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INMUNOLOGÍA IV: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS INMUNOLÓGICAS Y SEROLÓGICAS Dr. Lizano
Electroforesis de proteínas del suero
La electroforesis de proteínas es una prueba de laboratorio basada en la separación de proteínas aplicando un campo eléctrico, las diferentes proteínas de la mezcla se separarán en función de su peso molecular.
Esta técnica fue descubierta por el bioquímico sueco quien creo el primer aparato sofisticado de electroforesis en 1937. Su trabajo le valió el premio Nobel en 1948. Fue quien desarrollo el concepto de frente móvil, que más tarde se conoció como electroforesis de zona y se usó para separar proteínas en solución.
Esta técnica es importante ya que los niveles obtenidos permiten diagnosticar gammapatias monoclonales (asociadas al cáncer) y diversas patologías entre ellas:
• Cirrosis
• Hepatitis autoinmune
• Artritis reumática
• Osteomielitis
• Bronquitis
• Leishmaniasis
• Lepra
• Leucemia
• SIDA
• Mieloma
• Carcinomas
• Embarazo
• Diabetes
• Daño celular
• Infecciones agudas
• Desordenes renales
• Desnutrición.
Se intentó utilizar el plasma para esta técnica sin embargo, a menudo no permite determinar los cambios en los niveles de las beta y gamma globulinas. Por lo anterior es que se utiliza el suero sanguíneo para hacer determinaciones. El suero es el líquido amarillo que resulta después de formarse el coagulo sanguíneo, en el están contenidas una gran cantidad de proteínas, este carece de fibrinógeno, fibrina y varios factores de coagulación.
Con esta técnica se pueden apreciar principalmente dos proteínas: la albúmina y las globulinas. La albumina al igual que la α y β globulinas son sintetizadas en el hígado. Las γ globulinas son producidas por linfocitos y células plasmáticas.
Entonces son 5 grupos o fracciones proteicas en la sangre, de tamaño, forma y carga similares.
1. Albumina: Es la principal proteína del plasma humano y constituye aproximadamente el 60% de la proteína plasmática total. Trasporta atreves del torrente sanguíneo muchos metabolitos, como los ácidos grasos libres y la bilirrubina, también se unen a metales como el calcio, cobre, zinc, y a
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fármacos poco solubles, transportándolos eficazmente. Ayuda a mantener la presión osmótica de la sangre.
2. α -1-Globulinas: En esta fracción se incluyen α-1-antitripsina, glicoproteínas y lipoproteínas de alta densidad HDL, colesterol «bueno».
3. α-2-Globulinas: También llamada Haptoglobulina, que es una proteína que se une a la hemoglobina libre para evitar su excreción por los riñones, α-2 macroglobulina (inhibidor de proteasas), ceruplasmina (proteína transportadora de cobre y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), entre otras.
4. β-Globulinas: La principal es la Transferrina (proteína transportadora del hierro), el plasminogeno y el complemento, la hemoglobina libre y las lipoproteínas de baja densidad LDL.
5. γ-Globulinas: Inmunoglobulinas o anticuerpos, proteínas producidas por el sistema inmune en respuesta a infecciones, reacciones alérgicas y trasplantes de órganos. Los anticuerpos se dividen en IgA, IgE, IgD, IgM e IgG.
Valores normales en una corrida
Los resultados de la electroforesis de proteínas séricas pueden verse afectados por:
• El consumo de medicamentos como la clorpromazina, corticosteroides, isoniazida, neomicina, fenacemida, salicilatos, sulfonamidas y tolbutamida.
• Uso de colorantes de contraste pueden alterar los resultados.
Procedimiento
1. Obtención del suero sanguíneo
2. Se le agrega a la muestra el duodecil sulfato de sodio (SDS). Este permite la separación de las proteínas
3. Se calienta la muestra
Fracción Porcentaje con respecto a las Proteínas Séricas Totales (%)
Concentración (g/dL)
Albúmina 54.7 – 60.2 3.5 – 5.5
α – 1 globulina 1.6 – 3.6 0.2 -0.4
α – 2 globulina 9.4 – 12 0.5- 0.9
β globulina 10.9 – 14.5 0.6 – 1.1
γ globulinas 10.9 – 19.3 0.7 – 1.7
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4. Se da la reacción de las proteínas con el SDS. El SDS permite que las proteínas de
desplieguen y pierdan su carga negativa.
5. Las proteínas desnaturalizadas se colocan en pocillos de gel de policrilamida
6. Dependiendo de la carga y peso de las proteínas estas se separan. Se utiliza una fuente de energía que permite que los péptidos cargados negativamente se desplacen hacia el polo positivo.
En la siguiente imagen se puede observar la corrida de un suero comercial. También se puede ver el suero de una mujer embarazada el cual contiene más gammaglobulinas.
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Patologías detectadas por electroforesis
Mediante la electroforesis pueden separarse y cuantificarse un gran número de proteínas presentes en el suero, sin embargo los resultados pueden verse afectados por el consumo de medicamentos como clorpromazina, neomicina, corticoesteroides, fenacemida entre otros.
1. Albúmina.
• Elevación por encima de niveles normales: deshidratación.
• Disminución por debajo de los niveles normales: malnutrición, hepatopatías como cirrosis, nefropatías, hiperhidratación o enfermedades inflamatorias.
2. α-1-globulinas.
• Elevación por encima de niveles normales: inflamaciones crónicas por ejemplo artritis reumatoide, lupus eritematoso o inflamaciones agudas.
• Disminución por debajo de los niveles normales: enfisema pulmonar juvenil.
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3. α-2-globulinas.
• Elevación por encima de niveles normales: inflamaciones agudas y crónicas.
• Disminución por debajo de los niveles normales: hemólisis, insuficiencia hepática y enfermedad de Wilson.
