UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ESTE FACULTAD DE CIENCIAS MEDICAS - ESCUELA DE MEDICINA -

Inmunolo gaAlumno(a):__________________________ _ Matrcula:________

Dr. Carlos LpezSan Pedro de Macors, Enero de 2011

INDICEIntroduccin__________________________________ 1

1 Plasma y Suero_____________________________ 2

2 Diluciones seriadas y combinadas______________ 3

3 Microdiluciones____________________________ 7

4 Aglutinacin y Hemaglutinacin______________ 9

5 Fijacin del Complemento___________________ 11

6 Inmunodifusin y Contrainmunoelectroforesis__ 13

7 Inmunofluorescencia______________________ 15

8 Radioinmunoensayo_______________________ 16

9 - E L I S A________________________________ 17

Anexo: Inmunidad Celular___________________INTRODUCCION

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Las Pruebas de Laboratorio en Inmunologa, comprenden las determinaciones en el plasma y en el suero, de las protenas inmunolgicas, como las Inmunoglobulinas, las Citosinas, las Cininas y las Protenas del Sistema del Complemento. Tambin se consideran en este grupo, las Pruebas para evaluar la Inminidad Celular, como la Intradermorreaccin y las Determinaciones Cuantitativas de Linfocitos T. En el presente manual, nos circunscribimos a las Pruebas Serolgicas, debido a la limitada disponibilidad de tiempo docente para la asignatura. Espero que comprendan y corrijan todas las deficiencias que pueda contener el manual, el cual se imparte en la UCE por vez primera. He querido acompaar el texto, con material ilustrativo, que estoy seguro ayudar en su comprensin. El autor, dedic 18 aos al Diagnstico Serolgico de las Enfermedades Infecciosas. La Serologa, es el estudio de las reacciones antgeno- anticuerpo. En toda reaccin serolgica, se conoce uno de los dos elementos, el antgeno o el anticuerpo (reactivo de referencia), con el cual se identifica al otro (elemento problema o desconocido). Espero te sirva como complemento del aval de conocimientos esenciales que necesitas para la buena ejecucin de tu proceder como profesional. Dispnsame y tolrame en lo posible durante el desarrollo de este material. Ten en cuenta la carga que llevo y que hay alumnos ms asequibles que otros (y entre todos, tengo muchos). Creme que pondr mi mximo empeo en lograr que captes la esencia del folleto. Fraternalmente, tu profesor, Carlos Lpez Acosta.

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1 Plasma

y Suero

La sangre, como muestra mdica, se puede tomar por puncin venosa y depositar en un contenedor estril, con o sin anticoagulante. Con anticoagulante, se emplea, para el estudio de todos los componentes sanguneos celulares y moleculares. La parte celular se compone de eritrocitos, leucocitos y plaquetas. La parte lquida, se denomina plasma y ah se encuentran molculas de diversa ndole, incluyendo las inmunoglobulinas, que son el 20% de las protenas del plasma. La sangre sin anticoagulante, se utiliza para los estudios serolgicos. El cogulo, atrapa las clulas y muchas protenas y otras molculas plasmticas. El sobrenadante separado del cogulo, es el suero. En el suero se encuentran las inmunoglobulinas y las protenas del Sistema del Complemento.

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2 Diluciones

Seriadas y Combinadas

Realizar una dilucin srica es mezclar suero con un diluente en distintas proporciones. Uno de los diluentes ms utilizados es la Solucin Salina Bufferizada con Fosfatos (PBS) con pH 7- 7.4, que mantiene un pH neutro durante la reaccin.

Diluciones SeriadasLas diluciones seriadas logran la multiplicacin de las diluciones sricas subsiguientes por un factor nico de dilucin. Las ms empleadas son: 1:2, 1:3, 1:5 y 1:10. A continuacin, se ejemplifica una dilucin seriada 1:2(al doble). Los pases se dan en 1ml. Cada tubo tiene 1 ml de PBS.

