tesis doctoral factor de necrosis tumoral alpha …

FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MEDICINA

TESIS DOCTORAL

FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALPHA

COMO MARCADOR DE INFLAMACIÓN EN

FUMADORES SANOS

Autor: Juan Manuel Díez Piña

Directores:

Esteban Pérez Rodríguez

Salvador Díaz Lobato

Madrid, 2010

Es más fácil variar el curso de un río que el carácter de un hombre

Proverbio chino

A mi madre

AGRADECIMIENTOS

Parecía que nunca iba a llegar, pero siempre había tenido ilusión por realizar una tesis

doctoral. Es un duro trabajo, pero si algo me caracteriza es la tenacidad y el trabajo. Y al

final aquí está el fruto de dicho trabajo. Claro que sin ayuda no hubiera podido, por eso

quiero en este apartado agradecer a la gente que ha estado conmigo de una u otra

manera.

A Iván, mi “corrector” particular... y mucho más. Σέ ευχαριστώ, Σέ αγαπώ πολύ

A Javi y Juan, mis sobrinos, que no son simplemente mis sobrinos, son mis niños

A mi padre, a mi hermana y a mis tíos (Emilia y Jose)

Al resto de mi familia

A mis amigos, ellos saben quienes son, tanto en Sevilla, como en Madrid, en Écija y en

Granada

A Salva y Esteban, mis directores

A Sari, por sus buenos consejos. Y a Alvarito, por dejarle tiempo a sus padres

A Mª Jesús Fernández Aceñero, siempre está on-line cuando la necesito con el SPSS

A Mª Jesús Llorente, del laboratorio del hospital de Móstoles, por su ayuda en la

metodología del análisis de muestras. Y a sus técnicos de laboratorio, sobre todo a

Carmen

A mis compañeros del servicio de Neumología del Hospital de Móstoles, especialmente

a Lola Álvaro

A Asunción Flórez, enfermera de espirometrías, dispuesta siempre a colaborar

A Isabel González, por su apoyo logístico, y su ánimo

A todo el personal del hospital (y no perteneciente al mismo) que ha colaborado como

voluntario en este estudio

ÍNDICE

Índice

I.- Justificación, hipótesis y objetivos................................................................................1

1.- Justificación......................................................................................................2

2.- Hipótesis...........................................................................................................3

3.- Objetivos...........................................................................................................3

II.- Respuesta inflamatoria al tabaco.................................................................... Página 5

1.- Introducción......................................................................................................6

2.- Estudios comparativos......................................................................................8

2. a.- Fumadores sanos...............................................................................8

2. b.- EPOC y fumadores sin obstrucción al flujo aéreo.........................16

3.- Efectos agudos del tabaco..............................................................................26

4.- Respuesta inflamatoria dosis-dependiente.....................................................29

5.- Efectos de la reducción del consumo de tabaco en la inflamación................30

6.- Efectos del abandono del consumo de tabaco en la inflamación...................31

III.- Factor de necrosis tumoral alpha................................................................ Página 35

1.- Introducción....................................................................................................36

2.- Mecanismo de acción.....................................................................................38

3.- Metabolismo del TNF-α.................................................................................40

4.- Receptores del TNF-α....................................................................................41

5.- TNF-α y tabaco..............................................................................................42

6.- TNF-α y EPOC..............................................................................................50

6.1.- Estudios de laboratorio....................................................................50

6.2.- Estudios en humanos.......................................................................55

7.- Niveles de TNF-α en la población general....................................................56

Índice

IV.- Condensado de aire exhalado...................................................................... Página 58

1.- Introducción....................................................................................................59

2.- Descripción de la técnica................................................................................61

3.- Ventajas e inconvenientes de la técnica.........................................................66

4.- Posibles utilidades del condensado de aire exhalado.....................................75

5.- Conclusiones..................................................................................................78

V.- Material y métodos....................................................................................... Página 80

1.- Sujetos estudiados.........................................................................................81

1.a.- Criterios de inclusión.......................................................................81

1.b.- Criterios de exclusión......................................................................82

2.- Protocolo del estudio......................................................................................82

2.a.- Diseño..............................................................................................82

2.b.- Procedimientos................................................................................83

2.b.1.- Análisis de sangre.............................................................84

2.b.2.- Condensado de aire exhalado............................................84

2.b.3.- Pruebas funcionales respiratorias......................................87

2.b.4.- Determinaciones analíticas...............................................88

3.- Aspectos éticos...............................................................................................91

4.- Variables a estudiar.......................................................................................92

4.a.- Datos antropométricos.....................................................................92

4.b.- Datos de consumo de tabaco............................................................92

4.c.- Espirometrías...................................................................................92

4.d.- Condensado de aire exhalado..........................................................93

Índice

4.e.- TNF-α..............................................................................................93

5.- Análisis estadístico de datos...........................................................................93

VI.- Resultados................................................................................................... Página 95

1.- Análisis descriptivos.......................................................................................97

1.a.- Serie global......................................................................................97

1.b.- Grupo control.................................................................................103

1.c.- Grupo estudio.................................................................................106

2.- Análisis estadístico.......................................................................................110

2.a.- Comparación entre grupos estudio/control....................................110

2.b.- Correlaciones.................................................................................116

2.b.1.- TNF-α suero y condensado de aire exhalado vs datos

antropométricos..........................................................................116

2.b.2.- TNF-α suero y condensado vs función pulmonar..........123

2.b.3.- TNF-α suero y condensado vs consumo de tabaco........129

2.b.4.- TNF-α suero y condensado vs parámetros del

condensador................................................................................130

2.b.5.- Volumen de muestra vs consumo de tabaco...................133

2.b.6.- Volumen de muestra obtenido vs parámetros

condensador................................................................................134

VII.- Discusión................................................................................................. Página 135

1.- Metodología..................................................................................................136

1.a.- Diseño............................................................................................137

Índice

1.b.- Sujetos estudiados..........................................................................136

1.c.- Criterios de inclusión/exclusión.....................................................137

1.d.- Recogida de muestras del condensado de aire exhalado...............138

2.- Resultados.....................................................................................................141

2.a.- Valores de TNF-α plasmáticos......................................................141

2.b.- Valores de TNF-α en condensado de aire exhalado......................143

2.c.- Influencia de la cuantía de consumo de tabaco..............................144

2.d.- Volumen de condensado recogido.................................................145

3.- TNF-α como marcador precoz de enfermedad............................................147

VIII.- Conclusiones.......................................................................................... Página 150

IX.- Bibliografía............................................................................................... Página 153

X.- Abreviaturas............................................................................................... Página 169

XI.- Anexos...................................................................................................... Página 172

- Anexo I. Aprobación del estudio por el CEIC del hospital.........................173

- Anexo II. Modelo de consentimiento informado..........................................175

- Anexo III. Base de datos..............................................................................178

- Anexo IV. Resumen en Inglés.....................................................................191

I. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

Justificación, hipótesis y objetivos

2

1.- Justificación

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es un problema de salud

pública, ya que actualmente ocupa el cuarto lugar en causas de mortalidad en países

desarrollados, pero se estima que en 2020 llegue a ocupar el tercer puesto en la referida

escala1. La población mundial está afectada por EPOC en un 10%, pudiendo llegar la

prevalencia al 50% cuando nos referimos a grupos de grandes fumadores2. En España,

el estudio IBERPOC estableció una prevalencia de EPOC del 9,1%, estando el 78,2%

de los casos sin diagnosticar previamente3. Más recientemente, y dentro del estudio

EPI-SCAN, se ha establecido la prevalencia de EPOC en personas entre 40 y 80 años en

10,2%4.

La EPOC se define como una obstrucción crónica al flujo aéreo poco reversible,

siendo el consumo de tabaco el principal causante de dicha enfermedad. El problema del

diagnóstico de esta enfermedad es que, una vez detectada la obstrucción en la

espirometría, el proceso suele resultar ya irreversible.

La EPOC también se puede definir como una respuesta inflamatoria anómala a

partículas o gases nocivos, por lo que la inflamación forma parte del proceso de

desarrollo de la EPOC desde sus fases más tempranas. Por esta razón, sería muy

importante detectar los fenómenos inflamatorios en el período “silencioso” de la

enfermedad, fase en la que aún la obstrucción bronquial no es demostrable en la

espirometría. Aún desconocemos varios aspectos de la relación consumo de tabaco-

EPOC, como por ejemplo, por qué unos fumadores desarrollan una pérdida acelerada de

función pulmonar y otros no, o cuál es el “nivel de seguridad” de consumo de tabaco

(cantidad y tiempo) para desarrollar EPOC. Lo ideal sería poder contar con un método


3

que identificase a los fumadores en riesgo de padecer EPOC para poder detectarlos e

incidir en ellos más incisivamente en el abandono del consumo de tabaco.

Existen múltiples proteínas implicadas en la inflamación y descritas igualmente

en la EPOC. El factor de necrosis tumoral alpha (TNF-α) es una citocina pro-

inflamatoria que se ha detectado en varias enfermedades inflamatorias, así como en

pacientes EPOC, ya sean en fase estable o agudizado.

La toma de muestras para la determinación de la inflamación a nivel bronquial

ha limitado hasta ahora el número de muestras incluido en los estudios. Desde hace

unos años existe un interés creciente por una técnica no invasiva que obtiene muestras

que podrían equivaler al fluido extracelular de las vías aéreas inferiores: el condensado

de aire exhalado (CAE). Se piensa que este condensado procede de los alveolos y

bronquíolos, siendo por tanto el contenido equivalente al de un lavado broncoalveolar

(BAL)5. En el CAE se pueden detectar sustancias volátiles y no volátiles, como

proteínas o sustancias oxidantes, que están implicadas en varias patologías pulmonares.

2.- Hipótesis

En los fumadores sin patología existe una inflamación tanto a nivel local como

sistémico, que se puede detectar antes de que exista una pérdida de función pulmonar.

Esta inflamación está en relación con la cuantía de consumo de tabaco.

3.- Objetivos

• Objetivo primario: Analizar diferencias en la citocina inflamatoria factor

de necrosis tumoral (TNF-α) entre un grupo de fumadores y un grupo

control, ambos sin patología.


4

• Objetivos secundarios:

- Estudiar la influencia de las características antropométricas de los

pacientes en las cifras de la citosina a estudio.

- Estudiar la relación que el consumo de tabaco puede tener con los

valores de TNF-α.

- Saber si los valores de TNF-α se relacionan con la función

pulmonar.

5

II. RESPUESTA INFLAMATORIA AL TABACO

Respuesta inflamatoria al tabaco

6

1.- Introducción

Según la Organización Mundial de la Salud, la enfermedad pulmonar obstructiva

crónica (EPOC) es la cuarta causa de muerte en países desarrollados, y se prevé que sea

la tercera en 20201. Esta enfermedad afecta al 10% de la población mundial, pero su

prevalencia entre los grandes fumadores puede alcanzar el 50%2.

La EPOC está infradiagnosticada por distintas causas: la enfermedad es de

comienzo insidioso; el paciente subestima sus síntomas, atribuyéndoselos al tabaco, por

lo que no suele consultar con su médico y llega tarde a la intervención por parte del

mismo; y aún no existe una buena concienciación médica del problema6. Cuando se

realizan programas activos de detección de esta enfermedad se suelen obtener resultados

llamativos, como en el caso del proyecto PADOC. Este consistía en realizar

espirometrías a todo paciente mayor de 35 años, fumador de más de 10 cigarros/día o

exfumador de al menos 10 paquetes-año. Se realizaron 3209 espirometrías válidas,

detectando 723 casos (22,5%) funcionales de EPOC no sospechada7. En el estudio

epidemiológico multicéntrico IBERPOC se estableció una prevalencia de EPOC en

España del 9,1%, estando el 78,2% de los casos (284 de 363) sin diagnosticar

previamente3. Más recientemente, y dentro del estudio EPI-SCAN, se ha establecido la

prevalencia de EPOC en personas entre 40 y 80 años en 10,2%. De ellos, el 56% eran

EPOC leves, el 39% moderados y el 5% graves o muy graves, siendo más frecuente en

varones, y aumentando el porcentaje en ambos sexos con la edad. Del total de EPOC

detectados el 13,2 % eran fumadores activos, el 12,3% eran exfumadores y el 5,65%

eran EPOC en personas que nunca habían fumado4.

El humo del tabaco está presente casi siempre que se diagnostica a un paciente

de EPOC. Sin embargo, sólo un 15% de los fumadores desarrolla EPOC. La definición


7

de esta enfermedad es una obstrucción crónica al flujo aéreo poco reversible; no

obstante cuando la espirometría detecta dicha obstrucción, el problema está ya

instaurado y aunque se abandone el hábito de fumar, el proceso inflamatorio puede

resultar irreversible. La EPOC también se define como una respuesta inflamatoria

anormal a partículas nocivas o gases, por lo que una inflamación pulmonar puede ser un

evento patológico temprano en la EPOC. Por esta razón es muy importante detectar los

fenómenos inflamatorios en el periodo “silencioso” de la enfermedad.

La inmunidad innata es una respuesta rápida y no específica a microorganismos

y a daño tisular. Aún no se conoce la causa por la cual el humo del tabaco desencadena

la respuesta inmune innata, aunque la hipótesis de inmunidad de Matzinger (“danger

model”)8 de que no son los microbios, sino el stress celular o el daño tisular secundario

a ellos los que desencadenarían la respuesta inmune, podría servir de explicación. Las

infecciones o el daño por exposición ambiental, el stress oxidativo o la muerte celular

pueden liberar autoantígenos secuestrados, modificar proteínas, dañar la mitocondria y

liberar DNA de células apoptóticas. El sistema inmune puede reconocer estos productos

como antígenos extraños y desencadenar una reacción inmune. En fumadores, esos

antígenos pueden ser liberados como resultado de necrosis y apoptosis de células

epiteliales y endoteliales, así como del daño de la matriz extracelular. El resultado final

es que los macrófagos y células dendríticas producen citocinas y quimiocinas que

dirigen las condiciones inflamatorias requeridas para activar el sistema inmune. La

mayoría de los fumadores no avanzan en este estado y no llegan a desarrollar EPOC9.

La inflamación inducida por el tabaco se puede resumir en los siguientes

eventos: los neutrófilos y macrófagos alveolares serían reclutados en la superficie

epitelial pulmonar, cuyas células serían dañadas al igual que las proteínas intersticiales,


8

siendo ambas procesadas como péptidos y reconocidas por las células T iniciando su

activación y proliferación. Una vez activadas, las células T reclutarían al sitio de la

inflamación más neutrófilos y macrófagos alveolares, así como eosinófilos. Los

linfocitos CD8+ son capaces de iniciar la producción de IL-5, factor quimiotáctico de

eosinófilos y activador de citocinas, y de IL-8, que actúa como quimiotáctico potente de

neutrófilos. Se perpetuaría la respuesta inflamatoria inducida por el tabaco debido al

papel crucial de los CD8+ en la inflamación de la vía aérea pequeña10.

2.- Estudios comparativos

En la literatura médica se pueden encontrar muchas publicaciones que aportan evidencia

de la inflamación inducida por el tabaco. La mayoría son estudios comparativos entre no

fumadores y fumadores sanos o pacientes con EPOC diagnosticada.

2.a.- Fumadores sanos

El lavado broncoalveolar (BAL) ha sido un medio muy utilizado por

distintos autores a la hora de examinar la inflamación bronquial. Al estudiar en este

medio los niveles de TNF-α, IL-6, IL-8 en nueve fumadores sanos (con una historia de

al menos 3 paquetes-año) y otros nueve no fumadores se ha visto que el microambiente

pulmonar de los fumadores es anormal. También se comprobó que la capacidad de los

macrófagos de liberar IL-6 y TNF-α cuando se cultivaban con lipolisacáridos (LPS) era

igualmente distinta. El BAL de fumadores contenía dos veces y media más células que

los no fumadores, aunque no existían diferencias en las células de ambos grupos. La IL-

6 estaba disminuida en BAL de fumadores (1,8 vs 15,9 pg/ml), no detectándose en 6

fumadores. Para la IL-8 no se encontraron diferencias entre ambos grupos (26,7 pg/ml


9

en fumadores y 14,6 pg/ml en no fumadores), aunque estaba elevada en dos de los

nueve fumadores. En ninguno de los dos grupos se encontró actividad TNF-α. Los

estudios in vitro demostraron en ambos grupos que la liberación de TNF-α tras cultivar

los macrófagos obtenidos en el BAL sin LPS era similar a las 6 y 24 horas. Sin

embargo, tras 6 horas de incubación con 100 ng/ml de LPS se producía un incremento 7

veces mayor en BAL de no fumadores, el cual se mantenía a las 24 horas. Este hecho no

se pudo constatar en el grupo de fumadores. En cuanto a la liberación de IL-6, los

macrófagos de no fumadores, tras estar incubados 6 horas en un medio de cultivo,

liberaban hasta 10 veces más IL-6 que los fumadores. Cuando se añadía al medio de

cultivo 100 ng/ml de LPS, y tras 6 horas de incubación, se producía un incremento en

no fumadores de once veces frente a fumadores11.

Se ha planteado la hipótesis de que la destrucción pulmonar por enfisema

secundario al consumo de tabaco está mediada por la elastasa liberada por neutrófilos

que emigran al espacio alveolar atraídas por el humo del tabaco. En un grupo de ocho

fumadores se encontró una cantidad significativamente mayor de neutrófilos en el BAL

respecto a un grupo control del mismo número de no fumadores. Estos neutrófilos no

emigran por el propio humo del tabaco sino que son los macrófagos los que liberan un

factor quimiotáctico para neutrófilos, una vez que han sido estimulados por el humo del

tabaco. Además, en este mismo estudio los autores comprobaron cómo los macrófagos

de no fumadores, una vez estimulados in vitro, podían liberar grandes cantidades de ese

mismo factor quimiotáctico. Dentro de este estudio, realizaron biopsias pulmonares

abiertas por resección de lesiones pulmonares únicas a tres fumadores y otros tantos no

fumadores sanos en ambos casos. Los hallazgos fueron similares a los del BAL: mayor

cantidad de neutrófilos en las piezas histológicas de los fumadores12.


10

La anexina I es una proteína citosólica inhibidora de la fosfolipasa A2 con un

papel anti-inflamatorio que se puede encontrar fuera de la célula en fluidos segregados,

y así se ha encontrado su existencia en el BAL. Esta proteína parece que es degradada

en el BAL de fumadores. Se han encontrado niveles entre 10 y 25 veces más elevados

de proteínas en el BAL de fumadores; niveles significativamente más altos de elastasa

en BAL de fumadores (entre 2 y 10 veces más elevados); recuento celular total y

porcentaje de neutrófilos más altos en fumadores; también la anexina I estaba más alta

en BAL de fumadores, aunque sólo se encontró en la forma Mr 34,000, que carece del

péptido terminal anti-inflamatorio Mr 3,000. En los no fumadores las formas Mr 37,000

(con actividad proteolítica) eran las más abundantes. La anexina I inactivada encontrada

en BAL de fumadores puede conducir a una inflamación crónica incontrolada13.

Thompson et al estudiaron 28 pacientes con bronquitis crónica (BC) y

obstrucción al flujo aéreo, 15 fumadores asintomáticos y 25 voluntarios no fumadores

sanos. A todos ellos realizaron broncoscopia y determinaron el índice de bronquitis

(edema, eritema, friabilidad y secreciones), realizando en el mismo acto un BAL. Los

pacientes con BC y los fumadores asintomáticos tenían mayores valores en el índice de

bronquitis que los no fumadores, mientras que los BC tenían mayor índice que los

fumadores sanos. En cuanto al BAL, la celularidad era mayor en los BC que en el resto

de grupos estudiados. En fumadores y BC el porcentaje era mayor para neutrófilos y

había un menor porcentaje de macrófagos, aunque estos últimos no presentaban

diferencias entre los tres grupos. Al grupo de pacientes con BC lo dividieron en aquellos

que tenían valores de neutrófilos mayores del 20% frente a los que tenían menos del

20% para relacionarlos con parámetros clínicos, y comprobaron que el porcentaje de

neutrófilos se relacionaba con el número de cigarrillos fumados por día y con el número

de paquetes-año, así como con todos los valores espirométricos (FVC, FEV1,


11

FEV1/FVC, FEF25-75 y PEFR). Midieron también la albúmina como medida de

trasudación en el tracto respiratorio inferior debido a la inflamación celular observada

en la BC y observaron que los pacientes con BC tenían mayores niveles que los otros

dos grupos. La BC se correlacionaría con la neutrofilia en la vía aérea, que a su vez está

relacionada con la obstrucción al flujo aéreo y con la producción de esputo14.

Pero no sólo ha sido el BAL el único medio empleado para el estudio de la

inflamación en fumadores, sino que se ha estudiado también la histología pulmonar.

Niewoehner et al fueron los primeros en identificar los cambios en la histología de la

vía aérea pequeña de jóvenes fumadores. Estos autores estudiaron los cambios en 39

pulmones de jóvenes fumadores (19) y no fumadores (20) en una muestra de muertes

súbitas producidas en un hospital. La lesión característica observada en el pulmón de los

fumadores fue una bronquiolitis respiratoria asociada a macrófagos alveolares

pigmentados en los bronquiolos respiratorios de primer y segundo orden distales al

bronquiolo membranoso terminal. En estos pulmones de fumadores también se podían

ver pequeños incrementos, aunque significativos, de células murales inflamatorias y

epitelio denudado en los bronquiolos. La ausencia de destrucción de tejido o fibrosis

sugeriría una reversibilidad de las lesiones. Los responsables de este estudio postulan

con que esta bronquiolitis sea precursora de lesiones anatómicas más severas y la

responsable de las anormalidades funcionales de los jóvenes fumadores15. La histología

de la vía aérea pequeña de fumadores se ha tratado de correlacionar con la función

pulmonar. Cosio et al estudiaron la relación entre la función pulmonar y las

anormalidades en la vía aérea pequeña en 36 pacientes (30 fumadores, 2 no fumadores y

4 exfumadores) que iban a ser sometidos a biopsia pulmonar abierta para diagnóstico de

lesiones pulmonares localizadas. En la vía aérea estudiaron ocho variables: grado de

oclusión de la vía aérea por células y moco, presencia o ausencia de úlceras mucosas,


12

metaplasia de células caliciformes, metaplasia de células escamosas, grado de

infiltración de la pared de la vía aérea por células inflamatorias, cantidad de tejido

conectivo, de músculo y de pigmento en la pared de la vía aérea. Los pacientes con

menor puntuación patológica fumaban menos, y a medida que aumentaba el consumo

medio de tabaco, aumentaba también el nivel de hallazgos patológicos. A medida que se

avanzaba en la puntuación de hallazgos patológicos se vio que la fibrosis y la metaplasia

de células escamosas eran más marcadas, mientras que la infiltración por células

inflamatorias permanecía estable. En el grupo con menor puntuación se observó una

función pulmonar normal, que se deterioraba progresivamente al ir incrementándose los

hallazgos patológicos. Por tanto parece que existen unas lesiones que serían reversibles

(infiltrados celulares inflamatorios, metaplasia de células escamosas y mínima fibrosis

de la pared de la vía aérea) si se detectan antes de que el deterioro sea mayor16.

Existen multitud de publicaciones que estudian marcadores hematológicos de

inflamación en fumadores con resultados dispares. Se han realizado estudios que tratan

de correlacionar la función pulmonar con algunos marcadores inflamatorios. McKarns

et al estudiaron en un grupo de 32 fumadores sanos (17 varones y 15 mujeres, 20 ó más

cigarrillos al día al menos durante dos años) y otro de 29 no fumadores (15 varones y 14

mujeres) la función pulmonar y los niveles de marcadores hematológicos de

inflamación (leucocitos, monocitos, linfocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, IL-1,

LB4, PGE1, IgG, IgM, IgA, IgE). En varones fumadores no encontraron correlación

entre ninguno de los parámetros hematológicos estudiados y la función pulmonar; en

mujeres fumadoras, sólo los basófilos se correlacionaron de forma negativa con la

función pulmonar; en varones no fumadores, los leucocitos y los monocitos se

correlacionaban de forma negativa, y la IgE de forma positiva con la función pulmonar;

en mujeres no fumadoras, sólo la PGE1 se correlacionaba de forma negativa con la


13

función pulmonar17. Las citocinas han sido objeto de numerosos estudios. Gander et al

no demostraron unos niveles mayores de TNF-α en fumadores tras estudiar a 198 no

fumadores (entre los que se incluían exfumadores de al menos 6 meses), 24 fumadores

irregulares y 78 fumadores activos (de al menos 3 cigarros/día). Los niveles de TNF-α

estaban elevados en fumadores activos (2,2 pg / ml) frente a no fumadores y fumadores

irregulares (que mostraban cifras similares de 1,8 pg / ml), pero sin alcanzar

significación estadística18. Dentro del tercer estudio MONICA se estudió a 196 hombres

y 221 mujeres con edades entre los 25 y 74 años para medir los niveles de IL-6, y se

comprobó que los niveles aumentaban con la edad, sin existir diferencias entre sexos.

En relación al consumo de tabaco comprobaron que los exfumadores y no fumadores

tenían niveles similares de IL-6, mientras que los fumadores activos tenían mayores

niveles para ambos sexos. Las cifras de IL-6 correlacionaban con la edad, con los

niveles de fibrinógeno y de leucocitos, con la viscosidad de plasma y sangre, así como

con el consumo de tabaco19. Otros estudios publicados (tras estudiar 75 fumadores y 78

no fumadores) encontraron cifras de IL-6 plasmáticas un 10% mayor en fumadores,

aunque esta diferencia no alcanzaba significación estadística20.

