1

TEMA 2: BIOTEHNOLOGIA OBINERII PREPARATELOR

ENZIMATICE

2.1. Aspecte generale

Enzimele sunt din punct de vedere

structural proteine constituite din aminoacizi,

iar din punct de vedere funcional acioneaz

ca nite biocatalizatori biologici care au rolul

de a permite realizarea unor reacii cu o vitez

mrit.

Enzimele sunt utilizate drept catalizatori n

condiiile n care exist i catalizatori chimici,

deoarece prezint urmtoarele avantaje:

1. Au capacitatea de a cataliza reaciile

chimice n condiii blnde de temperatur, pH,

presiune. Aceasta permite un consum mai redus

de energie i nu necesit echipamente scumpe

rezistente la coroziune.

2. Enzimele sunt catalizatori specifici,

deseori stereoselective, care nu conduc la

obinerea de produi de reacie secundari

nedorii. n aceste condiii nu sunt necesare

cheltuieli mari privind rafinarea i purificarea

produsului ce urmeaz a fi fabricat.

3. Comparativ cu procesele chimice,

enzimele sunt din punctul de vedere al mediului

compui biodegradabili care nu necesit costuri

semnificative de epurare.

4. Anumite enzime nu sunt limitate numai

la aciunea n mediul apos, putnd aciona i la

interfaa dintre dou faze, ap: solvent organic

sau ap:ulei etc.

Totui exist i o serie de dezavantaje:

au stabilitate limitat;

de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singur dat.

Clasificarea enzimelor. Enzimele se

clasific conform sistemului stabilit de Comisia

de Enzime a Uniunii Internaionale de

Biochimie (1979). Conform acestei clasificri

exist 6 clase principale grupate conform cu

reaciile pe care le catalizeaz astfel:

1. Oxidoreductaze care catalizeaz reacii de oxidoreducere, transfer de atomi de

hidrogen, oxigen sau electroni;

2. Transferaze care catalizeaz transferul unei grupri de pe o molecul pe alta;

3. Hidrolaze ce catalizeaz scindarea hidrolitic (implic apa) a legturilor chimice

covalente;

4. Liaze, care catalizeaz scindarea legrutilor chimice altfel dect prin hidroliz

sau oxidare;

5. Izomeraze ce catalizeaz rearanjarea structural a moleculelor;

6. Ligaze sau sintetaze care catalizeaz formarea de noi legturi te tip C-N, C-O, C-

C, C-S, cu consumare de ATP.

2.2. Utilizri ale enzimelor n industrie:

Principalele domenii n care enzimele i-au

gsit utilizri sunt:

- fabricarea unor produse prin transformarea enzimatic a amidonului;

- la fabricarea altor produse alimentare : produse lactate, bere, sucuri, vin,

panificaie;

- n compoziia detergenilor; - industria textil, hrtiei i a furajelor

pentru animale;

- sinteza catalitic a unor substane chimice;

- analiza alimentelor, diagnoz chimic i terapie;

- inginerie genetic. Biotehnologia preparatelor enzimatice este

un domeniu de baz al biotehnologiei, avnd

drept scop studierea tehnicilor de obinere a

preparatelor enzimatice folosind materii prime

de origine animal, vegetal i microbian, sub

form liber sau imobilizat pentru a fi folosite

ca ageni biologici n industria alimentar,

industria furajelor, industria textil,

detergenilor, farmaceutic, cosmetic,

chimic, etc. Prin utilizarea preparatelor

enzimatice, tehnologiile tradiionale se

transform n biotehnologii, devenind mai

eficiente i mai puin poluante.

n figura 2.1 este prezentat ponderea de

utilizarea a preparatelor enzimatice n diferite

ramuri.

Aa cum se observ din datele de mai sus,

cea mai mare pondere o are utilizarea n

industria alimentar, urmat de industria

detergenilor.

n figura 2.2 sunt prezentate principalele

tipuri de preparate enzimatice produse pe plan

2

mondial. Cea mai mare pondere o au

preparatele de proteaze urmate de amilaze.

