DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONOUNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNALIGASI

CLONAGGIO-IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI

-IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICAOTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

Il clonaggio del DNA

• Clonaggio: viene generata una molecola di DNA ricombinante, cioe’ isolata dal suo contesto e introdotta in un replicone (una unita’ di DNA capace di replicarsi detto vettore).

• Questa molecola di DNA ricombinante viene introdotta in un sistema cellulare appropriato (in genere batteri derivati dall’ Escherichia coli).

• Tutti i discendenti di questa singola cellula, detta clone, conterranno la medesima molecola di DNA ricombinante originariamente isolata, permettendo di produrne quantita’ praticamente illimitate

Plasmidi

• Molecole extracromosomiali di DNA circolare, capaci di replicarsi e di segregare autonomamente rispetto al DNA cromosomale dei batteri. • Di solito sono portatori di geni che conferiscono ai batteri un vantaggio selettivo in particolari condizioni ambientali (resistenza agli antibiotici, ad es.)

• Possono ospitare DNA estraneo (a condizione che non sia troppo grande)

• Possono essere facilmente purificati dal DNA cromosomale in grande quantità.

Plasmidi

Plasmidi: Superavvolgimento

M

1

2

3

4

5

6

789

10

Non

dig

erit

o

Dig

erit

o

Enzimi di restrizioneEnzimi di restrizioneIl DNA digerito con gli enzimi di restrizione può essere analizzato mediante elettroforesi

Plasmide (P)

DNA genomico (G) 3x 109 basi

Eco RI (E)

Eco RI

M

1

2

3

4

5

6

789

10

Bam HI (B)

P P+B P+E G+E

10 kb

+

-

MAPPATURA ENZIMATICA DI UN TRATTO DI DNA

6.6 bp

PstI PstIHindIII HindIII

1.1 kb 0.6 kb 2.3 kb 1.2 kb 1.4 kb

PstI HindIIIM

1

2

3

4

+0,5

PstI+HindIII

1.1

1.4

4.1 -

1.7

2.32.6

1.1

0.6

2.3

1.41.2

Le DNA ligasi sono enzimi capaci di legare covalentemente due molecole di DNA adiacenti

con estremità libere

DNA RICOMBINANTE: due tratti di DNA che in natura non sonoadiacenti, vengono uniti in provetta.

Le proprietà degli enzimi di restrizione sono state essenziali per la tecnica del DNA ricombinante.

I due tratti da unire vengono tagliati con uno stesso enzima di restrizione.

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

EcoRI

G AATTCCTTAA G

G AATTCCTTAA G

G CTTAA

AATTC G

GAATTCCTTAAG

Le estremità coesive prodotte da uno stesso enzima possono appaiarsi.

GAATTCCTTAAG

5’

3’ 5’3’

DNA LIGASI ATP

5’

3’

GCTTAA

OH

P

AATTC G

OH

P

5’3’

G AATTCCTTAA G

5’

3’

OH P

OHP

G AATTCCTTAA G

OH

OH

P

P

5’

3’ 5’3’

Infine la DNA ligasi viene utilizzata per legare covalentemente le due molecole di DNA

Solo estremità compatibili possono essere legate efficientemente

INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

CLONAGGIO:

- LIGASI

- TRASFORMAZIONE

- SELEZIONE

- CRESCITA COLONIE

IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA

BATTERICA DI INTERESSE

Cosa può succedere in una reazione ligasica ?

1. Il vettore si richiude su se stesso senza legarsi con l’inserto

2. Il vettore si lega con l’inserto

L’enzima beta-galattosidasi può essere utilizzato per discriminare le colonie che contengono un plasmide con inserto

da quelle che contengono un plasmide senza inserto

ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA’ TRONCHE (BLUNT)

ESTREMITA’ BLUNT POSSONO ESSERE LEGATE A ESTREMITA’ BLUNT PRODOTTEDA QUALSIASI ALTRO ENZIMA, NON CI SONO LE LIMITAZIONI IMPOSTE DALLACOMPLEMENTARIETA’ DELLE BASI DELLE CODINE APPICCICOSE.

SVANTAGGIO: LIGASI DI ESTREMITA’ BLUNT E’ MENO EFFICIENTE PECHE’ NONSI HA APPAIAMENTO TRA CODINE A SINGOLO FILAMENTO.

CCC/GGGGGG/CCC

GAT/ATCCTA/TAG

SmaI EcoRV

CCCGGG

ATCTAG

LA SEQUENZA IBRIDA CHE SI FORMA NON E’ RICONOSCIUTA DA NESSUNO DEIDUE ENZIMI.

QUANDO E’ NECESSARIO UNIRE DUE ESTREMITA’ INCOMPATIBILI????

E’ POSSIBILE CONVERTIRE LE ESTREMITA’ STICKY IN ESTREMITA’ BLUNT

Estremita’ 5’ protruding:

5’3’5’

3’

L’estremità 3’ del filamento viene utilizzata come innesco dalla DNA POLIMERASI.Si utilizza il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli (DNA POLIMERERASI intera ha azione 5’esonucleasica).

Estremità 5’ o 3’ protruding:

5’3’5’

3’

Si utilizza la nucleasi S1: nucleasi che funziona su singolo filamento.

Il fago lambda come vettore di clonaggio

Il ciclo vitale del fago lambda

Placche di lisi

Lisogenia

Lisogenia

Ricombinazione sito-specifica

Ricombinazione omologa

INFEZIONE

Produzione di enzimiPer la sintesi del DNA

Inizia la replicazione

Produzione di testee code del fago

packaging

lisi

FASE PRECOCE

FASE TARDIVA

Ciclo litico

Un interruttore complesso

Replicazione ‘rolling circle’

COS Genoma COS Genoma COS Genoma COS

Packaging

Il fago lambda come vettore

• VETTORI PLASMIDICI -> 0-10 kb

• VETTORI di inserzione -> 0-10 kb• VETTORI di sostituzione -> 9-23 kb• VETTORI COSMIDICI -> 30-44 kb

• VETTORI PAC (crom. artif. P1) -> 130-150 kb• VETTORI BAC (crom. artif. batt.)-> fino a 300 kb

• VETTORI YAC (crom. artif.lievito)-> 0.2-2 Mb

Dimensione degli inserti contenuti nei principali vettori

Cosmidi

P1

YAC