La liberación de citocinas in vitro también ha aportado evidencia a la

inflamación producida por el consumo de tabaco. La liberación de TNF-α en leucocitos

de 41 varones fumadores sanos y 52 no fumadores tras ser estimulados con LPS y

posteriormente inhibidos con glucocorticoides arrojaron los siguientes resultados: los

fumadores tenían unos niveles basales de TNF-α más elevados que los no fumadores,

sin que la diferencia llegara a ser estadísticamente significativa; tras ser estimulados con

LPS, los leucocitos de los fumadores liberaban menos TNF-α por 105 monocitos; los

fumadores necesitaban menores concentraciones de glucocorticoides para alcanzar 50%

de inhibición de liberación de TNF-α, demostrando por tanto una mayor sensibilidad a


14

los glucorticoides. Por tanto, los leucocitos de los fumadores no serían los responsables

del nivel elevado de citocinas pro-inflamatorias circulantes21. Sin embargo, otros

autores sí encontraron diferencias significativas a favor de fumadores en la producción

in vitro de TNF-α. 75 fumadores y 78 no fumadores fueron seleccionados para estudiar

los niveles de IL-6 en plasma y las cifras de TNF-α en sangre tras ser esta estimulada

con 10 ng/ml de endotoxina (LPS). Las cifras de IL-6 plasmáticas eran un 10% mayor

en fumadores, aunque esta diferencia no alcanzaba significación estadística. La

producción de TNF-α en la sangre de los fumadores tenía un 38% de diferencia, que en

este caso sí resultaba ser significativa20.

El condensado de aire exhalado (CAE) es un medio que se ha utilizado en

investigación sobre todo en los últimos años, pues refleja el contenido de la vía aérea

inferior y así se puede estudiar el componente inflamatorio de la misma en los

fumadores. Garey et al estudiaron once fumadores y nueve no fumadores sanos para ver

las diferencias entre ambos grupos en proteínas, nitritos, IL-1β y TNF-α, así como la

actividad quimiotáctica de neutrófilos. Los niveles de proteínas totales eran inferiores

en los no fumadores (5,7 vs 28,8 μg/ml); las cifras de nitritos también eran inferiores en

no fumadores (16,156 mmol/l vs 24,672 mmol/l); los niveles de IL-1β eran similares en

no fumadores y en fumadores (1,5 y 1,6 pg/ml); el TNF-α estaba más elevado en

fumadores respecto a no fumadores (7,4 vs 3,9 pg/ml); la actividad quimiotáctica de

neutrófilos estaba incrementada en fumadores frente a no fumadores. En jóvenes

fumadores sanos, por tanto, se detectan mayores niveles de determinados mediadores

inflamatorios y de la actividad quimiotáctica de neutrófilos, lo cual se podría utilizar

como una herramienta de detección de inflamación temprana en fumadores como

identificación de población en riesgo de desarrollar EPOC22. Otro clásico estudio de

CAE en fumadores sanos es el de Carpagnano et al, que determinaron los niveles de IL-


15

6 y LTB4 (como marcador de inflamación neutrofílica) en el CAE de 21 fumadores de

al menos 10 cigarros/día. Los niveles de IL-6 estaban más elevados en fumadores (5,6

vs 2,6 pg/ml). Existían diferencias entre aquellos que fumaban menos de 1 paquete al

día, los que fumaban 1 paquete al día, y los que fumaban más de 1 paquete, siendo todas

las diferencias estadísticamente significativas. Así mismo comprobaron que existía una

correlación de los niveles de IL-6 con el número de cigarrillos/día y con el CO espirado,

siendo esta correlación negativa con FEV1 y FVC. Igualmente los niveles de LTB4

estaban también más elevados en fumadores (9,4 vs 6,1 pg/ml), y se correlacionaban

con los de IL-6. Se vuelve a confirmar la utilidad de determinados productos no

volátiles del CAE como marcadores de inflamación en fumadores23. Balint et al

estudiaron 15 fumadores sanos y 14 no fumadores a los que midieron el óxido nítrico

exhalado (NO), y realizaron pruebas de función pulmonar y toma de condensado de aire

exhalado para medir nitritos, nitratos, S-nitrosotiol y nitrotirosina (metabolitos del óxido

nítrico). Las concentraciones de NO en fumadores eran significativamente menores que

en no fumadores. No se vieron diferencias significativas entre ambos grupos para los

niveles de nitritos, nitratos, S-nitrosotiol ni nitrotirosina. Parece que no existe un efecto

del consumo de tabaco a largo plazo en el metabolismo del óxido nítrico, lo que sugiere

que deben de existir otras vías que jueguen un importante papel en el efecto nocivo del

tabaco24.

2.b.- EPOC y fumadores sin obstrucción al flujo aéreo

Se han demostrado en distintos estudios la diferencias que existen en la

celularidad del BAL de los fumadores según si tienen o no obstrucción al flujo aéreo.

Spurzem et al estudiaron el BAL de 28 fumadores con bronquitis crónica (BC) y

obstrucción al flujo aéreo, 15 fumadores sanos y 33 no fumadores25. El grupo de


16

fumadores con BC tenía mayor celularidad en el líquido recuperado del BAL que los

fumadores sanos y los no fumadores. Las células caliciformes estaban

significativamente elevadas en el grupo BC frente a los otros dos grupos, y también

existían diferencias en los fumadores asintomáticos frente a no fumadores. El porcentaje

de células caliciformes correlacionaba bien con las características de bronquitis

sugiriendo que es el reflejo de la anormalidad del epitelio, pues se relacionaba con el

índice visual de bronquitis y con el porcentaje de neutrófilos. También se relacionaba

con el número de paquetes-año y con medidas del flujo aéreo, relacionándose

negativamente con FEV1 porcentual, con FEV1/FVC y con FEF25-75. La celularidad

también es distinta en EPOC (fumadores activos y exfumadores) con respecto a

fumadores sanos y no fumadores26. El hecho de padecer EPOC hace tener un mayor

número total de células. El consumo de tabaco y el diagnóstico de EPOC influyen sobre

el porcentaje de neutrófilos, pues los que mayores porcentajes presentaban eran los

EPOC fumadores activos; los fumadores sanos tenían niveles similares a los EPOC

exfumadores, y eran superiores a los no fumadores. En el esputo inducido de los dos

grupos EPOC no se encontraron diferencias en la metaloproteinasa 12 (MMP-12,

mediador del enfisema secundario al consumo de tabaco), aunque sí se vieron con

respecto al grupo de sanos (fumadores y no fumadores); los fumadores sanos tenían

mayores niveles que los no fumadores. En BAL ocurría algo similar: niveles mayores

de EPOC frente a sanos; de EPOC fumadores frente a exfumadores; y de fumadores

sanos frente a no fumadores sanos. Se ha encontrado también correlación entre el

número de paquetes-año con: 1) los neutrófilos en BAL de ambos grupos de EPOC y de

fumadores sanos; 2) con MMP-12 en esputo inducido de EPOC fumadores y

exfumadores, así como en fumadores sanos. Por lo tanto, parece que el abandono del

tabaco puede alterar la composición del compartimento alveolar (menor cantidad de


17

neutrófilos en BAL de EPOC exfumadores frente a los EPOC fumadores activos). El

consumo de tabaco puede estimular la expresión de MMP-12 en los compartimentos

aéreos (esputo inducido y BAL) de los pacientes EPOC. La diferente inflamación de los

fumadores EPOC también ha sido puesta de manifiesto por Linden et al, que estudiaron

el lavado bronquial (primera alícuota del BAL obtenido) y el BAL de doce fumadores

con bronquitis crónica (BC), once fumadores con EPOC, cinco fumadores sanos y diez

no fumadores sanos para medir la celularidad inflamatoria, la actividad de neutrófilos

mediante mieloperoxidasa (MPO) y la de eosinófilos mediante la proteína catiónica

(ECP)27. También estudiaron los niveles de glutation, como un compuesto no proteínico

que protege frente al daño oxidativo, y la albúmina como indicador de exudación. Las

células estaban incrementadas en todos los grupos de fumadores, especialmente en los

sujetos con BC, siendo la células recuperadas en su mayoría macrófagos. El número de

macrófagos estaba disminuido en los EPOC en comparación con los BC, así como en

fumadores asintomáticos frente a BC. Existía también una tendencia a menores

concentraciones de la mayoría de las células (a excepción de células epiteliales) en

EPOC y fumadores asintomáticos frente a BC. El glutation estaba más elevado en el

BAL de EPOC, mientras que era similar en los cuatro grupos en el lavado bronquial. La

MPO y la ECP estaban más elevadas en el lavado bronquial que en el BAL en todos los

grupos, pero sólo significativamente elevadas en el lavado bronquial del grupo BC. Al

comparar los grupos de fumadores frente a no fumadores se observó una mayor

concentración de MPO y ECP en BAL. La albúmina sólo mostraba una diferencia en el

lavado bronquial de EPOC (mitad de concentración). Existía una relación inversa entre

el FEV1 y la historia de tabaquismo (paquetes-año y cigarrillos/día), así como con las

concentraciones de neutrófilos, basófilos, glutation, MPO y ECP en BAL. La

concentración de neutrófilos correlacionaba de forma positiva con la historia de


18

tabaquismo. Se demuestra así la existencia de una inflamación distinta en fumadores

con BC que en aquellos que ya han desarrollado EPOC.

La elastina es un componente de la degradación de la proteolisis de las

fibras elásticas, componente fundamental en la producción de enfisema. Las

concentraciones de elastina en plasma, orina y BAL de seis no fumadores, seis

fumadores sanos y diez pacientes con EPOC han sido estudiados por Schriver et al28.

Los valores de elastina en plasma estaban muy elevados en EPOC en comparación con

fumadores sanos y no fumadores; lo mismo ocurría con los valores en orina, siendo

estos hasta diez veces superiores que en plasma en los tres grupos. Los niveles de

elastina plasmática y urinaria se correlacionaban con la ratio FEV1/FVC. En el BAL no

existían diferencias significativas entre grupos, posiblemente debido a la menor

recuperación de líquido en el grupo EPOC, aunque los fumadores y los EPOC tenían

niveles más altos, lo cual sugeriría el origen pulmonar como una fuente importante de

elastina. Los productos de degradación de la elastina (desmosina e isodesmosina) y del

colágeno (hidroxilisilpiridinolina y lisilpiridinolina) fueron estudiados en la orina de 22

no fumadores, 13 fumadores sanos y 21 EPOC (ocho de ellos fumadores activos). Estos

productos estaban 50% más elevados en EPOC y fumadores sanos que en no

fumadores. El tabaquismo activo y la presencia de EPOC eran factores

independientemente asociados con una mayor excreción urinaria de estos productos.

Entre los EPOC, aquellos que continuaban fumando tenían niveles de desmosina e

isodesmosina más elevados. Ni el sexo ni la edad tenían influencia sobre los niveles de

los productos de degradación de elastina. Los niveles de hidroxilisilpiridinolina estaban

más elevados en EPOC que en fumadores sanos y no fumadores, sin tener influencia el

hecho de continuar o no fumando. En el grupo no EPOC, las mujeres tenían unos

niveles urinarios 37% mayores que hombres, no existía influencia de la edad, y en estos


19

grupos sí que existía una asociación con el hecho de ser o no fumador activo. Por tanto,

estos resultados evidencian una mayor degradación de elastina y colágeno en fumadores

activos y EPOC, la cual persiste en este último grupo a pesar de abandonar el tabaco29.

Se han realizado también estudios histológicos de pulmones de pacientes EPOC,

como el estudio de Hale et al, que estudiaron los pulmones de dieciocho fumadores con

obstrucción al flujo aéreo que habían fallecido sin que existiera neumonía con evidencia

radiológica ni déficit de α1-antitripsina30. Los resultados fueron comparados con los

pulmones de catorce no fumadores y veinticinco fumadores sin enfermedad pulmonar.

En los pulmones estudiados se identificaba: 1) la severidad del enfisema; 2) los

bronquíolos con diámetro menor de 2 mm asignándole puntuación de 0 a 3 en infiltrado

celular inflamatorio, hipertrofia de músculo liso y metaplasia de células caliciformes; y

3) el grosor de la capa media e íntima de las arterias de calibre menor de 500 μm. Estos

autores encontraron que la severidad del enfisema era significativamente mayor en los

fumadores con obstrucción al flujo aéreo, y no había diferencias entre fumadores sin

obstrucción y no fumadores. Los fumadores tenían mayor puntuación que los no

fumadores en las características estudiadas, y los fumadores con obstrucción tenían

mayores diferencias respecto a los otros dos grupos, con la salvedad de las células

caliciformes que no mostraban diferencias en los fumadores con obstrucción. En el

grupo de fumadores con obstrucción, se correlacionaron los valores de FEV1 en

porcentaje de su teórico con los hallazgos estudiados, encontrando correlaciones con

enfisema, con el diámetro bronquial y con el porcentaje de bronquíolos menores de 400

μm. En cuanto al estudio de las arterias, observaron que el grosor de la media (y no así

el de la íntima) estaba aumentado en fumadores frente a no fumadores, y sobre todo en

fumadores con obstrucción. Este grupo comparado con los no fumadores tenía el doble

de grosor de la media y hasta el triple en la íntima. Saetta et al estudiaron a dieciséis


20

pacientes fumadores que iban a ser intervenidos por carcinoma pulmonar periférico

solitario, nueve de los cuales tenían obstrucción al flujo aéreo y siete eran fumadores

asintomáticos con FEV1 normal31. En las vías aéreas periféricas utilizaron

inmunohistoquímica para identificar neutrófilos, macrófagos, y linfocitos CD4+ y

CD8+ infiltrando la vía aérea y el músculo liso. Los hallazgos encontrados fueron que

los CD8+ estaban aumentados en los EPOC, mientras que los neutrófilos, macrófagos y

CD4+ no presentaban diferencias significativas entre ambos grupos. Las características

morfométricas de la vía área periférica no mostraban diferencias entre ambos grupos,

salvo por el área muscular lisa normalizada por el perímetro interno, que estaba

incrementada en EPOC. El número total de CD8+ y el área muscular lisa normalizada

por el perímetro interno correlacionaban negativamente con el FEV1. Esto demostraría

el importante papel de los CD8+ y del remodelado de la vía aérea en la patogénesis de

la EPOC.

Además de la vía aérea periférica, también la vía aérea central ha sido objeto de

estudio comparativo entre fumadores y no fumadores32. Se han estudiado cuarenta y

cinco pacientes que iban a ser sometidos a toracotomía para resección de carcinoma

broncogénico con el fin de comparar la estructura de la vía aérea central. De ellos,

quince eran fumadores activos con hipersecreción mucosa, catorce fumadores sin

hipersecreción, cinco exfumadores con hipersecreción (de al menos cuatro meses de

abstinencia) y once exfumadores sin hipersecreción mucosa. Entre los grupos

estudiados no se observaron diferencias en el tamaño de las glándulas, en el músculo

liso, en el tejido conectivo ni en el índice de Reid. La vía aérea central de los pacientes

con hipersecreción mucosa mostraba mayor inflamación mucosa. Los cinco

exfumadores con hipersecreción tenían tanto las vías aéreas centrales como las

periféricas afectadas por la respuesta inflamatoria, así como mayor grado de enfisema e


21

hipertrofia de músculo liso en los bronquíolos membranosos. Este grupo de

exfumadores con hipersecreción era el que mostraba mayor grado de inflamación,

incluso más que los fumadores activos. Los fumadores activos mostraron mayor

metaplasia de células caliciformes, mientras que los exfumadores con hipersecreción

presentaban mayor metaplasia de células escamosas. En este estudio se trató de

correlacionar estos hallazgos con la función pulmonar de los pacientes, estudiando la

curva fase 3 de lavado de nitrógeno, la cual ha mostrado ser un buen predictor de caída

de FEV133. Los exfumadores con hipersecreción mucosa tenían una mayor curva que el

resto de los grupos, demostrando así que este grupo, además de una mayor inflamación

de las vías aéreas central y periférica, tenía una mayor obstrucción de las mismas. Lams

et al estudiaron en la vía aérea de gran tamaño los CD8, los eosinófilos y neutrófilos en

las biopsias de once fumadores con obstrucción al flujo aéreo frente a once no

fumadores y ocho fumadores asintomáticos34. En los pacientes EPOC existía un

incremento de CD8 infiltrando el subepitelio en comparación con fumadores

asintomáticos. Además existía una relación negativa entre el número de CD8 y el FEV1,

y positiva con el número de paquetes-año. No existían diferencias significativas entre

los grupos en el número total de eosinófilos ni en el número de eosinófilos activados,

aunque existía una correlación negativa del ratio eosinófilos activados/totales con el

FEV1 porcentual predicho. Tampoco existían diferencias entre grupos en el número total

de neutrófilos, pero sí había una correlación negativa entre el número de paquetes-año y

número de neutrófilos.

Se han propuesto distintos modelos de inflamación según la enfermedad

respiratoria que se padezca. Estudios con pacientes EPOC, asmáticos, bronquitis crónica

y “fumadores sanos” demostraron diferencias en determinados marcadores

inflamatorios. Los pacientes EPOC mostraron unos mayores niveles de neutrófilos, de


22

IL-8 y sTNF-R75 en esputo; y de IL-8, sTNF-R75 y proteína ligadora de

lipopolisacáridos (LBP) en plasma. Los asmáticos mostraban eosinofilia en esputo,

mientras que los pacientes con bronquitis crónica tenían más linfocitos en esputo y

valores significativamente inferiores en plasma de sTNF-R75 y 55. Los fumadores

sanos sólo mostraron unos mayores niveles de LBP en plasma35.

El hialurónico es un componente inflamatorio de la matriz extracelular que está

presente en cantidades importantes en el BAL y en plasma de pacientes con

enfermedades inflamatorias. Los fragmentos de bajo peso molecular (en torno a 250

kDa de masa molecular) estimulan la producción de citocinas, quimiocinas y

metaloproteinasa 12 de macrófagos. Para conocer su posible influencia en la

patogénesis de la EPOC, Dentener et al estudiaron el esputo inducido de dieciocho

pacientes EPOC (media FEV1 62%) y catorce fumadores sanos, a los cuales midieron

también los niveles de IL-8 y de los receptores solubles 55 y 75 del TNF-α. Los niveles

de hialurónico estaban más elevados en EPOC que en fumadores sanos. Al grupo EPOC

lo dividieron en dos subgrupos según niveles de hialurónico: aquellos con niveles más

elevados (n = 6, HA 1000 ng/ml) tenían una menor función pulmonar que aquellos con

niveles moderados (n = 12, HA 201 ng/ml). Los niveles de IL-8 y los de los factores

solubles de TNF-α estaban significativamente más elevados en pacientes con mayores

niveles de hialurónico respecto a controles y pacientes con niveles moderados. Por

tanto, puede existir una relación entre los niveles de hialurónico, inflamación local y

severidad de la enfermedad pulmonar36.

También el condensado de aire exhalado (CAE) es un medio utilizado en

fumadores sintomáticos que están en riesgo de padecer EPOC para el estudio de

marcadores inflamatorios. Mazur et al estudiaron a cuarenta pacientes a los que

realizaron esputo inducido y CAE: catorce no fumadores (cuatro de ellos habían dejado


23

de fumar al menos veinte años antes), diecisiete fumadores asintomáticos y nueve

fumadores con síntomas de bronquitis crónica (sólo uno de ellos con alteración en la

función respiratoria, estadio I GOLD)37. Se utilizó como grupo control positivo a diez

pacientes EPOC agudizados, ya que se sabe que tanto IL-8 como 8-isoprostano están

elevados en las agudizaciones. El 8-isoprostano se detectaba en todos los sujetos

estudiados, tanto en esputo inducido como en CAE mientras que IL-8 se encontraba

sólo en 14% de no fumadores, 20% de fumadores asintomáticos y 43% de fumadores

sintomáticos. Los niveles de ambos marcadores estaban más elevados en el esputo

inducido que en el CAE. Los no fumadores tenían los niveles más bajos de 8-

isoprostano en ambos medios y de IL-8 en esputo. Los niveles de ambos marcadores se

correlacionaban inversamente con varios parámetros de función respiratoria (FVC,

FEV1 , FEV1 /FVC, DLCO%). Las concentraciones de IL-8 en esputo diferenciaban a

fumadores asintomáticos de fumadores sintomáticos en riesgo de padecer EPOC,

mientras que 8-isoprostano en CAE distinguía no fumadores de fumadores no

sintomáticos. Corhay et al estudiaron cuarenta y cinco pacientes EPOC (veintiocho en

grado moderado y diecisiete grado severo) y sesenta y cinco sujetos sanos para conocer

la actividad quimiotáctica de eosinófilos y neutrófilos en CAE. En ambos grupos se

detectó actividad quimiotáctica de neutrófilos, que era mayor en sujetos EPOC. Dentro

del grupo de sanos, los fumadores tenían valores significativamente más altos que los

no fumadores y exfumadores. En el grupo EPOC, los fumadores activos tenían mayores

niveles que aquellos EPOC que habían dejado de fumar; los valores además eran

independientes del grado de EPOC del paciente y de si estaban en tratamiento con

corticoides inhalados; los exfumadores tenían mayores niveles que los exfumadores

sanos, aunque no existían diferencias entre controles fumadores y EPOC fumadores.

También se observó actividad quimiotáctica de eosinófilos en los dos grupos, que era


24

mayor para sujetos sanos que para EPOC. El consumo de tabaco no influía en la

actividad quimiotáctica de eosinófilos en EPOC ni en sujetos sanos. Estos resultados

demuestran que el consumo de tabaco favorece la actividad quimiotáctica de neutrófilos

y que los pacientes EPOC tienen una mayor actividad quimiotáctica de neutrófilos

frente a la de eosinófilos cuando se comparan con sujetos sanos38.

La hipótesis de que los nitritos elevados en CAE reflejan hiperinsuflación

pulmonar en pacientes EPOC se confirmó en el estudio que llevaron a cabo Gessner et

al39. Estos investigadores estudiaron la concentración de nitritos en CAE de un grupo de

fumadores sanos (n = 18), otro de no fumadores sanos (n = 17) y un grupo EPOC

exfumadores de al menos un año (ocho estadio 0 GOLD; trece estadio 1; veinticinco

grado 2; quince grado 3; y dieciséis estadio 4) y lo compararon con parámetros

inflamatorios y de función pulmonar. Los niveles de nitritos estaban más elevados en

pacientes EPOC frente a los fumadores y no fumadores, siendo mayor la elevación en

los EPOC estadio IV, e iba disminuyendo la concentración de nitritos a medida que iba

disminuyendo el estadio GOLD de la EPOC. Encontraron una correlación logarítmica

del nitrito en CAE de pacientes EPOC con el volumen residual, la capacidad pulmonar

total y el volumen de gas torácico, pero no con FVC ni con FEV1; los grupos de

fumadores sanos y no fumadores, por el contrario, no mostraron tener dicha correlación.

Al realizar un análisis de subgrupos en pacientes EPOC, se comprobó que existía una

relación logarítmica con volumen residual, capacidad pulmonar total y volumen de gas

intratorácico en pacientes con grado 2 de EPOC o mayores. Los niveles de citocinas

eran más elevados en el grupo de fumadores sanos (salvo IL-10) frente al grupo EPOC

y no fumadores. En los distintos subgrupos EPOC no se observaron diferencias en los

niveles de citocinas. No existía correlación entre los niveles de nitritos y los niveles de


25

IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12 y TNF-α. Tampoco se pudo comprobar correlación de

los niveles de citocinas con ninguno de los parámetros de función pulmonar.

El stress oxidativo es mayor en pacientes EPOC como se demuestra por la

mayor producción de radicales libres al compararlos con no fumadores y fumadores

sanos. Montuschi et al estudiaron el efecto del stress oxidativo en pacientes EPOC

(veinticinco exfumadores y quince fumadores), no fumadores (n = 10) y fumadores

sanos (n = 12) midiendo los niveles de 8-isoprostano en CAE. Tanto los EPOC

fumadores como los fumadores sanos se habían mantenido abstinentes al menos doce

horas antes de la toma de muestra. Los niveles de 8-isoprostano eran similares en EPOC

exfumadores (40 pg/ml) y fumadores activos (45 pg/ml), y a su vez eran 1,8 mayores

que en fumadores sanos (24 pg/ml). Los niveles de estos últimos eran 2,2 veces

mayores que los de no fumadores (10,8 pg/ml)40.

Vamos a repasar los efectos del consumo agudo y del consumo continuado del

tabaco sobre la inflamación. Es muy importante conocer la respuesta inicial al tabaco

para entender los efectos del consumo crónico del mismo, pues el efecto agudo repetido

puede tener efecto acumulativo y conducir a un daño irreparable y, como consecuencia,

al desarrollo de EPOC.

3.- Efectos agudos del tabaco

Se han realizado estudios en humanos y en animales para conocer el efecto

agudo del tabaco, realizando mediciones en distintos fluidos. Algunos estudios con ratas

demuestran que el humo del tabaco provoca una reacción inflamatoria aguda con

liberación de citocinas proinflamatorias. Un grupo de ratas eran sacrificadas

inmediatamente tras la exposición aguda a humo de tabaco, mientras que otro grupo de

ratas eran sacrificadas a las 2, 4, 8 y 24 horas de dicha exposición. En esos momentos


26

de tiempo se les extraía sangre, se les realizaba una extracción de líquido peritoneal tras

instilar suero salino con heparina para recoger macrófagos, y se les realizaba un lavado

broncoalveolar separando los macrófagos. Existía un grupo de ratas control a las que se

les realizaba el mismo procedimiento, pero estaban expuestas a aire sin contaminar por

humo de tabaco. Se comprobó que el número de macrófagos alveolares se incrementaba

tras ocho horas de exposición a tabaco. Tras incubar estos macrófagos durante 24, 48 y

72 horas se vio que se liberaban cantidades variables de TNF-α, siendo mayor a las

ocho horas tras la exposición. Ni los macrófagos peritoneales ni los alveolares

procedentes de ratas no expuestas a tabaco liberaban ninguna cantidad de TNF-α41.

