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ANÁLISIS CROMOSÓMICO POR MEDIO DETÉCNICAS CITOGENÉTICAS CLÁSICAS Y
MOLECULARES EN UN GRUPO DE PACIENTESCON SÍNDROME MIELODISPLÁSICO Y LEUCEMIAMIELOIDE AGUDA DEL INSTITUTO NACIONAL DE
CANCEROLOGÍA
JULIA SAMANDA MARTÍNEZ RICO
Código: 05599284
Universidad Nacional de ColombiaFacultad de Medicina, Departamento de Morfología
Maestría en Genética HumanaBogotá, Colombia
2015
ANÁLISIS CROMOSÓMICO POR MEDIO DE TÉCNICASCITOGENÉTICAS CLÁSICAS Y MOLECULARES EN UN
GRUPO DE PACIENTES CON SÍNDROMEMIELODISPLÁSICO Y LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA DEL
INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA
JULIA SAMANDA MARTÍNEZ RICOCódigo: 05599284
Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar altítulo de:
Magister en Genética Humana
Directora:Marta Lucía Bueno Angulo
Bióloga, Msc. Profesor Asociado – Departamento de BiologíaFacultad de Ciencias
Universidad Nacional de Colombia
Grupo de Investigación:Grupo de Identificación Cromosómica UN
Universidad Nacional de ColombiaFacultad de Medicina, Departamento de Morfología
Maestría en Genética HumanaBogotá, Colombia
2015
A mi mamá y a mi hermana por tenerme
mucha paciencia y más aún por brindarme su
amor, apoyo e impulso para continuar y sobre
todo a dos personas que aunque no están acá
presentes fueron el motivo de realización de
este proyecto.
Agradecimientos
A la profesora Marta Lucía Bueno por recibirme en su grupo de investigación y abrirme laspuertas del laboratorio para realizar este proyecto, por sus sabios consejos, por su sabiduríay por su amistad.
Al Dr. Leonardo Enciso por confiar en mí y brindar su apoyo incondicional en la consecuciónde las muestras y en el aprendizaje diario que se tenía con cada asesoría.
A Martha Lucia Diaz por el aprendizaje que se tuvo, por el tenerme paciencia en cuestionesadministrativas y por la motivación que me brindo para realizar el curso de buenas prácticasclinas.
Al grupo de laboratorio, Laura Rengifo y Camila Robayo por su apoyo, compañía y locurasque sacaron sonrisas en momentos difíciles.
A mis amigos que me presionaron hasta el final y aportaron su granito de arena como AndreaRobayo, José Pérez, Jairo Cuervo y Andrés Rodríguez.
A mis queridos compañeros de maestría que sin ellos esto no se hubiera podido realizar, porel aprendizaje obtenido de cada uno de ellos y el respaldo que nunca falto.
A la Maestría en Genética Humana, docentes y personal administrativo por la colaboracióny apoyo brindado.
A cada una de las personas consultadas para asesorar la estandarización de CGH, DusanKadlec, Kateřina Kašíková, Mariela Nieves y Joaquima Navarro
Al INC por aprobar la consecución de las muestras y poner a disposición los pacientes, elpersonal y la información necesaria para la realización del proyecto.
A la DIB por la financiación del proyecto ya que sin este dinero el proyecto hubiera quedadoen papel.
A la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional por brindar el apoyo financiero cuandomás se necesitaba.
A la Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá que permitió la realización delproyecto y de un sueño.
Resumen y Abstract VI
Resumen
El Síndrome Mielodisplásico (SMD) y la Leucemia Mieloide Aguda (LMA) son neoplasias
hematológicas que se caracterizan por la falla hematopoyética y la proliferación
incontrolada de blastos en médula ósea. En estas enfermedades se reconocen
anomalías de las células madre médulares multipotentes que presentan alteraciones
morfológicas, cariotípicas y moleculares induciendo a procesos leucemiogénicos
(Catalá, 2012). El objetivo de este estudio es describir y/o caracterizar las alteraciones
cromosómicas presentes en pacientes del Instituto Nacional de Cancerología (INC)con estas patologías por medio de técnicas citogenéticas convencionales y moleculares.
Se analizaron 11 pacientes, 5 de estos con SMD con promedio de edad de 48 y 6 con
LMA promedio de edad de 48,2. Se realizó análisis citogenético convencional, donde se
encontró que el 82% de los pacientes en general presentaron 1, 2 o 3 anormalidades
cromosómicas presentes en el cariotipo, el 60% en SMD y el 67% en LMA. La mayoría
presentaron monosomías (58,9% vs 77,5%), en menor proporción las trisomías (10,7%
vs 2,5%) y rearreglos estructurales (7,1% vs 1,2%). Los resultados para las sondas
evaluadas por FISH fueron negativos para translocaciones como t(8;21) y t(16;16). Se
evidenció que para pacientes con SMD y LMA las monosomías son un factor de riesgo,
dos pacientes murieron por enfermedad primaria, de los cuales dos presentaron pérdida
parcial del cromosoma 11; solo dos pacientes con LMA lograron remisión completa a las
4 semanas uno con monosomía del cromosoma 19 en dos células y otro con cariotipo
normal.
Es de resaltar que la implementación adecuada de estas técnicas citogenéticas
repercute directamente en (1) la confirmación del diagnóstico, (2) la información útil para
la clasificación, la estadificación y el pronóstico, (3) la información para guiar la elección
apropiada de la terapia, y (4) determinación de la remisión o recaída (Micale, 2010).
Palabras clave: SMD, LMA, citogenética, monosomías, trisomías, translocaciones,
FISH
VII Análisis Cromosómico en un grupo pacientes con SMD y LMA
Abstract
The myelodisplastic syndrome (MDS) and the acute myeloid leukemia (AML) are
hematogenous neoplasias characterized by the uncontrolled blast proliferation in the
bone marrow. In these diseases, multiple multipotent medullary stem cell anomalies
are recognized, presenting morphological, karyotypical and molecular disturbances
that induce leukemogenic processes (Catalá, 2012). The objective of this study is to
describe and/or characterize the chromosomal anomalies found in a group of patients
of the National Cancerology Institute (INC) with these pathologies, using
conventional and molecular cytogenetic techniques.
11 patients were analyzed; 5 with MDS with an average age of 47 years; and 6 with
AML and an average age of 47.5 years. Conventional cytogenetics showed that 82%
of all patients had chromosomal anomalies, either 1, 2 or 3; 60% of the anomalies
were found in the MDS group and 67% on AML. Most of them were monosomies
(58,9% vs 77,5%), trysomies were less frequent (10,7% vs 2,5%) and structural
rearrengements (7,1% vs. 1,2%). FISH analyses were negative for translocations
such as t(8;21) and t(16;16). It was found that for patients with MDS and AML the
monosomies were a risk factor, 2 patients died of the primary disease and two of
them had a partial loss of chromosome 11; only two patients with AML achieved
complete remission at 4 weeks, one with chromosome 19 monosomy in two cells and
other with a normal karyotype.
It is important to highlight that the adequate implementation of these techniques and
their analysis has a direct effect on (1) the confirmation of the diagnosis, (2)
classification, staging and prognosis, (3) appropriate therapy choice, and (4)
determining the remission or relapse.
Key words: MDS, AML, FISH, conventional cytogenetics, monosomies, trysomies,
translocations.
Contenido VIII
CONTENIDO
Resumen VILista de figuras XIIILista de tablas XVLista de símbolos y abreviaturas XVIIntroducción 171. OBJETIVOS......................................................................................................21
2. MARCO DE REFERENCIA...............................................................................22
2.1 Hematopoyesis .......................................................................................... 22
2.1.1 Mielopoyesis:......................................................................................... 23
2.2 Enfermedades Hematopoyéticas .............................................................. 25
2.3 Alteraciones Cromosómicas en el Cáncer ...............................................26
2.3.1 Genes Fusión Quiméricos .....................................................................29
Genes Tirosina Quinasa.................................................................................29
Genes Factor de Transcripción ......................................................................30
2.3.2 Desequilibrios Cromosómicos ............................................................... 32
Ganancias Genómicas ...................................................................................33
Ganancias Genómicas a Gran Escala............................................................ 33
Ganancias Genómicas Focales......................................................................33
Pérdidas Genómicas ...................................................................................... 34
Pérdidas Genómicas a Gran Escala............................................................... 35
Pérdidas Genómicas que Afectan Genes No Codificantes ............................. 36
2.4 Síndrome Mielodisplásico (SMD).............................................................. 36
2.4.1 Clasificación .......................................................................................... 38
French-American-British (FAB):......................................................................39
Organización Mundial de la Salud (OMS):...................................................... 40
Clasificación Basada en el Pronóstico............................................................ 41
2.5 Hallazgos Citogenéticos en Síndrome Mielodisplásico (SMD) ...............42
2.5.1 Cariotipo Normal.................................................................................... 43
2.5.2 Pérdida del cromosoma Y .....................................................................43
2.5.3 Deleción del brazo largo del cromosoma 20 del(20q) ............................ 44
IX Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
2.5.4 Rearreglos de cromosoma 5 o del(5q)...................................................44
2.5.5 Monosomía 7......................................................................................... 45
2.5.6 Ganancia del cromosoma 8 (+8) ........................................................... 46
2.5.7 Síndrome 17p-....................................................................................... 47
2.5.8 Rearreglos 3q........................................................................................ 48
2.5.9 Cariotipo Complejo y Monosomal .......................................................... 49
2.5.10 Translocación 11q23 ...........................................................................50
2.5.11 Translocaciones recurrentes raras:...................................................... 51
2.6 Evolución del Cariotipo .............................................................................51
2.7 Leucemia ....................................................................................................53
2.7.1 Mecanismos de Leucemogénesis.......................................................... 54
2.8 Leucemia Mieloide Aguda .........................................................................55
2.8.1 Impacto de la edad en frecuencias de anormalidades cromosómicas ...57
2.8.2 Clasificación .......................................................................................... 58
French-American-British (FAB).......................................................................58
MIC ................................................................................................................60
WHO ..............................................................................................................61
2.9 Pronóstico ..................................................................................................62
2.9.1 LMA DE PRONÓSTICO FAVORABLE ..................................................65
2.9.2 LMA de Pronóstico Intermedio............................................................... 66
2.9.3 LMA de Pronóstico Desfavorable .......................................................... 66
2.9.4 Otros Factores Pronósticos ...................................................................66
2.10 Alteraciones Cromosómicas en LMA ..................................................... 67
2.10.1 LMA con t(8;21)(q22;q22.3) .................................................................67
2.10.2 Inv(16)(p13.1q22.1) o t(16;16)(p13.1;q22.1) ........................................68
2.10.3 t(9;11)(p22;q23) y Otras Translocaciones en las que participa MLL ....68
2.10.3 LMA con t(6;9)(p23;q34.1)...................................................................69
2.10.4 inv(3)(q21.3q26.2) o t(3;3)(q 21.3 ;q 26.2 ) .........................................70
2.10.5 LMA Megacarioblástica con t(1;22)(p13.3;q13.1).................................70
2.11 Tratamiento SMD y LMA ..........................................................................71
2.11.1 Azacitidina ........................................................................................... 72
Contenido X
2.11.2 Citarabina............................................................................................ 72
2.11.3 Tratamiento de Inducción 7+3 ............................................................. 73
2.12 Mecanismos de Diagnóstico ...................................................................73
2.12.1 Citometría de flujo ...............................................................................73
Paneles inmunofenotípicos para el estudio de los síndromesmielodisplásicos: ............................................................................................ 75
Paneles inmunofenotípicos para el estudio de leucemias mieloblásticaaguda: ............................................................................................................76
2.13 Técnicas Citogenéticas ...........................................................................78
2.13.1 Convencional....................................................................................... 78
2.13.2 Molecular............................................................................................. 79
3. METODOLOGÍA ............................................................................................... 89
3.1 Aprobación del estudio .............................................................................89
3.2 Grupo de Casos ......................................................................................... 89
3.2.1 Criterios de Inclusión .............................................................................89
3.2.2 Criterios de Exclusión............................................................................90
3.2.3 Registro de Pacientes ...........................................................................90
3.3 Toma de Muestra de Médula Ósea............................................................ 90
3.4 Toma de Muestra de Sangre Periférica .................................................... 91
3.5 Citometría de Flujo .................................................................................... 91
3.6 Cultivo y Cosecha de Cromosomas Metafásicos a partir de SangrePeriférica y Médula Ósea.................................................................................92
3.6.1 Descripción del Procedimiento. ............................................................. 92
3.7 EVALUACIÓN CITOGENÉTICA .................................................................93
3.7.1 Descripción del Procedimiento. ............................................................. 93
3.8 Hibridación in situ Fluorescente (FISH) ...................................................94
3.9 Hibridación Genómica Comparada (CGH) ...............................................95
3.9.1 Preparación de Metafases Normales - Laminas Blanco para CGH........95
3.9.2 Realización Sonda.................................................................................96
3.9.3 Desnaturalización de la sonda e hibridación de la sonda a la láminaobjetivo o blanco ............................................................................................ 97
3.9.4 Post lavados de la Lámina.....................................................................97
XI Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
3.9.5 Visualización de la Hibridación .............................................................. 98
3.9.6 Evaluación e Interpretación de los Resultados ......................................98
3.9.7 Estandarización y Validación .................................................................99
3.10 Análisis Descriptivo Univariado de los Datos .............................................99
4. RESULTADOS................................................................................................ 100
4.1 Citogenética Convencional .....................................................................103
4.1.1 Síndrome Mielodisplásico....................................................................104
4.1.2 Leucemia Mieloide Aguda.......................................................................114
4.1.2.1 Caracterización Pacientes LMA........................................................ 115
4.1.3Caracterización de Supervivencia ........................................................ 129
4.1.4 Análisis de Regresión Logística........................................................... 129
4.2. Hibridación In Situ Fluorescente ........................................................... 132
4.2.1 Caracterización FISH Pacientes SMD ................................................. 133
4.2.2 Caracterización FISH Pacientes LMA.................................................. 134
4.3 Hibridación Genómica Comparada (CGH) ............................................. 135
