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SELECCIÓN DE BACTERIAS AISLADAS DE SEDIMENTOS DEL CARIBE
COLOMBIANO CON CAPACIDAD DEGRADADORA DE HIDROCARBUROS
SILVIA NARVÁEZ FLOREZ
Trabajo de grado presentado como requisito parcial
para optar el título de Microbiología Industrial
Director
MARTHA LILIANA GÓMEZ Msc.
Investigador Asistente – INVEMAR
Codirector
MARIA MERCEDES MARTÍNEZ Msc.
Profesor Asociado Universidad Javeriana
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C
2005
2
TABLA DE CONTENIDOS
Página
RESUMEN 7
ABSTRACT 8
1. INTRODUCCIÓN 9
2. MARCO TEÓRICO 12
2.1 HIDROCARBUROS 12
2.1.1 Hidrocarburos alifáticos 13
2.1.2 Hidrocarburos aromáticos 14
2.2 PETRÓLEO Y ACPM 16
2.3 BIODEGRADACIÓN 17
2.4 BIORREMEDIACIÓN 20
2.4.1. Atenuación natural 21
2.4.2 Bioaumentación 21
2.4.3 Bioestimulación 23
2.4.4 Bioventeo, Composteo, Biolabranza y Fitorremediación 24
2.5 FACTORES QUE AFECTAN LA BIORREMEDIACIÓN 25
2.5.1 Composición del petróleo y sus derivados 25
2.5.2 Estado físico del hidrocarburo 26
2.5.3 Temperatura 26
2.5.4 Aceptores de electrones 27
2..5.5 Nutrientes 28
2.5.6 pH 28
2.6 TECNICAS PARA EL ANÁLISIS DE HIDROCARBUROS 29
2.6.1 Fluorometría 29
2.6.2 Cromatografía de gases 29
3. OBJETIVOS 30
3.1 OBJETIVO GENERAL 35
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 35
4. MATERIALES Y MÉTODOS 31
3
4.1. MICROORGANISMOS 31
4.1.2 Aislamiento de microorganismos 31
4.2 SELECCIÓN DE CEPAS PARA ENSAYO DE DEGRADACIÓN 32
4.2.1 Selección horizontal en petróleo crudo y ACPM 32
4.2.2 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) 32
4.2.3 Identificación Microbiana 33
4.3 ENSAYOS DE DEGRADACIÓN DE ACPM 33
4.3.1 Preparación de inóculos 33
4.3.2. Ensayos de degradación 34
4.3.3 Curva de crecimiento 34
4.4 DETERMINACIONES QUÍMICAS 36
4.4.1 Extracción de hidrocarburos 36
4.4.2 Medición de hidrocarburos alifáticos 36
4.4.3 Medición de Hidrocarburos Aromáticos Totales (HAT) 36
4.4.4 Parámetros analíticos 37
4.5 PORCENTAJE DE DEGRADACIÓN 37
4.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 38
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39
5.1 SELECCIÓN DE CEPAS PARA ENSAYOS 39
5.1.1 Selección horizontal en petróleo crudo y ACPM 39
5.1.2 Concentración de ACPM Mínima Inhibitoria 41
5.1.3 Caracterización e Identificación Microbiana 43
5.2 ENSAYOS DE DEGRADACIÓN DEL ACPM 48
5.2.1 Degradación de alifáticos 49
5.2.2. Degradación de aromáticos 52
5.2.3 Curva de crecimiento 54
6. CONCLUSIONES 58
7. RECOMENDACIONES 59
8. BIBLIOGRAFÍA 60
9 ANEXOS 70
4
INDICE DE TABLAS
Página 1. Fuentes de hidrocarburos del petróleo al mar (106 Ton /año) 12
2. Composición del ACPM 17
3. Cepas aisladas en la región Caribe, con su contaminante y departamento
de aislamiento respectivamente
39
4. Selección horizontal en petróleo crudo y ACPM de las cepas del Cepario
de Bacterias Marinas
40
5. Características morfológicas de las cepas seleccionadas para el ensayo de
degradación de ACPM
45
6. Porcentaje de remoción y degradación de hidrocarburos alifáticos del
ACPM por factores bióticos y abióticos
49
7. Comportamiento de las cepas en ACPM a través del tiempo 56
5
INDICE DE FIGURAS
Página
1. Estructura molecular de los compuestos del grupo BTEX (Benceno,
Tolueno, Xileno y Etilbenceno)
15
2. Estructuras moleculares de Hidrocarburos Aromáticos Polinucleares
(HAP)
16
3. Esquema de ensayo de degradación de ACPM para el análisis
microbiológico y químico del tratamiento y control abiótico.
35
4. Porcentaje de cepas resistentes a concentraciones de ACPM de 1-10 %
(v/v)
42
5. Características microscópicas (100x) y macroscópicas de las cepas
seleccionadas. (A) cepa BCH28- Chromobacterium sp. (B) BCH30-
Klebsiella (C) cepa BCH31-Enterobacter cloacae (D) cepa BCH34
46
5 Características microscópicas (100x) y macroscópicas de las cepas
seleccionadas (E) BCH35-Flavimonas oryzihabitans (F) BCH36-
Bacillus brevis (G) cepa BCH52 (H) cepa BCH56-Pseudomonas
aeuroginosa.
47
5. Características microscópicas (100x) y macroscópicas de las cepas
seleccionadas. (I) cepa BCH74 Bacillus cereus (J) cepa BCH76 (K)
BCH135-Bacillus pumillus.
48
6 Perfil cromatografico del día 0 y 21 de los n-alcanos del ACPM. 51
7 Abundancia relativa de los n-alcanos en relación con C-15 durante los
21 días de exposición del ensayo.
51
8 Concentración de HAT (mg/mL) de ACPM Caribe 52
9 Cromatogramas de hidrocarburos aromáticos (A) día 0 (B) día 21 del
tratamiento
53
10 Curva de crecimiento del cultivo bacteriano mixto Caribe en ACPM 54
11 Curva de crecimiento del cultivo bacteriano y porcentaje residual de
hidrocarburos alifáticos y aromáticos en 21 días
56
6
INDICE DE ANEXOS
Página
1. Medios de cultivo 70
2. Recuentos de células / ml de los inoculos en ACPM al 2% 72
3. Curva de calibración de hidrocarburos aromáticos del ACPM 73
4. Scan de absorción de los hidrocarburos aromáticos del ACPM-longitud
de onda 310- 360 nm
74
5. Ensayos de concentración mímima inhibitoria de las 22 cepas
tolerantes a petróleo crudo y ACPM
75
6. Cromatogramas de n-alcanos día 0, 10 y 21 del tratamiento y el control
abiótico
76
7. Datos de hidrocarburos aromáticos totales (mg/ ml) medidos por
espectrofluorometría.
79
8 Recuentos microbiano del tratamiento
(cultivo mixto) en ACPM al 2% v/v.
80
9 Análisis estadísticos del tratamiento y el control abiótico 81
7
RESUMEN
A partir del proyecto de investigación “Selección y aplicación de bacterias marinas
nativas con capacidad degradadora de compuestos orgánicos persistentes (COP) en el
Pacífico y Caribe colombiano” realizado en sedimentos de la región Caribe, se
aislaron 26 cepas tolerantes a hidrocarburos, las cuales fueron sometidas a un proceso
de selección con el fin de escoger bacterias competitivas y evaluar su capacidad de
degradación. Por medio de una prueba de selección horizontal y un ensayo de
Concentración de ACPM Mínima Inhibitoria se escogieron 11 cepas capaces de
tolerar crudo y ACPM en un rango del 1-8% v/v. Klebsiella sp., Chromobacterium
sp., Flavimonas orizihabitans , Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeuroginosa,
Bacillus Brevis, B. cereus y B. pumillus se identificaron bioquímicamente mediante
el sistema BBL cristal y API 50 CHB/E. Basados en las capacidades degradativas
individuales de las 11 cepas se conformó un cultivo bacteriano mixto y se evaluó su
capacidad de degradación de hidrocarburos en un cultivo a escala de laboratorio con
una concentración del 2% v/v de ACPM en un periodo de 21 días. Recuentos de las
UFC/mL fueron empleados para elaborar la curva de crecimiento del cultivo mixto y
se realizaron mediciones de hidrocarburos alifáticos por cromatografía de gases-
masas e hidrocarburos aromáticos por espectroflurometría. El cultivo mixto fue capaz
de degradar el 68.6 % de los hidrocarburos alifáticos en 21 días, con preferencia de
los n-alcanos cadena larga (C12- C31) y alcanzó un crecimiento máximo de 3.13 (+/-
1.41) x 109 UFC / mL. No se observó la degradación de hidrocarburos aromáticos,
para lo cual es necesario prolongar el tiempo de evaluación. Las cepas evaluadas
tienen un potencial enzimático para la degradación de hidrocarburos y es necesario
caracterizarlas con el fin de conformar en una fase posterior un consorcio que pueda
ser aplicado efectivamente en campo.
8
ABSTRACT
From the investigation project "Selection and application of native marine bacteria
with degradative ability of organic compound persistent (COP) in the Pacific and the
Colombian Caribbean" made in sediments of the Caribbean region, were isolated 26
tolerant strains to hydrocarbons, which were put under a process of selection with the
purpose of choosing competitive bacteria and evaluating their capacity of
degradation. By means of a test of horizontal selection and a test of Inhibiting
Concentration of Minimum ACPM 11 strains able to tolerate crude oil and ACPM in
a range of the 1-8% v/v were chosen. Eight of eleven strains were identified
biochemically by system BBL crystal and API 50 CHB/E as Klebsiella sp.,
Chromobacterium sp., Flavimonas orizihabitans, Enterobacter cloacae,
Pseudomonas aeuroginosa, Bacillus brevis, B. cereus and B. pumillus. Based on the
individual degradation capabilities of the 11 strains were composed a mixed bacterial
culture and its ability of hydrocarbon degradation was evaluated in a assay on scale of
laboratory with a concentration of 2% v/v of ACPM in a period of 21 days. Counts
of the colonies forming units (CFU)/ mL were used to elaborate the curve of growth
of the mixed culture and the hydrocarbon removal was quantified by gas
chromatography. The mixed culture was able to degrade 68,6 % of aliphatic
hydrocarbons in 21 days, with preference of the n-alkanes long chain (C12- C31) and
achieved a maximum growth of 3,13 (+/- 1,41) x 109 UFC/mL. The aromatic
hydrocarbon degradation was not observed for which it is necessary to prolong the
time of evaluation. The evaluated strains have an enzymatic potential for the
hydrocarbon degradation and is necessary to characterize them with the purpose of
conforming in a later order consortium that can indeed be applied in field.
9
1. INTRODUCCIÓN
La contaminación por hidrocarburos del petróleo es una problemática de carácter
mundial y como cualquier otro tipo de contaminación se presenta con intensidad en
los centros de mayor población. Las principales fuentes son las actividades
domésticas, industriales, marítimas y procesos de explotación, transporte y manejo
del petróleo y sus derivados. Colombia, siendo el único país de Sudamérica que
cuenta con costas en los dos océanos, se ve enfrentado a la problemática de
contaminación por hidrocarburos en sus mares y costas.
La producción mundial de petróleo a finales del 2000 alcanzó los 880 toneladas/ día,
de los cuales el 40% fue transportado vía marítima y cerca del 9% se liberó al mar por
accidentes. En Colombia la producción alcanzó un volumen de 688 kB/día, de los
cuales 3470 kB aproximadamente fueron transportados desde los puertos de Tumaco
y Cartagena para cumplir la demanda interna.
En el Caribe los procesos de poblamiento e industrialización sumados al aporte del
río Magdalena, han contribuido con una descarga continua de contaminantes a los
mares; de igual forma los procesos de acumulación de hidrocarburos en el Caribe se
han visto favorecidos por sus características de mar cerrado, de aguas someras, más
tranquilo y donde rara vez la marea sube por encima de 60 cm (Garay y Velez, 2004).
Las zonas mas afectadas por hidrocarburos y derivados del petróleo en la costa Caribe
son Santa Marta, Barranquilla, Cartagena y los Golfos de Morrosquillo y Urabá.
Algunas zonas como el sur de la Guajira y San Andrés tienen un impacto medio y
regiones como el norte del Magdalena y norte de la Guajira permanecen
relativamente limpias de este tipo de contaminantes. Históricamente en la zona
costera del Atlántico, Bolívar y Magdalena se han encontrado valores de
Hidrocarburos Disueltos y Dispersos (HDD) que superan los 10 µg/l establecidos
10
como norma para aguas marinas y costeras no contaminadas por la UNESCO
(UNESCO, 1974, en INVEMAR; 2001)
Los hidrocarburos (e.g. petróleo, kerosene, ACPM) en el mar pueden encontrarse de
forma dispersa o disuelta dentro de la columna de agua, ser adsorbidos por la materia
orgánica y los limos y permanecer en los sedimentos largos periodos de tiempo o
acumularse en los organismos, gracias a sus propiedades lipofilicas. Los
hidrocarburos, como los poli aromáticos nucleares (HAP), pueden entrar en la cadena
alimentaría y ser concentrados gradualmente a través de los niveles tróficos hasta
llegar al hombre ocasionando efectos nocivos a largo plazo, por lo que están
considerados parte del grupo de compuestos peligrosos de la Agencia de Protección
Ambiental de Estados Unidos.
