tesis pedro ramirez
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IQ-2007-I-32
EVALUACIÓN DE LA CÁSCARA DE CAFÉ, EL BAGAZO DE LA CAÑA DE
AZÚCAR Y RESIDUOS DE PALMA PARA LA OBTENCIÓN DE LACASA POR
MEDIO DEL CULTIVO EN ESTADO SÓLIDO DE LA ESPECIE Trametes
pubescens
PEDRO ALONSO RAMÍREZ CARDOZO
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
JULIO DE 2007
IQ-2007-I-32
EVALUACIÓN DE LA PULPA DE CAFÉ, EL BAGAZO DE LA CAÑA DE
AZÚCAR Y RESIDUOS DE PALMA PARA LA OBTENCIÓN DE LACASA POR
MEDIO DEL CULTIVO EN ESTADO SÓLIDO DE LA ESPECIE Trametes
pubescens
PEDRO ALONSO RAMÍREZ CARDOZO
Proyecto de Grado para optar
El título de Ingeniero Químico
Asesora:
Isabel Cristina Jiménez Useche
Ingeniera Química
M.Sc. Ingeniería
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
JULIO DE 2007
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NOTA DE ACEPTACIÓN
_________________________
Asesor
_________________________
Jurado 1
_________________________
Jurado 2
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“A mis padres, Pedro y Luz Amparo.
Su apoyo ha sido incondicional
durante este proceso”
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AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se realizó en conjunto con el grupo BBG de la Universitat Rovira i
Virgili. Tarragona, España, quienes donaron el T. pubescens y los protocolos
experimentales.
El autor expresa sus agradecimientos a las siguientes personas y grupos:
A Isabel Jiménez Useche, asesora del proyecto. Universidad de Los Andes. Por la
confianza y apoyo durante este proyecto.
A Johann F. Osma, Universidad Rovira i Virgili. Por el apoyo durante este proceso.
A Oscar Fernando Sánchez. Universidad de Los Andes. Por la ayuda prestada
durante este proyecto.
A Claudia Loboguerrero, Paula Alonso y Luis Acevedo. Universidad de Los Andes.
Por la participación en distintas pruebas de este proyecto.
A José María Robles, Luz Dary Rúgeles y Sonia Rojas. Universidad de Los Andes.
Por el apoyo prestado en el laboratorio.
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A Coldanzimas Ltda. Por la donación de una muestra de Suberase (Lacasa
Comercial).
A Huntsman Colombia Ltda. Por la donación de los tintes Negro Super Cibacron,
Azul Teransil y Negro Teransil.
A Cenipalma por la donación del cuesco, la tusa y la fibra que son los principales
residuos del proceso de extracción de aceite de palma.
Al departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Los Andes por las
instalaciones del laboratorio.
Al departamento de Microbiología de la Universidad de los Andes. En especial a
Silvia Restrepo, coordinadora de pregrado y al grupo LAMFU. Por el apoyo y las
facilidades prestadas.
Al departamento de Química de la Universidad de los Andes por la colaboración
con las instalaciones de los laboratorios.
A mis familiares y amigos que siempre estuvieron pendientes de este proceso.
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CONTENIDO
Pág
LISTA DE TABLAS ____________________________________________________ ix LISTA DE FIGURAS_____________________________________________________ x LISTA DE ANEXO S ____________________________________________________ xi RESUMEN____________________________________________________________ xii
INTRODUCCIÓN ____________________________________________________ 1
OBJETIVOS_________________________________________________________ 2 1. ESTADO DEL ARTE______________________________________________ 3 1.1. GENERALIDADES DE LAS ENZIMAS__________________________________________3
1.1.1. Enzimas__________________________________________________________________3 1.1.2. Nomenclatura Internacional de Enzimas ________________________________________4 1.1.3. Niveles de Estructura de las Enzimas ___________________________________________5 1.1.4. Mecanismo de Catálisis Enzimática ____________________________________________7 1.1.5. Factores que Influencian la Actividad Enzimática _________________________________8 1.1.6. Determinación de Actividad Enzimática ________________________________________9
1.2. GENERALIDADES DE LA LACASA___________________________________________13 1.2.1. Nomenclatura de la Lacasa __________________________________________________13 1.2.2. Estructura y Sitio Activo de la Lacasa _________________________________________14 1.2.3. Función Biológica de la lacasa _______________________________________________17 1.2.4. Mecanismo de Reacción de la Lacasa__________________________________________20 1.2.5. Aplicaciones de la Lacasa ___________________________________________________22
1.3. GENERALIDADES DEL Trametes pubescens ____________________________________25 1.3.1. Clasificación del Trametes pubescens _________________________________________25 1.3.2. Actividad Lignolítica de Hongos de Putrefacción Blanca __________________________26 1.3.3. Trametes pubescens como Productor de Lacasa__________________________________30
1.4. TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN ÉSTADO SÓLIDO (SSF) _____________________34 1.4.1. Generalidades de la técnica__________________________________________________34 1.4.2. Factores que Influyen en el Proceso ___________________________________________36 1.4.3. Microorganismos Utilizados en la SSF y Enzimas Producidas ______________________38 1.4.4. Sustratos Utilizados en la SSF _______________________________________________39 1.4.5. Ventajas de la SSF sobre la SmF _____________________________________________41
1.5. DECOLORACIÓN MICROBIANA DE TINTES __________________________________42 1.5.1. Problemática Ambiental ____________________________________________________42 1.5.2. Métodos de Decoloración ___________________________________________________44 1.5.3. Tintes que Decolora la Lacasa _______________________________________________47
2. CONSIDERACIONES PRELIMINARES ____________________________ 50 2.1. RESIDUOS AGROINDUSTRIALES____________________________________________50
2.1.1. De Industria del Aceite de Palma._____________________________________________50 2.1.2. De Industria de Caña de Azúcar ______________________________________________52 2.1.3. De Industria del Café ______________________________________________________53
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2.2. TINTES INDUSTRIALES Y ENZIMA COMERCIAL______________________________55 2.2.1. Novozymes Suberase® _____________________________________________________55 2.2.2. Tintes Hunstman® ________________________________________________________55
3. METODOLOGÍA Y DISEÑO EXPERIMENTAL ______________________ 57 3.1. MATERIALES _____________________________________________________________57 3.2. METODOLOGÍA ___________________________________________________________58
3.2.1. Caract erización de Residuos_________________________________________________58 3.2.2. Fermentación en Estado Sólido_______________________________________________61 3.2.3. Degradación de Tintes _____________________________________________________62
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN_____________________________________ 64 4.1. CARACTERIZACIÓN DE RESIDUOS__________________________________________64
4.1.1. Resultados de Caracterización _______________________________________________64 4.1.2. Selección del Residuo de Palma______________________________________________68 4.1.3. Relevancia del Estudio de Residuos de Distinto origen ____________________________68
4.2. FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO _______________________________________69 4.2.1. Etapa 1: Efecto del Tipo de Sustrato y del Tiempo _______________________________69 4.2.2. Etapa 2: Efecto del Tiempo en cultivos de Fibra _________________________________72
4.3. DECOLORACIÓN DE TINTES________________________________________________73 4.3.1. Resultados de Ensayo de Decoloración ________________________________________73 4.3.2. Ensayo de Electroforesis____________________________________________________77
CONCLUSIONES ___________________________________________________ 79
REFERENCIAS_____________________________________________________ 80
ANEXOS___________________________________________________________ 83 ANEXO 1. PRÁCTICA DE CONSERVACIÓN DEL HONGO ______________________________84 ANEXO 2. PRÁCTICA DE CULTIVO EN ÉSTADO SÓLIDO ______________________________86 ANEXO 3. PRÁCTICA DE DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE LACASA _______________90 ANEXO 4. PRÁCTICA DE DECOLORACIÓN DE TINTES________________________________94
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LISTA DE TABLAS
TABLA 1. CLASIFICACIÓN INTERNACIONAL D E ENZIMAS (NÚMERO DE CLASE, NÚMERO D E CÓDIGO Y TIPOS DE REACCIÓN CATALIZADA) ...................................................................................................5
TABLA 2. ALGUNAS DEFINICIONES PARTICULARES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTIC A .......................................12 TABLA 3. ALGUNAS CARACTERÍSTICAS D E LACASAS DE TR AMETES .....................................................34 TABLA 4. DEGRADACIÓN DE TINTES POR PARTE DE HONGOS. .............................................................45 TABLA 5. DATOS SUMINISTRADOS POR HUNSTMAN S.A DE LOS TINTES INDUSTRIALES. ..........................56 TABLA 6. DISEÑO EXPERIMENTAL PARA PRIMERA ETAPA DE LA SSF....................................................61 TABLA 7. ESTIMACIÓN DE LA VELOCIDAD INICIAL DE REACCIÓN DE DEGRADACIÓN DE NEGRO TERANSIL CON
LACASA DE T. PUBESCEN S ...................................................................................................76
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. NIVELES DE ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS. ....................................................................7 FIGURA 2. ESQUEMA DEL MODELO LLAVE-CERRADURA PARA LA CAT ÁLISIS ENZIMÁTICA ...........................8 FIGURA 3. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD INICIAL DE LA REACCIÓN ENTRE LA β-GLOCUSIDASA Y UNA
SOLUCIÓN DE CELOBIOSA.....................................................................................................11 FIGURA 4. REACCIÓN CARACTERÍSTICA DE LA LACASA......................................................................13 FIGURA 5. SITIO ACTIVO DE LA RMAL (MULTIFORMA DE LACASA) ........................................................17 FIGURA 6. VISUALIZACIÓN DE LA LACASA DE T. VERSICOLOR EN RASMOL® . ........................................17 FIGURA 7. REACCIONES CATALIZADA POR LACASAS DE DISTINTAS FUENTES BIOLÓGICAS. .......................19 FIGURA 8. MECANISMO DE REACCIÓN. ...........................................................................................22 FIGURA 9. MONÓMERO DE LA LIGNINA. ...........................................................................................27 FIGURA 10. ACTIVIDAD LIGNOLÍTICA EN LA ESPECIE P. CHRYSOSPORIUM .............................................28 FIGURA 11. MECANISMO DE REACCIÓN DE DEGR ADACIÓN DE 1,2-DIARYLR POPAN E-1,3-DIOL POR MEDIO DE
LA LIP DE LA ESPECIE P. CHRYSOSPORIUM .............................................................................29 FIGURA 12. MECANISMO DE DEGRADACIÓN DEL 4,6-DI-T-BUTYLGUAIACOL POR MEDIO DE LACASA DE C.
VERSICOLOR......................................................................................................................29 FIGURA 13. PRODUCCIÓN DE LACASA POR PARTE DE HONGOS DE PUTREFACCIÓN BLANCA EN MEDIO D E
GLUCOSA CON ADICIÓN DE COBRE. ........................................................................................31 FIGURA 14. RELACIÓN ENTRE EL CONTENIDO DE GLUCOSA, BIOMASA Y ACTIVID AD DE LACASA EN CULTIVOS
DE LA ESPECIE T. VERSICOLOR .............................................................................................33 FIGURA 15. ALGUNAS ESTRUCTURAS DE COMPUESTOS XENOBIÓTICOS. ..............................................47 FIGURA 16. TINTES DEGRADADOS POR LÍQUIDO EXTRACELULAR DE T. VER SICOLOR. ACID GREEN 27
(ANTRAQUINÓNICO), ACID VIOLET (AZO) E INDIGO CARMINE (ÍNDIGO) ..........................................48 FIGURA 17. TINTES DEGRADADOS POR LACASA DE T. PUBESCENS. REMANZOL BRILLIANT BLUE
(IZQUIERDA). METHYL GREEN (DERECHA)...............................................................................49 FIGURA 18. RESIDUOS DE LA EXTRACCIÓN DEL ACEITE DE PALMA Y PALMISTE. TUSA (IZQUIERDA), FIBR A
(CENTRO), CUESCO (DERECHA) ............................................................................................51 FIGURA 19. RACIMOS DE LA PALMA AFRICANA. ................................................................................52 FIGURA 20. BAGAZO DE CAÑA D E AZÚCAR (ZONA DE SANTANDER, COLOMBIA) .....................................53 FIGURA 21. CÁSCARA DE C AFÉ VARIEDAD COLOMBIA. ......................................................................54 FIGURA 22. EQUIPO DE LIOFILIZ ACIÓN............................................................................................63 FIGURA 23. RESULTADOS DE HUMEDAD DE LAS MUESTRAS. ..............................................................64 FIGURA 24. RESULTADO DE CONTENIDO DE LIGNINA EN BASE HÚMEDA ................................................65 FIGURA 25. RESULTADO DE CONTENIDO DE HEMICELULOSA EN R ESIDUOS DE PALMA .............................66 FIGURA 26. RESULTADO DE SOLUBLES EN AGUA..............................................................................67 FIGURA 27. RESULTADOS DE SOLUBILIDAD EN ALCOHOL BENCENO .....................................................67 FIGURA 28. COMPARACIÓN DE SUSTRATOS EN CULTIVOS EN ESTADO SÓLIDO DE T. PUBESC ENS .............70 FIGURA 29. ACTIVIDAD DE LACASA EN CULT IVOS CON FIBRA D E PALMA ................................................72 FIGURA 30. DECOLORACIÓN CON NEGRO SUPER (IZ) Y AZUL TERANSIL (DER.).....................................74 FIGURA 31. BARRIDO DE ABSORBANCIA PARA NEGRO TERANSIL®......................................................74 FIGURA 32. DECOLORACIÓN DE NEGRO TERANSIL. ..........................................................................75 FIGURA 33. RESULTADO DE ELECTROFORESIS................................................................................77 FIGURA 34. ADAPTACIÓN DE ELECTROFORESIS. ..............................................................................78
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LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1. PRÁCTICA DE CONSERVACIÓN DEL HONGO.........................................................84 ANEXO 2. PRÁCTICA DE CULTIVO EN ÉSTADO SÓLIDO.........................................................86 ANEXO 3. PRÁCTICA DE DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE LACASA.................................90 ANEXO 4. PRÁCTICA DE DECOLORACIÓN DE TINTES...........................................................94
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RESUMEN
La lacasa (E.C. 1.10.3.2) es una enzima de uso potencial debido a su habilidad de
degradar compuestos de distinta estructura química, entre los que se encuentran
contaminantes como los tintes industriales. El hongo de putrefacción blanca
Trametes pubescens (CBS 696.94) produce lacasa de forma inducida y
principalmente como metabolito secundario. Se cree que la lignina tiene un efecto
inductor de lacasa en los hongos de putrefacción blanca, para lo cual se estudian
residuos con distinto contenido de ésta provenientes de la industria del café, la
caña de azúcar y la palma africana en un proceso de fermentación en estado
sólido. Se encontró que el cultivo con fibra de palma permite conseguir una
actividad de lacasa máxima de 3089U/l en 15 días, superando la actividad de
lacasa en los otros cultivos. La aplicación de decoloración fue estudiada con tres
tintes industriales, dos compuestos principalmente por grupos azo y uno por
antraquinónicos; sin embargo, sólo se pudo apreciar la decoloración del tinte azo
Negro Teransil de Hunstam® (40% en 5 días).
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INTRODUCCIÓN
La lacasa es una enzima oxidoreductasa de amplio uso industrial. Entre sus usos
se destaca la habilidad de la enzima para degradar compuestos fenólicos y no
fenólicos. La lacasa se utiliza en degradación de compuestos recalcitrantes como
algunos tintes industriales, en la industria alimenticia y en nanotenología. El interés
en la decoloración de tintes se debe a que éstos son utilizados extensamente;
existen aproximadamente 10000 tintes con una producción anual de más de
700000 toneladas. Entre el 5 y el 10% de los tintes producidos a nivel industrial
son desperdiciados y terminan en efluentes naturales. Estos tintes son
responsables del color, el cual es el primer contaminante del agua. Cantidades
mínimas de tintes entre 10–50mg/l son altamente visibles y afectan drásticamente
la estética de agua y las propiedades de ésta como la solubilidad de gases.
Una de las limitaciones actuales del uso de la lacasa se debe a que su producción
es costosa, por lo que la fermentación en estado sólido (SSF) puede ser una
alternativa ya que esta técnica utiliza residuos agroindustriales de bajo costo, los
cuales sirven de sustrato y soporte al microorganismo en la producción de
enzimas. En el ámbito mundial, Colombia es el cuarto productor de café y el
séptimo productor de caña de azúcar. En cuanto al aceite de palma, Colombia es
el primer productor en Latinoamérica y el cuarto a nivel mundial. Lo que hace que
estos residuos sean atractivos para su uso en SSF.
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OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de la pulpa de café, el bagazo de la caña de azúcar y residuos
de palma como sustratos en la obtención y el desempeño de la lacasa por medio
de la especie Trametes pubescens utilizando cultivo en estado sólido
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar los residuos de café, caña y palma en su contenido de lignina y
celulosa para inferir sobre su aplicabilidad en la técnica de fermentación en estado
sólido.
