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ASIGNATURA: Biotecnología alimentaria

BLOQUE II. BIOTECNOLOGÍA GENÉTICA: CONCEPTOS BÁSICOS RELACIONADOS CON EL ANÁLISIS Y LA MODIFICACIÓN DEL DNA

TEMA 2. Tecnología del DNA recombinante y técnicas de análisis el DNA

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE1973 - Berg, Boyer y Cohen – Primeros experimentos de DNA recombinantecon los que introducen Genes en E.coli

Unión artificial de DNA de distintos orígenes

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Ha hecho posible….

Aislamiento y secuenciación de genes y secuencias de DNA

Establecimiento de genotecas y elaboración de mapas genéticos

Modificación de genes y reintroducción en organismos: transgénicos

Clonación de DNA y sus posteriores aplicaciones

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

Producción de proteínas recombinantes

HERRAMIENTAS BÁSICAS NECESARIAS PARA EL CONOCIMIENTO Y MODIFICACIÓN DEL DNA

EXTRACCIÓN DEL DNA

DIGESTIÓN DEL DNA CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

VECTORES DE CLONACIÓN

GENOTECAS

IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS

PCR

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EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

- DNA cromosómico, DNA plasmídico. RNA- A partir de virus, bacterias, células vegetales, células animales…

ETAPAS BÁSICAS

1.- Ruptura de las células- Ultrasonidos- Choque térmico- Degradación enzimática (proteinasa K)- Detergentes (SDS)

2.- Eliminación de otros componentes( lípidos, proteínas, polisacáridos)

- Centrifugación- Tratamiento con proteasas- Mezcla con disolventes orgánicos y centrifugación

- fenol, cloroformo y eter

3.- Precipitación con alcoholes y sales- Centrifugación , secado y resuspensión en agua

Fase acuosa: ácidos nucleicos

Interfase: proteínas, polisacáridos

Fase orgánica(fenol, cloroformo): lípidos

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN…FINALES DE LOS 60

¿Cómo era posible que algunas bacterias resistiesen la invasión de ciertos virus?

El DNA del virus se introduce en la bacteria, donde se corta en pequeños fragmentos inactivándose

Demostraron que las bacterias sintetizaban endonucleasasque cortaban el ADN en una secuencia corta y específica

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- Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural

- Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena

- Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8

- Reconocen secuencias palindrómicas y el ccorte es simetrico

- Isoesquizomeros: existen enzimas que reconocen la misma secuencis pero con distinta forma de corte.

Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilusinfluenzae

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

AAGCTTTTCGAA

PUEDEN CORTAR DE DOS FORMAS:

EXTREMOS COHESIVOS

EXTREMOS ROMOS

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ALGUNOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE LOS MILES (>3000) QUE SE HAN AISLADO..

Extremos romos

NOMENCLATURA: 1 letra del Genero, 2 letras de la especie, 1 letra de la cepa (Opcional) y 1 numero romano ( si existen mas de una)

ALU I – primera enzima de restricción de Arthrobacter Luteus

VECTORES DE CLONACIÓN

Características generales:

- Replicación autónoma- Mapa de restricción conocido: un único punto de corte- Tengan marcadores selectivos:

- resistencia a antibióticos- cambios de color

- De fácil recuperación

TIPOS:- Plásmidos- Fago λ- Cósmidos- YACs- BACs

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PLÁSMIDOS

-ADN doble y circular -Replicación autónoma; información no vital-Pueden conferir resistencia a antibioticos-Posibilidad de integración en cromosoma

principal bacteriano → EPISOMA-Tamaño variable: 1 a 500Kb

FAGO λ

DNA doble hélice lineal con ~ 48.000 pb

infecta E. coli

extremos cohesivos (COS): extremos 5’ monocatenarios (12 nucleótidos de secuencia complemenaria)

lisis bacteria ciclo lisogénico

EXTREMOS COS

Clonación de fragmentos de

hasta 25 kb

Clonación de fragmentos de

hasta 10 kb

Cósmidos Vectores híbridos Fago λ + plásmido

Clonación de fragmentos de

hasta 45 kb

Sitio cos:Señales de

empaquetamiento

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• Factor F de Bacterias:– plásmido con replicación

autónoma, que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana

Resistencia antibióticos

Clonación de fragmentos de hasta 300 kb

BACs (Bacterial Artificial Chromosomes)

YACs (Yeast Artificial Chromosomes)

Clonación de fragmentos de hasta 1000 kb

Utilizacion: Clonación de genes es decir obtener copias del mismo

PRIMER PASO: cortar DNA que se quiere clonar y el vector que se va a utilizar con enzimas de restricciónGEN PLÁSMIDO

SEGUNDO PASO: LIGACIÓN. Mediante un enzima denominado ligasa se unen el vector y el fragmento de DNA