Con el fin de contrarrestar los efectos nocivos causados por la presencia del petróleo
en los ecosistemas marinos se han desarrollado técnicas físicas, químicas y biológicas
que buscan remover el mayor porcentaje del contaminante y disminuir el impacto
generado tras un derrame o acumulación progresiva.
La biorremediación emplea la acción de microorganismos, las condiciones físico-
químicas del área y el contaminante y un adecuado monitoreo, para lograr la mayor
remoción del contaminante. Significantes y cuantiosos adelantos han sido realizados
en este campo, se han adelantado gran cantidad de investigaciones en la búsqueda de
microorganismos con potencial degradador que lleven a mejoras biotecnológicas y al
diseño de estrategias efectivas de remediación.
Bajo este marco de referencia y con el propósito de conocer el potencial
biorremediador de los microorganismos nativos que a futuro puedan ser usados para
descontaminar y recuperar ecosistemas afectados por hidrocarburos el Instituto de
Investigaciones Marinas y Costeras-INVEMAR con el apoyo de COLCIENCIAS
adelanta el proyecto “Selección y aplicación de bacterias marinas nativas con
11
capacidad degradadora de compuestos orgánicos persistentes (COP) en el Pacífico y
Caribe colombiano” dentro del cual se enmarca el presente trabajo de investigación
enfocado en la capacidad de degradación de ACPM por bacterias nativas aisladas del
mar Caribe.
12
2. MARCO TEÓRICO
2.1 HIDROCARBUROS
Los hidrocarburos del petróleo (HP) son considerados alterágenos ya que por sus
características en el medio marino producen efectos nocivos a los recursos vivos y a
la vida marina, peligros para la salud humana, obstaculización de las actividades
marítimas, incluidas la pesca y otros usos legítimos del mar, deterioro de la calidad
del agua de mar para su utilización y menoscabo de los lugares de esparcimiento
(Tejada et al., 2003).
Se calcula que en promedio 1.7 - 8.8 x 106 toneladas de hidrocarburos son
descargados anualmente a las aguas marinas y estuarinas del mundo (Head y Swanell,
1999), ya sea a través de actividades antropogénicas, como el transporte y
explotación de crudo; como producto de fuentes biogénicas, como las algas (Prince et
al., 2003) o por la descarga de aguas residuales industriales y municipales (tabla 1).
Tabla 1 Fuentes de hidrocarburos del petróleo al mar (106 Ton /año)
Actividad Industria del Petrolera
Otras Total
Transporte 1.15 0.22 1.37 Producción, refinamiento y carga en terminales
0.12 0.12
Aguas industriales 0.15 Aguas de desecho municipales
0.30
Deposición atmosférica 0.60 Producción por fitoplancton marino
26.000
Desagües urbanos 0.40 Aguas rivereñas 1.40 Deposición atmosférica a 100-4000
a producto de la biosintesis. Tomada de Kennish, 1994.
13
Los hidrocarburos pueden clasificarse según la forma estructural en hidrocarburos de
cadena abierta e hidrocarburos cíclicos. Dentro de los hidrocarburos de cadena abierta
o alifáticos se encuentran los alcanos, los cuales pueden ser saturados y no saturados
(alquenos y alquinos) (Brown et al., 1997). Dentro de los cíclicos se encuentra el
grupo de hidrocarburos aromáticos de bajo y alto peso molecular. Su persistencia,
toxicidad, y biodegradabilidad depende de las cantidades en las que estén presentes
en el petróleo crudo y sus derivados.
2.1.1 Hidrocarburos alifáticos
Los hidrocarburos alifáticos se pueden clasificar en alcanos, alquenos y alquinos,
dependiendo de la saturación de sus enlaces. Los alcanos constituyen el mayor
componente de los combustibles del petróleo (So y Young, 1999) y son los
compuestos más simples, poseen hidrógeno y carbono unidos por enlaces sencillos.
Los alquenos son hidrocarburos que poseen al menos un doble enlace entre carbonos,
mientras los alquinos son compuesto más reactivos que los alquenos y presentan
enlaces triples entre sus carbonos (Brown et al., 1997).
Dependiendo del grado de insaturación (dobles o triples enlaces), la longitud de las
cadenas y las ramificaciones, varía la susceptibilidad del hidrocarburo a la
degradación y su toxicidad. Siendo más fácilmente degradables los compuestos
menos saturados, de cadenas cortas y poco o nada ramificados (Sikkema et al., 1995).
Los hidrocarburos alifáticos son indicadores de contaminación reciente, ya que las
transformaciones de estos hidrocarburos en el medio acuático, se produce
rápidamente por fenómenos de volatilización, foto-oxidación, dilución, dispersión y
biodegradación (Marrugo, 1995).
14
2.1.2 Hidrocarburos aromáticos
Los hidrocarburos aromáticos que se encuentran en el ambiente, son producto de
fuentes antropogénicas como los derrames de petróleo, plantas generadoras de gas y
en menor cantidad por la producción biológica en sedimentos anóxicos por parte de
cianobacterias (Meckenstock et al., 2004). De acuerdo al número de anillos se
clasifican en mono aromáticos y en poli aromáticos.
Un grupo de relevancia dentro de los mononucleares son los compuestos
denominados BTEX ( Benceno, Tolueno, Xileno, Etilbenceno) (Figura 1). Los BTEX
son hidrocarburos monoaromáticos no oxigenados, altamente solubles en agua,
volátiles y hacen parte del crudo, de la gasolina y otros derivados del petróleo
(Margesin y Schinner, 2001). Estos compuestos son empleados como solventes en las
industrias de plásticos, fibras sintéticas y pesticidas (Harwood y Gibson, 1997) las
cuales vierten el contenido de sus aguas de desecho en ríos (Kennish, 1994), que
finalmente desembocan en los océanos. Debido a sus características carcinogénicas y
tóxicas los compuestos BTEX están clasificados como contaminantes primarios por
la Agencia de Protección Ambiental (EPA) (Tsao et al., 1998).
Estos compuestos son considerados como uno de las mayores fuentes de
contaminación de hidrocarburos en aguas, puesto que los tanques de almacenamiento
subterráneos presentan fugas de combustible que continuamente se vierten en los
suelos y acuíferos subterráneos (Penet, 2004; Head y Swanell, 1999). Se estima que
aproximadamente el 35% de 1.4 millones de tanques de almacenamiento de gasolina
en los Estados Unidos presentan escapes que junto con las descargas provenientes de
la producción petrolera y los terminales marítimos, son un riesgo en diversos
ecosistemas.
15
Figura 1. Estructura molecular de los compuestos del grupo BTEX (Benceno,
Tolueno, Xileno y Etilbenceno)
Los Hidrocarburos Aromáticos Polinucleares (HAP) se encuentran presentes en
combustibles fósiles y se forman durante la combustión incompleta de materia
orgánica. Estos hidrocarburos forman parte de la lista de compuestos peligrosos de la
EPA (Witt, 1995). Las actividades de transporte y refinamiento del petróleo y las
deposiciones atmosféricas, producen las mayores descargas en el ambiente
(Phothuluri y Cerniglia, 1994). Los HAP están compuestos por dos o más anillos
aromáticos fusionados y sus propiedades químicas y degradación ambiental depende
del tamaño y patrón de fusión de los anillos (Kanaly y Harayama, 2000) (Figura 2).
De acuerdo con lo anterior se distinguen HAP de bajo y HAP de alto peso molecular.
En el primer grupo se encuentran los compuestos de dos o tres anillos como naftaleno
y antraceno que presentan toxicidad aguda. En el segundo grupo se encuentran las
moléculas de cuatro a seis anillos como pireno y fluoranteno que tiene alto potencial
carcinogénico y genotóxico (Witt, 1995).
El incremento en el tamaño de las moléculas de HAP genera un aumento en la
hidrofobicidad y estabilidad química, por lo cual aumenta la persistencia de estas
moléculas en el ambiente se hace mayor (Daane et al., 2001). Como consecuencia de
su característica hidrofobica, los HAP pueden migrar a los sedimentos de los
ecosistemas acuáticos, bioacumularse y biomagnificarse a través de la cadena trófica
(Kanaly y Harayama, 2000).
16
Figura 2. Estructuras moleculares de Hidrocarburos Aromáticos Polinucleares
(HAP)
Los HAP tienen capacidad de interferir en el metabolismo de lípidos y proteínas
(Hyland y Scheider, 1976). En bioensayos con organismos marinos adultos se
demostró que los efectos letales de la fracción soluble del petróleo ocurren en un
rango de 1 a 10 mg/L, mientras que para los estadios larvales y juveniles estos se
presentan a menores niveles (0.1 mg/L). También se ha comprobado que la radiación
solar eleva significativamente la toxicidad de la fracción aromática del petróleo,
debido a la fotoxidación de las moléculas de HAP, bastante menos (Antón y Lizaso,
2002)
2.2 PETRÓLEO Y ACPM
El petróleo crudo es una mezcla compleja de hidrocarburos que al fraccionarse por
cromatografía en sílica gel se presentan tres fracciones: un grupo de compuestos
saturados o fracción alifática, una fracción aromática y una asfáltica o polar. La
fracción saturada esta compuesta por n-alcanos, alcanos ramificados y cicloalcanos o
naftenos (Atlas, 1981). En la fracción aromática se encuentran compuestos
mononucleares (un solo anillo) conocidos como BTEX (Margesin y Schinner, 2001)
y los Hidrocarburos Aromáticos Polinucleares (PAH) de bajo y alto peso molecular
que tiene dos o más anillos (Kanaly y Harayama, 2000).
El diesel o aceite combustible para motores (ACPM), es un destilado medio del
petróleo crudo. Se encuentra clasificado por la National Fire Protection Association
dentro de la norma 321, como un líquido inflamable clase II que posee las
17
características de ser irritante, no oxidativo, no corrosivo y como todos los
hidrocarburos es insoluble en agua. El diesel presenta una mezcla compleja de
alcanos lineales, ramificados, cicloalcanos y compuestos aromáticos (Tabla 2).
Tabla 2. Composición del ACPM
Hidrocarburos Saturados
Hidrocarburos Aromáticos
Aromáticos Azufrados
Parafinas: 21.22% Monociclofinas: 21.84 % Ditritetracicloparafinas:15.71%
Monoaromáticos:16.60% Di Aromáticos: 13.54% Tri Aromáticos: 3.91% Tetra Aromáticos: 0.13% Penta Aromáticos: 0.01
Benzotiofeno: 4.45% Dibenzotiofeno: 2.58 % Naftobenzotiofeno: 0%
Datos tomados de http://www.ecopetrol.com.co/
2.3 BIODEGRADACIÓN
La biodegradación esta definida como la transformación o detoxificación parcial o
total de contaminantes por microorganismos y plantas (Sylvia et al., 1998) en
compuestos no peligrosos e inocuos que puedan ser integrados dentro de los ciclos
biogeoquímicos (Margesin y Schinner, 2001). En este proceso se puede lograr la
mineralización o no de los compuestos, obteniendo como resultado la conversión
total de un contaminante orgánico a sus constituyentes inorgánicos, esta
transformación puede ser realizada por una sola especie o un consorcio de
microorganismos (Ghazali et al., 2004) .
La habilidad de las poblaciones nativas para degradar los hidrocarburos, constituye
uno de los mecanismos principales para mitigar el impacto causado por la presencia
del petróleo crudo y sus derivados. Los microorganismos con capacidad enzimática
para degradar los hidrocarburos del petróleo pueden ser aislados de suelos y aguas
que han sido expuestos a estos compuestos (Márquez et al., 2001). Investigaciones
realizadas han demostrado que el número de degradadores de hidrocarburos en el área
se incrementa después de un derrame o liberación de petróleo crudo o sus derivados,
18
llegando a una proporción de 10% del total de la población bacteriana del sitio
contaminado (Lee y Merlín, 1999; Atlas, 1995).
Hasta el momento han sido identificados varios géneros con capacidad degradadora
de hidrocarburos, dentro de los cuales se encuentran especies de Pseudomonas sp,
Rhodanobacter sp., Flavobacterium sp., Thermomonas sp. (Kaplan y Kitts, 2004),
Brevibacillus sp., Paenibacillus sp., Alcaligenes sp., Nocardia sp. (Daane et al.,
2001), Ralstonia sp. y hongos de los géneros de Penicillium sp., Trichoderma sp.,
Alternaria sp. y Aspergillus sp. (Chávez et al., 2003) entre otros. De igual forma se
han reportado microorganismos con capacidad para degradan diesel de forma natural
como Acinetobacter lwoffi, Pseudomonas stutzeri (Gallego et al., 2001), Pleurotus
ostreatus, Pseudomonas sp., Serratia sp., y Flavobacterium spp. (Marquez et al.,
2001).