Este examen no es muy pedido pero ayuda a identificar diversas enfermedades
4. β-globulinas.
• Elevación por encima de niveles normales: hiperlipoproteinemia.
• Disminución por debajo de los niveles normales: trastorno de coagulación congénito, malnutrición, coagulopatía de consumo.
5. Ƴ-globulinas.
• Elevación por encima de niveles normales: mieloma múltiple, artritis reumatoide, hiperinmunización, macroglobulinemia de Waldenstrom.
• Disminución por debajo de los niveles normales: inmunodeficiencias secundarias y trastornos inmunológicos congénitos.
ELISA (Enzyme-linked Inmunoabsorbent Assay o Prueba inmunoabsorbente ligada a enzimas)
Es una prueba para la detección de moléculas usando el reconocimiento de antígeno-anticuerpo y la sensibilidad de pruebas enzimáticas. Un ensayo inmunoenzimático para detectar moléculas que sufren cambio al presentarse infecciones por virus, bacterias, hongos o parásitos.
Para la prueba hay que hacer varios lavados.
Existen dos tipos de pruebas:
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ELISA
No competitivo
Directo (buscar antígeno) Indirecto
(buscar
Competitivo
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En la siguiente imagen se puede ver la diferencia entre el método directo y el
indirecto. En el directo se busca directamente el antígeno mientras que en el indirecto se busca el anticuerpo que se una al antígeno.
En el lado izquierdo se observa el método directo. Hay un anticuerpo en la base, a este se le une un antígeno y sobre este se ubica un anticuerpo marcado que se utiliza ya que produce luminiscencia que es detectada. Por su parte, del lado derecho, está el método indirecto el cual es más sensible. En este caso, el antígeno se deposita en los posos y una doble combinación de anticuerpos produce luminiscencia.
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La técnica ELISA fue inventada por Peter Perlmann y Eva Engvall en la universidad
de Stockholm en 1971.
La prueba sirve para detectar antígenos, anticuerpos, medicamentos drogas de abuso contaminantes químicos y bacterianos, etc. La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune.
Problemas con la técnica
Un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
Hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
Ventajas de la técnica
La prueba es específica, fácil para la automatización de robots para hacer muchas pruebas en corto tiempo, es barato.
¿Para qué se utiliza la prueba?
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Esta prueba se emplea para detectar la presencia de anticuerpos contra agentes
virales, para identificar la presencia de antígenos de superficie virales (como en la hepatitis). Y también detecta anticuerpos contra bacterias.
También se utiliza en la determinación de antígenos o marcadores tumorales para seguir su evolución o la respuesta a tratamiento, cuantificación de medicamentos en sangre y la cuantificación de drogas en abuso
Procedimiento
1. Los antígenos se pegan a una placa de cloruro de polivinilo o poliestireno (PVC); también se pueden pegar anticuerpos.
2. Se agrega el suero o líquido problema diluido.
3. Después de la reacción antígeno-anticuerpo se utiliza un segundo anticuerpo conjugado a una enzima, específico para el isótipo del anticuerpo a cuantificar.
4. Se agrega el sustrato cromógeno que produce un cambio de coloración.
5. En un espectrofotómetro se produce una lectura de absorbancia, directamente proporcional a la concentración del analito a determinar.
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Western-Blot
Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular)
Fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford.
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En 1975, Edwin Southern demostró que la nitrocelulosa era capaz de capturar
ácidos nucleicos separados previamente por electroforesis. De esta forma, se permitía el análisis de una mezcla compleja de moléculas de ADN. Existen diversas técnicas capaces de detectar un antígeno determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis.
La aparición del Western no fue posible hasta la aparición de las membranas.
Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad. Luego son transferidas a una membrana adsorbente para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros métodos.
Preparación de la muestra
1. Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular.
2. Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracción.
3. Después se procede a una licuadora (para muestras pequeñas).
4. Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la fracción no precipitada.
Materiales
Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 °C) para evitar la desnaturalización proteica. Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es preciso combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y bioquímicas.
Electroforesis en gel
Las proteínas de la muestra serán separadas en gel en función de lo siguiente:
• Punto isoeléctrico
• Peso molecular
• Carga eléctrica
La electroforesis con gel más frecuente es la de poliacrilamida con dodecil sulfato (SDS-PAGE). Esta provoca la eliminación de las estructuras secundarias y terciaras de las proteínas y mantiene a los polipéptidos en estado desnaturalizado. Esto permitirá que las proteínas sean separadas en función del tamaño.
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Transferencia
Para que las proteínas sean accesibles a la detección de anticuerpos, se les transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de polifluoruro de vinilideno (PVDF). Las membranas utilizadas en la prueba Western Blot se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica.
Las membranas que se utilizan de acuerdo a las proteínas:
• Existe una membrana de nitrocelulosa en donde ocurren interacciones membrana-proteína de tipo no covalente, con naturaleza hidrófoba.
• En la membrana PVDF se dan interacciones hidrofóbicas y de dipolos. Deben ser humedecidas en metanol o etanol, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
Electrotransferencia
Este método se basa en una corriente eléctrica y un buffer de transferencia para llevar las proteínas desde el gel hasta la membrana.
Después de la transferencia se suele proceder a la tinción de Coomassie Brilliant Blue para comprobar que se ha transferido suficiente material proteico a la membrana.
Detección
En el proceso:
• Se comprueba la presencia en la membrana de la proteína.
• Se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica.
• Proceso tradicionalmente realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la detección en un único paso.
Análisis
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Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de
aquellas que sí se han unido a la proteína de interés.
Resultados
Se pueden examinar la cantidad de proteínas en una muestra y comparar los niveles de presencia entre varios grupos.
Transcrito por: Roxana Fernández Vaglio
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