4.3.1 Extracción ADN.............................................................................. 135
4.3.2 Digestión con Enzima DpnII ..................................................................136
5. Discusión....................................................................................................141
6. Conclusiones y Recomendaciones .......................................................... 154
Anexo 1. Consentimiento informado para participar en un estudio de investigaciónmédica ................................................................................................................ 156
Anexo 2. Consentimiento informado INC ........................................................ 159
Anexo 3. Formatos ............................................................................................. 163
Anexo 4. Toma de Muestra de Médula Ósea...................................................... 167
Anexo 5. Toma de Muestra Sangre Periférica. ................................................... 168
Anexo 6. Cultivo y Cosecha de Cromosomas Metafásicos a partir de SangrePeriférica y Médula Ósea .................................................................................... 170
Reactivos y Materiales. ................................................................................ 170
Anexo 7. Bandas G ............................................................................................ 171
Reactivos y Materiales ................................................................................. 171
Descripción del Procedimiento. ....................................................................171
Anexo 8. Hibridación in situ Fluorescente (FISH)................................................ 174
Contenido XII
DIA 1: ........................................................................................................... 174
Reactivos y Materiales ................................................................................. 174
Descripción del Procedimiento. ....................................................................174
DIA 2: ........................................................................................................... 175
Anexo 9. Extracción por Cloroformo de Ácido Desoxirribonucleico (ADN) Controlesy Pacientes.......................................................................................................... 176
LISIS DE ERITROCITOS (Lavado de la Muestra) ........................................176
LISIS DE LEUCOCITOS (Digestión de Proteínas) .......................................176
EXTRACCIÓN DE ADN ............................................................................... 177
Anexo 10. Hibridación Genómica Comparada de Alta Resolución (HR-CGH) ....178
Reactivos y Materiales ................................................................................. 178
Anexo 11. Variables........................................................................................... 179
Bibliografía.......................................................................................................185
XIII Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Lista de Gráficas
Gráfica 2 - 1 Representación Esquemática de la Hematopoyesis Normal .............23Gráfica 2 - 2 Anormalidades cromosómicas en cáncer .........................................27Gráfica 2 - 3 Amplificación génica .........................................................................28Gráfica 2 - 4 Tasa de Supervivencia global de los pacientes con LMA según elriesgo citogenética definido por el grupo MRC. Modificado ..................................64Gráfica 2 - 5 Tasa de Detección de anormalidades ...............................................80Gráfica 2 - 6 HR-CGH. Umbrales Fijos y dinámicos. .............................................86Gráfica 3 - 1 Ejemplo sonda AML1/ETO dual fusión.95Gráfica 4 - 1 Diagrama de Barras eje X género, eje Y enfermedad primaria 100Gráfica 4 - 2 Pérdida Material Genético SMD. En el eje X número de células con laalteración y eje Y cromosoma implicado.............................................................. 104Gráfica 4 - 3 Ganancia Material Genético SMD. En el eje X número de células conla alteración y eje Y cromosoma implicado.......................................................... 105Gráfica 4 - 4 Evolución Clonal Paciente 323008................................................. 107Gráfica 4 - 5 Fotos cariotipos 323008 LUCIA 2.8 KARYO ...................................107Gráfica 4 - 6 Evolución Clonal Paciente 640124.................................................. 109Gráfica 4 - 7 . Fotos cariotipos 640124 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 110Gráfica 4 - 8 Evolución Clonal Paciente 191286.................................................. 112Gráfica 4 - 9 Fotos cariotipos 191286 LUCIA 2.8 KARYO ...................................113Gráfica 4 - 10 Pérdida Material Genético LMA. En el eje X número de células conla alteración y eje Y cromosoma implicado.......................................................... 114Gráfica 4 - 11 Ganancia Material Genético LMA. En el eje X número de células conla alteración y eje Y cromosoma implicado.......................................................... 115Gráfica 4 - 12 Evolución Clonal Paciente 607410............................................... 116Gráfica 4 - 13 Fotos cariotipos 607410 LUCIA 2.8 KARYO ............................... 117Gráfica 4 - 14 Paciente 746799 .......................................................................... 119Gráfica 4 - 15 Fotos cariotipos 746799 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 119Gráfica 4 - 16 Paciente 826210 .......................................................................... 121Gráfica 4 - 17 Fotos cariotipos 826210 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 121Gráfica 4 - 18 Fotos cariotipos 212580 LUCIA 2.8 KARYO .................................123Gráfica 4 - 19 Evolución Clonal Paciente 099690............................................... 124Gráfica 4 - 20 Fotos cariotipos 099690 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 125Gráfica 4 - 21 Fotos cariotipos 466066 LUCIA 2.8 KARYO ................................ 127Gráfica 4 - 22 Fotos núcleos y metafases sonda AML1/ETO. LUCIA 2.85 FISH 133Gráfica 4 - 23 Fotos núcleos y metafases sonda CBFß/MYH1. LUCIA 2.85 FISH............................................................................................................................ 133Gráfica 4 - 24 Fotos núcleos y metafases AML1/ETO. LUCIA 2.85 FISH........... 134
Contenido XIV
Gráfica 4 - 25 Fotos núcleos y metafases sonda CBFß/MYH1. LUCIA 2.85 FISH............................................................................................................................ 134Gráfica 4 - 26 Foto digestión enzima DpnII 150-2500 pb....................................136Gráfica 4 - 27 Hibridación Genómica Comparada. LUCIA 2.85 CGH ................. 137Gráfica 4 - 28 CGH intervalos fijos –X. LUCIA 2.85 CGH ...................................138Gráfica 4 - 29 HR-CGH umbrales móviles LUCIA 2.85 CGH............................... 139Gráfica 4 - 30 Interferencia Citoplasma con metafase/sonda.............................. 148Gráfica 4 - 31 Sobredesnaturalización metafase blanco.....................................149Gráfica 4 - 32 Aumento de temperatura en incubación.......................................150Gráfica 4 - 33 Desnaturalización con NaOH........................................................ 150Gráfica 4 - 34 Modificación post lavados ............................................................ 151
XV Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Lista de tablas
Tabla 2 - 1 Clasificación FAB para SMD ............................................................... 39Tabla 2 - 2 Clasificación OMS para SMD(Vardiman JW, Thiele J, 2009)...............41Tabla 2 - 3 Clasificación IPSS. ………………..........................................................43Tabla 2 - 4 Frecuencia anormalidades cromosómicas en estudios de pacientepediátricos vs adultos............................................................................................ 58Tabla 2 - 5 Clasificación FAB. Criterios morfológicos y citoquímicos. .................... 59Tabla 2 - 6 Clasificación MIC. Morfología – Inmunofenotipo – Citogenética…...… 61Tabla 2- 7 Clasificación WHO. Categorías de LMA en función de las anomalíasmoleculares ……………………………………………………………………………..63Tabla 2-8 Grupos de diagnóstico. Diferentes grupos de diagnóstico clasificados poralteraciones cromosómicas ………………………………………………........………64Tabla 2-9. European LeukemiaNet (ELN). (Mroźek et al., 2012). …...………….. 66Tabla 2-10 Cluster de Diferenciación:Marcadores celulares………..………… .…..76Tabla 2 - 11Combinación de anticuerpos: Inmunofenotipificaciónde síndromesmielodisplásicos………………………………………………………………… 78Tabla 2 - 12 Combinación de anticuerpos:inmunofenotipificación de leucemiamieloblástica aguda……………………………………………………………………..80Tabla 4 - 1 Frecuencia absoluta de los datos para las variables degénero/subclasificación para SMD y LMA
…………………………………………………………………………………... 101Tabla 4 - 2 Datos Hematimétricos LMA/SMD………………………………………..102Tabla 4 - 3 Número de anormalidades cromosómicas por enfermedad primaria 103Tabla 4 - 4 Clasificación de Moorman………………………………………… 104Tabla 4 - 5 Consolidado Citogenética Convencional ........................................... 128Tabla 4 - 6 ……………………………………………………………………………….133Tabla 4 - 7 Resultados sondas FISH AML1/ETO y CBFß/MYH11 …………….…132Tabla 4 – 8 Cuantificación ADN ………………………………………………………135Tabla 4 - 9 Controles CGH. LUCIA 2.85 CGH……………………………….………140
Contenido XVI
Lista de Símbolos y abreviaturasAbreviatura TerminoABL1 Tyrosine-protein kinase ABL1add AdiciónAPC Adenomatous polyposis coliARSA Arylsulfatase AATM ATM serine/threonine kinaseBCR Breakpoint cluster regionCBFB Core-binding factor, beta subunitCD38 CD 38 moleculeCGH Hibridación Genomica Comparativadel Delecióndmin Dobles minutosEGFR Epidermal growth factor receptorETV6 Ets variant 6EVI1 MDS1 and EVI1 complex locusFISH Hibridación in situ fluorescenteFLT3 fms-related tyrosine kinase 3GATA-1 GATA binding protein 1 (globin transcription factor 1)HOXA9 Homeobox A9HR-CGH Hibridación Genomica Comparativa de Alta resoluciónHSR Región de tinción Homogeneai IsocromosomaIL Interleukinsinv InversiónLMA Leucemia Mieloide AgudaMIC Myelocytomatosis oncogeneMLL Mixed lineage leukemiaMYH11 Myosin, heavy chain 11, smooth muscleNF1 Neurofibromin 1NPM Nucleophosmin (nucleolar phosphoprotein B23, numatrin)NUP98 Nucleoporin 98kDaPIK3CG Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit
gammaPML Promyelocytic leukemiaPTEN Phosphatase and tensin homologRARA Retinoic acid receptor, alphaRB1 Retinoblastoma 1RBM15 RNA binding motif protein 15RUNX1 Runt-related transcription factor 1SMD Sindrome MielodisplasicoSNP Single Nucleotid Polimorfict TranslocaciónTP53 Tumor protein p53
Introducción 17
Introducción
El Síndrome Mielodisplásico (SMD) y la Leucemia Mieloide Aguda (LMA) son
desordenes clonales caracterizados inicialmente por la ineficiencia en la
hematopoyesis y por presentarse en población de edad avanzada con una media de
edad de 70 años al momento de diagnóstico y por el aumento de riesgo entre los
mayores de 70 años. El SMD tiene una incidencia de 3-5 en 100000 habitantes
(Schlegelberger, Göhring, Thol, & Heuser, 2012); mientras que en LMA la incidencia
aproximada es de 3,4 por 100000 habitantes por año (Morrissette & Bagg, 2011). La
epidemiologia en Colombia frente a estas enfermedades es aún un campo que está
iniciando, ya que la información está clara para leucemias mieloides agudas
pediátricas, más no para las patologías en general que incluirían niños, jóvenes y
adultos. En nuestro país los registros publicados sobre adultos con LMA son escasos
y no se cuenta con la información apropiada y completa sobre el comportamiento
clínico y epidemiológico, lo que dificulta la identificación de los grupos, perfiles de
riesgo, así como el diagnóstico temprano y con esto el tratamiento oportuno que
repercute directamente en el pronóstico de los pacientes (Ministerio de la Protección
Social e Instituto Nacional de Cancerología, 2007).
Las estimaciones de GLOBOCAN para el año 2012 evidencian que las leucemias
presentan una incidencia de 2628 (3,7 %) pacientes y una mortalidad de 1875 (4,9
%) en 100.000 habitantes por año, lo que indica que las leucemias son el noveno
cáncer con mayor frecuencia para el país, después de cánceres como el de próstata,
mama y estómago (http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx). Para
18 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
el año 2012 y según el Instituto Nacional de Salud, el reporte nacional es de 73
pacientes con leucemias mieloides agudas pediátricas. Datos proporcionados por el
Instituto Nacional de Cancerología de Colombia reportaron para el año 2010, 45
casos con leucemia mieloide aguda, de los cuales 19 son hombres y 26 son mujeres
(Instituto Nacional de Cancerología. Anuario Estadístico, 2010).
Es de importancia resaltar que existe una heterogeneidad en el abordaje clínico y
diagnóstico de pacientes con LMA y en las diferentes regiones del país; los
exámenes pronósticos básicos, clínicos y moleculares como son: detección de
cariotipo; marcadores moleculares y evaluación de enfermedad mínima residual
recomendadas por diferentes guías para el abordaje y tratamiento de esta
enfermedad, no se realizan de manera rutinaria en la práctica clínica diaria en
nuestro país (Ministerio de la Protección Social e Instituto Nacional de Cancerología,
2007). En Colombia, la ausencia y la falta de consolidación de este tipo de registros,
no permiten valorar la magnitud y la distribución de la morbilidad de forma adecuada
para las diferentes zonas del país (Díaz, Gordillo, Cruz, & Gálviz, 2011).
El SMD y LMA son enfermedades muy graves que sin administración de tratamiento
su pronóstico es de evolución a leucemia en el caso de SMD y letal en pocas
semanas para LMA. En general, el pronóstico de estas enfermedades varía en
función de parámetros como la edad y principalmente de las características
biológicas propias de las enfermedades. Uno de los factores pronósticos más
importantes para la clasificación en grupos de riesgo tanto para SMD como LMA
(Garcia-Manero et al., 2008; Greenberg et al., 2012; Grimwade et al., 1998;
Kantarjian et al., 2008; Mrózek, Heerema, & Bloomfield, 2004; Slovak et al., 2000)
Introducción 19
son la presencia de anomalías cromosómicas recurrentes que permitan la aclaración
de regiones y posibles genes comprometidos en cada una de las patologías.
La citogenética convencional es el método de elección para la evaluación inicial de
las anomalías cromosómicas en el cariotipo (Ministerio de la Protección Social,
Instituto Nacional de Cancerología, 2005), por tanto, los estudios citogenéticos
convencionales y citogenéticos moleculares como FISH, pueden proporcionar
apoyo clínico en los siguiente ítems: (1) la confirmación del diagnóstico, (2) la
información útil para la clasificación, la estadificación y el pronóstico, (3) la
información para guiar la elección apropiada de la terapia, y (4) determinación de la
remisión o recaída (Micale, 2011).
Se conoce que las alteraciones cromosómicas más frecuentes para estas entidades
a nivel mundial son: t(8;21), anomalías en la región 11q23 (deleciones, duplicaciones
en tándem y translocaciones), inv16 o t(16;16), t(9;22), monosomía del cromosoma
7, alteraciones en el cromosoma 5 (monosomías y deleciones), deleción del brazo
largo del cromosoma 20, trisomía 8 entre otras, que han sido visibles y detectadas
por citogenética convencional (Bandeo G), esta técnica identifica rearreglos y
desequilibrios génicos en un 33% de los casos; mientras que para citogenética
molecular que incluyen FISH y CGH, se detectan alteraciones en un 57% de los
casos, en conjunto las técnicas detectan en general un 75% (McGrattan, 2008).
Cabe resaltar que estos resultados citogenéticos son de relevancia clínica como se
mencionó anteriormente ya que repercutirán directamente en el pronóstico y
evolución de los pacientes, lo que quiere decir, que hasta el momento en el país, se
20 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
ofrece un panorama del 33% sobre el pronóstico y muchas veces en los protocolos
de tratamiento a los pacientes.
Este proyecto caracterizó por citogenética clásica (Bandeo G) y molecular (FISH)
once (11) pacientes con enfermedades hematológicas SMD/LMA remitidos por el
Instituto Nacional de Cancerología (INC), con el fin de describir alteraciones
cromosómicas frecuentes, puntos de ruptura específicos y genes implicados; es de
aclarar, que estas técnicas no se reemplazan una a la otra, si no que por el contrario
son técnicas complementarias que ayudan a esclarecer al médico tratante el
diagnóstico, pronóstico y evolución de la enfermedad. Adicionalmente se evaluaron
las características clínicas de los pacientes incluyendo tasas de remisión,
supervivencia global en relación con el tratamiento brindado y con las alteraciones
cromosómicas halladas (monosomías, trisomías, translocaciones, inversiones e
isocromosomas).
Con estos resultados se quiere evidenciar la necesidad de implementar de manera
adecuada tanto las técnicas como el análisis de las mismas para así refinar la
aplicación de la escala de riesgos citogenéticos ya establecida, fortaleciendo el
enfoque diagnóstico, el factor pronóstico, la respuesta de los pacientes al ciclo de
inducción y la determinación del tratamiento más adecuado en cada paciente.