Con frecuencia en ambientes marinos pueden ser aisladas bacterias pertenecientes a
los géneros Achromobacter sp., Acinetobacter sp., Alcaligenes sp., Arthrobacter sp.,
Bacillus sp., Flavobacterium sp., Nocardia sp. y Pseudomonas spp. Entre los
hongos se encuentran Aurebasidium sp., Candida sp., Rhodotorula sp. y
Sporobolomyces spp. (Leahy y Colwell, 1990).
La biodegradabilidad de los diferentes hidrocarburos del petróleo varía en función de
sus características físicas y químicas, de la presencia de grupos sustituyentes en las
cadenas hidrocarbonadas, el tamaño del hidrocarburo y la fusión de los anillos (Leahy
y Colwell, 1990). Las tasa de biodegradación de los HP puede variar entre 70 y 97%
dependiendo de la cepa microbiana involucrada, las condiciones de temperatura,
salinidad, pH, oxigeno, nutrientes, concentración del contaminante y flora microbiana
en el lugar (Prince et al., 2003; Muherji y Vijay, 2002).
El proceso de biodegradación de los HP esta mediado en primer lugar, por el acceso
que tenga la bacteria al contaminante. Este puede ser a través de un movimiento
19
quimiotáctico hacia la interfase agua-aceite donde se da el proceso catabólico o por la
adhesión mediada por la formación de biopelículas (Pandey y Jain, 2002).
La quimiotaxis bacteriana se conoce como el movimiento bajo influencia de un
gradiente de concentración química, el cual si va en dirección hacia el contaminante,
es llamado quimiotaxis positiva, pero si es en contra, se denomina quimiotaxis
negativa. Este movimiento ayuda al microorganismo a encontrar óptimas condiciones
para el crecimiento y supervivencia. Los hidrocarburos del petróleo quienes son
empleados como fuente de carbono y energía, actúan en muchos casos como
compuestos quimioatrayentes y de acuerdo al nivel de tolerancia a la toxicidad por el
microorganismo pueden o no convertirse en compuestos quimiorepelentes;
confiriendo una ventaja selectiva para la degradación bacteriana guiando la
sensibilidad y ubicación del contaminante en el ambiente (Pandey y Jain, 2002).
En contacto con los microorganismos los hidrocarburos son incorporados dentro de
las células, generalmente por transporte pasivo, aun cuando se han encontrado
diferentes adaptaciones en las vías asimilativas, como el caso de las inclusiones
formadas a partir de la membrana de Lipopolisacaridos (LPS), presente solamente en
bacterias Gram negativas, que son liberadas para encapsular gotas de hidrocarburos y
poder pasar a través de la membrana como ha sido reportado en cepas de
Pseudomonas sp. y levaduras, o por inclusiones formadas a partir de la membrana
citoplasmática en cepas de Acinetobacter sp. La membrana citoplasmática presenta
una baja permeabilidad para las moléculas cargadas y polares, de tal forma que los
compuestos apolares como los hidrocarburos pueden penetrar fácilmente la bicapa
lipidica o pueden ser acumulados dentro de la membrana causando en ciertos casos
problemas de toxicidad (Sikkema et al., 1995).
Las reacciones enzimáticas llevadas a cabo por bacterias y hongos para la
degradación aeróbica de hidrocarburos involucra la oxidación de los sustratos por
enzimas de tipo oxigenasas, que requieren una molécula de oxigeno. Los alcanos son
20
convertidos primero a alcoholes, cetonas y subsecuentemente a ácidos carboxílicos,
para posteriormente ser degradados vía β-oxidación (Whyte et al., 1998). Por otro
lado los anillos de los hidrocarburos aromáticos, por lo general, son hidroxilados y
forman dioles. Los anillos son clivados resultando en la formación de catecoles que
van a ser intermediarios de la vía de los ácidos tricarboxílicos (Atlas, 1995)
La presencia de las enzimas requeridas para estas transformaciones pueden
encontrase en un solo microorganismo, pero la mayoría de las veces este proceso se
efectúa gracias a la acción conjunta de diferentes bacterias que establecen relaciones
de cooperación y mutualismo. Estas asociaciones son conocidas como consorcios y
tienen la habilidad para complementar sus funciones metabólicas y poder de esta
forma degradar ciertos compuestos (Sylvia et al., 1998). En varios estudios sobre la
transformación del petróleo se han empleado mezclas de bacterias o bacteria–hongos
en un esfuerzo por maximizar la biodegradación. La ventaja de emplear cultivos
mixtos esta atribuida a los efectos de las interacciones sinérgicas entre miembros de
la asociación. Es posible que algunas especies remuevan los metabolitos tóxicos,
mientras otras sean capaces de degradar totalmente el compuesto que las primeras
solo degradaron parcialmente (Ghazali et al., 2004).
2.4 BIORREMEDIACIÓN
La biorremediación es una estrategia que usa procesos biodegradativos
(microorganismos, plantas o enzimas) para detoxificar y recuperar un ambiente
contaminado (Dua et al., 2002; Gallego et al., 2001). Dentro de las estrategias de
biorremediación desarrolladas se encuentra la atenuación natural, la bioestimulación,
el bioventeo, la bioaumentación, “landfarming” (Biolabranza), el compostaje y la
fitorremediación (Sylvia et al., 1998), pero las tres técnicas que predominan en la
actualidad son la atenuación natural, la bioestimulación y bioaumentación ( Kaplan y
Kitts, 2004).
21
2.4.1 Atenuación natural
La atenuación natural es un método que consiste en monitorear la concentración del
contaminante para asegurar que el proceso de degradación esta activo y es realizado
en forma segura, teniendo en cuanta la ecotoxicidad de los productos metabólicos que
se generan (Kaplan y Kitts, 2004). Su principal característica es el empleo de los
procesos físico-químicos de interacción contaminante-ambiente y los procesos de
biodegradación que tienen lugar de forma natural en el medio, conocidos de forma
conjunta como procesos de biotransformación. Entre estos procesos se encuentran el
efecto de dilución, dispersión, volatilización, adsorción y biodegradación. Los
procesos de biotransformación en condiciones favorables y sin intervención humana
deben reducir la masa, toxicidad, volumen y concentración del contaminante (EPA,
1999).
2.4.2 Bioaumentación
La bioaumentación se relaciona con la adición de microorganismos, en lugares donde
las poblaciones degradadoras no están presentes o son muy bajos los niveles
encontrados, esta técnica no siempre ha resultado ser efectiva debido a que los
microorganismos introducidos deben competir con las poblaciones autóctonas, que se
encuentran mejor adaptadas a las condiciones ambientales (Kaplan y Kitts, 2004).
Los microorganismos con capacidad de degradación de hidrocarburos se encuentran
distribuidos de forma ubicua y el número de estos incrementa tras sucesivas
exposiciones al contaminante (Lee y Merlín, 1999), razones por las cuales esta
técnica ha presentado algunos inconvenientes y no se ha podido establecer si
realmente estimula o no los procesos de remoción de hidrocarburos.
Goldstein y colaboradores (1985), establecieron que la bioaumentación no es efectiva
cuando la concentración del contaminante es tóxica para el inoculante y los
microorganismos adicionados son susceptibles a las toxinas generadas naturalmente
22
y/o a los predadores del ambiente, cuando el inoculante no es capaz de moverse en el
ambiente en dirección de la fuente contaminante (Swanell et al., 1996).
Varios experimentos han sido realizados para evaluar el efecto de la bioaumentación
en los procesos de biorremediación y los resultados obtenidos varían
circunstancialmente; Tagger et al. (1983) notaron que al adicionar microorganismos a
una parcela de agua de mar de 10m3, estos desaparecían rápidamente y no se
observaba incremento del potencial de degradación de los hidrocarburos, mientras
que en ausencia de la adición de microorganismos bajo las mismas condiciones la
población microbiana nativa se adaptó a la exposición del contaminante en un
periodo de cuatro días contribuyendo efectivamente con su transformación.
Por otro lado en investigaciones realizadas por Christon et al., (1997) en donde se
adicionaron inóculos para estimular la biorremediación en zonas donde el recuento
de microorganismos degradadores de petróleo era bajo (103 a 104 UFC/g), se obtuvo
como resultado una eliminación cercana al 95% de los hidrocarburos del crudo que
había sido inoculado, contra una desaparición del 14% en los campos de crudo que no
fueron tratados. Por el esfuerzo que supone implantar un proceso de biorrecuperación,
este debe demostrar ser eficaz, lo cual significa que la remoción del contaminante sea
debida realmente a la biodegradación y no a otros procesos en los cuales las tasa de
remoción sean mayores que los que se presentan en condiciones naturales.
La adaptación de las poblaciones naturales a la degradación de diferentes compuestos
pone de manifiesto que no es necesario la adición de un inoculo bacteriano para
biorremediar, puesto que ambientalmente se cuenta con el potencial para hacerlo y la
bioaumentación ha resultado ser poco eficiente para el tratamiento en mares abiertos
contaminados con crudo o sus derivados (Lee y Merlín, 1999).
23
2.4.3 Bioestimulación
La bioestimulación provee a las comunidades bacterianas de un ambiente favorable
en el cual pueda ser efectiva la degradación del contaminante, para lo cual el área a
biorremediar es suplida con nutrientes, cosustratos u oxigeno, de acuerdo a los
requerimiento específicos para cada área (Van Gestel et al., 2003), Puede darse por
medio de fertilizantes orgánicos o inorgánicos y ha demostrado ser una estrategia
efectiva especialmente donde los limitantes para la degradación son los nutrientes,
logrando un aumento en de tres a cinco veces las tasas de degradación (Lee y Merlín,
1999; Atlas, 1995).
Los nutrientes pueden ser aplicados en forma de fertilizante orgánicos o inorgánicos,
se encuentran en presentaciones granulares, liquidas y talcos cada uno presenta
variantes en cuanto a la aplicación y efectividad. Tal es el caso de algunos
fertilizantes de liberación lenta que generalmente no es adecuado situarlos de forma
individual por que pueden ser removidos rápidamente por acción del oleaje y de las
mareas. Los fertilizantes granulares son de fácil aplicación y liberan los nutrientes por
disolución cuando entran en contacto con el agua (Swanell et al., 1996) Los
fertilizantes oleofilicos son preferidos por que promueven el crecimiento de los
microorganismos degradadores de hidrocarburos al proveer los nutrientes a las
poblaciones en la interfase agua-aceite, en donde se presenta la biodegradación de los
hidrocarburos pero tienen la misma desventaja de otros fertilizantes orgánicos,
presenta una fuente de carbono orgánica la cual puede ser biodegradada primero que
los hidrocarburos (Pandey y Jain, 2002).
Al contrario de la bioaumentación la bioestimulación, aun cuando es difícil de aplicar
en mares abiertos (Lee y Merlín, 1999), ha demostrado ser efectiva en varios
incidentes como el caso del Exxon Valdez donde incremento hasta tres veces las tasas
de remoción de los HP por la aplicación de dos fertilizantes, el Custombler y el Inipol
EAP 22, que además de estimular la biodegradación del crudo por adición de
24
nutrientes, aparentemente ayuda a promover la formación de microemulsiones agua-
aceite, por reducción de la viscosidad y la tensión interfacial (Swanell et al., 1996).
2.4.4 Bioventeo , Composteo, Biolabranza y Fitorremediación
El bioeventeo es una variante de la bioestimulación en donde se inyecta a la zona no
saturada del suelo, gases como metano u oxigeno, para estimular la actividad
microbiana (Sylvia et al., 1998). El “landfarming” consiste en la incorporación de
contaminantes en superficies no contaminadas aprovechando las poblaciones
bacteriana autóctonas (Kaplan y Kitts, 2004) o bioaumentando (Sylvia et al., 1998),
con el fin de llevar a cabo las reacciones de biotransformación necesarias.
El composteo es un proceso ex situ, aerobio, donde se emplean microorganismos
termofílicos (Ryckeboer et al., 2003; Sylvia et al., 1998), y el contaminante a
remediar esta agrupado en pilas con material lignocelulólisico (Fernández et al.,
1998).
La fitorremediación es el empleo de plantas para remover contaminantes, ya sea por
acumulación dentro de sus tejidos o por estimulación de la población microbiana en
la rizosfera (Lee y Merlín, 1999).
La esencia de la biorremediación de los ambientes marinos es suplementar con
macronutrientes exógenos, (Maki et al., 2003), empleando de forma individual y
conjunta las técnicas de biestimulación y bioaumentación, teniendo en cuenta que la
bioestimulación al contrario de la bioaumentación, aun cuando es difícil de aplicar en
mares abiertos (Lee y Merlín, 1999) ha demostrado ser efectiva en varios incidentes,
(Swanell et al. 1996).
En Colombia los procesos de biorremediación han sido desarrollados desde hace
algunos años por instituciones como ECOPETROL y British Petroleum con el
propósito de degradar hidrocarburos presentes en los cortes de perforación, refinerías
25
y campos de producción, donde se han tratado mas de un millón de metros cúbicos
de lodos aceitosos con 30 –60 % de hidrocarburos, logrando recuperar suelos y
cuerpos de agua a condiciones ambientales favorables (en:
www.colciencias.gov.co/simbiosis/ directorios/vegetal_detalle.htm ).
