Técnicas:

ELISA y Western Blot

Aspectos prácticos…

Prof. Diana Ortiz

Cátedra Inmunología

EJMV-UCV

dprincz@gmail.com

Técnica de ELISA

Fundamento:

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: Ensayo por Inmunoadsorción

Ligado a Enzimas.

Inmunoensayo: detección Antígeno – Anticuerpo unido a una

enzima y cuantificado por espectofotometría

Ventajas:

Es una prueba de alta

sensibilidad y especificidad.

Es cuantitativa.

Es relativamente

económica.

Se pueden procesar hasta

96 muestras por placa.

Reactivos de gran

estabilidad.

Limitaciones:

Positividad Vs. Infección

activa: depende del tipo de

anticuerpo evaluado. A

menos que se evalúe

presencia de antígenos en la

muestra problema.

Dificultad de detección de

Acs en pacientes con alguna

inmunodeficiencia, en período

de ventana o infectados por

cepas desconocidas.

Técnica de ELISA

Tipos de ELISA:

Técnica de ELISA

Fases:

1. Unión del antígeno o anticuerpo primario a los pocillos de la

placa (soporte sólido (polímero): poliestireno, polivinilo)

2. Lavado

3. Bloqueo

4. Muestra (antígeno o anticuerpo)

5. Lavado

6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima

(sensibilidad)

7. Lavado

8. Sustrato de la enzima

9. Cuantificación (lector de ELISA)

Técnica de ELISA

Técnica de ELISA

Aspectos a considerar:

Adecuado uso de controles positivos y negativos

(control de calidad).

Adecuado diseño de la técnica (Ag-Ac, Enzima

sustrato).

Concentración/ dilución de antígenos y anticuerpos.

Reactivos en buen estado.

Cuidado de la cadena de frío.

Técnica de ELISA

Evaluación de anticuerpos ELISA

Estuches comerciales:

Detección de

anticuerpos

IgM, IgG, IgE,

IgA.

Kit Pyloriset EIA-G

(Orion Diagnostic):

Títulos ≥ 20 positivos

1.- IgA secretora anti H. pylori en saliva: (ELISA)

Sensibilización: 2,5µg/pozo Ag Hp toda la noche a 4°C o 2h a 37°C

Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween

Bloqueo: PBS-BSA 1% x 2h a 37°C

Muestras de saliva 1/10 x 1h a 37°C

Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween

Anticuerpo secundario conjugado: con peroxidasa 1/1000 x 1h a 37°C

Revelado: OPD (o-phenylenediamine) + Peróxido de hidrógeno

Se detiene la reacción con H2SO4

Valores: UDO > 0,300 positivos

(Ortiz y col., 2000)

2.- IgA secretora total en saliva: (ELISA)

Monoclonal IgA (Sigma) (Ortiz y col., 2000)

Técnica de ELISA

Elisa estandarizada en laboratorio

Técnica de ELISA

Enzimas más utilizadas:

Peroxidasa

Fosfatasa alcalina β-galactosidasa

Tetra-metil-benzidina

Interpretación de resultados:

Técnica de ELISA

¿Qué es un valor cut off?

Títulos de anticuerpos

Valores reportados en

unidades de Densidad óptica

Algunas Aplicaciones de la ELISA

Determinación de hormonas: progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, HGC, etc.

Proteínas

Agentes infecciosos (virales, bacterianos, parásitos, hongos)

Marcadores de drogas

Control de calidad de vacunas

Screening de recién nacido

Investigación clínica

Anticuerpos: Acs antinucleares

Antígenos tumorales: alfa-feto-proteína, Ag prostático, carcinoembrionario, etc.

Autoanticuerpos

Técnica de ELISA

Elispot

Mide el número de células productoras de anticuerpos. El

antígeno se une al fondo de un pocillo, se añaden las células

productoras de anticuerpos en un medio semisólido y los

anticuerpos que se han secretado y unido se detectan

mediante un anticuerpo anti-Ig ligado a una enzima como en

un ELISA.

Una variante de la ELISA

Inmunohistoquímica

Western Blot

Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica

altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas

en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos

celulares o de tejidos.

Etapas:

1. Preparación de la muestra

2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de

poliacrilamida)

3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa )

4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de

anticuerpos primarios o secundarios apropiados.

Western Blot

Preparación del gel de

poliacrilamida SDS-PAGE

y corrida electroforética.

Western Blot

Tinción del gel con azul de Coomassie

Western Blot

Transferencia Se transfieren las bandas de

proteínas o desde el gel hacia

una membrana de

nitrocelulosa (flechas azules).

Western Blot

Western Blot

Western Blot

Revelado

Western Blot

Western Blot

Wang, Mol Vis 2012; 18:1115-1122.

http://www.molvis.org/molvis/v18/a118

CORTES X, GARCIA Z, TORRES L, TAYLOR L. Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivos

por anticuerpos contra los virus linfotrópicos de células T tipo I/II (HTLV I/II) en donantes de sangre en

Costa Rica. Rev. costarric. cienc. méd [online]. 2007, vol.28, n.1-2 [cited 2017-02-15], pp. 11-20 .

Western Blot

Western blot

Western blot

Aplicaciones:

Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la

biología molecular

Permite identificar antígenos inmuno-dominates para vacunas.

Estudiar perfil de citocinas.

Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra.

Factores de crecimiento

Niveles de fosforilación, modificaciones post traduccionales, etc

Diagnóstico:

Prueba confirmatoria de VIH

Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente

llamada“enfermedaddelasvacaslocas”

Enfermedad de Lyme.

Western Blot

ELISA Vs. Western Blot…

Ensayo de unión a múltiples antígenos: MABA

Péptidos 20g/ml diluidos en buffer carbonato pH 9.6 (1 h)

Bloqueo: leche descremada al 5% en PBST pH 7.2 (2 h)

Muestras: Suero 1/100 en PBST (1 ½ h) Saliva 1/10

Anti IgG o IgA peroxidasa 1/30.000 , 1/6000 (1 ½ h)

Revelado quimioluminescente

Identificación de reconocimiento a epitopes sintéticos

Muestras: Sueros y salivas

MABA

(Noya o y col, 1998)

Fig. 24: Reactividad de sueros (IgG) frente a péptidos sintéticos de H. pylori utilizando MABA.

En vertical se muestran las tiras correspondientes a cada paciente: tira 1: conjugado, tiras 2-28 sueros de pacientes. En

horizontal están los péptidos sintéticos que fueron sensiblizados en el papel de nitrocelulosa, del 2- 4: péptidos de UreB, 5: pool

de Ure, 6: pool de flagelina, 7-14: péptidos de VacA, 15: pool de VacA, 16-26: péptidos de Cag, 27: pool de Cag, 1 y 28:

Antígeno de H. pylori.

MABA

(Ortiz-Princz D, 2015)

http://www.slideshare.net/amitgajjar85/elisa-14027063

http://es.slideshare.net/perlitayamii/we

stern-blot-28140948

http://es.slideshare.net/tratamiento1/fu

ndamento-y-procedimiento-de-las-

pruebas-de-western-blot

https://www.youtube.com/watch?v=GE8JlP0PBEM

https://www.youtube.com/watch?v=_8r5XVmKfOc