Figura 2.1. Poderea utilizrii preparatelor

enzimatice

Figura 2.2. Principalele tipuri de preparate

enzimatice.

2.3. Tipuri de preparate enzimatice.

Preparatele enzimatice se comercializeaz

sub diverse forme i grade de purificare:

Preparate enzimatice solide:

1. Preparate enzimatice brute, sub form

de pulbere, obinute prin uscarea i mcinarea

mediului fermentat;

2. Preparate sub form cristalizat, enzime

pure utilizate preponderent n chimia analitic

i ingineria genetic;

3. Preparate liofilizate, care sunt enzime

purificate n amestec cu substane

crioprotectoare, care sunt urcate n vacum la

temperaturi de -20......-50C.

Preparate enzimatice lichide

1. Preparate enzimatice brute, form sub

care se livreaz enzimele extracelulare

(eliberate de ctre microorganisme n mediul de

cultur n timpul fermentaiei).

2. Preparate parial purificate, n care se

adaug conservani pentru a le mri stabilitatea

n timp.

In tabelul de mai jos sunt prezentate

principalele tipuri de preparate enzimatice,

sursele din care se obin i aplicaile n industria

alimentar.

2.4. Surse de enzime

Preparatele fabricate la scar industrial

folosesc trei tipuri de surse: esuturi animale i

vegetale sau microorganisme.

Sursele animale sunt reprezentate de

subprodusele din industria crnii (ficat,

pancreas, inim, rinichi, creier, mucoas

stomacal i intestinal). Utilizarea acestr surse

este pe scar din ce n ce mai redus, fiind

nlocuite de sursele microbiene, deoarece

sursele animate prezint o serie de dezavantaje,

cum ar fi: producia limitat, apariia unor boli

cum ar fi encefalopatia spongiform la bovine.

Principalele enzime de origine animal care

se obin sub form de preparate sunt chimozin

(renina) care se extrage din stomacul de miel

sau viei care se utilizeaz pentru coagularea

laptelui la fabricarea brnzeturilor. O alt

enzim este -amilaza pancreatic care are

utilizri n industria farmaceutic.

Sursele vegetale sunt reprezentate de

semine(germinate sau negerminate), rdcini,

fructe, sev, latexuri, frunze. Utilizarea surselor

vegetale pentru obinerea preparatelor

enzimatice ridic o serie de probleme, cum ar

fi: prezena unor substane potenial duntoare

sntii omului (ex. Compuii fenolici) sau a

unor compui toxici de comtaminare. Aceste

dezavantaje face ca sursele de origine vegetal

s fie destul de puin utilizate. Principalele

enzime obinute din surse vegetale sunt.

- papaina, proteaz obinut din latexul

fructelor de Caryca Papaia. Enzima este

utilizat pentru tenderiyarea crnii sau n

industria berii;

- ficina, proteaz obinut din latexul

fructului de smochin (Ficus carica), utilizat

pentru degradarea proteinelor miofibrilare.

- bromelina, proteaz obinut din sucul de

ananas ( Ananas comosus ), folosit pentru

hidroliya proteinelor colagenice.

Alte enzime de origine vegetal sunt

lipoxigenaza din soia i complexul enzimatic

din mal ( amilaze, proteaze, glucanaze).

Preparatele enzimatice ale acestor enzime nu

sunt purificate, fiind sub form de fin de soia

sau de mal.

Microorganismele reprezint principala

surs pentru obinerea de preparate enzimatice.

