão antigênica,

– presença de anticorpos irregulares,

– transfusões recentes .

Tipagem em gel

• Os subgrupos do sistema ABO podem ser diferenciados através da utilização de lectinas anti-H e anti-A1

• O antígeno H : presente em maior quantidade em hemácias O

– O > Ax > A3 > A2 > B > A2B > Aint > A1 > A1B

Grupo Lectina Anti-H Lectina Anti-A1 A1 O ou ± + Aint + ou O + ou O A2 ++ O A3 +++ O A1B O + A2B + ou ± O Oh (Bombay) O O B + ou ± O O ++++ O

Subgrupos de ABO

Determinação de fator Rh

• Método direto – Verificação da presença de antígeno Rh.

– Pode ser realizado em lâmina, tubos e cartão de gel.

– As técnicas são as mesmas utilizadas para verificação do sistema ABO.

– A reação de aglutinação positiva indica a presença do antígeno D na membrana.

– A reação de aglutinação negativa nem sempre indica ausência de antígeno D na membrana – presença de D fraco

Pesquisa de D fraco

• Incubar os dois tubos da reação anterior por 30 minutos em banho maria a 37ºC

• Centrifugar a 3.400 rpm – 15’’

• Ressuspender delicadamente e proceder a leitura – Teste + para aglutinação no tubo D – terminar o

teste

– Teste – para aglutinação no tubo D- continuar o teste

Pesquisa de D fraco

• Lavar as hemácias com sol fisiológica por 3 vx à 3.500 rpm por 15’’.

• Adicionar duas gotas do soro de Coombs a cada um dos tubos e homogeneizar.

• Centrifugar.

• Proceder a leitura.

Hemácias+ soro anti D + centrifugação

negativo 37º C

Negativo COOMBS

Soro de coombs

• Anticorpo anti-imunoglobulina humana monoespecífico

– Anti-gama

• Dirigidos contra fração Fc das imunoglobulinas humanas

• Preparado a partir de soro de coelhos e/ou cabras imunizados à fração IgG (gamaglobulina) do soro humano.

Pesquisa de D parcial

• Utilização de ac monoclonais com clone específico

Pesquisa de D parcial

Identificação de ac. irregulares • Identificação de ac irregulares realizado através do

teste de Coombs.

– Coombs direto ou TAD: pesquisa de anticorpos fixos a membrana eritrocitária.

• Ex: DHRN, anemias autoimunes, transfusões incompatíveis.

– Coombs indireto ou TAI: detecta a presença de anticorpos livres no soro.

• Ex: sensibilização materna por gravidez.

Coombs direto (TCD)

• Coleta com Edta – lavar as hemácias.

• Realizar suspensão de hemácias a 5%.

• Pingar em um tubo 2 gotas da suspensão.

• Lavar mais uma vez, decantando o sobrenadante.

• Adicionar 2 gotas de soro de Coombs e homogeneizar.

• Centrifugar por 15’’ a 3.400 rpm.

• Proceder a leitura.

Coombs direto (TCD)

• Resultado negativo: ausência de aglutinação.

– As hemácias não estão sensibilizadas.

• Resultado positivo: presença de aglutinação

– As hemácias estão sensibilizadas com anticorpos.

– Para identificação do ac, realizar eluição.

Coombs direto

Coombs indireto

• Pesquisa de anticorpos irregulares livres no plasma

• Realizado em 4 fases

– 1ª, 2ª e 3ª fase: mais eficientes na detecção de IgM

– 4ª fase: utilização do soro de Coombs para detecção de IgG

• Utilização de hemácias comerciais I e II- Triacel ®

Coombs indireto

• 1ª fase: fase salina temperatura ambiente

• 2ª fase: fase protéica temperatura ambiente - albumina bovina 22%

• 3ª fase: fase protéica quente - 37ºC

• 4ª fase: fase de Coombs

• As centrifugações entre uma fase e outra deverão respeitar 1 mim a 100o rpm ou 15’’ a 3400 rpm

Pesquisa de Anticorpo Irregular “Coombs indireto”

Meio salino / TA

Meio Protéico/ TA Meio Protéico / 37ºC Soro de Coombs

He I - - +3 +4

He II - - - -

He I ou He II (comerciais)

Soro do Paciente

Centrifugação Albumina 37oC

45min

Soro de Coombs

Objetivo: Verificar a existência de Ac irregular no Soro do paciente a ser transfundido, doadores, gestantes, etc.

Coombs indireto

Painel de hemácias

• Painel formado por 11 lotes de hemácias

– 10 lotes obtidos de doadores do tipo O

– 1 lote obtido de sangue de cordão umbilical de recém-nascidos do grupo O

• Utilizado para a pesquisa dos anticorpos irregulares

Coombs indireto

• Homogeneizar e submeter os tubos as todas as 4 fases do teste de Coombs indireto – Temperatura ambiente – Meio protéico – 37ºC – Coombs

• Verificar o antígeno em comum nos tubos onde houveram aglutinação

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11

Soro (gotas)

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Prova cruzada

• Utilizada para transfusões sanguíneas ou transplante de órgãos

• Finalidade de determinar a presença de anticorpos pré-formados no sangue do receptor contra as células do possível doador

Prova cruzada

• Prova cruzada maior e menor

• Maior

– Finalidade de testar os glóbulos vermelhos do doador contra o soro do receptor.

• Menor:

– Finalidade de testar os glóbulos vermelhos do receptor contra o soro do doador (desuso)

Tubo de hemólise

Hemácias do doador 1 gota se suspensão 5%

Soro do receptor 2 gotas do soro

• Homogeneizar e submeter os tubos as todas as 4 fases do teste de Coombs indireto – Temperatura ambiente

– Meio protéico

– 37ºC

– Coombs

• Verificar a presença ou não de aglutinação

Exercício

• Paciente precisa de transfusão sanguínea depois de acidente grave com hemorragia intensa.

Seu tipo sanguíneo é O Rh+ (D fraco) e sem histórico de transfusões anteriores.

Cite como serão realizadas as seguintes provas: a. ABO direto e reverso b. pesquisa de D fraco c. pesquisa de anticorpos irregulares - TAD e TAI d. prova cruzada para doador AB Rh+

Referência bibliográfica

• AZEVEDO, Maria Regina A. Hematologia Básica: fisiopatologia e estudo laboratorial. 4 ed. São Paulo: Editora Luana. 2008. 420 p

• BORDIN. José O.; JÚNIOR, Dante M. L.; COVAS, Dimas T. Hemoterapia. São Paulo: Editora Atheneu. 2007. 632p

• GIRELLO, Ana L.; KUHN, Telma .I.B. Fundamentos da Imunohematologia eritrocitária. 2.ed.SãoPaulo: Editora Senac. 2007. 208p.

• Hemocentro Unicamp. Manual de Orientações para uso de hemocomponentes e derivados .2008

• OLIVEIRA,Luciana C. O. COZAR, Ana Paula C. N .C. Cozac. Reações transfusionais: diagnóstico e tratamento. Medicina, Ribeirão Preto, 36: 431-438, abr./dez. 2003.