Objetivos 21
1.OBJETIVOS
1.1 Objetivo General
Analizar cromosómicamente un grupo de pacientes del Instituto Nacional de
Cancerología con Síndrome Mielodisplásico (SMD) y Leucemia Mieloide Aguda
(LMA) mediante técnicas citogenéticas Clásicas y Moleculares.
1.2 Objetivos Específicos
Caracterizar desequilibrios y reordenamientos cromosómicos a una
resolución de 10Mb (citogenética convencional) en un grupo de pacientes
con SMD y LMA
Caracterizar reordenamientos cromosómicos a una resolución de 5 Mb
(FISH) para 2 de los rearreglos más frecuentes asociados a LMA
Identificar microdeleciones y microduplicaciones a una resolución de 2 Mb
(HR-CGH) en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Comparar la sensibilidad y especificidad de las 3 técnicas citogenéticas
empleadas para la detección de anormalidades cromosómicas en un grupo
de pacientes con SMD y LMA
Relacionar los hallazgos citogenéticos con las tasas de remisión de los
pacientes con SMD y LMA del Instituto Nacional de Cancerología.
Marco de Referencia 22
2. MARCO DE REFERENCIA
2.1 Hematopoyesis
La hematopoyesis es un vigoroso proceso, en adultos ocurre primordialmente en
médula ósea (Rodak & Carr, 2012) y es definida como la producción, desarrollo,
diferenciación y maduración de todas las células sanguíneas (Ciesla, 2012). Es un
proceso a través del cual las células troncales hematopoyéticas proliferan y se
diferencian, dando lugar a los distintos tipos de células maduras circulantes. La
hematopoyesis es necesaria para reabastecer las células que mueren con las
nuevas células de la sangre, esta tiene lugar en la médula ósea en donde una
intricada red de células estromales y sus productos, regulan cada una de las etapas
que conducen a la generación de células primitivas, intermedias y maduras (Flores,
Pelayo, & Mayani, 2007). Existen dos linajes principales de diferenciación de las
células sanguíneas, el linfoide y el mieloide. Los progenitores linfoides se diferencian
en los linfocitos B a través de células B precursoras de desarrollo en la médula ósea
o en los linfocitos T a través del desarrollo de precursores de células T en el timo.
Los otros tipos de células de la sangre se desarrollan a través del linaje mieloide
(Gráfica 2-1). Tan pronto como el proceso de diferenciación linfoide o mieloide se
completa, las células maduras son liberadas de la médula ósea o el timo en la
circulación sanguínea (Bellantuono, 2004). El papel clave de las células
hematopoyéticas es el mantenimiento de la homeostasis hematopoyético, la
inmunidad del huésped y la oxigenación de los tejidos.
23 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Gráfica 2-1: Representación Esquemática de la Hematopoyesis Normal. Una
célula madre pluripotente da lugar a células progenitoras comprometidas de los
linajes linfoides y mieloides con la diferenciación de los tipos de células de la sangre
(Camús, & Esteve, 2007).
Gráfica 2 - 1 Representación Esquemática de la Hematopoyesis Normal
2.1.1 Mielopoyesis:
Las células de este grupo surgen en la cavidad médular central. Las células
sanguíneas de linaje mieloide que surgen en otras partes del cuerpo son designadas
como de origen “extra médular”. El sistema mieloide consiste en las siguientes
células: glóbulos rojos (eritrocitos), glóbulos blancos (neutrófilos, monocitos,
eosinófilos, basófilos y linfocitos) y plaquetas (trombocitos). Los neutrófilos,
Marco de Referencia 24
eosinófilos y basófilos han sido llamados en conjunto “granulocitos” debido a que la
presencia y la naturaleza de sus gránulos citoplasmáticos definen su función
(Schmaier & Lazarus, 2012)
Eritrocitos: Son células anucleadas y bicóncavas que empaquetan la
hemoglobina, la proteína que es un vehículo de transporte del oxígeno. Los
eritrocitos se someten a la eritropoyesis por el que maduran a partir de una
célula progenitora temprana. Con su ausencia de núcleo y la flexibilidad de
su membrana es capaz de doblarse para atravesar capilares de 2-3 micras.
El proceso de eritropoyesis toma 4 días para producir el disco con las
características antes mencionadas, la duración de la vida de los glóbulos
rojos es de 120 días (Schmaier & Lazarus, 2012).
Neutrófilos: Contiene un núcleo que es generalmente una estructura
segmentada de 3-4 lóbulos y tarda normalmente 12-13 días para ser
producidos en la médula ósea. Su tiempo de vida en la circulación es de
aproximadamente 12 horas y pueden vivir en los tejidos durante varios días
Sus funciones son las de fagocitar y digerir bacterias, restos celulares y
tejido muerto (Schmaier & Lazarus, 2012).
Monocitos: Son células grandes mononucleares (en forma de riñón) una
vez que atraviesan a los tejidos se pueden diferenciar a macrófagos que
pueden sobrevivir en los tejidos durante periodos largos (hasta 80 días)
(Schmaier & Lazarus, 2012). Los monocitos se especializan en fagocitar
25 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
restos de células muertas, matriz envejecida, cuerpos extraños, bacterias
cubiertas de anticuerpo, células de tumores, entre otros (Welsch, 2008).
Eosinófilos: Generalmente son núcleos bilobulados que aumentan en
reacción a proteínas foráneas y por lo tanto se ven en las infecciones
parasitarias, condiciones alérgicas, el cáncer y ciertos medicamentos.
(Schmaier & Lazarus, 2012).
Basófilos: Poseen actividad fagocitaria y quimiotactica (Miale, 1985), los
basófilos también se caracterizan por contener gránulos de secreción. La
membrana posee receptores específicos para el fragmento Fc de la IgE que
se produce en respuesta a la presencia de alérgenos. (Ross y Pawlina, 200
7).
Plaquetas: Tienen una vida media de 7 a 10 días y sus primeros 1-2 día
s se gastan en el bazo. Desempeñan un papel central en la hemostasis,
también en la inflamación ya que contienen muchos factores de crecimiento
(Schmaier & Lazarus, 2012).
2.2 Enfermedades Hematopoyéticas
Se puede entender pues y según lo mencionado anteriormente que en el proceso
hematológico participan múltiples líneas celulares que permiten la producción de
células sanguíneas de manera controlada. La alteración en la hematopoyesis puede
conducir a situaciones de sobreproducción de las células hematopoyéticas (como
Marco de Referencia 26
las leucemias), o a una producción deficiente de las mismas (como en la anemia
aplásica) (Flores et al., 2007) e incluso la muerte del individuo.
2.3 Alteraciones Cromosómicas en el Cáncer
Entre los rearreglos cromosómicos característicos del cáncer se tienen las
translocaciones reciprocas, inversiones e inserciones. Hay evidencia sustancial de
que estas alteraciones son principios de eventos tumorogénicos. Por otra parte, la
mayoría de los reordeamientos cromosómicos están estrechamente asociados con
tipos de tumores específicos, aunque los genes individuales involucrados como MLL,
ETV6 y NUP98 pueden participar en múltiples y diferentes translocaciones a veces
con asociaciones clínico-patológicas distintas (Mitelman, Johansson, & Mertens,
2007). En particular, ciertos reordenamientos cromosómicos, tales como el gen
fusión BCR-ABL1, sirve como indicadores sensibles en la evaluación de la respuesta
al tratamiento del cáncer (Hughes et al., 2006). Con respecto a sus consecuencias
funcionales, los reordenamientos cromosómicos recurrentes son de dos tipos
generales: (1) aberraciones balanceadas que resultan en la formación de un gen de
fusión quimérico con actividad nueva o alterada, o el rearreglo cromosómico que
conduce a la expresión desregulada de un gen estructuralmente normal (Fröhling &
Hartmut, 2008) (Gráfica 2-2); (2) Los rearreglos cromosómicos involucran ganancias
y pérdidas genómicas. Ganancias genómicas incluyen trisomías completas o
parciales y amplificaciones intracromosomica o extracromosómica (Fröhling &
Hartmut, 2008) pueden ser identificados citogenéticamente como regiones de tinción
homogénea (HSR) y/o dobles minuto (dmin). Las HSR son regiones cromosómicas
que no muestran un patrón típico de bandas y dmin que son cadenas de ADN de
27 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
replicación autónoma de diferentes tamaños y se pueden ver como fragmentos
circulares o acéntricos (Gráfica 2-3)
(http://gmein.uib.es/registro/informacion/investigadores/informacion384.htm
Gráfica 2-2 Anormalidades cromosómicas en cáncer (Fröhling & Hartmut, 2008)
La amplificación génica, es un suceso común en el desarrollo de las neoplasias, que
presumiblemente tiene lugar porque el incremento de la expresión de los genes
amplificados aporta una ventaja selectiva a las células tumorales. Ciertos oncogenes
pueden ser potenciados por amplificación de genes, como son los casos de RAS,
MYC, ERBb, etc. Esto puede tomar parte en el avance de las células tumorales a un
estado de mayor malignidad.
Marco de Referencia 28
Gráfica 2-3: Amplificación génica: Relación dinámica entre las regiones HSR y los
cromosomas doble diminutos (Dmin)
(http://gmein.uib.es/registro/informacion/investigadores/informacion384.htm)
Gráfica 2-3 Amplificación génica.
Las pérdidas genómicas incluyen monosomías y pérdidas a gran escala o
submicroscópicas (Fröhling & Hartmut, 2008). En los años 90 los reordenamientos
cromosómicos se relacionaron principalmente con cánceres hematológicos y
tumores de origen mesenquimal (Rabbitts & Rabbitts, 1994; Rowley, 1998), esto
debido a que debido para tumores sólidos la situación es más compleja por las
múltiples complicaciones que son evidentes desde el crecimiento celular in vitro
hasta el enmascaramiento del análisis citogenético por múltiples cambios complejos
y a menudo la presencia de cariotipos inespecíficos (Fröhling & Hartmut, 2008).
29 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
2.3.1 Genes Fusión Quiméricos
La mayoría de los reordenamientos cromosómicos dan como resultado la formación
de un gen quimérico mediante la fusión de partes de genes implicados en las
rupturas. Dos grupos principales de genes han sido reportados con estas fusiones y
son los encargados de la codificación tirosin quinasa y los que codifican para factores
de transcripción.
Genes Tirosina Quinasa
El ejemplo clásico de una anormalidad citogenética que conduce a la formación de
un gen fusión quimérico es el cromosoma Filadelfia (Nowell & Hungerford, 1960),
un cromosoma truncado 22 que está presente en prácticamente todos los pacientes
con leucemia mieloide crónica (LMC), aproximadamente el 20% de pacientes con
leucemia linfoblástica aguda, y en casos raros en leucemia mieloide aguda. El
cromosoma filadelfia es el resultado de una translocación recíproca,
t(9;22)(q34.1;q11.23) (Rowley, 1973). La proteína quimérica resultante, BCR-ABL1,
contiene el dominio catalítico de ABL1 fusionado a un dominio BCR que es
responsable de la expresión constitutiva de la proteína (Goldman & Melo, 2003).
El descubrimiento del cromosoma Filadelfia y la comprensión de sus bases
moleculares se han tenido consecuencias de gran alcance. En primer lugar, estos
resultados proporcionan evidencia de que el cáncer humano puede surgir de
alteraciones genéticas adquiridas en las células somáticas. Segundo, la señal
aberrante tirosina quinasa en LMC conduce al uso de un inhibidor selectivo tirosina
quinasa, el Mesilato de Imatinib como droga blanco específico (Deininger,
Marco de Referencia 30
Buchdunger, Druker, & Dc, 2012; Druker et al., 2006). Tercero, la presencia de
mutaciones en el dominio quinasa genera resistencia al Imatinib lo que se ha
identificado como una causa importante de recaída durante el tratamiento. Este
hallazgo ha conducido al desarrollo de inhibidores de segunda generación dirigidos
a la quimera de BCR-ABL tales como Dasatinib y Nilotinib (Kantarjian et al., 2006;
Weisberg et al., 2005).
En complemento a la conocida t(9;22)(q34.1;q11.23), nuevas translocaciones se han
reportado formando la proteínas fusión con actividad enzimática tirosina quinasa
constitutiva (Krause & Etten, 2005), y algunas de estas fusiones también confieren
sensibilidad a inhibidores de tirosina quinasa (Chultheis, Ross, & Oldman, 2002;
David et al., 2007). Estas observaciones ponen en manifiesto la gran utilidad del
análisis cromosómico convencional y en especial complementado con técnicas
citogenéticas moleculares como la hibridación fluorescente in situ (FISH) (Ota et al.,
1990), ya que mejora la detección de reordenamientos genómicos, esclareciendo los
puntos de ruptura para guiar el desarrollo de nuevos agentes contra el cáncer, y
servir como base para nuevos tratamientos (Baccarani et al., 2007; Graux et al.,
2004).
Genes Factor de Transcripción
Existen reordenamientos cromosómicos que alteran los genes del factor de
transcripción que pueden resultar en proteínas de fusión con actividad
transcripcional aumentada, aberrante o proteínas fusión que median la represión
trancripcional. El papel funcional de muchos factores de transcripción oncogénicos
ha sido bien caracterizados. Aún así, la inhibición selectiva de actividad
31 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
transcripcional anormal ha demostrado ser un objetivo farmacológico menos
manejable que la inhibición de la actividad tirosina quinasa constitutiva (Fröhling &
Hartmut, 2008)
Los reordenamientos cromosómicos que implican la represión transcripcional
aberrante ocurren en una proporción sustancial en pacientes con leucemia mieloide
aguda (Mrózek, Heerema, & Bloomfield, 2004). Por ejemplo, las proteínas
quiméricas resultantes de la fusión de genes tales como PML-RARA
t(15;17)(q22;q21), RUNX1-RUNX1T1 t(8;21)(q22;q22.3), CBFB-MYH11
inv(16)(p13.11q22.1), RBM15-MKL1 t(1;22)(p13;q13), NUP98-HOXA9 t(7;11)(p15-
p14;p15.5) y MLL-MLLT3 t(9;11)(p22;q23) todas contienen un factor de transcripción
que conserva el motivo de unión al ADN y a una proteína no relacionada que
interactúa con los inhibidores de genes transcripcionales. Como resultado, la unión
de los factores de transcripción quiméricos a sus genes diana, que incluyen genes
necesarios para la diferenciación mieloide normal, causa la represión transcripcional
aberrante, contribuyendo así a la acumulación de células mieloides inmaduras en la
característico de la leucemia mieloide aguda (Licht & Sternberg, 2005).
Los ácidos retinoicos trans y trióxido de arsénico revierten la represión
transcripcional causada por la proteína fusión PML-RARA (Leucemia promielocítica
aguda) al forzar la liberación de inhibidores de la transcripción, de la proteína de
fusión o al estimular la degradación de PML-RARA o ambos, estos dos mecanismos
son muy eficaces en LPA (Sanz, 2006), lo que ha permitido mejorar la evolución
clínica y el pronóstico de la enfermedad. Es así como esta variedad de leucemia
Marco de Referencia 32
paso de ser una de las más agresivas y de peor pronostica por su alta mortalidad, a
ser la leucemia mieloide de más fácil manejo y de mayor porcentaje de curación.
