DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE

� DNA ricombinante e sue applicazioni

� Tecniche del DNA ricombinante

� Inserzione di un gene in un plasmide

� Progetto Genoma Umano

� Biotecnologie e loro applicazioni

� Organismi transgenici

� Clonazione nei mammiferi

� Ingegneria genetica in campo medico

� Link a: cDNA, enzimi di restrizione e plasmidi

INDICE

� Il DNA ricombinante è un frammento di DNA che può essere modificato e inserito in altre cellule per essere copiato più volte (amplificato) ed espresso

� Il DNA ricombinante è ottenuto dalla combinazione di materiale genetico di diversa origine

DNA ricombinante

Applicazioni

� ottenere frammenti specifici di DNA in grandi quantità

� studiare la sequenza di determinati frammenti genici

� identificare particolari sequenze in un cromosoma

� studiare le modalità di espressione e regolazione genica

� creare piante o animali transgenici

� diagnosticare e curare malattie genetiche

Il DNA ricombinante viene utilizzato per:

Tecniche del DNA ricombinante

↓Tecniche del DNA ricombinante

ibridazione

libreria genomica

sequenziamento

clonazione PCR

↓ ↓↓ ↓

� Nel 1973, con il primo esperimento di clonazione di un segmento genico inserito nel batterio Escherichia coli, Stanley Cohen e Herbert Boyedimostrarono che è possibile produrre copie multiple di un determinato gene

Clonazione genica

� La clonazione molecolare serve a produrre grandi quantità di una specifica sequenza di DNA. La capacità di generare un numero quasi infinito di copie (cloni) di una particolare sequenza è alla base delle tecnologie ricombinanti del DNA

Le basi per la clonazione

� un frammento di DNA, che può essere ricavato anche da un mRNA(in questo caso viene detto cDNA)

� specifici enzimi di restrizione che servono a “tagliare” il DNA

� particolari enzimi in grado di unire le estremità di nucleotidi (DNA-ligasi)

� i plasmidi, vettori in grado di inserirsi nelle cellule ospiti

� cellule batteriche modificate in modo da rendere la loro membrana permeabile al plasmide

I materiali necessari per il processo di clonazione sono:

Inserzione di un gene in un plasmide

Se trattiamo un frammento di DNA e un plasmide (anello di DNA) con lo stesso enzima di restrizione, il frammento può integrarsi nelplasmide, dato che le loro estremità sono complementari

L’enzima DNA-ligasiunisce e richiude le estremità di DNA

Clonazione di un DNA esogeno

Nel 1973 Cohen e Boyercombinano due sequenze diverse di DNA per produrre una nuova molecola di DNA ricombinante.

L’esperimento di Cohen e Boyer

Libreria genomica

Una popolazione di cellule batteriche che porta vettori ricombinanti con frammenti diversi provenienti dallo stesso campione di DNA è detta libreria genomica

Le colonie sono formate da cloni contenenti frammenti diversi del DNA originario

PCR: reazione a catena della polimerasi

La PCR è una tecnica che permette di ottenere grandi quantità di un determinato segmento genico grazie a cicli successivi di duplicazione

Campionedi DNA

Applicazioni della PCR

L’elettroforesi su gel

Ogni individuo possiede la sua impronta genetica:frammentando il DNA e analizzandolo su gel di elettroforesi, ognuno di noi può essere identificato da una specifica combinazione di polimorfismi della lunghezza dei frammenti di DNA (RFLP).

L’impronta genetica

Nel 1983 Kary Mullis vince il premio Nobel per aver sviluppato la tecnica della PCR.

La reazione a catena della polimerasi

Sequenziamento del DNA

È possibile determinare la sequenza nucleotidica di un segmento di DNA tramite il metodo di Sanger, che permette di sequenziare al massimo 700 coppie di basi; per porzioni più lunghe il DNA viene tagliato in frammenti più piccoli, che sono poi analizzati separatamente

Il DNA viene tagliato con due enzimi di restrizione

diversi. I frammenti ottenuti sono sequenziati e

sovrapposti in modo da determinare l’intera sequenza

nucleotidica; questo metodo è oggi interamente

automatizzato

Progetto Genoma Umano

� Frammentando il DNA con enzimi di restrizione si ottengono segmenti che possono essere separati (tramite elettroforesi), clonati, sequenziati e conservati in banche dati informatizzate

� Nel 2000, grazie alla collaborazione fra scienziati di varie discipline scientifiche (soprattutto biologia e informatica), si è concluso il Progetto Genoma Umano che ha permesso di mappare l’intero genoma dell’uomo

il corredo cromosomico aploide di un essere umano, che comprende oltre 3 miliardi di nucleotidi.

