Terapie genica: metode de terapie

genica, sisteme de transfer a genelor la

om

1

CUPRINS

Introducere 3

Capitolul 1: Terapia genica 4

1.1. Metode de terapie genica 4

Capitolul 2: Sisteme de transfer a genelor la om 6

2.1. Sisteme virale 6

2.2. Sisteme nevirale 11

Capitolul 3: Siguranta terapiei genie 14

Concluzii 16

Bibliografie 17

2

Introducere

Terapia genica este o tehnica care se refera la introducerea uneia sau a mai multor

gene intr-o celula pentru a corecta un defect. Acest lucru este destinat pentru a incetini

progresia unei boli si imbunatatirea calitatii vietii unui individ.

In viitor aceasta tehnica ar putea permite medicilor sa trateze o tulburarea celulara

prin introducerea unei gene in celulele unui pacient in loc de a folosi medicamente sau

interventii chirurgicale.

Desi terapia genica este o optiune promitatoare de tratament pentru un numar

mare de boli (inclusiv tulburari mostenite, anumite tipuri de cancer si infectii virale)

tehnica ramane riscanta si este in curs de studiu pentru a-i pori siguranta si eficacitate.

Terapia genica momentan este folosita si testata in tratamentul bolilor care nu au leac.

3

Capitolul 1: Terapia genica

O data cu aparitia de noi cunostinte in domeniul biologiei moleculare, a devenit

un lucru evident faptul ca aparitia multe boli umane sunt legate de schimbari la nivelul

genelor. Genele reprezinta punctul de plecare pentru toate evenimentele care conduc

ulterior la shimbari in expresia proteinelor din celule. Cand genele sunt modificate in asa

fel incat proteinele codificate de acestea sunt in imposibilitatea de a indeplini functia lor

normala, poate aparea o tulburarea genetica.

Efectul cumulat determinat de gene atipice sau defecte intr-un organ conduce la

fenotipul bolii. Terapia genica este utilizata pentru a corecta defecte genice care pot

determina aparitia unor boli si consta in blocarea unei gene activate nedorite, corectarea

sau inlocuirea genei defecte cu o gena normala. Bolile in principal vizate de terapie

genica unama sunt bolile monogenice, care sunt cauzate de defecte ale unei singure gene.

1.1. Metode de terapie genica

Primul pas in terapia genica este de a identifica gena care cauzeaza problema.

Apoi materialul genetic adecvat este introdus in celulele tinta, cu scopul de a corecta

problema.

Se utilizeaza doua strategii principale:

terapia in vivo, in care materialul genetic este introdus direct in individ pe

o cale sistematica, sau atunci cand este posibil, la o locatie specifica;

terapia ex vivo, in care celulele tinta sunt tratate cu produsul genei inafara

individului, celulele sunt extinse si apoi transferate inapoi la pacient;

Cheia pentru succes in terapia genica in vivo este transferul de material genetic la

celulele tinta sau tesuturi, si exprimarea efectiva a genei in cauza dar acest lucru este un

proces complex care necesita depasirea mai multor obstacole.

Terapia genica ex vivo implica trasferul de gene la celule mentinute in cultura,

ulterior vor fi transplantate la tesutul tinta. Se utilizeaza celule din sangele pacientului sau

maduva osoasa, care sunt recoltate si cultivate in laborator. Celulele sunt expuse la

4

virusul care poarta gena dorita. Virusul intra in celula si insereaza gena dorita in ADN-ul

gazdei. Celulele cresc in laborator si sunt apoi returante pacientului prin injectarea intr-o

vena. Celulele transferate trebuie sa fie disponibile in cantitati mari, sa aiba o viata lunga

dupa trasfer in corpul pacientului, sa exprime gena de interes pentru o perioada lunga de

timp si sa nu atraga nici un fel de raspuns imun.

Avantajele terapiei ex vivo includ posibilitatea caracterizarii populatiei de celule

modificate inainte de transfer. Acest lucru usureaza introducerea materialului genetic in

celule si se poate asigura ca populatia de celule clonate exprima o cantitate mare de

produs codificat de catre transgene inainte de transferul inapoi la pacient.

5

Capitolul 2: Sisteme de transfer a genelor la om

O gena care se introduce direct intr-o celula, de obicei nu functioneaza. In schimb

un transportator denumit vector, este modificat genetic pentru a livra gena. Dezvoltarea

acestor vectori a facut obiectul a numeroase studii. Vectorii utilizati pot fi impartiti in

doua categorii: vectori virali si vectori nevirali sau sintetici.