Ensayar los sustratos de cáscara de café, bagazo de caña y un tipo de residuos
de palma en la producción de lacasa por medio del hongo Trametes pubescens.
La actividad enzimática será calculada por medio del cambio de absorbancia que
resulta en la oxidación de ABTS por parte de la enzima.
Medir el desempeño de la lacasa obtenida con el uso de los tres sustratos en
procesos de degradación de un tinte de estructura aromática. A su vez, realizar el
mismo experimento con la enzima comercial para comparar resultados.
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1. ESTADO DEL ARTE
1.1. GENERALIDADES DE LAS ENZIMAS
1.1.1. Enzimas
Las enzimas, o biocatalizadores, son en su mayoría son proteínas (excepto por
algunas moléculas de ARN, las cuales son ácidos nucleicos) de alto peso
molecular y son responsables de la catálisis de la mayoría de reacciones
celulares. Son de particular interés debido a que a diferencia de los catalizadores
convencionales, las enzimas son muy específicas evitando reacciones paralelas y
productos indeseados y son más efectivas debido a que promueven mayores
velocidades de reacción bajo condiciones ambientales.1
Sin embargo, el éxito de la comercialización de las enzimas depende de tres
factores: su uso debe producir productos con mejor calidad que los producidos sin
los biocatalizadores, debe ser más económico producir con la enzima que sin ella
y las enzimas deben promover la creación de nuevos productos. Por lo tanto, los
estudios actuales están orientados a la producción económica de estos
1 Shuler M; Kargi F. Bioprocess Engineering: Basic Concepts, 2nd edition Upper Saddle River: Prentice Hall, Inc., 2002. 57 p
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4
compuestos, aprovechando que están presentes en todos los materiales
biológicos, lo cual hace que el costo de su producción pueda optimizarse. 2
La producción de enzimas se realiza por medio de distintas formas. Las enzimas
extraídas directamente de plantas, animales y microorganismos se conocen como
enzimas nativas. De origen vegetal, se tiene que las más producidas son la
papaína (100 ton/año), la amilasa (10,000 ton/año), mientras que las provenientes
de fuentes animales como la pepsina porcina y la tripsina porcina son producida a
menos escala (5-15 ton/año). Sin embargo, las enzimas mayormente producidas
provienen de procesos de fermentación con microorganismos como bacterias y
hongos debido a que las plantas superiores tienden a acumular toxinas en sus
vacuolas, mientras que los microorganismos (Ver Sección 1.4.3). Otro grupo de
enzimas se denominan xenozimas, las cuales se generan por medio de
modificaciones genéticas y mutaciones aleatorias.3
1.1.2. Nomenclatura Internacional de Enzimas
Algunas enzimas tienen un grupo asociado a la unidad proteica principal para
poder funcionar. Este grupo puede ser un grupo organometálico que se denomina
coenzima o un grupo metálico denominado cofactor (Ej.: iones de cinc, cobre,
2 Kilara A., Desai M. Enzymes.. En A.L. Barren, P.M. Davidson, S. Salminen, J.H. Thorngate III (Eds.). Food Additives. New York: Marcel Dekker, Inc., 2001. 662 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library 3 Ibíd. 662 p.
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5
magnesio). Una enzima asociada a un grupo inorgánico se denomina holoenzima;
la parte proteica de una holoenzima se denomina apoenzima4.
Las enzimas son nombradas sistemáticamente con el prefijo –asa al final del
sustrato o de la reacción catalizada. A su vez, son clasificadas con un número de
clase y número de código dependiendo de la reacción que catalizan5. La Tabla
1resume los distintos tipos de enzima y la nomenclatura internacional usada:
Tabla 1. Clasificación internacional de enzimas (Número de Clase, Número de Código y Tipos de
Reacción Catalizada)6
1. Oxidoreductasas 3. Hidrolasas (Reacciones REDOX) (Reacciones de Hidrólisis) 1.1 Actúan en >CH-OH 3.1 Ésteres 1.2 Actúan en >C=O 3.2 Enlaces glicosídicos 1.3 Actúan en >C=CH- 3.3 Enlaces peptídicos 1.4 Actúan en >CH-NH2 4. Liasas 1.5 Actúan en >CH-NH- (Adición a doble enlace) 1.6 Actúan en NADH; NADPH 4.1 >C=C<
2. Transferasas 4.2 >C=O (Transferencia de grupos funcionales) 5. Isomerasas 2.1 Grupos de un carbono (Reacciones de Isomerización) 2.2 Grupos aldehído o cetona 5.1 Racemasas 2.3 Grupos acilo 6. Ligasas 2.4 Grupos glicosídico (Formación de enlaces con ruptura de ATP) 2.7 Grupos fosfato 6.1 C-O
1.1.3. Niveles de Estructura de las Enzimas
Debido a que la mayor parte funcional de una enzima está constituida por
aminoácidos, las enzimas adoptan la forma estructural de una proteína. El arreglo
4 Boyer, R. Conceptos Básicos en Bioquímica (M. Ramírez & K. Aoki, Trads.). México DF., México: Thomson Learning, 2000. (Trabajo original publicado en 1999). 147 p. 5 Shuler M; Kargi F. Bioprocess Engineering: Basic Concepts, 2nd edition Upper Saddle River: Prentice Hall, Inc., 2002. 58 p 6 Adaptado de: Ibíd., p. 58
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6
de los átomos en una proteína es llamado conformación, lo cual le permite a la
enzima adoptar una forma tridimensional y poder hacer cambios estructurales sin
necesidad de romper los enlaces covalentes. Las proteínas adoptan una
termodinámicamente estable que se conoce como el estado nativo de las
proteínas. Los cambios de la conformación de las proteínas se realizan pro medio
de interacciones débiles, como puentes de hidrógeno, puentes bisulfuro e
interacciones hidrofóbicas7.
La estructura de las proteínas se ha jerarquizado en cuatro niveles, que describen
como se forma la macromolécula hasta llegar a la forma tridimensional (Figura 1).
La estructura primaria de las enzimas se refiere a la secuencia de residuos de
aminoácidos unidos por medio de enlace covalente. En su mayoría, los enlaces
covalentes son enlaces peptídico entre terminales amino y carboxilo y enlaces o
puente bisulfuro8.
La estructura secundaria de las proteínas se refiere a la conformación local de
algunas regiones de la cadena del polipéptido, Por lo tanto, este nivel está definido
por los patrones regulares en que los aminoácidos se organizan. Los patrones
más comunes observados en las proteínas son las hélices α y las láminas β, y la
formación de éstos depende de los aminoácidos que forman la proteína, ya que de
los grupos laterales de cada aminoácido depende el tipo de interacciones que se
da dentro de la estructura de la proteína9.
7 Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger principles of biochemistry, 4th ed. New York : W.H. Freeman and Company, 2005. 159-160 p. 8 Ibíd. 129 p. 9 Ibíd. 163-166 p.
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7
La estructura terciaria de la enzima se refiere a la organización espacial de la
enzima, pero a diferencia de la estructura secundaria, este nivel de estructura se
refiere a la organización global de la enzima, incluyendo la forma en que se
organizan las hélices y las láminas. La estructura terciaria es estabilizada por
residuos específicos como la Pro, Thr, Ser y Gly que se encargan del
acoplamiento de las regiones de la proteína y por los enlaces bisulfuro10.
La estructura cuaternaria se refiere a la organización de subunidades de las
proteínas, cada subunidad con una estructura terciaria definida. Cabe notar que
las proteínas pueden ser fibrosas o globulares, siendo las últimas las que pueden
presentar los niveles terciario y cuaternario11. Las enzimas son proteínas
globulares.
Figura 1. Niveles de estructura de las proteínas12.
1.1.4. Mecanismo de Catálisis Enzimática
Las enzimas actúan de forma similar a los catalizadores convencionales que
reducen la energía de activación de la reacción, lo cual permite el aumento de las
tasas de reacción sin modificar la conversión final, la cual es dada por condiciones
10 Ibíd. 170 p. 11 Ibíd. 170 p. 12 Ibíd. 129 p.
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8
de equilibrio. En cuanto al aspecto molecular, las enzimas forman un complejo
enzima-sustrato por medio de adsorción física en donde intervienen fuerzas de
interacción débiles. Aunque el mecanismo molecular de la catálisis enzimática no
está del todo entendido, la especificidad de las enzimas se explica por medio de la
existencia de un sitio activo, que es una pequeña región de la enzima donde
ocurre la adsorción del sustrato; por ende, la enzima sólo adsorbe sustratos
compatibles con la estructura molecular del sitio activo. Lo anterior se conoce
como el modelo llave-cerradura como se muestra en la Figura 2.13
Figura 2. Esquema del modelo Llave-Cerradura para la catálisis enzimática14
1.1.5. Factores que Influencian la Actividad Enzimática
Debido a su naturaleza de proteína, las enzimas no sólo están conformadas por
enlaces covalentes fuertes, sino también por fuerzas de interacción débiles que
definen las estructuras superiores de estos compuestos. Lo anterior hace muy
sensible a las enzimas a cambios de condiciones en el medio en que se
encuentran. La temperatura y el pH del medio de reacción son de los factores más
13 Shuler M; Kargi F. Bioprocess Engineering: Basic Concepts, 2nd edition Upper Saddle River: Prentice Hall, Inc., 2002. 58 - 59 p 14 Ibíd., p. 59
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relevantes y de mayor consideración, aunque factores como los esfuerzos
cortantes, la intensidad iónica del medio y el estado de la enzima (libre o
inmovilizada) también influyen en el desempeño del biocatalizador15.
El pH afecta a los grupos ionizables presentes en el sitio activo de la enzima, ya
que estos grupos están compuestos de grupos carboxilos y amino que se ionizan
generando una carga neta total en el sitio activo. Enzimas como la pepsina
muestran actividad entre rangos de pH extremadamente ácidos, siendo inactiva a
pH mayor de 4, en cambio enzimas como la arginasa presentan un punto óptimo
de pH alrededor de 10, lo cual es extremadamente básico16.
La temperatura dentro de un intervalo adecuado de temperatura favorece la
activación de la enzima. Sin embargo, fuera de este intervalo, las enzimas se
desnaturalizan con el aumento de la temperatura. Por ejemplo, la catalasa
(encargada de la descomposición del peróxido) se desactiva a una temperatura de
66º C17.
1.1.6. Determinación de Actividad Enzimática
Las Unidades de Actividad Enzimática indican la cantidad de enzima que produce
o consume un sustrato o producto de la enzima por unidad de tiempo bajo
condiciones estándar para la enzima en particular. Esta cantidad está relacionada
15 Duarte A. Introducción a la Ingeniería Bioquímica. Bogotá DC: Publicaciones de la Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, 1998. 196-197p. 16 Ibíd. 17 Ibíd.
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10
con la determinación de la velocidad inicial de reacción, la cual se define como la
variación inicial de sustrato, o de producto, con respecto al tiempo al inicio de la
reacción. Para determinar la velocidad inicial de reacción se mezclan soluciones
de sustrato y enzima de forma apropiada y se ajusta el pH por medio de una
solución amortiguadora. La variación de la concentración de sustrato o producto
se mide por medio de técnicas espectrofotométricas, manométricas,
polarimétricas, electrodos y métodos de muestreo y análisis18.
La Figura 3 muestra el progreso de la reacción de producción de glucosa a partir
de celobiosa por medio de la β-glocusidasa a condiciones éstandar de pH,
temperatura y fijas de concentración de sustrato y enzima. Se observa que el
origen y los puntos a 1 y 5 minutos caen sobre una misma línea, cuya pendiente
es la velocidad inicial de reacción. A partir de 5 minutos, la pendiente del progreso
de la reacción tiende a disminuir con el tiempo, por ende la velocidad de reacción
varía con respecto a su valor inicial. Lo anterior se debe a que a medida que se
consume la celobiosa la concentración de glucosa va alcanzando un valor estable.
Es importante observar que un buen estimado de la velocidad inicial de reacción
se logra con al menos tres puntos que permitan validar una tendencia lineal,
incluyendo el punto del origen. En el caso de la β-glocusidasa se lograría un mejor
estimado de la velocidad inicial tomando más datos entre 0 y 5 minutos de la
reacción, siendo los datos de 5 minutos en adelante irrelevantes para la
estimación de la velocidad inicial.
18 Ibíd., 191-193 p.
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11
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15
Tie mpo de Reacción [min]
Glu
cosa
Pro
duc
ida
[mic
rom
ol/m
l]
Figura 3. Determinación de la velocidad inicial de la reacción entre la
β-glocusidasa y una solución de celobiosa19.
Una vez se calcula la velocidad inicial, se multiplica por el volumen total de la
solución (incluyendo el volumen del amortiguador) y se divide entre la cantidad de
enzima adicionada (en unidades de volumen o de masa), obteniendo las Unidades
de Actividad Específica de Enzima. La Ecuación 1 define las unidades de
actividad específica con respecto a la velocidad inicial mostrando su análisis
dimensional:
[ ][ ] ⎥
⎦
⎤⎢⎣
⎡=
⋅⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
=⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡mgUAmgE
mlVml
molv
mgmolA
Tminmin
0µ
µ
Ecuación 1
Donde, A, v0, VT y E definen las unidades de actividad, la velocidad inicial de
reacción, el volumen total de solución y la cantidad de enzima (asumida en mg)
pata la reacción en cuestión.
Las unidades de actividad (no específica) tal como están expresadas en la
Ecuación 1 son reconocidas con la unidad U. Sin embargo la Unión Internacional
19 Adaptado de Ibíd. 194 p
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12
de Bioquímica (International Union of Biochemistry) recomienda el uso de la
unidad Katal como unidad estándar de unidad de actividad, la se define con
unidades del SI, por lo tanto 1 Katal es la cantidad de enzima que se necesita para
producir/degradar 1 mol de producto/sustrato por segundo a las condiciones del
ensayo (pH, temperatura, solvente, etc). Sin embargo, el uso de la unidad U sigue
prevaleciendo ya que las actividades definidas como Katal son muy pequeñas (1 U
= 6x10-7 Katal = 0,6 µKatal).20
A pesar de la existencia de una unidad SI para la actividad enzimática, los
sistemas sustrato-enzima son complicados y requieren de definiciones muy
específicas en cuanto al tipo de sustrato y las condiciones de éste y del ensayo
como se observa en la Tabla 2.
Tabla 2. Algunas definiciones particulares de actividad enzimática
ENZIMA UNIDAD DEFINICIÓN
Amilasa DU (Unidad dextrinizadora) Cantidad de amilasa que hidrolisa almidón soluble en
exceso de B-amilasa a una razón de 1 g/h a 30º C
Amilasa BAU (Unidad de amilasa bacterial) Cantidad de enzima que dextriniza 1 mg de almidón
por minuto en las condiciones del ensayo
Catalasa BU (Unidades Baker) Cantidad de enzima necesaria para descomponer
266mg de peróxido de hidrógeno a las condiciones del ensayo
Celulasa CA (Actividad de celulasa)
Cantidad de enzima necesaria para disminuir la viscosidad de 200 g de solución de 5% de foma de
celulosa (Hercules Type 7-LF) de 400 a 300 cP a 35 +-0,1 ºC, pH = 5.0 en 1 h.
Glucosa Isomerasa
GLcU (Unidad de glucosa isomerasa con el método de la
columna)
Cantidad de enzima necesaria para convertir glucosa
a fructosa a una velocidad inicial de 1µmol/min a condiciones específicadas
Pepsina Unidades de Pepsina Cantidad de enzima que digiere 3000 veces su peso
de albúmina de huevo coagulada a las condiciones del ensayo
20 Kilara A., Desai M. Enzymes.. En A.L. Barren, P.M. Davidson, S. Salminen, J.H. Thorngate III (Eds.). Food Additives. New York: Marcel Dekker, Inc., 2001. 664 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library
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13
Proteasas Bacterianas PC (Proteolytic
Casein) Cantidad de enzima que libera el 1,5mg de
equivalentes de tirosina (caseína solubil izada como tirosina) por minutos a las condiciones del ensayo
1.2. GENERALIDADES DE LA LACASA
1.2.1. Nomenclatura de la Lacasa
La lacasa es una oxidoreductasa clasificada por su participación de la oxidación
del bencendiol a benzoquinona (Figura 4), por tanto, su nombre sistemático es
benzenediol:oxygen oxidoreductase; también es conocida como Urushiol oxidase.
La enzima está clasificada como E.C. 1.10.3.2, donde el 1 se refiere a que la
enzima es una oxidoreductasa, el 10 a que toma bifenoles o compuestos
relacionados como donadores y el 3 porque toma el oxígeno como aceptor. Entre
el grupo E.C.1.10.3 se encuentran enzimas como la catecol oxidasa, la L-
ascorbato oxidasa y la o-aminofenol oxidasa, que participan en reacciones
similares a la de la lacasa21.
Figura 4. Reacción característica de la Lacasa22
21 Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB): Enzyme Nomenclature Recommendations. Recuperado el día 6 de junio de: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC1/09p.html#100302 22 European Bioinformatics Institute. Enzyme Database. Recuperado el día 6 de junio de: http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/enzymes/GetPage.pl?ec_number=1.10.3.2.