2.3.2 Desequilibrios Cromosómicos
Desequilibrios cromosómicos - ganancias o pérdidas de material genético - puede
variar desde alteraciones que abarcan cromosomas enteros a duplicaciones o
deleciones intragénicas. El determinar las implicaciones de algunas pérdidas o
ganancias cromosómicas donde participa solo un gen ha sido relativamente sencillo,
pero la mayoría de los desequilibrios afectan grandes regiones genómicas que
contienen múltiples genes, y muchos tumores tienen numerosas anomalías
cromosómicas desbalanceadas. Aunque este grado de complejidad genética ha
obstaculizado la delimitación de las funciones individuales de ganancias
cromosómicas o pérdidas en el cáncer, estudios recientes sugieren que la
integración del análisis de todo el genoma, la dosis génica, perfiles de expresión
genética global, y las técnicas de genómica podría identificar genes funcionalmente
relevantes dentro regiones genómicas que son afectadas por desequilibrios
cromosómicos (Kim & Hahn, 2007).
Las Ganancias frecuentes en SMD y LMA están relacionadas con trisomía del
cromosoma 8, amplificación del cromosoma 13 en la banda q12.3 donde se
compromete el gen CDX2 y amplificación del cromosoma 21 banda q22.3 gen ERG.
En cuanto las pérdidas son frecuentes del(5q), del(7q), del(11q), del(20q) donde en
algunos casos no son claros los genes blanco implicados; mientras que para
del(5)(q32) gen implicado RPS14 y del(12)(p13) gen implicado ETV6.
33 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Ganancias Genómicas
La mayoría de las ganancias genómicas recurrentes probablemente contribuyen a
la tumorigénesis mediante el aumento de la actividad de genes específicos en las
regiones cromosómicas afectadas. Algunos de estos genes codifican para proteínas
que pueden ser objetivo específicamente de nuevos agentes anticancerígenos
(Fröhling & Hartmut, 2008)
Ganancias Genómicas a Gran Escala
Las ganancias genómicas comúnmente surgen de la no disyunción cromosómica o
de translocaciones desequilibradas, que causan trisomías cromosómicas completas
o parciales, o de eventos de amplificación que afectan a los segmentos de ADN de
diferentes tamaños (Gráfica 2-2,) (Gráfica2-3). Dado que tales aberraciones
involucran múltiples genes, la identificación de sus objetivos funcionalmente
relevantes ha demostrado ser difícil. Una forma de "filtro" de los genes dentro de las
regiones de ganancia es el número de copias de ADN identificándolo que también
se modifica a nivel de ARN o proteína, en el supuesto de que los genes cuyo
aumento de la dosis se traduce en el aumento de la expresión son más propensos
a estar involucrados en la transformación maligna (Fröhling & Hartmut, 2008).
Ganancias Genómicas Focales
Estas ganancias afectan a las pequeñas regiones genómicas o incluso genes
individuales que se han descrito con menor frecuencia en comparación con grandes
ganancias. Sin embargo, ahora es posible identificar las ganancias focales mediante
el escaneo del genomas del cáncer en cuanto variaciones en el número de copias
del ADN con nuevos métodos de alta resolución, tales como la hibridación genómica
Marco de Referencia 34
comparativa (CGH) y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) genotipo (Fröhling
& Hartmut, 2008). El análisis de los genes que se amplifican de forma recurrente en
los tumores también puede revelar mecanismos patogénicos alternativos que
pueden ser explotadas terapéuticamente como es el caso del receptor EGFR en
pacientes con cáncer de pulmón que está asociado con la respuesta al Gefitinib y
Erlotinib inhibidores de la quinasa (Sharma, Bell, Settleman, & Haber, 2007).
Por el contrario, las ganancias genómicas también pueden subyacer adquiriendo
resistencia a la terapia dirigida contra el cáncer, como se ejemplifica en el
descubrimiento de la amplificación y la sobreexpresión del gen que codifica para el
receptor MET de la tirosina quinasa en la banda 7q31 y que puede restaurar la
transducción de señales aberrante corriente abajo del receptor EGFR en cáncer de
pulmón (Engelman et al., 2007).
Pérdidas Genómicas
El espectro de las pérdidas genómicas oscila entre alteraciones citogenéticamente
visibles, como monosomías cromosómicas completas o parciales, a deleciones en
solo un gen e intragénicas que solo son detectables mediante técnicas que
proporcionan una alta resolución (CGH, SNP o Secuenciación). La mayoría de las
pérdidas genómicas recurrentes probablemente contribuyen a la transformación
maligna mediante la reducción de la función de genes específicos en las regiones
cromosómicas afectadas (Fröhling & Hartmut, 2008).
35 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Pérdidas Genómicas a Gran Escala
Deleciones genómicas extensas que afectan a múltiples genes son frecuentes en
los tumores, lo que hace difícil la identificación y contribución al desarrollo del cáncer.
El enfoque clásico para la identificación de un gen supresor de tumores es comparar
múltiples tumores con una deleción cromosómica específica para determinar la
región genómica mínima que se pierde en todos los casos. Los genes candidatos a
estas regiones se investigan luego por modificaciones en deleciones, mutaciones, o
epigenética que inactivan el alelo restante (Hinds & Weinberg, 1994; Knudson,
2001). Mediante esta estrategia ha sido identificada en importantes genes
supresores tumorales tales como RB1 (banda 13q14.2), TP53 (17p13.1), APC
(5q21-q22), NF1 (17q11.2), PTEN (10q23), y ATM (11q22-q23).
Sin embargo para muchas pérdidas genómicas recurrentes como deleción 1p en
neuroblastoma (Okawa et al., 2008), deleción 3p en cáncer de pulmón (Zabarovsky,
Lerman, & Minna, 2002), y deleción 7q en canceres mieloides (Curtiss et al., 2005;
K. Döhner et al., 1998), los genes críticos son desconocidos. Independientemente
de si los genes de las enfermedades respectivas han sido identificados, algunos
supresores han demostrado ser de gran valor para determinar el pronóstico y
orientar las decisiones de tratamiento, como lo demuestra la deleción del
cromosoma 5q en la leucemia mieloide aguda (Mrózek, Heinonen, & Bloomfield,
2001) clasificada como anormalidad de buen pronóstico; deleciones de los
cromosomas 11q, 13q y 17p en la leucemia linfocítica crónica (H. Döhner et al., 2000)
y leucemia mieloide aguda son clasificadas como pronósticos intermedios y
adversos (Haase et al., 2007), la deleción simultánea de los cromosomas 1p y 19q
en los oligodendrogliomas anaplásicos (Cairncross et al., 2006).
Marco de Referencia 36
Pérdidas Genómicas que Afectan Genes NoCodificantes
Pérdidas cromosómicas asociadas con el cáncer pueden actuar a través de la
inactivación de genes que no codifican para proteínas. Por ejemplo, varias regiones
genómicas que son pérdidas recurrentemente en una variedad de tumores y
contienen genes de microARN (Calin et al., 2004; Zhang et al., 2006). Estos genes
codifican ARNs pequeños implicados en la regulación post-transcripcional de la
expresión génica, existe evidencia creciente de que la pérdida de microRNAs
específicos se relaciona con la actividad supresora tumoral contribuyendo así a la
tumorigénesis (Fröhling & Hartmut, 2008).
2.4 Síndrome Mielodisplásico (SMD)
Es un desorden clonal caracterizado inicialmente por ineficiencia en la
hematopoyesis y subsecuentemente por el desarrollo a leucemia aguda. Citopenias
en sangre periférica en combinación con médula ósea hipercelular exhibe cambios
displásicos y que son el sello distintivo en SMD (Boyiadzis, Frame, Kohler, & Fojo,
2014). Progenitores hematopoyéticos en SMD muestra una disminución en la
diferenciación y una tendencia al aumento de la apoptosis conduciendo a la
inefectividad de la hematopoyesis. Con el tiempo muchos pacientes desarrollan un
aumento de blastos en médula ósea; cerca del 30% desarrolla Leucemia Mieloide
Aguda (LMA) (Ritchie & Lachs, 2009).
37 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
El SMD es una enfermedad que afecta a los ancianos con una edad media de 70
años y una incidencia de 3-5/100000 personas, el riesgo aumenta de >20/100000
entre los mayores de 70 años (Schlegelberger, Göhring, Thol, & Heuser, 2012).
El defecto inicial en la mayoría a de los casos es a nivel de la célula madre mieloide
debido a que células mieloides, eritroides y megacariociticas son las primeras en ser
afectadas. La célula madre anormal puede ser el resultado de efectos acumulativos
a exposición ambiental en individuos susceptibles. La célula madre mutada produce
líneas clónales patológicas que crecen en tamaño a expensas de la población de
células normales, debido a que cada mutación produce un clon único con un defecto
celular especifico (Bernadette, Fritsman, & Keohane, 2012). Mencionan Komrokji y
Bennett en el 2006, que la patogénesis de SMD es bien vista como un proceso
multiple-hit donde se incluyen y contribuyen factores como la predisposición genética
e inmunológica, ambiental y factores iatrogénicos.
La médula ósea de pacientes SMD puede revelar disminución de la maduración
mieloide normal con el aumento de los precursores mieloides pero disminución de
granulocitos maduros. El número de megacariocitos puede ser normal o
aumentados, y hay formas de megacariocitos anormales incluyendo
micromegacariocitos, células con múltiples núcleos dispersos y grandes células
mononucleares o hipogranulares. Neutropenia absoluta se produce hasta en el 50%
de los pacientes con SMD. La trombocitopenia está presente en aproximadamente
el 25-50% de los pacientes con SMD. Trombocitosis es menos común pero se puede
ver en algunos casos con anormalidades 5q- y 3q21q26 (Schmaier & Lazarus, 2012).
Marco de Referencia 38
En 1982 el grupo de estudio cooperativo en leucemias propone terminología y un
conjunto especifico de criterios morfológicos para describir lo que ahora se conoce
como síndromes mielodisplásicos. En 1997 un grupo de la organización mundial de
la salud (OMS) propone una nueva clasificación que incluye criterios inmunológicos,
citogenéticos y moleculares en adición a las características morfológicas (Bernadette
et al., 2012).
2.4.1 Clasificación
Para el Síndrome Mielodisplásico se cuenta con las siguientes clasificaciones
French – American – British (FAB), la de la Organización Mundial de la Salud (OMS)
y la del Sistema Internacional de Puntuación Pronostica (IPSS por sus siglas en
ingles). Cada una de estas clasificaciones tiene limitaciones. Las clasificaciones de
la FAB y la de la OMS no incluyen edad o citogenética y por lo tanto tiene un valor
limitado en la evaluación específica del riesgo del paciente. La de las IPSS son más
completas incluyen el porcentaje de blastos, las alteraciones citogenéticas y número
de citopenias, que permite estimar la supervivencia global y el riesgo de
transformación a LMA basado en la edad del paciente. Debido a que la mayoría de
los pacientes analizados en el estudio original IPSS no habían recibido terapia, IPSS
es actualmente la mejor herramienta para predecir la evolución natural de SMD no
tratado. A pesar de sus ventajas, la clasificación IPSS tiene varias limitaciones, la
más importante es que no identifica a los pacientes con enfermedad de bajo riesgo
(IPSS bajo o intermedio – 1 de riesgo) y pobre pronóstico (Garcia-Manero et al.,
2008).
39 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
French-American-British (FAB): En un esfuerzo por
estandarizar el diagnóstico de SMD, la FAB crea cinco clases de SMD
(Tabla 2-1), cada uno con un específico set de criterios morfológicos.
Las categorías fueron definidas por la cantidad de displasia y número
de blastos en médula ósea. El diagnóstico de leucemia aguda
requiere de al menos el 30% de blastos en la médula ósea
(Bernadette et al., 2012). La clasificación FAB incluye:
Tabla 2 – 1 Clasificación FAB para SMD (Bennett et al., 1982)
Clasificación FAB (1982)
Subclase
Blastos ensangre
periférica
Blastos enmédula
óseaAnemiaRefractaria (AR) < 1% < 5%Anemia refractariacon sideroblastosen anillo (ARSA) < 1% < 5%Anemia refractariacon exceso deblastos (AREB) < 5% 5-20Anemia refractariacon exceso deblastos entransformación(AREB-t) > 5% 21-30 %Leucemiamielomonociticacrónica (LMMC) < 5% 5-20 %
Marco de Referencia 40
Organización Mundial de la Salud (OMS): Esta
clasificación se basa en la FAB. La clasificación de OMS (Tabla 2-2)
confirma su utilidad como un mejor sistema de clasificación pronóstico
y como una herramienta capaz de predecir las respuestas clínicas
(Komrokji & Bennett, 2006). Las modificaciones originales de la
clasificación FAB de SMD incluye una reducción en el porcentaje de
blastos requeridos para el diagnóstico de LMA de 30% a 20% y el
reconocimiento de dos nuevas clasificaciones: citopenia refractaria
con displasia multilinaje y síndrome del (5q) (Bernadette et al., 2012).
Esta clasificación incorpora e interrelaciona morfología, citogenética,
genética molecular y marcadores inmunológicos en un intento de
construir una clasificación aplicable universalmente válida para el
pronóstico.
41 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Tabla 2 - 1 Clasificación OMS para SMD (Vardiman JW, Thiele J, 2009)
Clasificación OMS (2008)
Subclase de SMD Sangre periférica Médula óseaCitopenia refractaria condisplasia unilinaje
Anemia refractaria (AR)Anemia < 1 % deblastos
Displasia eritroide unilineal (en ≥ 10%de las células) < 5% de blastos
Neutropenia Refractaria (NT) Neutropenia< 1 % deblastos
Displasia granulocítica uni-lineal < 5%de blastos
Trombocitopenia refractaria(TR)
Trombocitopenia < 1 %de blastos.
Displasia megacariocítica < 5% deblastos.
Anemia refractaria consideroblastos en anillo (ASA) Anemia; < 1 % de
blastos
Displasia eritroide (de eritrocitos); <5% de blastos;≥15 % de sideroblastosen anillo.
Citopenia refractaria condisplasia multilinaje (CRDM)
Citopenia; < % deblastos; sin blastos deAuer
Displasia multilinea +/- sideroblastosen anillo < 5% de blastos, sinbastones de Auer
Anemia refractaria conexceso de blastos tipo 1AREB-1
Citopenia; < 5 % deblastos; sin bastones deAuer
Displasia mono- o multi-linaje 5-9 %de blastos; sin bastones de Auer.
Anemia refractaria conexceso de blastos tipo 2AREB-2
Citopenia (s) 5%-19%de blastos ± bastonesde Auer
Displasia uni o multilinaje 10%-19%blastos ± bastones de Auer.
SMD asociada con deleciónaislada 5q Del (5q)
Anemia; < 1 % deblastos Plaquetasnormales oaumentadas.
Deleción aislada 5q, Anemia,megacariocitos hipolobulados, <5 %de blastos.
