tÉcnicas de estudio cromosÓmico

7/22/2019 TCNICAS DE ESTUDIO CROMOSMICO

1/37

PRESENTACIN

El desarrollo espectacular de la ciencia y tecnologa es notorio en todos los mbitosque rodean al ser humano. De igual forma la Gentica Humana se ha desarrolladoaceleradamente en los ltimos aos y ha pasado a ocupar un lugar central en lamedicina. Ya sea explicando los aspectos fisiolgicos normales, como los patolgicosdel ser humano.La aplicacin de las tcnicas de Gentica (en especial de la Citogentica Humana) han

permitido, primero, localizar las enfermedades en sus respectivos cromosomas y, mastarde, la descripcin formal de las mutaciones implicadas. As sabemos que el 50% delos Retardos Mentales son atribuibles a factores genticos, y que se detectanalteraciones cromosmicas en el 0.5% de recin nacidos vivos, 6 a 10% de parejasabortadoras a repeticin, 15% en parejas con fallas reproductivas, el 50% de losproductos abortados, en el 80 al 90% de las Leucemias Mieloides Crnicas, en el 70%de las Leucemias Agudas, etc.Esto ha llevado a la necesidad de que diferentes especialidades mdicas ( Pediatras,Gineco-obstetras, Neurlogos, Psiquiatras, Endocrinlogos, Urlogos, Neonatlogos,Hematlogos, Onclogos etc.) requieran de la valiosa informacin que les proporcionaestas Pruebas de Estudios Citogenticos.Por estas razones, es importante que se difunda la importancia que tienen los

estudios citogenticos en Medicina objetivo que este SEMINARIO TALLER pretende

lograr para que se fomente la formacin de un Laboratorio de Gentica en donde se

desarrollen estas Tcnicas de Estudios Citogenticos para brindarles a los Mdicos

herramientas importantes que les ayuden directamente en el Diagnstico, Evaluacin

y Tratamiento, o conocer el Pronstico de la enfermedad que adolece su paciente, a

quien finalmente se le podr brindar una atencin integral y especializada.

Hctor E. Herrera ReynosoTecnlogo Mdico


2/37

TCNICAS DE ESTUDIO CROMOSMICO

Una de las alteraciones genticas frecuentes, se debe a un defecto en los

cromosomas ya sea por una alteracin del nmero o una alteracin en su

morfologa (deleciones, translocaciones, inserciones, etc.); esta causa de alteracin

gentica motiv a los investigadores a desarrollar tcnicas de cultivo que

permitieran el estudio de los cromosomas. As desde la dcada del 50 se

desarrollaron tcnicas de cultivo celular lo cual permiti a Soe Thio y Albert Levan

en 1956 demostrar una preparacin a travs del cual se poda observar

separadamente cada uno de los cromosomas. Este descubrimiento hizo posible

hacer el recuento del nmero de cromosomas y estudiar su configuracin

individual. Como resultado de estas investigaciones se concluy que el humano

tena un nmero diploide de cromosomas, (46) puesto que antes se consideraba

que eran 48 cromosomas. Esta observacin fue confirmada por Ford y Hamerton.

Ms tarde reportes de otros investigadores presentaron tcnicas que aumentaban

grandemente la fineza de la preparacin de los cromosomas. Un ejemplo de estos

hallazgos es la adicin de Phitohemaglutinina (PHA) en el medio de cultivo celular.

La PHA es un extracto salino de un tipo de frjol rojo llamado Phaseolus vulgaris.La PHA fue originalmente utilizada dentro de su capacidad para producir

hemoaglutinacin. Ms tarde, Nowell descubri su propiedad mitgenica. Otro

hallazgo fue el uso de Colchicina, una sustancia derivada del Autumn Crocus que

tiene un efecto especifico de inhibicin mittica deteniendo la divisin en el

estadio de metafase. Esto permite la acumulacin de clulas en metafase en el

cultivo. Hughes y Hsu reportaron que el pre-tratamiento de las clulas en mitosis

con una solucin hipotnica causaba la absorcin de lquido y el hinchamiento de

la clula, facilitando la separacin de los cromosomas. Moorehead y colaboradores

fueron los primeros en describir el mtodo del cultivo de linfocitos de sangre

perifrica.