En fumadores intermitentes se han visto resultados dispares, pues se ha

comprobado que tras el consumo existe un aumento en determinados parámetros

inflamatorios, mientras que a la vez hay un efecto supresor sobre otros. Esto se puede

comprobar en el estudio de Van der Vaart et al, que estudiaron a dieciséis fumadores

intermitentes sanos a los que pidieron no fumar durante los nueve días previos al

estudio, siendo fumador intermitente aquel que fumaba más de un cigarro al mes, pero

no diariamente, durante los últimos seis meses. En estos fumadores determinaron los

niveles de células sanguíneas (leucocitos, neutrófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos)

y de marcadores inflamatorios en condensado de aire exhalado (óxido nítrico), esputo

inducido (estudio de células, nitritos y nitratos, ECP, IL-8, LTB4, MMP-9, inhibidor

tisular de MMP-1, y elastasa de neutrófilos), plasma (TNF-α, IL-1β, IL-8 y IL-10) y

orina (leucotrieno E4) a las 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 96 y 192 horas tras fumarse dos

cigarros separados por treinta minutos. Los resultados que encontraron fueron: 1) el NO

en CAE no sufría ningún cambio por el consumo agudo de tabaco; 2) en sangre, el

número de eosinófilos disminuía más a las tres horas de fumar, mientras que no tenía

efecto en ninguna otra célula sanguínea. La IL-8 producida por células sanguíneas


27

estimuladas con LPS era mayor entre cero y tres horas tras fumar, mientras que no había

ningún efecto sobre la producción de TNF-α, IL-10 y IL-1β; 3) en esputo, el número de

neutrófilos incrementaba significativamente tras 3-12 horas de fumar; el número de

linfocitos disminuía entre cero y tres horas tras fumar y luego incrementaba entre tres y

doce horas. Ninguna otra célula ni mediador inflamatorio en esputo sufría efecto alguno

por el consumo agudo de tabaco; 4) en la orina, no existía ninguna influencia del

consumo de tabaco en los niveles de leucotrieno E4. Otros autores sí han encontrado

diferencias en los niveles de IL-1β (menores valores) y de TNF-α (valores más

elevados) en condensado de aire exhalado treinta minutos después de fumar un

cigarrillo, mientras que las proteínas y los nitritos presentaba niveles muy similares

antes y después de fumar42.

El stress oxidativo está aumentado tras el consumo agudo de tabaco. Se ha

podido comprobar que un grupo de doce fumadores sanos, tras doce horas de

abstinencia a los quince minutos de fumar un cigarrillo, presenta unos niveles de 8-

isosprostano en CAE significativamente más elevados que los basales (32,3 vs 20,7

pg/ml), y que estos niveles a las cinco horas no mostraban diferencias significativas,

aunque existía una tendencia a mantenerse elevados (28,9 vs 20,7 pg/ml)40.

El efecto agudo del consumo de tabaco ha sido utilizado para el estudio del

metabolismo del óxido nítrico (NO). Balint et al estudiaron quince fumadores sanos y

catorce no fumadores a los que midieron el óxido nítrico exhalado y realizaron pruebas

de función pulmonar y toma de condensado de aire exhalado para medir nitritos,

nitratos, S-nitrosotiol y nitrotirosina (metabolitos del óxido nítrico). También estudiaron

el efecto agudo de dos cigarros en el grupo de fumadores tras una abstinencia de cuatro

horas, repitiendo la toma de muestras a los treinta y noventa minutos posteriores. Tras el

consumo agudo de tabaco se observó que los niveles de nitritos y nitratos estaban


28

significativamente más elevados a los treinta minutos y volvían a niveles basales a los

noventa minutos. El resto de parámetros no mostraba diferencias con la exposición

aguda al tabaco. No existía correlación entre los niveles de NO exhalado y sus

metabolitos en CAE antes y después de la exposición aguda al tabaco. Por tanto, el

tabaco puede modular el metabolismo de NO facilitando la oxidación de NO,

incrementando así los productos de oxidación, lo que contribuye al efecto dañino del

tabaco24.

4.- Respuesta inflamatoria dosis-dependiente

Pero la inflamación producida depende de la cuantía del consumo de tabaco. Así

se ha comprobado que la cantidad de tabaco consumido puede tener un valor predictivo

para los valores de determinados parámetros inflamatorios. Kuschner et al estudiaron en

el BAL de catorce fumadores sanos y dieciséis no fumadores el porcentaje celular,

algunos mediadores proinflamatorios (TNF-α, IL-6, IL-1β) y quimioatrayentes (la

proteína quimiotáctica de monocitos y la IL-8 como quimiotáctica de neutrófilos)43.

Observaron que, en fumadores, existían valores significativamente más altos de

neutrófilos, macrófagos, IL-1β, IL-6, IL-8 y MCP-1. Cuando dividían a los fumadores

según el consumo en menos de un paquete al día, un paquete al día, o más de un

paquete al día, vieron que un mayor consumo tenía valor predictivo para cifras de

neutrófilos, macrófagos, IL-1β y IL-8. También Lind et al han demostrado el efecto que

tiene un mayor consumo diario de tabaco sobre las proteínas inflamatorias44. Estos

autores estudiaron proteínas inflamatorias (α1-glicoproteína ácida, α1- antitripsina,

haptoglobina, fibrinógeno y ceruloplasmina) para conocer el riesgo cardiovascular en

una serie de varones de entre 28 y 61 años de los cuales 1489 eran no fumadores, 1685

exfumadores (de al menos cinco años) y 2901 fumadores activos. Los niveles de los


29

marcadores de inflamación estudiados estaban significativamente más elevados en

fumadores activos que en no fumadores y exfumadores; además, los niveles más altos

estaban en el grupo de fumadores de más de un paquete al día. La proporción de niveles

elevados de al menos dos de los marcadores estudiados en el cuartil superior se

incrementaba con la cuantía de tabaco consumido (19,5% en no fumadores y 56% en

fumadores activos) y con los niveles de carboxihemoglobina. Estas diferencias se

mantenían incluso después de ajustarlas a otros factores de riesgo cardiovascular (edad,

diabetes, colesterol, IMC, hipertensión sistólica arterial, etc). Carpagnano et al también

han demostrado diferencias significativas según el nivel de consumo diario de tabaco23.

Han estudiado los niveles de IL-6 y LTB4 (como marcador de inflamación neutrofílica)

en CAE de fumadores de al menos 10 cigarros / día. Existían diferencias entre aquellos

que fumaban menos de un paquete al día, los que fumaban un paquete al día y los que

fumaban más de un paquete, siendo todas las diferencias estadísticamente significativas.

También encontraron correlación entre los niveles de IL-6 y el número de

cigarrillos/día, así como con el CO espirado; y correlación negativa con FEV1 y FVC.

Los niveles de LTB4 estaban también más elevados en fumadores (9,4 vs 6,1 pg/ml), y

se correlacionaban con los de IL-6.

5.- Efecto de la reducción del consumo de tabaco en la inflamación

Para demostrar la influencia del consumo de tabaco sobre la inflamación es muy

importante también saber qué ocurre si se reduce el mismo. Rennard et al estudiaron

quince grandes fumadores sanos (nueve varones y seis mujeres, mínimo consumo de

dos paquetes/día) y quince no fumadores también sanos, a los que realizaron

broncoscopia con BAL. Se estudió en todos ellos el índice visual de bronquitis, la

celularidad del BAL, y la actividad de elastasa antigénica de neutrófilos. El grupo de


30

fumadores fue tratado con 20 mg diarios de chicles de nicotina para que redujesen el

consumo al 50% a lo largo de dos meses y posteriormente se les repitió la broncoscopia.

El índice de bronquitis estaba significativamente más elevado en fumadores frente a no

fumadores, y a los dos meses existía una reducción significativa en el mismo, aunque

sin llegar al nivel de los no fumadores. Los fumadores tenían mayores porcentajes de

neutrófilos que los no fumadores, y esos porcentajes se reducían significativamente tras

la reducción del consumo de tabaco. No se detectó actividad elastasa de neutrófilos en

el BAL de ninguno de los sujetos estudiados, por lo que se usó un método ELISA

antigénico, y se pudo observar que el complejo antigénico de elastasa estaba

significativamente elevado en fumadores y que se reducía significativamente con la

reducción del consumo. Esto demuestra que una reducción del consumo mejora la

inflamación del tracto respiratorio inferior45.

6.- Efecto del abandono del consumo de tabaco en la inflamación

Más importante aún que el efecto de la reducción del consumo en la inflamación

es el abandono absoluto del mismo. Turato et al estudiaron a un grupo de pacientes con

bronquitis crónica, nueve fumadores activos y siete exfumadores de al menos un año, y

lo compararon con siete no fumadores. A todos ellos les realizaron biopsias

transbronquiales para estudiar el número de células inflamatorias (eosinófilos,

neutrófilos, macrófagos, y linfocitos T con sus subpoblaciones CD4 y CD8), los

marcadores de activación de células mononucleares (IL-2R, VLA-1) y la expresión en

el subepitelio de citocinas (TNF-α, IL-1β) y células de adhesión endotelial (ICAM-1,

anti-E selectina y anti-CD31). Encontraron que tanto los fumadores como los

exfumadores tenían mayor número de macrófagos que los no fumadores, aunque el


31

número de neutrófilos y eosinófilos era similar en los tres grupos. Aunque existía una

tendencia a tener un mayor número de linfocitos T y sus subpoblaciones en fumadores y

exfumadores, no se encontraron diferencias significativas con los no fumadores. Los

marcadores de activación de células mononucleares VLA-1 y IL-2R sí estaban

significativamente elevados en fumadores activos y exfumadores, al igual que las

células de adhesión endotelial; por el contrario, IL-1β y TNF-α no mostraron

diferencias entre los tres grupos. Al comparar fumadores activos con exfumadores se

vio que no existían diferencias para ninguno de los parámetros estudiados. Esto

demuestra una persistencia de la inflamación a pesar del abandono del tabaco cuando

existen síntomas de bronquitis crónica46.

Se ha visto que la respuesta tras el abandono del tabaco es distinta en los

fumadores según si son fumadores asintomáticos o existe ya una EPOC instaurada, ya

que estos últimos muestran una inflamación que persiste a pesar del abandono47.

Willemse et al estudiaron en un grupo de pacientes el efecto de un año de abandono de

consumo de tabaco en la inflamación de las vías aéreas. Realizaban a los pacientes una

toma de esputo inducido y una broncoscopia con toma de biopsias en lóbulo medio o

inferior derecho. Los grupos estaban formados por veintiocho fumadores EPOC (trece

leves, ocho moderados y siete graves), diez fumadores con síntomas de bronquitits

crónica pero con función pulmonar normal, y veinticinco fumadores asintomáticos

también con función pulmonar normal. De todos ellos, doce EPOC (cuatro fumadores

con bronquitis crónica y dieciseis fumadores asintomáticos) consiguieron abandonar el

consumo de tabaco. En el grupo EPOC, la concentración de células, el número de

neutrófilos y de linfocitos, los niveles de IL-8 y de proteína catiónica de eosinófilos

estaban aumentados al año del abandono del tabaco, mientras que los eosinófilos y

macrófagos tendían a disminuir. En los fumadores asintomáticos, el número y


32

porcentaje de macrófagos, porcentaje de eosinófilos y niveles de IL-8 se reducían al

año. En los EPOC, las biopsias al año no mostraban ningún cambio en marcadores

celulares de inflamación ni moléculas de adhesión vascular; por el contrario, en

fumadores asintomáticos los mastocitos disminuían significativamente, mientras que las

células B aumentaban.

También se ha comprobado que existe una diferente morfología en la vía aérea

de los fumadores activos, que es similar a la de los exfumadores, pero muy diferente a la

de los no fumadores. Wright et al estudiaron noventa y siete pacientes a los que se les

iba a realizar una toracotomía diagnóstica de lesiones nodulares y estudiaron la

morfología de las vía aéreas periféricas. De ellos, nueve eran no fumadores, cincuenta y

uno fumadores activos, dieciocho exfumadores de menos de dos años y diecinueve

exfumadores de más de dos años. Los bronquíolos membranosos en fumadores activos

y exfumadores mostraban mayor metaplasia de células mucosas que los no fumadores.

Los bronquíolos respiratorios de fumadores activos y exfumadores eran muy diferentes

a los de los no fumadores, con mayor inflamación, fibrosis y depósito de pigmento, así

como mayor número de macrófagos intraluminales48.

La citomorfología del esputo ha sido estudiada por Swan et al, que comprobaron

que, con el abandono del consumo de tabaco, alguna de las características del mismo

retornaban a sus valores basales49. Estos autores estudiaron los cambios en células

exfoliadas traqueobronquiales de cuarenta y seis fumadores que abandonaron el

consumo de tabaco durante doce meses, y treinta y siete fumadores que continuaron

fumando. Realizaban análisis mensuales de los esputos analizando: macrófagos

(pigmentados y no pigmentados), neutrófilos, moco, espirales mucosas, células

cilíndricas y células metaplásicas benignas, así como presencia de displasia (leve,

moderada o grave). Estas características correlacionaban con determinados parámetros


33

de la siguiente manera: los sujetos de mayor edad tenían mayor número de macrófagos

pigmentados, neutrófilos y células columnares; los de mayor consumo de tabaco

(paquetes-año) tenían elevadas todas las características estudiadas salvo el número de

macrófagos; menores niveles de FEV1/FVC estaban asociados con mayores niveles de

todas las características estudiadas salvo los macrófagos y espirales. Existía una

correlación positiva hacia mayor cantidad de características citológicas entre el hecho

de continuar fumando y la edad y el número de paquetes-año; mientras que la ratio

FEV1/FVC correlacionaba de forma negativa con las características citológicas en los

que lograban dejar el hábito. Tras analizar los dos grupos, los que lograban abandonar el

hábito tenían diferencias significativas en las siguientes características: 14.7% reducción

de macrófagos; descenso de 3,9% de macrófagos pigmentados; y descenso de

neutrófilos, frente al ascenso en los que continuaban fumando. Se observaba una

diferencia no significativa en lo siguiente: los que dejaban de fumar tenían menores

niveles de células columnares, de moco, de espirales y de metaplasia. En cuanto a la

displasia, no se observó diferencia entre los dos grupos a lo largo del periodo de estudio.

34

III. FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALPHA

Factor de necrosis tumoral alpha

35

1.- Introducción

El Factor de Necrosis Tumoral (TNF-α) fue descubierto en 1975 por Carswell et

al, autores que identificaron una sustancia que producía necrosis en determinados

tumores en el suero de ratas infectadas con el bacilo de Calmette-Guérin (BCG) y

tratadas con endotoxinas. Esta sustancia (TNF-α) mediaba la necrosis tumoral inducida

por endotoxinas, y además podía ser responsable de la citotoxicidad selectiva de

macrófagos activados50.

Tras esta primera definición, se identificó el TNF-α como una citocina con

diferentes efectos en tejidos y células entre los que se encuentran: 1) la activación del

endotelio, que conduce a una liberación del factor de crecimiento derivado de las

plaquetas51 y a cambios en la morfología endotelial y en la organización celular52; 2) la

estimulación de las linfocitos B humanos, si se combina con otros mitógenos de dichas

células53 ; 3) y otras propiedades inmunomoduladoras54.

El TNF-α se ha considerado tradicionalmente un agente antitumoral que

originaba caquexia e inflamación55. Hoy día es bien conocido su papel en la defensa

contra virus, bacterias e infecciones parasitarias, así como su mediación en la

inflamación y en varias reacciones inmunológicas. Su producción fisiológica sirve como

protección, pero su sobreproducción puede ser perjudicial e, incluso, letal56.

El efecto perjudicial en la sobreproducción del TNF-α se observa en el efecto

letal de las endotoxinas en el shock séptico mediado por el TNF-α, como demostraron

Rothstein et al. Estos autores comprobaron que existía una sinergia entre TNF-α y

bacterias o productos de éstas, causando necrosis hemorrágica y shock letal a ratones no

manipulados. Estos autores inyectaron TNF-α como única sustancia subcutánea, o junto

con: 1) lipolisacáridos (endotoxinas) de Escherichia Coli; 2) Corinebacterium parvum

(gram positivo) inactivado por calor; 3) lisados de células infectadas por micoplasmas.


36

El TNF-α no producía necrosis hemorrágica cuando era administrado como único

producto; tampoco producía shock letal, salvo cuando se administraba a la dosis

máxima (160 μg) y sólo en el 10% de los ratones. La combinación de TNF-α con LPS

tenía una acción sinérgica sobre la mortalidad por shock. De la misma manera,

inyecciones secuenciales de LPS seguidas de TNF-α originaban una necrosis

hemorrágica masiva en la mayoría de los ratones (21 del total de 26), y muerte posterior

en la mitad de ellos (11 de 21). Sin embargo, si la inyección primera era el TNF-α

seguida de LPS, no se producía ni necrosis hemorrágica ni muerte por shock, sugiriendo

así que son los LPS los que sensibilizan el tejido subcutáneo para la inducción de

necrosis. El TNF-α, junto con una suspensión de C. Parvum, producía necrosis

hemorrágica en el sitio de la administración pero no causaba muerte por shock. Pero si

la administración era intravenosa, se observaba un efecto sinérgico produciendo muerte

por shock, aunque en menor grado que la asociación TNF-α-LPS. Los preparados de

TNF-α con micoplasmas no demostraron efecto alguno sobre la mortalidad por shock,

aunque sí producían necrosis hemorrágica. Estos resultados indican que una sinergia

entre el TNF-α y bacterias (o sus productos) causa necrosis hemorrágica y shock mortal

en ratones normales57.

La actividad del TNF-α en la inflamación la encontramos en el trabajo de

Michie et al. Estos autores publicaron en 1988 un trabajo en el cual inyectaban

endotoxina de Escherichia coli a 13 voluntarios sanos. Medían los niveles de TNF-α

tras la administración de dicha toxina y tras un periodo control con administración de

suero salino. A un grupo de 8 pacientes les suministraron ibuprofeno previo a la

endotoxina o al suero salino. Comprobaron que entre 90 y 180 minutos tras la

endotoxina se producía un pico de TNF-α de 240 pg/ml, cifra significativamente mayor

a los 35 pg/ml de los controles con salino. En ese período de pico de TNF-α se


37

detectaban los síntomas gripales (escalofríos, dolor de cabeza, mialgias, náuseas), así

como fiebre, taquicardia y un incremento en las cifras de hormonas del estrés (ACTH y

adrenalina). En el grupo de pacientes que recibió ibuprofeno previo, se detectaron cifras

elevadas (170 pg/ml) a las 2 horas, que sin embargo volvían a la normalidad a las 4

horas. Y lo más destacado fue la ausencia de síntomas y la menor síntesis de hormonas

de estrés en este grupo. Por tanto, parece que la inhibición de la ciclooxigenasa no

afecta a los niveles de TNF-α circulante tras endotoxina; no obstante, la ausencia de

síntomas indicaría que las citocinas producen unas respuestas a través de la vía de la

ciclooxigenasa, y que es ésta la vía a través de la cual actuaría este grupo de fármacos, y

no inhibiendo la producción del TNF-α58.

2.- Mecanismo de acción

El TNF-α a nivel celular ha sido implicado en multitud de acciones, como por

ejemplo en la activación de varios genes relacionados con las respuestas inmunológica e

inflamatoria, en proliferación celular, respuesta antiviral, inhibición del crecimiento y

muerte celular56. Actualmente se ve como un mediador endógeno de la inflamación y

fenómenos asociados, siendo las células endoteliales las principales dianas

proinflamatorias del TNF-α. Esta sustancia no tiene actividad enzimática y todas sus

acciones resultan de las respuestas de células ante la presencia de la citocina. Ésta activa

dos vías de señalización: una que conduce a la activación de nueva transcripción de

genes, y otra que lleva a la muerte celular.

El TNF-α induce la muerte celular en células tratadas con la citocina, a través de

la apoptosis o por necrosis celular, dependiendo de determinadas variables como el tipo

de célula, dosis y condiciones de la exposición al TNF-α. El receptor I del TNF-α

(TNFR-I, correspondiente al receptor de 55 kDa) es el principal implicado en la


38

transducción de la muerte celular. Estos receptores se encuentran localizados en su

mayoría en el complejo perinuclear de Golgi. No obstante, y ante determinadas

circunstancias, el receptor II (TNFR-II, de 75 kDa) ensalza la señal de muerte celular

del receptor I, o bien interviene él mismo en dicha muerte. Este último receptor se

localiza en la superficie celular. Existe suficiente evidencia de que el TNF-α induce

cambios en la estructura y función de las mitocondrias, que tienen un papel activo en la

muerte celular. Pero además el TNF-α activa sistemas de señalización en múltiples

compartimentos subcelulares como plasma celular, mitocondrias, endosomas, citosol y

núcleo59. (Fig. 1)

Figura 1: Receptores I y II del TNF-α en la célula, sus complejas relaciones con

órganos intracelulares y con otros mediadores. Tomado de Ledgerwood et al59.

3.- Metabolismo del TNF-α

El metabolismo del TNF-α marcado con yodo 125 radiactivo se ha estudiado en

ratas a las cuales se les había inyectado LPS. En estos animales se observó una

elevación en niveles de TNF-α a los 15 minutos de la administración, con un pico a las


39

2 horas, alcanzando de nuevo niveles basales a las 5 horas. La vida media plasmática

fue de 6 minutos aproximadamente. Los tejidos que captaban el 80% de actividad de

TNF-α no circulante fueron: piel, tracto gastrointestinal, riñón, hígado y pulmón; el

cerebro fue el órgano que menos captación radiactiva tenía. Se comprobó que el TNF-α

era degradado rápidamente en el tejido periférico sin formación de productos

intermedios; sólo 10% de la sustancia radiactiva se detectó en la orina (como producto

de degradación y no como sustancia activa)60.

Con la intención de conocer la farmacocinética, la toxicidad y la actividad

biológica del TNF-α, se realizó un estudio con TNF-α recombinante (TNFr) en 20

pacientes con cáncer metastásico. Inyectaron TNFr dos veces por semana durante 4

semanas de forma alternativa, bien vía intravenosa (IV) o vía intramuscular (IM). Tras

la administración IV, se detectaban niveles en suero entre 25 y 100 μg/m2, y se calculó

una vida media de 14-18 minutos. Tras la inyección IM, los niveles en suero eran de

150 μg/m2 o mayores, con un pico de concentración en las 2 primeras horas, y

ocasionalmente se detectaba en el límite más bajo a las 24 horas61.

Por tanto, podemos decir que el TNF-α circulante tiene un vida media de entre 6

y 18 minutos, que su degradación se produce en su mayoría en los tejidos periféricos,

sin originar productos activos, y con mínima eliminación en orina.

4.- Receptores del TNF-α

Estos receptores fueron identificados por Hohmann et al, tras varios intentos

previos con descripción de productos de distintas masas moleculares. Estos autores

demuestran que las células mieloides tienen mayoritariamente productos cruzados de

98-100 kDa, mientras que los de las células de origen epitelial eran de 75 y 95 kDa.

Esto les sugiere que, al menos, existen dos tipos de receptores TNF-α62.


40

Brockhaus et al, a través de estudios con TNF-α marcado con yodo radiactivo y de

inmunoprecipitación, reconocen dos proteínas, de 55 kDa y 75kDa, que actúan en la

señal de reconocimiento de TNF, pudiendo así ser consideradas como receptores de

TNF-α63.

El TNF-α es una citocina, liberada por macrófagos y linfocitos, con una potente

actividad proinflamatoria que realiza sus acciones a través de dos receptores

transmembrana: TNF-R p55 y TNF-R p7564. Estos receptores forman parte de una

superfamilia que incluye el factor de crecimiento de nervios (NGFR), antígeno Fas,

CD27, CD30, CD40, OX40 y 4-1BB. Los dominios ricos en cisteína de la parte

extracelular de estos receptores, son homólogos a proteínas víricas producidas por el

virus de la varicela vacuna, el virus del fibroma Shope y el virus mixoma. La

cooperación entre estos receptores es compleja y su interacción puede resultar en una

inhibición o una excitación de la señal. La señal del TNF-α a las células está mediada

por el receptor p55, mientras que la principal función del receptor p75 es la de presentar

el TNF-α al receptor 5565.

El receptor p55 interviene en: la inducción del receptor de IL-2, actividades

antivirales, estímulos del crecimiento, la expresión de antígenos HLA y la adhesión de

células endoteliales. El receptor p75 actúa en la proliferación de los timocitos inducida

por el TNF-α66.

Aunque ambos receptores se expresan en la superficie de la mayoría de los

diversos tipos de células, TNF-R p55 se expresa principalmente en células de estirpe

epitelial , y TNF-R p75 en células de origen mieloide63.


41

5.- TNF-α y tabaco

La influencia del tabaco en los niveles de TNF-α ha provocado mucha

controversia entre los diversos estudios publicados al respecto: unos llevados a cabo en

células de laboratorio, otros en animales y algunos también en humanos.

Ouyang et al estudiaron el efecto de extractos del tabaco sobre la producción

humana in vitro de IL-1β, IL-2, TNF-α y IFN-γ. Determinaron la concentración de

hidroquinona y catecol en extractos del humo del tabaco mediante cromatografía líquida

de alta eficacia (HPLC). Las células mononucleares de sangre periférica de humanos no

fumadores (PBMC) se trataron con extractos del humo del tabaco (hidroquinona,

catecol, nicotina, fenol, resorcinol, o-cresol, m-cresol o p-cresol), y posteriormente se

estimularon con anti-CD3 y forbol-12-miristato-13-acetato. Los niveles de citocina en el

sobrenadante fueron medidos por ELISA. Estos autores demostraron que: 1) los

extractos del humo del tabaco suprimían de forma muy intensa (en relación a la

concentración de estos tóxicos) la producción de IL-1β, IL-2, TNF-α y de IFN-γ; 2) la

nicotina disminuía ligeramente, en cultivos de sangre periférica, la producción de TNF-

α (38%), IL-2 (27%), IFN-γ (21%), IL-1β (8%); 3) la hidroquinona y el catecol

(productos de la pirolisis del tabaco) llegaban a producir una inhibición de la

producción de las 4 citocinas hasta en un 90%, incrementándose así el riesgo de

infecciones y de cáncer de pulmón67.

En discrepancia con este trabajo, Morimoto et al68 no lograron demostrar que el

humo del tabaco influya por sí solo en la producción de TNF-α. Estos autores realizaron

experimentos en ratas que eran expuestas durante 4-5 días a concentraciones de 10

mg/m3 de humo de tabaco durante 8 horas (Fig. 2).


42

Figura 2: Diagrama del sistema utilizado por Morimoto et al para la exposición al

humo del tabaco en ratas68.