Ejercicio 1. Realice las siguientes diluciones: (no.1) 1:3, (no.2) 1:5 y (no.3) 1:10. no.1 - 1:3(al triple)

no.2 1:5(a la quinta o quntuplo)

3 no.3 1:10(a la dcima)

Ejercicio 2. Realice las diluciones seriadas: (no.4) 1:9, (no.5) 1:15 y (no.6) 1:25. no.4 1:9

no.5 1:15

no.6 1:25

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Diluciones CombinadasLas diluciones combinadas se realizan con el objetivo de acortar la distancia o rango entre una dilucin seriada y la siguiente. Esto permite dar una cualificacin ms precisa del ttulo serolgico. Se denomina ttulo serolgico, a la mxima dilucin del suero donde se observe la reaccin positiva. En el ejemplo, el ttulo del suero es 1:160 (la ltima dilucin positiva). Observe que se realizaron diluciones al doble a partir de 1:20.

El ltimo tubo, representa un control negativo. Toda prueba serolgica, conlleva controles positivo y negativo. El control positivo se realiza con un suero conocido con anticuerpos (suero de referencia). El control negativo se efecta, con un suero conocido sin los anticuerpos buscados. A continuacin, se ejemplifica una dilucin combinada. Los pases se dan en 1ml. Cada tubo tiene x mls (el nmero que aparece en el fondo de cada tubo) de PBS. Se combinan diluciones al doble (tubos 1,3,5,6,8,11), al triple (tubos 2,7,9,10,13,14), a la quinta (tubos 4,12) y a la dcima (tubo 15).

5 Ejercicio 3. Realice las diluciones combinadas: (no.1, no.2, no.3 y no.4) no.1 Combine diluciones al triple y a la quinta

no.2 Combine diluciones a la quinta y a la dcima

no.3 Combine diluciones a la dcima y al doble

no.4 Combine diluciones al doble y al triple

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3 MicrodilucionesActualmente, las pruebas serolgicas, se realizan en Sistemas de Microtcnica, mediante placas de acrlico u otro plstico inerte (que no interfiera con la reaccin). Estas placas poseen 96 hoyuelos, los cuales sustituyen a un nmero idntico de tubos. Estos hoyuelos tienen una capacidad limitada (en mls), por lo que las diluciones deben hacerse empleando mnimas cantidades de suero y reactivos (en dcimas o milsimas de mls). En la figura de abajo, se muestra una placa de microtcnica.

A continuacin, se ejemplifica una microdilucin 1:2(al doble). Los pases se dan en 0.5ml. Cada tubo tiene 0.5ml de PBS.

Ejercicio 4. Realice las siguientes microdiluciones: (no.1, no.2, no.3, no.4 y no.5) no.1

7 no.2

no.3

no.4

no.5

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4 Aglutinacin

y Hemaglutinacin

En las Reacciones de Aglutinacin, el antgeno se encuentra particulado (en forma de partculas). Estas reacciones son microscpicas, no se ven a simple vista, por lo que se emplea un INDICADOR, elemento visible que se acopla al antgeno o al anticuerpo, pero que no participa en la reaccin. Cuando el indicador es el eritrocito, la reaccin se denomina Hemaglutinacin. La Hemaglutinacin puede ser Directa o Indirecta.

En la Hemaglutinacin Directa o Activa(HA), los antgenos (hemaglutininas), aglutinan de por s a los eritrocitos de una especie animal determinada. Como ejemplo tenemos al Virus Influenza, cuyas hemaglutininas, aglutinan eritrocitos de pollo.

Para detectar anticuerpos anti-influenza, se pone una suspensin de virus conocido (reactivo de referencia), en presencia del suero del infectado. Si el suero tiene anticuerpos, estos se unen al antgeno, pero esta reaccin no es visible. Despus, esta mezcla, se une con el indicador, que es el eritrocito de pollo y este no se aglutinar. Este fenmeno se llama Inhibicin de la Hemaglutinacin(IHA). Si el suero no tiene anticuerpos, los eritrocitos sern aglutinados por las partculas virales libres.

9 En la Hemaglutinacin Indirecta o Pasiva(HAP), el antgeno no aglutina de por s, a los eritrocitos, los cuales tienen que ser previamente sensibilizados.

Posteriormente, al adicionar el suero, si hay anticuerpos en el mismo, los eritrocitos, quedan aglutinados(hemaglutinados).