3/37

CULTIVO CELULAR

Para el estudio Citogentico (Estudio Cromosmico) es necesario que las clulas

estn en divisin celular (Mitosis) ya que los cromosomas slo podrn ser

analizados, de acuerdo a su morfologa y patrn de bandas, cuando las clulas

estn en el estadio de metafase.

Algunas clulas de nuestro organismo normalmente pueden estar en un proceso

de proliferacin y diferenciacin por lo que no es necesario estimularlos para que

entren en divisin celular; pero otras clulas como los linfocitos de sangre

perifrica como son clulas ya diferenciadas requieren de un estimulante mitgeno

para que entren en mitosis.

Por esto los cultivos celulares se dividen en dos tipos:

A. CULTIVOS INDIRECTOS:

Son aquellos en los que la clula requiere de una estimulacin mitgena

para entrar en divisin celular. Como en:

A.1. Cultivo de sangre perifrica (Linfocitos)

B. CULTIVOS DIRECTOS:

Son aquellos en los que la clula no requiere de una estimulacin mitgena

para entrar en divisin celular. En algunos casos basta someter a las clulas

directamente a un choque hipotnico y posterior fijacin, como el caso de:


4/37

B.1. Cultivo de Lquido Orgnico: Estudio realizado para demostrar la

presencia de metafases anormales que reflejaran la presencia de clulas

neoplsicas.

En otros casos se procede, generalmente a suministrarle todos los

nutrientes necesarios para su crecimiento celular, como en:

a. Cultivo de Piel: realizado generalmente cuando se sospecha de un

mosaicismo no detectado en Cultivo de Linfocitos.

b. Cultivo de Mdula sea: realizado para el estudio Cromosmico en

casos de Sndromes Mielodisplasicos y Leucemias.

c. Cultivo de Tumores: realizado para demostrar la presencia de una

alteracin numrica y/ o estructural de los cromosomas que estn

asociados a la presencia de clulas tumorales o clulas neoplsicas.

d. Cultivo de clulas fetales (Amniocentesis).

e. Cultivo de vellosidades coriales.


5/37

ESTUDIO CITOGENTICO DE SANGRE PERIFRICA

1. MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo celular son compuestos que contienen: Aminocidos,

vitaminas y cofactores, enzimas y coenzimas, sales, iones, indicadores de pH.

Todo lo necesario para que la clula pueda dividirse in vitro.

Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionaran dependiendo del

tipo de muestra o tipo de clula a cultivar y lograr que estos respondan

adecuadamente con un crecimiento celular, as tenemos:

a. MEDIO McCoy's 5 MODIFIED: Utilizado con ms frecuencia para

Sangre perifrica (Linfocitos).

Cultivo de Mdula sea

b. MEDIO Ham Flo o Ham F12: Utilizado en condiciones especiales

Deficiencia de cido flico.

Para el estudio de Cromosoma X frgil. Utilizado tambin para el cultivo de sangre perifrica (Linfocitos).

c. MEDIO Tc 199: Utilizado con ms frecuencia para:

Cultivo de piel.

Cultivo inicial de liquido amnitico (clulas fetales)

Cultivo de tumores (clulas neoplsicas)

d. MEDIO RPMI 1640: Utilizado para:

Sangre perifrica (Linfocitos)


e. MEDIO DE CULTIVO CHANG B + CHANG C: Utilizado para:

Cultivo de vellosidades coriales.

Cultivo de liquido amnitico (clulas fetales)



6/37

f. MEDIO AMNIOMAX: Utilizado para:

Cultivo de vellosidades coriales.

Cultivo de liquido amnitico (clulas fetales)

2. SUPLEMENTOS:

Adems del medio de cultivo base las clulas requieren para su crecimiento y

divisin celular de suplementos, los cuales sern utilizados dependiendo del

tipo de clulas que se desea cultivar. As tenemos:

a. SUERO BOVINO FETAL (SBF): Se utiliza a diferentes concentraciones, por

Ejemplo:

Para el estudio de X frgil al 5%

Para Cultivo de Sangre Perifrica y cultivo de Medula sea al 20%.