Vectorii virali utilizeaza capacitatea virusurilor de a livra noua gena prin

infectarea celulei. Virusurile sunt modificate astfel incat sa nu poata provoca boala atunci

cand sunt utilizate la oameni.

Vectorii sintetici depind de transferul direct de informatii genetice in celule tinta.

Ambele sisteme au avantaje si dezavantaje, care trebuie luate in considerare, in functie de

tratamentul destinat.

2.1.Sisteme virale

Conceptul de vectori virali este bazat pe capacitatea innascuta a virusurilor pentru

a elibera materialul lor genetic in celula infectata. Vectorii virali sunt utilizati pe scara

larga in cele mai multe protocoale preclinice si clinice, pentru terapi in care se doreste o

transfectie foarte stabila. Cu toate acestea, cea mai mare ingrijorare in utilizarea

virusurilor ca vectori pentru terapie este ca infectia virala poate conduce la efecte

nedorite, cum ar fi distrugerea tesutului gazda. Alte dezavantaje includ limitarea

dimensiunii genei pe care virusurile o pot trasnsporta, dificultatea de standardizare a

producerii de particule virale prin culturi de celule si cost mai mare in comparatie cu

producerea plasmidului ADN.

Pentru utilizarea virusurilor ca vectori este necesara utilizarea unor informatii de

baza cum ar fi:

identificarea secventei virale necesare pentru replicare;

constructia de particule virale;

ambalarea genomului viral;

eliberarea genei heteroloage in celula gazda;

6

Printre virusurile utilizate pe scara larga pentru terapie geica sunt folosite pentru

obtinerea proteinelor heterogene din celule de animal, in special virusuri ARN

(retrovirusuri si lentivirusuri) si virusuri ADN (adenovirusuri, virusuri adeno-asociate si

herpesvirus).

Adenovirusurile sunt distribuite pe scara larga in natura, si infecteaza pasari si

multe mamifere, inclusiv omul. Acestea provoaca infectii respiratorii superioare la copii

si la adulti. Adenovirusurile sunt neincapsulate, cu genomul liniar compus din ADN

dublu catenar. Genomul virusului nu se integreaza in genomul celulei gazdei, eliminand

astfel riscurile de mutageneza datorita insertiei genormice. Subtipurile 2 sau 5 sunt

utilizate preponderent ca vectori de terapie genica.

Acest sistem vector a avut rezultate promitatoare in tratarea cancerului si intra-

adevar primul produs licentiat pentru terapia genica, este un adenovirus folosit pentru

tratarea cancerului.

7

Figure 1: Gene therapy using an Adenovirus vector

Virusuri adeno-asociate (AAV) sunt virusui mici, non-patogene, fac parte din

familia parvovirusurilor. Aplicarea acestor virusuri depind de un virus auxiliar, de obicei,

un adenovirus. AAV sunt capabili de a infecta diviziunea celulelor, si in absenta unui

virus auxiliar ele se pot integra intr-un sit specific in genomul celulei gazde. Genomul

AAV este compus dintr-o molecula de ADN monocatenar. Spre deosebire de

adenovirusuri, cei mai multi pacienti tratati cu AAV nu au prezentat un raspuns imun de a

elimina virusul si celulele au fost tratate cu succes.

Exista cateva dezavantaje la folosirea AAV si se refera la cantitatea mica de ADN

care se poate transporta si la dificultatea in realizarea procesului.

Mai multe studii cu AAV sunt in curs de desfasurare sau in pregatire, in special se

incearca tratare bolilor la nivelul muschilor si a ochilor, deasemenea vectorii AAV sunt

utilizati si pentru a transporta gene la nivelul creierului.

8

Figure 2: Producing recombinant AAV vectors

Virusul herpes simplex (HSV) este un virus uman, utilizat ca un vector pentru

transferul de gene in sistemul nervos. Genomul HSV este relativ mare, liniar compus

dintr-o molecula de ADN dublu catenar, invelit intr-o cusca proteica denumita capsida,

care este invelita intr-un strat lipidic denumit anvelopa. Genomul virusurilor herpetice

codifica intre 100-200 de gene. Aceste gene codifica o varietate de proteine implicate in

formarea capsidei, tegumentului si a anvelopei virusului, precum si controlul replicarii si

functia de infectie a virusului.