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14
La lacasa fue descubierta en el látex del Rhus vernicifera en 1883 por Yoshida, en
especial por su habilidad de oxidar el urushiol. La enzima fue redescubierta entre
1894-1896 por Bertrand, quien encontró la enzima en lacas de árboles y en
hongos23.
1.2.2. Estructura y Sitio Activo de la Lacasa
La lacasa es una holoenzima que tiene como cofactor un conjunto de cuatro
cobres unidos a la estructura proteica inicial y se encuentra en plantas, hongos,
insectos y bacterias. Estas enzima se encuentra dentro de la familia de las
oxidasas azules y catalizan reacciones de oxidación de una variedad de de
sustratos orgánicos e inorgánicos como mono-, di- y polifenoles, metoxifenoles,
aminas aromáticas y ascorbato con la reacción acoplada de reducción de cuatro
electrones de oxígeno a agua. La lacasa contiene cuatro iones de cobre que se
distribuyen entre los sitios T1 (principal responsable de la actividad enzimática),
T2, y T3 (Al último pertenecen dos de los cuatro iones de cobre)24.
La lacasa de hongos es producida de forma extracelular y como múltiples
isoenzimas (de ahí es común encontrar referencias donde se habla de lacasas).
La variedad de multiformas, inclusive en una misma especie, y la importancia de
éstas en la naturaleza no están del todo comprendidas; en general sólo una
23 Flurkey, W. H. Laccase. En J.R. Whitaker (Eds.). Handbook of Food Enzymology. New York: Marcel Dekker, Inc., 2002. 525 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library 24 Galhaup C., Haltrich D. Enhaced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes Pubescens in the presence of copper. Applied Microbiology and Biotechnology 2001; 56:22-232.
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multiforma en particular es descrita a profundidad para cada especie y pocas
referencias presentan comparaciones entre distintas multiformas25. Debido a la
multiformas de la lacasa, y a las distintas formas de estimación de tamaño de la
molécula (ultracentrifugación, electroforesis, exclusión por tamaño, predicha por
secuencia genética), el peso molecular de la lacasa varía entre 40 a 100 kDa,
siendo más común el rango de 60 a 80 kDa. 26.
Las múltiples formas de la lacasa hacen que dependiendo de la fuente biológic de
la enzima, la lacasa tenga distintos rangos de pH óptimo. Generalmente, las
lacasas actúan en el lado ácido de la escala de pH, aproximadamente entre 3 – 5,
pero algunas lacasas provenientes de fuentes vegetales actúan cerca de pH 7. En
cuanto a la estabilidad térmica, la lacasa es estable a altas temperaturas, de
hecho, el rango óptimo de muchas isoformas de la lacasa está por encima de 50º
C.27
Hakulinen et al. (2006) hacen un estudio exhaustivo sobre estructura del sitio
activo de la lacasa recombinada de M. albomyces (rMal, ver Figura 5). Los
autores expresan que las lacasas comparten el mecanismo catalítico con enzimas
como la ascorbato oxidasa, donde cuatro iones de cobre se necesitan para la
actividad catálitica. El cobre del sitio T1 forma un sitio mononuclear mientras que
un cobre tipo T2 con dos cobres tipo T3 (T3 y T3’) forman un sitio trinuclear. Los
nombres de los sitios provienen de características espectrofotométricas; los
25 Ibíd. 26 Flurkey, W. H. Laccase. En J.R. Whitaker (Eds.). Handbook of Food Enzymology. New York: Marcel Dekker, Inc., 2002. 528 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library 27 Ibíd. 531 p.
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cobres T1 son cobres azules y paramagnéticos con absorción cercana a 610 nm,
los cobres T2 no son paramagnéticos y los cobres T3 forman un par acoplado de
forma antiferromagnética.28
En la Figura 5 se observa que el cobre T1 esta ligado de forma tetraedral a los
aminoácidos de cistidina e histidina. Los cobres T3 y T3’ están coordinados con
residuos de histidina y de forma tetraedral mientras que el cobre T2 está ligado a
un átomo de cloro y dos residuos de histidina.29
En la Figura 6 se encuentra una figura de la estructura tridimensional de la enzima
de la especie T. versicolor (archivo de visualización tomado de la base de datos
PDB30), en la cual se observa presencia de láminas β (amarillo) y hélices α
(rosado). Se puede apreciar el sitio activo de la enzima conformado por los sitios T
(esferas en rojo oscuro), los cuales se organizan de forma que los sitios T2 y T3
forman una tríada, mientras que el sitio T1 esta aislado. También se observan los
residuos de histidina (azul) y los residuos de cistidina (amarillo)
28 Hakulinen N., Kruus K. Koivula K., Rouvinen J. A crystallographic and spectroscopic study on the effect of X-ray radiation on the crystal structure of Melanocarpus albomyces laccase. Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 350, Issue 4, 1 December 2006, Pages 929-934. 29 Ibíd. 30 Choinowski, T., Antorini, M., Piontek, K. Crystal structure determination at room temperature of a laccase from trametes versicolor in its oxidised form containing a full complement of copper ions. PDB (Protein Databank) [en línea]. Recuperado el día 6 de junio de: http://www.pdb.org/pdb/explore.do?structureid=1gyc.
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Figura 5. Sitio activo de la rMal (Multiforma de lacasa)31
Figura 6. Visualización de la Lacasa de T. versicolor en Rasmol®32 .
Izquierda: vista 3D de la enzima. Derecha: acercamiento al sitio activo
1.2.3. Función Biológica de la lacasa
La lacasa se localiza en el xilema de las plantas, donde esta asociado con las
paredes celulares; esta enzima no se encuentra en el citoplasma de las células
31 Hakulinen N., Kruus K. Koivula K., Rouvinen J. A crystallographic and spectroscopic study on the effect of X-ray radiation on the crystal structure of Melanocarpus albomyces laccase. Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 350, Issue 4, 1 December 2006, Pages 929-934.. 32 RASMOL es un software de visualización molécular Disponible en: http://www.umass.edu/microbio/rasmol/. Archivo PDB disponible en:
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18
vegetales33. En los hongos , la lacasa es producida de forma extracelular pero en
bajas cantidades: sin embargo, se ha demostrado que el proceso de producción
de lacasa es inducido con la adición de compuestos al cultivo de los
microorganismos como lo son la xilidina, el ácido telúrico, el ácido veratryl y el
pirogallol.34 Moldes et al. (2002) estudian el efecto de algunos posibles inductores
de lacasa de T. hirsuta, incluyendo inductores presentes en los tipos de sustratos
que se utilizan para la producción de la enzima. En el estudio de Moldes et al. se
analiza dos tipos de residuos lignocelulósicos, el bagazo de vino y la cebada, ya
que está demostrado que la celulosa favorece el crecimiento del hongos, pero se
demuestra que el residuo de mayor contenido de lignina (bagazo de vino) permite
la obtención de mayor actividad de lacasa en el extracto del cultivo, por ende, se
puede pensar que la lignina es un inductor de la enzima.35
La lacasa (en distintas multiformas) se encuentra en plantas y hongos donde
participa en procesos de oxidación de una variedad de compuestos, en su mayoría
relacionados con la estructura del fenol. En el caso del la especie Rhus vernicifera,
la lacasa actúa sobre el urushiol para generar cadenas acopladas (Figura 7). En
otras plantas, la lacasa oxida monolignoles generando dímeros y trímeros. La
lacasa en los hongos convierte syringylglycol guaiacol en productos que contienen
33 Ibíd. 526 p. 34 Minussi R.C, Pastore G.M and Durán N. Laccase induction in fungi and laccase/N–OH mediator systems applied in paper mill effluent. Bioresource Technology, Volume 98, Issue 1, January 2007, Pages 158-164 35 Moldes D., Gallego P.P, Rodríguez-Couto S. Sanromán A. Grpe seeds: the best l ignocellulosic waste to produce laccase by solid state cultures of Trametes hirsuta. Biotechnology Letters 25: 491-495, 2003.
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19
grupos de aldehídos, ácidos carboxílicos, ésteres y quinonas36 Se cree que las
reacciones catalizadas por la lacasa en la naturaleza, sobretodo en los hongos de
putrefacción blanca, intervienen en la degradación de la lignina y los compuestos
tóxicos provenientes de ésta. También se cree que la enzima previene la acción
de compuestos tóxicos que pueden generar estrés en los microorganismos37.
Figura 7. Reacciones catalizada por lacasas de distintas fuentes biológicas38.
Sin embargo, autores como Minussi et al. (2006) afirman que la importancia
biológica de la lacasa, así como de otras enzimas con cofactor de cobre, es
incierta. Lo que está claro que la enzima es aplicable en procesos de degradación
de contaminantes ambientales, procesamiento de papel, estabilización de vinos y
36 Flurkey, W. H. Laccase. En J.R. Whitaker (Eds.). Handbook of Food Enzymology. New York: Marcel Dekker, Inc., 2002. 525 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library 37 Galhaup C. Haltrich D. Enhaced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper. Applied Microbiology and Biotechnology (2001) 56: 225-232. 38 Ibíd. 527 p
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20
conversión de lignina en productos útiles, por lo que la investigación de está
enzima ha sigo orientada a sus posibles aplicaciones.39
1.2.4. Mecanismo de Reacción de la Lacasa
El mecanismo de reacción de la lacasa no ha sido del todo explicado, sin
embargo, autores como Solomon et al (1996) proponen un mecanismo donde un
electrón es transferido al cobre T1. Este sitio transfiere un electrón al sitio
trinuclear T2-T3 y la reducción del sitio trinuclear se hace de forma secuencial de
cada cobre en el sitio trinuclear o por reducción de los cobres tipo T3 acoplada con
el par T1 y T2. Yarpolov et al. (1997) propone otros mecanismos, pero todos
implican la transferencia de un electrón al sitio T1 como paso inicial. Lo anterior
muestra que hay distintos mecanismos propuestos debido a que al reducirse
cuatro iones de cobre pueden ocurrir distintos pasos intermedios40. Los electrones
aceptados por el sitio T1 son transferidos al sitio trinuclear a través de la ruta Cys-
His (Figura 5) hasta que cuatro electrones son transferidos a los cuatro sitios de
cobre en el sitio activo de la enzima. Finalmente, los electrones son transferidos a
las moléculas de oxígeno reduciéndolos a agua. 41
39 Minussi R.C., Pastore G.M., Durán N. Laccase induction in fungi and laccase/N-Oh mediator systems applied in paper mill effluent. Bioresource Technology 98 (2007) 158-164 40 Flurkey, W. H. Laccase. En J.R. Whitaker (Eds.). Handbook of Food Enzymology. New York: Marcel Dekker, Inc., 2002. 534 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library 41 Hakulinen N., Kruus K. Koivula K., Rouvinen J. A crystallographic and spectroscopic study on the effect of X-ray radiation on the crystal structure of Melanocarpus albomyces laccase. Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 350, Issue 4, 1 December 2006, Pages 929-934.
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21
La lacasa ha mostrado la habilidad de degradar múltiples compuestos, por lo que
Wong et al. (1999) llevaron a cabo un estudio exhaustivo a cerca del mecanismo
de reacción de la lacasa contenida en extracto de cultivos de T. versicolor. Se
estudia la degradación de tres tintes de distinta estructura química, antraquinónico,
índigo y azo. El primer resultado que encuentran es que los tintes que sirven de
sustrato para la enzima son los tintes de tipo antraquinónico, sin embargo, la
enzima es capaz de degradar los otros dos tipos de tintes cuando existe la
presencia de un sustrato mediador en la reacción. También muestran que el ABTS
permite la degradación de tintes que no son sustrato de la enzima al formarse
radicales libres que promueven la transferencia de electrones en el medio. Otro
experimento realizado por los mismos autores muestra que en el líquido
extracelular hay metabolitos de menos de 8kDa que actúan como activadores de
la lacasa permitiéndoles degradar los distintos tipos de tintes. Sin embargo, ni el
ABTS ni los metabolitos de bajo peso molecular son capaces de degradar los
titnes por sí solos42.
42 Wong Y., Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat. Res. Vol. 33, No. 16, pp. 3512-3520, 1999
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22
Figura 8. Mecanismo de reacción43.
En la Figura 8 se observa que la enzima interviene en reacciones de transferencia
de electrones, acorde a su naturaleza de oxidoreductasa. La enzima oxida un
sustrato M generando ya sea un producto PM o un intermedio M+ que sirve como
agente oxidante de un compuesto D, el cual no es sustrato de la enzima,
produciendo un producto PD. Durante el proceso, la enzima se reduce a E- pero
vuelve a su estado natural al cederle los electrones a las moléculas de oxígeno
para la formación de O-2 que finalmente produce agua. . Lo anterior muestra que la
mayor actividad de la enzima se observa cuando esta actúa en conjunto con los
distintos metabolitos que los microorganismos producen.
1.2.5. Aplicaciones de la Lacasa
La lacasa tiene la habilidad de degradar compuestos fenólicos y no-fenólicos
relacionados con la lignina, por lo que tiene múltiples aplicaciones, entre las que
43 Ibíd.
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23
se encuentra la industria de alimentos, la industria textil, la nanobiotecnología, la
bioremediación de suelos, los cosméticos, entre muchas otras aplicaciones,
incluyendo el uso en drogas para combatir el cáncer. En especial, la lacasa, así
como diferentes técnicas de oxidación enzimática, son de interés industrial debido
a que no requieren el uso de químicos tóxicos y a que no producen reacciones
laterales indeseadas.44
En la industria textil la lacasa participa en la apariencia del color del producto, en
especial, existe una aplicación en la cual la casa interviene en la eliminación de
compuestos fenólicos indeseados que son responsables de la formación de un
color marrón en bebidas como jugo, vino y cerveza. También son útiles en
procesos de cocción debido a que la enzima es capaz de participar en el
entrecruzamiento de biopolímeros, permitiendo aumentar la resistencia en masas
de gluten y harinas. Otras aplicaciones, entre la que se encuentra el uso de la
enzima en biosensores para el procesamiento de comidas están en constante
estudio, pero se requiere de técnicas de inmovilización menos costosas que las
actuales.45
En la industria de la pulpa y papel, la lacasa participa en la degradación de la
lignina, lo cual actualmente se hace con métodos en los que participan
compuestos extremadamente tóxicos (como blanqueadores de cloro). Otras
enzimas como la lignin peroxidasa y manganeso perosidasa han sido utilizadas
para aplicaciones de deslignificación de tejidos leñosos, pero la lacasa ha sido
44 Rodríguez Couto S. Toca Herrera J.L. Industrial and biotechnological applications of laccases: A review. Biotechnology Advances, Volume 24, Issue 5, September-October 2006, Pages 500-513 45 Ibíd.
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24
más fácil de manejar y de mayor disponibilidad. La habilidad de crear radicales
libres permite utilizar la lacasa como adhesivo de fibras provenientes de materiales
lignocelulósicos creando materiales compuestos con buenas propiedades
mecánicas.46
En la industria textil, la lacasa tiene una aplicación muy relevante, debido a que
esta enzima es capaz de degradar tintes de distintas estructuras moleculares que
no son degradados por técnicas tradicionales. La industria textil consume largos
volúmenes de agua y consume más de 100.000 tipos de tintes comerciales, por lo
que las legislaciones son más estrictas en el tratamiento de estos residuos.
Además de la habilidad de decolorar, la lacasa también se utiliza para blanquear
textiles y para sintetizar tintes. 47
En el campo de la nanobiotecnología la lacasa tiene aplicaciones como biosensor
para detectar varios compuestos fenólicos, oxígeno, catecol aminas, morfina,
codeína, entre otros. Se han realizados distintos estudios de inmovilización de
lacasas, como lo muestra Roy et al. (2005) inmovilizando lacasa de T. versicolor
por medio de entrecruzamiento, lo cuál permite utilizar el inmovilizado como
biosensor. 48
Otras aplicaciones de la enzima se encuentra en degradación de hidrocarburos
aromáticos policíclicos y xenobióticos, los cuales son responsables de
contaminación de suelos. Se espera que la enzima pueda utilizarse para sintetizar
químico debido a su habilidad de promover reacciones de polimerización, lo
46 Ibíd. 47 Ibíd. 48 Ibíd.
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25
anterior permitiría la síntesis de medicamentos. En la industria de cosméticos se
ha encontrado que la lacasa sustituye el uso de peróxido de hidrógeno como
agente oxidante en la formulación de productos para el cabello. 49
1.3. GENERALIDADES DEL Trametes pubescens
1.3.1. Clasificación del Trametes pubescens
La especie Trametes pubescens (CBS 696.94) es un hongo de putrefacción
blanca, el cual es considerado como uno de los principales productores de lacasa,
así como los hongos del género Trametes.50 El Tramets pubescens está
clasificado dentro de la división basidiomicetes51, los cuales se caracterizan por
ser tabicados y reproducirse asexualmente por conidios o sexualmente por
basidioporas52
Los hongos en su mayoría son organismos saprofitos que se caracterizan por su
habilidad de descomponer. En especial, los hongos tienen la habilidad de
49 Ibíd. 50 Osma J.F, Toca Herrera J.L, Rodríguez Couto S. Banana skin: A novel waste for laccase production by Trametes pubescens under solid-state conditions. Application to synthetic dye decolouration, Dyes and Pigments, Volume 75, Issue 1, 2007, Pages 32-37 51 Galhaup C., Wagner H., Hinterstoisser B., Haltrich D.. Increased production of laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens. Enzyme and Microbial Technology, Volume 30, Issue 4, 16 April 2002, Pages 529-536 52 Koneman E.W., Roberts G.D. Micología Práctica de Laboratorio (N.G. Meeroff & M.R. Iglesia, Trads.). Buenos Aires, Argentina: Editorial Médica Panamericana, 1987. (Trabajo original publicado en 1985). 83 p.