SMD no clasificable MDS-UCitopenias ≤ 1 % deblastos
No se ajusta claramente a otrascategorías de displasia < 5% deblastos; si no hay displasia ni cariotipoasociado a SMD
Clasificación Basada en el Pronóstico
Adicionalmente se han propuesto una variedad de sistemas de clasificación
patológica y de riesgos para predecir la supervivencia general de los pacientes con
SMD a LMA. Los sistemas más importantes de clasificación pronostica es la
International Prognostic Scoring System (IPSS) (Tabla 2-3) revisado como IPSS-R
(Greenberg et al., 2012); WHO Prognostic Scoring System (WPSS) y los MD
Anderson Cancer Center Prognostic Scoring Systems (Garcia-Manero et al., 2008;
Kantarjian et al., 2008). Las variables clínicas evaluadas en estos sistemas
Marco de Referencia 42
incluyeron porcentajes de mieloblastocitos en la sangre y la médula ósea, citopenias
específicas, requisitos de transfusión, edad, nivel funcional y anomalías
citogenéticas en médula ósea.
Tabla2-2. Clasificación IPSS (Greenberg et al., 2012)
Clasificación IPSSSubgruposPronósticos Anormalidad Citogenética
Muy Bueno -Y, del(11q)Bueno Normal, del(5q), del(12p), del(20q), dos incluyendo del(5q)
Intermediodel(7q), +8, +19, i(17q) y otros clones independientes dobleso únicos
Pobre7, inv(3)/t(3q)/del(3q), dos incluyendo 7/del(7q), complejo: 3anormalidades
Muy Pobre Complejo:> 3 anormalidades
2.5 Hallazgos Ciogenéticos en SíndromeMielodisplásico (SMD)
Aproximadamente el 50% de todos los pacientes con SMD primario tienen
alteraciones cromosómicas identificadas citogenéticamente al momento del
diagnóstico.
Sumado a esto, estas alteraciones cromosómicas proporcionan evidencia de la
naturaleza clonal de este desorden siendo importante como indicador pronóstico.
Alteraciones cromosómicas numéricas más frecuentes son trisomía 8, del(5q),
monosomía 7 y del(20q), que se pueden utilizar para caracterizar el clon SMD.
(Boultwood & Wainscoat, 2001).
43 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
2.5.1 Cariotipo Normal
En el SMD, entre el 30 – 60% de los pacientes tienen un cariotipo normal. Este grupo
de pacientes muy probablemente es genéticamente heterogéneo donde por los
factores técnicos complejos característicos de los cultivos in vitro, pudieron haber
impedido la detección de células cromosómicamente anormales o con alteraciones
leucemogénicas a nivel molecular no detectables con los métodos citogenéticos
estándar (Deeg et al., 2013).
No obstante, a pesar de esta heterogeneidad, estos casos son una referencia
estándar para la comparación de los resultados. Los pacientes con un cariotipo
normal entran dentro del grupo de riesgo favorable. La mediana de supervivencia
para estos pacientes es de 3,8 años y el tiempo de progresión a LMA (25%) es del
5.6 años en los pacientes de esta cohorte (Deeg et al., 2013).
2.5.2 Pérdida del cromosoma Y
La significancia clínica y biológica de la pérdida del Y es desconocida, esta ha sido
observada en un número de enfermedades malignas pero también se ha informado
de que es un fenómeno asociado con el envejecimiento (Pierre & Hoagland, 1972).
La pérdida del Y puede ser identificada en el 7.7% de pacientes sin enfermedades
malignas hematológicas y en un 10.7% de pacientes con SMD y por lo tanto su
importancia como marcador de la enfermedad no está claramente definido (Deeg et
al., 2013). Sin embargo Wiktor en el 2000 señala la pérdida del Y como la única
anomalía citogenética en 215 hombres con SMD y se valoró la importancia clínica
de la pérdida del cromosoma Y después de ajustar la edad.
Marco de Referencia 44
2.5.3 Deleción del brazo largo del cromosoma 20
del(20q)
Esta es una anormalidad común en desordenes mieloides malignos. Esta deleción
es vista en aproximadamente 5% de casos con SMD y 7% en casos de SMD en
transformación (Angel, Sanz, & Vallespí, 1998) características clínicas que describen
a pacientes con SMD con del(20) incluye bajo riesgo de la enfermedad (usualmente
AR), baja tasa de progresión a LMA y supervivencia prolongada (Morel et al., 1993).
Morfológicamente, la presencia de la del(20q) es asociada con displasia prominente
en linajes eritroides y megacariocítica (Kurtin et al., 1996). El grupo internacional de
análisis del riesgo SMD evidencia que pacientes con esta deleción se asocian con
la identificación de cariotipos complejos (Greenberg et al., 1997). Estos datos
sugieren que la del(20q) en SMD puede estar asociado con un resultado favorable
cuando aparece como la única anomalía pero con un pronóstico menos favorable en
el contexto de un cariotipo complejo (Deeg et al., 2013).
2.5.4 Rearreglos de cromosoma 5 o del(5q)
En SMD o LMA derivada de NOVO, rearreglos del brazo largo del cromosoma 5 o
deleción -5/del(5q), son observadas en un 10-20% de los pacientes, mientras en
SMD-t/LMA-t es identificada en un 40% de pacientes (Angel et al., 1998; Godley &
Larson., 2008; Smith et al., 2003). Sin embargo deleciones intersticiales son más
comunes. Otros rearreglos tales como translocaciones desbalanceadas también
ocurren. (Deeg et al., 2013). Se sugiere que anormalidades de los cromosoma 5 o 7
pueden ser un marcador de mutagénesis inducida en enfermedades hematológicas
45 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
malignas (West et al., 2000). Cuando los pacientes con SMD primario, presentan
anormalidades del cromosoma 5, conocido como, el síndrome 5q- más común en
RAEB 1, 2 de la clasificación WHO en asociación con un cariotipo complejo, tienen
un pobre pronóstico con temprana progresión a leucemia, resistencia al tratamiento
y corta supervivencia (Deeg et al., 2013).
Los puntos de ruptura reportados en región del 5q son muy variables, pero la región
más crítica está entre 5q31 y 5q33. Varios genes codifican como factores de
crecimiento hematopoyético y receptores que comprenden IL-3, IL-4, IL-5, M-CSF
(CSF-I), GM-CSF y el receptor M-CSF (CSF-1R), están localizados en el brazo largo
del cromosoma 5, por lo que la pérdida de uno o más de estos genes puede ser
crítica y asociada a la patogénesis de SMD (Hirai, 2002). El síndrome es mucho más
común en mujeres que en hombres (mujeres:hombres=3:1) y cuentan con la mayor
incidencia entre los 60 y 65 años de edad (Bernasconi et al., 2006).
2.5.5 Monosomía 7
Monosomía del 7 y -7q son anormalidades más frecuentes en SMD, y son asociadas
con pobre pronóstico en términos de corta supervivencia o evolución leucemogénica.
Esta anormalidad sola es observada aproximadamente en el 5% de pacientes
adultos con SMD y aproximadamente en un 55% de pacientes con SMD en terapia
(Godley & Larson., 2008; Smith et al., 2003). Sin embargo los genes del cromosoma
7 que sean responsables del fenotipo de la enfermedad no están identificados, Hirai
en el 2002 reporta como una región crítica 7q22.1 por la presencia de un potencial
gen supresor tumoral mieloide, PIK3CG. Esta pérdida está asociada con tres
Marco de Referencia 46
situaciones clínicas (1) SMD y LMA de novo, (2) leucemia mieloide asociada con
predisposición constitucional y (3) t-SMD/t-LMA (Deeg et al., 2013).
2.5.6 Ganancia del cromosoma 8 (+8)
La incidencia de ganancia de un cromosoma 8 en SMD es de aproximadamente el
5-10%. Esta anormalidad es observada en todos los subgrupos y varia con la edad,
el género y el pretratamiento con agentes citotóxicos o radiación (Angel et al., 1998;
Greenberg et al., 1997; Paulsson, Säll, Fioretos, Mitelman, & Johansson, 2001). La
presencia de un cromosoma 8 de más ha sido asociado con LMA subtipos M4 y M5
con SMD con un componente monocitico. La media de supervivencia en pacientes
con SMD con trisomía 8 está entre un rango de 25 a 57 meses (Angel et al., 1998).
Para el 2012 Coleman y Ebert señalan esta trisomía como anormalidad
independiente, presente en el 5% de SMD y es asociada con riesgo pronóstico
intermedio con una mediana de supervivencia global de 23 meses (Haase et al.,
2007; Schanz et al., 2012).
La ganancia del cromosoma 8 parece representar un evento tardío en la patogénesis
de SMD, ocurre en progenitores restringidos mieloides y no son fáciles de detectar
en compartimientos de células madre CD34+, CD38-, CD90+ que se cree que
contienen el clon de iniciación de la enfermedad (Nilsson et al., 2002). Progenitores
hematopoyéticos que albergan +8 expresan altos niveles de genes antiapoptóticos
y son resistentes a estimulo apoptótico experimental, sugiriendo un posible
mecanismo de ventaja clonal (Sloand et al., 2007).
47 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
2.5.7 Síndrome 17p-
Pérdida del brazo corto del cromosoma 17 (17p-) ha sido reportado en más del 5%
de los pacientes con SMD. Esta pérdida se puede evidenciar anormalidades,
incluyendo deleciones simples, translocaciones desbalanceadas, rearreglos
dicéntricos (particularmente con el cromosoma 5) o menos a menudo la monosomía
total de 17 o formación del isocromosoma 17q (Johansson, Mertens, & Mitelman,
1993). La deleción 17p está siempre acompañada por otros defectos cromosómicos
y a menudo participan en cariotipos complejos (≥ 3 anormalidades cromosómicas)
(Bernasconi et al., 2006). La mayoría de los pacientes tiene por lo menos dos
rearreglos citogenéticos diferentes (Coleman & Ebert, 2012).
Morfológicamente, el síndrome 17p- es asociado con formas características de
disgranulopoyesis combinada de hipolobulación pseudo-Pelger-Huet y la presencia
de pequeños gránulos en granulocitos. Clínicamente, la enfermedad es agresiva con
resistencia al tratamiento y supervivencia corta. El gen TP53 (p53), un importante
gen supresor tumoral que funciona en la respuesta celular al daño del ADN, es
localizado en la región 17p13.1. En este caso, un alelo de TP53 es típicamente
perdido como resultado de la anormalidad de 17p; una mutación de inactivación en
el segundo alelo restante causa la pérdida total de la función de p53 (Deeg et al.,
2013).
Marco de Referencia 48
2.5.8 Rearreglos 3q
Aproximadamente el 2% de pacientes con SMD tiene rearreglos en 3q, ya sea
inv(3)(q21q26), t(3;5)(q25q34), t(3;3)(q21q26) u otras anormalidades menos
frecuentes. Estos defectos cromosomales son más comunes en pacientes mujeres
jóvenes (edad ≤ 55 años), son frecuentemente asociados con -7/7q- y 5q- y
determina una corta supervivencia y una respuesta pobre a la quimioterapia
(Bernasconi et al., 2006).
Estos pacientes presentan casi siempre un exceso de blastos en la médula y del 30
al 50% de los casos se relaciona con la terapia que es por lo general pobre con
supervivencia corta (Angel et al., 1998).
El gen EVI1 localizado en 3q26 codifica una proteína de unión al ADN dedos de zinc
descrito originalmente como un gen transformante asociado con un sitio común de
inserción viral ecotropico en leucemias mieloides. Los puntos de ruptura
cromosómica 3q26 en t(3;3)(q21q26) ocurren aproximadamente 330 Kb corriente
arriba del gen EVI1 y la inv(3)(q21q26) ocurre corriente abajo del gen EVI1, ambas
situaciones pueden llevar a una inactivación inapropiada que pueda interferir con
diferenciación normal. Este gen puede bloquear la actividad transcripcional de
GATA-1, un factor requerido para la diferenciación eritropoyetica normal en líneas
celulares (Angel et al., 1998).
Se ha demostrado que otros puntos de ruptura como (3q21) presente junto a la t(3;3)
e inv(3) son agrupadas sobre una región de 50 Kb corriente abajo del gen Riboforina
I y puede resultar en la activación transcripcional del gen EVI1 por aumento de los
49 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
elementos asociados con el gen Riboforina I (Suzukawa et al., 1994); Sin embargo
el gen EVI1 es también activado en cerca del 30% de SMD sin necesidad de
presentar rearreglos en 3q y ser prácticamente exclusive de anemias refractarias
con exceso de blastos en transformación (AREB y AREB-T). Por último otro gen
importante y localizado en el mismo punto 3q26 es THPO, distante a EVI1 por cerca
de 600 Kb y no se reordena en translocación o inversión de 3q (Angel et al., 1998),
estos son los 3 posibles genes que se verían alterados en función con rearreglos
cromosómicos como translocaciones o inversiones.
2.5.9 Cariotipo Complejo y Monosomal
Un cariotipo complejo es definido como la participación de 3 o más anormalidades
cromosómicas. La mayoría de casos con cariotipo complejo envuelven
anormalidades cromosómicas desbalanceadas provocando la pérdida o ganancia de
material genético. Los cariotipos complejos son observados en por lo menos el 20%
de los pacientes con SMD primaria y hasta en el 90% de pacientes con SMD-t
(Godley & Larson, 2008; Smith et al., 2003). Las anomalías que involucran los
cromosomas 5, 7 o ambos se identifican en la mayoría de los casos con cariotipos
complejos. En el consenso general un cariotipo complejo conlleva a un pobre
pronóstico (Haase et al., 2007; Malcovati et al., 2007).
Pacientes con cariotipos complejos que presenten más de tres anormalidades
parecen tener un peor pronóstico que aquellas con tres anomalías (Haase et al.,
2007). En el 2008 se introduce la nueva definición de cariotipo monosomal como la
presencia de al menos dos monosomías autosómicas o la presencia de una
monosomía autosómica y al menos una anormalidad estructural, como un factor
Marco de Referencia 50
pronóstico pobre en adultos con LMA (Breems et al., 2008). Existe información
limitada en cuanto la importancia pronostica de un cariotipo monosomal en SMD
(Raza et al., 2011). En una serie de 421 pacientes argentinos, cariotipos con
monosomías autosómicas fueron asociado con una supervivencia media de 16
meses, comparando con la supervivencia media de pacientes con otros pobres
riesgos citogenéticos (Belli et al., 2011).
Otro estudio demuestra en 127 pacientes con cariotipo complejo y que a su vez
tenían cariotipo monosomal tuvieron un peor pronóstico que los pacientes con un
cariotipo complejo sin monosomías. Pacientes con un “cariotipo estructuralmente
complejo” definido como más de o igual a tres aberraciones cromosómicas,
incluyendo al menos una aberración estructural, tenían una probabilidad de
supervivencia muy corta de solo el 14% (Patnaik et al., 2011). Cabe destacar que la
presencia de un “cariotipo estructuralmente complejo” fue un mejor predictor de un
pronóstico muy desfavorable en niños con SMD que la presencia de un cariotipo
monosomal (Schlegelberger et al., 2012).