Amidon; 30

Detergenti; 35

Produse lactate;

5

Distilate; 5

Bere; 4

Sucuri, vinuri; 10

Morarit,

panificatie; 5

Alte domenii; 6

Proteaze de

coagulare; 5

Amilaze bcteriene;

10

Amilaze fungice;

18

Glucozizomeraze;

14Alte enzime; 4

Pectinaze; 10

Proteaze fungice;

4

Proteaze

bacteriene; 35

3

Avantajele utilizrii microorganimelor constau

n:

- microorganismele se pot obine n cantiti

mari (biomas) prin cultivare n instalaii

speciale pe medii de cultur ieftine (tr de

gru, extract de porumb, melas, roturi de soia

sau floarea soarelui, zer),

- ciclul de dezvoltare al microorganismelor

este foarte scurt fa de cel al plantelor sau

animalelor;

- producia de enzime de ctre

microorganisme poate fi mrit prin selectarea

i utilizarea de tulpini mutante, nalt

performante (productive) i prin stabilirea

condiiilor optime fizice i chimice pentru

producerea de enzime;

- proprietile enzimelor i specificitatea de

aciune difer cu natura microorganismelor

productoare, astfel industrial se pot obine

preparate care corespund ntocmai scopului

dorit.

- preparatele enzimatice obinute pot avea

activiti diferite cu predominana unei

activiti.

2.5. Tehnologii de obinere a

preparatelor enzimatice

Schema tehnologic general de obinere a

preparatelor enzimatice este prezentat n

figura Tehnologia de obinere a preparatelor

enzimatice implic operaiile indicate n

schema prezentat n fig. 1.4. din care rezult

ca preparatele enzimatice pot fi obinute sub

form de:

- preparate enzimatice brute-uscate;

- preparate enzimatice brute lichide

concentrate;

- preparate enzimatice purificate

concentrate, respectiv i uscate.

Procesele biotehnologice de obinere a

preparatelor microbiene sunt complexe,

realizarea lor presupune parcurgerea a trei

etape:

1. Pregtirea mediului de cultur, prin

prelucrarea mecanic i fizico chimic a

materiilor prime ce intr n compoziia

mediului de cultur (fermentativ). Aceast

etap presupune operaii de dozare, mrunire,

solubilizare, sterilizare etc.

2 Etapa biologic care const n obinerea

culturilor starter intermediare i a culturii de

producie, urmat de etapa fermentativ

prorpiu-zis.

3. Etapa de separare, purificare i

standardizare a enzimelor.

A. Pregtirea mediului de cultur Materii prime utilizate pentru fabricarea

mediilor de cultur.

Materiile prime trebuie s asigure

principalii nutrieni microorganismelor n

vederea dezvoltrii lor n timpul fermentaiei.

Surse de carbon. Principala surs de

carbon (surs de energie) pentru

microorganisme o constituie glucidele, sub

form de glucoz, fructoz, galactoz care sunt

uor asimilabile, n timp ce maltoz, zaharoza

i lactoza sunt asimilate doar dac

microorganismele posed enzime capabile s le

transforme n monoglucide. Poliglucidele pot fi

utilizate doar de ctre microorganismele apte s

sitetizeze enzimele care s le hidrolizeze

extracelular n monoglucide capabili s

difuzeze prin membrana celular.

Ca surse de carbon n reetele mediilor

industriale se folosesc urmatoarele:

- Melasele care provin de la rafinarea

zahrului.

- Extractul de porumb, este reprezentat de

extractul obinut din industria amidonului dup

ce sufer o concentrare pn la 50% S.U.

- Leiile sulfitice provin din industria hrtiei

ca urmate a transformrii masei lemnoase n

pulp celulozic sub aciunea bisulfitului de

calciu.

Surse de azot. Azotul din mediul de cultur

are rol anabolic, participnd la biosinteza

proteinelor structurale, a enzimelor i acizilor

nucleici.

Principalele surse de azot sunt:

- azot anorganic: amoniac, sruri de

amoniu, sulfatul de amoniu, forfatul acid de

diamoniu,

- azot organic: hidrolizate proteice de

cazein, soia, carne etc.