Tras esta exposición al humo de tabaco, se les realizaba un BAL y se comparaba con el

BAL de ratas similares que no habían sido expuestas al humo del tabaco. Las expuestas

al humo de tabaco demostraban tener un número significativamente mayor de células en

el BAL, aunque el contaje celular diferencial de ambos grupos no variaba. De los

macrófagos de dicho BAL se estudió la producción de TNF-α y se observó que, en

ambos grupos, la producción era similar. Sin embargo, si a dichos macrófagos se les

estimulaba con crisolita, las diferencias eran significativamente mayores para el grupo

de ratas expuestas al humo del tabaco. Además, esta mayor producción dependía de las

concentraciones de crisolita. En el caso de usar fibras de cerámica para estimular a los

macrófagos, la producción de TNF-α era mayor en el grupo de ratas expuestas, pero sin


43

diferencias significativas. Concluyen, por tanto, que el humo del tabaco y las fibras

minerales tienen un efecto sinérgico en la producción de TNF-α por los macrófagos

alveolares.

Zhang et al estudiaron el efecto del humo del tabaco en ratas y el efecto de un

inhibidor del TNF-α (proteína de fusión Fc IgG: receptor II de TNF recombinante

humano, rhTNFR:Fc) sobre la apoptosis de células del septo alveolar. Distribuyeron a

las ratas en 4 grupos de 12 ratas cada uno: un grupo estaba formado por ratas control;

otro grupo por ratas sometidas a humo de tabaco (fumadoras pasivas); otro grupo, ratas

tratadas con TNF recombinante humano; y el último grupo, tratado con placebo. Los 3

últimos grupos fueron expuestos diariamente al humo del tabaco durante 80 días. Tras

un mes, a los 2 últimos grupos se les inyectaba rhTNFR:Fc o placebo dos veces por

semana durante 7 semanas. En estos grupos estudiaron la función pulmonar

(FEV0.3/FVC y PEF) y los niveles de TNF-α en suero y BAL, así como el intercepto

linear medio (medida de distancia entre las paredes alveolares), el número medio de

alveolos (como indicador de densidad alveolar) y el índice de TUNEL (como análisis

cuantitativo de apoptosis, mediante la reacción diaminobentidina mediada por

peroxidasa). Con respecto a la función pulmonar, comprobaron que el grupo de

fumadoras pasivas tenían valores de función pulmonar inferiores que el resto de grupos;

las del grupo intervención tenían niveles más elevados que las del grupo placebo. Los

valores del TNF-α en suero eran mayores en ratas fumadoras pasivas; las del grupo

placebo tenían niveles significativamente más altos que las del grupo intervención. En

BAL, el TNF-α estaba más alto en fumadoras pasivas, pero no se veían diferencias

significativas entre el grupo placebo y el grupo de intervención. El estudio histológico

revelaba que en el grupo control no existía enfisema, mientras que en los otros 3 grupos

sí era evidente un enfisema histológicamente avanzado: el intercepto linear medio


44

estaba aumentado y el número medio de alveolos disminuido. Además, observaron que

este proceso se caracterizaba por un infiltrado inflamatorio celular (Fig. 3).

Figura 3: Histología del parénquima pulmonar (hematoxilina-eosina, amplificada x

100). 1: ratas control. 2: ratas fumadoras pasivas. 3: ratas que recibieron el TNF

recombinante humano. 4: ratas tratadas con placebo. Tomado de Zhang et al69.

En cuanto a la apoptosis, las fumadoras pasivas tenían un mayor índice de TUNEL

respecto al grupo control y al grupo intervención, sin existir diferencias con el grupo

placebo (Fig. 4 y 5). Por tanto, un inhibidor del TNF-α podría reducir la apoptosis

alveolar septal en fumadores69.

Figura 4: Apoptosis de células del septo alveolar (fluorescencia amplificada x 200). 5:

ratas control. 6: ratas fumadoras pasivas. 7: ratas que recibieron TNF recombinante

humano. 8: ratas tratadas con placebo. Tomado de Zhang et al69.


45

Figura 5: Apoptosis de células del septo alveolar (TUNEL, amplificado x 400). 9: ratas

control. 10: ratas fumadoras pasivas. 11: ratas que recibieron TNF recombinante

humano. 12: ratas tratadas con placebo. Tomado de Zhang et al69.

Estudios en humanos, como el de Keatings et al, encuentran niveles más

elevados de TNF-α en el esputo inducido de fumadores con EPOC, pero no en

fumadores asintomáticos70. Estos autores estudiaron a 14 pacientes EPOC, 23

asmáticos, 12 fumadores control y 18 no fumadores control. Midieron en el esputo

inducido de todos los grupos el recuento celular y los niveles del TNF-α y la IL-8. Los

pacientes EPOC presentaban cifras más elevadas de neutrófilos en esputo que el resto

de grupos de pacientes estudiados, los cuales se correlacionaban con el grado de

obstrucción bronquial (FEV1). Los fumadores tenían también niveles significativamente

más elevados que los no fumadores. Los niveles de TNF-α también eran mayores en

EPOC, y ligeramente en los asmáticos frente a los grupos control. Sin embargo, y en

contra de lo que cabía pensar, los fumadores no mostraban diferencias en las cifras de

TNF-α en esputo inducido frente a los no fumadores; por tanto, los niveles elevados de

TNF-α en EPOC no deben ser efecto del consumo de tabaco per se. Por el contrario, IL-

8 sí era mayor en fumadores control frente a no fumadores. Estos autores sugieren que,

como TNF-α activa la proteolisis extracelular producida por los neutrófilos, y esta


46

actividad es un mecanismo de producción de enfisema, es este el mecanismo a través

del cual TNF-α actúa en la progresión de la enfermedad. Sin embargo, el hecho de que

los fumadores tengan mayores niveles de neutrófilos, pero no de TNF-α, sugeriría que

es necesaria la presencia de TNF-α para el desarrollo de la enfermedad.

Continuando la misma línea de estudio en humanos, Kuschner et al71 estudiaron

un grupo de 14 fumadores (que se abstuvieron de fumar las 8 horas previas a la

realización de la toma de muestras), y un grupo de no fumadores, en ambos casos sin

patología crónica ni aguda (4 últimas semanas) y sin tratamiento farmacológico activo.

A los dos grupos se les realizó espirometría y fibrobroncoscopia con BAL. En el BAL

de los fumadores existían niveles significativamente más elevados de macrófagos (524

vs 220 x 103/ml) y de neutrófilos (12,9 vs 2,1 x 103/ml); dichos niveles guardaban

relación con la intensidad del consumo de tabaco. En cuanto a las citocinas y proteínas

estudiadas en el sobrenadante del BAL, se observó que existían niveles

significativamente más elevados para los fumadores en las siguientes interleukinas: IL-

1β, IL-6, IL-8 y MCP-1 (proteína 1 quimiotáctica de macrófagos). Las cifras de TNF-α

eran más altas en fumadores (2,5 vs 0,2 pg/ml) pero no alcanzaban significación

estadística.

Sin embargo, existen series que describen el efecto supresor del tabaco sobre la

producción del TNF-α por los macrófagos alveolares y monocitos periféricos, estudiado

tanto in vivo como in vitro. McCrea et al seleccionaron a un grupo de 9 fumadores y 9

no fumadores sin patología crónica ni aguda en las 6 semanas previas, sin tratamiento

farmacológico en el momento del estudio y con valores espirométricos dentro de la

normalidad. Realizaron BAL, centrifugando inmediatamente el mismo, y congelando el

resultante libre de células. El BAL de los fumadores contenía 2 veces y media más

células que el de los no fumadores (65,3 x 108 vs 27,2 x 108). En el contaje diferencial


47

no existía diferencia entre ambos grupos. Los niveles de IL-6 del BAL de fumadores

eran muy inferiores a los de los no fumadores (1,8 vs 15,9 pg/ml). No existían

diferencias entre ambos grupos para los niveles de IL-8 y actividad quimiotáctica de

neutrófilos. No se detectaron niveles en ninguno de los dos grupos para TNF-α. Los

macrófagos del BAL fueron puestos a cultivar con lipolisacáridos (potente estímulo

fisiológico para la liberación de TNF-α e IL-6) y observaron que la liberación de TNF-

α por dichos macrófagos era mayor en el grupo de no fumadores que en el de

fumadores a las 6 horas (211 vs 1,406 unidades por 106 células), y esa mayor liberación

se mantenía a las 24 horas de dicha incubación. De la misma forma, la liberación de IL-

6 era también mayor en los no fumadores (5,8 vs 64,9 unidades hibridoma por ml). Por

tanto, concluyen que, incluso en fumadores sanos y jóvenes, el microambiente

pulmonar es anormal, explicado por niveles inferiores de IL-6, macrófagos con

disminución de capacidad para liberación de citocinas mediada por LPS, y

concentraciones elevadas de IL-811.

También el efecto supresor del tabaco sobre TNF-α es descrito por Dandrea et

al72, que estudiaron el efecto que el dióxido de nitrógeno (NO2) tenía sobre la liberación

de citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-8, MIP-1) por los macrófagos alveolares de fumadores y

no fumadores. El NO2 está presente en altas concentraciones (hasta 1000 ppm) en la

corriente principal del humo del tabaco, aunque no es ésta la concentración a la que se

encuentra expuesto el pulmón. Las células del BAL de un grupo de 6 fumadores y otro

de 6 no fumadores, sanos en ambos casos, fueron expuestas a este gas tóxico. En

fumadores, con concentraciones de 5 ppm no se producía ningún cambio en la

producción de estas citocinas; sin embargo, al incrementar la exposición a 20 ppm se

producía una disminución significativa de IL-8, TNF-α y MIP-1, pero no de IL-1β. Esta

inhibición se producía también en las células que habían sido estimuladas con LPS. En


48

el grupo de no fumadores, la exposición a 20 ppm de NO2 inhibía sólo la liberación de

TNF-α; no se producía ninguna alteración en la liberación de citocinas tras estimulación

con LPS. Sí comprobaron que los macrófagos del BAL de no fumadores liberaban 1,5

veces más TNF-α que el de los fumadores durante la incubación control. Esta alteración

en la liberación de citocinas mediada por NO2 sugiere que la inhalación de este gas en

los fumadores puede contribuir a la deteriorada defensa pulmonar contra infecciones.

6.- TNF-α y EPOC

Se han relacionado determinadas citocinas, entre ellas el TNF-α, con la EPOC

sobre todo en estadíos avanzados, formando parte de la cascada inflamatoria sistémica

desatada una vez que la enfermedad está establecida y desarrollada. Pero también está

implicada esta citocina en la patogénesis de la propia enfermedad. Así se sabe que el

TNF-α, junto con los neutrófilos, conducen a una degranulación, liberando elastasa,

lisozima y otras enzimas73, 74. Existen multitud de publicaciones que tratan de estudiar la

influencia del TNF-α en el desarrollo de EPOC, unas realizadas en estudios de

laboratorio y otras en humanos.

6.1.- Estudios de laboratorio

Gamble et al, usando TNF-α recombinante humano, demostraron que

éste aumentaba la adherencia de los neutrófilos sanguíneos a las células endoteliales de

vena umbilical in vitro. Dicha acción la ejercía mediante su efecto sobre los neutrófilos

y sobre las células endoteliales. El efecto sobre los neutrófilos era máximo en los

primeros cinco minutos, y no precisaba síntesis de proteínas o de RNA. Los máximos

efectos sobre las células endoteliales se alcanzaban a las 4 horas, y por el contrario, sí

que requerían síntesis de nuevas proteínas y RNA. Los efectos sobre los neutrófilos y


49

sobre las células endoteliales eran bloqueados por anticuerpos monoclonales anti-TNF.

El TNF-α inducía un rápido incremento en la superficie de antígenos neutrofílicos, que

eran reconocidos por los anticuerpos monoclonales. Así se demuestra que el TNF-α es

inductor de un proceso clave para el desarrollo de la respuesta inflamatoria73.

También se ha estudiado el TNF-α recombinante humano como estímulo

de la ruptura y degranulación de los neutrófilos del tracto respiratorio. Klebanoff et al

vieron que la LDH (marcador citoplasmático) era liberada por los neutrófilos tras ser

estimulados con TNF-α, lo que sugería un efecto lítico sobre los neutrófilos. Pero era

aún mayor la liberación de lisozima (presente principalmente en los gránulos de los

neutrófilos), con lo cual se observaba que el TNF-α tenía un efecto secretagogo sobre

los gránulos. Además, a diferencia de la acción del TNF-α sobre determinadas células

(células endoteliales, adipocitos, etc), que requieren su unión a receptores superficiales

y modificación genética, el efecto sobre los granulocitos era rápido e independiente de

la síntesis de RNA. Así, se puede concluir que el TNF-α es un estimulante natural de

neutrófilos que promueve la adherencia a células endoteliales y a partículas, lo que

origina fagocitosis y degranulación74.

Lucey et al75 encontraron que el enfisema inducido por la elastasa pancreática

porcina estaba muy disminuido en ratones cuyos receptores TNF-α se habían

inactivado. Estos autores estudiaron a un grupo de ratones a los que se les había

bloqueado el receptor de IL-B, el del TNF-α o ambos, y lo compararon con ratones que

no habían sido manipulados y disponían de todos los receptores anteriormente citados.

Administraron a estos ratones, una vez anestesiados, una única dosis intratraqueal de 30

μg de elastasa pancreática porcina (EPP) o bien 0,1 ml de suero salino. Posteriormente

los animales fueron exsanguinados y se extrajo su pulmón, obteniendo muestras de su

tejido pulmonar. Para la localización in situ de apoptosis, utilizaron un kit de marcaje de


50

DNA fragmentado, obteniendo una tinción de color marrón al microscopio. Una vez

llegados a este punto, medían el tamaño del espacio aéreo pulmonar (intercepto linear)

de los ratones manipulados y lo comparaban con el de los ratones control. Observaron

que en los días 1 y 3, las diferencias entre los ratones tratados con elastasa y los tratados

con salino eran mínimas. Sin embargo, a los días 5, 10 y 21, los valores medios eran

significativamente más elevados en los ratones manipulados (en los días 10 y 21, los

valores llegaban a ser el doble). El examen microscópico demostró que no existían

diferencias entre los 3 grupos de ratones sin receptores que habían sido tratados con

suero salino. En los tratados con EPP, existía un importante aumento de tamaño de las

paredes alveolares, compatible con destrucción (Fig. 6).

Figura 6: Fotomicrogramas de parénquima pulmonar tratado con 30 μg de EPP o suero

salino. A: ratón sin manipular tras ser tratado 21 días con suero salino. B: ratón sin

manipular tras tratamiento de 21 días con EPP. C: ratones sin ningún tipo de receptor

tras 21 días con EPP. El tamaño y la estructura alveolar son normales en la figura A. En

la figura B existe una destrucción de las paredes alveolares y un aumento de tamaño del

espacio alveolar. La severidad del enfisema es menor en la figura C que en la B. EPP:

elastasa pancreática porcina. Tomado de Lucey et al75.


51

También se observó un incremento de las células marcadas para detectar

apoptosis en las ratas no manipuladas tratadas con EPP. Por el contrario, análisis de las

imágenes de este material en ratones sin receptores demostraron menores niveles de

apoptosis (Fig. 7). Por tanto, concluyen que los mediadores inflamatorios incrementan

el enfisema inducido por EPP en ratones y que la cuantía de la apoptosis, producida de

alguna manera por estos mediadores, contribuye al desarrollo de enfisema mediante el

defecto en el proceso de reparación.

Figura 7: Fotomicrograma del parénquima pulmonar de un ratón no manipulado, 1 día

después de ser tratado con EPP, que demuestra células positivas para el marcado de

transferasa desoxinucleótida. Las flechas indican las áreas positivas. EPP: elastasa

porcina pancreática. Tomado de Lucey et al75.

Churg et al76 también realizaron experimentos con ratones a los que se les había

eliminado los receptores TNF-α (p55/p75). Exponían a estos ratones al humo de 4

cigarrillos, utilizando un dispositivo para fumar. Una vez transcurridas 24 horas de la

exposición, se les inducía la muerte por sobredosis de halotano y se les extraían los


52

pulmones. Les introducían un catéter a través de la tráquea y realizaban un lavado

intrapulmonar con 1 ml de suero salino frío para contaje celular, o con agua destilada

para el análisis de degradación de tejido conectivo. De un grupo determinado de ratones

obtenían el RNA pulmonar, según el método de Chomezynski y Sacchi77, y realizaban

la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa. En los ratones control

observaron que 2 horas tras la exposición al humo del tabaco, se incrementaba

ligeramente la expresión genética del TNF-α, se producía una marcada expresión de la

proteína-2 inflamatoria de macrófagos (MIP-2), y, aproximadamente, se duplicaba la

expresión de la proteína 1 quimiotáctica de macrófagos (MCP-1). Por el contrario, los

ratones manipulados no tenían incremento en ninguno de los productos genéticos, y

existía, de hecho, una disminución en la expresión de TNF-α. A las 6 horas de la

exposición, los niveles de TNF-α, MIP-2 y MCP-1 volvían a los niveles basales en los

ratones control, y así se mantenían igualmente a las 24 horas. En los ratones sin

receptores TNF-α, no se producía cambio alguno ni a las 6 ni a las 24 horas. En los

ratones control, a las 24 horas, se observaba un incremento importante de los neutrófilos

en el lavado, así como un ligero incremento en macrófagos, desmosina (medida de

ruptura de elastina) e hidroxiprolina (media de ruptura de colágeno). Esta misma

observación no se podía demostrar en los ratones manipulados, de la misma forma que

tampoco se veían cambios tras exposición durante 7 días (mientras sí se veía un

continuo incremento en neutrófilos y macrófagos del lavado en los ratones control).

Estos autores concluyen, pues, que el TNF-α es clave para la inflamación aguda

producida por el tabaco y produce una destrucción del tejido conectivo, precursor de

enfisema.


53

6.2.- Estudios en humanos

Takabatake et al estudiaron pacientes EPOC frente a sanos para tratar de

conocer la fisiopatología de la EPOC. Determinaron los niveles de Fas (receptor

transmembrana expresado en células normales y malignas) y TNF-α en 34 pacientes

EPOC frente a 35 controles sanos. Ambas sustancias son dos importantes mecanismos

de apoptosis en humanos, que in vitro, han demostrado similar activación por la

hipoxia. La hipoxia crónica está presente en la EPOC y se ha demostrado que el sistema

TNF-α está activado debido a la misma.78 Estos autores intentaron demostrar si los

cambios fisiológicos en pacientes EPOC hipoxémicos tenían influencia sobre el sistema

Fas-Fas. Demostraron que los niveles de TNF-α estaban significativamente más

elevados en los pacientes EPOC (6,45 vs 5,21 pg/ml). Por el contrario, no encontraron

diferencias significativas en los niveles de Fas entre ambos grupos. Concluyen así que

el sistema Fas por sí solo no juega un importante papel en la fisiopatología del EPOC79.

Estos mismos autores pretendían demostrar in vivo lo que algunos autores

habían demostrado in vitro: la hipoxia acelera la producción de TNF-α en macrófagos

alveolares estimulados por lipopolisacáridos y en células mononucleares periféricas.

Estudiaron a 27 varones con diagnóstico de EPOC estable en los 3 últimos meses, y

comprobaron cómo los valores de TNF-α estaban significativamente más elevados en

los EPOC (6,15 vs 5,41 pg/ml). Comprobaron igualmente que existía una relación

inversa entre PaO2 y el TNF-α circulante. Además, los pacientes con PaO2 < 60 mm

Hg tenían niveles significativamente mayores que los que mantenían PaO2 > 60 mm

Hg. (6,76 vs 5,79 pg/ml). Concluyen así que la hipoxemia activa el sistema TNF-α en

pacientes EPOC78.


54

7.- Niveles de TNF-α en la población general

Los niveles de TNF-α han sido estudiados en la población general y se ha visto

que dichos niveles están significativamente asociados al sexo (ligeramente inferiores en

mujeres) y a la edad (niveles más elevados en grupos de mayor edad)80. Se estudiaron

568 pacientes de entre 13 y 80 años, incluidos en el segundo estudio nutricional de

bávaros, a los cuales se les extrajo una muestra sanguínea. Se estudió la relación entre

los niveles de TNF-α, de sus receptores y de IL-6 con sexo, edad, IMC, historia de

tabaquismo, hipertensión o diabetes. Así, observaron que las mujeres tenían unos

niveles de TNF-α ligeramente menores que los varones, al igual que ocurría con el

receptor p55. Sin embargo, el receptor p75 y la IL-6 no tenían relación con el sexo del

paciente. El grupo de mayor edad (>= 70 años) tenía niveles significativamente más

elevados que el resto de grupos de edad en TNF-α, sus receptores e IL-6. EL IMC no

tenía relación con los niveles de TNF-α; sin embargo, los pacientes con mayor IMC sí

demostraban tener mayor IL-6 y receptores de TNF-α (incluso tras corregirlo con edad

y sexo). Después de ajustar a los pacientes por edad, sexo e IMC, no se encontró que el

consumo de tabaco, ni el padecer diabetes o hipertensión estuvieran asociados con las

cifras de las citocinas estudiadas.

A diferencia del estudio anterior, se ha comprobado que existen niveles más

elevados en pacientes obesos81. Park et al estudiaron a 100 asiáticos (46 obesos frente a

54 con IMC < 25 kg/m2), una vez excluidos aquellos con enfermedad maligna o

inflamatoria previamente diagnosticada. En ambos grupos determinaron los niveles de

PCR, IL-6 y TNF-α. Para las tres citocinas estudiadas existían unos niveles

significativamente más elevados en los obesos (para TNF-α, 1,72 vs 2,69 pg/ml).

Además, dichos niveles se correlacionaban con peso, IMC, perímetros de cintura y de

cadera, y la relación cintura-cadera. Sin embargo, y a diferencia de PCR y de IL-6, en


55

los sujetos obesos, TNF-α no se relacionaba con los parámetros antropométricos o

depósito abdominal de grasa (tejido adiposo total, tejido adiposo subcutáneo, tejido

adiposo visceral).

También se ha estudiado la influencia de la diabetes. Se comprobó que los

pacientes diabéticos tenían igualmente mayores niveles de TNF-α, lo cual se ha

relacionado con la resistencia a la insulina en modelos animales de obesidad. En estos

animales se comprobó que se recuperaba la sensibilidad a la insulina al neutralizar el

TNF-α mediante la administración de receptor soluble de TNF-α82.

Por tanto, parece que TNF-α está más elevado en varones, de mayor edad, en

relación al peso y con la presencia de diabetes.

56

IV. CONDENSADO DE AIRE EXHALADO

Condensado de aire exhalado

57

1.- Introducción

El árbol bronquial presenta inflamación en relación con multitud de enfermedades.

La medida de esta inflamación local se ha realizado tradicionalmente con pruebas

invasivas, como el lavado broncoalveolar, o mediante técnicas no invasivas, pero no

exentas de problemas, como el esputo inducido. Una técnica aún no difundida en la

práctica clínica habitual es el condensado de aire exhalado (CAE). Esta técnica comenzó a

conocerse en la década de los ochenta por medio de un grupo de autores rusos83, y

posteriormente suscitó interés de tal forma que se han publicado multitud de artículos en la

literatura acerca de la utilidad de este método en la investigación de enfermedades

pulmonares y en enfermedades ocupacionales. Desde hace varios años el aire exhalado se

utiliza como herramienta de diagnóstico y control de tratamiento. Así el análisis del óxido

nítrico exhalado se está difundiendo como medida de inflamación en enfermedades

respiratorias, como el asma bronquial84.

La muestra recogida en el CAE reflejaría la capa de fluidos extracelular

broncoalveolar. En la capa de fluidos de las vías aéreas inferiores se han encontrado

múltiples sustancias volátiles y hasta 200 no volátiles. Entre las moléculas no volátiles que

se encuentran en el aire exhalado se incluyen proteínas, lípidos, oxidantes y nucleótidos.

Estas moléculas representan marcadores de varios procesos patológicos pulmonares.

Distintos marcadores de stress oxidativo y/o mediadores de la inflamación (8-isoprostano,

leukotrienos, postraglandinas, etc.) se han detectado en el CAE de sujetos sanos y de

pacientes con diferentes patologías inflamatorias de las vías aéreas. No obstante, en la

literatura científica existe una gran variabilidad en la concentración de solutos en el CAE,

algunos de los cuales se han visto que son similares para sujetos sanos y enfermos de

distintas patologías.


58

Se piensa que la capa de fluidos de la vía aérea, debido a la turbulencia del flujo de

aire, se convierte en aerosol y, por tanto, el contenido del condensado procedería de los

alveolos y bronquíolos, reflejando así la composición del lavado broncoalveolar (BAL)5.

A pesar de esto, las comparaciones realizadas en determinadas publicaciones no

correlacionan los marcadores en CAE y BAL. Así Jackson et al llevaron a cabo un estudio

comparativo entre CAE y BAL para tratar de determinar concentraciones de

biomarcadores en enfermedades e investigar el lugar de procedencia del CAE. Las

muestras fueron recogidas de 49 pacientes a los que se les iba a realizar una broncoscopia

por indicación clínica. Para identificar los componentes alveolar y mucinoso, realizaron

determinaciones de: óxido nítrico, 8-isoprostano, peróxido de hidrógeno, pH, proteínas

totales, y fosfolípidos y queratina. Los resultados de 8-isoprostano, óxido nítrico y pH

fueron significativamente más elevados en CAE que en BAL (3,845 vs 0,027 ng/ml; 28,4

vs 3,8 μM; y 7,35 vs 6,4 respectivamente; p<0,001). Por el contrario, el peróxido de

hidrógeno no mostró ninguna diferencia entre ambas muestras (17,5 vs 20,6 μM), mientras

que las proteínas estaban significativamente más elevadas en BAL (33,8 vs 183,2 μg/ml,

p< 0,001). Los fosfolípidos totales en el CAE estaban en mayor concentración, pero la

queratina no presentaba diferencias. No encontraron asociaciones entre CAE y BAL para

ninguno de los marcadores estudiados, corregidos o no según dilución. Por lo tanto,

concluyen que, aunque se pueden medir fácilmente biomarcadores en el CAE, estos

valores no deben ser comparados directamente con la información que proporciona el

BAL. Aunque no era el motivo principal de su estudio, sí destacaron que en contra de lo

esperado, la queratina (que procede de las células epiteliales) era similar en CAE y BAL

(cuando se supone que debería ser mayor en CAE, ya que éste examina toda la vía aérea,

desde la orofaringe a los alveolos), mientras que los fosfolípidos (que se encuentran

principalmente en el surfactante) estaban significativamente más elevados en CAE85.