De igual manera el Instituto Colombiano del Petróleo (ICP), ha estudiado la
aplicación de la industria del proceso de biodegradación de aguas fenolicas en
sistemas continuos que le ha permitido reducir cerca del 95% de los fenoles,
manejando flujos hasta de doscientos mil barriles por día. Paralelamente a la
biodegradación de fenoles se han reducido los niveles de nitrógeno amoniacal e
hidrocarburos en cerca del 40% (en: www.colciencias.gov.co/
simbiosis/percepcion/c1mambiente.htm - 20k).
Así mismo el Centro de Investigaciones Microbiológicas de la Universidad de los
Andes ha desarrollado diferentes estudios en el campo de la biorremediacion como es
el caso del empleo de bacterias nativas degradadoras de crudo y fenol en la región de
Caño Limón (Dussán, 2000). Otras investigaciones han adelantado estudios de
aislamiento, caracterización y aplicación de microorganismos degradadores de
compuestos orgánicos en ambientes marinos como los realizados en biodegradación
de hidrocarburos con bacterias aisladas de la Bahía de Cartagena (Salamanca, 1999).
2.5 FACTORES QUÍMICOS Y FÍSICOS QUE AFECTAN LA
BIORREMEDIACIÓN
Los procesos de biorremediación pueden verse afectados o beneficiados por
características presentes en la zona a tratar o por propiedades inherentes al
contaminante. Tal es el caso de
2.5.1 Composición del petróleo y sus derivados
Tisson y Welte (en: Prince et al., 2003) determinaron que en promedio el petróleo
crudo estaba conformado por un 58.2% de compuestos saturados, 28.6% de
26
aromáticos y 14.2% de compuestos polares. Las variaciones dentro de estas
relaciones y la presencia o no de ciertos compuestos le confieren resistencia a la
degradación y persistencia en el ambiente (Atlas, 1981). Algunas bacterias requieren
de ciertos hidrocarburos, en especial los alcanos, fuente rica de energía, para poder
degradar otros en forma cometabolica (Van Hamme et al., 2003).
2.5.2 Estado físico del hidrocarburo
La biorremediación esta influenciada por el estado físico en el que se encuentran los
hidrocarburos. Cuando ocurre un derrame de crudo, se tiende a formar una mancha en
el mar que por acción del oleaje genera emulsiones, las cuales aumentan el área de
superficie de los hidrocarburos dentro de la columna de agua, siendo así mas
biodisponibles para el ataque microbiano (Leahy y Colwell, 1990), este proceso se
conoce como pseudosolubilización (Atlas, 1981).
Algunos hidrocarburos pueden variar su disponibilidad dependiendo de si se
encuentran en estado líquido o sólidos. Los hidrocarburos aromáticos líquidos son
utilizados por bacterias en la interface agua-aceite, pero no pueden ser metabolizados
a 30oC por encontrarse en su estado sólido. De igual forma el naftaleno no puede ser
utilizado en su estado sólido y debe ser disuelto en otro hidrocarburo líquido para
poder ser catabolizado por determinadas bacterias (Atlas, 1981).
2.5.3 Temperatura
La temperatura de un ambiente a biorremediar también afecta las propiedades del
hidrocarburo derramado y la actividad metabólica de los microorganismos. A bajas
temperaturas la viscosidad y solubilidad en agua de los aceites incrementa, mientras
la volatilización se reduce, alterando la biodisponibilidad del hidrocarburo (Venosa y
Zhu, 2003; Leahy y Colwell, 1990).
27
A nivel del metabolismo microbiano la degradación óptima se lleva a cabo en un
intervalo de temperaturas de 10-40oC (Fernández et al., 1998). La biodegradación de
hidrocarburos puede ser llevada a cabo en un amplio rango de temperaturas aunque
por lo general, la tasa de biodegradación desciende generalmente con el descenso de
temperatura. Las altas tasas de remoción de los hidrocarburos se presentan
generalmente en un rango de 30-40 oC en suelos, 20-30 oC en aguas dulces y de 15-
20 oC en ambientes marinos (Venosa y Zhu, 2003). Las aguas del Caribe presentan
temperaturas aproximadas de 28 oC, pero en las proximidades del departamento del
Magdalena la temperatura puede descender hasta los 25 oC o menos por efecto de la
surgencia.
Sorkhoh et al. (Margesin y Schinner, 2001) tras un estudio de áreas contaminadas en
Kuwait, región que se distingue por que la temperaturas ambientales cercanas a 50oC,
encontraron densidades de bacterias de 3x103 hasta 1x107 por gramo de suelo,
aislaron 368 cepas que en su mayoría eran bacilos pertenecientes a la especie Bacillus
stearothermophilus y dos de las cepas fueron capaces de degradar entre el 80-89%
de crudo a concentración de 5g/l en cinco días, con un optimo de temperatura de
60oC.
2.5.4 Aceptores de electrones
Los procesos de biodegradación se pueden llevar a cabo empleando diferentes
aceptores de electrones como el oxigeno, los nitratos, sulfatos y algunos compuestos
orgánicos (Fernández et al., 1998) y dependiendo del tipo de aceptor de electrones
empleado se establece la clase de metabolismo. En ambientes marinos, cuando los
niveles de oxigeno descienden, los aceptores de electrones más importantes son el
hierro, manganeso y sulfatos (Head y Swanell, 1999), pero debido a la abundancia del
sulfato en los ambientes marinos los procesos de sulfato reducción son
predominantes; estudios realizados en la Bahía de San Diego reportaron que la
oxidación de naftaleno, fenantreno, metilnaftaleno, fluoreno y fenantreno en muestras
28
de sedimentos se lleva a cabo bajo condiciones sulfato reductoras (Coates et al.,
1997). Weiner y Lovley (1998) encontraron que en un acuífero contaminado con
petróleo crudo, el benceno era degradado de forma natural a metanol y dioxido de
carbono bajo condiciones de reducción de Fe (III) generando intermediarios como
acetato, propionato y fenol y obteniendo porcentajes de mineralización del 53%.
2.5.5 Nutrientes
Después de un derrame de hidrocarburos las relaciones C:N:P se ven alteradas por el
exceso de carbono que desfavorece el crecimiento microbiano (Leahy y Colwell,
1990). Para alcanzar un equilibrio es necesario suplementar con nutrientes, como
nitrógeno y fósforo, en forma de fertilizantes orgánicos u inorgánicos. Teniendo en
cuenta que en el medio marino el efecto de dispersión y la acción del oleaje conlleva
a una disminución casi instantánea de las concentraciones aplicadas, pero que en
áreas de menor movimiento la aplicación exagerada de nitrógeno y fósforo puede
generar eutroficación (Swanell et al., 1996).
2.5.6 pH
El pH afecta la cinética de las enzimas involucradas en la degradación, las cuales
tiene rangos óptimos de acción que varían de acuerdo a su estabilidad. En general se
ha encontrado que la transformación de hidrocarburos es más eficaz a valores de pH 7
(Fernández et al., 1998) sin dejar de presentarse adaptaciones a ambientes extremos
que permiten tasas de degradación significativas en valores de pH ácidos o
alcalófilos (Margesin y Schinner, 2001).
El pH del agua de aguas marinas es generalmente estable y ligeramente alcalino
(Venosa y Zhu, 2003), en el año 2004 en el Caribe Colombiano se registro un valor
promedio en los ecosistemas marinos de 8.07 (Marín et al., 2004).
29
2.6 TÉCNICAS PARA ANÁLISIS DE HIDROCARBUROS
La fluorometría y la cromatografía de gases son técnicas empleadas para la
determinación y cuantificación de hidrocarburos que presentan ciertas diferencias en
cuanto a la clase de compuestos que pueden determinar.
2.6.1 Fluorometría
La fluorometría esta relacionada con la cuantificación de la fluorescencia emitida por
una especie que ha absorbido una radiación incidente (Schenk et al.,1984). Los
hidrocarburos aromáticos son los únicos capaces de emitir fluorescencia; por esta
razón esta técnica solo es aplicada para la determinación de Hidrocarburos Disueltos
y Dispersos (HDD) en aguas (Garay et al., 1993). En la fluorescencia las sustancias
son irradiadas a una longitud de onda, los compuestos absorben esta energía e
irradian otra longitud de onda mas larga y de menor energía que la radiación que ha
sido absorbida, la intensidad con la que es emitida esta longitud de onda es analizada
por medio de un sistema óptico y un fotodetector.
Para el análisis de hidrocarburos del petróleo se emplea una longitud de onda de
excitación de 310 nm y de emisión de 360 nm (Garay et al., 2003) y estándares,
como criseno, que permiten determinar errores al cuantificar con esta técnica.
2.6.2 Cromatografía de gases.
La cromatografía de gases es una técnica de separación en donde se emplea una fase
móvil (gas de arrastre) y una estacionaria adsorbente con el fin de obtener
compuestos individuales. Los extractos obtenidos son inyectados en una columna
donde son movidos por el gas de arrastre. Cada componente presenta un tiempo de
retención particular, que sumado a la altura del pico y al área bajo la curva resultante,
es proporcional a la cantidad del hidrocarburo presente en la muestra original (Garay
et al., 2003). Esta técnica discrimina cada uno de los compuestos presentes en una
muestra y representa con mayor exactitud concentraciones precisas en las cuales se
encuentran tanto hidrocarburos lineales como aromáticos y cíclicos.
30
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
� Seleccionar bacterias aisladas de sedimentos del caribe colombiano con
capacidad de degradar hidrocarburos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
� Seleccionar del Cepario de Bacterias Marinas (CBM) cepas tolerantes a
Hidrocarburos (ACPM y crudo).
� Establecer la concentración de ACPM mínima inhibitoria sobre las cepas tolerantes a hidrocarburos (ACPM y crudo).
� Identificar bioquímicamente las cepas bacterianas tolerantes a hidrocarburos.
� Determinar la capacidad de degradación de las cepas seleccionadas en
términos de porcentaje de degradación de hidrocarburos del ACPM.
31
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 MICROORGANISMOS
Los microorganismos que se emplearon en el presente estudio hacen parte del
Cepario de Bacterias Marinas (CBM) del Laboratorio de Microbiología del
INVEMAR. Fueron aislados de sedimentos del mar Caribe como parte del proyecto
¨Selección y Aplicación de Bacterias Marinas Nativas con Capacidad Degradadora de
Compuestos Orgánicos Persistentes (COP) en el Pacífico y Caribe Colombiano”
desarrollado con el apoyo de COLCIENCIAS. Los microorganismos se aislaron y
cultivaron bajo las condiciones descritas a continuación
4.1.2 Aislamiento de microorganismos
En la fase de campo se tomaron 500 g de sedimento con una draga metálica Ekman
de 0.05 m3, a una profundidad no mayor a los 15 cm, se colocaron en papel aluminio
previamente tratado con hexano y se transportaron al laboratorio en bolsas plásticas
con sello hermético a 4°C.
En la fase de laboratorio se tomó 50g del sedimento recolectado y se colocó en un
erlenmeyer de 1000 mL que contenía 450 mL de agua de mar estéril. Se agitó en un
shaker orbital por 15 minutos, 180 rpm a temperatura ambiente, se dejó reposar por
10 minutos para permitir que el sedimento se separara de la fase acuosa
(sobrenadante). Posteriormente se tomó 1ml del sobrenadante para ser inoculados en
9 mL de Caldo de preenriquecimiento N y P (Anexo 1) con crudo al 1% y ACPM al
1%. Los caldos de preenriquecimiento con crudo y ACPM se incubaron a 35°C con
una agitación de 180rpm cada 12 horas por 7 días. Transcurrido este tiempo se tomó
1ml de cada uno de los caldos de preenriquecimiento y se adicionó a 9ml de Caldo
MMS (Medio Mínimo de Sales) (anexo 1) mas Crudo 1% v/v y ACPM 1% v/v (por
separado) durante 7 días, Transcurrido este tiempo se realizó un pase (1ml) a Caldo
MMS fresco por 7 días más de incubación. Completados 21 días de crecimiento se
32
realizó el aislamiento de bacterias tolerantes a Crudo y a ACPM en agar nutritivo
(Haines et al., 1996; Rojas-Avelizapa et al., 1999; Núñez, 2003).
Las cepas aisladas se conservaron en el CBM del INVEMAR a 4oC en tubo inclinado
con medio Gorvienko (anexo 1) y medio MMS, suplementados con 1% de ACPM y
1% de petróleo crudo (PC) de acuerdo al contaminante de aislamiento y aceite
mineral.
4.2 SELECCIÓN DE CEPAS PARA ENSAYO DE DEGRADACIÓN
Con el fin de elegir microorganismos que presentaron una capacidad de degradación
competitiva se efectuaron dos pruebas: selección horizontal en PC y ACPM y
Concentración Mínima Inhibitoria.