Il Progetto Genoma Umano

Il sequenziamento del DNA

Sequenziare il DNA significa determinare l’ordine dei nucleotidi nella molecola d’interesse.

Come si fa a sequenziare il DNA?

La genomica studia la struttura del genoma, le informazioni in esso contenute, il modo in cui le sue parti interagiscono e la sua evoluzione.

Si parla di genomica funzionale e comparata.

La genomica

Ibridazione

� L’ibridazione è una tecnica utilizzata per localizzare un segmento di DNA in un cromosoma e si basa sull’utilizzo di una sonda marcata di DNA complementare alla sequenza nucleotidica cercata

� La sonda può essere marcata con radioisotopi o con un colorante fluorescente; se la sonda incontra molecole di DNA complementari, si appaia a esse, evidenziandole

Biotecnologie

applicazioni

ambientaleagroalimentare farmacologico

↓ ↓

Le biotecnologie prevedono l’utilizzo di organismi modificati per migliorare le condizioni di vita umana

L’uso delle biotecnologie trova applicazioni in vari ambiti:

↓

Applicazioni agroalimentari

Le piante GM (geneticamente modificate) presentano uno o più geni modificati, con lo scopo di conferire loro particolari caratteristiche o farle diventare resistenti a determinate malattie

Le fragole GM risultano piùresistenti al

freddo

In Italia le leggi vigenti non consentono di coltivare gli OGM su larga scala

I pomodori GM risultano piùresistenti a un virus

Applicazioni ambientali

Si possono utilizzare microrganismi modificati geneticamente per degradare sostanze tossiche di rifiuto, come metalli, idrocarburi, pesticidi, diserbanti

In laboratorio sono stati ottenuti batteri contenenti plasmidi artificiali in grado di ossidare idrocarburi più velocemente dei batteri naturaliQuesto batterio (Sulfolobus acidicaldarious) appartiene a

una delle specie più spesso usate nella biorimediazione, in quanto permette il passaggio in soluzione di elementi metallici

Applicazioni farmacologiche:sintesi della somatostatina

� I batteri possono essere utilizzati per produrre grosse quantità di proteine

� La prima proteina di sintesi biotecnologica è stata la somatostatina (ormone della crescita), costituita da 14 amminoacidi

� Il sequenziamento dei 600 nucleotidi che codificano per la somatostatina ha permesso di sintetizzare un gene artificiale, che è stato poi fatto esprimere

Altre applicazioni farmacologiche

Tra le sostanze che possono essere sintetizzate mediante i processi biotecnologici ci sono:

� l’insulina, un ormone che controlla il livello glicemico nel sangue, è somministrata ai soggetti diabetici che presentano alterazione delle cellule pancreatiche

� l’eritropoietina, una proteina che stimola la formazione dei globuli rossi, viene somministrata ai soggetti che non la producono a causa di problemi renali

Organismi transgenici

Gli organismi transgenici possiedono nel proprio genoma uno o più geni appartenenti a individui di un’altra specie

Si possono ottenere isolando il gene che si vuole trasferire e inserendolo, mediante microscopici aghi, in cellule uovo fecondate; queste verranno poi impiantate in un organismo che genereràindividui in grado di esprimere quel carattere

Clonazione nei mammiferi

La clonazione nei mammiferi consiste nel trasferimento del nucleo di una cellula somatica, prelevato da un organismo, in una cellula uovo non fecondata privata del materiale genetico proveniente da un altro organismo

La pecora Dolly è stato il primo organismo nato da un esperimento di clonazione nei mammiferi

Ingegneria genetica in medicina

Terapia genica: le tecniche di ingegneria genetica possono essere molto efficaci per curare alcune malattie dovute all’alterazione di un singolo gene, mediante la sostituzione di un gene malato con un gene sano. In questo campo ci sono ancora molti aspetti etici e tecnici irrisolti

Diagnosi delle malattie: sono oggi disponibili test per la diagnosi prenatale di molte malattie ereditarie che utilizzano enzimi di restrizione e sonde di acidi nucleici per rilevare la presenza di geni alterati. Due importanti test diagnostici prenatali riguardano l’anemia falciforme e la corea di Hungtinton

La clonazione consiste nella produzione in molte copie di una molecola di DNA ricombinante.

