técnicas moleculares i “tecnología del adn”. estructura y características de los ácidos...
TRANSCRIPT
Técnicas moleculares I“Tecnología del ADN”
Estructura y características de los ácidos nucleicos
mRNA
Propiedades físico-químicas de los AN
Temperatura de melting
Procariotas vs Eucariotas
Genoma de un mamífera3 Gb
Genoma de E.coli1,2 Mb
Tecnología del ADN recombinante
Clivaje del ADN en sitios específicos mediante endonucleasas de restricción, que facilitan el aislamiento y manipulación de genes.
Hibridización de AN que hace posible detectar secuencias específicas de ADN y ARN.
Clonado de ADN usando tanto vectores de clonado como la técnica de PCR
Secuenciación de los nucleótidos que componen un determinado fragmento de ADN
Monitoreo de la expresión de genes en una célula mediante microarrays
Enzimas como herramientas de la tecnología del ADN
Clivaje de secuencias específicas del ADN: Enzimas de restricción
En general reconocen secuencias palindrómicas
Extremos romos
Extremos cohesivos
5’ extendido
3’ extendido
Técnicas electroforéticas: separación, purificación e identificación de AN
Permiten separar lasmoléculas de AN portamaño.
Geles de: Agarosa
Poliacrilamida
Clivaje y purificación de secuencias específicas de ADN
MAPA DE RESTRICCION PURIFICACIÓN DEL ADN
Marcaje de fragmentos de ADN: ADN polimerasa y Polinucleótido quinasa
Oligonucleótidos: son fragmentos cortos de AN de simple cadena, cuyasecuencia es conocida y se encuentra marcado para su posterior seguimiento
Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Southern blot
Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Northern blot
Ejemplos de Southern blot y Northern blot
Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda
Calle 1-9: muestras a chequearCalle L: ladder, patrón de tamañoCalle 10: control positivo
Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda
Calle M: ladder, patrón de tamaño
Detección de secuencias de AN específicas: Hibridización in situ
Clonado de ADN: Enzima ADN ligasa y vectores de clonado
Componentes mínimos:
1- Origen de replicación2- Gen marcador de selección3- Sitios de restricción “polylinker”
Vectores de clonado: Plásmidos
Estructura CCC y su tamaño es de 3-10 kb y aceptan insertos de hasta 10 kb
Otros tipos de vectores
Fagos: 50 kb y aceptan 15 kb
Cósmidos: híbrido plásmido y fago L(30-40 kb)
Fásmidos: híbrido plásmido y fago M3
Cromosomas artificiales: BACs, PACs y YACs (100-500 kb)
Transferencia de la químera de ADN a la célula huesped
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Ciclos:
Desnaturalización(92-95 ºC)
Hibridación(35-60 ºC)
Polimerización(72 ºC)
http://www.dnalc.org/resources/3d/19-polymerase-chain-reaction.html
PCR : incorporación de secuencias de restricción
EJEMPLO: Objetivo comparar genomas y aislar gen X del jerbo.
Aislar ADN genómico de ambos animales e identificar y comparar gen X en ambas especies
Calle L: Ladder patrón de tamañoCalle 5, 7 y 9: controles negativoCalle 6: ADN del jerbo digerido con ER1Calle 8: ADN del ratón digerido con ER1Calle 10: gen X de ratón
Southern blot
Gen x jerbo
ER1 ER2ER2
ER3ER3
L 3 1 2
purificación
del gen
Gen x jerboPCRER3
ER3
Digerir con ER3 plásmido y fragmento de PCR
ER1
ER2
ER3
+ gen X + ADN ligasa
Transformar bacterias
Ligación
Chequeo de colonias
Extracción de ADN plasmídico:
TECNICA DE MINIPREP
Introducción a los TP 1 y 2
Extracción de ADN plasmídico a partir de bacteriasMiniprep- Hidrólisis alcalina
Cuantificación y análisis de pureza
Chequeo del extracto mediante electroforesis en gel de agarosa
TP nº 1: Extracción y cuantificación de DNA plasmidico