4.2.1 Selección horizontal en petróleo crudo y ACPM
Las cepas se reactivaron en tubos con cinco mL de caldo nutritivo (Merck) (Anexo1),
los cuales se incubaron a 35oC por 24 horas. Finalizado el tiempo de incubación, los
cultivos se ajustaron al tubo No.1 del patrón de MacFarland (3x108 células/mL).
Posteriormente, de cada tubo se realizó un pase de forma masiva a cajas con agar
MMS suplementado con 1% de PC y cajas con agar MMS suplementadas con 1 % de
ACPM. Los pases se realizaron por triplicado y las cajas se incubaron a 35oC durante
siete días. Al cabo se este tiempo se observó si las cepas tenían la capacidad de crecer
en ambos contaminantes.
4.2.2 Concentración de ACPM Mínima Inhibitoria (CMI)
Los ensayos de CMI se realizaron por triplicado y se evaluó un rango de
concentraciones en una escala de 1%, 2%, 4%, 6%, 8% y 10% de ACPM teniendo
como referencia las concentraciones evaluadas por diferentes autores (Márquez-
Rocha et al., 2005; Rojas- Avelizapa et al., 1999, Ururahyl et al., 1998), para lo cual
se prepararon tubos de ensayo con cinco mL de medio MMS adicionado con ACPM,
por cada bacteria a evaluar. Cada serie se inoculó con una alícuota de 0.5 mL de un
33
cultivo de 24 de horas de crecimiento, ajustado al tubo No.1 del patrón de
MacFarland. Los cultivos se incubaron a 35oC y se realizaron observaciones
periódicas por un periodo de 21 días. Se estableció como tubos positivos aquellos
donde se presentó crecimiento por turbidez y disgregación del ACPM (Haines et al.,
1996; Brown y Braddock, 1990). Se consideró la CMI de ACPM como la
concentración más baja de este compuesto a probar donde no se presentó crecimiento
y ausencia de disgregación del ACPM (Suárez, 2004).
4.2.3 Identificación Microbiana
Las cepas seleccionadas se caracterizaron macroscópicamente y microscópicamente
de acuerdo a las características descritas en la guía de referencia del Cepario del
Laboratorio de Microbiología del INVEMAR y se identificó bioquímicamente
mediante el sistema BBL Crystal y API 50 CHB/E, basados en la utilización y
degradación microbiana de sustratos específicos detectados por varios sistemas
indicadores (Avelizapa et al., 1999).
4.3 ENSAYOS DE DEGRADACIÓN DE ACPM
En el montaje de los ensayos, el material de vidrio (Schott Duran) empleado se
sometió a un tratamiento químico para evitar la contaminación cruzada e
interferencias. El material se lavó inicialmente con detergente y se trató con solución
sulfocrómica, posteriormente se enjuagó con agua de la llave, agua destilada y
preextraída; a continuación se hizo un lavado con metanol, acetona y un enjuague
con una solución de hexano. Finalmente se sometió a un tratamiento térmico de
150oC por tres horas (Garay et al., 2003).
4.3.1 Preparación de Inóculos
A cada una de las cepas provenientes de las pruebas de selección se le hizo un pase a
un erlenmeyer de 250 mL con 125 mL de medio MMS suplementado con 2% v/v de
ACPM. Los cultivos se incubaron por 24 horas a 30 oC y agitaron a 200 rpm (Shaeker
orbital BWR DS-500). Transcurridas las 24 horas se realizó un recuento en cámara de
34
Neubauer para determinar las concentraciones celulares de cada inoculo (Núñez,
2004 com pers.) (Anexo 2).
4.3.2 Ensayos de degradación
Los ensayos de degradación se realizaron evaluando la actividad en conjunto de las
cepas seleccionadas. El ensayo constó de un tratamiento y un control abiótico. En el
tratamiento cada unidad experimental se constituyó de 500 mL medio MMS, ACPM
al 2% v/v y el cultivo bacteriano mixto. El cultivo mixto estuvo conformado por cada
cepa proveniente del inóculo, a una concentración final de 105 células/mL (Marquéz
et al., 2001, Palittapongarnpim et al., 1998). El control abiótico se constituyó por 500
mL de medio MMS y ACPM al 2% v/v (17600 mg/ L). Los cultivos se incubaron a
30 oC en agitación a 200 rpm cada 12 horas (Shaeker orbital BWR DS-500) (Solano
et al., 2000) Cada uno se realizó por triplicado. Las determinaciones microbiológicas
se hicieron cada tres días, a partir del día cero y los análisis químicos cada cinco días
para hidrocarburos aromáticos y los días 0, 10 y 21 para alifáticos (Márquez-Rocha et
al., 2005) durante tres semanas (Figura 3). El tiempo de incubación y de las
mediciones se estableció con base a los estudios reportados por otros autores (Kaplan
y Kitts, 2004; Márquez et al., 2001, Ururahyl et al, 1998).
4.3.3 Curva de Crecimiento.
De cada botella con el tratamiento y el control abiótico se realizó el recuento de
viables a partir de día cero hasta el día 21, por la técnica de dilución y recuento en
placas de agar nutritivo (Palittapongarnpim et al., 1998). Con los resultados obtenidos
se elaboró la curva de crecimiento. Adicionalmente se realizaron observaciones de las
colonias recuperadas en los recuentos y se comparo con las características
morfológicas de las cepas iniciales con el objeto de establecer un patrón de
comportamiento del cultivo mixto en ACPM a través del tiempo.
35
Figura 3. Esquema de ensayo de degradación de ACPM para el análisis
microbiológico y químico del tratamiento y control abiótico.
36
4.4 DETERMINACIONES QUÍMICAS
El análisis de hidrocarburos aromáticos totales (HAT) y alifáticos se realizó siguiendo
los métodos de extracción y medición de hidrocarburos descritos en el manual de
técnicas analíticas del INVEMAR (Garay et al., 2003).
4.4.1 Extracción de hidrocarburos
Las muestras sé transfirieron a un embudo de decantación y se extrajeron con n-
hexano. Posteriormente, las fracciones fueron separadas por cromatografía en
columna de Alúmina (120 - 230 mesh). La columna se lavó con n-hexano y se
sembró el extracto de la muestra. Para el fraccionamiento se utilizaron como
eluyentes las siguientes soluciones: n-hexano para la recuperación de los
hidrocarburos alifáticos (F1); n-hexano:diclorometano (7:3) para hidrocarburos
mono-aromáticos (F2); y diclorometano para hidrocarburos poli-aromáticos (F3).
4.4.2 Medición de hidrocarburos alifáticos
El análisis de hidrocarburos alifáticos se realizó los días 0, 10 y 21con la técnica de
cromatografía de gases. Se empleó un cromatógrafo de gases con detector selectivo
de masas (GC/MSD) HP 6890/5973, equipado con una columna capilar HP5-MS de
30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y película de 0.25 µm. El
cromatógrafo operó con las siguientes condiciones: programación de temperatura del
horno desde 60 °C (1 min) hasta una temperatura final de 300 °C (8 min) a 8 °C/min,
inyección Splitless (0.75 min) y temperatura del inyector 280 °C. Como gas de
arrastre se utilizó helio a flujo constante de 1 mL/min. Los espectros de masa fueron
adquiridos con un detector MSD (280 °C) en un rango de 35-450 amu a 3.8 scan/s.
4.4.3 Medición de Hidrocarburos Aromáticos Totales (HAT)
Mediante técnica fluorométrica se determinó la concentración de HAT en las
fracciones F2 y F3, empleando un Espectrofluorómetro Shimadzu RF-5301 PC. Los
resultados fueron cuantificados con base a una curva de calibración externa generada
a partir de soluciones estándar de ACPM (anexo 3). Las lecturas se realizaron a una
37
longitud de onda de excitación de 310 nm y de emisión de 360 nm. La longitud de
onda se estableció después de realizar un scan del ACPM y determinar en que rango
se presentaba la mayor absorción por parte de los hidrocarburos aromáticos del
ACPM (anexo 4). Adicionalmente las muestras del día 0 y 21 se leyeron por
cromatografía de gases-masas con el fin de establecer la identidad de los
hidrocarburos aromáticos (mono y polinucleares) individuales.
4.4.4 Parámetros analíticos
Para determinar los parámetros analíticos como error relativo, limite de detección,
porcentaje de recuperación y el aporte de las células a la emisión de fluorescencia se
montó una serie de siete replicas de hidrocarburos mas ACPM y siete blancos de
reactivo, y una muestra compuesta por el medio de cultivo (sin ACPM) más células
(APHA, 1998).
4.5 PORCENTAJE DE DEGRADACIÓN
El porcentaje de degradación del cultivo mixto se estableció por medio de la
diferencia de los porcentajes de remoción del tratamiento y el control abiótico en el
tiempo 0 y 21 del ensayo. La diferencia en el área bajo los picos (Sharma y Pant,
2000) y la diferencia de las concentraciones de HAT obtenidas por fluorometría entre
el tratamiento y el control abiótico fue el empleado para calcular el porcentaje de
remoción de hidrocarburos alifáticos y aromáticos respectivamente. De acuerdo con
Gómez, 2003; Palittapongarnmin et al. 1998 (1, 2, 3).
% Remoción Alifáticos = −1( )( ) 100
0Recos
21Recos×
∑∑
DíasueltosHArea
DíasueltosHArea (1)
% Remoción Aromáticos = −1( )( ) 100
0/
21/ ×
DíaACPMHATmLmg
DíaACPMHATmLmg (2)
38
% Degradación =
−
abióticoControl
moción
oTratamient
moción Re%Re% (3)
E n donde:
HAT: Hidrocarburos Aromáticos Totales; Tratamiento: Cultivo bacteriano mixto
4.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Inicialmente se procedió a determinar si los datos correspondientes se distribuían
normalmente mediante la prueba de Shapiro Wilk y si las varianzas entre los dos
grupos eran homogéneas por medio del test de Bartlett´s. Cumplidos estos dos
supuestos se realizó un análisis de varianza con un nivel de significancia del 5% para
determinar si existían diferencias entre los factores bióticos y abióticos en la
degradación de ACPM a través del tiempo de muestreo. Para la evaluación de los
datos se empleo el programa computarizado Statistix versión 8.
39
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 SELECCIÓN DE CEPAS PARA ENSAYOS
A partir de los sedimentos recolectados en la región Caribe se aislaron 31 cepas
bacterianas con capacidad de tolerar hidrocarburos del petróleo. Las cepas se aislaron
en medio MMS con PC/ACPM y posteriormente se conservaron en el CBM del
INVEMAR. De estas 31 cepas aisladas 26 fueron recuperadas, 12 cepas provenían de
medio MMS con ACPM y 14 de medio MMS con PC (Tabla 3). A partir del grupo
de 26 cepas se inició el proceso de selección, donde se evaluó primero la capacidad
de estas de tolerar PC y ACPM en una prueba de selección horizontal.
Tabla 3. Cepas aisladas en la región Caribe, con su contaminante y departamento de aislamiento respectivamente.
Cepa Contaminante Departamento Cepa Contaminante Departamento
BCH26 ACPM Magdalena BCH53 ACPM Bolívar BCH27 ACPM Magdalena BCH54 ACPM Bolívar BCH28 ACPM Magdalena BCH55 Petróleo crudo Bolívar BCH30 ACPM Magdalena BCH56 Petróleo crudo Bolívar BCH31 ACPM Magdalena BCH71 ACPM Sucre BCH32 Petróleo crudo Magdalena BCH72 ACPM Sucre BCH33 Petróleo crudo Magdalena BCH73 ACPM Sucre BCH34 Petróleo crudo Magdalena BCH74 Petróleo crudo Sucre BCH35 Petróleo crudo Magdalena BCH76 Petróleo crudo Sucre BCH36 Petróleo crudo Magdalena BCH77 Petróleo crudo Cordoba BCH37 Petróleo crudo Magdalena BCH79 Petróleo crudo Sucre BCH38 Petróleo crudo Magdalena BCH135 ACPM Magdalena BCH52 Petróleo crudo Bolívar BCH136 ACPM Magdalena
5.1.1 Selección horizontal en petróleo crudo y ACPM
De las catorce cepas bacterianas aisladas de PC y evaluadas en ACPM se obtuvo que
el 100% fueron capaces de crecer en ACPM, mientras que sólo el 66.7% de las 12
cepas aisladas de ACPM presentaron la capacidad de crecer en PC. En total el 84.6%
de las 26 cepas evaluadas crecieron en ACPM y PC (Tabla 4).
El petróleo crudo puede actuar como un agente selectivo de microorganismos (Wrenn
y Venoza, 1996), ya que presenta una mezcla compleja de hidrocarburos, mayor
concentración de HAP de alto peso molecular que el ACPM (Wang et al., 2001),
40
compuestos tóxicos para algunos microorganismos y compuestos del tipo resinas y
asfáltenos resistentes a la degradación (Venoza y Zhu, 2003).