Retrovirusurile sunt virusuri care apartin familiei virale Retroviridae. Tot

materialul genetic al retrovirusurilor este in forma de molecule de ARN, in timp ce

materialul genetic al gazdelor este in forma de ADN. Atunci cand un retrovirus infecteaza

o celula gazda, se va introduce in celula ARN-ul sau impreuna cu unele enzime. Aceasta

molecula de ARN din retrovirus trebuie sa produca o copie a ADN-ului, inainte de a

putea fi considerata ca facand parte din materialul genetic al gazdei. Procesul de

producere a unei copii de ADN de la o molecula de ARN este denumit reverstransciptie.

Aceasta se realizeaza cu ajutorul unei enzime transportate in virus, numita

reverstranscriptaza. Dupa aceasta copie ADN-ul este produs si este liber in nucleul

9

Figure 3: Replication of Herpes simplex virus

celulei gazda si trebuie sa fie incorporat in genomul celulei., proces efectuat de o alta

enzima numita integraza.

Acuma ca materialul genetic al virusului este incorporat si a devenit o parte din

materialul genetic al celulei gazda, puteam spune ca celula gazda este acum modificata si

contine o noua gena. Daca aceasta celula gazda se divide mai tarziu, descendentii acesteia

va contine toate genele noi. Uneori genele de retrovirus nu exprima imediat informatiile

lor.

Retrovirusurile sunt cele mai des utilizate in terapia genica pana in prezent si

avantajul lor este ca realizeaza transfectari stabile deoarece genomul virusului este

introdus in genomul celulei gazde. Dezavantajele sunt ca aceasta insertie se produce la

intamplare, si poate modifica genele intr-un mod daunator. Particula virusului este foarte

fragila ceea ce face ca manipularea si atingerea sa fie foarte dificila. In plus ei infecteaza

numai celulele care se divid.

10

Figure 4: Integration of retroviruses

Lentivirusurile sunt o subclasa de retrovirusuri care exprima un complex care

controleaza functii nucleare importante in celulele infectate. Lentivirusurile pot livra o

cantitate semnificativa de informatii genetice in ADN-ul celulei gazde, astfel incat ele

sunt una dintre cele mai eficiente metode vector de a transporta gene. Lentivirusurile sunt

capabile de replicare in celulele care nu se divid, rezultand o infectie care dureaza

intreaga viata a gazdei.

2.2. Sisteme nevirale sau sintetice

Vectorii sintetici depind de transferul direct a informatiei genetice in celula tinta,

si includ ADN plasmidic, ADN gol (naked ADN) sau ADN asociat cu un anumit sistem

de eliberare. Unele pot fi aplicate ca vaccinuri ADN.

Metodele nevirale permit anumite avantaje fata de metodele virale si anume

productia pe scara larga si imunogenitate scazuta din partea celulei gazda.

ADN plasmidic este un vector sintetic utilizat in terapia genica datorita

avantajelor pe care le ofera si anume capacitatea sa de a transporta o cantitate mare de

material genetic, absenta riscului de infectie sau mutageneza si productia la scara larga a

celulelor bacteriene.

Plasmida este un ADN circular, care se reproduce independent fata de

cromozomul celulei. Plasmida folosita in terapia genica ar trebui sa aiba urmatoarele

proprietati:

origine de replicare in bacterii, pentru a permite replicarea eficienta a

plasmidelor care ajung la sute de exemplare per celula;

o gena de selectie, care ofera, de obicei, rezistenta la un antibiotic, pentru

a permite selectarea clonelor care transporta plasmida;

un sit de donare multiplu, care poate fi scindat cu enzime de restrictie,

permitand insertia genei de interes;

un promotor viral care sa permita transcriptia genei de interes in celulele

eucariote;

Dupa ce gena de interes este clonata, aceasta este transferata la o bacteria gazda,

de obicei Escherichia coli, prin procesul de transformare bacteriana, pentru a produce

11

plasmide pe o scara larga si pentru a obtine o cantitate suficienta de ADN pentru utilizare

terapeutica.