Per fare questo il DNA ricombinante deve essere inserito in cellule ospiti che vengono chiamate transgeniche.

Per riconoscere le cellule contenenti DNA ricombinante si possono usare geni reporter di cui si conosce il fenotipo, che servono dunque da marcatori genetici.

La clonazione

Il famoso caso di DollyStoria della scienza

Dopo aver clonato il DNA ricombinante nelle cellule transgeniche, queste colture cellulari diventano degli archivi (genoteche) di informazioni genetiche.

Le genoteche di frammenti di DNA

Gli mRNA trascritti da una cellula in un determinato momento (trascrittoma) si possono copiare in sequenze complementari di DNA (cDNA).Il cDNA è più stabile del filamento di mRNA e perciò viene utilizzato per creare biblioteche contenenti l’informazione sull’attività genica della cellula.

Le biblioteche di cDNA

I microarray a DNAPer saperne di più

cDNA

Il DNA da inserire può essere un frammento di varie dimensioni. Per ottenerlo, si può partire da un segmento di mRNA grazie all’intervento di un enzima, la trascrittasi inversa

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono particolari enzimi, identificati nei batteri, che riconoscono e tagliano le sequenze nucleotidiche in punti specifici. Possono effettuare due tipi di tagli:

� netticome l’enzima Hpa1

� sfalsaticome gli enzimi EcoR1 e Hind3, che tagliano in maniera asimmetrica, creando “estremità appiccicose”

Plasmidi

I plasmidi sono:

� molecole circolari di DNA che contengono alcuni geni (da uno a decine)

� presenti naturalmente nelle cellule batteriche, alle quali conferiscono caratteristiche peculiari

� utilizzati in natura dai batteri per favorire il trasferimento di informazioni da una cellula all’altra

� in grado di trasportare un frammento genetico da un organismo all’altro (vettori)

Membrana di cellule batteriche

Per favorire l’entrata del plasmide ricombinato nella cellula ospite, ènecessario modificare la membrana batterica in modo da renderla permeabile al plasmide. Il processo tramite il quale un frammento di DNA estraneo entra in una cellula batterica è detto trasformazione

Farmacogenetica e farmacogenomica

Farmacogenetica: è la disciplina che studia il ruolo delle variazioni interindividuali nella sequenza del DNA in relazione alla risposta o agli effetti avversi dei farmaci.

Farmacogenomica: branca della farmacogenetica, che descrive l’uso dell’informazione genetica (genotipo del paziente) nel guidare la scelta di terapie farmacologiche personalizzate in grado di ridurre, nel singolo paziente, i rischi ed aumentare l’efficacia terapeutica; studia, inoltre, l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici, avvalendosi delleconoscenze e delletecnologie derivate dallo studio del genoma.

Farmacogenetica e farmacogenomica

I farmaci agiscono interferendo con particolari molecole della cellula.

Si tratta spesso di proteine, la cui presenza è determinata dal patrimonio genetico ed è fondamentale per l’azione del farmaco. Se manca il gene che codifica per la proteina in un soggetto, questo non potràtrarre vantaggio dal farmaco.

La risposta individuale a un farmaco è influenzata da alcuni geni coinvolti nel metabolismo della molecola stessa. Alcune piccole variazioni su questi geni, denominate SNP (polimorfismi a singolo nucleotide) possono determinare una maggiore o minore capacità dell’organismo di assimilare i farmaci, influenzando così l’attività dei principi attivi.

SNP: Single Nucleotide Polymorphism

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp

SNP: Single Nucleotide Polymorphism

� All’interno di una popolazione è possibile determinare il rapporto tra la frequenza della variante più rara e quella più comune di un determinato SNP. Solitamente si guarda con maggiore attenzione a SNPs aventi frequenza allelica minore dell’1%

� Gli SNPs possono presentarsi all’interno della sequenza codificante di un gene. Essi all’interno di un gene,in ogni caso,non necessariamente modificano la sequenza amminoacidica codificata , dal momento che il codice genetico èdegenerato.