Para Cultivo de Liquido Amnitico (clulas fetales) al 30%.

b. PENICILINA + ESTREPTOMICINA: utilizado como antibitico para impedir la

contaminacin bacteriana.

c. FUNGIZONA: Utilizado como antimictico en caso que fuera necesario.d. L - GLUTAMINA: Utilizado para mejorar el crecimiento celular.

e. FITOHEMAGLUTININA (PHA): Utilizado solo en caso de cultivo de sangre

perifrica (linfocitos) como un estimulante mitognico.

NOTA: Adems se utilizan otros suplementos cuando se quiere realizar

estudios Citogneticos especiales, como:

Estudio de cromosoma X frgil: se cultiva la sangre perifrica (linfocitos) en

medio TC199 o RPMI 1640 deficiente en cido flico, ms L - GLUTAMINA o

bien utilizando Inhibidores de la Timidilato Sintetasa como la

Fluorodeoxiuridina (FUDR) o Metotrexate (MTX).

Estudio Cromosmico de alta resolucin: En la que se busca realizar una

sincronizacin celular utilizando el Metotrexate (MTX). Esta tcnica es

usada para obtener cromosomas en profase o prometafase.


7/37


8/37

NOTA: Con esta tcnica de Coloracin convencional solo podr ser posible hacer el

recuento del nmero de cromosomas y tener en cuenta los criterios de morfologa,

tamao y posicin del centrmero se podrn agrupar los cromosomas en GruposCromosmicos A, B, C, D, E, F, y G. No se podr identificar cada par Cromosmico

porque para ello seria necesario realizar una tcnica de Bandeo Cromosmico.

OBSERVACIN

En los casos que no sea posible obtener el volumen de sangre perifrica adecuado

se puede usar una tcnica llamada de "Microcultivo o Micromtodo" que consisteen aadir unas 40 gotas de sangre obtenidas inclusive de pulpejo del dedo o de

taln (en caso de recin nacidos) al frasco de cultivo. Los pasos siguientes son

exactamente iguales en la Tcnica de Cultivo de linfocitos descrito anteriormente.

PRECAUCIONES A CONSIDERAR.

1. Los medios de cultivo, reactivos y colorantes debern prepararse de acuerdo a

como est indicado para cada tipo de cultivo.

2. Se deber realizar la siembra con la mayor esterilidad posible.

3. No debern ser modificados los tiempos o rangos de centrifugacin ni las

temperaturas incubacin inadecuadamente.

4. Deber tenerse en cuenta que son muchas las causas que interfieren con elnormal desarrollo de la mitosis y que incluso producen alteraciones

cromosmicas. Estos agentes interferentes pueden ser de naturaleza fsica

como los rayos X, la Luz Ultravioleta, cambios bruscos de temperatura, campo

magntico u ondas sonoras.


9/37

5. El normal desarrollo de los cromosomas puede tambin ser inhibido por ciertos

agentes biolgicos como: genes, virus y protozoarios, y muchos reactivos

qumicos como:

a) Compuestos relacionados con los cidos nucleicos (6-Mercaptopurina y 5-

Fluorodoxiuridina)

b) Antibiticos (Mitomicina C, Actinomicina y Daunomicina).

c) Drogas del Sistema Nervioso Central (Meprobamate, mescalina, cido

lisergico y dietilamida).

d) Cafena y derivados del Ciclamato.

e) Contaminantes del aire y del agua (Cloramina T y el Ozono).

f) Pesticidas (Captan y Tio-Tepa).

g) Inhibidores mitticos (Colchicina).

h) Colorantes derivados de la Fotocianina (Acricina orange y rojo neutro).

i) Compuestos antiflicos (Metrotexate y aminopterina).

j) Solventes orgnicos (Benceno y Mercapto-etanol).

k) Solventes Inorgnicos (Plomo y Arsnico).