Tabla 4: Selección horizontal en petróleo crudo y ACPM de las cepas del Cepario de
Bacterias Marinas
ContaminanteAislamiento Crudo 1% ACPM 1%
BCH26 ACPM 1% A xBCH27 ACPM 1% A xBCH28 ACPM 1% P xBCH30 ACPM 1% P xBCH31 ACPM 1% P xBCH32 Crudo 1% x PBCH33 Crudo 1% x PBCH34 Crudo 1% x PBCH35 Crudo 1% x PBCH36 Crudo 1% x PBCH37 Crudo 1% x PBCH38 Crudo 1% x PBCH52 Crudo 1% x PBCH53 ACPM 1% P xBCH54 ACPM 1% P xBCH55 Crudo 1% x PBCH56 Crudo 1% x PBCH71 ACPM 1% A xBCH72 ACPM 1% P xBCH73 ACPM 1% A xBCH74 Crudo 1% x PBCH76 Crudo 1% x PBCH77 Crudo 1% x PBCH79 Crudo 1% x PBCH135 ACPM 1% P x
BCH136 ACPM 1% P x8 (12) 14(14)
26 (100%) 22 (86,4%)
Cepa No. Crecimiento
No. de cepas seleccionadasCepas iniciales Cepas finales
A: Ausencia; P: Presencia, X: contaminante donde se aisló inicialmente.
Posiblemente el 100% de las bacterias aisladas de crudo crecieron en ACPM debido a
que la variedad de sustratos presentes en el PC contribuye a la selección de
41
microorganismos con capacidades metabólicas para degradar productos refinados del
petróleo, como el ACPM, ya que se involucran genes, complejos enzimáticos y vías
metabólicas relacionados. Este proceso se conoce como “aclimatación cruzada” y ha
sido descrito por Bauer y Capone (en: Leahy y Colwell, 1990) al observar que
comunidades microbianas expuestas a fenantreno incrementan las tasas de
metabolismo de otros compuestos de estructuras similares como el naftaleno y por
Alvarez y Vogel (1991) reportan microorganismos aislados en presencia de tolueno
como única fuente de carbono, los cuales también pueden crecer en benceno y p-
xileno, aumentando la tasa de degradación de estos cuando se cultiva en presencia del
contamínante de donde fueron aislados. La capacidad de un microorganismo para
asimilar diferentes mezclas de hidrocarburos como fuentes de carbono depende de la
especificidad de sus enzimas, algunas monooxigenasas, dioxigenasas y
lipooxigenasas tienen el potencial para convertir sustratos de petróleo y sus derivados
en enantiomeros que puedan ser asimilados, ampliándose de esta forma el rango de
sustratos disponibles para el metabolismo (Van Hamme et al., 2003; Smits et al.,
2002, Mahajan et al., 1994;).
Sólo aquellas cepas que crecieron en PC y ACPM (22 cepas) fueron sometidas a
diferentes concentraciones de ACPM en con el objetivo de escoger las que toleraran
una mayor concentración de hidrocarburos.
5.1.2 Concentración de ACPM Mínima Inhibitoria
Las 22 cepas bacterianas (84.6%) provenientes de la selección horizontal se
enfrentaron a concentraciones de ACPM entre1-10% v/v. Se encontró que el 50% de
las cepas evaluadas toleraron un rango de 1%-8% v/v de ACPM, mientras que una
concentración mínima del 2% de ACPM inhibió el 50% de la población restante
(Figura 4 y Anexo 5). Márquez-Rocha et al. (2005) y Rojas- Avelizapa et al. (1999)
han reportado aislamientos de bacterias empleando concentraciones de ACPM del 7%
y degradación de ACPM en suelos contaminados hasta el 17.7 %. Ururahyl et al.
(1998) describen una degradación de hidrocarburos en lodos con crudo al 5% v/v del
42
76.9 %, mientras en lodos con 10 % v/v la máxima degradación fue de 8.9 % en un
periodo de 21 días posiblemente debido a los efectos tóxicos de los hidrocarburos o a
un fenómeno de inhibición por sustrato.
Concentraciones de ACPM
100%(22 cepas)
50% (11 cepas)
50% (11 cepas)
50% (11 cepas)
50% (11 cepas)
45% (10 cepas)
1% 2% 4% 6% 8% 10%
Figura 4. Porcentaje de cepas resistentes a concentraciones de ACPM de 1-10 %
(v/v)
Elevadas concentraciones de ACPM inhiben el desarrollo microbiano, producen
intoxicación (LaGrega et al., 1996) e inducen en las bacterias una respuesta de
“stress”y cambios celulares a nivel de la membrana, enzimas y proteínas. Los
hidrocarburos tienden a penetrar en la membrana de las bacterias alterando su
estructura, fluidez y actividad enzimática (Sikkema et al., 1995; Heipieper, 1994).
Los microorganismos han desarrollado diferentes mecanismos que les permiten
mantener la integridad de su membrana ante un flujo excesivo de hidrocarburos, por
ejemplo un incremento en la rigidez de la membrana por descenso en el contenido de
ácidos grasos insaturados, alteración en la conformación cis/trans de los fosfolípidos
y sistemas de exclusión homólogos a los empleados por las bacterias en la resistencia
a antibióticos han sido desarrollados por Pseudomonas putida DOT-T1E, la cual es
capaz de crecer en presencia de un 90 % v/v de tolueno.(Rojas et al., 2001; Ramos et
al.,1997). Estas adaptaciones son dependientes de energía e influyen en las tasas de
crecimiento, presentándose una disminución de estas mientras aumenta la energía
destinada al mantenimiento microbiano (Isken et al., 1999).
43
De acuerdo con las prueba de selección horizontal y CMI se escogieron 11 cepas para
ser utilizadas en los ensayos de degradación, destacando la capacidad que presentaron
estas cepas de tolerar valores superiores a los establecidos por Franco et al. (2004)
para describir un grado de contaminación media-fuerte y la capacidad para crecer
rápidamente en un rango de tres a diez días con ACPM y PC.
5.1.3 Caracterización e Identificación Microbiana
Las cepas bacterianas seleccionadas se caracterizaron macroscópica y
microscópicamente, encontrando que todas las cepas tuvieron morfologías bacilares,
ocho gram negativas y tres gram positivas (Figura 5 y Tabla 5). Como han reportado
otros autores, la mayoría de las bacterias relacionadas con la degradación de
hidrocarburos pertenecen al grupo de gram negativas (Ruberto et al., 2003). Los
lipopolisacaridos de las membranas de las bacterias Gram negativas ayudan en la
formación y estabilización de emulsiones de hidrocarburos en sistemas acuosos y
contribuyen al incremento en la superficie de ataque del contaminante, confiriéndoles
a estas una ventaja comparativa para la asimilación de hidrocarburos (Sikkema et al.,
1995).
Ocho cepas correspondientes a los géneros Klebsiella sp, Chromobacterium sp.,
Flavimonas orizihabitans, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeuroginosa y
Bacillus (Bacillus brevis y B. pumillus, B. cereus) se identificaron mediante el
sistema BBL Crystal y API 50 CHB/E (Tabla 5). Klebsiella sp. (Survery et al., 2004)
Flavimonas orizihabitans (LanFraconi et al., 2003; Van Hamme et al., 2000)
Enterobacter cloacae (Saadoun, 2002) y Bacillus (Márquez Rocha et al., 2005;
Kazunga y Aitken, 2002; Díaz et al., 2000) han sido aisladas frecuentemente de
lugares contaminados con hidrocarburos y pueden crecer sobre un rango amplio de
hidrocarburos empleándolos como única fuente de carbono y energía. Pseudomonas
sp. es la bacteria más frecuentemente aislada de ambientes contaminados con
hidrocarburos (Norman et al., 2002) y de la cual mayor información ha sido
reportada; se conoce su capacidad para crecer sobre una amplia variedad de
44
hidrocarburos del petróleo, benceno, naftaleno, tolueno ( Haigler et al., 1992),
gasolina , kerosene, y diesel ( Wongsa et al., 2004). También han sido estudiados los
complejos enzimáticos y los plasmidos relacionados en la asimilación y degradación
de hidrocarburos (Smits et al., 2002; Hamamura et al., 2001) siendo útiles para el
conocimientos de los mecanismos adaptativos desarrollados por los microorganismos
degradadores de hidrocarburos.
También se observó que las cepas BCH28 y BCH35 al realizarles un pase de un
medio con la tensión del contaminante (MMS adicionado con ACPM/ crudo) a un
medio nutritivo, formaban una sustancia mucoide alrededor de las colonias, hecho
que se relaciona con la formación de polisacaridos extracelulares que confieren a los
microorganismos resistencia a ciertos hidrocarburos del petróleo (Iwabuchi et al.,
2002).
45
Tabla 5. Características morfológicas de las cepas seleccionadas para el ensayo de degradación de ACPM
Cepa No Morfología/Gram Forma Bordes Elevación Color Superficie Consistencia Tamaño
mm
Identificación
BCH28 Bacilo
Negativo
Redonda Entero Convexa Crema Lisa Mucosa 1.82 Chromobacterium
BCH 30 Cocobacilo
Negativo
Redonda Entero Convexa Crema Lisa Mucosa 4.17 Klebsiella
BCH 31 Bacilo
Negativo
Redonda Entero Convexa Crema Lisa Mucosa 2.17 Enterobacter
cloacae
BCH 34 Bacilo
Negativo
Redonda Entero Convexa Blanco Lisa Mucosa 4.76 No Identificada
BCH 35 Cocobacilo
negativo
Redonda Entero
Plana Crema Lisa Mucosa 2.5 Flavimonas
oryzihabitans
BCH 36 Bacilo
Positivo
Arrugada
Compleja
Lobulado Montuosa Crema Rugosa Granigienta 3.8 Bacillus
brevis
BCH 52 Bacilo
Negativo
Redonda Entero Convexa Crema Lisa Mucosa 3.7 No
Identificada
BCH 56 Bacilo
Negativo
Redonda
Festonada
Ondulado Plana Crema Lisa Mucosa 1.3 Pseudomonas
aeuroginosa
BCH 74 Bacilo
Positivo
Redonda Entero Convexa Amarillo claro Lisa Mucosa 1.1 Bacillus
cereus
BCH 76 Bacilo
Negativo
Redonda Entero Convexa Crema
Transparente
Lisa Mucosa
brillante
2.6 No
Identificada
BCH 135 Bacilo
Positivo
Irregular
expansiva
Entero Plana Blanco Lisa Mucosa
Brillante
4.3 Bacillus
pumillus
46
A
B
C
D
Figura 5. Características microscópicas (100x) y macroscópicas de las cepas
seleccionadas. (A) cepa BCH28- Chromobacterium sp. (B) BCH30-Klebsiella (C)
cepa BCH31-Enterobacter cloacae (D) cepa BCH34
47
E
F
G
H
Continuación Figura 5. Características microscópicas (100x) y macroscópicas de las
cepas seleccionadas (E) BCH35-Flavimonas oryzihabitans (F) BCH36-Bacillus
brevis (G) cepa BCH52 (H) cepa BCH56-Pseudomonas aeuroginosa.
48
I
J
K.
Continuación Figura 5. Características microscópicas (100x) y macroscópicas de las
cepas seleccionadas. (I) cepa BCH74 Bacillus cereus (J) cepa BCH76 (K)
BCH135-Bacillus pumillus.
5.2 ENSAYOS DE DEGRADACIÓN DEL ACPM
Basados en las capacidades degradativas de cada cepa se conformó un cultivo mixto,
del cual se evaluó su acción en conjunto frente a una concentración de ACPM del 2%
a través de mediciones en los cambios de abundancia de hidrocarburos alifáticos y
concentración de aromáticos.
49
5.2.1 Degradación de alifáticos
Finalizado el periodo de incubación de los ensayos de degradación de ACPM se
evidenció una disminución total de alifáticos en términos de n- alcanos del 92.15%,
donde el cultivo bacteriano degradado el 68.61 %y por factores abióticos se removió
el 23.54% (Tabla 6 y Anexo 6 ).Algunos autores han reportado una degradación de la
fracción alifática del 50% (Sharma y Pant, 2000), 70% (Plohl y Leskovsek, 2002),
90% (Márquez-Rocha et al., 2001) y 91.3%(Palittapongarnmim et al., 1998) en un
periodo de tres días a un mes.
Tabla 6. Porcentaje de remoción y degradación de hidrocarburos alifáticos del ACPM por factores bióticos y abióticos.
Parámetros Ensayos
% Remoción % Degradación
Día 10| Día 21 Día 10 Día 21 Tratamiento 31.28 92.15 9.42 68.61
Control abiótico 21.85 23.54 ------ -----
En la figura 6 se muestra el perfil cromatografico de masas del ACPM del día cero y
21 del tratamiento donde se observó la degradación de los alcanos de cadena larga
(C12- C31). Los alifáticos de cadena corta, menores de 10 átomos de carbono, tienden
a ser tóxicos y alterar las funciones de membrana y proteínas de las bacterias o se
volatilizan en las primeras horas posteriores a un derrame (Solano-Serena et al.,
2000; Cookson, 1995). La alta solubilidad de estos compuestos en los medios de
cultivo aumenta su toxicidad sobre los microorganismos (Plohl y Leskovsek, 2002) y
disminuye su degradación como se ha observado en otros experimentos (Solano-
Serena et al., 2000).