Surse de ioni anorganici. Pentru

dezvoltarea microorganimelor n timpul

procesului de fermentaie este necesar

prezena ionilor anorganici, acetia reprezint

circa 8% din substana urcat a a celulelor

microbiene. Principalii ioni anorganici care

trebuie s fie prezeni n mediul de cultur sunt:

macronutrienii (azot, fosfor, sulf, potasiu, i

4

magneziu) i micronutrienii (sodiu, calciu,

clor, fier, cobalt, zinc, molibden, cupru,

mangan, nichel i seleniu).

Surse de factori de cretere. Factorii de

cretere sunt compui organici a cror prezen

n mediul de cultur este necesar n cantiti

mici, avnd un rol catalitic sau structural

pentru microorganisme. Factorii de cretere

includ vitaminele, purine, pirimidine,

nucleotide i nucleozide, aminoacizi, acizi

grai, steroli i poliamide.

Principalele vitamine necesare ca factori de

cretere sunt: biotina, acid pantotenic, acidul

nicotinic, tiamina.

Tratementul termic al mediilor de cultur.

Pentru buna desfurare a procesului de

fermentaie este necesar cultivarea

microorgnimelor pe un mediu de cultur steril

pentru a preveni contaminarea. Sterilizarea

mediului de cultur se poate realiza direct n

bioreatorul n care se realizeaz fermentaia sau

ntr-un vas sub presiune separat, ulterior fiind

transferat n bioreactor.

B. Etapa biologic. Obinerea culturilor starter de producie

Pentru producerea enzimelor, fermentaiile

industriale se desfoar n volume de 150

250 de mc de mediu, motiv pentru care trebuie

pregtit o cantitate suficient de inocul.

Cultura folosit drept inocul trebuie s fie n

faza exponenial de cretere. La

microorganismele care au vitez de cretere

redus, se recomand s se foloseasc o

cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce

durata iniieirii fermentaiei. Cultura starter de

producie trebuie s conin celule active,

adaptate la mediul industrial pentru ca

fermentaia s se declaneze rapid. n cazul

fermentaiilor desfurate pe mediul solid,

pentru care se utilizeaz inocule sporifere se

recomand s se asigure prin inoculare

concentraii de 105-106 spori pe g mediu, iar n

cazul celor submerse cultura starter de

producie s fie de circa 10% din mediul de

cultur.

5

6

7

Figura 2.3. Schema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimatice

8

Figura 2.4. Schema bloc pe operaii de obinere a preparatelor enzimatice microbiene brute

2.6. Tehnici de fermentaie

Pentru producia de preparate enzimatice de

origine microbian se poate aplica dou tehnici

de baz :

Fermentaia de suprafa n care se

utilizeaz un mediu solid pe care se cultiv

microorganismul (de regul un mucegai

filamentos). Aceast tehnic are avantajul c

mediul de cultur va deveni un mediu bogat

n activitate enzimatic ;

Fermentaia de submers, n care mediul

este lichid ce se afl ntr-un reactor unde toi

parametrii fermentaiei sunt perfect controlai.

Aceast ultim tehnic este superioar primei

metode din punct de vedere tehnologic i

biochimic.

Dintre speciile de microorganisme ce se

folosesc menionm urmtoarele : Aspergillus

niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei,

Saccharomyces cerevisiae, Endothia parasitica,

Penicillium emersonii, Kluyveromyces lactis,

Bacillus amylolichefaciens, Bacillus

licheniformis, Bacillus stearothermophilus,

Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola.

9

La sfritul fermentaiei microorganismul

trebuie distrus cu condiia pstrrii intacte a

activitii enzimatice.

