1. 2 clonación de fragmentos de dna 3 minipreps preparación de plásmido por lisis alcalina...
TRANSCRIPT
1
2
Clonación de fragmentos de DNA
3
MiniprepsPreparación de plásmido por lisis alcalina
Disolución P1•Tris 50 mM pH 8.0•EDTA 10 mM
+ RNasa 0.1 mg/ml
Disolución P2•NaOH 0.2 N•SDS 1%
Disolución P3•Acetato potásico 3M•Áciso acético 11%
Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic acids research 7(6):1513-1522
Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for the isolation of plasmid DNA. Methods in Enzymology 100:243-256
4
Endonucleasas de restricción
5
6
7
Reacción catalizada por la DNA Ligasa
Lehninger. Principios de Bioquímica
8
La defosforilación con fosfatasa alcalina evita el religado del vector
9
La Fosforilación con polinucleótido quinasa facilita la ligación de fragmentos de DNA
10
Síntesis en fase sólida de una cadena de DNA por el método del triéster fosfito
(Dimetoxitritilo)
(-cianoetil)
Finalmente se añade NH3 para eliminar los grupos protectores y liberar el oligonucleótido del soporte sólido
SÍNTESIS QUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS
11
PUNTOS CLAVE DE UNA DNA POLIMERASA
• Fidelidad. La mantiene en dos etapas:
– Sólo forma enlace fosfodiéster si el nucleótido entrante está correctamente empareado con el molde (error 10-4).
– Si el emparejamiento ha sido incorrecto y aun así se ha formado enlace, lo hidroliza con su actividad 3’ exonucleasa (error final 10-6)
• Eficiencia catalítica.
– Depende fundamentalmente de la procesividad (1minuto asociación-reasociación enzima-DNA; 1milisegundo adición de cada nucleótido)
12
COMPARACIÓN DE LAS DNA POLIMERASAS I, II Y III DE E. Coli
Lehninger. Principios de Bioquímica
13
Secuenciación de DNAMétodo de Sanger automatizado
Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´Oligo: 5´--C T T A A
- DNA polimerasa- Nucleótidos dATP, dCTP, dGTP, dTTP-Terminadores fluorescentes ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP
5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´
5´--C T T A A G C G A T T A C -3´
5´--C T T A A G C G A T T A -3´
5´--C T T A A G C G A T T -3´
5´--C T T A A G C G A T -3´
5´--C T T A A G C G A -3´
5´--C T T A A G C G -3´
5´--C T T A A G C -3´
5´--C T T A A G -3´
Detector de fluorescencialáser
Separación de los
fragmentos de DNA
marcados, mediante
electroforesis capilar
-
+
G C G A T T A C G . . .
14
1 tggtcttcagATGTCTGATTCGCTAAATCA 150 accagaagtcTACAGACTAAGCGATTTAGT
31 TCCATCGAGTTCTACGGTGCATGCAGATGA 120 AGGTAGCTCAAGATGCCACGTACGTCTACT
61 TGGATTCGAGCCACCAACATCTCCGGAAGA 90 ACCTAAGCTCGGTGGTTGTAGAGGCCTTCT
91 CAACAACAAAAAACCGTCTTTAGAACAAAT 60 GTTGTTGTTTTTTGGCAGAAATCTTGTTTA
121 TAAACAGGAAAGAGAAGCGTTGTTTACGGg 30 ATTTGTCCTTTCTCTTCGCAACAAATGCCc
15
Marcaje de sondas de DNA“Random primer”
5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´
5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´
3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´
DNA polimerasadATP, dGTP, dTTP, 32P-dCTPOligonucleótidos aleatorios
TAAAGC-5´
5´-GCGCCC 5´-TGGCACCGCATTTCGGA-3´GGTATTCGTAGT
3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCG
16
Sistemas de expresión bacterianos
17
Sistemas de expresión bacterianos basados en la RNA polimerasa de T7
18
19
Sistemas de expresión bacterianos: precipitación de proteínas recombinantes
20
Sistemas de expresión bacterianos: “refolding” de proteínas recombinantes
21
Utilización de transcriptasa reversa para obtener cDNA
IVIII V VI VIIIVII II I exonesDNA
Pre- mRNA
mRNA maduro AAAA
Transcripción
Maduración
TTTTAAAA
Transcripción reversa
cDNA
22
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
• Eliminación en la mayoría de los casos de la formilmetionina en procariotas y de la metionina iniciadora en eucariotas en el extremo N-t.
• Fosforilación de ciertos residuos de Ser, Thr y Tyr en algunas proteínas.
23
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
• Unión de grupos lipídicos (isoprenilación, palmitoilación, miristoilación)
24
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
• Glicosilación (adición de glúcidos) de residuos de Asn mediante enlaces N-glicosídicos o de residuos de Ser o Thr mediante enlaces O-glicosídicos.
• Formación de puentes disulfuro.
• Modificación proteolítica. Algunas proteínas, como la insulina, la tripsina, la quimotripsina, se sintetizan como precursores inactivos, y han de ser procesadas proteolíticamente para dar sus formas activas, más pequeñas.
25
Envío de proteínas al Retículo Endoplásmico
26
Sistemas de expresión en células animales
27
Introducción de DNA en células animales
• Carácter transitorio. El DNA sólo es introducido en parte de las células del cultivo. No se aplica selección. El cultivo se recoge y analiza al cabo de unos pocos días.
• Carácter estable. El vector debe contener un marcador (p.ej. un gen de resistencia a un antibiótico) que permita seleccionar las células en las que se ha introducido el DNA e integrado en el genoma. Se pueden aislar clones individuales o trabajar con toda la población.
28
Introducción de DNA en células animales
• Transfección.• Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI)
• Fosfato cálcico
• Lípidos catiónicos
• Transducción.
• Partículas virales. Retrovirus
• Microinyección
• Electroporación.
29
Introducción de DNA en células animales• Transfección.• Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI), FuGENE
• Fosfato cálcico• Lípidos catiónicos (Lipofectamina)
30
Introducción de DNA en células animales
• Electroporación.
31
Introducción de DNA en células animales• Transfección transitoria: éxito parcial
32
Introducción de DNA en células animales
• Transducción
Célula empaquetadora
Célula diana
33
Introducción de DNA en células animales
• Transducción
34
Sistemas de expresión inducibles
Transgénicos induciblesTransgénicos inducibles
collagen II tTA
Collagenase 3TRE
doxicyclin
35
collagen II tTA
Collagenase-3TRE
doxicyclin
Transgénicos induciblesTransgénicos inducibles
36