10/37

TCNICA DE CULTIVO DE LINFOCITOS

(Sangre Perifrica)

1. TOMA DE LA MUESTRA:

Se obtiene 5ml de sangre venosa teniendo

en cuenta todas las medidas de

bioseguridad, con una jeringa previamente

cargada con 0.1 ml de heparina sdica.

Tomada la muestra se deja la jeringa en

posicin vertical con la aguja hacia abajo el

tiempo necesario para que sedimente el

paquete globular

2. SIEMBRA DE LA MUESTRA:

Se elimina el paquete globular de la jeringa,

dejndose la interfase entre el paquete

globular y el plasma, donde se

encuentra la mayor cantidad de

glbulos blancos que se utilizaran para

la siembra.


11/37

Se adiciona al frasco de cultivo 1 a 1.5ml

de la muestra (plasma + elementos

celulares). Mezclar suavemente y cerrarhermticamente el frasco de cultivo. Se

deja en incubacin en una estufa a 370C

por 70 a 72 horas. Todo el procedimiento

de la siembra se debe realizar en absoluta

esterilidad, diariamente se debe de

mezclar el frasco de cultivo y observar Si

hay cambios de color del medio o turbidez

que nos indicara una probable

contaminacin.

Cumplida las 70 a 72 horas se saca

el frasco de cultivo de la estufa y se

agrega 100 l de Colchicina al 0.1

gr/ ml. Mezclar suavemente e

incubar en estufa a 37C por 50 -

60 minutos.

Utilizando una pipeta Pasteur,

decantar o eliminar el sobrenadante

y homogenizar el sedimento o Pellet.


12/37

Luego agregar 6ml de Cloruro de

Potasio 0.075M (solucin Hipotnica)

y agitar bien el Pellet usando la

pipeta Pasteur por 2 3 minutos. Se

colocar el tubo en la estufa a 37.0

durante 10 minutos.

NOTA: El tiempo de exposicin en la

solucin Hipotnica no deber

exceder en ningn caso ms de 15

minutos.


13/37

Sacar el tubo de la estufa y agregar

de 5 a 8 gotas de fijador Carnoy

(recin preparado), para detener la

accin de la solucin Hipotnica.

Mezclar suavemente usando una

pipeta Pasteur.

Se centrifuga a 1000rpm por 10

minutos.


14/37

Utilizando una pipeta Pasteur eliminar

el sobrenadante y resuspender elPellet. Agregar 6ml de fijador Carnoy, el

1er ml agregarlo gota a gota, el resto

puede hacerse ms rpido, utilizando

una pipeta Pasteur agite y deje

fijndolo por 30 minutos a To ambiente.

Eliminar el sobrenadante y

resuspender el Pellet usando una

pipeta Pasteur. Se adicionar 6

ml de fijador y nuevamente

centrifugar a 1000 RPM.Se repite

el paso anterior 3 veces a manera

de lavados con fijador.

El Pellet obtenido finalmente se

debe resuspender con 1 a 2 ml.

de fijador (esta cantidad puede

variar dependiendo de la cantidad

de Pellet) hasta obtener una

suspensin opalescente.

NOTA: En este paso puede dejarse

fijando el cultivo por 24h (o ms

tiempo si fuera necesario) a To de

refrigeracin. Se centrifuga a 1000rpm

por 10min.


15/37

4. PREPARACIN DE LAS LMINAS:

Las lminas portaobjetos son limpiadas

previamente con una mezcla de alcohol -

acetona, y se almacenan en la nevera hasta el

momento de su empleo.

La preparacin de las lminas conteniendo

las metafases se obtienen aadiendo 3 4

gotas de la suspensin final sobre las laminas

portaobjetos a una distancia de 20 a 35cm y

soplar para obtener un extendido homogneo.

Secar la lmina usando un mechero de

alcohol.