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26
descomponer la celulosa en los tejidos leñosos, los cuales están compuestos en
un 40-60% de celulosa, un 10-30% de hemicelulosa y 15-30% de lignina. 53
Los hongos de putrefacción blanca se caracterizan por atacar la celulosa y la
hemicelulosa en forma simultánea con la degradación de lignina, la cuál se torna
más pálida y más fibrosa hasta que es removida. Lo anterior hace que las paredes
del xilema de los vegetales se angosten destruyendo la estructura del vegetal.
Entre estos hongos se incluye cientos de especies del género Agaricus y Poliporus
(a parte del género Trametes). El Coriolus versicolor es uno de los más eficientes
logrando descomponer cerca del 90% de la lignina en la mayoría de los téjidos
leñosos.54
1.3.2. Actividad Lignolítica de Hongos de Putrefacción Blanca
Los microorganismos cuya fuente de carbono y nitrógeno corresponde a tejidos
leñosos tienen la limitación de la lignina para poder acceder a los polisacáridos de
celulosa y hemicelulosa. Sólo algunos grupos de microorganismos presentan
actividad lignolítica debido a que la lignina (Figura 9) es un polímero aromático
muy irregular que es difícil de degradar. Entre los microorganismos que
sobresalen por su actividad lignolítica, se encuentran los hongos de putrefacción
blanca. Las enzimas que participan en el proceso de degradación de la lignina en
53 Ingold C.T. Hudson H.J. The Biology of fungi, 6ed. London: Chapman & Hall, 1993. 146-147 p. 54 Ibíd. 147 p
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27
los hongos de putrefacción blanca son la lignin peroxidasa (LiP), la manganeso-
dependiente peroxidasa (MnP) y la lacasa. 55
Figura 9. Monómero de la lignina56.
La especie Phanerochaete chrysosporium ha sido estudiada de forma extensiva
para entender los requerimientos fisiológicos de la ligninólisis. Se observa que la
ligninólisis sólo ocurre cuando otras fuentes de carbono, azufre y nitrógeno fáciles
de degradar están disponibles, por ende el proceso ocurre cuando ha pasado la
fase primaria del crecimiento. En el caso del P. chrysosporium , las enzimas
responsables de la actividad lignolítica son principalmente la LiP y la MnP y
algunas oxidasas que producen peróxido de hidrógeno, pero no la lacasa. La LiP
retira un electrón de la parte no fenólica de la molécula de lignina creando un
radical libre que inicia una serie de oxidaciones aleatorias que terminan en la
oxigenación y rompimiento de la cadena polimérica de la lignina. En cuanto a la
MnP, esta funciona oxidando el Mn(II) a MN(III), haciendo que el catión +3 del
manganeso actúe como mediador de bajo peso molécular que permite llegar a
zonas remotas de la lignina. La Figura 10 muestra de forma simplificada el
55 Field J. Jong E. Gumersindo F, de Bont J. Screening for lignolityc fungi applicable to the biodegradation of xenobiotics. Trends in Biotechnlogy 1993, 11:44-49. 56 Ibíd.
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28
mecanismo de ligninólisis de la especie P. chrysosporium, se incluye la
participación del alcohol veratryl, el cual es un producto sintético de novo® que
estabiliza la LiP previniendo la inactivación por la producción de peróxido.57
Figura 10. Actividad lignolítica en la especie P. chrysosporium58
Kirk y Nakatsubo (1983) explican de forma detallada el mecanismo de reacción de
la degradación del diarylpropane-1,3-diol (compuesto principal de la lignina) por
medio de la LiP de P. chrysosporium . En la reacción interviene el rompimiento de
la cadena del radical propano, rompiendo el enlace Cα-Cβ de la unidad estructural
de la lignina (Figura 11). Yolota et al. (1990) demuestran que en la especie
Coriolus versicolor la lacasa cumple la función de la LiP en el rompimiento del
mismo enlace59.
Kawai et al. (1988) encontraron que el 4,6-butylguaiacol (intermediario en la
degradación de la lignina) es degradado por medio de la lacasa del C. versicolor
hasta un producto de cadena abierta, proponiendo el mecanismo de la Figura 12.
57 Ibíd. 58 Ibíd 59 Higuchi T. Biodegradation mechanism of lignin by white-rot basidiomycetes. Journal of Biotechnology, Volume 30, Issue 1, July 1993, Pages 1-8
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29
Estos estudios, en conjunto con los realizados con la LiP muestran que estas
enzimas intervienen en el proceso de degradación inicial de la lignina en los
basidiomicetos de putrefacción blanca.60
Figura 11. Mecanismo de reacción de degradación de 1,2-diarylrpopane-1,3-diol
por medio de la LiP de la especie P. chrysosporium61
Figura 12. Mecanismo de degradación del 4,6-di-t-butylguaiacol por
medio de lacasa de C. versicolor62
Especies de putrefacción blanca como el T. versicolor63 y el T. pubescens64 liberan
lacasa en mayor proporción que otras enzimas extracelulares, mostrando que la
lacasa de estos hongos participan en la decoloración de la lignina en los tejidos
leñosos. En el T. pubescens, las distintas multiformas de la lacasa cumplen dos
60 Ibíd. 61 Ibíd. 62 Ibíd. 63 Wong Y., Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat. Res. Vol. 33, No. 16, pp. 3512-3520, 1999 64 Galhaup C. Haltrich D. Enhaced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper. Appl Microbiol Biotechnol (2001) 56: 225-232
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30
funciones, la primera es la degradación de la matriz de lignina en los tejidos
leñosos y la segunda es la polimerización y condensación de los productos tóxicos
que provienen de la descomposición de la lignina65. Sin embargo, el mecanismo
de producción y de catálisis de la lacasa no ha sido explicado de la misma forma
que el de la LiP de P. chrysosporium
1.3.3. Trametes pubescens como Productor de Lacasa
Distintas especies de hongos y plantas producen lacasa, sin embargo, no todas
las especies producen la enzima en alta proporción; por tal razón los estudios
actuales están orientados a encontrar las especies que producen la enzima en
proporciones considerables y las especies capaces de asimilar los inductores de la
enzima. Entre estas especies Galhaup et al. (2001) afirman que el hongo de
putrefacción blanca Trametes pubescens es un productor de lacasa sobresaliente,
aunque los estudios realizados con esta especie aún están en desarrollo.66
Galhaup et al. (2001) afirma que la especie T. pubescens se desempeña mejor
que especies como el T. versicolor que han sido estudiadas con mayor frecuencia
para la producción de lacasa. Sin embargo, tanto el T. pubescens como las otras
especies productoras de lacasa muestran que el contenido de lacasa en su líquido
extracelular es muy bajo a menos de que se induzca a la formación de la enzima.
65 Shleev S., Nikitina O., Christenson A., Reimann C., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton L. Characterization of two new multiforms of Trametes pubescens laccase. Bioorganic Chemistry 35 (2007) 35–49 66 Ibíd.
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31
Por tal razón, se encuentra que las especies cultivadas en medio a base de
glucosa no muestran formación de la enzima. Se estudia entonces el efecto de la
adición de cobre a distintas especies para estudiar la asimilación de éste por parte
de los microorganismos y su efecto en la producción de la enzima, encontrando
que el género Trametes corresponde a las especies que más producen lacasa
(Figura 13).67
Figura 13. Producción de lacasa por parte de hongos de putrefacción blanca en
medio de glucosa con adición de cobre.68
Otro aspecto que ha sido estudiado en la producción de la enzima es el periodo
del metabolismo en el que los hongos de putrefacción blanca producen la enzima.
Wong et al. (1999) verifican experimentalmente que el T versicolor produce la
enzima mayormente en la fase de crecimiento estacionario, cuando las fuentes de
carbono como la glucosa se han agotado. Por lo tanto, la enzima se produce
principalmente como metabolito secundario. En la Figura 14 se observa que a
medida que la glucosa se agota, la producción de lacasa se incrementa a más o
menos a 20 U/L, una vez el hongo ha llegado a la fase estacionaria de su
67 Ibíd. 68 Ibíd.
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32
metabolismo y se ha agotado la glucosa, la concentración de lacasa en el líquido
de cultivo alcanza las 100 U/L. También se observa que el contenido de biomasa
se estabiliza cuando se agota la glucosa, mostrando que el crecimiento del hongo
es sensible a este compuesto. La actividad de lacasa sigue incrementándose
hasta un valor máximo, donde tanto ésta como la biomasa comienzan a
disminuir.69
El caso descrito en la Figura 14 se aplica también para el T. pubescens. De
hecho, Galhaup et al. (2001) muestran que a pesar que el cobre tiene un efecto
muy marcado hacia la inducción de la enzima en los cultivos del T. pubescens, la
mayor producción se da en la etapa estacionaria del crecimiento del hongo. Otro
estudio realizado en el 2002 por el mismo grupo de investigación investiga más a
fondo el efecto del agotamiento de la glucosa en el incremento de la producción de
lacasa de T. pubescens. Estos autores encontraron que al alimentar la glucosa al
cultivo en forma semi batch, de manera que el contenido de glucosa siempre se
mantiene en un nivel bajo, la actividad de lacasa alcanza las 740000 U/l,
demostrando que la producción de lacasa es estimulada por el agotamiento de
fuentes de carbono70.
69 Wong Y., Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat. Res. Vol. 33, No. 16, pp. 3512-3520, 1999 70 Galhaup C., Wagner H., Hinterstoisser B., Haltrich D. Increased production of laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens. Enzyme and Microbial Technology, Volume 30, Issue 4, 16 April 2002, Pages 529-536
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33
Figura 14. Relación entre el contenido de glucosa, biomasa y actividad de
lacasa en cultivos de la especie T. versicolor71
La especie Trametes pubescens también ha sido evaluado con residuos como la
cáscara de banano72 y la cáscara de mandarina73. En el caso de la cáscara de
banano, los autores reportan una actividad de lacasa de 1570 U/L, sin necesidad
de utilizar suplementos de cobre u otros compuestos que tradicionalmente se han
utilizado para inducir a la producción de la enzima. En el caso de la mandarina,
ésta por sí sola produce un máximo de 228 U/l en un cultivo con medio basado en
glucosa y el hongo inmovilizado en una malla de acero inoxidable. Estos
resultados muestran que residuos agroindustriales promueven a la producción de
lacasa de T. pubescens (De la misma forma que los residuos de semillas de uva
en la especie T hirsuta, ver Sección 1.2.3), lo cual es una alternativa prometedora
para reducir los costos en la producción de la enzima.
71 Ibíd. 72 Osma J.F, Toca Herrera J.L. Rodríguez Couto S. Banana skin: A novel waste for laccase production by Trametes pubescens under solid-state conditions. Application to synthetic dye decolouration. Dyes and Pigments, Volume 75, Issue 1, 2007, Pages 32-37 73 Osma J.F., Saravia V., Toca Herrera J.L. Rodríguez Couto S. Mandarin peelings: The best carbon source to produce laccase by static cultures of Trametes pubescens. Chemosphere, Volume 67, Issue 8, April 2007, Pages 1677-1680
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Shleev et al. (2007) muestra una caracterización de algunas multiformas de la
lacasa de T. pubescens. Las multiformas de esta especie muestran similitudes con
las de otras especies de hongos de putrefacción blanca en cuanto a su contenido
de carbohidratos y su peso molecular (Tabla 3). Tan sólo en unas pocas
multiformas, se puede observar la gran variabilidad en los pesos moleculares,
puntos isoeléctricos y rangos de pH que hacen que la lacasa sea una enzima muy
versátil y que abre las probabilidades de intervenir en muchas más reacciones que
las que se han estudiado hasta el momento.
Tabla 3. Algunas características de lacasas de Trametes74
Lacasa
MW (kDa)
pI
pH-Optimo
Carbohidratos [%]
Trametes pubescens 67 5,3 4,0 - 4,5 13 LAC1 Trametes pubescens 67 5,1 4,0 - 4,5 13 LAC2 Trametes pubescens 65 2,6 3,0 - 4,5 18 LAP2 Trametes C30 63 3,6 4,5 - 5,0 12 LAC1 Trametes C30 65 3,2 5,5 - 6,0 12 LAC2 Trametes C30 65 4 5,5 - 6,0 LAC3
1.4. TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN ÉSTADO SÓLIDO (SSF)
1.4.1. Generalidades de la técnica
La fermentación en estado (SSF) sólido es una técnica de gran impacto en las
industrias farmacéutica y agrícola, además de ser de interés actual las
74 Shleev S., Nikitina O., Christenson A., Reimann C., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton L. Characterization of two new multiforms of Trametes pubescens laccase. Bioorganic Chemistry 35 (2007) 35–49
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35
exploraciones en otros campos de aplicación. Se define como el crecimiento de
microorganismos en ambientes húmedos con cantidades de medio líquido muy
pequeñas o inclusive ausentes. La fermentación en estado sólido es un
procedimiento similar a la fermentación en estado sumergido (SmF), pero con
cantidades de medio líquido superiores; sin embargo, se han encontrado distintas
ventajas que favorecen el uso de la técnica en estado sólido. En el caso del
empleo de la técnica en estado sólido con hongos se utiliza la abreviatura FSSF;
esta sección está principalmente enfocada a la aplicación de la técnica a hongos.75
Un procedimiento general para la fermentación en estado sólido es descrito por
Gowthaman et al. (2001) y se describe a continuación:76
- Preparación del Inóculo, donde las esporas generalmente alcanzan el
sustrato real.
- Preparación del sustrato, que incluye la reducción de tamaño, la adición de
nutrientes y el ajuste de pH.
- Autoclavado o esterilizado de los medios para fvorecer el crecimiento
bacteriano.
- Inoculación del medio sólido húmedo.
- Inoculación bajo condiciones favorables y fáciles de llevar en un sistema de
reactor.
75 Gowthaman M.K., Krisma C. Moo-Young M. Fungal solid state fermentation. En Khachatourians G.G. (Ed) Applied Mycology and Biotechnology, 2001. 528 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library 76 Ibíd.
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36
- Secado de los sólidos y extracción de los productos.
- Pasos finales de filtración, concentración/purificación.
La técnica de fermentación en estado sólido ha mostrado gran aplicabilidad en la
producción de enzimas con fines industriales. En especial, la técnica se podría
emplear en procesos donde el extracto de los cultivos se puede usarse
directamente sin etapas de purificación77.
1.4.2. Factores que Influyen en el Proceso
En la SSF hay factores que influyen en el uso y la aplicabilidad de la técnica. El
tipo de inoculo, ya sea esporas o células vegetales influyen en la facilidad del
almacenamiento de los inóculos y la resistencia a errores en el manejo de éstos.