2.5.10 Translocación 11q23
El gen MLL (Leucemia Linaje Mixto) (también conocido como ALL1, HTRX, HRX)
participa en rearreglos con 71 asociaciones de genes en leucemia (Marschalek,
2011). Otras anormalidades incluyen cariotipo complejo y -7/del(7q), frecuentemente
acompañan la anormalidad 11q23 en SMD primario y SMD-t. No se identificaron
asociaciones con subgrupos FAB, sin embargo AR fue excesivamente
representativa y ARSA insuficientemente representada en comparación con la
mayoría de series de pacientes con SMD. La media de supervivencia fue corta (19
51 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
meses) con transformación a leucemia en al menos el 20% de casos. Las más
comunes translocaciones en las que se involucra esta región fueron
t(9;11)(p22;q23), t(11;19)(q23;p13.1) y t(11;16)(q23;p113.3) (Deeg et al., 2013).
2.5.11 Translocaciones recurrentes raras:
La identificación de genes implicados en anomalías citogenéticas recurrentes ha
sido de gran utilidad en la obtención de conocimientos sobre sus funciones normales
y su papel en la leucemiogénesis (Look, 1997; Rowley, 2000). La consecuencia de
las translocaciones recurrentes es la desregulación de la expresión génica con una
mayor producción de un producto normal de las proteínas o la generación de un gen
fusión y la producción de una proteína fusión. Hasta el momento la mayoría de las
translocaciones recurrentes clonales en desordenes mieloides malignos dan lugar a
proteínas fusión. En SMD, varias de estas translocaciones han sido identificados y
examinados por análisis molecular (Deeg et al., 2013).
2.6 Evolución del Cariotipo
La identificación de nuevas anormalidades en el cariotipo suelen coincidir con un
cambio en el comportamiento de la enfermedad, por lo general a un curso más
agresivo y puede anunciar la incipiente leucemia.
La progresión clonal es un proceso evolutivo en presencia de muchas mutaciones
genéticas que demuestran diversidad en la línea celular y la selección conduce a la
expansión de más de una forma de subclon (Jan & Majeti, 2012) a esto se le
denomina como evolución citogenética definida como la aparición de un clon
Marco de Referencia 52
anormal en el que solo las células normales se han visto anteriormente, o la
progresión de la presencia de un único clon para múltiples relacionados, o de vez en
cuando, clones anormales no relacionados. Los clones anormales pueden
evolucionar adquiriendo anomalías adicionales con la progresión de la enfermedad,
y por lo general resolver con la remisión de la enfermedad después del tratamiento.
En los estudios publicados, la mayoría de los pacientes con SMD mueren de
insuficiencia en médula ósea, cerca de la mitad progresan a leucemia mieloide
aguda y algunos mueren de enfermedades intercurrentes (Deeg et al., 2013)
Así pues la historia natural del SMD se caracteriza generalmente por uno de los tres
escenarios clínicos: (1) un empeoramiento gradual de pancitopenia, donde el
recuento de blastos en médula ósea tiende a estar en aumentando, (2) un curso
clínico relativamente estable seguido de un cambio brusco a una clara
transformación leucémica, y (3) un curso estable a lo largo de muchos años sin
cambio significativo en los conteos de blastos en médula cuando son reevaluados
(Hamblin & Oscier, 1987). En el primer grupo el cariotipo normalmente se mantiene
estable y la progresión a leucemia se basa en el hallazgo relativamente arbitrario de
más del 20% de blastos en médula ósea, haciendo la transición a LMA definido como
un mal evento. En el segundo grupo, un cambio en el cariotipo con la ganancia de
clones secundarios y cariotipos complejos es típico. Tanto el cariotipo como la
enfermedad tienden a permanecer estables en el tercer grupo. Sin embargo, la
evolución del cariotipo en SMD se asocia con la transformación a leucemia aguda
en aproximadamente el 60% de los casos y reducción de la supervivencia, en
particular para aquellos pacientes que evolucionan dentro de un corto periodo de
tiempo (Deeg et al., 2013; Geddes, Bowen, & Jacobs, 1990).
53 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Como se describe anteriormente, muchas de las anormalidades cromosómicas
recurrentes en SMD conducen a la pérdida de material genético. Dichas pérdidas
son las características de genes supresores tumorales, que normalmente funcionan
para controlar el crecimiento celular, la respuesta al daño del ADN y la apoptosis.
Un modelo simple conocido como “doble hit” (Modelo Knudson) implica que un gen
supresor tumoral blanco debe anteceder la pérdida de función de ambos alelos para
que ocurra la expresión del fenotipo maligno (Knudson, 1971). La pérdida de función
de los genes pueden ocurrir por deleciones o pérdidas cromosomales, puntos de
mutación o metilación de elementos regulatorios de los genes (silenciamiento
transcripcional) (Deeg et al., 2013).
2.7 Leucemia
La leucemia es generalmente definida como la proliferación incontrolada o la
expansión de las células hematopoyéticas que no retienen la capacidad de
diferenciarse normalmente a células sanguíneas maduras. De acuerdo con esta
definición, algunos trastornos hematológicos no son estrictamente leucemias porque
muestran sólo una parte del fenotipo leucémico, ya sea la expansión del crecimiento
(síndromes mieloproliferativos, MPS) o el bloqueo de la diferenciación (síndromes
mielodisplásicos, SMD) descrito anteriormente. Sin embargo, ambos pueden
progresar a leucemia aguda y son algunas veces llamados trastornos pre-
leucémicos (Sawyers, Wittet, & Angeles, 1991)
Por lo general, la leucemia se divide en dos clases principales: leucemia aguda y
crónica. La leucemia aguda presenta un cuadro clínico rápido y puede causar la
Marco de Referencia 54
muerte en un período relativamente corto de tiempo. Esta se caracteriza por la
presencia de células muy inmaduras (leucemias blásticas), mientras que la leucemia
crónica generalmente es menos agresiva y un paciente puede vivir con esta
enfermedad durante varios años aún sin tratamiento. La leucemia crónica por su
parte se caracteriza por, al menos inicialmente presentar leucocitos bien maduros
(Benner, et al., 2003). Ambas leucemias tanto aguda como crónica se subdividen en
diferentes categorías dependiendo del tipo de linaje y de células involucradas (Jaffe,
et al., 2001).
El crecimiento excesivo de las células leucémicas, la proliferación descontrolada de
células hematopoyéticas con bloqueo de la diferenciación, puede resultar en un
número reducido de células sanguíneas normales en médula ósea presentando
manifestaciones clínicas como anemia (bajo conteo de glóbulos rojos),
trombocitopenia, neutropenia, lo que conlleva a la fatiga, problemas con la
coagulación de la sangre (por ejemplo, sangrado prolongado y moretones) y las
pancitopénias que dan mayor susceptibilidad a infecciones (Jaffe et al., 2001).
2.7.1 Mecanismos de Leucemogénesis
En la patogénesis de la LMA se han implicado múltiples alteraciones moleculares
que interrumpen procesos celulares diversos, tales como la regulación de la
proliferación, diferenciación, supervivencia, control del ciclo celular, reparación del
ADN y estabilidad de la cromatina. Las anomalías habitualmente observadas son
translocaciones cromosómicas y mutaciones que se evidenció anteriormente y que
pueden producir un aumento de la función del gen implicado, o por el contrario, una
55 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
pérdida o disminución de su función. En otras ocasiones se produce una anomalía
a nivel epigenético, con el resultado del silenciamiento o activación de una
determinada diana celular. Estos eventos moleculares actúan en diferentes etapas,
y pueden sistematizarse en dos grupos complementarios. Un grupo de alteraciones,
conocido como tipo II, que comprende las anomalías que afectan a factores de
transcripción o correguladores, que conllevan un bloqueo de la diferenciación
hematopoyética y/o adquisición aberrante de propiedades de auto-renovación de los
progenitores hematopoyéticos. El otro grupo, tipo I incluye las mutaciones que
activan vías de transducción de señales, lo que resulta en un aumento de la
proliferación y/o supervivencia de los progenitores hematopoyéticos (Fröhling,
Scholl, Gilliland, & Levine, 2005; Hiddemann et al., 2005; Steffen, Müller-Tidow,
Schwäble, Berdel, & Serve, 2005). Estos dos tipos de anomalías moleculares
presentarían una gran interdependencia entre ellos y es frecuente observar la
coexistencia de alteraciones de los dos grupos en un mismo paciente; por el
contrario, raramente parecen coincidir dos alteraciones del mismo tipo en un mismo
caso.
2.8 Leucemia Mieloide Aguda
La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad en la que se produce una
expansión clonal de células neoplásicas de estirpe mieloide denominadas
mieloblastos, cuyo origen radica en la transformación maligna de precursores
hematopoyéticos (Lowenberg, Downing, & Burnett, 1999). La definición de LMA
según la Organización Mundial de la Salud (World Health Organization, WHO)
requiere la presencia de al menos un 20% a 30% de blastos en médula ósea como
Marco de Referencia 56
un umbral mínimo de diagnóstico, cifra que la distingue de los síndromes
mielodisplásicos (SMD), en los que el porcentaje de blastos en médula ósea es
menor del 5% (Cheson et al., 2003; Harris et al., 1999). La LMA comprende, en
realidad, un grupo heterogéneo de enfermedades que se caracterizan por presentar
un bloqueo de la maduración de las células mieloides y un aumento de la
proliferación de las mismas, como consecuencia de diversos eventos moleculares
complementarios (Lowenberg et al., 1999).
LMA es una enfermedad heterogénea que resulta de mutaciones genotípicamente
cooperantes de varios pasos en precursores hematopoyéticos. Mutaciones de Clase
I confieren proliferación y/o ventaja de supervivencia por lo general como
consecuencia de la activación aberrante de las rutas de transducción de señal tal
como mutación en las vías de señalización de tipo fmstirosina quinasa 3 (FLT3) y
RAS. Mutaciones de clase II perjudican la diferenciación hematopoyética
generalmente como resultado de mutaciones en factores de transcripción o co-
activadores importantes para el desarrollo hematopoyético normal. A veces este tipo
de mutaciones incluyen translocaciones cromosómicas causadas por reordenación
de partes entre los cromosomas no homólogos, creando una fusión entre los dos
genes separados de otro modo, y conferir propiedades tales como el deterioro de la
diferenciación o la capacidad proliferativa mejorada. Ejemplos de tales
translocaciones se producen en las leucemias llamadas core- binding factor (CBF)
que implican t(8;21) e inv(16)/t(16; 16). Estos dos cambios dan lugar a mayor número
de células malignas clonales y la supresión de elementos normales (Schmaier &
Lazarus, 2012).
57 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
La Leucemia Mieloide Aguda es más común en población de edad avanzada, con
incidencia aproximadamente de 3,4 por 100000 habitantes año y una mediana de
edad de 70 años al momento del diagnóstico (Morrissette & Bagg, 2011).
Para Colombia se implementó el proyecto GLOBOCAN que tenía como objetivo
proporcionar las estimaciones actuales de incidencia y mortalidad de los principales
tipos de cáncer, a nivel nacional, y para todos los países del mundo. Las
estimaciones GLOBOCAN se presentan para el año 2008 evidencias de una
incidencia para leucemias de 2073 y una mortalidad de 1560 pacientes, lo que indica
que las leucemias son el 9 cáncer con mayor frecuencia para Colombia después de
canceres como el de próstata, mama y útero (http://globocan.iarc.fr/factsheet.asp).
Datos proporcionados por el Instituto Nacional de Cancerología de Colombia reporta
45 casos con leucemia mieloide aguda para el año 2010 de cuales 19 son hombres
y 26 son mujeres (Instituto Nacional de Cancerología. Anuario Estadístico, 2010).
2.8.1 Impacto de la edad en frecuencias deanormalidades cromosómicas
Numerosos estudios muestran que en LMA pediátrica son más frecuentes las
anormalidades cariotípicas que en LMA en adultos (Tabla 2-4). En general, cambios
clonales son encontrados en mayor frecuencia entre un 70-80% en casos infantiles
mientras que para LMA en adultos corresponde a un 50-60%.
Marco de Referencia 58
Tabla 2-3. Frecuencia anormalidades cromosómicas en estudios de paciente
pediátricos vs adultos
LMA pediátrica LMA adultosFrecuencia Referencia Frecuencia Referencia
68% (147/217) Lampert et al., (1991) 52% (631/1213) Byrd et al., (2002)73% (249/340) Grimwade et al.,(1998) 52% (1335/2555) Bacher et al., (2005)73% (211/288) Forestier et al., (2003) 54% (683/1272) Grimwade et al., (1998)76% (560/736) Dusenbery et al., (2003) 55% (653/1192) Sanderson et al., (2006)76% (826/1083) Barbaric et al., (2007) 57% (575/1003) Schnittger et al., (2002)77% (369/478) Raimondi et al., (1999) 59% (728/1225) Schoch et al., (2004)
2.8.2 Clasificación
Existen diversos subtipos de LMA causados por distintos mecanismos patogénicos,
que se traducirán en entidades con un comportamiento clínico y biológico diferente.
En los últimos años el avance en las técnicas diagnósticas ha permitido ampliar de
forma notable el conocimiento de la biología de las leucemias; este hecho queda
reflejado en las sucesivas clasificaciones de la LMA que se han utilizado en las
últimas décadas.
French-American-British (FAB)
La primera de las clasificaciones de las LMA fue la del grupo FAB (Francés-
Americano-Británico). Esta clasificación se basó inicialmente en criterios
morfológicos y citoquímicos, identificando el equivalente leucémico de las células
mieloides para cada estadio de diferenciación. Inicialmente se definieron 6
categorías M1 y M6 (Flandrin et al., 1976) pero en revisiones posteriores se
59 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
añadieron las definiciones de los subtipos M0 y M7 al incorporar criterios
inmunológicos (Bennett et al., 1989) (Tabla 2.5).
Tabla 2-4. Clasificación FAB. Criterios morfológicos y citoquímicos (Flandrin et al.,
1976)
Clasificación FABComportamiento
CitoquímicoSubtipoFAB
Denominación % deCasos
MPO/NS EsterasasInespecíficas
M0 LMA con diferenciaciónmínima
< 5 - -**
M1 LMA sin maduración 15 – 20 + -M2 LMA con maduración 15 -25 + -M3 Leucemia aguda
promielocítica5 – 10 + -
M4 Leucemia agudamielomonocítica
20 + +
M4 Eo Leucemia agudamielomonocítica coneosinofília
5 – 10 + +
M5 Leucemia aguda monocítica 10 – 20 - +M6 Eritroleucemia 3 – 5 + -M7* Leucemia aguda
megalocarioblástica< 5 - +†
Nota: MPO: Mieloperoxidasa. NS: Negro Sudán.*Subtipos definidos posteriormente incorporando criterios inmunológicos.**Las células son positivas para algún antígeno mieloide por inmunofenotipo.†Las células son positivas para a-naftil-butirato-esterasa.
Marco de Referencia 60
MIC
La clasificación MIC (morphology– immunophenotype - cytogenetics) fue posterior e
integra a los subtipos FAB, los datos morfológicos – citoquímicos, el inmunofenotipo
y la citogenética (tabla 2.6) (Hage- & Group, 1988)
Tabla 2-5.Clasificación MIC. Morfología – Inmunofenotipo – Citogenética (Hage- &
Group, 1988).