16/37

5. COLORACIN Y OBSERVACIN DE LOS CROMOSOMAS:

a. Se prepara la solucin colorante de Giemsa al 4% en un Koplyns.

b. Se introducen las lminas y dejarlo por espacio de 6 minutos.

c. Enjuagar con agua destilada y secarlo usando papel filtro.

d. La metafase seleccionada deber ser una metafase aislada y que presente

los cromosomas separados, no sobrepuestos, para lograr una fcil

visualizacin.


17/37

TCNICAS DE BANDEO CROMOSMICO

Hasta antes del ao de 1970 no era posible estudiar los cromosomas bandeados

sino slo en forma convencional. Pero en la actualidad se conocen varias tcnicas

de bandeo cromosmico que permiten identificar individualmente los

cromosomas, lo cual facilita la identificacin de una alteracin cromosmica

numrica y especialmente demostrar la presencia de alteraciones cromosmicas

estructurales.


18/37

TCNICA DE BANDAS Q

Fue la primera metodologa de bandeo cromosmico, desarrollado por Casperson y

colaboradores en 1970 quienes utilizaron la Mostaza de Quinacrina para luego

observar la distinta emisin de fluorescencia cuando eran observados los

cromosomas en el microscopio de fluorescencia (utilizando luz ultravioleta). Este

mtodo fue posteriormente denominado como las tcnicas de bandas Q (Paris,

Conferencia de 1971).

Esta metodologa tiene como principal desventaja que la fluorescencia desaparece

progresivamente por lo que la observacin y anlisis cromosmico as como la

toma de microfotografa debe ser lo ms rpido posible. Para la observacin

microscpica, los objetivos del diafragma anular son tiles para regular la

intensidad de luz y as obtener un ptimo contraste y eliminar la excesiva luz que

puede causar una rpida perdida de la emisin de fluorescencia. Para la

fotografia de la metafase se recomienda usar una pelcula de elevado contraste

pancromtico como KODAK TRI X.

Las bandas obtenidas con esta tcnica son caractersticas para cada cromosoma;

pero tienen mayor utilidad para demostrar la porcin distal del brazo largo del

cromosoma Y, que se tie ms intensamente que los dems cromosomas. Las

regiones pericentromericas de los cromosomas 3 y 4, y las regiones satlites y

pericentromericas de los cromosomas acrocntricos muestran variaciones

significativas conocidos como Polimorfismos o Heteromorfismos, que pueden

ser demostrados con esta tcnica.

Aunque el mecanismo que produce la fluorescencia diferencial requiere una

mayor investigacin se acepta que la fluorescencia mayor depende del DNA, si la

regin es ms rica en Adenosina y Timina (A-T) (Ellison y Barr, 1972).


19/37

Recientes estudios indican que el DNA rico en A-T tienden a unirse al Fluorocromo

Quinacrina mientras que el DNA rico en G-C tiende a apagar su fluorescencia

(Comings et al, 1975; Comings 1978; Miller et al, 1973). Sin embargo existenevidencias claras recientes que la interaccin DNA-Protena puede jugar un rol

importante en las bandas Q (Pachmann y Rigler, 1972; Weisbium y de Haseth,

1973).

Soluciones:

1. Buffer Sorensen's a pH 5.6

2. Colorante Dihidrocloruro de Quinacrina al 1%.

Procedimientos:

1. Se tien las lminas con el Colorante de Quinacrina por 15 - 20 minutos en

oscuridad.2. Se lavan las lminas con el Buffer Sorensen's.

3. Se monta con una laminilla cubreobjetos con el Buffer.

4. Examinar al microscopio de fluorescencia utilizando una luz de longitud de

onda de 450 a 500nm.


20/37

TCNICA DE BANDAS G

La Tcnica de bandas Giemsa (Bandas G) obtenidas por digestin proteolitica con

el uso de la enzima Tripsina, es la ms utilizada en el Laboratorios de

Citogentica para el anlisis rutinario de los cromosomas, esta tcnica es descrita

o conocida como GTG (Bandas G por tripsina usando Giemsa).