Los inóculos de micelios tienden a favorecer el contenido proteico debido a la
disponibilidad inmediata de enzimas necesarias para el crecimiento. En la técnica
también influye la densidad del inóculo.78
Otro factor importante es el nivel de humedad, la cual determina que tan accesible
es el medio para el hongo. Un óptimo nivel de humedad debe mantenerse, debido
a que la baja humedad tiende a desfavorecer la difusión de nutrientes al
microorganismo y por ende inhibe el crecimiento del microorganismo, asi como
77 Pandey A., Selvakumar C. Poonam N. Solid State Fermentation for the production of industrial enzymes. School of Applied Biological and Chemical Science, University of Ulster, Coleraine BT52 1 AS, N. Irelan, UK. 78 Gowthaman M.K., Krisma C. Moo-Young M. Fungal solid state fermentation. En Khachatourians G.G. (Ed) Applied Mycology and Biotechnology, 2001. 528 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library
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37
influye negativamente en la estabilidad de la enzima y en la adaptación del
microorganismo al sustrato. Un nivel alto de humedad puede promover el
crecimiento de bacteria, la aglomeración de partícula y limitaciones de
transferencia de oxígeno.79
El pH es otro factor fundamental en el crecimiento de los hongos. Aunque la
mayoría de los hongos filamentosos pueden crecer en un amplio rango de pH, de
2-9 siendo el rango óptimo de 3.8–6, el objetivo es aprovechar está características
de los hongos para evitar el crecimiento bacteriano, por lo que la tendencia es a
llevar cabo la técnica en los valores de pH mínimos posibles. En varios
experimentos se ha mostrado que pH ácidos del rango entre 3 y 3.5 evitan de
forma efectiva la contaminación bacteriana. Sin embargo, cabe recordar que la
naturaleza de la técnica hace casi imposible controlar el pH, debido a que el
sistema es altamente heterogéneo, lo cual no es el caso de la SmF de tres fases.80
La temperatura es el factor más importante en la FSSF, ya que a pesar que los
hongos pueden crecer en un rango amplio de temperatura (20 – 55º C), se debe
evitar la presencia de gradientes de temperaturas generados por la generación de
calor en el proceso. También se debe mantener aireado el sistema y evitar alto
contenido de humedad en el aire ya que el proceso es altamente aeróbico. Estos
problemas de transferencia de calor al sistema se convierten en un factor
importante entre mayor sea la escala del proceso.81
79 Ibíd. 80 Ibíd. 81 Ibíd.
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38
1.4.3. Microorganismos Utilizados en la SSF y Enzimas Producidas
Diferentes microorganismos son usados en la técnica de fermentación en estado
sólido, entre estos microorganismos se encuentran las bacterias, los hongos
filamentosos y las levaduras y son usados ampliamente para producir diferentes
grupos de enzimas. Entre los hongos mayormente utilizados se encuentran los
Trichoderma y los Aspergillus. La elección de la cepa adecuada para la producción
de una enzima en particular no es una decisión sencilla debido a que un mismo
microorganismo puede producir más de 19 tipos de enzimas y una sola enzima
puede ser producida por más de 28 microorganismos. De forma que la elección de
un microorganismo para un fin en particular depende de la elección conjunta entre
el tipo de microorganismo y las condicines a la que se llevará a cabo la
fermentación82.
Generalmente, las enzimas hidrolíticas como las celulasas, las xilanasas y las
pectinasas son producidas por hongos, ya que éstos las utilizan para su
crecimiento en la naturaleza. Las celulasas han sido producidas por especies del
género Trichoderma y las especies del género Aspergillius describen actividad
hidrolítica. A pesar que las bacterias y las levaduras producen xilanasas, se
prefieren los hongos filamentosos debido a que éstos producen la enzima en
82 Pandey A., Selvakumar C. Poonam N. Solid State Fermentation for the production of industrial enzymes. School of Applied Biological and Chemical Science, University of Ulster, Coleraine BT52 1 AS, N. Irelan, UK
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39
mayor proporción, incluyendo casos en el que las especies producen la enzima sin
presencia de celulasas.83
Las ligninasas son enzimas que participan en el proceso de degradación de la
lignina. Estas enzimas son de particular interés debido a que la lignina es un
polímero muy resistente a la acción microbiana y sólo especies como los
basidiomicetos de putrefacción blanca son hábiles en degradar la lignina. Entre
estas enzimas, las más comunes son las LiP, las MnP y la lacasa84. Las especies
que producen este tipo de enzimas han sido mencionadas en la sección 1.3,
debido a que estas incluyen a la lacasa que es el centro de este trabajo.
Otros tipos de enzimas importantes a nivel industrial son las proteasas, las cuales
ocupan el 60% del mercado mundial. Se ha encontrado reportes de la cepa de A.
Níger como productor de proteasas en SSF. La especie R. oligospora y P. citrinum
también ha sido reportada como productor de proteasas. Las pectinasas,
galactosidasas, glutaminasas, amilasas son otros grupos de enzimas producidas
por SSF, muchas de éstas son producidas por especies del género Aspergillius,
incluyendo modificaciones genéticas de éstas. 85
1.4.4. Sustratos Utilizados en la SSF
Una de las mayores ventajas de la FSSF es la facilidad de los hongos de crecer
en múltiples tipos de sólidos. Pro tal razón la técnica de fermentación en estado
83 Ibíd. 84 Ibíd. 85 Ibíd.
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40
sólido permite el aprovechamiento de residuos agroindustriales sin necesidad de
mayor pretratamiento. Además del aprovechamiento de residuos agroindustriales,
los residuos agroindustriales permiten inducir a los hongos a la producción de
enzimas, debido a que estos residuos tienen compuestos como la lignina, la
celulosa e inclusive pequeñas moléculas de azúcares que no son asimiladas pro el
hongo por sí solos.86
En la escogencia del sustrato para la SSF se debe tener en cuenta el tamaño de
partícula, sobretodo en términos del cociente área/volumen, ya que una alta área
superficial favorece la colonización del sustrato por parte del hongo y la
transferencia de masa de los nutrientes en el medio. Un adecuado tamaño de
partícula también influye en la homogeneidad de las condiciones físicas.87
Se han reportado múltiples residuos agroindustriales usados en la SSF con
distintos microorganismos y para distintos fines. En la lista se encuentran distintos
residuos de provenientes del trigo, el arroz, el maíz, la caña de azúcar, la soya, el
vino de uva, el coco, el banano, el té, el aceite de palma, la manzana, la mostaza,
entre otros88. Encontrando que cada industria puede tener residuos de distinta
naturaleza y por ende con distintos fines para la SSF, como el caso de trigo, cuyos
residuos pueden ser el salvado (el salvado de trigo es el residuo más utilizado en
86 Gowthaman M.K., Krisma C. Moo-Young M. Fungal solid state fermentation. En Khachatourians G.G. (Ed) Applied Mycology and Biotechnology, 2001. 309 - 310 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library 87 Ibíd. 88 Pandey A., Selvakumar C. Poonam N. Solid State Fermentation for the production of industrial enzymes. School of Applied Biological and Chemical Science, University of Ulster, Coleraine BT52 1 AS, N. Irelan, UK
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41
procesos con SSF), la harina, la cascarilla, cada uno ofreciendo compuestos
químicos como la lignina y la celulosa en distintas proporciones.
1.4.5. Ventajas de la SSF sobre la SmF
Como se ha mencionado previamente, la fermentación en estado sumergido
(SmF), ha sido más empleada que la fermentación en estado sólido. Sin embargo,
recientes estudios muestran que la SSF puede llegar a optimizar los procesos de
producción de enzimas. En especial se encuentra que en el caso de enzimas que
son producidas como metabolitos secundaros (caso de la lacasa), la SSF tiene las
siguientes ventajas:89
- Se le permite al micelio penetrar al sustrato sólido de forma más efectiva.
- El escalamiento de cultivos implica el manejo de líquidos no newtonianos
con altas viscosidades. Entre más sumergido se tengan los sólidos, se
tendrá mayor consumo de energía para evitar gradientes de velocidad, de
concentración y de temperatura.
- La calidad del producto generalmente es mayor en la SSF
Los costos de implementar las dos técnicas también han puesto en ventaja a la
SSF sobre la SmF. Targerdy (1996) compara la producción de la celulasa por las
dos técnicas, encontrando que los costos de la SmF son de $ 20/kg, mientras que
89 Gowthaman M.K., Krisma C. Moo-Young M. Fungal solid state fermentation. En Khachatourians G.G. (Ed) Applied Mycology and Biotechnology, 2001. 324 p. Recuperado el 6 de junio de 2007 de la base de datos E-Library
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42
La producción de la enzima por SSF es de $ 0,2/Kg90. Esto demuestra que el
manejo de altos volúmenes de líquido en las fermentaciones con hongos repercute
directamente en los costos de producción, haciendo el proceso incompetitivo.
1.5. DECOLORACIÓN MICROBIANA DE TINTES
1.5.1. Problemática Ambiental
Los tintes sintéticos son utilizados extensamente en la industria. Se producen más
de 10000 tintes con una producción anual de más de 700000 toneladas. Entre el 5
y el 10% de los tintes producidos a nivel industrial son desperdiciados y terminan
en efluentes naturales. Estos tintes son responsables del color, el cual es el primer
contaminante del agua. Cantidades mínimas de tintes entre 10–50 mg/L son
altamente visibles y afectan drásticamente la estética de agua y las propiedades
de ésta como la solubilidad de gases.91 La remoción de contaminantes con color
es más importante que las de los materiales incoloros debido a que estos
repercuten negativamente en la demanda bioquímica de oxígeno (BOD). Los tintes
son difíciles de remover debido a que estos son producidos para resistir la
humedad, el jabón, el agua, la luz y agentes oxidantes.92
90 Pandey A., Selvakumar C. Poonam N. Solid State Fermentation for the production of industrial enzymes. School of Applied Biological and Chemical Science, University of Ulster, Coleraine BT52 1 AS, N. Irelan, UK 91 Wong Y., Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat. Res. Vol. 33, No. 16, pp. 3512-3520, 1999 92 Ibíd.
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43
Los tintes no son susceptibles de forma uniforme al ataque microbiano, debido a
que estos tienen una diversidad de estructuras que hacen que la degradación de
estos no sea sencilla. Entre las múltiples estructuras que poseen los tintes, se
encuentran grupos ácidos, básicos, reactivos, azo, diazo, antraquinónicos, y de
complejos metálicos. Lo anterior hace que lo único que estos tintes tengan en
común es la habilidad de absorber luz en el espectro visible, lo que hace que las
reacciones de degradación de estos compuestos puedan ser monitoreadas con
espectrofotometría.93
Los tintes de la industria textil son de los que acaparan el mayor interés en la
actualidad debido a su potencial toxicidad y a que son cancerigenos. Esto se debe
a que estos compuestos tienen como base la benzidina y otros compuestos
aromáticos. Se ha demostrado que los tintes tipo azo y los basados en nitrógeno
son reducidos en el medio ambiente resultando en aminas tóxicas. Los tintes
antraquinónicos son más resistentes a la degradación debido a que están
compuestos de acoplados de aromáticos que resultan ser altamente resistentes a
la decoloración por altos periodos de tiempo. Los tintes básicos son muy brillantes,
y los basados en complejos metálicos liberan metales altamente carcinógenos al
medio ambiente. Sumado al impacto de los tintes en el medio ambiente, se tiene
también el problema de que muchas de las estructuras químicas de los tintes son
93 Banat I., Nigam P., Singh D. Marchant R. Microbial decolorization of textile-dyecontaining effluents: A review. Bioresource Technology, Volume 58, Issue 3, December 1996, Pages 217-227
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desconocidas y la información disponible de éstos (si son dispersos, básicos, etc)
no es relevante al momento de analizar técnicas de remoción del color.94
En Europa y Estados Unidos la legislación cada vez es más estricta en cuanto a la
exigencia a las industrias textiles a remover el color de las aguas de desperdicios
antes de depositar éstas en el ambiente. Por tal razón, las industrias de textiles
han tenido la necesidad de tener dentro de sus facilidades una planta de
tratamiento de aguas residuales. La investigación en técnicas de decoloración son
de interés actual y están más dirigidas al uso de técnicas biológicas, debido a que
además de ser más efectivas, son más limpias, económicas y de fácil uso.95
1.5.2. Métodos de Decoloración
Algunas de las técnicas utilizadas tradicionalmente para la decoloración de tintes
son la floculación físico-química combinada con flotación, electroflotación,
floculación con Fe(II)/Ca(OH)2, filtración por membranas, coagulación
electrocinética, destrucción electroquímica, intercambio iónico, irradiación,
precipitación, ozonización, método Katox (con carbón activado y aire), entre otros
métodos. Sin embargo, estos métodos implican el uso de químicos, la formación
de lodos y la dificultad en el manejo de residuos. Además, muchos de estos
94 Ibíd. 95 Ibíd.
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45
métodos resultan ser costosos y en algunos casos deficientes en la decoloración o
aún peor, en la remoción de compuestos contaminantes96.
Desde 1980 se ha estudiado la degradación de tintes con hongos de putrefacción
blanca como el Phanerochaete chrysosporium. El mecanismo de remoción de
color se le ha atribuido a las enzimas LiP, MnP y a la lacasa (ver Figura 15), las
cuales son las responsables de la actividad lignolítica en este tipo de hongos (ver
seccion 1.3.2). La especie P. chrysosporium ha sido estudiada en la degradación
de compuestos xenobióticos, los cuales son compuestos de estructura aromática
como los PAHs (hidrocarburos aromáticos policíclicos), los fenoles clorinados,
pesticidas TNT, y tintes industriales97. Varios autores han reportado la factibilidad
de algunos hongos para decolorar ciertos tintes industriales, como se resume en la
Tabla 4.
Tabla 4. Degradación de tintes por parte de hongos98.
Especie
Tinte/ Concentración
Remoción/ tiempo
Mecanismo
Referencias
Aspergillus sojae B-10
Amaranth (10 mg/1) 97.8% (5 days) No reportado
Ryu & Weon (1992)
Sudan III (10 mg/l) 97.4% (5 days) No reportado
Congo Red (10 mg/l) 93.0% (5 days) No reportado
Myrothecum verrucaria
Orange II (200 mg/1) 70.0% (5 h) Adsorción
Brahimi-Horn et al. (1992)
10B (Blue) (200 mg/1) 86.0% (5 h) Adsorción
RS (Red) (200 mg/l) 95.0% (5 h) Adsorción
Myrothecum sp.
Orange II (100 mg) 25-91% (24 h) Adsorción Mou et al. (1991)
96 Ibíd. 97 Ibíd. 98Adaptado de Ibíd.
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46
10B (Blue) (200 mg/l) 58-98% (24 h) Adsorción
RS (Red) (100 mg/1) 81-98% (24 h) Adsorción
Neurospora crassa
Vermelho Reanil P8B (16-32 mg/1) 89-91% (24 h) Adsorción
Corso et al. (1981)
Pycnoporus cinnabarinus Efluente industrial 90% (3 días)
Oxidasas extracelulares
Schliephake et al. (1993)
Trichoderma sp. Efluente Industrial 85% (3 días) Enzimas lignolíticas
Prasad & Joyce (1991)
Candida sp. Procyon Black SPL (100 mg/1) 93.8% (2 h) Adsorción
De Angelis & Rodrigues (1987)
Procyon Blue MX2G (100 mg/l) 96.8% (2 h) Adsorción
Procyon Red HE7B (100 mg/l) 98.9% (2 h) Adsorción
Procyon Orange HER (100 mg/I) 96.8% (2 h) Adsorción
Como se observa en la Tabla 4, los hongos tienen distintas formas de degradar o
de remover los tintes. Algunos actúan adsorviendo el color y acumulándolo y otros
degradándolo por medio de enzimas extracelulares. Field et al. (1993) se centra
en los organismos con actividad lignolítica para degradar tintes, aparte del
mencionado P. chrysosporium, se encuentran las especies Trametes versicolor,
Trametes hirsuta y demas hongos de putrefacción blanca que son capaces de
degradar compuestos como los mostrados en la Figura 15.
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47
Figura 15. Algunas estructuras de compuestos xenobióticos.99
1.5.3. Tintes que Decolora la Lacasa
Wong et al. (1999) muestran que la lacasa de T. versicolor es capaz de degradar
tintes de naturaleza distinta. A pesar que los tintes tipo antraquinónicos son los
sustratos de la enzima debido a que muestran correspondencia con el modelo de
Michaelis Menten, el líquido extracelular del cultivo contiene otros metabolitos
capaces de degradar tintes de distintas estructuras químicas (ver sección 1.2.4).
Entre lo reportado por el autor, la lacasa del T. versicolor es capaz de degradar
tintes antraquinónicos, índigos y azo, cuyas estructuras químicas se muestran en
la Figura 16.
99 Field J. Jong E. Gumersindo F, de Bont J. Screening for lignolityc fungi applicable to the biodegradation of xenobiotics. Trends in Biotechnlogy 1993, 11:44-49.
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Figura 16. Tintes degradados por líquido extracelular de T. versicolor. Acid
Green 27 (antraquinónico), Acid Violet (azo) e Indigo Carmine (índigo)100
Las estructuras químicas de los tintes de la Figura 15 y de la Figura 16 tienen
similitudes en tanto que están formadas por anillos aromáticos. Esto podría
permitir que la lacasa sea utilizada para una alta gama de compuestos
xenobióticos. Field et al. (1993) reporta la habilidad de la enzima de degradar
clorofenoles (con uno o más radicales de cloro), clorometoxifenoles,
cloroguaiacoles, clorocatecoles.101 Esto muestra el alto potencial que tiene la
lacasa dentro de una amplia gama de compuestos, justificando las múltiples
aplicaciones que tiene actualmente y dejando campo a aplicaciones futuras.
Osma et al. (2006) muestra que la lacasa de T. pubescens, aplicada directamente
sin purificar, es capaz de degradar dos clases de tintes de diferentes estructuras
químicas, En el estudio se demuestra que el tinte antraquinónico Remanzol
Brilliant Blue puede ser degradado en un 40,9% en un tiempo de 4 horas y que el
tinte Methyl Green, de estructura de trifenilmetano, es degradado en un 23,2% en
100 Ibíd. 101 Ibíd.
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49
4 horas. Los autores comparan la degradación de estos tintes con la enzima
comercial, encontrando que para el caso del tinte antraquinónico, el extracto del
cultivo de T. pubescens se desempeña mejor y en el otro se desempeña de forma
similar, mostrando que esta especie tiene potencial en la degradción de tintes de
distinta naturaleza química. Las estructuras químicas de los compuestos de
muestran en la Figura 17.