+ MOLÉCULA DE DNARECOMBINANTE

TERCER PASO: Introducción de la molécula de DNA recombinante en las células procariotas o eucariotas correspondientes para la obtención de numerosas copias

(otro tipo de vector)

Procariotas: transformación, conjugación

Eucariotas: Electroporacion microinyección, vectores virales, proyectiles de DNA

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CONSTRUCCIÓN DE GENOTECAS

- Clonación de todas las secuencias del genoma de una especie

- Presente al menos una copia de cada gen o fragmento de DNA

- Numero de clones necesarios depende de- Tamaño del inserto- Tamaño del genoma

Fórmula de Clarke y Carbon N= ln (1 - p)

ln (1 - f )

N= nº de clones necesariosP= probabilidad de tener el genoma completoF= tamaño medio del inserto/ tamaño genoma

Ejemplo -E.coli-Tamaño: 4.300 KbP= 0,95

1300 plásmidos300 cósmidos130 BACs12 YACs

IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICASPARA PODER AISLAR Y TRABAJAR CON LAS SECUENCIAS CLONADAS… TODOS LOS

MÉTODOS SE BASAN EN LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NÚCLEICOS

Southern blotting

- Digestión del DNA con enzimas de restricción- Separación mediante electroforesis- Transferencia del los fragmentos del gel a un soporte sólido (blotting)- Hibridación del DNA transferido al filtro con una sonda marcada (radiactividad, fluorescencia..)- Detección de los fragmentos hibridados (dependiendo del tipo de marcaje de la sonda )

SONDA: Fragmento de DNA que hibridará por comlelmentariedad

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1º PASO

2º PASO

3º PASO

4º PASO

5º PASO

SOUTHERN BLOTTING

OTROS TIPOS DE HIBRIDACIÓN PARA AISLAMIENTO DE SECUENCIAS

NORTHERN BLOT Similar a Southern blot pero para identificación de secuencias de RNA

SLOT/DOT BLOT. No se realiza electroforesis, simplemente se deposita y se transfiere a soporte sólido

HIBRIDACION IN SITU. Hibridación en preparaciones histológicas o células en cultivo

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PCR ¿Qué es?

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Técnica que nos permite amplificar o clonar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta

obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación

FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO”

FOTOCOPIADORA MOLECULAR

HASTA AHORA HEMOS HABLADO DE CLONAR DNA… existe otra forma de “clonación de DNA”

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¿Cuáles son los fundamentos?

EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasa realiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde

DNA Polimerasa

3’ 5’

dNTPs dTTPdATPdGTPdCTP

+ Mg ++

5’ 3’

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EXTENSION DEL CEBADOR

DNA Polimerasa

3’ 5’

DNA polimerasa

5’ 3’

Utilizando dos cebadores que son complementarios a los extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que queremos amplificar

¿Qué necesitamos?

DNA molde

Tampón de la reacción(tris,BSA, K…) Nucleotidos

(dNTPs, A, C, G y T)

Cebadores

DNA polimerasa

Mg++

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. Primer express•PrimerGen searches strings of amino acid residues in order to reverse-translate oligonucletide primers of a desired range of lengths and maximum number of degeneracies. •Primer (Stanford) Sun Sparcstations only •Primer (Whitehead) Unix, Vms (and DOS and Mac if you can compile it) •Amplify, Bill Engels (Macintosh only), is for use in designing, analyzing, and simulating experiments involving the polymerase chainreaction (PCR). You can obtain your copy of Amplify here•PrimerDesign 1.04, a DOS-program to choose primer for PCR or oligonucleotide probes. See also the PrimerDesign Welcome Page. •PC-Rare, a new software by R. Griffais, which uses a rare octamer at the 3' termini of the primer. This powerful (but user friendly) software is available for Macintosh and Windows environment. •Primer Design, a Java applet by Luca Ida Giovanni TOLDO. •CODEHOP, PCR primers designed from protein multiple sequence alignments (Local mirror site at WIS). •Primer3, an online service to pick PCR primers from nucleotide sequence. (Local mirror site at WIS). .NetPrimer (PREMIER Biosoft International). NetPrimer combines the latest primer design

algorithms with a web-based interface allowing the user to analyze primers over the internet

Programas de ordenadorELECCIÓN DE PRIMERS

ELECCIÓN DE LOS CEBADORES

Evitar G y C en el extremo 3’

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DNA polimerasas

Termoestables: Tª óptima de actuación de 72-74ºC- Taq DNA polimerasa- Tth polimerasa

Termolábiles: Tª óptima de actuación de 42ºC- DNA polimerasa I de E. Coli- Fragmento Klenow de DNA polimerasa- T4 DNA polimerasa

REPETICIÓN “n” VECES DE UN CICLO CONSTITUIDO POR TRES ETAPAS

DESNATURALIZACIÓN

HIBRIDACIÓN DE LOS CEBADORES

EXTENSIÓN

Ciclo

1

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“n CICLOS”: ciclo 3

“n CICLOS”: ciclo 4

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“n CICLOS”: ciclo 5

Después de:- 2 ciclos tenemos 2 x 2 - 3 ciclos - 2 x 2 x 2 - 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2N.