59

2.- Descripción de la técnica

Se han utilizado dispositivos cuasi-artesanales que recogen la muestra mediante un

tubo, a través del cual se exhala, que se encuentra introducido en una cubeta con hielo o

nitrógeno líquido (Fig. 8).

Figura 8: Representación de un dispositivo semi-artesanal de recogida de condensado de

aire exhalado utilizado en los primeros estudios. Tomada de Hunt et al90.

Muchos tipos se han usado como tubos de teflón inmersos en agua helada86,

condensadores de doble pared con una cámara interna con hielo87 (Fig. 9), tubos de doble

luz enfriados mediante aire frío a través de la luz externa, y más recientemente

dispositivos disponibles comercialmente que disponen de un cilindro de aluminio para

enfriar (Rtube, Respiratory Research Inc, Charlottesville, VA)88 (Fig. 10) o refrigerar el

sistema (EcoScreen, Jaeger, Alemania).

Aire exhalado

Cubeta con hielo Condensado

recogido


60

Figura 9: Representación esquemática del aparato de colección de condensado exhalado.

Tomada de Horváth et al87.

Figura 10: Rtube, Respiratory Research Inc, Charlottesville, VA. Sistema de recogida de

CAE. a) El sujeto respira a volumen corriente a través de la boca. El aire ambiente se

inhala a través de una válvula unidireccional. El aire exhalado es conducido a través de

otra válvula unidireccional que está dentro del dispositivo. El condensado se forma y se

recoge de la pared del condensador mediante un émbolo tipo jeringa. b) Para monitorizar

la ventilación, un monitor de dióxido de carbono para el final del volumen tidal se añade a

la cámara del condensador. El flujo unidireccional asegura que las medidas sean lo más

Sujeto

Hielo

Válvula unidireccional Cámara Interna

Cámara Externa

Condensado exhalado

Válvula


61

exactas posibles. c) El mismo sistema de colección conectado a un circuito de ventilación.

Un tubo endotraqueal fenestrado se utiliza para aislar la vía aérea inferior. El condensador

se coloca en el brazo de exhalación del circuito. Tomada de Vaughan et al88.

Existen ya en el mercado dispositivos comercializados muy simples para su uso

(Fig. 11), como el EcoScreen, fabricado por Eric Jaeger GMBH (Hoechberg, Alemania),

el cual es un sistema eléctrico refrigerado modificado de dispositivo de aire frío. Dispone

de un brazo extensible y móvil que permite al paciente sentarse cómodamente en una silla

y exhalar en el interior de una cámara congelada. Esta es eficiente en condensar fluidos ya

que el condensador mantiene una temperatura de unos – 10º C en el período de

recolección de la muestra.

Figura 11: Representación esquemática del funcionamiento de un dispositivo de

condensador.

Previo al inicio de la prueba se le pide al paciente que se enjuague la boca y que

trague saliva periódicamente para evitar la contaminación de la muestra por saliva. El

Respiración tidal

Cámara de recogida de muestra

Aire ambiental

2-4 ml de condensado/5-10 min


62

paciente respira a través de una boquilla que dispone de una “trampa” cerca para retener la

saliva y evitar contaminación de la muestra por saliva del paciente (Fig. 12). El aire

inspirado procede del aire ambiente, y una válvula “no rebreathing” evita que el aire

espirado vuelva al paciente y se dirige así hacia el aparato, en cuyo interior hay una

cámara congelada, que mantiene una temperatura de – 20º C89.

Figura 12: Representación esquemática de un dispositivo de condensador. La válvula de

bloqueo es una válvula que impide que se mezclen el aire espirado y el inspirado. Tomada

de Montuschi et al5.

La técnica consiste en realizar respiraciones a volumen corriente entre 10 y 15

minutos, tiempo suficiente para recoger entre 1-3 ml de CAE. Debe congelarse la muestra

a –70º C, ya que son necesarias temperaturas bajas para preservar la labilidad de

determinados marcadores inflamatorios como los mediadores lipídicos. Posteriormente es

Válvula unidireccional

Depósito de recogida de muestra

Cubierta refrigerante

Válvula de bloqueo

Condensador lamelar

Pieza bucal


63

analizado por cromatografía y/o espectrofotometría de extracción o por

enzimainmunoensayo (ELISA)84, 90.

3.- Ventajas e inconvenientes de la técnica

Esta técnica tiene la ventaja de ser no invasiva, de poder repetirse sin problemas,

de poder usarse en fase estable o en fase aguda de la enfermedad, se puede usar en niños y

en pacientes graves. Así se ha usado en pacientes ventilados en UCI, conectándolo al

brazo espiratorio del ventilador, para comparar parámetros inflamatorios de estos

pacientes con personas sanas fumadores y no fumadores. Sack et al estudiaron a 11

pacientes conectados a ventilación invasiva en UCI durante 24-72 horas (con diagnóstico

de neumonía grave y síndrome de distrés respiratorio), 12 fumadores sanos y 21 controles

sanos. En las muestras de CAE de todos ellos determinaron varias IL (1B, 6, 8, 10), TNF-

α y IL-12p70. Los pacientes con enfermedades inflamatorias pulmonares tenían niveles

elevados de todos los parámetros estudiados en CAE en comparación con el grupo

fumador y el no fumador sano91. Además se ha demostrado que la técnica no tiene

influencia posterior en la función pulmonar ni en la inflamación5. No obstante, existen aún

algunos problemas en la recogida, análisis e interpretación del condensado de aire

exhalado que han de ser tenidos en cuenta84, 92.

La principal limitación es la ausencia de métodos estándares de recolección. Además otros

problemas son la falta de reproducibilidad, la variabilidad, la influencia de factores

externos (alcohol, tabaco, fármacos) y la labilidad de determinadas sustancias encontradas

en el CAE para su medición tras congelación. Debido a la falta de consenso, y para tratar

de que todos los trabajos que utilicen CAE sigan las mismas normas, se publicó una

normativa conjunta entre las sociedades europea y americana de Neumología (ERS /

ATS)90. Otro inconveniente con el que nos encontramos es la falta de guías clínicas que


64

nos informen sobre valores de referencia para personas sanas o con determinadas

enfermedades pulmonares, relación de dichos valores con síntomas o con función

pulmonar; o estudios clínicos que analicen la respuesta a fármacos5, 90, 93. No obstante, se

han realizado trabajos para intentar comparar los valores de sujetos sanos y pacientes con

determinadas patologías. Así, Montuschi et al midieron 8-isoprostano en CAE como

marcador de stress oxidativo en 12 fumadores sanos, 10 no fumadores y pacientes EPOC

(25 exfumadores y 15 fumadores activos). Los niveles de 8-isoprostano eran similares en

EPOC exfumadores (40 pg/ml) y EPOC fumadores activos (45 pg/ml), pero eran menores

en fumadores sanos (24 pg/ml, p< 0.001) y menores aún en no fumadores (10,8 pg/ml, p<

0,05). Para conocer el efecto del consumo agudo de tabaco, a 12 fumadores sanos les

midieron 8-isoprostano tras una abstinencia de 12 horas, y 15 minutos (así como 5 horas)

después del consumo de dos cigarrillos consecutivamente. Con respecto a los niveles

basales, el 8-isoprostano estaba más elevado a los 15 minutos del consumo de tabaco (32,3

vs 20,7 pg/ml; p< 0,03), y aunque mostraba una tendencia, no existían diferencias

significativas a las 5 horas (28,9 vs 20,7 pg/ml; p< 0,073)94.

También se desconoce todavía la influencia de la edad, sexo, maniobras

respiratorias (espirometrías), calibre de la vía aérea, ritmo circadiano, infecciones y uso de

medicación sobre marcadores de CAE. No obstante, Koutsokera et al, en una revisión

reciente, analizan la influencia de determinados factores demográficos en sujetos sanos

para tratar de establecer unos valores de referencia95. Así por ejemplo analizan:

- Tabaco: los fumadores tienen niveles más altos de H2O2 y 8-isoprostano en

relación a no fumadores.

- Obesidad: IL-6, a diferencia de 8-isoprostano, está elevado en CAE de sujetos

obesos frente a sujetos con valores de peso dentro de la normalidad. Otros

autores, discrepan de esta afirmación y han publicado datos de que el IMC no


65

se correlaciona con H2O2 y TBARs (sustancias reactivas al ácido

tiobarbitúrico) en CAE.

- Sexo: existen datos controvertidos en cuanto al impacto que pueda tener el

género del sujeto sobre niveles de H2O2 en CAE.

En cuanto a circunstancias especiales revisan las siguientes:

- Efecto del flujo y parámetros de función pulmonar: existen muchas dudas de la

influencia del patrón respiratorio en la cantidad de muestra obtenida o en la

concentración de los mediadores a estudio. Existen trabajos que han encontrado

que el factor que más influye en el volumen exhalado es la ventilación minuto

y la duración de la recolección. Gessner et al estudiaron la influencia sobre la

cantidad de condensado obtenida, de factores como la frecuencia respiratoria,

el volumen tidal, los parámetros de función pulmonar, el peso, la edad y la

altura del paciente. Tomaron muestras de 22 voluntarios sanos y 23 pacientes

EPOC. En ambos grupos observaron una fuerte correlación del volumen de

condensado obtenido con el volumen total respirado. No se encontró

correlación significativa con TLC, VR, VC, FEV1, Rtot, altura, peso o edad en

ninguno de los dos grupos. Sí encontraron un dato muy interesante: si la

ventilación se mantiene constante, el volumen de condensado obtenido se

incrementa linealmente a través del tiempo. Por tanto, concluyen que depende

más de ventilación que de datos de función pulmonar96. Otros trabajos han

demostrado que incrementando el volumen minuto y el volumen corriente se

puede obtener una mayor cantidad de condensado sin influir en la

concentración de determinadas sustancias no volátiles, como nitritos y

proteínas. McCafferty et al estudiaron el agua total exhalada y el volumen de


66

CAE obtenido en 3 grupos de 10 pacientes cada uno a los que ponían a respirar

a diferentes volumen minuto, volumen tidal (VT) y condiciones de aire

inspirado distintas. Observaron que los volúmenes obtenidos se incrementaban

significativamente con el volumen minuto, de tal forma que para 7,5, 15 y 22,5

l/min, el CAE obtenido era 627, 1019 y 1358 μl, respectivamente (p<0.001)97.

Menores VT proporcionaban menores cantidades de vapor de agua exhalado

(26,6 vs 30,7 μl/l, diferencia media 4,1 μl/l, p<0,001) y de CAE (4,3 vs 7,6 μl/l,

diferencia media 3,4 μl/l , p<0,001). En este mismo trabajo se observó que las

características del aire inspirado también influían en el volumen de condensado

obtenido, ya que respirando un aire más seco y frío, la cantidad de condensado

obtenida era menor que en condiciones estándar (p<0,05). Los cambios en

parámetros de respiración no tenían influencia sobre las concentraciones de

proteínas y nitritos en CAE, ni tampoco en pH. Por tanto, concluyen que el

volumen de condensado puede ser incrementado usando mayores volúmenes

tidal y mayores Vmin sin comprometer la dilución de la muestra. Un trabajo

más reciente de Liu et al analiza la influencia que determinados parámetros de

función pulmonar (VT, Vmin y TLC) puedan tener sobre el volumen de CAE

obtenido. Estudiaron 23 sujetos sanos, 25 pacientes EPOC y 17 pacientes

asmáticos, obteniendo cantidades de 5,55 μl/respiración, 3,56 μl/respiración y

5,77 μl/respiración respectivamente. El volumen de CAE obtenido se

relacionaba significativamente con VT (r Pearson = 0,075, p<0,0005) y Vmin

(r Pearson = 0,425, p< 0,0005), pero no se correlacionaba con TLC. Tampoco

se encontró correlación alguna con edad, sexo ni status de enfermedad98.

- Efecto del consumo agudo de tabaco: existen varios estudios con escaso

número de pacientes, que analizan este efecto. En general, los niveles de


67

compuestos derivados del NO, aldehídos y proteínas totales no cambian por el

consumo de tabaco; el 8-isoprostano y el TNF-α aumentan; y la IL-1B y el

glutation disminuyen a los pocos minutos de fumarse un cigarro.

- Variación diurna: Nowak et al demostraron que el ritmo circadiano afectaba a

los niveles de H2O2, que se exhala con un patrón de variación diurn99.

- Exposición a ozono: una exposición de 2 horas a 0,1 ppm de ozono es capaz de

producir cambios en marcadores de inflamación y estrés oxidativo.

- Ejercicio: un significativo incremento en H2O2 se puede ver inmediatamente

después de realizar un ejercicio máximo en sujetos sanos.

- Uso de medicación inhalada: una inhalación de salbutamol o ipratropio no tiene

efectos en niveles de H2O2 y TBARs en CAE de sujetos sanos99. La

administración de budesonida no afectaba a los niveles de nitritos, incluso

después de haber sido expuestos a ozono100. Szkudlarek et al demostraron que,

aunque la inhalación de agua desionizada o cloruro sódico estéril al 0,9% no

producía ningún cambio en los niveles de H2O2, la inhalación de N-

acetilcisteína producía una abolición casi completa de la producción de H2O2.

Tras 2,5 horas, los niveles de H2O2 en CAE aumentaban a 1,8 por encima del

nivel basal, observándose así un efecto bifásico de la N-acetilcisteína en las

vías aéreas101.

- Efecto del test de metacolina y AMP: no se han apreciado cambios

significativos en niveles de leucotrienos ni histamina antes y después de

realizar test de metacolina y AMP.

- Esputo inducido: en sujetos sanos, tras inducir el esputo, se han visto mayores

niveles de leucotrieno B4, IL-6 y TNF-α, mientras que el pH disminuye.


68

- Condiciones hiperbáricas y aire seco: un estudio analiza la influencia de

inmersiones profundas e inhalación de aire muy seco sobre los niveles de LTB4

en CAE, sin que ninguna de esas situaciones influyan en los mismos102, 103.

- Inhalación de sustancias neumotóxicas: existen estudios que han analizado la

exposición laboral (como la exposición a trabajadores de maquinaria de barco o

plateado de cromo), mientras que no existe ningún estudio que haya analizado

el efecto del tabaquismo pasivo en CAE de adultos.

Otro problema a tener en cuenta a la hora de interpretar los resultados de sustancias

obtenidas en CAE es la dilución de las sustancias no volátiles, como las proteínas, en el

vapor de agua. La formación de las gotas no se realiza a un ritmo constante y no tiene una

relación lineal con la producción de vapor de agua. Por tanto, las diferencias en dilución

de gotas exhaladas por el vapor de agua puede necesitar del uso de indicadores de dilución

para una más precisa interpretación. Así, Effros et al usaron la concentración de sal y urea

como factores de normalización, asumiendo que en sujetos sanos y en enfermos tienen la

misma concentración en plasma que en el fluido de las vías aéreas. Estos autores en su

trabajo afirman que las gotitas obtenidas en el CAE están muy diluidas por vapor de agua.

Ellos estimaron la dilución de las gotitas comparando concentraciones de indicadores de

referencia no volátiles (cationes no volátiles totales, urea o conductividad) en 18 sujetos

normales con concentraciones normales en plasma, asumiendo que las concentraciones en

plasma y tracto respiratorio son similares. Las concentraciones de NH4+ constituían el 93

+/- 3% del total de cationes en las muestras de CAE antes de liofilizarlo. Tras realizar èsta,

el 9% del NH4+ se eliminaba y así se podía usar la conductividad para estimar las

concentraciones totales iónicas no volátiles y facilitando el análisis de urea. Así obtienen

que las estimaciones de dilución basadas en cationes totales (20,472 +/- 2,516 meq/l),

conductividad (21,019 +/- 2,427 μmol/l) y urea (18,818 +/- 2,402 mmol/l) no fueron


69

significativamente diferentes. Por tanto, concluyen que la conductividad de muestras

liofilizadas se puede usar como método barato, simple y fiable para estimar la dilución de

mediadores no volátiles hidrofílicos104. Estos autores en un trabajo previo utilizan la

concentración de electrolitos para calcular la dilución de las gotas de fluido respiratorio en

20 pacientes sin antecedentes recientes de patología pulmonar ni consumo de tabaco. Estos

pacientes exhalaron durante una hora hasta obtener al menos 10 ml de CAE. La

concentración total de iones fue 498 +/- 68 μM, de los cuales 229 +/- 43 μM era NH4+.

Observaron que grandes variaciones en concentraciones de Na+ en CAE correlacionaban

bien con variaciones de K+ y de Cl-, lo que atribuían a dilución de las gotas del CAE. Al

dividir valores en CAE de Na+ y K+ entre los de plasma se obtenían unos valores de

fluidos respiratorios entre 0,01% y 2,00% del volumen del condensado. Se pudo

comprobar cómo existían variaciones importantes de concentración de solutos intra- e

intersujetos. Por tanto, concluyeron que es imposible determinar si el aumento de

concentración de mediadores descritos en varias enfermedades reflejan una mayor

formación de gotas o un aumento en las concentraciones de estos mediadores en la capa de

fluidos del tracto respiratorio. En este mismo artículo, minimizaron el efecto de dilución

de los solutos no volátiles por vapor de agua depositado en las paredes del condensador

mediante la división de la concentración de solutos entre la suma de las concentraciones

de los principales cationes no volátiles en el CAE (Na+ y K+)105.

La contaminación nasal, por saliva o por esputo, es un problema que se ha puesto

de manifiesto en distintos estudios. El grupo de trabajo conjunto ATS / ERS recomienda

usar una pinza nasal para evitar que se pierda muestra por la nariz, o que la inspiración se

realice a través de la misma. Sin embargo, en otras publicaciones anteriores se recomienda

la realización de inhalaciones y exhalaciones a través de la boca sin usar pinza nasal, ya


70

que se piensa que la pinza nasal favorecería la contaminación procedente de la nariz al

abrir el velo nasofaríngeo5, 92.

Las ventajas y limitaciones de la colección y análisis del CAE se resumen en la

siguiente tabla.

Ventajas

- fácil

- no invasiva

- posibilidad de uso domiciliario

- nos permite toma de muestras de

forma longitudinal

- los compuestos no volátiles

obtenidos están asociados con

fisiopatología pulmonar

- posibilidad de estudiar DNA y

RNA amplificados de células

eucarióticas y procarióticas

- posibilidad de estudiar la

farmacocinética y farmacodinamia

de fármacos

- permite el estudio de aclaración de

solutos

Limitaciones

- ausencia de estandarización del

método de recogida

- no es posible estudiar un sitio

anatómico específico

- ausencia de evidencia del origen

de las partículas de aerosol

(bronquios vs vías respiratorias

terminales)

- la concentración puede estar

artefactada debido a evaporación de

las muestras

-viabilidad y utilidad de

biomarcadores no relacionados con

stress oxidativo no demostrados

aún

-escasa información de

biomarcadores en enfermedades

intersticiales pulmonares


71

4.- Posibles utilidades del CAE

El estudio del CAE puede ser útil en la evaluación de la inflamación bronquial o

del daño epitelial, investigar la integridad del surfactante, crecimiento de tumores y

posibles mutaciones genéticas. La mayoría de ellos se centran en patologías como EPOC,

asma o discinesia ciliar primaria5, 106. También se han hecho trabajos con fumadores sin

patología conocida, que demuestran una mayor concentración de determinados

marcadores de inflamación en dicho grupo. Garey et al estudiaron a 9 no fumadores y 11

fumadores, a los cuales se les recogió CAE (en el grupo de fumadores también se recogió

una muestra 30 minutos tras fumar un cigarrillo). Su intención era conocer las

concentraciones de proteínas totales, nitritos, IL-1B, TNF-α y actividad quimiotáctica de

neutrófilos. Sus hallazgos fueron que los niveles de proteínas totales (28,8 vs 5,7 ug/ml),

nitritos (24,672 vs 16,156 nmol/l), TNF-α (7,4 vs 3,9 pg/ml) y actividad quimiotáctica de

neutrófilos eran significativamente mayores en fumadores. Los niveles de IL-1B (1,5 vs

1,6 pg/ml) eran similares para ambos grupos. Además, ninguno de los parámetros

cambiaban de forma significativa tras fumar un cigarrillo (salvo IL-1B que descendía

significativamente)22. Carpagnano et al estudiaron a 21 fumadores y 14 no fumadores para

determinar la influencia del consumo de tabaco (número de cigarrillos y niveles de CO) en

los niveles de IL-6 y LT B4. Estos autores encontraron que los niveles de IL-6 estaban

significativamente más elevados en fumadores (5,6 vs 2,6 pg/ml, p< 0,01), de la misma

manera que ocurría con los niveles de LT B4 (9,4 vs 6,1 pg/ml, p< 0,001). Además vieron

que los niveles de IL-6 se correlacionaban con el número de cigarrillos/día consumidos,

los niveles de CO espirado, y el porcentaje de FEV1 y FVC23.

El campo en el cual el análisis de CAE puede tener una pronta aplicación a la

práctica clínica es en el asesoramiento de la exposición a compuestos químicos dañinos

para el sistema respiratorio, como por ejemplo, en la exposición laboral a determinadas


72

sustancias. Goldoni et al estudiaron 33 trabajadores expuestos a cobalto y tungsteno

(trabajadores con diamantes o metales) y 16 controles sanos. Medían en todos ellos, tanto

en orina como en CAE, el cobalto, el wolframio y el malondialdehido (MDA) como

marcador pulmonar de estrés oxidativo. En los expuestos, medían los niveles antes de la

jornada laboral (15 horas tras la última exposición) y después de la misma. En el CAE de

los controles, el cobalto se detectó a niveles ultrasensibles, mientras que no se detectó

wolframio. En los trabajadores, los niveles de cobalto en CAE oscilaban entre 40,7 y 163

nmol/l; los de wolframio entre menos de 0,5 y 25,6 nmol/l; y los de malondialdehido entre

11,5 y 26,5 nmol/l (frente a los 7,6 nmol/l de los controles). Al comparar los datos antes y

tras la jornada laboral, observaron que los niveles de cobalto en CAE y en orina mostraban

incrementos significativos tras la exposición, mientras que los datos pre-exposición no

mostraban diferencias significativas con los controles. Los niveles de malondialdehido

postexposición mostraban diferencias significativas con controles, y en un grupo de

trabajadores sí se encontró incrementos significativos tras la exposición. En el caso del

wolframio, sólo en un grupo de trabajadores se observó mayores niveles pre-exposición

laboral tanto en CAE como en orina; en el resto, los niveles no eran detectables. Además

observaron una correlación positiva entre los niveles de MDA y las concentraciones de

cobalto, siendo mayor cuando la exposición era conjunta cobalto-wolframio. Esta

correlación no se observó con los niveles de MDA urinarios. Estos autores le dan un papel

prometedor al CAE para el estudio de sustancias neumotóxicas en ambientes laborales

contaminados y de marcadores de la exposición a las mismas107. Se han realizado también

trabajos de investigación en otras patologías como el síndrome de apneas obstructivas

durante el sueño (SAOS), observando que existen parámetros inflamatorios que pueden

predecir el SAOS. Li et al estudiaron a 22 pacientes con SAOS leve, 22 moderados, 24

graves , 22 controles y 10 fumadores, en los cuales midieron los niveles plasmáticos y en


73

CAE de IL-6, IL-10, TNF-α y 8-isoprostano. Los niveles de IL-6, TNF-α y 8-isoprostano

correlacionaban bien con el índice apneas-hipoapneas (IAH) tanto en CAE como en

plasma, mientras que este índice mostraba una correlación negativa con IL-10. Los niveles

de los marcadores en el grupo de fumadores estaban en la zona intermedia de todos los

grupos. Tras realizar análisis de regresión logística y análisis linear discriminante

encontraron que: IL-10 mostraba la mejor correlación con IAH (kappa = 0,88); usando IL-

6 con regresión linear distingue perfectamente a los SAOS moderados-graves de los leves-

no SAOS, y casi perfectamente usando IL-10. Por tanto, podría ser que IL-6 e IL-10 en

CAE pudieran predecir la severidad del SAOS108. Carpagnano et al estudiaron a 18

pacientes con SAOS, 10 obesos y 15 sanos y determinaron los niveles en CAE de IL-6 y

8-isoprostano para demostrar que estos marcadores de inflamación y estrés oxidativo

estaban elevados en pacientes SAOS y obesos. Para conocer el diagnóstico de SAOS

realizaron polisomnografía a todos los pacientes, diagnosticando de SAOS aquellos con un

IAH > 20 y síntomas de somnolencia diurna excesiva; mientras que los obesos y controles

tenían un IAH < 5. Encontraron que los SAOS tenían niveles de IL-6 significativamente

mayores que los sanos (8,7 vs 1,6 pg/ml, p < 0,0001) y más que los obesos (2,1 pg/ml, p <

0,0001), aunque estos sí tenían valores significativamente mayores que los controles

(p<0,05). El 8-isoprostano era igualmente mayor en SAOS (7,4 pg/ml) que en obesos (5

pg/ml, p = 0,4) y sanos (4,5 pg/ml, p< 0,005). Existía una correlación positiva entre los

dos marcadores estudiados y la circunferencia del cuello y el índice de apneas-hipoapneas,

así como entre ambos marcadores entre sí. Concluyen que en el SAOS existe un estado de

inflamación y estrés oxidativo (no así en obesos), cuyos niveles se relacionan con el

IAH109.