Figura 17. Tintes degradados por lacasa de T. pubescens.
Remanzol Brill iant Blue (izquierda). Methyl Green (derecha).
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2. CONSIDERACIONES PRELIMINARES
2.1. RESIDUOS AGROINDUSTRIALES
2.1.1. De Industria del Aceite de Palma.
Los residuos más comunes del proceso de la extracción de la palma son
conocidos como fibra, tusa y cuesco (Figura 18). La tusa resulta de la primera
etapa de extracción del aceite de palma, la cual resulta de pasar el racimo de
frutos por unos rastrillos que retiran al máximo los frutos; sin embargo, en este
residuo queda mucha pulpa del fruto remanente. Una vez se extraen los frutos, el
aceite crudo se extrae pro compresión dejando un bagazo de donde se obtiene las
almendras de palmiste como se mencionó previamente y el remanente es el
material exprimido del fruto que se denomina fibra. El cuesco es la cobertura de la
semilla de la palma y es el residuo de aspecto más rígido y menos propenso a
descomponerse102. De los tres residuos de la palma, se escogióuno sólo basado
en la primera etapa del proyecto, la cual fue la caracterización en cuanto a
contenido de lignina y celulosa (Ver sección 4.1). A continuación se muestra un
breve contexto de la industria de palma y su impacto en la economía colombiana.
102 García Nuñez, J.A. Cenipalma, Bogotá. Conversaciones personales. Febrero de 2007.
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51
Figura 18. Residuos de la extracción del aceite de palma y palmiste. Tusa
(izquierda), fibra (centro), cuesco (derecha)103
La palma de aceite es un árbol de origen africano y crece en climas tropicales
cálidos por debajo de 500 metros sobre el nivel del mar. El nombre científico de la
palma es Elaeis guineensis Jacq; coloquialmente conocida como palma africana
de aceite. En Colombia, la palma fue introducida en 1932, pero hasta 1942
comienza su uso comercial. Hoy en día los cultivos de palma africana en el país
alcanzan las 270.000 hectáreas, colocándolo como el primer productor de palma
en Latino América y el cuarto productor mundial de aceite de palma. 104
Los frutos del aceite de palma se arreglan en forma de racimos (Figura 19) de 10 a
40 kilogramos, los cuales pasan de un color violeta oscuro a un color naranja
vistoso al madurar los frutos. Cada fruto posee una sola semilla denominada
palmíste que está protegida por una almendra rígida conocida como cuesco. El
procesamiento del fruto de la palma consta de dos etapas, la extracción del aceite
crudo de palma y de las almendras o del palmiste. Del primer proceso se obtiene
un bagazo de donde se recuperan las almendras, las que posteriormente se
someten a impacto para retirar el palmíste. Del palmíste se obtiene el aceite de
palmíste y la torta de palmíste y del fraccionamiento del aceite de palma se
103 Fuente: Elaboración propia. Residuos donados por Cenipalma, Bogotá D.C. Febrero de 2007. 104 FEDEPALMA: Recuperado el día 15 de junio de: http://www.fedepalma.org/palma.htm
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obtiene la oleína y la estearina de la palma, de los cuales se extraen oleoquímicos
como margarinas, jabones, entre otros.105.
Figura 19. Racimos de la palma africana106.
El aceite de palma con fines alimenticios es el segundo aceite más consumido en
el mundo. Sin embargo, estudios recientes se orientan a producir múltiples
productos a partir de este aceite, los cuales se denominan productos
oleoquímicos, entre los que se encuentran los ácidos grasos, ésteres grasos,
alcoholes grasos, compuestos de nitrógeno graso y glicerol, elementos esenciales
en la producción de jabones, detergentes, lubricantes para pintura, barnices,
gomas y tinta107.
2.1.2. De Industria de Caña de Azúcar
El residuo que se utiliza de la industria de la caña es el bagazo de caña de azúcar,
que resulta de la extracción del “jugo o guarapo” de la caña de azúcar. La Figura
20 muestra el aspecto del bagazo después de la extracción del azúcar.
105 Ibíd. 106 Ibíd. 107 Ibíd.
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53
Figura 20. Bagazo de caña de azúcar (zona de Santander, Colombia)108
Así como la industria del aceite de palma, la industria del azúcar caña ha
encontrado nuevas aplicaciones del proceso obteniendo subproductos de interés
similar al del producto principal. Incauca S.A. tiene un proceso que consta de tres
pasos, el cultivo, la cosecha y la transformación de la caña de azúcar en azúcares,
alcohol y sus derivados. El bagazo de caña, a pesar de ser residuo de este
proceso, es utilizado actualmente para obtener bioetanol que sirve como
combustible industrial109. En el ámbito mundial, Colombia es el séptimo productor
de caña de azúcar110.
2.1.3. De Industria del Café
El residuo utilizado de la industria de café es la cáscara de café. Es bien sabido
que el café es un fruto, pero el producto se obtiene de la semilla, dejando como
residuo principal la cáscara. Existen múltiples variedades de café, de acuerdo a la
108 Fuente: Elaboración propia. Residuos adquiridos personalmente. 109 Incauca S.A. Recuperado el día 15 de junio de: http://www.incauca.com/ 110 Organización de las Naciones Unidas Para la Agricultura y Alimentación. Recuperado el día 11 de octubre de 2006 de: http://www.fao.org/es/ess/top/commodity.html?lang=es&item=489&year=2005
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zona del país, a la resistencia a microorganismos y a otros factores.111 El café
adquirido es Variedad Colombia de la zona de Santander y debido a que la
cáscara se descompone muy rápido, fue adquirido en forma de cereza y
despulpado manualmente (Figura 21).
Figura 21. Cáscara de café variedad Colombia112.
Colombia es el cuarto productor de café a nivel mundial según la
ONU113.Colombia actualmente tiene más de 300.000 hectáreas cultivadas de café
y se estima que produce entre 10 y 12 millones de sacos al año. El esfuerzo de
Cenicafé, ente investigativo de la Federación Nacional de Café de Colombia, ha
sido orientado hacia el ahorro de agua en el proceso de producción del café,
desarrollando el método Becolsub que reduce el uso de agua de 40 l/kg a 0,6 l/kg.
El proceso de extracción de la semilla de café consta de tres pasos: despulpado,
111 Canicafé. Recuperado el día 15 de junio de: http://www.cenicafe.org/modules.php?name=Variedades_de_Cafe. 112 Fuente: Elaboración propia. Residuos adquiridos personalmente. 113 Organización de las Naciones Unidas Para la Agricultura y Alimentación. Recuperado el día 11 de octubre de 2006 de: http://www.fao.org/es/ess/top/commodity.html?lang=es&item=489&year=2005
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desmucilaginado y lavado. Del despulpado es que se obtiene la cáscara que es
distinta al mucílago, que es otro residuo de la producción de café114.
2.2. TINTES INDUSTRIALES Y ENZIMA COMERCIAL
2.2.1. Novozymes Suberase®
Suberase® es un producto de Novozymes y fue donado pro Coldanzimas S.A.,
Bogotá D.C. La enzima es obtenida por medio de fermentación en estado
sumergido con una especie genéticamente modificada de Aspergillus oryzae. La
enzima es purificada y preservada para distribuirla en estado líquido.115
2.2.2. Tintes Hunstman®
Los tintes fueron donados a través de Hunstman S.A., Bogotá D.C. La Tabla 5
describe de forma breve estos tintes.116
114 Cadena G. DESARROLLOS CIENTÍFICOS DE CENICAFÉ EN LA ÚLTIMA DÉCADA Recuperado el día 15 de junio de: http://www.accefyn.org.co/PubliAcad/Periodicas/Volumen29/110/08_89_100.pdf. 115 Ficha de Datos del Producto de Novosymes®. Suberase®. Válido a partir de febrero 17 de 2007. Novozymes Latin America Ltda. 116 Hojas Datos de seguridad de Hunstman Textile Effect. Códigos de productos: Negro Super 1907610. Negro Teransil 1258983. Azul Teransil 1486814
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Tabla 5. Datos suministrados por Hunstman S.A de los tintes industriales.
Nombre
Tipo CAS Nombre Sistemático Estructura Porcentaje
Negro Super
Azo 17095-24-8 4-amino-5-hidroxi-3,6-bis[[4-[[2-(sulfonatooxi)etil] sulfonil]fenil]azo]naftaleno-2,7-disulfonato de tetrasodio
70-80%
Azo 481066-69-7
Disodium 3,5-diamino-2-[(2-sulfophenyl)azo] benzoate, reaction products with diazotized 2-[(4-aminophenyl)sulfonyl]ethyl hydrogen sulfate,sodium salts
No especificada 8-12%
Azo 577954-20-2
2-Naphthalenesulfonic acid, 7-amino-4-hydroxy-8-[[2-sulfo-4-[[2-(sulfooxy)ethyl]sulfonyl]phenyl]azo]-, potassium sodium salt, coupled with diazotized 2-[(4-amino-5-methoxy-2-methylphenyl)sulfonyl]ethyl hydrogen sulfate
No espedificada 20-30%
Negro Teransil
Azo 13301-61-6 ((4-((2,6-Dicloro-4-nitrofenil)azo)fenil)etilamino) ropanonitrilo
Azul Teransil
Antraqui- nónico
No específicado
No especificado No especificado -
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3. METODOLOGÍA Y DISEÑO EXPERIMENTAL
3.1. MATERIALES
Los materiales utilizados en este trabajo son:
Microorganismo: Trametes pubescens (CBS 696.94). Donado por el grupo BBG de
la Universitat Rovira i Virgili.
Otro material donado: Negro Super, Negro Teransil y Azul Teransil de Hunstman®.
Donados por Hunstman Colombia, 2007. Suberase®, donado pro Coldanzimas,
2007.
Residuos agroindustriales: tusa, fibra y cuesco de palma (Ver Sección 502.1.1),
donados por Cenipalma, 2007. Cáscara de café variedad Colombia y bagazo de
caña de azúcar, adquiridos de la región rural de Suaita, Santander.
Insumos: ABTS (Sigma A-1888), ácido succínico, acido sulfúrico industrial 98%,
dicromato de Potasio, hidróxido de Sodio, sulfato amónico ferroso. Ferroína, medio
mínimo de glucosa y sales, insumos para electroforesis en gel SDS-page.
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Equipos: Espectrofotómetro Varian, Carry 50. Departamento de Ingeniería
Química, Universidad de Los Andes.
3.2. METODOLOGÍA
3.2.1. Caracterización de Residuos
En esta etapa del proyecto se tiene un sólo factor categórico correspondiente al
tipo de residuo con cinco niveles correspondientes a la fibra, el cuesco, la tusa, la
cáscara de café y el bagazo de caña. Las respuestas son la humedad, el
contenido de lignina, el contenido de hemicelulosa, el contenido de solubles en
agua y el contenido de solubles en alcohol-benceno. Todos los ensayos se
realizan por triplicado y se reportan como el promedio más o menos la desviación
estándar. Estas pruebas se realizaron en conjunto con Claudia Loboguerreo.
Reducción de tamaño:
Las muestras de palma y bagazo fueron reducidas en tamaño en un molino
rotatorio CONDUX D640. Para poder ser introducidas al molino, estas muestras se
esterilizaron con formaldehído (10:1 agua-formaldehído) y secadas a 100 º C por 2
h. El cuesco fue tamizado y se tomó lo que se retuvo en la malla 100 (150 micras),
que corresponde a la almendra del fruto de palma. Lo que retienen las mallas 60 y
40 son fibrillas y otros residuos que no son cuesco. Todos los análisis
subsecuentes se realizan a partir de las muestras tratadas.
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Determinación de humedad:
La humedad fue detectada en un montaje con reactivo Karl Fisher® modelo DV
400, acoplado a sistemas de adquisición de datos. Este artefacto realiza la
titulación de la humedad y reporta un volumen de reactivo de Karl Fisher
consumido por el agua de humedad de la muestra. El aparato se calibra con agua
para saber la relación entre miligramos de agua y mililitros de Karl Fisher y así
determinar el contenido de humedad de la muestra.
Determinación de lignina:
La lignina es un constituyente de la pared celular, es un polímero amorfo que
contiene grupos metoxilos e hidróxidos. La lignina se determina de acuerdo al
método de Klason, donde se exponen aproximadamente 2 gr. de muestra a ácido
sulfúrico 24 N., se deja a 20º C. durante 2 horas y se llevan a calentamiento con
reflujo por 4 horas. El residuo de la digestión es la lignina, único compuesto que
resiste el ácido sulfúrico (Rodríguez de Cáceres L. 1978).
Determinación de hemicelulosa:
La celulosa es un polisacárido resultante de la unión de monómeros de glucosa.
Esta ha sido clasificada arbitrariamente en alfa, beta y gamma celulosa de
acuerdo a como son cuantificadas experimentalmente. La beta y gamma celulosa
en conjunto conforman la hemicelulosa, o celulosa de menor cadena (TAPPI
Standards, 1968).
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60
La hemicelulosa se determinó de acuerdo al método diseñado por Cross Bevar.
Una muestra de aproximadamente 2 gr. se disuelve en 100 ml. de NaOH al 17.5%
y al cabo de 30 min. se agrega 100 ml. de agua destilada. Se filtra la solución
anterior y se toma 25 ml. del filtrado, se agrega 10 ml. de dicromato de potasio 0.5
N. y 90 ml. de ácido sulfúrico 24 N. Después de 15 min., se agrega 50ml. de agua
destilada y 2-4 gotas de ferroína. La solución resultante se titula con sulfato
amónico ferroso 0.1 N. hasta color púrpura. Por aparte, se realiza un blanco
sustituyendo el filtrado por 12.5 ml. de NaOH al 17.5% y 12.5 ml. de agua, el
volumen para los cálculos es la diferencia entre el volumen de la titulación del
filtrado menos la titulación del blanco (Rodríguez de Cáceres L. 1978).
Determinación de solubilidad en agua:
La solubilidad en agua permite tener un estimado del contenido de sales
orgánicas, azúcares, gomas, pectinas, porciones de taninos y pigmentos. Esta
prueba se realizó tomando 2 gr. de la muestra, se agrega 300 ml. de agua
destilada y se deja por 48 h. Se pesa el residuo y por diferencia se conoce los
solubles (Rodríguez de Cáceres L. 1978).
Determinación de solubilidad en alcohol benceno:
El contenido de solubles en alcohol-benceno es una medida de la cantidad de
ceras, grasas, resinas, aceites, colorantes orgánicos (clorofila), taninos y gomas.
Se determina mediante un equipo de extracción soxlet, colocando 2 gr. de muestra
en un dedal de extracción y en el matraz del extractor 150 ml. de mezcla 3: 1
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61
benceno-alcohol, al cabo de 5 horas se retira la muestra y se determinan los
solubles por diferencia (Rodríguez de Cáceres L. 1978).
3.2.2. Fermentación en Estado Sólido
Estas pruebas se dividen en dos etapas, La primera etapa es la evaluación de
cultivos con tres residuos. La segunda etapa corresponde a la determinación del
día de máxima producción de lacasa en cultivos con un sustrato escogido en la
primera etapa. La respuesta del experimento en ambos casos es la actividad de
lacasa. En la primera etapa se tiene un factor categórico correspondiente al tipo de
sustrato con tres niveles correspondientes a la cáscara de café, el bagazo de caña
y la fibra de palma. La respuesta en este experimento es la actividad de lacasa y
su valor se toma por duplicado. En la segunda etapa, el factor categórico sólo
tiene el nivel de la fibra que es el sustrato escogido. Los experimentos se realizan
por triplicado. La Tabla 6 muestra el diseño experimental.
Tabla 6. Diseño experimental para primera etapa de la SSF
Factor Clase Niveles Sustrato Categórico Fibra* Bagazo Café
* Residuo seleccionado entre los de la palma
El cultivo en estado sólido se realiza tomando tres plugs de 7mm de la especie T.
pubescens (conservada en agar malta y subcultivada cada dos meses) y se lleva a
un medio de dos fases, la líquida es un medio con mínimo de sales y glucosa y la
sólida es el residuo industrial. Las condiciones en la primera etapa son 3g
sólido/20ml líquido y 25º C y en la segunda etapa son 5g sólido/30ml líquido y 30º
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C117. La actividad de lacasa se determina por medio de espectrofotometría con la
molécula ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) basado en
el método descrito por Niku-Paavola et al. 1990118. Los resultados de la actividad
se expresan en U/l. Para información más detallada de estos procedimientos
consultar la sección de Anexos. (Ver ANEXO 2 y ANEXO 3)
3.2.3. Degradación de Tintes
Esta etapa tiene dos factores categóricos: el tinte y el extracto de la lacasa (T.
pubescens y comercial). La respuesta del experimento es el porcentaje de
degradación.