� Uno SNP che genera in tutte le sue forme lo stesso peptide è detto sinonimo (synonymous);

� in caso contrario è detto non sinonimo(non-synonymous).

� Gli SNPs che non si trova in sequenza codificante possono presentare sequenze negative sullo splicing o sul legame dei fattori di trascrizione.

� Essi costituiscono il 90% di tutte le variazioni genetiche umane.

� Lo studio degli SNP è molto utile poiché variazioni anche di singoli nucleotidi possono influenzare lo sviluppo delle patologie o la risposta ai patogeni, agli agenti chimici, ai farmaci.

� Gli SNPs possono avere una grande importanza nello sviluppo di nuovi farmaci e della diagnostica, in quanto, attraverso uno screening degli SNPs presenti nel gene responsabile della metabolizzazione del farmaco stesso, consentono di conoscere l’effetto che può avere un farmaco sull’individuo ancor prima della somministrazione. Dal momento che gli SNPs sono per lo più ereditati da generazione in generazione, essi vengono utilizzati in alcuni studi genetici.

Melanoma: la svolta è nella terapia personalizzata. I pazienti: “I nuovi trattamenti siano subito disponibili”

� Napoli, 10 febbraio 2012 – È necessario abbreviare i tempi: le terapie innovative per il trattamento del melanoma devono essereimmediatamente disponibili per i pazienti. Non si può ritardare ulteriormente l’accesso a queste armi efficaci nel combattere il tumore. La richiesta sarà presentata il prossimo aprile a Bruxelles al Parlamento europeo da una delegazione di pazienti, guidata dal napoletano Antonio Brancaccio della Fondazione Melanoma. Nel nostro Paese questa forma di cancro della pelle particolarmente aggressiva fa registrare ogni anno 7000 nuove diagnosi e 1500 decessi. “Oggi assistiamo a una svolta nel trattamento – spiega il prof. Paolo Ascierto, presidente della Fondazione Melanoma, dell’Unità di Oncologia Medica e Terapie Innovative dell’Istituto ‘Pascale’ di Napoli -. Nel 50% dei casi di melanoma è presente la mutazione di una proteina, il gene BRAF V600, che svolge un ruolo chiave nello sviluppo del tumore. (roche)

Dal sito internet della ROCHE� "E' un dato di fatto che per circa il 50% dei pazienti, i farmaci non sono

efficaci quanto dovrebbero - e in alcuni casi questa media è ancora più bassa.

� Per questo Roche è fortemente impegnata per promuovere la Medicina Personalizzata".

� Tumore al seno: misurando la presenza di un fattore di crescita (HER2) della patologia con test specifici, ad esempio quello fornito da Roche Tissue Diagnostics (Ventana), è possibile individuare quali pazienti rispondono meglio al farmaco Roche per il tumore della mammella, specifico per il trattamento dei tumori positivi a questo recettore.

� Tumore del colon-retto: il test K-RAS individua le mutazioni tumorali che indicano la prognosi della malattia nei pazienti con tumore colorettale. Alcuni farmaci utilizzati per il trattamento di questa e di altre forme tumorali sono adatti solo per i pazienti che non presentano mutazioni. Questo test consente ai medici di individuare i pazienti cui potrà essere somministrata una terapia antitumorale specifica sulla base dello stato delle mutazioni.

� HIV: test altamente specifici consentono ai medici di monitorare larisposta alla terapia durante il trattamento con un farmaco antiretrovirale, nonché l'evolvere della resistenza alla terapia e il relativo adeguamento. HCV: utilizzando test altamente sensibili, basati sulla tecnologia real-time PCR, che permettono di misurare i livelli di virulenza nel sangue, i medici possono "personalizzare" il regime terapeutico dei pazienti sulla base della loro risposta al trattamento.

� Osteoporosi: monitorando gli effetti della terapia antiriassorbimento tramite farmaci, i medici possono prescrivere ai pazienti trattamenti specifici a seconda delle loro esigenze particolari.

� Il test AmpliChip CYP450 analizza le variazioni in due geni essenziali per il metabolismo di molti farmaci ampiamente prescritti. È il primo prodotto farmacogenetico in commercio per la previsione della risposta ai farmaci da parte dei singoli soggetti.