El mecanismo de accin de las bandas G no est completamente aclarado. Un rol

directo de la tincin con Giemsa es producir bandas G (Mc Kay, 1973; Shuh et al,

1975). Clark y sus colegas (Clark y Felsenfeld, 1975) sugirieron que las Histonas

ricas en argininas estn involucradas en las bandas GTG y no tanto la prdida de

DNA y las protenas de los cromosomas, durante el tratamiento con la tripsina.

Esta hiptesis que diferencia entre bandas G positivas (oscuras) y bandas G

negativas (claras) puede ser debido a la distribucin de las protenas

cromosmicas y el DNA. Tambin se ha sugerido que las bandas G positivas son

relativamente ricas en protenas disulfuro, mientras que las bandas G negativas

contienen sulfhidrilos.

El patrn de bandas es similar entre bandas G y bandas Q, aunque el mecanismo

involucrado en el patron de bandas obtenidas son muy diferentes.

No necesariamente tienen un enfasis especial, ni tener una descripcin

justificada, la aplicacin de bandas G es ilimitada.

La Tcnica de Bandas GTG es usada rutinariamente en los Laboratorios de

Citogentica.

Las bandas G obtenida por GTG es muy superior en la resolucin, comparada con

aquellas tecnicas que utilizan fluorcromos. La naturaleza permanente de esta

perparacion facilita el anlisis microscpico completo de las metafases.


21/37

Soluciones (GTG)

1. Solucin de tripsina 1%.

2. Solucin salina fisiolgica.

3. Colorante Giemsa 4%.

Procedimiento:

1. Se coloca en Bao Mara a 370C el frasco No 1 de Solucin de tripsina 1%.

2. Se colocan las lminas con la preparacin cromosmica (menos de 1 semana)

en el frasco No 1 por 10 segundos. NOTA: A mayor tiempo de la preparacin

cromosmica se le dar mayor tiempo en la tripsina.

3. Se enjuaga las lminas en el frasco No 2 de Solucin salina fisiolgica.

4. Se colocan las lminas en el frasco No 3 de Colorante Giemsa 4% por 6 a 8 minutos.

5. Lavar con agua corriente y dejar secar y observar en el microscopio.


22/37

TCNICA DE BANDAS R

El principio basico de esta tcnica es el tratamiento de las lminas a altas temperaturas en

varios buffers, seguido por la tincin con Acridina Orange (RFA) o en Giemsa (RHG, bandas

R, por calor usando Giemsa). Las bandas que produce est tcnica en los cromosomas

humanos son el reverso de las bandas G o bandas Q, es decir que las bandas claras en Q o

G son bandas oscuras en R y viceversa. (Dutrillanx and Lejeune 1971; Sehested, 1974;

Bobrow and Madan, 1973).

Una de las ms importantes ventajas de la Tcnica de bandas R, es que las regiones

telomricas de los cromosomas son teidas, a diferencia de las Tcnicas bandas Q y G en

las que no son tan claras. El mecanismo de las bandas reversas no esta totalmente

conocido. (Coming's 1978).

El tratamiento con calor induce denaturacin de las protenas cromosmicas as como de

las secuencias del DNA ricas en nucletidos A-T, mientras que el DNA rico en G-C de las

bandas R en una configuracin nativa (SUMMER 1982). Coming s (1978) detalla que a

temperaturas altas el DNA rico en A-T de las bandas G es denaturada y parcialmente

extrada, mientras que el DNA nativo de las bandas R no lo es.

Soluciones RHG:

1. Buffer Sorensen's (0.06M, pH 6.59)

2. Colorante Giemsa.

Procedimientos:

1. Preparar el buffer Sorensen's en un Koplins y llevar a bao mara a 85.C.

2. Colocar las laminas preparadas (1 a 2 semanas) en el Buffer Sorensen's durante 10

minutos.


23/37

TCNICA DE BANDAS C

La tcnica de bandas C produce una tincin selectiva de la Heterocromatina

constitutiva. Estas bandas estn localizadas en la regin pericentromerica de los

cromosomas humanos.