ADN-ul plasmidic poate fi administrat la mai multe specii de animale, inclusiv la

om prin mai multe cai. In plus fata de injectarea intramusculara, aceasta poate fi

administrata oral, intranazal (ca un spray), sau printr-o cale intradermica prin

“bombardarea” cu microparticule din aur acoperite cu material genetic. Desi injectarea

intramusculara a plasmidei este o tehnica simpla si utilizata pe scara larga, exista unele

probleme, cum ar f prezenta enzimelor (nucleazelor) capabile sa degradeze ADN-ul

plasmidic facandu-l ineficient. O conditie prealabila pentru utilizarea ADN-ului ca vaccin

in terapia genica este ca acidul nucleic sa fie eliberat in mod eficient in celula tinta. O

estimare este ca numai una din fiecare 1000 de molecule plasmidice administrate este

capabila sa ajunga la nucelu si sa exprime mesajul pentru sinteza proteinei dorite, ceea ce

inseamna ca un tratament necesita de obicei administrarea de doze mari de ADN

plasmidial. Printre strategiile utilizate vom mentiona metoda biobalistica, lipozomi,

lipoplecsi si poliplecsi, in plus fata de utilizarea microparticulelor polimerice

biodegradabile.

Meoda biobalistica sau “gena arma” consta in transfectia celulelor individuale

folosind ADN absorbit pe particulele de aur. Pentru transfectie, particulele sunt plasate

intr-un dispozitiv cunoscut ca un “pistol gena”, care prin intermediul unui proces de

accelerae folosind evacuarea gazelor de heliu sub presiune ridicata, particulele ajung in

apiderma individului. Aceasta tehnica de introducere a unui vector, desi eficace pentru

multe procedurei, necesita un dispozitiv special pentru realizarea ei. Cu toate acestea

rezultatele studiilor clinice fiind promitatoare au motivat companiile sa investeasca in

imbunatatirea acestei tehnologii.

O alta alternativa pentru introducerea unui vector ADN plamidic, este de a folosi

lipozomi. Deoarece acestea sunt compuse din vezicule apoase inconjurate de un bistrat

fosfolipidic, lipozomi permit incapsularea si transportul numeroaselor substante atata

hidrofile cat si lipofile impreuna cu plasmida. Acestia permit, pentru a fi incorporate in

suprafata lor, si molecule cum ar fi anticorpi, proteine si zaharuri si le directioneaza la

anumite situri. Datorita versatilitatii structurale a acestor aceste sisteme, sansele ca

12

transfectarea sa se realizeze cat mai eficient pot creste, prin schimbarea compozitiei

lipidelor, care ar putea modifica dimensiunea veziculei.

Lipoplecsi si poliplecsi sunt complexe moleculare de ADN-cationici, formate prin

interactiunea cu lipide respectiv polimeri, a ADN-ului. Proprietatea principala a acestor

complexe este de a permite trecerea mai usoara a ADN-ului prin membrana celulelor

plasmatice, prin doua mecanisme: neutralizarea ADN-ului si condensarea plasmidei , care

reduce dimensiunea sa. Odata aflate in interiorul celulei, complexele care contin ADN

sunt eliberate din vezicula endocitotica si sunt raspnadite prin citosol deplasandu-se spre

nucleu. Cea mai comuna utilizare a lipoplecsilor a fost in transferul de gene in celule

canceroase, unde genele furnizate au activat genele supresoare tumorale de control din

celula si au redus activitatea oncogenelor. Studii recente au aratat ca lipoplecsii sunt utili

in transfectia celulelor epiteliale respiratorii, astfel incat acestia pot fi utilizati pentru

tratarea bolilor respiratorii genetice cum ar fi fibroza chistica.

ADN gol (naked ADN) este cea mai simpla metoda de transfectie nevirala.

Studiile clinice efectuate asupra injectarii musculare a unui ADN plasmidic gol, s-au

produs cu un oarecare succes, cu toate acestea, expresia a fost foarte scazuta in

comparatie cu alte metode de transfectie. In plus fata de studiile cu plasmide, au fost

realizate experimente si cu PCR gol, care au avut succes similar sau mai mare. Dar acest

succes nu se compara cu al altor metode ceea ce duce la cercetarea unor metode mai

eficiente de livrare a ADN-ului gol, cum ar fi utilizarea unui “pistol gena”.

13

Capitolul 3: Siguranta terapiei genice

Terapia genica este intr-o continua cercetare pentru a determina daca aceasta ar

putea fi utiliza pentru tratarea bolilor dar si pentru a evalua cat de sigura este pentru

sanatatea omului. Mai multe studii au aratata deja ca aceasta abordare poate avea riscuri

pentru sanatate foarte grave cum ar fi toxicitate, inflamatie, cancer si pentru ca aceste

tehnici sunt relativ noi, la unele dintre ele riscurile pot fi imprevizibile.