Los pacientes con cáncer de pulmón también han sido objeto de estudio con CAE,

tanto para medir parámetros inflamatorios110, como para detectar mutaciones genéticas,


74

abriendo una interesante posibilidad para el diagnóstico oncológico en el futuro. Gessner

et al estudiaron DNA en CAE de pacientes con carcinoma pulmonar no microcítico y en

controles sanos. El DNA humano fue amplificado mediante PCR para detectar mutaciones

en el gen p53. Un PCR del fragmento b-actina se usó para detectar DNA humano en las

muestras de CAE, hallándose el mismo en el 65,7% de las muestras. Los exones 5-8 del

p53 fueron amplificados y secuenciados en las muestras de pacientes con cáncer de

pulmón, encontrándose mutaciones en 4 de los 11 pacientes (36,4%), mientras que en los

10 voluntarios no se encontró ninguna mutación. Las mutaciones encontradas en el CAE

se compararon con las del tejido tumoral, viéndose que existían diferentes mutaciones

puntuales. Por tanto, el CAE podría ser una herramienta útil para el análisis de mutaciones

genéticas en un área de daño directo de DNA en relación con el consumo de tabaco111.

5.- Conclusiones

El condensado de aire exhalado (CAE) es una técnica a la que le queda aún camino

por recorrer para ser considerada como una herramienta diagnóstica más en el campo de la

neumología. No obstante, su uso dentro de la investigación queda demostrado por la

cantidad de artículos publicados al respecto en los últimos años. Hemos de esforzarnos

por utilizar las mismas condiciones en la técnica para hacer más homogéneos los trabajos

y poder así compararlos. Debemos seguir esperando conclusiones de mayor peso para

poder difundir esta técnica dentro del arsenal diagnóstico neumológico habitual.

75

V. MATERIAL Y MÉTODOS

Material y métodos

76

Para tratar de demostrar que los fumadores sin patología presentan un status

inflamatorio a nivel local y sistémico, a pesar de mantener niveles de función pulmonar

en rangos dentro de la normalidad, se ha realizado un estudio analítico observacional

prospectivo de cohortes: cohorte de fumadores sanos y cohorte de sanos no fumadores.

1.- Sujetos estudiados.

Se estudiaron dos grupos de sujetos: el grupo estudio, compuesto por

fumadores, y un grupo control de no fumadores, en ambos casos sanos. El grupo de

fumadores se seleccionó de la consulta de deshabituación tabáquica del Hospital

Universitario de Móstoles, y el grupo control de no fumadores lo componían

trabajadores del mismo centro que colaboraron de forma voluntaria. A todos ellos se

les informaba del estudio y se obtenía el consentimiento informado, si cumplían todos

los criterios de inclusión y ninguno de los de exclusión.

1.a.- Criterios de inclusión

Pacientes mayores de edad

Firma del consentimiento informado

Ausencia de síntomas clínicos de bronquitis crónica

Ausencia de episodios previos de hiperreactividad bronquial

Ausencia de diagnóstico de enfermedad crónica

Ausencia de enfermedad aguda las ocho semanas previas a la

toma de muestras

No toma de fármacos de forma continuada en las ocho semanas

previas a la toma de muestras

Hemograma y bioquímica básicas en rango de normalidad

Material y métodos

77

Pruebas de función pulmonar en rango de normalidad

Test broncodilatador negativo

1.b.- Criterios de exclusión

• No firmar el consentimiento informado

• Presencia de criterios clínicos de bronquitis crónica

• Episodio previo de hiperreactividad bronquial

• Diagnóstico de enfermedad crónica

• Haber padecido alguna enfermedad aguda en las ocho semanas

previas a la toma de muestras

• Haber realizado algún tratamiento de forma continuada en las

ocho semanas previas a la toma de muestras

• Alteración en alguno de los parámetros de las pruebas de función

pulmonar

• Hemograma y bioquímica básicas con algún parámetro fuera de

los rangos de normalidad

• Test broncodilatador positivo

2.- Protocolo del estudio

2.a.- Diseño

Se trata de un estudio analítico observacional prospectivo de dos

cohortes: cohorte de fumadores sanos y cohorte de no fumadores sanos.

Material y métodos

78

2.b.- Procedimientos

Tanto al grupo estudio como al grupo control se le explicó el objetivo y el

protocolo del estudio. Una vez obtenido el consentimiento verbal de ser incluidos en el

estudio se comprobaba que cumplieran con todos los criterios de inclusión, para lo cual

se les realizaba una historia clínica en la que se reflejase: los antecedentes personales

médicos y quirúrgicos, los antecedentes familiares, la medicación habitual y una

exploración física completa. Se hacía especial hincapié en los antecedentes de

enfermedades agudas o toma continuada de medicación en las ocho semanas previas a

la toma de muestras para el estudio. En el grupo de fumadores interrogábamos de

forma especial por los criterios de bronquitis crónica y / o clínica previa de

hiperreactividad bronquial. Además, a este último grupo se le realizaba una historia

específica de tabaquismo en la que se recogían los siguientes datos:

- número de cigarrillos / día fumados

- edad de inicio del consumo

- índice paquetes-año: calculado multiplicando el número de cigarrillos

fumados al día por el número de años de fumador, y dividido entre 20

- intentos previos de abandono y duración de los mismos

A ambos grupos se les realizaba igualmente una exploración física que incluía

auscultación cardíaca y auscultación respiratoria, con toma de constantes que incluían

peso, talla, tensión arterial, saturación arterial de oxígeno y medición de monóxido de

carbono, en el caso de los fumadores.

Una vez firmado el consentimiento informado del estudio, que había sido

previamente aprobado por el Comité de Ética e Investigación Clínica del Hospital

Universitario de Móstoles, los sujetos eran incluidos en el estudio y eran citados para la

Material y métodos

79

toma de muestras y realización de pruebas funcionales respiratorias. Al grupo de

fumadores se les realizaba la toma de muestras antes del intento del abandono del

consumo de tabaco. Los sujetos eran citados a primera hora de la mañana, debían estar

en ayunas, y en el caso del grupo de fumadores, sin fumar desde la noche anterior (al

menos ocho horas de abstinencia). Primero se procedía a la extracción sanguínea,

posteriormente la toma del condensado de aire exhalado, y por último la espirometría

con test broncodilatador. La realización de estas pruebas se llevó a cabo en la sala de

espirometrías, siempre bajo las mismas condiciones ambientales de humedad y

temperatura.

2.b.1.- Análisis de sangre

. La extracción de sangre se realizó mediante venopunción

obteniéndose 3 mililitros (ml) diluido en EDTA para el estudio hematológico y 10 ml

en un tubo con gel separador para la bioquímica básica. Una muestra (2 ml) de suero se

congelaba a – 70º C hasta su análisis.

2.b.2.- Condensado de aire exhalado (CAE)

Para la toma de muestras de CAE se utilizó un

condensador distribuido comercialmente (Ecoscreen; Jaeger, Hoechberg, Alemania)89

(Fig. 13). Este es un sistema eléctrico refrigerado modificado de dispositivo de aire

frío.

Material y métodos

80

Figura 13: Fotografía del modelo comercial de condensador de aire exhalado

utilizado en el estudio.

Este dispositivo dispone de un brazo extensible y móvil que permite al paciente

sentarse cómodamente en una silla y exhalar en el interior de una cámara congelada

(Fig. 14). Esta cámara es eficiente en condensar fluidos ya que el condensador

mantiene una temperatura de unos – 10º C en el período de recolección de la muestra

(Fig. 15).

Material y métodos

81

Figura 14: Fotografía de un sujeto durante la toma de muestras del condensado de aire

exhalado.

Figura 15: Representación esquemática del modelo de condensador de aire exhalado

utilizado para la toma de muestra en el estudio.

Respiración tidal

Cámara de recogida de muestra

Aire ambiental

2-4 ml condensado/5-10 minutos

Material y métodos

82

Previo al inicio de la prueba, se le indicaba al sujeto que se enjuagara la boca,

para posteriormente realizar respiraciones a volumen corriente, sin usar pinza nasal,

inspirando y exhalando por la boca, durante 15-20 minutos o hasta obtener un volumen

total de 200 ml. El sujeto se debía separar de la boquilla periódicamente para tragar la

saliva acumulada en la cavidad bucal. La muestra obtenida se congelaba

inmediatamente a – 70º C hasta su análisis.

2.b.3.- Pruebas funcionales respiratorias

Se realizaba a todos los sujetos incluidos en el estudio

una espirometría forzada (Jaeger MS Body/diff Master Screen) según las normativas

publicadas por distintos autores para espirometrías forzadas, con el fin de comprobar la

existencia de una función pulmonar normal. También realizamos un test de

broncodilatación con salbutamol para descartar reversibilidad basándonos en los

valores recogidos en las normativas publicadas por las asociaciones de neumología

americanas y europeas (ATS/ERS)112.

Figura 16: Fotografía del modelo de espirómetro utilizado para la realización de las

pruebas funcionales respiratorias.

Material y métodos

83

2.b.4.- Determinaciones analíticas

Todas las determinaciones analíticas se llevaron a cabo

en los servicios de hematología y en el de bioquímica del Hospital Universitario de

Móstoles.

La determinación de la hematología se realizó mediante técnica láser

(Advia 120, Bayer). Las determinaciones analíticas de bioquímica básica se realizaron

en un HITACHI modular (Roche Diagnostics) en el suero obtenido tras centrifugado

de la muestra. La valoración de TNF-α en suero y condensado de aire exhalado se

realizó mediante un inmunoensayo ELISA (DRG Diagnostics GMBH, Alemania)

(Fig. 17).

Figura 17. Fotografía del autoanalizador para placas ELISA utlizado para el análisis

de las muestras (DRG Diagnostics GMBH, Alemania) en el estudio.

Material y métodos

84

Se utilizaron anticuerpos monoclonales dirigidos frente a distintos epitopos de TNF-α.

El conjugado anti-TNF-α estaba marcado con peroxidasa (HRP) en buffer TRIS

maleato con albúmina bovina, EDTA y timol. Se utilizó tetrametilbencidina en

dimetilformamida (TMB) como cromógeno. La concentración de TNF-α es

proporcional a la intensidad de color desarrollada y se determina por interpolación en

la curva de calibración a cinco puntos (fig. 18).

Figura 18. Curva de determinación del valor de TNF-α. En el eje de abscisas se

expresa la densidad óptica en relación al color, y en el de ordenadas el valor de TNF-α

expresado en pg/ml.

Material y métodos

85

Se hizo una lectura bicromática de la placa microtiter a 450 nm frente a filtro de

referencia de 620 nm (Fig. 19). El ensayo se realizó de forma automatizada en DSX

(Dynex Tecnology).

Figura 19. Fotografía de placa ELISA utilizada para las determinaciones de TNF-α,

donde se pueden apreciar distintas intensidades de color. La primera columna

corresponde a la curva automática de concentraciones según densidad de color

realizada por el dispositivo. La mayor intensidad del color indica una mayor

concentración de TNF-α.

3.- Aspectos éticos.

El estudio obtuvo la aprobación por parte del Comité de Ética y de

Investigación Clínica del Hospital Universitario de Móstoles (anexo I), el cual aprobó

Material y métodos

86

también el consentimiento informado que debía firmar el sujeto previo a su inclusión

en el estudio (anexo II).

4.- Variables a estudiar

4.a.- Datos antropométricos

- Sexo

- Edad (años)

- Talla (cm)

- Peso (kg)

- IMC (kg/m2)

4.b.- Datos de consumo de tabaco (grupo de fumadores)

- Edad de inicio (años)

- Número de cigarrillos / día

- Número de paquetes-año

4.c.- Espirometría

- FVC (ml)

- FVC (%)

- FEV1 (ml)

- FEV1 (%)

- FEV1/FVC (%)

- MMEF 75-25 (ml)

- MMEF 75-25 (%)

- Test broncodilatador

Material y métodos

87

o Positivo

o Negativo

4.d.- Condensado de aire exhalado

- Volumen total (l)

- Tiempo (minutos)

- PEF ( l / s)

- VT (l)

- Volumen minuto ( l / m)

- Frecuencia respiratoria ( l / m)

- Volumen de muestra obtenida (ml)

4.e.- TNF-α

- niveles en suero (pg/ml)

- niveles en condensado de aire exhalado (pg/ml)

5.- Análisis estadístico de datos

Los resultados fueron analizados con el paquete estadístico SPSS 11.0 (SPSS®

Inc., 1989-2001). La analítica descriptiva de las variables cuantitativas se realizó con la

media (desviación estándar) tras confirmar normalidad de la distribución con la prueba

de Kolmogorov-Smirnov y con mediana (rango) en variables de distribución normal.

Las variables cualitativas se describieron con porcentajes. El análisis bivariable se

realizó con la prueba de t de Student para comparación de las medias de las variables

cuantitativas entre los grupos de variables cualitativas dicotómicas o con ANOVA para

las variables con más de dos categorías. Para las variables de distribución no normal se

eligieron las correspondientes pruebas no paramétricas: U de Mann-Whitney o prueba

Material y métodos

88

de Kruskal-Wallis. La asociación entre las variables cualitativas se analizó con la

prueba de xi cuadrado y las correspondientes tablas de contingencia. La correlación

entre variables cuantitativas se realizó con r de Pearson para las variables de

distribución normal y con rho de Spearman para las no normales. El valor de

significación se fijó en todos los casos para un valor de p < 0,05.

89

I.-RESULTADOS

Resultados

90

Una vez descrita la metodología del estudio, en el capítulo actual se realiza una

minuciosa redacción del análisis descriptivo tanto de la serie global como de cada uno

de los grupos por separado (control y estudio), así como un análisis de comparación

entre las variables a estudio (TNF-α en suero y en CAE) de ambos grupos; y un análisis

de correlación entre los valores de TNF-α en suero y en CAE con el resto de parámetros

incluidos en el estudio (valores antropométricos, valores de función pulmonar, consumo

de tabaco y valores de recogida de CAE); y un análisis de correlación entre el volumen

de muestra de condensado de aire exhalado recogido y los parámetros de recogida de

CAE, y entre el citado volumen y el consumo de tabaco.

Resultados

91

1.- Análisis descriptivos

1. a. Serie global

Se han incluido en este estudio 51 pacientes, cuyas características

generales se pueden ver en la tabla 1. La distribución según sexo y hábito tabáquico

están representados en las figuras 20 y 21.

Edad (años) 39,88 (7,61)

Sexo (% mujeres) 56,9%

Hábito tabáquico (% fumadores) 60,8%

Peso (kg) 73,64 (19,98)

IMC (kg/m2) 25,33 (5,74)

Tabla 1. Características generales de los sujetos estudiados. Las cifras están expresadas

en medias con desviación estándar (entre paréntesis) para variables cuantitativas, y en

porcentajes para variables cualitativas.

Resultados

92

Figura 20. Distribución según hábito tabáquico de la serie global.

Figura 21. Distribución por sexos de la serie global.

43,1%

56,9%

VARONESMUJERES

60,8%

39,2%FUMADORESNO FUMADORES

Resultados

93

Los datos de función pulmonar se pueden ver en la tabla 2 y los obtenidos del

condensador de aire exhalado en la tabla 3.

FVC (ml)

4359,61 (1059,55)

FVC (%)

97,12 (11,80)

FEV1 (ml)

3579,22 (853,87)

FEV1 (%)

102,16 (12,78)

MMEF (ml) 3545,68 (981,59)

MMEF (%)

88,90 (19,70)

FEV1/FVC 82,30 (4,70)

Tabla 2. Datos de función pulmonar de la serie global. Datos expresados en medias con

desviación estándar entre paréntesis.

Resultados

94

Volumen de muestra (ml)

3,44 (1,03)

Volumen total aire (l)

249,27 (102,58)

Tiempo (min)

15,44 (3,63)

Pico flujo (l/s)

0,45 (0,26)

Volumen tidal (l) 0,63 (0,33)

Volumen minuto (l/min)

15,07 (14,38)

Frecuencia respiratoria

19,48 (4,54)

Tabla 3. Valores de los parámetros recogidos en el condensador. Datos expresados en

medias con desviación estándar entre paréntesis.

Resultados

95

El valor medio de TNF-α en suero y en el CAE se puede ver en la tabla 4.

En las figuras 22 y 23 se puede ver la distribución de los niveles de TNF-α en

suero y en CAE.

TNF-α suero

(pg/ml)

6,29 (1,16)

TNF-α CAE

(pg/ml)

4,04 (0,58)

Tabla 4. Valores de TNF-α (pg/ml) en los medios estudiados. Datos expresados en


Resultados

96

0,00 2,50 5,00 7,50 10,00 12,50

TNF suero (pg/ml)

0

5

10

15

Núm

ero

de p

acie

ntes

Figura 22. Distribución del número de pacientes según los niveles de TNF-α en suero

de los sujetos estudiados. Se puede apreciar que la mayoría de pacientes se encuentran

en valores comprendidos entre 4 y 8 pg/ml.

4,00 5,00 6,00 7,00

TNF condensado (pg/ml)

0

5

10

15

20

Núm

ero

de p

acie

ntes

Figura 23. Distribución del número de pacientes según los niveles de TNF-α en

condensado de aire exhalado. La mayoría de los pacientes se concentran en valores

menores de 5 pg/ml.

Resultados

97

1. b. Grupo control

Se incluyeron 20 pacientes, cuyas características generales se pueden ver

en la tabla 5.

Edad (años)

38,10 (7,65)

Peso (kg)

67,7 (16,04)

IMC (kg/m2) 23,53 (3,66)

Tabla 5. Características generales de los sujetos del grupo control. Las cifras están

expresadas en medias con desviación estándar (entre paréntesis).

La distribución por sexos de este grupo está representada en la figura 25.

Figura 25. Distribución por sexos del grupo control.

45,0%

55,0%

VARONESMUJERES

Resultados

98

Los valores de función pulmonar de este grupo y los obtenidos

del condensador se pueden ver en las tablas 6 y 7.

FVC (ml)

4432,50 (1072,81)

FVC (%)

98,56 (10,77)

FEV1 (ml)

3701,00 (872,45)

FEV1 (%)

104,79 (10,51)

MMEF (ml)

3756,50 (990,21)

MMEF (%)

91,35 (18,13)

Tabla 6. Datos de función pulmonar del grupo control. Datos expresados en medias con


Resultados

99


3,42 (1,03)


245,10 (83,07)

Tiempo (min)

14,99 (2,64)

Pico flujo (l/s)

0,48 (0,29)

Volumen tidal (l)

0,62 (0,29)


19,03 (21,49)

Frecuencia respiratoria 19,72 (5,86)

Tabla 7. Datos de condensado en el grupo control. Datos expresados en medias con


Resultados

100

El valor de TNF-α en suero y en CAE se puede ver en la tabla 8.

Tabla 8. Valores de TNF-α (pg/ml) en los medios estudiados. Datos expresados en


1. c. Grupo estudio

Se incluyeron 31 sujetos cuyas características generales se puede ver en

la tabla 9, y la distribución por sexos en la figura 26.

Figura 26. Distribución por sexos del grupo estudio.

TNF-α suero (pg/ml)

5,88 (0,94)

TNF-α CAE (pg/ml)

4,05 (0,51)

41,9%

58,1%

VARONESMUJERES

Resultados

101

Edad (años)

38,10 (7,65)

Sexo (% mujeres)

55%

Peso (kg)

67,7 (16,04)

IMC (kg/m2)

23,53 (3,66)

Nº cigarrillos/día (n)

21,68 (9,18)

Edad inicio consumo (años)

15,77 (2,56)

Paquetes-año

28,47 (14,97)

Tabla 9. Características generales del grupo estudio. Las cifras están expresadas en

medias con desviación estándar (entre paréntesis).

Resultados

102

Los valores de función pulmonar y los obtenidos en el condensador se pueden

ver en las tablas 10 y 11. El valor medio de TNF-α en suero fue de 6,55 +/- 1,23 pg/ml

y en el CAE de 4,03 +/- 0,62 pg/ml (Tabla 12).

FVC (ml)

4312,58 (1065,99)

FVC (%)

96,18 (12,49)

FEV1 (ml)

3500,64 (846,64)

FEV1 (%)

100,47 (13,95)

MMEF (ml)

3409,67 (967,54

MMEF (%)

87,31 (20,78)

FEV1/FVC 81,39 (4,45)

Tabla 10. Datos de función pulmonar del grupo estudio. Las cifras están expresadas en

medias con desviación estándar (entre paréntesis)

Resultados

103

Volumen de muestra (ml) 3,45 (1,04)


251,97 (114,67)

Tiempo (min)

15,74 (4,16)

Pico flujo (l/s)

0,43 (0,25)

Volumen tidal (l)

0,64 (0,35)


12,51 (5,91)


19,33 (3,53)

3

,

5

3

Tabla 11. Valores del condensado en el grupo de fumadores. Las cifras están

expresadas en medias con desviación estándar (entre paréntesis)

Resultados

104


6,55 (1,23)

TNF-α CAE (pg/ml)

4,03 (0,62)

Tabla 12. Valores de TNF-α (pg/ml) en los medios estudiados. Las cifras están

expresadas en medias con desviación estándar (entre paréntesis)

2. Análisis estadístico.

2. a. Comparación entre grupos estudio/control

No existían diferencias significativas entre grupos en los parámetros

antropométricos estudiados, salvo por el IMC, que era mayor en el grupo de fumadores

(26,50 vs 23,53 kg/m2, p = 0,044). Los valores de función pulmonar tampoco mostraron

diferencias entre grupos. Los valores recogidos en el condensador y el volumen de la

muestra recogida no demostraron diferencias entre grupos.

Todos estos valores comparativos se pueden ver en las tablas 13, 14 y 15.

Resultados

105

No Fumador Fumador Valor p

Edad (años)

38,10

41,03

0,18


5,88

6,54

0,043

TNF-α CAE (pg/ml)

4,05

4,03

0,89

Peso (kg)

67,70

77,48

0,09

IMC (kg/m2)

23,53

26,50

0,044

Tabla 13. Diferencias en los parámetros cuantitativos estudiados entre el grupo control

y el grupo estudio. Los valores están expresados como medias. Valor significativo de p

si es menor de 0,05.

Resultados

106

No fumador Fumador Valor p

FVC (ml)

4432,50

4312,58

0,70

FVC (%)

98,56

96,18

0,48

FEV1 (ml)

3701,00 3500,64 0,42

FEV1 (%)

104,79

100,47

0,24

MMEF (ml)

3756,50

3409,68

0,22

MMEF (%)

91,35

87,32

0,48

FEV1/FVC

83,71

81,39

0,09

Tabla 14. Diferencias en los parámetros funcionales respiratorios estudiados entre el

grupo control y el grupo estudio. Los valores están expresados como medias. Valor

significativo de p si es menor de 0,05.

Resultados

107

No Fumador Fumador Valor p


3,42

3,45

0,92


245,10

251,97

0,81

Tiempo (min)

14,99

15,74

0,43

Volumen tidal (l)

0,62

0,64

0,84

Volumen Minuto (l/min)

19,03

12,51

0,12


19,72

19,33

0,77

Tabla 15. Diferencias en los parámetros de condensado de aire exhalado estudiados

entre el grupo control y el grupo estudio. Los valores están expresados como medias.

Valor significativo de p si es menor de 0,05.

Resultados

108

Al comparar los valores de TNF-α en suero y CAE del grupo control y grupo estudio, se

observó una diferencia estadísticamente significativa en los valores de TNF-α en suero

de los fumadores (p= 0,043) (Fig. 27), diferencia que era independiente de edad, sexo y

valor de IMC. No encontramos diferencias para el TNF-α en CAE (Fig. 28).

3120 N = Fumadores No fumadores

TNF-α suero

11

10

9

8

7

6

5

4

Figura 27. Niveles de TNF-α en suero en los dos grupos. Diferencias estadísticamente

significativas entre ambos grupos. Los valores de TNF-α expuestos en la gráfica

corresponden a medianas.

5,64 pg/ml

6,41 pg/ml

Resultados

109

3120N =

MOTIVO PETICION

FumadoresNo fumadores

TNF

cond

ensa

do

6,5

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

Figura 28. Niveles de TNF-α en el condensado de aire exhalado en los dos grupos.

Diferencias estadísticamente no significativas entre ambos grupos. Los valores de TNF-

α expuestos en la gráfica corresponden a las medianas.

2. b. Correlaciones

2. b. 1. TNF-α suero y condensado vs datos antropométricos.

No existía correlación entre los niveles en suero de TNF-α con el

sexo (Tabla 16; Fig. 29), aunque sí existía una correlación con la edad (p= 0,04; r =

0,29) y con el IMC (p=0,037; r = 0,29) (Fig. 30 y 31).

No se encontró correlación alguna entre el TNF-α en CAE con los datos

antropométricos. (Fig. 32, 33 y 34).

3,92 pg/ml

3,79 pg/ml

Resultados

110

Mujer

Varón

Valor p


6,27 (1,30)

6,30 (0,97)

0,93

TNF-α condensado (pg/ml)

4,01 (0,49)

4,08 (0,68)

0,63

Tabla 16. Valores de TNF-α en suero y CAE según sexo. Las cifras están expresadas

en medias con desviación estándar (entre paréntesis). Valor significativo de p si es

menor de 0,05.

2229N = V arones M ujeres

T N F -α suero

11

10

9

8

7

6

5

4

Figura 29. Valores de TNF-α en suero según sexos. Diferencias no significativas (6,27

en mujeres y 6,30 los varones). Los valores de TNF-α se expresan en pg/ml.

6,27 pg/ml

6,30 pg/ml

Resultados

111


1098765 4

Edad

60

50

40

30

20

Figura 30. Correlación entre la edad y los niveles de TNF-α en suero. Los

valores de TNF-α se expresan en pg/ml y la edad en años. Esta correlación

fue estadísticamente significativa (p=0,04; r = 0,29).

TNF-α suero

1098765 4

IMC

50

40

30

20

10

Figura 31. Correlación entre el IMC y los niveles de TNF-α en suero. Los

valores de TNF-α se expresan en pg/ml y el IMC en kg/m2. La correlación

resultó estadísticamente significativa (p=0,037; r = 0,29).

Resultados

112

2229N =

SEXO

VaronesMujeres

TNF

cond

ensa

do

6,5

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

Figura 32. Valores de TNF-α en condensado según sexos. Diferencias no

significativas (4,01 para mujeres y 4,08 los varones). Los valores de TNF-α

se expresan en pg/ml.