Se mide el porcentaje de degradación por medio del espectrofotómetro de forma
que el cambio de absorbancia con respecto al tiempo se divide entre la
absorbancia inicial. La tendencia lineal entre la absorbancia y la concentración se
comprobó para el tinte Negro Teransil, único que muestra decoloración.
La concentración del tinte se ajusta de forma que se tenga más de una unidad de
absorbancia a la máxima longitud de onda. Para el Negro Teransil la
concentración inicial es de 91mg/l que corresponde a 1,3 unidades de absorbancia
a 575 nm. (Ver ANEXO 4)
117 Osma J.F, Toca Herrera J.L, Rodríguez Couto S. Banana skin: A novel waste for laccase production by Trametes pubescens under solid-state conditions. Application to synthetic dye decolouration, Dyes and Pigments, Volume 75, Issue 1, 2007, Pages 32-37 118 Ibíd.
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Debido a que la decoloración de los tintes en cuestión es muy lenta en
comparación con estudios realizados con tintes analíticos de naturaleza química
similar, se decidió realizar una electroforésis en gel SDS-Page. Este ensayo fue
realizado con el extracto comercial Suberase® y con extracto de T. pubescens, el
cual fue liofilizado para concentrarlo siete veces y resuspenderlo directamente en
buffer de carga. El liofilizador es un equipo LABCOMCO perteneciente al LAMFU
del departamento de microbiología.
Figura 22. Equipo de liofilización. El gel se hizo con poliacrilamida 5%/12% y la tinción se realizó con Azul de
Coomassie G250 al 2%. Se utiliza SDS para eliminar cargas en los aminoácidos y
se usa un extracto comercial de aproximadamente 2907U/l. El Marcador de peso
es Biorad: Catalog 161-0318, Control: 300001371
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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. CARACTERIZACIÓN DE RESIDUOS
4.1.1. Resultados de Caracterización
El contenido de humedad de los residuos se observa en la Figura 23. No hay
evidencia estadística que distinga entre el contenido de humedad del bagazo y la
tusa ya que las barras de error se cruzan. La humedad estimada del cuesco y la
fibra sí muestra ser menor que las otras dos y diferente entre ellas. Se esperaba
que el cuesco y la fibra tuvieran un contenido bajo de humedad, debido a la
procedencia del cuesco y a que la fibra se prensa para extraer aceite.
Figura 23. Resultados de humedad de las muestras.
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El resultado de contenido de lignina (Figura 24) muestra que los residuos de
palma exhiben el mayor contenido de ésta. El café tiene el menor contenido de
lignina por ser menos rígido. Los resultados de la palma se compararon con el
estudio de García et al. 1991, en donde se estudian residuos de palma
colombiana, mostrando similitud en la tendencia en el contenido de lignina de los
tres residuos119.
Figura 24. Resultado de contenido de lignina en base húmeda
El resultado de contenido de hemicelulosa (Figura 25) muestra que hay diferencia
significativa entre el contenido de ésta en los tres residuos de palma. La tusa
muestra mayor contenido de hemicelulosa, de lo cual se puede inferir que el
contenido total de carbohidratos en esta muestra es mayor. El contenido de
celulosa en los otros residuos no fue determinado, pero Ferrer et al. (2002) reporta
119 García J. Determination of Kinetic Constants and Thermal Modeling of Pyrolisis of Palm Oil Mill Solid Wates. University of Georgia, 1991
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un 52.25% de celulosa total en el bagazo de caña venezolano120 y Peñaloza et al.
(1985) muestra un contenido de celulosa en la cáscara del café del 18.65%121.
Figura 25. Resultado de contenido de hemicelulosa en residuos de palma
Los resultados de solubles en agua de la Figura 26 muestran que los residuos de
palma tienen un bajo contenido en comparación con los otros residuos. Esto
muestra que estos residuos son deficientes en azúcares y sales minerales, por
ende, estos residuos pueden ser de difícil acceso al microorganismo. El café tiene
alta solubilidad en agua en parte por su contenido en taninos cercano al 2.33%,
cafeína 0.68% y minerales como el potasio 1.39%122. Sin embargo, el contenido
de taninos y cafeína puede influir negativamente en el uso de café en cultivos con
microorganismos123. El bagazo de la caña muestra alta solubilidad en agua debido
120 Ferrer J., Páez G., Arenas de Moreno L. , Chandler C., Mármol Z. y Sandoval L. Cinética de la hidrólisis ácida de bagacillo de caña deazúcar. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2002, 19: 23-33 121 Penaloza W., Molina M., Gomez brenes r., Bressani R. Solid-State Fermentation: an Alternative to Improve the Nutritive Value of Coffee Pulp. APPLIED AND Environmental Microbiology, Feb. 1985, p. 388-393 122 Ibíd. 123 Murrieta D., Mata G., Iglesias L. Cambios en la producción de lacasa por el hongo Pleurotas Pulmonarius (Fr.) Quél. Cultivado en Pulpa de Café en Confrontación con Tricoderma Vides Pers., Un Moho Contaminante. Foresta veracruzana, año/vol. 4, número 001. Universidad Veracruzana. Xalapa, México. Pp 47-52.
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67
a que este contiene azúcar a pesar que se ha llevado a procesos de extracción del
jugo de caña. Esta observación es muy importante debido a que el contenido de
azúcares hace más accesible este residuo al hongo.
Figura 26. Resultado de solubles en agua
El contenido de solubles en alcohol benceno no es distinguible entre los residuos
de palma. Sin embargo de esto se puede inferir que los residuos de palma tienen
contaminantes como ceras, grasas y pigmentos que pueden influir negativamente
en el crecimiento del hongo (Figura 27).
Figura 27. Resultados de solubilidad en alcohol benceno
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68
4.1.2. Selección del Residuo de Palma
En la escogencia del residuo de palma se debe tener en cuenta dos aspectos
fundamentales: el primero es el contenido de lignina de estas muestras que induce
la formación de lacasa y el segundo es la facilidad que este medio le puede
ofrecer al hongo para su crecimiento.
El cuesco presenta el mayor contenido de lignina de los tres, superando en casi un
10% el contenido de lignina de la fibra y en un 20% el de la tusa. La tusa es el
compuesto con menor cantidad de lignina, siendo comparable con el contenido del
bagazo de caña.
Tanto en contenido de lignina y celulosa, la fibra está en un intermedio entre los
dos compuestos. Por ende, la fibra puede favorecer tanto la adaptación del hongo
al medio como la inducción a la formación de lacasa. Además, la fibra supera en
casi un 20% el contenido de lignina del bagazo de caña. Por lo tanto, para los para
la fermentación en estado sólido se escoge la fibra de la palma como residuo
proveniente de la extracción del aceite de palma.
4.1.3. Relevancia del Estudio de Residuos de Distinto origen
Aunque los tres residuos de palma muestran mayor contenido de lignina que el
bagazo de caña y la cáscara de café, el estudio de residuos de distinto origen
hace que se puedan evaluar distintos factores que favorecen tanto el crecimiento
del hongo como la inducción a la formación de lacasa.
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La cáscara de café a pesar de su bajo contenido de lignina puede ofrecer un
medio más accesible al hongo, aunque el contenido de taninos y cafeína puede
inhibir el crecimiento de éste. Al mismo tiempo, la formación de lacasa podría ser
inducida de forma similar que en los otros residuos, haciendo que un mayor
contenido de lignina no sea relevante en la obtención de la enzima.
El bagazo es un residuo cuya importancia radica en que el contenido de lignina es
intermedio entre la fibra de palma y la cáscara de café. Además, se observa que
los solubles en agua pueden proporcionar azúcares y sales que favorezcan el
crecimiento del hongo.
La fibra de la palma es el sustrato de mayor contenido de lignina. Sin embargo, el
alto contenido de lignina hace que el medio sea rígido y puede dificultar el acceso
del hongo a las fuentes de carbono. Sin embargo, el hongo podría adaptarse al
medio a pesar de estas condiciones incrementándose la inducción a la formación
de lacasa.
4.2. FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO
4.2.1. Etapa 1: Efecto del Tipo de Sustrato y del Tiempo
La Figura 28 muestra los resultados de la actividad de lacasa en los sustratos de
fibra, bagazo y cáscara de café.
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Figura 28. Comparación de sustratos en cultivos en estado sólido de T. pubescens
La influencia del tipo de sustrato en la actividad de lacasa se hace evidente con
los resultados de la Figura 28. Se tiene mayor inducción a la actividad de lacasa
en los cultivos de fibra, ya que se observa que las barras de varianza de la Figura
28 no se cruzan antes del día 13, siendo los datos de fibra significativamente
mayores a los de los otros dos residuos. Después del día 13, la actividad de
lacasa en el cultivo de fibra tiende a estabilizarse.
En cuanto al bagazo de caña y la cáscara de café, se observa que antes del
noveno día los cultivos de café muestran baja producción de lacasa,
probablemente debido a que la presencia de taninos y colorantes afecta el
desarrollo del microorganismo124. El bagazo de caña al contener azúcares libres
124 Murrieta D., Mata G., Iglesias L. Cambios en la producción de lacasa por el hongo Pleurotas Pulmonarius (Fr.) Quél. Cultivado en Pulpa de Café en Confrontación con Tricoderma Vides Pers.,
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favorece la adaptación del microorganismo, lo cual se refleja en una producción de
enzima ligeramente mayor a la del cultivo con café. Sin embargo, después del
noveno día, la producción de lacasa en los cultivos de café se dispara y las barras
de varianza de los datos se cruzan con las de los cultivos de caña. Esto hace que
el mayor contenido de lignina del bagazo de caña sea irrelevante en comparación
con el contenido de ésta en la cáscara de café.
También se puede inferir que en los cultivos con los tres residuos la tasa de
producción de lacasa tiende a incrementarse; esto se deduce a partir del cambio
de pendiente de la actividad de lacasa con respecto al tiempo observado en los
resultados de la Figura 28. Lo anterior se debe a que en los primeros días el
microorganismo se está adaptando al medio y está agotando fuentes de carbono
de fácil acceso, como la glucosa y los polisacáridos del sólido (celulosa), haciendo
que la producción de lacasa sea baja. A medida que el tiempo aumenta, la
velocidad a la que el microorganismo produce la enzima se incrementa, lo cual se
puede deber al agotamiento de fuentes de carbono y aumento de la actividad
lignolítica125. Esto concuerda con que la enzima es mayormente producida como
metabolito secundario pero está presente en todas las etapas del metabolismo126.
Un Moho Contaminante. Foresta veracruzana, año/vol. 4, número 001. Universidad Veracruzana. Xalapa, México. Pp 47-52 125 Galhaup C., Wagner H, Hinterstoisser B., Haltrich D. Increased production of laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens. Enzyme and Microbial Technology 30 (2002) 529–536 126 Wong Y., Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat. Res. Vol. 33, No. 16, pp. 3512-3520, 1999
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4.2.2. Etapa 2: Efecto del Tiempo en cultivos de Fibra
En la segunda etapa de las pruebas de la fermentación en estado sólido se
escogió la fibra para analizar el efecto del tiempo y hallar un óptimo en la
producción de la enzima. Cabe notar que las condiciones del experimento se
modificaron un poco respecto a la Etapa 1 (Ver Sección 3.2.2).
En la Figura 29 se observa que el máximo de producción de la enzima
corresponde al día 15 con 3089U/l, pero las barras de varianza se cruzan con el
valor en el día 14; esto hace que no se pueda distinguir entre la actividad de
lacasa en estos dos días. Sin embargo, se evidencia el hecho que en el día 16 no
se tiene un valor de actividad de lacasa máximo, ya que este valor cae
abruptamente a las 2008U/l y de ahí hasta el día 22 tiende a estabilizarse en el
rango entre 2000-2500U/l.
Figura 29. Actividad de lacasa en cultivos con fibra de palma
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73
Esta tendencia de aumento y disminución de la actividad de lacasa durante el
tiempo de cultivo concuerda con resultados obtenidos por autores como Osma et
al. 2007 para cultivos de T. pubescens en estado sumergido con fuentes de
carbono de glicerol, glucosa y cáscara de mandarina127. La especie de
putrefacción blanca Pleurotus ostreatus también muestran este comportamiento
de aumento y disminución de actividad de lacasa con fuentes tanto ricas como
limitadas en carbono y nitrógeno128.
4.3. DECOLORACIÓN DE TINTES
4.3.1. Resultados de Ensayo de Decoloración
Resultados obtenidos en la pre-experimentación con los tres tintes muestran una
decoloración muy lenta, y sólo resultados con Negro Teransil son apreciables. Por
tal razón se hizo la curva de calibración del Negro Teransil. La Figura 30 muestra
los resultados de la decoloración con los otros dos tintes observando datos con
alta varianza, debido a que el cambio color en estos tintes es tan mínimo que no
es detectado por el espectrofotómetro de forma que el resultado sea reproducible.
127 Osma J.F., Saravia V., Toca Herrera J.L. Rodríguez Couto S. Mandarin peelings: The best carbon source to produce laccase by static cultures of Trametes pubescens. Chemosphere, Volume 67, Issue 8,April 2007, Pages 1677-1680 128 Hou H., Zhou J., Wang J., Du C. Yan B. Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye. Process Biochemistry, Volume 39, Issue 11, 30 July 2004, Pages 1415-1419
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74
Figura 30. Decoloración con Negro Super (iz) y Azul Teransil (der.)
La longitud máxima se estimó realizando un barrido en todo el rango de luz visible
(340-800nm) encontrando que la máxima absorbancia para este tinte corresponde
a 575nm, longitud de onda a la cual se hace la curva de calibración (Figura 31).
Figura 31. Barrido de absorbancia para Negro Teransil®
Los resultados de la decoloración del tinte se muestran en la Figura 32. De estos
resultados se calculo que la concentración inicial del tinte es de 91mg/l (1,3
unidades de absorbancia a 575nm) y la concentración final es de 36,4mg/l.
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75
Figura 32. Decoloración de Negro Teransil.
A: extracto de cultivo de 2062U/L. B: extracto de cultivo de 1323U/L.
C: extracto comercial, Suberase®.
Los resultados de la degradación de tintes no son del todo satisfactorios. Osma et
al. 2007 muestra que el extracto de cultivo de T. pubescens y cáscara de banana
es capaz de degradar el tinte Remanzol Brilliant Blue R de Merck® en un 40.9% al
cabo de 4h129. Este tinte analítico es de tipo antraquinónico, por lo que era de
esperarse que el tinte industrial Azul Teransil (Tabla 5) mostrara mayor
sensibilidad a la decoloración, sin embargo, los resultados no confirmaron esto.
En cuanto a los tintes tipo azo, Negro Super y Negro Teransil (Tabla 5), se
esperaba una degradación lenta. Se observa que el tinte Negro Teransil se
degrada en un 40% del color inicial al cabo de 5 días con extracto de cultivo de
2062U/l.
129 Osma J., Toca J., Rodriguez S. Banana skin: a novel waste for laccase production by Trametes Pubescens under solid-state conditions. Application to synthetic dye decolouration. Department of Chemical Engineering, Rovira I Virgili University. Tarragona Spain
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Tabla 7. Estimación de la velocidad inicial de reacción de degradación de Negro Teransil con
lacasa de T. pubescens
Fuente Actividad de Lacasa [U/l]
Velocidad inicial específica* [(mg/l)/(día (U/L))]
T. pubescens 2062 ± 40 2,72E-06 T. pubescens 1323 ± 45 2,29E-06
Comercial 4822 ± 500 5,39E-07 *La dispersión entre los datos es despreciable (Figura 32)
En cuanto al efecto de la actividad enzimática, se observa que la enzima comercial
tiene menor capacidad de degradar el Negro Teransil. La Tabla 7 muestra la
estimación de la velocidad inicial específica; observando que este valor para los
dos extractos del cultivo de T. pubescens es similar, como era de esperarse,
mientras que el de la enzima comercial es menor en un orden de magnitud. Lo
anterior muestra que el hecho que el extracto comercial tenga mayor capacidad de
oxidar el ABTS no se traduce en una mayor capacidad de degradación del tinte.
Este aspecto del mecanismo de reacción de la lacasa en decoloración de tintes ha
sido discutido por varios autores, confirmando que lacasa actúa con mediadores y
no por sí sola en el medio natural130.
Debido a la poca información de la estructura de los tintes, es difícil saber por qué
hay degradación en uno y en los otros no. Por ejemplo, los dos tintes negros
contienen mezclas de compuestos tipo azo, por lo que se esperaría que la
decoloración de ambos tuviera una respuesta similar en el ensayo de
decoloración. Una posible causa responsable de la baja decoloración puede ser
que los tintes tienen dos componentes, uno cromóforo encargado del color y uno
reactivo. En el caso del Negro Super, los compuestos tipo azo son parte del 130 Wong Y., Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat. Res. Vol. 33, No. 16, pp. 3512-3520, 1999
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componente reactivo del tinte [Acuña O. Huntsman Colombia ltda. (Conversación
Personal, junio de 2007)]. Probablemente, la degradación de los componentes azo
y antraquinónico en los tintes no ha sido detectada porque la disminución del color
no es notable ya que se puede estar atacando el componente reactivo mas no el
cromóforo que es responsable del color.