En la figura 7. se observa el comportamiento individual de los n-alcanos en el
tratamiento y el control abiótico del día cero y 21 en términos de abundancia relativa,
por lo cual la abundancia de cada compuesto se encuentra comparada y manifestada
en relación con C-15 quien fue el alcano mas abundante en el día cero (abundancia
relativa/C-15) de acuerdo con Guyomarch, (2002). Se destaca una disminución
50
general de la abundancia de los alcanos de C24-C31 y el C13 con un porcentaje de
degradación del 75%- 85%. La degradación de n-alcanos se encuentra ampliamente
reportada (Díaz et al., 2000; Sharma y Pant, 2000; Palittanpogarmin et al., 1998)
siendo requerido para este proceso una adaptación compleja de la superficie celular
de los microorganismos para adherirse al ACPM y entrar en contacto directo con el
sustrato (Norman et al., 2002). En el proceso de degradación de n-alcanos se puede
alcanzar la mineralización de los sustratos obteniendo como productos finales CO2,
biomasa y agua o generarse productos intermedios en el proceso de oxidación hasta
ácidos grasos, seguido por la β-oxidación (Plohl y Leskovsek, 2002).
El pristano y fitano son alcanos ramificados persistentes, empleados en la evaluación
de los procesos de remoción de hidrocarburos donde se revela el efecto de la
degradación microbiana, las transformaciones en un periodo de tiempo y el origen
biogénico o antropogénico de la muestra (Wang y Fingas, 2003; Seklemova et al.,
2001; Díaz et al., 2000). En el ensayo se observó una degradación de pristano y fitano
del 30% y 73.8% respectivamente (Figura 7).En algunos casos se ha reportado la
degradación total de los alifáticos lineales, mientras el pristano y fitano permanecen
hasta el final de los ensayos (Ghazali et al., 2004; Penet et al., 2004), mientras en
investigaciones llevadas a cabo por Sharma y Pant (2000) se alcanzaron valores en la
degradación del pristano del 30 %, sugiriendo la oxidación del compuesto y
formación de ácidos monoicos y dioicos. Hara et al. (2003) reportan la degradación
de pristano por una especie de Alcanivorax aislado del mar y establecen la
importancia de la asimilación de este compuesto ya que permite el crecimiento
continuo de la cepa después del consumo exhaustivo de n-alcanos, sin verse afectado
por el mismo. La ruta de degradación del pristano involucra la oxidación a ácido
pristanico, seguido de la esterificación y formación de Pristanol CoA , compuesto que
es transformado vía β-oxidación con producción final de Acetil CoA y Propionil CoA
(Sakai et al., 2004)
51
Los microorganismos del cultivo mixto tienen potencial enzimático para remover
compuestos persistentes, teniendo en cuenta que han sido aislados de lugares
contaminados con hidrocarburos por varios años, metabolicamente se encuentran
adaptados a la presencia del contaminante y pueden transformarlo rápidamente
(Emtiazi et al, 2005, Chávez et al., 2003; Korda et al., 1997)
Figura 6. Perfil cromatografico del día 0 y 21 de los n-alcanos del ACPM.
0
20
40
60
80
100
C1
3
C1
4
C1
5
C1
6
C1
7
Pri
sta
no
C1
8
Fit
an
o
C1
9
C2
0
C2
1
C2
2
C2
3
C2
4
C2
5
C2
6
C2
7
C2
8
C2
9
C3
0
C3
1
n-alcanos
% A
bund
anci
a re
lativ
a /C
15
Dia 0Control Abiótico Día 21Cultivo bacteriano Dia 21
Figura 7 Abundancia relativa de los n-alcanos en relación con C-15 durante los 21
días de exposición del ensayo.
52
5.2.2 Degradación de Aromáticos
En los ensayos de degradación de ACPM al cabo de 21 días no se observaron
diferencias significativas en la remoción de HAT entre el tratamiento con bacterias y
el control abiótico (Figura 8y 9). El porcentaje de remoción del cultivo mixto fue de
3.5% y del control abiótico 3.6 %. Los valores hallados entre estos dos tratamientos
son similares y las diferencias alcanzadas se encuentran dentro del rango de error del
método de extracción y cuantificación empleado. El método de extracción y
cuantificación de hidrocarburos empleado tiene un porcentaje de recuperación del
98%, con un error de 2.2% y el limite de detección se encuentra en 0.35 µg/mL.
0 5 10 15 20 25
Tiempo (Días)
400
450
500
550
600
Con
cent
raci
ón H
AT
mg/
ml A
CP
M
CaribeTratamiento 1 (Bacterias + ACPM)
0 5 10 15 20 25
Tiempo (Días)
400
450
500
550
600
Con
cent
raci
ón H
AT
mg/
ml d
e A
CP
M
CaribeTratamiento 2 (ACPM)
A) Tratamiento B) Control abiótico
Figura 8. Concentración de HAT (mg/mL) de ACPM Caribe
El porcentaje de remoción de HAT alcanzado por el cultivo bacteriano no fue
significativo, y las perdidas de HAT presentadas en el tratamiento 1 se atribuyen a
fenómenos de volatilización y evaporación, que como se conoce, minimizan el efecto
causado por el metabolismo microbiano en un periodo inicial en todos los sistemas
(Ruberto et al.,2003).
53
(A)
(B)
Figura 9. Cromatogramas de hidrocarburos aromáticos (A) día 0 (B) día 21 del
tratamiento.
Otros autores como Mukherji et al. (2004) han reportado pérdidas por factores
abióticos del 10% en un periodo de 8 días y Ruberto et al. (2003) no encontraron
diferencias significativas en los valores de hidrocarburos entre el control abiótico y el
tratamiento sólo después 20 días de haber iniciado el ensayo, sugiriendo que las
54
perdidas por factores abióticos solapan el metabolismo microbiano y se hace
necesario prolongar el tiempo de las mediciones para su detección.
El ACPM esta compuesto de alcanos lineales, ramificados, hidrocarburos aromáticos
de dos y tres anillos en su mayoría y pocos hidrocarburos aromáticos de alto peso
molecular (Wang et al., 2001). Los hidrocarburos aromáticos no disminuyeron
significativamente debido a la altas concentraciones de alifáticos, que son preferidos
por las bacterias para su metabolismo y son fácilmente degradables, aún cuando se ha
encontrado que algunos aromáticos de bajo peso molecular son metabolizados antes
que muchos compuestos saturados (Venoza y Zhu, 2003).
5.2.3 Curva de crecimiento
El comportamiento exhibido por el cultivo bacteriano mixto en la curva de
crecimiento mostró crecimiento exponencial entre los días cero y seis, con valores
promedio de 2.98 (+/- 0.81) x 106 y 1.33 (+/- 1.41) x 109 UFC/mL respectivamente,
seguido de un descenso poblacional en el día nueve y continuo ascenso en el día
doce, punto donde inicia una etapa de declive que se extiende hasta el día 21
obteniendo un valor final de 1.29 (+/- 0.53) x 108 UFC/ml (figura 10).
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20 25Tiempo (Días)
Bio
mas
a (
LN U
FC
/ mL)
Figura 10. Curva de crecimiento del cultivo bacteriano mixto Caribe en ACPM
Se determinó que la curva logro su máximo crecimiento durante los días 6 y 12 con
valores de 1.33 (+/- 1.41) x 109 UFC/ml y 3.13 (+/- 1.48) x 109 UFC/ml (Anexo 8), lo
55
cual deja de manifiesto que las cepas se encontraban creciendo a expensas de los
hidrocarburos alifáticos y que las cepas pueden emplear estos compuestos como
fuente de carbono y energía. Los valores poblacionales alcanzados obedecen a una
oferta elevada de sustratos. El Diesel o ACPM es una fuente rica de hidrocarburos
alifáticos y estos son mas susceptibles al ataque microbiano, seguidos por los
hidrocarburos ramificados, aromáticos de bajo peso molecular, y por último los
aromáticos de alto peso molecular y ciclo alcanos (Plohl y Leskovsek, 2002; Leahy y
Colwell, 1990).
La curva de crecimiento del cultivo mixto muestra un descenso poblacional en el día
diez y la tendencia en el día 21 es a disminuir la tasa de crecimiento; estos cambios se
llevan a cabo como producto de las sucesiones bacterianas al interior del cultivo
mixto, donde cada cepa o genero tiene un papel fundamental en la transformación de
los hidrocarburos ya que generan compuestos intermediarios que pueden
subsecuentemente ser empleados por otros organismos o beneficiar a otras cepas por
remoción de compuestos tóxicos, estableciendo entre ellas relaciones sinérgicas que
generan un proceso de degradación mayor (Ghazali et al., 2004, Venoza y Zhu,
2003).
Kaplan y Kitts (2004), asocian los descensos poblacionales con cambios en las fases
de degradación rápida-lenta donde se presenta cambios en la dominancia y diversidad
de determinadas especies. Los cambios en la curva, también se encuentran asociados
con la disponibilidad de sustratos como se observa en el día 21 del ensayo donde la
mayoría de n-alcanos han sido degradados y la curva de crecimiento ha iniciado su
descenso y mantenimiento (Figura 11).
Por otro lado, durante los recuentos microbianos se observó como algunas cepas
aparecían y desaparecían a través del tiempo, mientras otras permanecían a lo largo
de los 21 días (Tabla 7), este fenómeno ha sido también reportado por Kasai et al.
(2002) quien observo cambios en el patrón de las poblaciones bacterianas en un
56
ensayo de remoción de petróleo crudo realizado durante quince días. Él estableció
como bacterias del género Cyclocasticus pueden permanecer a lo largo del ensayo y
jugar un papel importante en la degradación de alquil aromáticos, mientras otras
cepas fluctúan de acuerdo a la disponibilidad de sustratos.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25
Tiempo ( Días)
% R
esi
dua
l de
hid
roca
rbur
os
0
5
10
15
20
25
Bio
ma
sa (
LN U
FC
/ mL)
% Residual alifáticos % Residual aromáticos Biomasa (Ln UFC/ mL)
Figura 11. Curva de crecimiento del cultivo bacteriano y porcentaje residual de
hidrocarburos alifáticos y aromáticos en 21 días.
Tabla 7. Comportamiento de las cepas en ACPM a través del tiempo
Cepa Día 0 Día 3 Día 6 Día 9 Día 12 Día 15 Día 18 Día 21 BCH28 X - X X - X X X BCH30 X - - X X X X X BCH31 X X X X X X X X BCH34 X X X X X X BCH35 - - X X X - - - BCH36 - - - - - - - - BCH52 X X - - X X X - BCH56 X X X X X X X X BCH74 - - X X X - - X BCH76 - - - X X X X X BCH135 - - - - - - - -
Independientemente de la frecuencia de aparición una cepa en el transcurso del
ensayo no se puede subestimar su papel hasta que no se identifique el papel exacto
57
que cumple en la asociación y como se puede ver afectada la efectividad del cultivo,
porque cada miembro puede ser necesario para la dependencia o presencia de otras
especies capaces de sobrevivir cuando la fuente de energía se encuentra limitada y
confinada en carbonos complejos (Ghazali et al., 2004).
Las asociaciones bacterianas mediante la aplicación de cultivos mixtos o consorcios
permite incrementar los porcentajes de remoción de los contaminantes debido a los
efectos sinérgicos y las relaciones de mutualismo que se presentan entre los
miembros, evitando la acumulación de metabolitos tóxicos y logrando en condiciones
ideales la mineralización de los contaminantes (Solano-Serena et al., 2003), como es
referido en las investigaciones de Nakamura y colaboradores (1996) sobre un
consorcio de Acinetobacter sp y Pseudomonas putida que degradan secuencialmente
petróleo crudo. En una primera fase Acinetobacter sp. degrada los alcanos y produce
una acumulación de metabolitos sobre los cuales Pseudomonas putida inicia su
crecimiento para finalmente degradar los .compuesto aromáticos.
58
6. CONCLUSIONES
� De un total de 26 cepas, 22 son tolerantes a petróleo crudo y ACPM en una
concentración del 1% v/v y 11 de estas cepas toleran concentraciones de
ACPM en un rango del 1-8% v/v.
� De las once cepas pertenecientes al cultivo mixto ocho se identificaron
bioquímicamente como Klebsiella sp., Chromobacterium sp., Flavimonas
orizihabitans, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeuroginosa, Bacillus
brevis, B. cereus y B.pumillus.
� El cultivo bacteriano mixto conformado por las once cepas seleccionadas
degradó el 68.6% de los hidrocarburos alifáticos en términos de n-alcanos y
transformo el pristano y fitano, compuestos resistentes a la degradación e
indicadores de degradación microbiana en un 30 % y 70 % respectivamente.
� La degradación de hidrocarburos aromáticos no se observó durante los 21 días
del ensayo, debido a la oferta abundante de alifáticos degradables por los
microorganismos.