Edad

6050403020

TNF

cond

ensa

do

6,5

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

Figura 33. Representación gráfica de la correlación entre la edad y los

niveles de TNF-α en condensado. Los valores de TNF-α se expresan en

pg/ml y la edad en años. Esta correlación no alcanzó valores

estadísticamente significativos (p = 0,56; r = 0,083).

Resultados

113

TNF condensado

6,56,05,55,04,54,03,53,0

IMC

50

40

30

20

10

Figura 34. Representación gráfica de la correlación entre el IMC y los

niveles de TNF-α en condensado. Los valores de TNF-α se expresan en

pg/ml y el IMC en kg/m2. No existe una correlación estadísticamente

significativa entre los valores estudiados ( p = 0,26; r = 0,16).

2. b. 2. TNF-α suero y condensado vs función pulmonar.

Se pudo apreciar una correlación entre los niveles de TNF-α

en suero con los valores porcentuales de FVC (p = 0,012; r = - 0,35), y

rozaba la significación con el valor porcentual de FEV1 (p = 0,054; r = -

0,27) (Fig. 35 y 36). No tenía valores de significación estadística la

correlación con FEV1/FVC (Fig. 37).

Los niveles de TNF-α en el condensado no guardaban correlación con los

valores espirométricos (Fig. 38, 39 y 40).

Resultados

114

TNF suero

10987654

FVC

(%)

130

120

110

100

90

80

70

Figura 35. Gráfico que expresa la correlación significativa (p = 0,012; r = -

0,35) entre el FVC expresado en valor porcentual y los niveles de TNF-α en

suero. Los valores de TNF-α se expresan en pg/ml.

TNF suero

10987654

FEV

1 (%

)

140

130

120

110

100

90

80

70

Figura 36. Gráfico que expresa la correlación cercana a la significación ( p

= 0,054; r = - 0,27) entre el FEV1 expresado en valor porcentual y los

niveles de TNF-α en suero. Los valores de TNF-α se expresan en pg/ml.

Resultados

115

TNF suero (pg/ml)

10987654

FEV

1/FV

C

100

90

80

70

Figura 37. Gráfico que expresa la correlación entre el FEV1/FVC y los

niveles de TNF-α en suero. Los valores de TNF-α se expresan en pg/ml. La

correlación no alcanzó niveles de significación estadística ( p = 0,87; r =

0,023).

TNF-α condensado

6,56,05,55,04,54,0 3,5 3,0

FVC %

130

120

110

100

90

80

70

Figura 38. Gráfico que expresa la correlación entre el FVC expresado en

valor porcentual y los niveles de TNF-α en condensado. Los valores de

TNF-α se expresan en pg/ml. Esta correlación no alcanzó valores de

significación estadística ( p = 0,56; r = - 0,082).

Resultados

116

TNF condensado

6,56,05,55,04,54,03,53,0

FEV

1 (%

)

140

130

120

110

100

90

80

70

Figura 39. Gráfico de correlación entre el FEV1 expresado en valor

porcentual y los niveles de TNF-α en condensado. Los valores de TNF-α se

expresan en pg/ml. Esta correlación no fue estadísticamente significativa (p

= 0,29; r = - 0,15).

TNF condensado

6,56,05,55,04,54,03,53,0

FEV

1/FV

C

100

90

80

70

Figura 40. Gráfico que expresa la correlación entre el FEV1/FVC expresado

en valor porcentual y los niveles de TNF-α en condensado. Los valores de

TNF-α se expresan en pg/ml. No existía significación estadística para esta

correlación ( p = 0,16; r = - 0,20).

Resultados

117

2. b. 3. TNF-α suero y condensado vs consumo de tabaco.

En el grupo de fumadores se analizó la influencia del

consumo de tabaco (edad de inicio, número de cigarrillos / día consumidos e

índice paquetes-año) en los valores de TNF-α en suero y CAE, y sólo se

observó una relación estadísticamente significativa entre los valores de

TNF-α plasmáticos y la edad de inicio en el consumo de tabaco (p=0,006, r

= 0,48) (Fig. 41).

TNF-α suero

109876 5 4

Edad Inicio

26

24

22

20

18

16

14

12

10

Figura 41. Correlación significativa entre la edad de inicio en el consumo

de tabaco y los niveles de TNF-α en suero ( p = 0,006; r = 0,48). Los

valores de TNF-α se expresan en pg/ml.

2. b. 4. TNF-α suero y condensado vs parámetros del condensador

Para saber si existía correlación entre los valores de respiración del

condensado y los niveles de TNF-α en la muestra de condensado observamos que el

tiempo que se mantenían respirando y el volumen de muestra obtenido eran los únicos

parámetros que obtenían significación estadística ( p = 0,028 y 0,016 respectivamente).

Resultados

118

En el análisis por sexos se observó que el TNF-α en mujeres no guardaba correlación

con ningún volumen, mientras que en hombres sólo lo guardaba con el volumen total de

muestra. Al dividirlo entre grupos de estudio y control vemos que en el grupo control no

existe correlación con ninguno de los parámetros estudiados, mientras que en el grupo

de fumadores la correlación encontrada en la serie general entre TNF-α en CAE con el

tiempo de respiración y el volumen de muestra obtenida se hace más significativo aún

(p = 0,001 en ambos casos; r = 0,55 para el tiempo; r = 0,56 para el volumen de

muestra) (Fig. 42 y 43).

TNF-α condensado

6,56,05,55,04,54,0 3,5 3,0

Tiempo

30

20

10

0

Figura 42. Correlación significativa entre los valores de TNF-α en la muestra de

condensado y el tiempo que se mantiene el sujeto respirando (grupo estudio). Los

valores de TNF-α se expresan en pg/ml, y el tiempo en minutos.

Resultados

119

TNF-α condensado

6,56,05,55,04,54,03,5 3,0

Volumen de muestra

6

5

4

3

2

1

0

Figura 43. Correlación significativa entre los valores de TNF-α (pg/ml) en la muestra

de condensado y el volumen de muestra obtenido (ml) en el grupo de fumadores.

2. b. 5. Volumen de muestra vs consumo de tabaco

En el grupo de fumadores se estudió la posible correlación de los datos

de consumo de tabaco con los volúmenes de CAE y se observó una correlación entre el

número de cigarrillos / día (p = 0,001; r = 0,55) y número paquetes-año con el volumen

de muestra obtenido ( p = 0,003; r = 0,53) (Fig. 44) y el volumen tidal (p = 0,034; r =

0,38 para ambos).

Resultados

120

Volumen de muestra

654321 0

Número cigarros/día

60

50

40

30

20

10

0

Figura 44. Correlación significativa entre el volumen de muestra obtenido (ml) y el

número de cigarrillos consumidos cada día ( p = 0,001; r = 0,55).

2. b. 6. Volumen de muestra obtenido vs parámetros condensador

Al analizar el volumen de muestra obtenido con el resto parámetros del

condensador pudimos comprobar que sólo se relacionaba con el tiempo que se

mantenían respirando y no con el resto de parámetros.

121

VII.-DISCUSIÓN

Discusión

122

Una vez descrita la metodología del estudio y expuestos los resultados obtenidos

se procede a exponer la comparación con los estudios encontrados en la literatura de

similares características. Se analiza en un primer apartado la metodología seguida en

este estudio, posteriormente los resultados, y por último el papel del TNF-α como

marcador precoz de enfermedad.

1.- Metodología

1.a.- Diseño

Se trata de un estudio analítico observacional prospectivo de dos

cohortes: cohorte de fumadores sanos y cohorte de no fumadores sanos. La primera

intención era realizar un estudio longitudinal para comprobar el cambio en los niveles

de TNF-α en el grupo estudio tras el abandono del consumo de tabaco durante un año, y

compararlo con el grupo control. No obstante, y tras comprobar el bajo porcentaje de

éxito de abstinencia a lo largo del seguimiento, se decidió no realizar el análisis de los

resultados anuales. No se ha encontrado en la literatura ningún estudio que realice un

seguimiento longitudinal para comprobar si existe reducción de proteínas inflamatorias

tras el abandono del consumo de tabaco en fumadores sin patología conocida.

1.b.- Sujetos estudiados

Existen en la bibliografía múltiples trabajos que comparan los niveles de

TNF-α en distintos grupos de pacientes: EPOC estables, EPOC agudizados, pacientes

con distrés respiratorio, etc. El grupo control en los mencionados estudios suele estar

constituido por fumadores sanos. No hemos encontrado artículos que estudien los

niveles de TNF-α en fumadores en suero y en condensado, aunque sí existen series que

estudian el TNF-α sólo en el condensado de aire exhalado22, o en plasma 113, 114. En el

Discusión

123

trabajo que hemos realizado ampliamos el estudio a dos muestras biológicas para

conocer la inflamación a nivel local (condensado de aire exhalado) y a nivel sistémico

(plasma).

El número de fumadores sanos reclutados no es muy elevado, debido a la

dificultad de encontrar fumadores que no padezcan ningún tipo de patología, ya sea

derivada del consumo de tabaco, o bien sin relación con el mismo, pero de alta

prevalencia como hipertensión, dislipemia, etc. Igualmente, muchos de los inicialmente

reclutados tuvieron que ser excluidos ya que, bien en la espirometría, bien en la analítica

general, se detectaba algún parámetro fuera del rango de normalidad, desconocido hasta

ahora por ellos. No obstante, en los estudios similares al nuestro, el número de sujetos

no es muy elevado tampoco22, 113, 114. Existen otros estudios que comparan grupos de

fumadores sanos con no fumadores, y en ningún caso superan la muestra obtenida por

nosotros115.

1.c.- Criterios de inclusión/exclusión.

En los sujetos incluidos en ambos grupos se descartó enfermedad crónica

o aguda en las ocho semanas previas por la propia entrevista clínica con el paciente. En

la historia clínica se incidía de forma marcada en los síntomas de bronquitis crónica y

antecedentes de hiperreactividad bronquial. Se realizó una exploración física así como

una analítica general para descartar algún hallazgo patológico. Igualmente se descartó

mediante espirometría algún trastorno a nivel funcional respiratorio, o la existencia de

reversibilidad mediante el test broncodilatador. Esta selección de sujetos sanos es más

exhaustiva que la realizada en otros estudios, en los cuales sólo constatan mediante

historia clínica la ausencia de enfermedad respiratoria crónica o aguda, sin realizar

espirometría22. Otros estudios con grupos de fumadores sanos y no fumadores descartan

Discusión

124

patología respiratoria y confirman parámetros dentro del rango de la normalidad

simplemente mediante la realización de una espirometría91, 114, 115, 116.

El periodo de tiempo marcado en nuestro estudio para enfermedad aguda que

excluyera al paciente del estudio fue de 8 semanas. En la bibliografía consultada,

podemos coincidir con algunos autores113, 115, y en otros casos los límites de tiempo

oscilan entre 4 semanas22, 43, 6 semanas11 y 12 semanas114, 117.

1.d.- Recogida de muestra de condensado de aire exhalado.

La muestra recogida en el CAE reflejaría la capa de fluidos extracelular

broncoalveolar. En la capa de fluidos de las vías aéreas inferiores se han encontrado

múltiples sustancias volátiles y no volátiles. Entre las moléculas no volátiles que se

encuentran en el aire exhalado se han detectado citocinas que pueden representar

marcadores de algún proceso patológico pulmonar, entre ellas la molécula TNF-α, que

es la utilizada en nuestro estudio. Se ha postulado que la composición del CAE podría

reflejar la del BAL, y existen datos a favor y en contra de dicha afirmación. Jackson et

al comprobaron las correlaciones entre ambos fluidos de las concentraciones de óxido

nítrico, 8-isoprostano, peróxido de hidrógeno, pH y proteínas totales, sin encontrar

correlación alguna. Sin embargo, al estudiar las concentraciones de fosfolípidos y

queratina pudieron comprobar que eran similares los niveles de queratina en BAL y

CAE, mientras que los fosfolípidos estaban significativamente más elevados en CAE.

Estos últimos resultados no eran de esperar ya que la queratina tiene un origen epitelial,

y se presuponía mayores concentraciones en CAE al examinar éste toda la vía aérea; y

los fosfolípidos proceden del surfactante, por lo que era de presuponer una mayor

concentración en BAL85.

Discusión

125

Entre las principales ventajas de esta técnica están: la de ser no invasiva, puede

repetirse sin problemas, se puede usar en fase estable o en fase aguda de la enfermedad,

se puede usar en niños y en pacientes graves. Además se ha demostrado que la técnica

no tiene influencia posterior en la función pulmonar ni en la inflamación5. Sin embargo,

su principal limitación es la ausencia de métodos estándares de recolección. Están

descritos también otros problemas de la técnica como son la falta de reproducibilidad, la

variabilidad, la influencia de factores externos (alcohol, tabaco, fármacos) y la labilidad

de determinadas sustancias encontradas en el CAE para su medición tras la congelación.

Otro inconveniente con el que nos encontramos es la falta de guías clínicas que nos

informen sobre valores de referencia para personas sanas o con determinadas

enfermedades pulmonares, relación de dichos valores con síntomas o con función

pulmonar; o estudios clínicos que analicen la respuesta a fármacos5, 90, 93. También se

desconoce todavía la influencia de la edad, sexo, maniobras respiratorias

(espirometrías), calibre de la vía aérea, ritmo circadiano, infecciones y uso de

medicación sobre marcadores de CAE.

Debido al uso cada vez mayor del condensado de aire exhalado como una

novedosa herramienta de investigación en el campo de la neumología, la European

Respiratory Society publicó en 2005 unas normativas para tratar de unificar la

metodología de los trabajos que se estuvieran llevando a cabo con CAE90. Hemos

tratado de cumplir con la mayoría de las recomendaciones descritas en dicha

publicación. Así hemos utilizado el modelo comercializado Ecoscreen; Jaeger,

Hoechberg, Alemania; hemos registrado para cada paciente el tiempo de recolección, el

volumen minuto y el volumen de muestra recogido; y se han congelado las muestras a la

menor temperatura disponible en nuestro centro (-70º C). Por el contrario, no hemos

usado un atrapador de saliva para evitar la contaminación salival; no utilizamos una

Discusión

126

pinza nasal para evitar el paso de aire por el conducto nasal, tanto en la inspiración

como en la espiración; y no realizamos mediciones del pH. La contaminación salival sí

es un potencial problema que puede interferir con los resultados. En la realización de la

técnica a nuestros pacientes, al no disponer de atrapador, le pedíamos que se retirasen de

la pieza bucal y tragasen la saliva de forma periódica. Nuestro esfuerzo para evitar la

contaminación nasal consistió en pedir a los sujetos que trataran de respirar única y

exclusivamente por la boca. En el estudio más similar al nuestro encontrado en la

bibliografía (Garey et al) no usaron pinza nasal22, y existen otros estudios donde

también evitan el uso de esa pieza, ya que se piensa que la pinza nasal puede favorecer

la contaminación procedente de la nariz al abrir el velo nasofaríngeo5, 92. El pH de la

muestra no es una medida directa de que el líquido proceda de la vía aérea. En el estudio

de Garey et al tampoco realizan mediciones de pH. Estos motivos, y las limitaciones

económicas, nos inclinaron a tomar la decisión de no medir el pH de las muestras, a

pesar de que la recomendación está realizada por unanimidad de los expertos.

Como ya se señala en las normativas que estamos comentando, existe un posible

error de tipo II debido a la pérdida de sustancia durante el tiempo de congelación y hasta

su análisis. En lo que respecta al TNF-α, se conoce la vulnerabilidad de esta citocina,

con poca resistencia a la congelación-descongelación, con datos publicados de hasta un

15% de desviación estándar en los resultados91. Teniendo en cuenta este dato, hay que

asumir un posible sesgo en los resultados obtenidos en nuestra serie.

Discusión

127

2.- Resultados

2.a.- Valores de TNF-α plasmáticos

Existen dudas del efecto supresor o no del tabaco sobre TNF-α. Se

conoce que la producción de TNF-α por parte de las células mononucleares periféricas

de fumadores sanos frente a las de no fumadores es mayor en los fumadores118. Estudios

in vitro han demostrado el efecto supresor de extractos de humo del tabaco y de la

nicotina (ésta disminuía un 38% la producción de TNF-α en sangre periférica)67.

Estudios realizados en ratas han encontrado mínimas diferencias no significativas en

BAL de ratas “fumadoras pasivas”69, o ninguna diferencia68. En estudios con humanos,

se han visto cifras más elevadas de TNF-α en BAL de fumadores sanos frente a un

grupo control de no fumadores43. Sin embargo, existen trabajos que hablan del poder

supresor del tabaco sobre la producción del TNF-α11. También Dandrea et al describen

el efecto supresor del tabaco sobre la producción de TNF-α en las células del BAL de

un grupo de fumadores y otro de no fumadores tras ser incubadas con NO272

.

El valor medio de TNF-α plasmático en fumadores incluidos en nuestro estudio

fue de 6,55 pg/ml en plasma, frente a los 5,88 del grupo control, diferencias que fueron

significativas. Estas diferencias significativas las podemos encontrar en varios artículos

113, 114, aunque discrepan con lo publicado por otros autores, que no hallaron diferencias

en plasma según el estatus de fumador del sujeto, aunque en este última cita se trata de

un estudio poblacional80.

De Maat et al, en un estudio de TNF-α en plasma de pacientes con enfermedad

coronaria y 30 controles sanos (15 de ellos fumadores y 15 no fumadores), encontraron

que no existían diferencias significativas entre fumadores y no fumadores aunque estaba

ligeramente más elevado en el grupo de fumadores (2,21 vs 2,12 pg/ml)117. Gander et al

Discusión

128

no demostraron unos niveles mayores de TNF-α en fumadores tras estudiar a 198 no

fumadores (entre los que se incluían exfumadores de al menos 6 meses), 24 fumadores

irregulares y 78 fumadores activos (de al menos 3 cigarros/día). Los niveles de TNF-α

estaban elevados en fumadores activos (2,2 pg / ml) frente a no fumadores y fumadores

irregulares (que mostraban cifras similares de 1,8 pg / ml), pero sin alcanzar

significación estadística18. Tampoco Shaker et al encuentran diferencias en los niveles

de TNF-α en suero de fumadores y no fumadores sanos, aunque sí con un grupo de

pacientes con EPOC diagnosticado115.

Los niveles de TNF-α en plasma han sido estudiados en la población general y

se ha visto que dichos niveles están significativamente asociados al sexo (ligeramente

inferiores en mujeres) y a la edad (niveles más elevados en grupos de mayor edad)80. En

nuestro estudio, al igual que en el mencionado estudio poblacional, los niveles en

plasma también son ligeramente inferiores en mujeres (6,27 vs 6,30 pg/ml) sin alcanzar

la significación estadística. En nuestro estudio también encontramos diferencias

asociadas a la edad, de modo que a mayor edad, mayor niveles de TNF-α en plasma. En

este estudio, al igual que alguna otra publicación no encuentran relación entre TNF-α en

suero y el IMC115; sin embargo, nosotros sí encontramos que existe correlación entre

ambos valores, al igual que otros autores han encontrado relación entre TNF-α y

obesidad81.

2.b.- Valores de TNF-α en condensado de aire exhalado

El valor medio de TNF-α en CAE de nuestros fumadores fue de 4,03

pg/ml, siendo de 4,05 en el grupo control. Garey et al obtienen unos resultados muy

diferentes a los nuestros, ya que encuentran valores significativamente más elevados en

el grupo de fumadores que en el de controles sanos (7,4 vs 3,9 pg/ml)22. Sack et al

Discusión

129

encontraron diferencias en niveles de TNF-α en CAE entre fumadores y no fumadores,

aunque no queda especificado en su artículo las cifras de TNF-α en cada grupo. No

obstante, la figura incluida en el artículo referido demuestra que los valores en ambos

grupos eran muy bajos (menores a 0,5 pg/ml según dicha figura)91.

Estos resultados en CAE hay que asumirlos con el posible sesgo descrito en la

bibliografía, que es el debido a la labilidad del TNF-α al proceso congelación-

descongelación. El hecho de que no exista uniformidad en la recogida del CAE en los

trabajos existentes en la bibliografía, también puede influir en la discrepancia entre

nuestros resultados y lo publicado hasta ahora. Además el efecto supresor del tabaco en

la producción de TNF-α descrito en la literatura se aprecie más a nivel local (CAE) que

a nivel sistémico, de ahí que no encontremos diferencias en dicho medio y sí en plasma.

Para obtener una mayor cantidad de condensado se puede incrementar el

volumen minuto y el volumen corriente, sin que ello influya en la concentración de

determinadas sustancias no volátiles, como nitritos y proteínas97. Con la finalidad de

conocer la posible influencia de los parámetros de recogida de condensado, realizamos

un análisis de correlación entre los niveles de TNF-α y los parámetros recogidos en el

estudio (volumen de muestra, tiempo, volumen total de aire, pico flujo, volumen tidal,

volumen minuto y frecuencia respiratoria), y pudimos comprobar que los niveles de

TNF-α en CAE de fumadores se correlacionaban con el tiempo que estaban respirando

y con el volumen obtenido, sin que dichos niveles guarden relación con el resto de

parámetros analizados.

2.c.- Influencia de la cuantía de consumo de tabaco

La inflamación producida por el consumo de tabaco depende de la cuantía del citado

consumo. Así se ha comprobado que la cantidad de tabaco puede tener un valor

predictivo para los valores de determinados parámetros inflamatorios.

Discusión

130

Kuschner et al estudiaron en el BAL de catorce fumadores sanos y dieciséis no

fumadores el porcentaje celular, algunos mediadores proinflamatorios (TNF-α, IL-6,

IL-1β) y quimioatrayentes (la proteína quimiotáctica de monocitos y la IL-8 como

quimiotáctica de neutrófilos)43. Observaron que en fumadores, existían valores

significativamente más altos de neutrófilos, macrófagos, IL-1β, IL-6, IL-8 y MCP-1. En

este grupo de fumadores, comprobaron que aquellos que fumaban más de un paquete al

día tenían un valor predictivo para cifras de neutrófilos, macrófagos, IL-1β y IL-8.

También Lind et al han demostrado el efecto que tiene un mayor consumo diario de

tabaco sobre las proteínas inflamatorias44. Estos autores estudiaron un grupo de

proteínas inflamatorias (α1-glicoproteína ácida, α1-antitripsina, haptoglobina,

fibrinógeno y ceruloplasmina), encontrando mayores niveles en fumadores activos que

en no fumadores y exfumadores. Además, los niveles más altos estaban en el grupo de

fumadores de más de un paquete al día. La proporción de niveles elevados de al menos

dos de los marcadores estudiados en el cuartil superior se incrementaba con la cuantía

de tabaco consumido (19,5% en no fumadores y 56% en fumadores activos) y con los

niveles de carboxihemoglobina. Estas diferencias se mantenían incluso después de

ajustarlas a otros factores de riesgo cardiovascular (edad, diabetes, colesterol, IMC,

hipertensión sistólica arterial, etc). Carpagnano et al también han demostrado

diferencias significativas según el nivel de consumo diario de tabaco10. Estos autores

han estudiado los niveles de IL-6 y LTB4 (como marcador de inflamación neutrofílica)

en CAE de fumadores de al menos 10 cigarros / día. Existían diferencias entre aquellos

que fumaban menos de un paquete al día, los que fumaban un paquete al día y los que

fumaban más de un paquete, siendo todas las diferencias estadísticamente significativas.

También encontraron correlación entre los niveles de IL-6 y el número de

cigarrillos/día, así como con el CO espirado; y correlación negativa con FEV1 y FVC.

Discusión

131

Los niveles de LTB4 estaban también más elevados en fumadores (9,4 vs 6,1 pg/ml), y

se correlacionaban con los de IL-6.

En el análisis estadístico de nuestra serie sólo hemos encontrado correlación

entre los valores de TNF-α plasmáticos y la edad de inicio en el consumo, sin que

influya la cantidad diaria consumida ni el consumo total acumulado. En un estudio de

43 fumadores sanos, a diferencia de nuestro trabajo, sí demostraron una relación

positiva entre los valores de TNF-α en suero y el consumo diario, así como con el

índice paquetes-año113. En nuestros resultados hay que tener en cuenta, no obstante, que

la edad de inicio es un factor en la ecuación del cálculo del índice acumulado de

consumo (índice paquetes-año). El TNF-α en CAE no guarda relación con ninguno de

los parámetros de consumo recogidos en el estudio.

2.d.-Volumen de condensado recogido

La media de volumen de condensado obtenido fue de 3,44 ml, sin

diferencias entre sexos. No hemos encontrado en la bibliografía estudios que analicen la

posible influencia del género en el volumen de muestra ni en la concentración de

biomarcadores. Tampoco hemos encontrado diferencias entre el grupo control (3,42 ml)

y el grupo estudio (3,45 ml).

El volumen de CAE obtenido en nuestra serie sólo se correlacionaba con el

tiempo que estaban respirando, a pesar de que existen trabajos que han encontrado que

el factor que más influye en el volumen exhalado es, además de la duración de la

recolección, la ventilación minuto96. Otros trabajos han demostrado que incrementando

el volumen minuto y el volumen corriente se puede obtener una mayor cantidad de

condensado sin influir en la concentración de determinadas sustancias no volátiles97.

Discusión

132

La media de tiempo empleada por los sujetos estudiados (tanto fumadores como

no fumadores) para la recolección de CAE fue de 15,44 minutos, con un volumen de

muestra obtenido de 3,44 ml. En las recomendaciones ATS / ERS se sugiere un periodo

de tiempo de 10 minutos (como la mayoría de estudios publicados), ya que con ese

tiempo se obtienen entre 1 y 2 ml de condensado, y porque es un periodo de tiempo con

buena tolerancia por parte de los pacientes. Nosotros decidimos prolongar el tiempo de

recogida de muestra para disponer de un mayor volumen de condensado con la

intención de incluir en el análisis de alguna otra citocina inflamatoria.

En nuestro trabajo no hemos encontrado que exista una correlación entre los

valores de función pulmonar (tanto en niveles absolutos como en el porcentaje respecto

al teórico) y el volumen de muestra obtenido. En la literatura se describe cómo es mayor

la influencia de la ventilación que la de la función pulmonar en la cantidad de muestra

resultante, ya que si la ventilación se mantiene constante, el volumen de condensado se

incrementa con el tiempo, incluso en pacientes EPOC96. Además se ha comprobado que

el volumen obtenido se relaciona con el volumen tidal y con el volumen minuto, pero

no con la capacidad pulmonar total98.