Microorganismele cultivate pot produce

enzime extracelular sau intracelular. n funcie de

tipul acestora variaz i procedeul de extracie. n

ceea ce privete tipurile de culturi submerse,

ne putem situa n unul din urmtoarele cazuri:

Procedeul nealimentat, n care caz toate

ingredientele mediului de fermentare sunt

pregtite n fermentator la pH-ul i temperatura

dorit nainte de a introduce inoculum. Dup

introducerea inoculum, fermentaia principal

ncepe i finalizarea ei se urmrete prin

prelevarea de probe, n mod steril, care arat :

- creterea microorganismelor (biomas,

vscozitatea mediului) ;

- concentraia n enzim (activitatea

enzimatic a mediului) ;

- consumul de glucide ;

- nivelul de proteine.

La procedeul nealimentat se pot monta

diferii senzori care arat :

- pH-ul care se poate regla prin adaus de

baze sau acid ;

- temperatura care se poate regla prin

debitul de circulaie al apei reci n mantaua

fermentatorului sau n serpentina din interiorul

fermentatorului ;

- nivelul de spum care se poate combate

cu un antispumant aflat ntr-un rezervor ataat

fermentatorului;

- presiunea care se regleaz prin supape

care se deschid la presiuni de 1 pn la 3 bar;

- coeficientul respirator QR care se

msoar prin cantitatea de CO2 produs fa

de cantitatea de oxigen consumat ;

- nivelul de oxigen consumat, pornind de la

analiza efluenilor.

Procedeul alimentat, n care se ncepe cu un

volum de 10 30% de substrat n care se

introduce inoculum, dup care fermentatorul se

alimenteaz cu restul de mediu, dup care

oprirea fermentaiei se face dup un anumit

timp fixat experimental. Acest procedeu se

aplic n cazul n care sinteza enzimelor ar fi

reprimat de concentraiile ridicate ntr-unul din

nutrienii mediului de cultur sau n cazul cnd

creterea microorganismelor, n funcie de

concentraia n unul din componenii mediului,

ar provoca creterea vscozitii, care trebuie s

fie reglat n timp. Alimentarea fermentatorului

poate fi repetat de mai multe ori efectundu-

se sutiraje (evacuri) programate, dar ntotdeauna

30%, care servete n acest caz drept cultur

de producie.

Procedeul continuu necesit alimentarea

continu a fermentatorului cu mediu i folosirea

unei culturi concentrate de microorganisme. n

acest caz, bioreactorul (fermentatorul) de

dezvoltare a celulelor este cuplat cu o unitate

de micro sau ultrafiltrare. n figura 1.9. se arat

schia unei astfel de instalaii format dintr-un

bioreactor cuplat cu o unitate de ultrafiltrare la

care exist i posibilitatea de a recicla biomasa.

Figura 2.5. Procedeul continuu

Avantajele unui astfel de procedeu sunt

urmtoarele:

-se poate detoxifica mediul de cultur prin

eliminarea produsului de inhibare ;

-celulele reciclate devin perfuzate ;

-cantitatea de mediu de cultur care se

introduce n bioreactor este controlat de

cantitatea de permeat care traverseaz

membrana de ultrafiltrare ;

-celulele au posibilitatea de a se dezvolta

pn la concentraii relativ mari ( 300 g

substan uscat/l, n cazul drojdiilor) ;

-aceste concentraii mari de celule se

constituie ca o barier eficace fa de

contaminarea exterioar ;

-retenatul poate fi evacuat i el periodic,

fiind constituit din biomas care conine

enzime intracelulare, dup care este trecut la

prelucrare ulterioar (extracie) ;

-permeatul de la ultrafiltrare, care conine

enzime nu mai are celule microbiene i poate

fi, deci, stocat sau dirijat direct la o operaie n

aval de purificare sau concentrare.

10

Figura 2.6. Cultivarea submers a microorganismelor.