Clasificación MIC
Anomalía cromosómica FAB Frecuencia Genes implicados
t(8;21)(q22;q22) M2 ̴ 5 – 10% AML1-ETOt(15;17)(q22;q21) M3 ̴ 10 – 15% PML-RARa
inv(16)/t(16;16) M4 ̴ 5 – 10% CBFB-MYH11
Anomalías 11q23 M4/M5 ̴ 5 – 10% MLL
-t(9;11)(p21-22;q23) M5 ̴ 5 – 10% AF9-MLL
-t(11;19)(q23;p13.1) MLL-ELL
-t(11;19)(q23;p13.3) MLL-ENL
-Otras
t(6;9)(q23;q34) M2/M4 ̴ 1% ▫EK-CAN
t(8;16)(p11;p13) M4/M5 < 1% MOZ-CBP
Anomalías en 3q26
-inv(3)(q21;q26)/t(3;3) M4 3 -5% EVI1
-t(3;21)(q26;q22) 1% EVI1-AML1
-t(1;3)(p36;q21) < 1% EVI1
t(9;22)(q34;q11) M1 3% BCR-ABL
t(1;2)(p13;q13) M7 < 1% OTT-MAL
61 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
WHO
La clasificación de la organización mundial de la salud (WHO) es la más reciente y
define las principales categorías de LMA en función de las anomalías moleculares
subyacentes. Además, esta clasificación ha aportado el reconocimiento de nuevas
subentidades como la LMA con displasia multilínea (LMA-DM), o la consideración de
los antecedentes de hemopatía previa o de exposición a leucemógenos que definen
la leucemia como secundaria (Harris et al., 1999; Vardiman, Harris, & Brunning,
2002) (Tabla 2.7). De esta manera, esta clasificación estratifica las LMA en cuatro
grupos principales: el primero lo constituye aquellos subtipos con anomalías
citogenéticas y moleculares recurrentes, como las LMA con t(15;17), la inv(16) y las
anomalías de cromosoma 11 en la zona 11q23, afectando el gen leucemia linfoide
mieloide o leucemia de linaje mixto (MLL). Por otro lado se define la LMA-DM, ya
sea secundaria y SMD/SMPC previo. Se reconoce un tercer grupo de leucemias
secundarias a tratamientos químicos o radioterápeuticos. El resto de pacientes no
definidos en las categorías descritas son clasificados según su estirpe y el grado de
diferenciación de los blastos (Vardiman JW, Thiele J, 2009).
Marco de Referencia 62
Tabla 2-6. Clasificación WHO. Categorías de LMA en función de las anomalías
moleculares (Vardiman JW, Thiele J, 2009)
Clasificación WHO
LMA con anomalías genéticas recurrentes*
LMA con t(8;21)(q22;q22), (RUNX1-RUNX1T1 o AML1-ETO) LMA con eosinófilos anormales en médula ósea e inv(16)(p13;q22) o
t(16;16)(p13;q22), (CBFβ-MYH11) Leucemia promielocítica aguda con t(15;17)(q22;q12), (PML-RARα) y
variantes LMA con anomalías en 11q23 (MLL)
LMA con displasia multilínea
Relacionados con tratamientos alquilantes / radiaciones ionizantes Relacionados con inhibidores de la topoisomerasa II Otros
LMA no clasificable por los criterios anteriores
LMA mínimamente diferenciada (FAB M0) LMA sin maduración (FAB M1) LMA con maduración (FAB M2) Leucemia aguda mielomonocítica (FAB M4) Leucemia aguda monoblástica y monocítica (FAB M5a y M5b) Leucemia aguda eritroide (eritroide/mieloide y eritroleucemia pura) (FAB M6a
y M6b) Leucemia aguda megacarioblástica (FAB M7) LMA/trastorno mieloproliferativo transitorio en el síndrome de down Leucemia aguda de basófilos Panmielosis aguda con mielofibrosis Sarcoma mieloide Leucemias agudas de linaje ambiguo
2.9 Pronóstico
La LMA es una enfermedad muy grave y sin la administración de tratamiento su
pronóstico es letal en pocas semanas. Sin embargo, el uso de tratamientos
intensivos ha permitido que hasta una tercera parte de los pacientes adultos con
LMA se curen de su enfermedad. En general, el pronóstico de la LMA varía en
63 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
función de diversos parámetros como la edad y principalmente las características
biológicas de la propia enfermedad que se describieron anteriormente.
Más de la mitad de los pacientes adultos con LMA presentan aberraciones
cromosómicas recurrentes, como translocaciones reciprocas, inversiones,
deleciones, trisomías y monosomías. Por citogenética se distinguen tres grupos
diferentes de pronósticos: favorable, intermedio y desfavorable (Calgb et al., 2002;
Grimwade et al., 1998; Slovak et al., 2000) (Tabla 2-8).
Tabla 2-7.Grupos de diagnóstico. Diferentes grupos de diagnóstico clasificados por
alteraciones cromosómicas (Camús & Esteve, 2007).
Riesgo MRC SWOG/ECOG CALGB*
Favorable t(8;21) t(8;21) t(8;21)
inv(16)/t(16;16) inv(16)/t(16;16)/del(16q) inv(16)/t(16;16)t(15;17) t(15;17) **
del(9q)***Intermedio Cariotipo normal Cariotipo normal Cariotipo normal
+8 +8del(7q) del(7q)
-Y -YAnomalías 11q23 t(9;11)
del(11q)+11
del(12p) Anomalías 12p+21 +21+22 +6 +13
del(9q) del(5q)Otras anomalías del(20q)
del(9q)***Desfavorable Anomalías 3q Anomalías 3q inv(3)/t(3;3)
-7 -7/del(7q) -7-5/del(5q) -5/del(5q)Complejo Complejo Complejo
Marco de Referencia 64
t(6;9) t(6;9)Anomalías 11q t(11;19)
t(6;11)t(9;22) +8Anomalías 9qAnomalías 17pAnomalías 20qAnomalías 21q
Cada uno de estos grupos de diagnóstico tiene diferencias en cuanto a la tasa de
remisión completas (RC) y supervivencia global (SG) (Gráfica 2.4).
Gráfica 2 - 4 Tasa de Supervivencia global de los pacientes con LMA según el
riesgo citogenética definido por el grupo MRC. Modificado (Grimwade et al., 1998).
Las guías en línea llamadas International European LeukemiaNet (ELN) permiten
evaluar la evolución y la significación del pronóstico con relación a las alteraciones
genéticas que se presente (Mroźek et al., 2012).
65 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Tabla 2-9. European LeukemiaNet (ELN). (Mroźek et al., 2012).
European LeukemiaNet (ELN)Grupo Genético Subset
FAVORABLE
t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1 inv(16)(p13.1q22) ot(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11Mutación NPM1 sin FLT3-ITD (cariotipo normal)Mutación CEBPA (cariotipo normal)
INTERMEDIO I
Mutación NPM1 sin FLT3-ITD (cariotipo normal)Wild-type NPM1 y FLT3-ITD (cariotipo normal)Wild-type NPM1 sin FLT3-ITD (cariotipo normal)t(9;11)(p22;q23);
INTERMEDIO II
t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLLAnormalidades citogenéticas no clasificadas comofavorable o adversas.
ADVERSO
inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214 t(v;11)(v;q23); MLLAlteraciones –5 or del(5q) –7Cariotipos Complejos
Cariotipo Complejo definido como tres o más anormalidades
(ISCN, 2013)
2.9.1 LMA DE PRONÓSTICO FAVORABLE
El grupo de LMA consideradas de buen pronóstico incluye la LPA y las leucemias
con translocaciones que involucran al core- binding factor (CBF). Las leucemias CBF
(LMA-CBF) están constituidas por la LMA con translocación t(8;21)(q22;q22) y la
LMA con inv(16)(p13;q22) o más raramente t(16;16)(p13;q22). En estas leucemias
se hallan involucradas alguna de las dos subunidades, alfa y beta, respectivamente,
del CBF un factor de transcripción fundamental en la regulación de la hematopoyesis
normal (Steffen et al., 2005). Globalmente, este subgrupo de leucemias (LPA y LMA-
Marco de Referencia 66
CBF) presentan una supervivencia a largo plazo superior al 64% (Grimwade et al.,
2001).
2.9.2 LMA de Pronóstico Intermedio
El amplio conjunto de leucemias que integran el grupo de pronóstico intermedio, con
una supervivencia de alrededor del 30-41% con los protocolos terapéuticos
actualmente empleados, es heterogéneo. En el se incluye tanto los casos con
citogenética normal como aquellos que presentan +8, del(7q), anomalías 11q23,
+21, +22, del(9q) junto a otras anomalías (Mroźek et al., 2012).
2.9.3 LMA de Pronóstico Desfavorable
La presencia de un cariotipo complejo, la deleción o monosomía de los cromosomas
5 y/o 7 y las anomalías de cromosoma 3q definen un grupo de LMA de pronóstico
desfavorable. En este grupo de leucemias se caracterizan por una pobre respuesta
a la quimioterapia y un alto riesgo de residual, lo que se traduce en una supervivencia
inferior al 20% (Grimwade et al., 1998).
2.9.4 Otros Factores Pronósticos
Se ha sugerido un valor pronóstico para diferentes anomalías biológicas como la
leucocitosis, la presencia de proteínas transportadoras transmembrana que
confieren una resistencia al tratamiento o las mutaciones o sobreexpresión de genes
específicos como FLT3 (Kiyoi et al., 1999; Kottaridis et al., 2001; Thiede et al., 2001),
nucleofosmina (NPM) (Fröhling et al., 2005; Preudhomme et al., 2002; Valk et al.,
2004), EVI1 (Valk et al., 2004), c-KIT (Care et al., 2003; Paschka et al., 2006),
67 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
BAALC (Baldus et al., 2006), ERG (Marcucci et al., 2005) o BCL2-BAX (Köhler et al.,
2002).
2.10 Alteraciones Cromosómicas en LMA
2.10.1 LMA con t(8;21)(q22;q22.3)
Esta representa una de los core binding factor (CBF) en leucemias mieloides, afecta
a aproximadamente el 8-10% de los pacientes con LMA, principalmente adultos
(Paschka, 2008). La t(8;21) conduce a una fusión de RUNX1- RUNXT1
(anteriormente AML1-ETO) y generalmente se asocia con un pronóstico favorable
(Perea et al., 2006; Peterson & Zhang, 2004). Esta particular LMA es también
conocida como LMA con maduración y como subtipo M2 de acuerdo a la clasificación
FAB (Klaus et al., 2004). Con menor frecuencia t(8;21) puede ser visto también en
LMMA (FAB M4) y relacionada con la terapia SMD/LMA (Meloni-ehrig, 2013).
Variantes de la translocación, que usualmente afectan un tercer cromosoma, han
sido reportado en el 3% de los casos (Bae et al., 2010; Kelly, Meloni-Ehrig, Manley,
& Altura, 2009; Udayakumar, Alkindi, Pathare, & Raeburn, 2008). La presencia de
anormalidades adicionales es común (aproximadamente el 70% de los casos), la
anormalidad adicional más frecuente es la pérdida de un cromosoma sexual (Y en
los hombres), seguido de del(9q), del(7q), 8, y/o 21, aunque la mayoría de estas
anomalías adicionales no parecen afectar el pronóstico favorable asociado con
t(8;21), la ganancia del cromosoma 6 se observa también y algunos informes e
indican una evolución de la enfermedad con pronóstico menos favorable cuando la
trisomía 6 es parte del cariotipo (Choi et al., 2010; Kelly et al., 2009).
Independientemente de la presencia o la ausencia de anormalidades adicionales,
Marco de Referencia 68
los pacientes presentan una buena respuesta a la quimioterapia junto con una alta
tasa de remisión completa y la supervivencia libre de enfermedad. Sin embargo, el
resultado de pronóstico favorable es sin excepción alterado por la presencia de
mutaciones de KIT (Lück et al., 2010; Monma et al., 2007).
2.10.2 Inv(16)(p13.1q22.1) o t(16;16)(p13.1;q22.1)
La característica de esta LMA es la presencia de blastos mielomonociticos y
eosinófilos atípicos. También conocida como LMA M4Eo de acuerdo a la
clasificación FAB constituye un 7–10% de los casos con LMA y es generalmente
asociada con un pronóstico favorable (Paschka, 2008). Los adultos son más
frecuentemente afectados que los niños. El sello distintivo de esta LMA es la
inv(16)(p13.1q22.1) o con menos frecuencia la t(16;16)(p13.1;q22.1). Esta
anormalidad conduce a la fusión de MYH11 en 16p13.1 con CBFB en 16q22.1
(Hernández et al., 2000). Anormalidades cromosómicas adicionales a inv(16) o
t(16;16) son detectadas en aproximadamente 30% de los casos (Appelbaum et al.,
2006), el más común es el +22, que se considera una pista por muchos
citogenetistas, en particular cuando la presencia de inv(16) o t(16; 16) no es obvia.
Otras anomalías cromosómicas adicionales incluyen 8, del(7q), y/o 21 (Lück et al.,
2010).
2.10.3 t(9;11)(p22;q23) y Otras Translocaciones en lasque participa MLL
Esta translocación conduce a la fusión de MLLT3 en 9p22 con MLL en 11q23 y se
encuentra en AML con un fenotipo monocítica o mielomonocítica, la falta de
69 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
expresión de CD34, y las mutaciones RAS frecuentes (DiMartino & Cleary, 1999).
Esta es la translocación más común relacionada con MLL (Swerdllow, S. H, 2008).
Entre aproximadamente 85 translocaciones conocidas implicando el gen MLL,
t(9;11) se cree que están asociadas con un de mejor pronóstico (Rubnitz et al.,
2002). Con citogenética convencional, translocaciones del gen MLL están
usualmente presentes en todas o casi todas las metafases analizadas. Anomalías
adicionales pueden ser vistas, y las más comunes son la pérdida de un cromosoma
sexual (-Y en los hombres) y +8 (Swansbury, Slater, Bain, Moorman, & Secker-
Walker, 1998). Otra translocación MLL frecuente es la t(11;19) con variantes en
puntos de ruptura en el cromosoma 19, específicamente, el punto de corte es en
19p13.1 (ELL) y se observa principalmente en los adultos, mientras que el punto de
corte en 19p13.3 (MLLT1) es típica de LMA infantil (Biggerstaff et al., 2006). Se han
observado dos translocaciones recurrentes que afectan a los cromosomas 10 y 11,
la más común consiste en el gen MLLT10 en 10p12.3 y la fusión con MLL es a
menudo el resultado de una inserción invertida de un segmento variante del
cromosoma 11 que contiene la porción 3´ del gen MLL en el brazo corto del
cromosoma 10 en lugar de una translocación recíproca (Stasevich et al., 2006). La
otra es la t(10;11)(q21.3;q23) con fusión TET1 con MLL.