3.- TNF-α como marcador precoz de enfermedad

La EPOC es una enfermedad infradiagnosticada y con una prevalencia que va en

aumento, ya que se estimaba en 9,1% en nuestro país hace unos años3 y recientemente

se ha publicado una cifra ligeramente superior (10,2%) en personas entre 40 y 80 años4.

El humo del tabaco está presente casi siempre que se diagnostica a un paciente de

EPOC. Sin embargo, sólo un 15% de los fumadores desarrolla EPOC. La definición de

esta enfermedad es una obstrucción crónica al flujo aéreo poco reversible; no obstante

cuando la espirometría detecta dicha obstrucción, el problema está ya instaurado y

Discusión

133

aunque se abandone el hábito de fumar, el proceso inflamatorio puede resultar

irreversible. La EPOC también se define como una respuesta inflamatoria anormal a

partículas nocivas o gases, por lo que una inflamación pulmonar (consistente en un

incremento en el número y actividad de células inflamatorias como neutrófilos y

macrófagos)119 puede ser un evento patológico temprano en la EPOC. Por esta razón es

muy importante detectar los fenómenos inflamatorios en el periodo “silencioso” de la

enfermedad, que puede ser de años de duración.

Se conocen datos de inflamación en fumadores sin patología establecida. El

BAL de pacientes con bronquitis crónica tiene mayor celularidad y mayor porcentaje de

neutrófilos que el BAL de fumadores sanos y no fumadores14, 25. Además, el porcentaje

de neutrófilos en aquellos que superan el 20% se relaciona con el consumo diario de

tabaco y con el índice acumulado de paquetes-año, así como con todos los valores

espirométricos. Las células caliciformes están más elevadas en pacientes con bronquitis

crónica y guardan relación con el número de paquetes-año y de forma negativa con

FEV1, FEV1/FVC y con FEF25-75. También se ha observado que el índice de bronquitis

determinado mediante broncoscopia es menor en fumadores asintomáticos que en

aquellos que ya padecen una bronquitis crónica14. A nivel histológico se han

identificado lesiones típicas posiblemente reversibles, que pueden ser las precursoras de

lesiones anatómicas más severas, como es la bronquiolitis respiratoria asociada a

macrófagos alveolares pigmentados en los bronquíolos respiratorios de primer y

segundo orden distales al bronquiolo membranoso terminal15. Comparando pulmones de

pacientes EPOC con los de un grupo de fumadores sin patología y otro grupo de no

fumadores, se vio que la severidad del enfisema era mayor en el grupo EPOC, sin que

existieran diferencias entre los otros dos grupos. En el grupo de fumadores sanos

Discusión

134

respecto al grupo control se vio que los bronquíolos de menos de 2 mm de diámetro

tenían mayor infiltrado celular inflamatorio y mayor hipertrofia de músculo liso30.

Además, se han realizado intentos de correlacionar los hallazgos patológicos

encontrados en fumadores antes de padecer enfermedad con la función pulmonar. En el

grupo con menor puntuación patológica se ha visto una función pulmonar normal, que

se deterioraba progresivamente al ir incrementándose los hallazgos patológicos. Con

esto se han podido identificar unas lesiones potencialmente reversibles, como son los

infiltrados celulares inflamatorios, la metaplasia de células escamosas y una mínima

fibrosis de la pared de la vía aérea16.

Se han realizado intentos para identificar un marcador plasmático de inflamación

en fumadores. Gander et al no demostraron unos niveles mayores de TNF-α en

fumadores. Los niveles de TNF-α estaban elevados en fumadores activos (2,2 pg / ml)

frente a no fumadores y fumadores irregulares (que mostraban cifras similares de 1,8 pg

/ ml), pero sin alcanzar significación estadística18. Garey et al, utilizando el CAE

encuentran diferencias entre un grupo de fumadores sanos y un grupo control no

fumador (7,4 vs 3,9 pg/ml)22.

Se han propuesto distintos modelos de inflamación según la enfermedad

respiratoria que se padezca. Estudios con pacientes EPOC, asmáticos, bronquitis crónica

y “fumadores sanos” demostraron diferencias en determinados marcadores

inflamatorios. Los pacientes EPOC mostraron unos mayores niveles de neutrófilos, de

IL-8 y sTNF-R75 en esputo; y de IL-8, sRNF-R75 y proteína ligadora de

lipopolisacáridos (LBP) en plasma. Los asmáticos mostraban eosinofilia en esputo,

mientras que los pacientes con bronquitis crónica tenían más linfocitos en esputo y

valores significativamente inferiores en plasma de sTNF-R75 y 55. Los fumadores

sanos sólo mostraron unos mayores niveles de LBP en plasma35.

Discusión

135

También el condensado de aire exhalado (CAE) es un medio utilizado en

fumadores sintomáticos que están en riesgo de padecer EPOC para el estudio de

marcadores inflamatorios. Los no fumadores tienen niveles más bajos de 8-isoprostano

respecto a fumadores asintomáticos y fumadores con síntomas de bronquitis crónica.

Los niveles de IL-8 y de 8-isoprostano se correlacionaban inversamente con varios

parámetros de función respiratoria (FVC, FEV1 , FEV1 /FVC, DLCO%). Además el 8-

isoprostano en CAE permite distinguir ente no fumadores y fumadores no

sintomáticos37.

En nuestro intento por encontrar un posible papel del TNF-α como predictor de

inflamación en fumadores sanos, sólo hemos encontrado diferencias significativas en

los valores de TNF-α en plasma, y no en CAE. Dichos valores sólo correlacionaban

discretamente con los valores de función pulmonar (FEV1% y FVC%). La influencia del

consumo de tabaco tampoco se ha podido demostrar, aunque los niveles de TNF-α

plasmáticos correlacionaban de forma positiva con la edad de inicio en el consumo,

factor clave en la carga tabáquica acumulada.

136

VIII. CONCLUSIONES

Conclusiones

137

1.- Los fumadores tienen valores más elevados que los no fumadores de la

citosina proinflamatoria TNF-α en suero.

2.- No existen diferencias en los valores de TNF-α en condesado de aire

exhalado (CAE) entre fumadores y no fumadores.

3.- El sexo no demuestra ser un factor determinante en los niveles de TNF-α en

ninguno de los medios estudiados.

4.- A mayor edad de los sujetos, se pueden encontrar mayores niveles de TNF-α

en suero.

5.- No existe influencia de la edad sobre los valores de TNF-α en CAE.

6.- Un mayor índice de masa corporal (IMC) influye en mayores niveles de

TNF-α plasmáticos.

7.- No existe relación entre el IMC y los valores de TNF-α en CAE.

8.- El tiempo de duración del hábito tabáquico influye más sobre la inflamación

sistémica que el consumo diario.

9.- Los niveles de TNF-α en CAE no se modifican por ninguno de los

parámetros de consumo de tabaco.

Conclusiones

138

10.- La función pulmonar (FVC y débilmente FEV1) guarda relación con los

valores plasmáticos de TNF-α.

11.- Los parámetros de función pulmonar no influyen en los valores de TNF-α

en CAE.

139

IX. BIBLIOGRAFÍA

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154

X._ABREVIATURAS

Abreviaturas

155

ADN: ácido desxosirribonucleico

AMP: adenosín monofosfato

BAL: lavado broncoalveolar

BC: bronquitis crónica

CAE: condensado de aire exhalado

CO: monóxido de carbono

DLCO: capacidad de difusión del monóxido de carbono

ECP: proteína catiónica de eosinófilos

ELISA: enzima inmunoensayo

EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica

FEF25-75: flujos meso-espiratorios

FEV1: flujo espirado en el primer segundo

FEV1/FVC: relación entre el flujo espirado en el primer segundo y la capacidad vital

forzada

FVC: capacidad vital forzada

HA: ácido hialurónico

Ig: inmunoglobulinas

IFN: interferón

IL: interleukinas

IMC: índice de masa corporal

LBP: proteína ligadora de lipopoilisacáridos

LPS: lipopolisacáridos

LT: leucotrienos

MCP: proteína quimiotáctica de monocitos

MMEF75-25: flujos meso-espiratorios

Abreviaturas

156

MMP: metaoloproteinasa

MPO: mieloperoxidasa

NO: óxido nítrico

PCR: proteína C reactiva

PCR: reacción en cadena de polimerasa

PEF: pico flujo espiratorio

Ppm: partes por millón

Rtot: resistencias totales pulmonares

TLC: capacidad pulmonar total

TNF-α: factor de necrosis tumoral alpha

VC: capacidad vital

Vmin: volumen minuto

VR: volumen residual

VT: volumen tidal

157

XI. ANEXOS

Anexos

158

Anexo I. Aprobación del estudio por el CEIC del hospital

Anexos

159

Anexos

160

Anexo II. Modelo de consentimiento informado

Anexos

161

Estimado Sr. Dº/ª ……………….

Queremos solicitarle su autorización para la extracción de una muestra de sangre

y para la recogida de una muestra de condensado de aire exhalado con el fin de realizar

un estudio de investigación que se llevará a cabo en nuestro centro. El estudio lleva el

título de “REDUCCIÓN DE INFLAMACIÓN SISTÉMICA Y DEL TNF-ALPHA EN

EL CONDENSADO DE AIRE EXHALADO EN FUMADORES QUE ABANDONAN

EL HÁBITO CON BUPROPION: ESTUDIO DE CASOS Y CONTROLES”. Antes de

firmar este documento, léalo con atención. No está obligado a firmarlo si no lo desea, y

en este caso, no se verá mermada su atención en nuestra consulta de deshabituación

tabáquica.

Objeto de la Investigación

El consumo de tabaco es la principal causa de la enfermedad pulmonar obstructiva

crónica (EPOC), enfermedad que ocupa el cuarto lugar de causas de mortalidad en

países desarrollados. Esta enfermedad está definida por una obstrucción al flujo aéreo

detectada en la espirometría, pero una vez se observa este hecho, la situación es ya

irreversible. La inflamación forma parte del proceso inicial de la enfermedad, por lo que

sería muy importante detectarla antes de que se establezca la obstrucción bronquial. En

esta inflamación intervienen múltiples proteínas, siendo una de ellas el TNF-α, la cual

es objeto de estudio por nuestra parte.

Nuestra intención es demostrar que los fumadores sin enfermedades tienen un

estado de inflamación en comparación con los no fumadores, también en este caso sin

enfermedad conocida. Esta inflamación se relacionaría con el consumo de tabaco, y con

los datos de función pulmonar obtenidos en la espirometría que se realiza de forma

rutinaria en nuestra consulta. Tras el abandono del tabaco utilizando la medicación

bupropion, los datos de inflamación en los fumadores se reducen y alcanzan valores

Anexos

162

similares a los de los no fumadores. Con ello intentamos contribuir a la detección de

fumadores en riesgo de desarrollar EPOC.

Implicaciones del estudio

Todas las investigaciones que se llevan a cabo para este estudio cuentan con la

supervisión del Comité de Ética e Investigación Clínica de nuestro hospital.

La colaboración en este estudio es altruista y por lo tanto no conlleva ningún

beneficio económico para la persona que decide colaborar.

El uso que se haga de la información obtenida será confidencial. Por lo tanto, su

identidad será siempre preservada. Igualmente los datos obtenidos sólo podrán ser

publicados de forma anónima y agregada, es decir, en forma de porcentajes o datos

numéricos sin identificación del participante, y nunca de manera individual.

Consentimiento

El doctor....................................... me ha proporcionado suficiente información acerca

del estudio denominado “REDUCCIÓN DE INFLAMACIÓN SISTÉMICA Y DEL

TNF-ALPHA EN EL CONDENSADO DE AIRE EXHALADO EN FUMADORES

QUE ABANDONAN EL HÁBITO CON BUPROPION: ESTUDIO DE CASOS Y

CONTROLES”, y me ha aclarado las dudas surgidas. Por ello, consiento en participar

en este estudio y autorizo que mi muestra de sangre y de condensado de aire exhalado

sea utilizada para la investigación.

Firma del propietario de la muestra

Anexos

163

Anexo III. Base de datos

Anexos

164

Paciente Edad Sexo Tabaco TNF-α suero TNF-α CAE

1 38 Varón No 4,95 3,97

2 40 Varón Si 5,66 4,90

3 38 Varón No 6,19 4,10

4 54 Varón Si 5,37 5,50

5 38 Varón Si 6,28 6,06

6 49 Mujer Si 5,09 4,39

7 41 Mujer Si 5,46 4,20

8 32 Mujer No 5,00 4,60

9 25 Varón No 5,73 3,87

10 39 Mujer Si 5,36 4,51

11 33 Varón No 5,20 4,20

12 31 Mujer No 4,73 3,90

13 43 Mujer Si 5,79 3,64

14 42 Varón No 5,97 3,65

15 31 Varón No 5,37 4,30

16 33 Mujer No 5,40 3,85

17 47 Mujer No 6,28 5,83

18 37 Mujer Si 6,62 3,77

19 26 Varón No 7,17 3,71

20 31 Mujer Si 5,12 4,34

Anexos

165

Paciente

FVC

(ml)

FVC

(%)

FEV1

(ml)

FEV1

(%)

MMEF

(ml)

MMEF

(%)

IT

1 5.870 119,2

4.630 119,9

4.000 90,70 78,87

2 5.470 99,6

4.650 109,3

4.940 110,90 84,94

3 5.240 90,4

4.410 98,3

4.380 94,90 84,30

4 4.490 90,6

3.410 92,1

2.550 68,00 76,14

5 5.140 92

3.750 86,3

2.680 58,80 72,84

6 2.980 91,1

2.460 97,8

2.230 69,20 82,77

7 4.430 122,4

3.820 134,1

4.480 126,70 86,20

8 4.020 85

3.470 91,9

3.160 69,60 86,22

9 5.370 94

4.410 96,5

4.400 86,20 82,05

10 2.860 88

2.460 94,2

3.140 90,00 85,92

11 6.060 99,6

4.910 102,9

4.490 90,90 80,99

12 4.100 104,6

3.810 120,5

4.910 125,70 92,83

13 4.260 114,7

3.420 118,4

3.040 86,70 80,35

14 4.440 98,1

3.930 111,3

4.650 112,40 88,48

15 4.640 91,1

3.870 95,3

3.910 82,70 83,36

16 4.150 102,3

3.700 114,4

4.660 119,90 89,12

17 3.270 94,8

2.700 101,3

2.810 84,50 82,61

18 3.890 94,5

3.220 99,7

3.500 92,40 82,89

19 5.760 91,2

5.340 106,9

6.130 117,10 92,82

20 3.630 88,5

2.720 81

2.250 66,10 75,03

Anexos

166

Paciente IMC

Número

cigarrillos/día

Número

paquetes-año

Edad

inicio

1 26,64

No fumador No fumador No fumador

2 36,2

18 24 14

3 29,11


4 32,2

20 40 15

5 32,86

25 30 13

6 25,96

20 30 18

7 28,66

50 74 14

8 21,41


9 28,25


10 20,56

30 39 14

11 26,3


12 19,57


13 18,03

20 25 18

14 25,71


15 23,6


16 18,11


17 21,88


18 22,15

24 30 13

19 20,65


20 18,03

14 15 15

Anexos

167

Paciente

Volumen

muestra Volumen

Total Tiempo PEF

Volumen

Tidal

Volumen

minuto

Frecuencia

respiratoria

1 4,4 312,9 15,18 0,5 0,82 17,8 17,9

2 4,2 400,5 29,11 0,4 0,38 9,6 23,5

3 3,7 250,2 14,01 0,4 0,38 11,8 19,5

4 4,3 200,4 20,28 0,5 1,11 15,1 17,6

5 4,6 250,9 20,03 0,5 0,76 19,8 22,4

6 4,2 202,6 21,50 0,4 0,40 8,2 21,2

7 5,0 216,9 20,56 0,4 0,54 8,8 16,4

8 4,2 274,1 14,18 0,4 0,68 15,6 20,6

9 5,0 304,1 20,03 0,9 0,99 17,1 17,2

10 5,1 223,9 21,29 0,4 0,63 12,4 22,0

11 4,0 527,6 15,07 1,2 1,16 19,9 25,2

12 4,9 262,3 15,07 0,4 0,59 12,5 18,7

13 4,7 232,8 13,19 0,3 0,83 4,8 16,5

14 4,4 206,2 17,49 0,3 0,42 6,8 15,1

15 2,9 204,9 12,05 0,4 0,66 18,1 18,9

16 3,2 287,9 10,11 0,6 1,19 107,2 35,2

17 2,1 135,0 12,13 0,1 0,27 6,9 21,7

18 4,2 284,7 13,22 0,3 0,57 11,3 17,0

19 3,2 244,7 12,54 0,6 0,85 14,1 15,3

20 3,0 151,5 12,39 0,3 0,54 7,8 19,0

Anexos

168


21 26 Mujer Si 6,17 3,56

22 50 Mujer Si 7,55 3,83

23 45 Varón Si 7,74 3,73

24 42 Mujer No 6,72 3,93

25 45 Mujer No 5,55 4,22

26 54 Mujer Si 8,46 3,77

27 40 Mujer Si 9,84 4,11

28 32 Mujer Si 8,38 4,13

29 44 Varón Si 7,47 3,49

30 39 Varón Si 7,32 4,63

31 30 Varón No 4,98 4,40

32 45 Mujer Si 5,02 3,86

33 47 Mujer No 4,89 3,76

34 50 Varón Si 7,74 3,73

35 43 Varón Si 7,08 4,10

36 48 Mujer Si 6,19 4,70

37 43 Mujer No 5,47 4,06

38 44 Varón Si 6,41 3,69

39 46 Mujer No 6,24 3,88

40 36 Mujer Si 5,97 3,78

Anexos

169

Paciente

FVC

(ml)

FVC

(%)

FEV1

(ml)

FEV1

(%)

MMEF

(ml)

MMEF

(%)

IT

21 3320 75,7 2970 83,9 3270 78,3 89,35

22 2970 87,8 2210 85,2 1640 50,9 74,26

23 4480 93,1 3580 96,7 3300 81,3 79,80

24 4130 100,9 3320 104,7 3030 83,2 80,31

25 3830 114,2 3080 116,8 2950 86,6 80,50

26 3110 81,9 2540 89,4 2470 76,6 81,53

27 3970 98,7 3450 109,9 4410 119,8 86,88

28 3110 77,2 2810 86,9 3850 98,5 90,10

29 4930 88,5 3830 89,7 2870 66,5 77,68

30 6190 109,7 5230 119,5 5590 123,2 84,41

31 6410 108,2 4870 104,0 3820 76,4 75,92

32 4260 118,9 3470 124,8 3420 100,2 81,50

33 3860 106,4 3290 117,0 4050 118,3 85,20

34 5340 103,1 3980 101,8 3020 76,0 74,63

35 3990 76,1 3120 77,3 2640 61,9 78,20

36 3430 98,9 2690 100,8 2280 69,1 78,50

37 2780 86,5 2340 92,0 2790 82,6 84,17

38 5130 85,8 4000 87,6 3400 76,7 78,01

39 3970 111,6 3200 116,1 2990 88,4 80,50

40 3110 87,7 2510 88,2 2400 65,6 80,72

Anexos

170

Paciente IMC

Número

cigarrillos/día

Número

paquetes-año Edad inicio

21 22,23

10 11 12

22 46,09

25 35 16

23 26,99

30 42 16

24 18,93


25 21,78


26 31,46

25 35 19

27 23,67

22 18 24

28 31,57

30 24 16

29 21,37

20 26 13

30 26,25

12 14 16

31 29,11


32 18,07

20 27 18

33 19,57


34 23,95

20 30 20

35 30,02

40 60 14

36 23,92

30 45 16

37 23,92


38 25,17

10 13 17

39 20,2


40 32,05

20 20 16

Anexos

171

Paciente

Volumen

muestra

Volumen

total Tiempo PEF

Volume

Tidal

Volumen

minuto

Frecuencia

respiratoria

21 3,0 203,5 12,25 0,2 0,40 13,9 21,9

22 3,4 180,8 14,16 0,3 0,58 8,3 16,7

23 2,8 217,9 10,46 1,4 1,34 28,1 19,6

24 2,9 200,8 16,58 0,2 0,36 24,1 16,5

25 3,5 218,4 15,44 0,5 0,29 7,8 12,7

26 3,3 203,8 16,26 0,4 0,40 11,7 28,2

27 4,0 224,2 17,28 0,3 0,41 11,4 17,6

28 3,3 228,6 14,01 0,8 1,34 15,4 11,5

29 3,2 254,3 12,47 0,4 0,42 13,1 17,1

30 3,3 200,0 11,51 0,5 0,39 9,9 21,7

31 4,7 243,7 14,04 0,4 0,71 18,7 19,5

32 4,0 199,9 14,08 0,3 0,67 13,1 20,7

33 1,0 155,1 14,18 0,3 0,34 12,9 33,8

34 2,6 629,4 9,48 0,8 0,92 17,3 17,7

35 3,8 349,4 17,52 0,5 1,73 30,8 17,6

36 5,4 222,0 16,08 0,6 0,42 8,6 19,9

37 2,6 182,0 13,57 1,0 0,67 13,7 13,9

38 1,8 180,2 15,14 0,1 0,27 6,7 16,9

39 3,2 301,5 12,47 0,7 0,86 23,6 15,9

40 3,7 327,8 18,41 0,1 0,22 5,3 15,7

Anexos

172


41 38 Varón Si 5,43 3,97

42 45 Varón Si 7,26 3,25

43 43 Varón No 7,18 3,35

44 52 Mujer No 6,14 3,63

45 35 Varón Si 7,03 3,52

46 26 Varón Si 5,07 3,77

47 38 Mujer No 8,41 3,91

48 29 Mujer Si 4,67 3,55

49 36 Mujer Si 6,58 3,36

50 48 Mujer Si 7,47 3,79

51 47 Mujer Si 7,38 3,35

Anexos

173

Paciente

FVC

(ml)

FVC

(%)

FEV1

(ml)

FEV1

(%)

MMEF

(ml)

MMEF

(%)

IT

41 6360 100,1 5160 105,1 5110 106,2 81,21

42 4360 82,5 3780 93,6 4570 123,6 86,70

43 4740 97,7 3820 101,5 3180 75,9 80,53

44 3390 101,5 2590 102,0 1850 58,6 76,38

45 5630 105,0 4640 110,4 4420 95,9 82,47

46 4540 104,5 3880 110,6 4370 105,0 85,48

47 2620 74,0 2330 82,5 2970 82,5 88,94

48 3680 103,5 3040 104,0 3180 82,3 82,65

49 6920 118,8 5420 119,5 4120 87,5 78,36

50 4080 102,7 3240 107,2 2910 84,7 79,33

51 3630 100,1 3060 109,5 3650 108,2 84,17

Anexos

174

Paciente IMC

Número

cigarrillos/día

Número

paquetes-año

Edad

inicio

41 30,15

10 13 14

42 35,58

30 45 15

43 25,61


44 21,48


45 17,43

25 30 14

46 17,99

10 11 16

47 28,84


48 21,08

20 17 13

49 28,68

15 16 15

50 23,66

7 10 20

51 29,37

20 32 15

Anexos

175

Paciente

Volumen

muestra

Volumen

total Tiempo PEF

Volumen

Total

Volumen

minuto

Frecuencia

respiratoria

41 3,7 298,6 18,00 0,5 0,64 18,0 16,7

42 3,5 192,0 16,00 0,3 0,52 11,2 21,0

43 3,0 194,8 17,43 0,2 0,49 18,6 19,4

44 3,3 203,7 19,06 0,5 0,52 10,3 15,7

45 3,0 206,3 17,32 0,4 0,62 9,9 17,8

46 2,5 216,7 16,46 0,4 0,35 9,4 24,4

47 2,1 192,1 19,18 0,1 0,16 3,2 21,8

48 2,4 128,9 14,06 0,1 0,19 5,3 27,8

49 2,0 620,8 12,23 0,7 0,97 17,2 18,0

50 1,0 149,4 10,00 0,3 0,71 14,3 17,5

51 1,8 212,3 13,21 0,3 0,54 11,1 17,8

Anexos

176

Anexo IV. Resumen en Inglés

Anexos

177

The aims of this study were to demonstrate an inflammatory status of healthy

smokers in comparison to a group of healthy non smokers by measuring the levels of a

proinflammatory citokyne: TNF-α. We also wanted to know whether there was

influence of gender, age and weight on TNF-α levels; and to determine the association

between smoking, pulmonary function and TNF-α.

We made a prospective study of smokers and non-smokers without any known

disease. Respiratory function tests, samples of exhaled breath condensate (EBC) and

blood were performed before smoking cessation. Statistical analysis were made with

SPSS 11.0.

We studied 51 patients, 60,8% smokers (n = 31), 56,9% female (n = 29), mean

age 39,88 +/- 7,61 years old, and mean body mass index (BMI) 25,33 +/- 5,74 kg/m2 .

There were no significant differences between the two groups, except for BMI that was

higher in smokers (26,50 vs 23,53 kg/m2, p = 0,044). Smokers had significant higher

levels of TNF-α in plasma (6,54 pg/ml vs 5,88 pg/ml, p = 0,043), but there were no

differences in TNF-α in EBC (4,03 pg/ml vs 4,05 pg/ml, p = 0,89). Age and BMI has an

influence on the levels of serum TNF-α, but not in EBC values. Of the parameters of

smoking studied, only the age when smoking first began had an influence on TNF-α

plasma values, but not in EBC TNF-α levels. In terms of lung function, we just found a

correlation between FVC and FEV1 (porcentual values) with serum TNF-α (not in

EBC).

In conclusion, we can say that healthy smokers showed higher levels of TNF-α

in serum but not in EBC when compared to non smokers. There was an influence of

body mass index on serum TNF-α levels. The time when smoking started is the main

Anexos

178

data of tobacco consumption that influenced the levels of TNF-α in plasma. There was a

correlation between lung function and serum TNF-α.

tesis doctoral factor de necrosis tumoral alpha …

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