Neajunsurile acestui procedeu de obinere a

biomasei i enzimelor sunt urmtoarele :

-membranele trebuie s fie rezistente la

sterilizarea cu vapori de ap i la igienizare cu

substane chimice ;

-costurile energetice sunt destul de ridicate;

11

-mediul de cultur poate fi colmatant pentru

membrana de ultrafiltrare;

-chiar la densiti mari de celule, la sfritul

ciclului de dezvoltare este posibil o oarecare

liz a celulelor, ceea ce face necesar o purjare

a bioreactorului prin unitatea de ultrafiltrare, fapt

care conduce la micorarea vrstei medii a

celulelor care rmn n sistem.

O variant a procedeului continuu de obinere

a biomasei/ enzimelor const n folosirea

bioreactorului cu membran.

C. Etapa de separare a enzimelor Extracia. La procedeul discontinuu

(nealimentat) i cel alimentat, dup terminarea

fermentaiei se separ partea solid insolubil

(celule i produse insolubile) de partea lichid

care conine enzimele, separare care se poate face

prin centrifugare, filtrare frontal sau microfiltrare.

Soluia steril obinut este apoi ultrafiltrat

pentru a concentra enzimele. n cazul n care

enzimele sunt destinate a intra n compoziia unui

preparat comercial lichid, ultrafiltratul se

stabilizeaz cu polioli (sorbitol, glicerol) i/sau

sruri (NaCl, MgSO4), respectiv se adaug

bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat,

ascorbat).

n cazul n care enzima (enzimele) intr n

compoziia unui preparat comercial pulbere,

ultrafiltratul se suplimenteaz cu un suport i se

usuc prin atomizare (suplimentarea se face cu

amidon, dextrine). nainte de atomizare mai poate

fi realizat o filtrare steril.

Pentru a obine i enzimele intracelulare,

biomasa din fermentator, separat de partea

lichid, este supus lizei. Liza poate fi realizat

chiar de enzimele proprii microorganismelor ce

alctuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate

exogene, cum ar fi lizozimul din albuul de ou,

preparate enzimatice exogene complexe de natur

bacterian care conin chitinaz, mananaz, -1,6

glucanaz, proteaze, cteodat n combinaie cu

adaosul de metabisulfit.

n cazul n care enzima este periplasmic, un

oc osmotic este suficient pentru a elibera

enzimele. Se poate realiza i o liz mecanic

(folosire de presiuni mari de 600 1000 bar,

urmat de detenta brutal) Se pot folosi i

ultrasunetele cu frecvene mai mari de 20 MHz

pentru liza celulelor i deci pentru eliberarea

enzimelor intracelulare. Odat eliberate, enzimele

intracelulare sunt supuse operaiilor aplicate i

enzimelor extracelulare.

Preparatele enzimatice se comercializeaz de

regul sub form de pulbere, de microgranule,

precum i sub form lichid.

Preparatele enzimatice sub form de pulbere

sunt formulate cu un suport cum ar fi amidonul,

maltodextrinele, zahrul, sarea. La aceste preparate

se controleaz granulometria, umiditatea ( 6%).

Suportul trebuie s nu fie higroscopic pentru a

se evita formarea de cocoloae. n preparatele

comerciale pulbere sau lichide, coninutul de

enzim este redus raportat la suport i de aceea

cantitatea de preparat comercial este mult mai

mare, n comparaie cu nivelul de enzim

coninut.

n ceea ce privete preparatele comerciale

microgranulate, acestea se obin dintr-un

ultrafiltrat care se amestec cu un suport (sare,

amidon solubil, maltodextrine etc.). Cantitatea de

substrat este astfel calculat nct s se obin

titrul enzimatic dorit n microgranule. Amestecul

respectiv este pulverizat mpreun cu un agent

liant care reprezint 0,1% pn la 0,5% fa de

masa suportului. Picturile pulverizate sunt uscate

ntr-un turn de uscare, cu aer la 70 - 90C.

Preparatele comerciale lichide sunt formulate

n general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se

utilizeaz n proporie de 20 50% fa de

preparatul lichid. La aceste formulri se adaog

o substan bacteriostatic (de exemplu benzoat

de sodiu n proporie de 0,1 0,2%).