El mtodo original descrito por Arrighi y Hsu (1971) involucra primero un

tratamiento con lcali, (OH)Na, para denaturar el DNA Cromosmico y

subsiguiente incubacin en una Solucin Salina. Posteriormente se describe un

mtodo por SUMMER (1972) en la que el lcali usado es el (OH)2Ba. Ambos

mtodos producen un patrn caracterstico similar de bandas C.

El tratamiento de denaturacin con el lcali (OH)2Ba es crtico y debe ser ptimo

para obtener mejor calidad bandas C. La duracin del tratamiento depende de la

edad (vejez) de la preparacin cromosmica y del tejido de origen. Un tratamiento

inadecuado con lcali produce una pobre diferenciacin de bandas C, mientras

que un tratamiento excesivo resulta en la prdida de la morfologa cromosmica.

Las bandas C requieren de dos pasos sucesivos para la prdida del DNA

cromosmico, primero una depurinacin y denaturacin sucesiva durante el

tratamiento con un cido (HCl) y un lcali (Ba(OH) 2). La denaturacin del DNA es

seguida de una remocin de los pequeos fragmentos y eliminacin de ellos

durante la incubacin en la solucin 2xSSC.

La principal aplicacin de la tcnica de bandas C es para demostrar la variacin detamao de la regin de Heterocromatina Constitutiva presente en las regiones

pericentromrica de los cromosomas, en especial de los cromosomas 1, 9, 16 y

los brazos largos del cromosoma Y. Estas variaciones constituyen los llamados

Polimorfismos. Adems esta tcnica es til para demostrar la presencia de una

inversin pericentromrica.


24/37

Soluciones CBG

1. HCl0.2N.

2. Ba (OH)2 5%.3. Solucin Saluria de Citrato de Sodio (2 x SSC).

4. Giemsa (Solucin colorante.)

Procedimiento:

1. Tratar las lminas con HCl 0.2N x 20 minutos a temperatura del ambiente.

2. Lavar la lmina con agua destilada.

3. Tratar las lminas con soluciones Ba(OH)2 al 5% x 1 a 2 minutos (dependiendo de

la vejez del preparado cromosmico).4. Lavar a chorro directo con agua destilada hasta eliminar el exceso de bario.

5. Colocar las lminas en la solucin 2xSSC a 600C x 2 horas.

6. Lavar con agua destilada.

7. Teir con Giemsa 5% en Buffer Sorensen's a pH 7.0 x 15 minutos.

8. Lavar en agua destilada y observar al microscopio.


25/37

SISTEMA DE NOMENCLATURA CROMOSOMICA

1. Introduccin:Cada cromtide de un cromosoma est formada por una molcula de ADN en un soportede protenas. La cromtide est constituida por cromatina; que es el conjunto del ADNcon las protenas de soporte, formadas fundamentalmente por histonas y otras.

Los cromosomas cambian ligeramente de forma segn la etapa de la divisincelular; son ms alargados en profase y alcanzan el mximo de condensacin enla metafase; por lo cual es el momento ideal para observarlos.

En esa etapa podemos observar que cada cromosoma tiene una zona que es como unaconstriccin, y se llama el centrmero (constriccin primaria). El centrmero determina en

el cromosoma los brazos cortos (p) y los brazos largos (q).

2. Definiciones:

Segn la posicin del centrmero, los cromosomas se clasifican en:

Metacntricos: el centrmero se localiza a mitad del cromosoma y los dos brazospresentan igual longitud. Submetacntricos: la longitud de un brazo del cromosoma es algo mayor que ladel otro. Acrocntrico: un brazo es muy corto (p) y el otro largo (q). Telocntrico: slo se aprecia un brazo del cromosoma al estar el centrmero enel extremo (este tipo de cromosomas no se encuentran en el cariotipo humano).

Los pares cromosmicos se ordenan de forma decreciente de tamao, y luego seclasifican en grupos, de acuerdo al tamao y a la ubicacin del centrmero. Estos gruposse nombran con las letras: A, B, C, D, E, F, G. La representacin ordenada de loscromosomas constituye el cariotipo.