4.3.2. Ensayo de Electroforesis
Los resultados de la electroforesis se muestran en la Figura 33. Esta figura
muestra el gel pasado por el transiluminador, donde se ve la imagen en contraste
e invertida.
Figura 33. Resultado de Electroforesis
La Figura 34 es una adaptación de los resultados de la electroforesis. En ésta
figura se muestra a qué extracto corresponde cada corrida y se estima de forma
gráfica el rango de pesos moleculares.
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Figura 34. Adaptación de electroforesis.
En la Figura 34 se observa que la banda más oscura de la comercial coincide con
una banda del liofilizado En el extracto del hongo, se evidencian cuatro bandas en
el rango de 52-96kDa. En comparación con datos reportados en la literatura, el
peso molecular de dos lacasas de T. pubescens está en el rango de 63-65 kDa131,
aunque se presume la existencia de más isoformas de esta enzima.
131 Shleev S., Nikitina O., Christenson A., Reimann C., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton L. Characterization of two new multiforms of Tra metes pubescens laccase. Bioorganic Chemistry 35 (2007) 35–49
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CONCLUSIONES
- La fibra de palma, al tener un contenido apreciable de celulosa y de lignina,
favorece la adaptación del microorganismo e induce a la actividad de lacasa de
mayor forma que la cáscara de café y el bagazo de caña.
- La máxima actividad de lacasa obtenida en el cultivo con fibra de palma fue de
3089U/l en el día 15 del cultivo. Después del día 15, la actividad cae
abruptamente y se mantiene entre las 2000-2500U/l.
- El extracto del cultivo de Trametes pubescens con fibra de palma degrada el
tinte tipo azo, Hunstman Negro Teransil®, en un 40% en 5 días. La lacasa
comercial, Suberase®, degrada el mismo tinte en un 18% en 5 días. Ninguno
de los dos extractos degrada los tintes de Hunstman Negro Super® (azo) ni
Azul Teransil® (antraquinónico).
- El extracto de cultivo se desempeña de mejor forma que el comercial en la
aplicación de degradación de tintes evidenciando que la lacasa actúa con
compuestos mediadores que se encuentran en el extracto del cultivo.
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REFERENCIAS
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23. Osma J.F., Saravia V., Toca Herrera J.L. Rodríguez Couto S. Mandarin peelings: The best
carbon source to produce laccase by static cultures of Tra metes pubescens.
Chemosphere, Volume 67, Issue 8, April 2007, Pages 1677-1680
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A review. Biotechnology Advances, Volume 24, Issue 5, September-October 2006, Pages 500-
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27. Shleev S., Nikitina O., Christenson A., Reimann C., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton L.
Characterization of two new multiforms of Trametes pubescens laccase. Bioorganic Chemistry
35 (2007) 35–49
28. Shuler M; Kargi F. Bioprocess Engineering: Basic Concepts, 2nd edition Upper Saddle River:
Prentice Hall, Inc., 2002.
29. Wong Y., Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat. Res. Vol. 33, No. 16,
pp. 3512-3520, 1999
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ANEXOS
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ANEXO 1. PRÁCTICA DE CONSERVACIÓN DEL HONGO
Objetiv o:
Conservar el hongo T. pubescens para tener disponibilidad del microorganismo durante la
ejecución del proyecto.
Fundamento Teórico:
El microorganismo T. pubescens (CBS 696.94) se debe cultivar cada tres meses para mantener la
cepa fresca. Se utiliza como medio agar con extracto de malta, el cual le proporciona al hogno
nutrientes necesarios para su crecimiento (Osma et al. 2006).
En la siguiente figura se observa la apariencia del hongo en la caja de petri:
Figura 1. Trametes pubescens en Caja de Petri
Bioengineering & Bioelectrochemistry Group BBG.
Universitat Rovira i Virgili, 2006.
Materiales y Reactiv os:
- Agar con extracto de malta (1,6g malta/1,36 g agar).
- Caja de petri
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- Incubadora
- Nevera
- Aro metálico o plástico
Procedimiento:
1. Inicialmente se tiene una caja de petri con 20mL de agar malta y hongo en la superficie. A
partir de esta muestra, se toma una porción circular del hongo con diámetro de 7-8mm.
Este procedimiento se puede hacer con aro plástico o metálico.
2. Estos círculos se introducen en las nuevas cajas de petri de agar con extracto de malta.
Las cajas de petri se llevan a la incubadora a 30º C. Se espera un tiempo mínimo de dos
semanas para retirar muestra del hongo.
3. Una vez el hongo ha crecido en la caja de petri, se conserva en una nevera a 4º C.
Nota: Cada dos meses se debe repetir el procedimiento para conservar el hongo.
Referencias:
Osma J., Toca J., Rodriguez S. Banana skin: a novel waste for laccase production by Trametes
Pubescens under solid-state conditions. Application to synthetic dye decolouration. Department of
Chemical Engineering, Rovira I Virgili University. Tarragona Spain
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ANEXO 2. PRÁCTICA DE CULTIVO EN ÉSTADO SÓLIDO
Objetiv o:
Emplear la técnica de fermentación en estado sólido con el hongo T. pubescens en distintos
su stratos provenientes de residuos industriales.
Fundamento Teórico:
Los residuos agroindustriales son usados ampliamente como sustratos en la técnica de
fermentación en estado sólido. Esta técnica ha sido ensayada en distintos residuos como el bagazo
de la caña, residuos de trigo, tusa de maíz, residuos de uva, residuos de banana, residuos de
molienda de palma entre otros. La mayoría de los productos que se obtienen por medio de la
técnica son enzimas, las cuales provienen de levaduras, hongos o bacterias dándole un valor
agregado a los residuos agroindustriales. En un proceso de fermentación en estado sólido, el
su strato no sólo provee al microorganismo de nutrientes, sino también le da un medio que le
permita formar una colonia para su crecimiento (Pandey et al. 1999).
Osma et al. 1999 utiliza la técnica de fermentación en estado sólido (SSF) para la obtención de
lacasa por medio de la especie T. pubescens en cáscara de banana. A pesar de tratarse de un
cultivo en medio sólido, se adiciona una solución líquida inicial como medio de cultivo para
garantizar que el hongo tenga acceso a nutrientes como la glucosa y así empiece su crecimiento y
pueda colonizar el medio sólido. Una vez el hongo llega a la fase estacionaria de crecimiento, la
lacasa es producida como metabolito secundario.
La siguiente figura muestra el montaje de fermentación en estado sólido con la especie T.
pubescens en cáscara de banana:
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Figura 1. Cultivo de Trametes pubescens en cáscara de banano
Bioengineering & Bioelectrochemistry Group BBG.
Universitat Rovira i Virgili, 2006.
Materiales y Reactiv os:
- Medio de cultivo (ver procedimiento)
- Material orgánico de desperdicio (caña, palma y café)
- Muestra de Trametes pubescens en caja de petri (Proveniente de práctica 1)
- Hidróxido de potasio 83.17mM
- Erlenmeyers de 250mL con tapón de algodón
- Agua destilada
- Autoclave (esterilizador)
- Incubadora
Procedimiento:
1. Determinación de tamaño de muestra:
Osma et al. 1999 usa 7g de soporte de cáscara de banano, por lo tanto, se hará la relación
proporcional de los gramos de carbohidratos contenidos en los 7g de cáscara de banano y
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los gramos de cada soporte que le permitan al hongo tener acceso a la misma cantidad de
carbohidratos. Para esto se debe tener caracterizado el sustrato (residuos de caña, café y
palma)
2. Preparación de medio de cultivo
El siguiente paso es preparar el medio de cultivo, el cual le proporciona sales,
carbohidratos y vitaminas necesarias para el crecimiento del hongo. Éste se prepara con
los siguientes reactivos en las siguientes proporciones:
Tabla 1. Medio de Cultivo (Rodríguez Couto et al. 2006)
Reactivo Proporción
Glucosa 2 g/l
Sulfato de Amonio. (NH4)2SO4 0.9 g/l
Fosfato diácido de Potasio. KH2PO4 2 g/l
Sulfato de Magnesio. MgSO4 0.25 g/l
Cloruro de Calcio. CaCl2.2H2O 0.1 g/l
Cloruro de Potasio. KCl 0.5 g/l
Tiamina 0.5 g/l
Buffer de ácido cítrico 20mM* -
* Esta solución se prepara a partir de 272.5ml de ácido cítrico 0.1mM y227.5ml de fosfato diácido
de sodio (Na2HPO4)
3. Preparación del soporte y esteril ización:
El soporte se debe adecuar con 30ml de KOH 83.17mM por cada 10g de éste durante una
hora para neutralizar ácidos. Después se lava con agua destilada para retirar el hidróxido y
se deja sumergido en agua fría hasta el día siguiente. Por último el soporte se somete a
esterilización a temperatura de 121º C durante 20min antes de ser usado el hongo.
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4. Preparación del cultivo en estado sólido:
Una vez se determina la cantidad de cada soporte, se toma esta cantidad ya esteril izada,
tres muestras en forma de círculo del hongo que está en la caja de petri (práctica 1) y 20ml
de medio de cultivo. Se lleva a erlenmeyers de 250ml, se taponan con algodón y se
mantiene en la incubadora a 30º C durante 22 días, tiempo en el cual se van a tomar datos
para la medición de la actividad de la enzima.
Referencias:
Rodríguez Couto S., Rodríguez A., Paterson R.R.M., Lima N. Teixeira J.A. Laccase activity from
the fungus Trametes hirsuta using an air-l ift bioreactor. Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-
8254
Osma J., Toca J., Rodriguez S. Banana skin: a novel waste for laccase production by Trametes
Pubescens under solid-state conditions. Application to synthetic dye decolouration. Department of
Chemical Engineering, Rovira I Virgili University. Tarragona Spain
Pandey A., Selvakumar C. Poonam N. Solid State Fermentation for the production of industrial
enzymes. School of Applied Biological and Chemical Science, University of Ulster, Coleraine BT52
1 AS, N. Irelan, UK.
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ANEXO 3. PRÁCTICA DE DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE LACASA
Objetiv o:
Determinar las unidades de actividad de lacasa en el líquido extracelular del cultivo como medida
de la concentración de la enzima.
Fundamento Teórico:
La lacasa es determinada por medio de espectrofotometría con ABTS (2,2'-azino-bis(3-
ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) con el método descrito por Niku-Paavola et al. 1990.
El ABTS es un compuesto no fenólico que es sustrato de la lacasa y sirve para la detección de las
unidades de actividad de ésta. El ABTS también actúa como mediador en la reducción de
compuestos que no son sustratos de la enzima pero que pueden ser oxidados por medio de la
intervención de éste en reacciones de transferencia de electrones (Wong et al. 1999).
Figura 1. Molécula de ABTS
Tomado de: Shleev et al. Characterization of two new multiforms of Trametes
pubescens laccase. Bioorganic Chemistry 35 (2007) 35–49
Materiales y Reactiv os:
- ABTS (Sigma A-1888)
- Ácido succínico 25mM (pH = 4.5)
- Agua destilada
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- Espectrofotómetro
- Micropipeta 100-1000µl
- Líquido de cultivo obtenido en práctica 2.
Procedimiento:
1. Preparación de Solución de ABTS
Por cada 11mg de ABTS se toma 1mL de agua destilada. Por facilidad de medida de estas
cantidades se recomienda preparar 10mL de solución, tomando 110mg de ABTS.
2. Toma de muestras de líquido de cultivo
Después de tener los cultivos en los erlenmeyers de 250ml se procede a tomar muestras
diarias de lacasa para determinar las unidades de actividad con ABTS. Después del primer
día, se toman diariamente muestras de 500�l del líquido de cultivo con una micropipeta,
estas muestras se almacenan con un respectivo rótulo que indique a que día pertenece la
muestra y se guarda en la nevera hasta juntar cerca de 20 muestras (en el diseño
experimental se mostrará que se van a tener 45 muestras semanales).
3. Muestreo en espectrofotómetro:
a. Se toman 350�l del ABTS y se agrega en la cubeta.
b. Se adiciona 3000�l de ácido succínico 25mM (pH = 4.5) y se llevan a la cubeta. La
cubeta se coloca en el espectrofotómetro.
c. Se toman 150�l de enzima, evitando la presencia de sólidos, y se agrega en la cubeta.
Al momento de agregar la a la cubeta se toma esto como tiempo cero y se mide la
absorbancia cada 20seg durante dos minutos.
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Cálculos:
Se debe tener en cuenta que el resultado debe ser una línea recta. La medición en el tiempo cero
se compara con blanco de sólo ABTS y succínico esperando resultados similares.
Una vez se tiene el seguimiento de la absorbancia durante los 2 minutos, se debe obtener un
comportamiento de este estilo:
Figura 2. Seguimiento de cambio de abosorbancia de ABTS
Fuente: Elaboración propia.
Para la correlación entre U/l y absorbancia [J. Osma, Grupo BBG, Universitat Rovira i Virgili
(comunicación personal, 5 de diciembre, 2006)] se necesitan los parámetros:
( ) ( )( )( )60202 pendientefinalyinicialaabsorbancientreDiferenciaAA tt ==− ==
dilusióndeeCoeficientCd =
El coeficiente de dilución se obtiene como el cociente entre el volumen total antes de adicionar el
ABTS en la cubeta sobre el volumen de la muestra de enzima. Para el caso descrito anteriormente,
el coeficiente de dilución sería (3000�l+150�l)/ 150�l.
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Este procedimiento se realiza para cada una de las muestras tomadas a diario, obteniendo una
curva que relacione las unidades de actividad de lacasa con el tiempo de cultivo para determinar el
día de mayor producción. El procedimiento de toma de datos se debe hacer para cada sustrato por
triplicado para garantizar medición de error y validez estadística. (Ver diseño experimental)
Referencias:
Niku-Paavola M-L, Raaska L, Itävaara M. Detection of white-rot fungi by a non-toxic stain.
Mycological Research 1990;94:27e31.
Wong Y., Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat. Res. Vol. 33, No. 16, pp.
3512-3520, 1999
Shleev S., Nikitina O., Christenson A., Reimann C., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton L.
Characterization of two new multiforms of Trametes pubescens laccase. Bioorganic Chemistry 35
(2007) 35–49
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ANEXO 4. PRÁCTICA DE DECOLORACIÓN DE TINTES
Objetiv o:
Evaluar el desempeño de la lacasa (sintetizada en el laboratorio y/o comercial) con un tinte
industrial.
Fundamento Teórico:
La lacasa es objeto de investigación debido a sus múltiples usos. Entre estos usos se destaca la
participación en las industrias alimenticia, textil, pulpa y papel, bioremediación, cosméticos,
biosensores, bioremedación entre otras (Rodríguez Couto et al. 2006). Una importante aplicación
de la lacasa es la detección y degradación de contaminantes de efluentes de la industria textil. La
importancia de la acción decolorante de la lacasa se debe a que el color es uno de los
contaminantes principales del agua, una pequeña cantidad del orden de 10mg/L puede ser visible y
causar turbidez en el agua, deterioro de su apariencia estética e interferir en la solubilidad de gases
(Wong et al. 1999).
Materiales y Reactiv os:
- Tinte industrial o analítico
- Extracto de lacasa (Obtenido en práctica 2)
- Lacasa comercial, Suberase® (Donada por Coldanzimas)
- Espectrofotómetro
Procedimiento:
1. Se define una concentración de tinte y se prepara la solución con agua destilada.
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2. Se toma una muestra de 1000µL de la solución de tinte y se ajusta el pH en 4.5 con 2000µl
de ácido succínico. Se mide la absorbancia inicial, la cual debe estar alrededor de 1.
3. Se lleva esta solución a una cubeta del espectrofotómetro se adicionan 500�L del líquido
de cultivo o de Suberase®. Se toma la absorbancia inicial qué es diferente a la de la
solución inicial.
4. Se toman muestras cada 15-30min de la solución anterior, se lleva a la cubeta del
espectrofotómetro y se mide la absorbancia en el espectrofotómetro. Al cabo de tres horas
se comienza a tomar muestras a intervalos de una hora ya que la degradación es más
rápida al inicio. Los tiempos de degradación varían drásticamente inclusive en el orden de
días.
Cálculos:
Cuando se tienen los datos de absorbancia versus tiempo, se debe convertir a unidades de
concentración. Lo anterior se logra por medio de comparación con curva de calibrado a
concentraciones de tinte conocidas, la cual se hace antes de realizar el experimento de
degradación.
Referencias:
Rodríguez Couto S., Toca J.L. Industrial and biotechnological applications of laccases: A review.
Biotechnology Advances 24 (2006) 500–513
Wong Y., Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat. Res. Vol. 33, No. 16, pp.
3512-3520, 1999