59
7. RECOMENDACIONES
Es necesario evaluar la degradación de los hidrocarburos aromáticos en un periodo
más largo de tiempo (30-60 días), teniendo como base las curvas de crecimiento de
cada microorganismo y las relaciones microbianas que se pueden establecer entre
ellos.
Con los microorganismos seleccionados en las diferentes pruebas realizadas se puede
conformar un consorcio bacteriano y evaluar la acción individual de cada una de las
cepas en la asociación.
Teniendo en cuenta que las cepas presentan capacidades metabólicas para degradar
hidrocarburos alifáticos en un alto grado, se debe continuar caracterizando los
productos metabólicos finales e intermediarios con el objeto de determinar sino se
producen compuestos intermediarios tóxicos.
60
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70
9. ANEXOS
ANEXO 1- MEDIOS DE CULTIVO
Caldo de Pre-Enriquecimiento N Y P
Solución de Preenriquecimiento de nitrógeno y fosfato. Usado en los primeros días
de incubación de bacterias marinas
K2HPO4 100 mg/L
NH4 SO4 100 mg/L
Agua 1 L
pH 7.0-8.0
Medio MMS (Núñez, 2004)
Medio para el cultivo de microorganismos degradadores de hidrocarburos
Ca(NO3)2 60mg/L
Na2H CO3 125mg/L
KNO3( 70mg /L
NH4Cl 70mg/L
KH2PO4 100mg/L
FeSO4.7H2O 10mg/L
MnCl2.H2O 7mg/L
ZnSO4 1.5mg/L
Petróleo / ACPM 10mg/L
pH 8.0
Cuando el medio es preparado en forma sólida se adiciona agar-agar ( 14g/l), primero
se prepara una emulsión de 10 ml de Petróleo crudo/ ACPM en 90 mL de agua más
1mL de Tween 80%, esta emulsión se coloca en agitación (200 rpm) durante 4 horas.
Las sales del medio se mezclan junto con el agar agar y el agua. Cuando las dos
soluciones estén listas se mezclan y se llevan al autoclave a 121oC, 121 lb de presión,
15 minutos.
71
Medio Gorvienko
Medio para la conservación de bacterias aisladas de medio marino (Gorvienko, 1961).
Extracto de carne 3 g/L
Peptona 5 g/L
Extracto de Levadura 5g/L
Agua de mar 750 mL
Agua destilada 250 mL
Agar- Agar 14 g/ L
pH 7.0
Caldo Nutritivo
Peptona de carne 5.0 g/L
Extracto de carne 3.0 g/L
Agua 1 L
pH 7.0
72
ANEXO 2
RECUENTOS DE CÉLULAS / mL DE LOS INOCULOS EN ACPM A L 2%
Cepa Células / mL
BCH28 4.4 x 106 BCH30 2.8 x 107 BCH31 6.5 x 106 BCH34 1.2 x 108 BCH35 5.1 x 107 BCH36 1.0 x 108 BCH52 3.7 x 107 BCH56 1.2 x 108
BCH74 8.4 x 106 BCH76 9.0 x 106 BCH136 5.6 x 106
73
ANEXO 3
CURVA DE CALIBRACIÓN DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS DEL
ACPM
Concentración ppm Intensidad0 2,355 101,38810 200,75120 410,49830 578,64240 766,087
Curva de Calibración ACPM
y = 19,101x + 9,0232
R2 = 0,9989
0
200
400
600
800
0 10 20 30 40 50Intensidad
Con
cent
raci
ón p
pm
74
ANEXO 4
SCAN DE ABSORCIÓN DE LOS HIDROCARBUROS AROMÁTICOS DEL
ACPM-LONGITUD DE ONDA 310- 360 nm.
Scan ACPM
0
5
10
15
20
25
30
35
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Longitud de Onda (nm)
Inte
nsid
ad
75
ANEXO 5
ENSAYOS DE CONCENTRACIÓN MÍMIMA INHIBITORIA DE LAS 22 CEPAS
TOLERANTES A PETRÓLEO CRUDO Y ACPM
R1 R2 R3 Promedio R1 R2 R3 Promedio R1 R2 R3 Promedio R1 R2 R3 Promedio R1 R2 R3 Promedio 28 si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si30 si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si31 si si si si si si si si no si si si no si si si si si no si32 no no no no no no no no no no no no no no no no no no no no33 no no no no no no no no no no no no no no no no no no no no34 si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si35 si si no si no si si si si si no si no si si si no no no no36 si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si37 no no no no no no no no no no no no no no no no no no no no38 no no no no no no si no no si no no si no no no si no no no52 no si si si no si si si si si si si no si si si si si no si53 no no no no no no no no no no no no no no no no no no no no54 no no no no no no no no no no no no no no no no no no no no55 no no no no no no no no no no no no no no no no no no no no56 si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si72 no no no no no no no no si no no si no no si si si no no no74 si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si76 si si si si si si si si si si no si si si no si si si si si77 no no no no no no no no no no no no no no no no no no no no79 no no no no no no no no no no no no no no no no no no no no135 si si si si no si si si si si si si si si si si si si si si136 no no no no no no no no no no no no no no no no no no no no
SubTotales 11 11 11 11 10
Número Cepa
2% 6%Concentraciones de Diesel/ ACPM
10%8%4%
---- Cepas Seleccionadas para el ensayo de degradación.
76
ANEXO 6
CROMATOGRAMAS DE n-ALCANOS DÍA O, 10 Y 21 DEL TRATAMIENTO Y
EL CONTROL ABIÓTICO
DIA O TRATAMIENTO Y CONTROL ABIÓTICO
77
DIA 10 DELTRATAMIENTO
DÍA 21 DEL TRATAMIENTO
DÍA 10 DEL CONTROL ABIÓTICO
78
DÍA 21 DEL CONTROL ABIÓTICO.
79
ANEXO 7
DATOS DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS TOTALES (mg/ ml) MEDIDOS
POR ESPECTROFLUOROMETRÍA.
Día Replica 1 Replica 2 Replica 3 Promedio DS0 597,47 614,0 592,49 601,32 11,265 509,93 543,28 584,53 545,91 37,3710 572,12 568,78 609,94 583,62 22,8615 574,84 582,88 590,93 582,88 8,0521 590,89 572,84 576,62 580,12 9,52
Tratamiento mg/ml ACPM
Día Replica 1 Replica 2 Replica 3 Promedio DS0 597,98 599,44 594,10 597,17 2,765 593,43 560,92 550,68 568,34 22,3210 592,57 597,68 576,73 589,00 10,9215 607,66 582,61 579,83 590,03 15,3321 572,00 591,10 564,46 575,85 13,73
mg/ml ACPMControl abiótico
DS: desviación estándar.
80
ANEXO 8
RECUENTOS MICROBIANO DEL TRATAMIENTO
(CULTIVO MIXTO) EN ACPM al 2% v/v.
Día Replica 1 Replica 2 Replica 3 Promedio Desviación Estandar 0 2.18 x 106 3.18 x 106 3.60 x 106 2.98 x 106 8.10 x 105 3 3.56 x 107 5.24 x 107 9.61 x 107 6.13 x 107 3.61 x 107 6 Incontables 2.14 x 109 5.15 x 108 1.33 x 109 1.41 x 109 9 9.45 x 107 1.28 x 108 1.34 x 108 1.19 x 108 3.27 x 107 12 2.46 x 109 3.93 x 109 3.00 x 109 3.13 x 109 1.48 x 109 15 2.46 x 108 9.28 x 108 7.95 x 107 4.18 x 108 4.32 x 108 18 2.79 x 108 2.32 x 108 5.75 x 107 1.89 x 108 1.07 x 108 21 1.33 x 108 1.21 x 108 1.34 x 108 1.29 x 108 5.32 x 107
81
ANEXO 9
ANÁLISIS ESTADÍSTICOS DE LOS TRATAMIENTOS
PRUEBA DE NORMALIDAD DEL TRATAMIENTO
Shapiro-Wilk Normality Test Variable N W P T1D0 3 0.9123 0.4259 T1D10 3 0.8104 0.1396 T1D15 3 1.0000 0.9993 T1D21 3 0.8988 0.3817 T1D5 3 0.9963 0.8834
PRUEBA DE NORMALIDAD DEL CONTROL ABIÓTICO
Shapiro-Wilk Normality Test Variable N W P T2D10 3 0.9196 0.4509 T2D15 3 0.8241 0.1734 T2D21 3 0.9409 0.5312 T2D5 3 0.9170 0.4420 T2DO 3 0.9359 0.5112
Interpretación: Todas las muestras se distribuyen normalmente. Los valores de p no
son menores de 0.05.
ANÁLISIS DE VARIANZA DE LAS CONCENTRACIONES DE
HIDROCARBUROS AROMÁTICOS TOTALES DEL TRATAMIENTO Y EL
CONTROL ABIÓTICOS
DIA O
One-Way AOV for: T1D0 T2DO Source DF SS MS F P Between 1 0.001 0.001 0.00 0.9982 Within 4 589.273 147.318 Total 5 589.274 Grand Mean 597.19 CV 2.03
82
Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 3.67 1 0.0553 Cochran's Q 0.9741 Largest Var / Smallest Var 37.682 Component of variance for between groups -49.1058 Effective cell size 3.0 Interpretación: Las varianzas del tratamiento y el control abiótico son homogéneas, el valor de p es mayor a 0.05. Variable Mean T1D0 597.20 A T2DO 597.17 A Observations per Mean 3 Standard Error of a Mean 7.0076 Std Error (Diff of 2 Means) 9.9102 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T1D0 597.20 T2DO 597.17 Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 9.9102 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 27.542 Interpretación: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abiótico
1 DIA 5
One-Way AOV for: T1D5 T2D5 Source DF SS MS F P Between 1 754.66 754.657 0.80 0.4226 Within 4 3789.42 947.355 Total 5 4544.08 Grand Mean 557.13 CV 5.52 Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 0.41 1 0.5233 Cochran's Q 0.7370 Largest Var / Smallest Var 2.8030
83
Component of variance for between groups -64.2327 Effective cell size 3.0 Interpretación: Las varianzas del tratamiento y el control abiótico son homogéneas, el valor de p es mayor a 0.05. Variable Mean T1D5 545.91 T2D5 568.34 Observations per Mean 3 Standard Error of a Mean 17.770 Std Error (Diff of 2 Means) 25.131 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T2D5 568.34 A T1D5 545.91 A Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 25.131 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 69.844 Interpretación: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abiótico
2.3.1 DÍA 10
One-Way AOV for: T1D10 T2D10 Source DF SS MS F P Between 1 43.42 43.417 0.14 0.7317 Within 4 1283.86 320.964 Total 5 1327.27 Grand Mean 586.30 CV 3.06 Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 0.80 1 0.3701 Cochran's Q 0.8141 Largest Var / Smallest Var 4.3799 Component of variance for between groups -92.5160 Effective cell size 3.0
84
Interpretación: Las varianzas del tratamiento y el control abiótico son homogéneas, el valor de p es mayor a 0.05. Variable Mean T1D10 583.61 T2D10 588.99 Observations per Mean 3 Standard Error of a Mean 10.344 Std Error (Diff of 2 Means) 14.628 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T2D10 588.99 A T1D10 583.61 A Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 14.628 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 40.654 Interpretación: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abiótico
2.3.2 DÍA 15
One-Way AOV for: T2D15 T1D15 Source DF SS MS F P Between 1 76.684 76.684 0.51 0.5139 Within 4 599.357 149.839 Total 5 676.041 Grand Mean 586.46 CV 2.09 Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 0.62 1 0.4298 Cochran's Q 0.7840 Largest Var / Smallest Var 3.6302 Component of variance for between groups -24.3852 Effective cell size 3.0 Interpretación: Las varianzas del tratamiento y el control abiótico son homogéneas, el valor de p es mayor a 0.05.
85
Variable Mean T2D15 590.03 T1D15 582.88 Observations per Mean 3 Standard Error of a Mean 7.0673 Std Error (Diff of 2 Means) 9.9946 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T2D15 590.03 A T1D15 582.88 A Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 9.9946 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 27.777 Interpretación: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abiótico
2 DÍA 21
One-Way AOV for: T2D21 T1D21 Source DF SS MS F P Between 1 27.264 27.264 0.20 0.6814 Within 4 558.358 139.590 Total 5 585.622 Grand Mean 577.99 CV 2.04 Chi-Sq DF P Bartlett's Test of Equal Variances 0.21 1 0.6467 Cochran's Q 0.6754 Largest Var / Smallest Var 2.0807 Component of variance for between groups -37.4419 Effective cell size 3.0 Interpretación: Las varianzas del tratamiento y el control abiótico son homogéneas, el valor de p es mayor a 0.05. Variable Mean T2D21 575.85 T1D21 580.12 Observations per Mean 3
86
Standard Error of a Mean 6.8213 Std Error (Diff of 2 Means) 9.6467 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test Variable Mean Homogeneous Groups T1D21 580.12 A T2D21 575.85 A Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 9.6467 Critical Q Value 3.930 Critical Value for Comparison 26.810 Interpretación: No hay diferencias significativas entre el tratamiento y el control abiótico