Ejercicio 5. Llene los espacios en blanco. 1 - En las Pruebas de Hemaglutinacin, si el suero es el elemento problema o desconocido: a) El elemento de referencia es_____________________________________; b) El indicador es________________________________________________; 2 La prueba en que el antgeno aglutina a los eritrocitos es la ______________________________________________________________; 3 La prueba en que los anticuerpos impiden la hemaglutinacin es la ______________________________________________________________; 4 El acoplamiento de los antgenos a los eritrocitos se llama _____________________________________________________________; 5 La prueba en que los anticuerpos aglutinan a los eritrocitos es la _____________________________________________________________.

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Los sueros positivos son: B, C, D, F, G y H. Los sueros negativos son: A y E. Las diluciones seriadas al doble se numeran en la parte superior de la figura.

Ejercicio 6. Notifique el ttulo de cada suero positivo. Llene los espacios en blanco.

Suero B____________

Suero C____________

Suero D____________

Suero F_____________

Suero G_____________

Suero H____________

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5 Fijacin

del Complemento

La Prueba de Fijacin del Complemento(FC o CF), se fundamenta en la propiedad principal del Complemento, que es la lisis celular. Se utilizan eritrocitos de carnero como indicadores. En esta tcnica, se emplean 5 elementos: 1)Antgeno conocido-reactivo de referencia; 2)Suero del paciente-elemento problema; 3)Eritrocitos de carnero(ErC); 4)Hemolisina(Hl), anticuerpos-antigbulo de carnero;

5)Suero de curiel, que contiene el Sistema de Protenas del Complemento(C). Hay 2 sistemas: El Sitema Principal(Ag+Suero) y el Sistema Indicador(ErC+Hl). Ejercicio 7. Interprete la figura y describa qu pasa en el suero + y el suero -

a) Suero positivo:_______________________________________________________ ________________________________________________________ ____________________________________________= No hemlisis; b) Suero negativo:______________________________________________________ ______________________________________________= Hemlisis. 12

y ContrainmunoelectroforesisEn las Reacciones de Precipitacin, el antgeno se encuentra en solucin.

6 Inmunodifusin

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Ejercicio 8. Inmunodifusin(ID) y Contrainmunoelectroforesis(CIE). Diferencias: Inmunodifusin._______________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________; _

Contrainmunoelectroforesis______________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________.

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7 Inmunofluorescencia

Ejercicio 9. Inmunofluorescencia Directa(IFD) e Indirecta(IFI). Diferencias: IFD_________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ___________________________________________________________________; IFI________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ __________________________________________________________________.

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8 Radioinmunoensayo

Ejercicio 9a. Fundamente el Radioinmunoensayo. _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________

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ELISA

17 Ejercicio 10. ELISA Directo y ELISA Indirecto.). Diferencias: ELISA Directo (Sandwich)______________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

ELISA Indirecto______________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

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Anexo Inmunidad Celular

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Citometra de Flujo

La citometra de flujo es una tcnica de anlisis celular que implica medir las caractersticas de dispersin de luz y fluorescencia que poseen las clulas conforme se las hace pasar a travs de un rayo de luz. Para su anlisis por citometra de flujo, las clulas deben encontrarse individualmente en suspensin en un fluido. Las clulas sanguneas pueden analizarse prcticamente de manera directa, las clulas de tejidos slidos deben primero dispersarse. Las clulas pueden hacerse pasar a muy altas velocidades (pueden llegar a alcanzarse velocidades cercanas a las 100,000 clulas por segundo). Al atravesar el rayo de luz, las clulas interaccionan con este causando dispersin de la luz, basndose en la difraccin de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamao de las clulas que pasan y al medir la reflexin de la luz de manera lateral se evala la granularidad o complejidad de estas. Adems de la dispersin de la luz, si previamente a su anlisis se coloca a las clulas en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con molculas fluorescentes, se pueden evaluar que clulas poseen los antgenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados. El uso de molculas fluorescentes distintas (distintos colores de fluorescencia) permite analizar la presencia de varios marcadores de manera simultnea. Si el anlisis incluye la deteccin de fluorencencia hablamos estrictamente de citofluormetros de flujo (los conocidos como "citmetros" o "FACS" (por "Fluorescence-Activated Cell Sorter"). Los citmetros de flujo pueden analizar partculas en funcin de su fluorescencia y tamao. Los conocidos como separadores o "sorters" pueden tambin purificar clulas de caractersiticas determinadas. 20