Legile federale, regulamentele si directivele ajuta la protejarea oamenilor care

pariticpa la studiile de cercetare. US Food and Drug Administration (FDA)

reglementeaza toate produsele de terapie genica in Statele Unite si supravegheaza acest

domeniu de cercetare. Cercetatorii care doresc sa realizeze un studiu clinic trebuie sa

obtina mai intai permisiunea FDA. FDA are autoritatea de a respinge sau de a suspenda

studiile clinice care sunt suspectate ca fiind nesigure pentru pacienti.

National Institutes of Health (NIH) joaca deasemenea un rol important in

asigurarea sigurantei de cercetare in terapia genica. NIH ofera linii directoare, pentru

anchetatori si institutii (cum ar fi universitati sau spitale), de urmat in realizarea studiilor

cu terapia genica. Aceste linii directoare de stat primesc finantare de la NIH pentru

realizarea acetor cercetari si trebuie sa fie inregistrate la NIH Office of Biotechnology

Activities. Protocolul sau planul pentru fiecare studiu clinic este apoi realizat de catre

NIH Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) pentru a stabili daca aceste

cercetari ridica probleme medicale, etice, sau de siguranta pentu om.

In ciuda tuturor acestor probleme legate de siguranta terapiei genice, inca se fac

eforturi in cercetare pentru a elimina problemele existente. Aceste eforturi au atins

punctul culminant pentru aprobarea primului produs de terapie genica, care se bazeaza pe

un vector adenoviral. Este Gendicine1, un medicament produs de o companie chineza,

Shenzhen Sibiono GeneTech. Acest medicament este destinat pentru cap si tratarea

carcinomului gatului si a fost aprobat pentru comercializare in anul 2003 de catre agentia

de reglementare din China (China’s State Food and Drug Administration- SFDA).

Adenovirusul recombinant sub forma de particule de 90 nm, contine gena p53 pentru

suprimarea tumorii. Gena p53 sufera mutatii in aproximativ 50-70% din tumorile umane.

Genele mutante nu sunt neaparat inactive dar pot avea functii oncogenice si pot contribui

la geneza tumorii. Introducerea exogena a genei p53 si exprimarea ulterioara a proteinei

14

p53 duce la controlul si eliminarea tumorii. Un efect sinergic poate fi deasemenea

obtinut, prin asocierea terapiei genice cu radioterapia si chimioterapia.

Colectarea de date toxicologice este impotanta pentru a permite clarificarea

nivelului de risc la diferite clase de vectori virali. Aprobarea primului medicament

destinat pentru terapia genetica, deschide noi perspective obtinerea acestor date esentiale,

atat de necesare si valoroase pentru agentiile de reglementare. Disponibilitatea tot mai

mare de noi date, vor constitui baza de orientare pentru producerea, comercializarea,

realizarea studiilor clinice si siguranta acestor produse.

Cunoașterea detaliată a genomului uman, oferă un instrument de dezvoltare rapida

si obiectiva pentru terapia genica. Un mare impact este de asteptat in domeniul asistentei

medicale umane cu aceste cunostinte noi, creand asteptari mari in ceea ce priveste geneza

de noi produse destinate pentru tratamentul bolilor infectioase si a tumorilor, care nu au

tratamente alternative.

15

CONCLUZII

1. Terapia genica este utilizata pentru a corecta defecte genice care pot determina aparitia unor boli, si consta in blocarea unei gene activate nedorite, corectarea sau inlocuirea genei defecte cu o gena normala.

2. Sistemele utilizate pentru transferarea genelor la om sunt de doua feluri: sisteme virale (virusi) si nevirale (sintetice).

3. Terapia genica este intr-o continua cercetare pentru a determina daca aceasta ar putea fi utiliza pentru tratarea bolilor dar si pentru a evalua cat de sigura este pentru sanatatea omului.

4. Terapia genica se afla inca in fazele incipiente, va provoca un impact mare asupra sanatatii umane in urmatoarele cateva decenii, mai mult, o scara mai mare de biomanufacture de produse pentru uz clinic si de tehnologii pentru culturi de celule animale, va fi un pas important in aplicarea terapiei genice.

16

BIBLIOGRAFIE

1. Leda R. Castilho, Angela Maria Moraes, Elisabeth F.P. Augusto, Michael

Butler, 2008, Animal Cell Technology: From Biopharmaceuticals to Gene

Therapy.

2. National Institutes of Health, Department of Health & Human Services,

May 15, 2009, Handbook .

3. Tudose Cristian, Maniu Marilena, Maniu Calina, Genetica umana,

Editura Corson Iasi, 2000.

4. http://www.genetherapynet.com

17