La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la del ciclo

anterior.

Pero la reacción no puede mantenerse indefinidamente, se alcanza una fase de meseta, según lo demostrado en las cifras que aparecen en rojo.

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No se puede detectar la amplificación hasta el ciclo 25

Se observa una fase lineal a partir del 25

Al final existe una fase de meseta que se representa en rojo

Representación gráfica de la amplificación por PCR

Si representamos los valores en una escala logarítmica, podemos ver las diferencias en ciclos anteriores.

Esto es porque la amplificación de PCR es una reacción exponencial.

Existe una relación directa entre el número de copias (cantidad de DNA) y el ciclo de amplificación

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MARCADORES MOLECULARES

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA

Test de paternidad

Autentificación de productos

TrazabilidadDiagnóstico de patologías

Patógenos

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Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones.

•Mezcla de cromosomas de origen paterno y materno en cada generación en las especies de reproducción sexual.

• Recombinación genética que permite el intercambio de fragmentos de cromosomas homólogos en la meiosis.

•Mutaciones que suponen cambios de bases o bien adición o pérdida de algunas de ellas.

¿CÓMO SE GENERA ESTA GRAN VARIACIÓN GENÉTICA?

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA: Bases moleculares

Causar patologías Generar variabilidad

DETECCIÓN DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA

Análisis de marcadores moleculares a nivel del DNA

• RFLPs : Polimorfismos tamaño de los fragmentos de restricción

• Microsatélites: repeticiones de un pequeño número de bases

• RAPDs : Random amplified polymorphic DNA

• SNPs . Single nucleotide polymorphisms

• …

Para su detección : amplificación por PCR

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MARCADORES GENÉTICOS APLICADOS A LA IDENTIFICACIÓN

Un marcador de ADN, para ser utilizable en identificación genética, necesita reunir una serie de características:

• Que sea muy polimórfico, • Que esté distribuido por todo el genoma. • Que tenga un bajo coste tanto en la obtención como en la aplicación• Que sea público .• Que sea fácilmente interpretable de una forma objetiva.• Que requiera poca cantidad y calidad de muestra a partir de la que se obtendrá el ADN.• Que sea fácilmente intercambiable entre laboratorios• Que sea automatizable para aumentar el rendimiento y abaratar los costes.• Que sea estable

RFLPs : Polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción

• Detectables por PCR

• Bialélicos

• Muy abundantes

• Ampliamente distribuidos por el genoma

• Codominancia

• Alta reproducibilidad

Origen: mutacionesdeleccionesinserccionesreordenaciones

CARACTERÍSTICAS

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CC TT CTAmpl.+

_

199 pb165 pb

34 pb

+

_

1 2 3 4 5 6 7 8

Ejemplo RFLP

Secuencias del genoma que consisten en repeticiones de 1 a 6 pb.

MICROSATÉLITES

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- Su polimorfismo radica en el número de repeticiones

- Herencia mendeliana codominante

- Altamente polimórficos ( nº medio de alelos 10)

- Se han encontrado en todas las especies conocidas

- Muy numerosos y bien distribuidos por el genoma

MICROSATÉLITES - Características -

TGLA227 TGLA126 ETH225 BM2113 TGLA122 BM1824 INRA23 ETH10SPS115

• Fácilmente automatizable

• No requiere grandes cantidades de DNA

• Posibilidad de hacer multiplex : amplificar varios micros a la vez

TGLA 122

TGLA 126

TGLA 227

TGLA227 TGLA126 ETH225 BM2113 TGLA122 BM1824 INRA23 ETH10 SPS115

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RAPDs (Random ampliflied polymorphic DNA)

• Se utilizan primers diseñados al azar. • Generalmente de pequeño tamaño (10-12 nucleótidos)• No es necesario el conocimiento previo de la secuencia

Ventajas

El mayor inconveniente puede ser su baja reproducibilidad

SNPs (single nucleotide polymorphisms)

Son mutaciones, debidas a la variación de un nucleótido.

A C CA AG

cerdo 1AA

cerdo 2TT

A C CT AG

cerdo 3AT

A C CA AG

A C CA AG

A C CT AG A C CT AG

C/C

C/T

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SNPs Características

• Variación muy frecuente (1 cada 1000bp)

• Dos posibles alternativas en cada individuo

• Herencia muy estable ( t. mutación 10-6)

• Fácil estandarización

• Posibilidad de automatización