26/37

Grupo A: Metacntricos grandes. Cromosomas 1, 2, 3, excepto el 2, el cual es un

cromosoma submetacntrico grande.

Grupo B: Submetacntricos grandes. Cromosomas 4 y 5.

Grupo C: Submetacntricos medianos. Los cromosomas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y elcromosoma X

Grupo D: Acrocntricos medianos. Cromosomas 13,14 y 15, presentan satlites en susbrazos cortos.

Grupo E: Submetacntricos pequeos. Los cromosomas 16, 17, 18,

Grupo F: Metacntricos pequeos. Los cromosomas 19 y 20.

Grupo G: Acrocntricos pequeos. Los cromosomas 21 y 22 y el cromosoma Y


27/37

3.- ANOMALAS ESTRUCTURALES DE LOS CROMOSOMAS

Deleccin: Cuando se pierde un fragmento de cromosomas. Puede ser Terminalo intersticial.

Translocacin: Cuando hay cambio de posicin de un fragmento, el cual va aparar a otro cromosoma, generalmente implica una ruptura en cada cromosoma.

Recproca: Cuando hay intercambio de fragmentos entre dos cromosomas;Robertsoniana: Unin entre los brazos largos de dos cromosomas acrocntricos.


28/37


29/37

Duplicacin: Es un fenmeno ms difcil de explicar; cuando no ha sidoconsecuencia de una inversin en cromosomas paternos, probablemente se debe

a translocacin entre dos cromosomas homlogos, durante la meiosis que originuno de los gamentos paternos o maternos.La duplicacin puede ser en serie o en espejo.

Cromosoma en anillo: Se origina por ruptura en ambos extremos del mismocromosoma.

4.- NOMENCLATURA EN ANOMALIAS ESTRUCTURALES DE LOSCROMOSOMAS

De acuerdo a la Conferencia de Pars (1971) y posteriores (hasta ISCN 1995) haydos sistemas de nomenclatura: El breve y el detallado.El breve solamente indica cules son los cromosomas involucrados y los puntosde ruptura de un rearreglo.El detallado describe cada uno de los cromosomas resultantes.


30/37

SIMBOLOS:

p brazo corto q brazo largo

de...... hasta : ruptura:: Ruptura y unin cen centrmero

chi quimera mos mosaicodel delecin der cromos. derivadodic dicntrico fra lugar frgildup duplicacin dir directoi isocromosoma mar cromosoma marcador inv inversin ins insercinmat de origen materno pat de origen paternor anillo t translocacinrob translocacin robertsoniana ter telmeroadd material adicional de origen desconocido

Delecin terminal46,XX,del(8)(p12)

46,XX,del(8)(qterp12):

Delecin intersticial46,XX,del(8)(q21q23)

46,XX,del(8)(pter21::q23qter)

Isocromosoma del brazo largo46,X,i(X)(q10)

Isocromosoma del brazo corto46,XY,i(5)(p10)

Inversin pericntrica46,XY,inv(4)(p15q13)

46,XY,inv(4)(pterp15::q13p15::q13qter)

Inversin paracntrica46,XY,inv(13)(q13q32)

46,XY,inv(13)(pterq13::q32q13::q32qter)

Cromosoma en anillo46,XX,r(18)(p11q22)

46,XX,r(18)(p11q22)

Translocacin recproca46,XY,t(2;8)(p13;q12)

46,XY,t(2;8)(2pter2p13::8q128pter;2qter2p13::8q128qter)


31/37

Trisoma y monosoma parciales por herencia de cromosomas derivados46,XY, der(8)t(2;8)(p13;q12)pat

46,XY, der(8pter8q12::2p132pter)pat

Translocacin robertsoniana balanceada45,XX,der(14;21) (q10;q10)45,XX,der(14;21)(14qtercen21qter)

Translocacin robertsoniana desbalanceada46,XX,+13,der(13;14)(q10;q10)

46,XX,+13,der(13;14)(13qter13q10::14q1014qter)


32/37


33/37


34/37


35/37


36/37


37/37

tÉcnicas de estudio cromosÓmico

Documents