2.10.3 LMA con t(6;9)(p23;q34.1)
Es una translocación rara que da como resultado la fusión de los genes DEK en
6p23 con NUP214 en 9q34.1. La t(6;9) es probablemente la anormalidad más
frecuente y está asociada con basofilia y se ha visto tanto en pacientes pediátricos
como adultos (Oancea, Rüster, Henschler, Puccetti, & Ruthardt, 2010). En la
Marco de Referencia 70
mayoría de los casos, esta anormalidad está presente como único cambio, pero
también puede ser vista en cariotipos complejos particularmente junto con ganancias
de cromosomas 8, 13 y/o 21 (Chi, Lindgren, Quigley, & Gaitonde, 2008).
2.10.4 inv(3)(q21.3q26.2) o t(3;3)(q21.3;q26.2 )
Estas dos anomalías tienen en común la participación de dos genes asociados con
un resultado de pronóstico desfavorable. RPN1 en 3q21.3 y MECOM (EVI1) en
3q26.2 (Fonatsch, C, 1994). Hay otros reordenamientos equilibradas y
desequilibradas que implican estas dos regiones, incluyendo 1p36, 2p15, 3p12,
3p24, 3q23, 5q31.2, 5q34, 7q21, 8q24, 11p15, 12p13, 12q21, 17q22, 18q11, y
21q22.3. (Martinelli et al., 2003; Morishita et al., 1992). Las anormalidades
adicionales más comunes se acompañan de rearreglo -7 y con menos frecuencia
del(5q) (Igarashi et al., 1998).
2.10.5 LMA Megacarioblástica con t(1;22)(p13.3;q13.1)
Leucemia megacarioblástica aguda (FAB M7) es una neoplasia de células madre
clonal que constituye alrededor del 3-15% de todos los casos de LMA (Dastugue et
al., 2002). Este subtipo de leucemia es vista más en niños con una edad media entre
1 y 8 años (Dastugue et al., 2002; Oki et al., 2014). Los rearreglos más comunes que
participan o acompañan esta anormalidad son 3q21.3 and 3q26.2. Adicionalmente
la anormalidad cromosómica incluye −5/del(5q), −7/del(7q), y +8 (Dastugue et al.,
2002), esta t(1;22) no ha sido vista en adultos.
71 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
2.11 Tratamiento SMD y LMA
En el momento del diagnóstico, la mayor parte de los SMD se presentan en lo que
se conoce como formas de bajo riesgo (baja probabilidad de evolución a LMA y una
supervivencia esperada superior a 30 meses). El problema más habitual en estos
pacientes es la presencia de anemia, presente en un 90% de los casos (Bennett et
al., 1982).
El Tratamiento de pacientes con SMD de bajo riesgo a diferencia de los de alto riesgo
en general está destinado a modificar la historia natural de la enfermedad y a
prolongar la supervivencia global (SG) que de otra forma estaría claramente
reducida en relación con la esperanza de vida de los pacientes. Para pacientes con
SMD de bajo riesgo el objetivo terapéutico es mejorar las citopenias y la
sintomatología de los pacientes, en especial la anemia. Además esta se ha asociado
a mayor mortalidad (Malcovati et al., 2005), de modo que su corrección podría
suponer una mejoría de la supervivencia (Itzykson et al., 2012).
Los cambios epigenéticos constituyen uno de los fenómenos más importantes en
SMD. La hipermetilación en algunas zonas del genoma, induciría cambios
transcripcionales. Existen 2 drogas hipometilantes aprobadas por la FDA (Food and
Drug Administration) y por ANMAT: Azacitidina (AZA) y Decitabina (DAC)
(Silverman, 2001). Ambas inhiben la ADN metiltransferasa induciendo de esta forma
hipometilación.
Marco de Referencia 72
2.11.1 Azacitidina
Se cree que la Azacitidina ejerce sus efectos antineoplásicos mediante diversos
mecanismos, que incluyen citotoxicidad sobre las células hematopoyéticas
anormales en la médula ósea e hipometilación del ADN (Andalucía, 2009). Los
efectos citotóxicos de la Azacitidina pueden deberse a diversos mecanismos, que
incluyen la inhibición del ADN, el ARN y la síntesis de proteínas, la incorporación en
el ARN y en el ADN, y la activación de las vías que causan daño en el ADN. Las
células no proliferativas son relativamente insensibles a la Azacitidina. La
incorporación de Azacitidina en el ADN produce la inhibición de las ADN
metiltransferasas, lo que lleva a la hipometilación del ADN. La hipometilación del
ADN da genes metilados aberrantes. Estos genes intervienen en las vías de
regulación normal del ciclo celular, diferenciación y muerte pudiendo producir la re-
expresión de genes y el restablecimiento de funciones supresoras del cáncer en las
células cancerosas. No se ha establecido la importancia relativa de la hipometilación
del ADN frente a la citotoxicidad u otras actividades de la Azacitidina con los
desenlaces clínicos (Iastrebner, Flores, & Benasayag, 2009).
2.11.2 Citarabina
La Citarabina se ha empleado en el tratamiento de LMA por aproximadamente 40
años (Chalmers, 1988) es un agente antineoplásico específico de una fase del ciclo
celular, que afecta sólo a las células durante la fase S de la división celular. En el
interior de la célula, Citarabina es convertida en Citarabina-5-trifosfato (ara-CTP),
que es el metabolito activo. El mecanismo de acción no está comprendido
73 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
totalmente, pero parece ser que el ara-CTP actúa fundamentalmente a través de la
inhibición de la síntesis de ADN. La incorporación al ADN y al ARN puede contribuir
también a la toxicidad de Citarabina.
2.11.3 Tratamiento de Inducción 7+3
La Citarabina (arabinosido de citosina: Ara-C) es el principal citostático utilizado en
la quimioterapia de inducción a la remisión. Las dosis de Citarabina son de 100-200
mg/m2, por vía intravenosa y en infusión continua durante 7 días. A ésta se añade
una Antraciclina: la Daunorubicina a dosis de 30-60 mg/m2 o la Idarubicina
(Lowenberg, Downing, & Burnett, 1972) 12 mg/m2, por vía intravenosa los primeros
3 días, siguiendo el acrónimo 7+3 (Sala, Blanco, & Perez, 2002).
2.12 Mecanismos de Diagnóstico
2.12.1 Citometría de flujo
Es invaluable en el diagnóstico y clasificación de neoplasias hematológicas,
determina el pronóstico y monitorea la respuesta a la terapia (Jaffe, Harris,
Vardiman, Campo, & Arber, 2011). Una técnica que mide las características físicas,
propiedades químicas, fenotipo de células y define el estado de maduración celular.
Esta metodología utiliza principios de la dispersión de luz, excitación de la luz y
emisión de fluorocromo para generar datos específicos de células o partículas. Los
datos obtenidos permiten la medición de a cantidad, el tamaño, la morfología y la
estructura interna y externa de las células en cuestión. Estas aplicaciones se utilizan
para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la enfermedad. Las señales
Marco de Referencia 74
fluorescentes emitidas por los colorantes que se unen a los anticuerpos
monoclonales específicos tienen muchas aplicaciones en el diagnóstico de
neoplasias malignas hematológicas (Tabla 2-10), como lo son
inmunofenotipificación, diagnóstico y estadificación, análisis de contenido de ADN y
RNA y estudio enzimático (Ciesla, 2012).
Tabla 2-10. Cluster de Diferenciación: Marcadores celulares (Ciesla, 2012)
Cluster de DiferenciaciónInmaduroCD34 Células MadreCD38 HematopoyéticasCD117 Células MadreTdT Precursores linfoidesHLA-DR HematopoyéticasCélulas BCD10 Precursores BCD19 Precursores y maduración BCD20 Activación de células B
CD22Activación citoplasmática concélulas B
Kappa Receptor Fc con células BLambdaFMC7 Células BCélulas TCD2 TempranaCD3 Pan-células TCD4 Subconjunto de células TCD5 Células TCD7 TempranaCD8 Células TCD56 Subconjunto de células TMegacariocitosCD31CD41 GP IIb/IiaCD42CD61 GP IIb/IiaGranulocitosCD13 Pan mieloideCD33 Pan mieloideCD15 PromielocíticaCD11b Mielocito
75 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
MPO MieloideMonocitoCD11B Granulocitos y monocitosCD13 Monocitos tempranosCD14 Monocitos maduradosCD33 Granulocitos y monocitosHLA-DR Monocitos madurados
CD, Designación cluster; GP, glicoproteinas; HLA,Antígeno leucocitario humano; MPO,Mieloperoxidasa; TdT, Desoxinucleotidil transferasaterminal
Paneles inmunofenotípicos para el estudio delos síndromes mielodisplásicos:
Es útil para el diagnóstico de la enfermedad y su diferenciación respecto a las
citopenias de otro origen o monocitosis reactivas, especialmente en Citopenias
ideopáticas; además contribuye a la identificación y caracterización fenotípica de
subgrupos específicos de SMD (Saavedra et al., 2010).
Los estudios inmunofenotípicos de síndromes mielodisplásicos mediante citometría
de flujo han reportado diferentes alteraciones en la médula ósea, que incluyen patrón
es alterados de tamaño y complejidad de los mieloblastos y otras subpoblaciones
celulares, aberraciones fenotípicas (aumento o disminución de la expresión
antigénica, pérdida de expresión de antígenos, infidelidad de línea y bloqueos
madurativos), además de alteraciones en la distribución numérica de diferentes
subpoblaciones celulares (Matarraz et al., 2008; Van De Loosdrecht et al., 2009).
Marco de Referencia 76
El estudio inmunológico permite, además, establecer un sistema de puntuación para
estratificar a los pacientes en grupos de mayor o menor riesgo (Malcovati & Nimer,
2008) y para el seguimiento después del tratamiento. No obstante, en este consenso,
no se estimó el diseño de paneles enfocados a explorar el papel de la citometría de
flujo en relación con el pronóstico de los síndromes mielodisplásicos, y éstos se
centraron más en el diagnóstico y la clasificación de la enfermedad, mediante el
análisis de la maduración de distintas poblaciones celulares, incluyendo neutrófilos
y monocitos junto a los precursores CD34+ (Tabla 2-11) (Saavedra et al., 2010)
Tabla 2-8.Combinación de anticuerpos: Inmunofenotipificación de síndromes
mielodisplásicos (Saavedra et al., 2010)
Marcadores Fenotípicos
CD11b/CD13/CD45/CD34CD7/CD56/CD45/CD34HLA-DR/CD117/CD45/CD34CD36/CD64/CD45/CD14TdT/MPO/CD45/CD34
Paneles inmunofenotípicos para el estudio deleucemias mieloblástica aguda:
En la leucemia mieloide aguda, se consideró que el uso de la citometría de flujo
confirma el diagnóstico de leucemia aguda y permite diferenciarla de otras entidades
como los síndromes mielodisplásicos y los síndromes mieloproliferativos crónicos
(Saavedra et al., 2010).
77 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Para los anticuerpos propuestos, se tiene en cuenta que la detección de la
mieloperoxidasa en los mieloblastos es de gran utilidad para la caracterización del
linaje y que, en los casos negativos para mieloperoxidasa, deben identificarse como
positivos más de dos antígenos mieloides para confirmar el linaje (Matarraz et al.,
2008). En el caso de algunas leucemias mieloides agudas con anomalías genéticas
recurrentes, debe tenerse en cuenta que el porcentaje de mieloblastos puede ser
inferior a 20%; asimismo, se considera que en los estudios por citometría de flujo la
equivalencia a la definición morfológica de mieloblasto correspondería a células
precursoras que generalmente, expresan CD34, CD117 y HLA-DR o muestran
compromiso madurativo a monocito (CD34-, CD117-/+,HLADR+, CD64+fuerte y
CD14-/+débil), que incluyen marcadores aberrantes detectados en el momento del
diagnóstico (Del Cañizo et al., 2003).
Sin duda, la caracterización inmunológica de la leucemia promielocítica aguda
porcitometría de flujo permite demostrar un inmunofenotipo muy característico de la
presencia de la anomalía genética característica de esta entidad t(15;17)
(reordenamiento PML-RARα) al establecerla existencia de promielocitos aberrantes
que expresan, generalmente, CD34-/+ débil, CD15-/+débil, CD33++, CD2-/+ débil,
y CD13+ heterogéneo.
Otras anomalías genéticas, como la inv(16)/t(16;16), se relacionan con expresión
fuerte de mieloperoxidasa, CD2-/+ débil y presencia de monocitos aberrantes. Por
otra parte, los casos con t(8;21) muestran frecuentemente expresión de CD19 y
CD56, mientras que los casos con anomalías a nivel de 11q23 se asocian a fenotipo
CD56+, 7.1-/+, CD2-/+ y CD19-/+ débil (Orfao, Ortuño, de Santiago, Lopez, & San
Miguel, 2004). Se recomendaron anticuerpos básicos para el diagnóstico y la
Marco de Referencia 78
clasificación de las leucemias mieloides agudas y el rastreo de alteraciones
genéticas características de diferentes subtipos de la enfermedad (Tabla 2-12).
Tabla 2-12. Combinación de anticuerpos: inmunofenotipificación de leucemia
mieloblástica aguda (Saavedra et al., 2010)
LINAJEa MADURACIÓN SUBCLASIFICACIÓN ALTERACIONESGENÉTICAS
OPCIONAL
MPO(citoplasmatica)
HLA-DR CD15 CD56 CD36
CD3(citoplasmatica)
CD34 CD13 CD64
CD19 CD45 CD33 CD123CD79a(citoplasmatica)
CD117a CD11b CD61
CD14
a: para definir el linaje de células mieloides, debe demostrarse la expresión de doso más marcadores asociados a linaje mieloide en los blastos según estos seanMPO+ o MPO-, respectivamente.MPO: mieloperoxidas
2.13 Técnicas Citogenéticas
2.13.1 Convencional
Según la guía Europea LeukemiaNet (ELN) -Workpackage la citogenética y el
análisis del cariotipo convencional (CC) es obligatoria para diagnosticar
correctamente y clasificar las neoplasias malignas hematológicas. Al revelar las
aberraciones cromosómicas subyacentes, balanceadas y no balanceadas, se puede
proporcionar (1) confirmación del diagnóstico; (2) información útil para la
clasificación, puesta en marcha y pronóstico; (3) información para guiar la elección
adecuada de la terapia; y (4) evidencia de remisión o recaída (Micale, 2011).
Como se describió anteriormente, las aberraciones cromosómicas pueden ocurrir
como anomalías fácilmente visibles, con el intercambio de partes grandes o de
79 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
diferentes cromosomas, o como reordenamientos crípticos. Estos últimos son el
resultado del intercambio de pequeños fragmentos con similares patrones de
bandas, que se confunden fácilmente con citogenética convencional y posiblemente
explican una proporción de casos de leucemias agudas con cariotipos
aparentemente normales o clones con anomalías cromosómicas inespecíficas.
Análisis por citogenética convencional de leucemias en cultivos de sangre y/o
médula ósea permite una evaluación completa del genoma y de las anomalías que
presente, sin embargo, a veces se ve obstaculizada por el bajo índice mitótico, la
mala morfología de los cromosomas, considerando cariotipos complejos como
cariotipos normales (Micale & Mohamed, 2012). Además, el origen de cromosomas
marcadores no puede ser dilucidado mediante las técnicas de bandeo
convencionales en la mayoría de los casos.
2.13.2 Molecular
En los últimos 30 años, los nuevos avances técnicos han conducido a una revolución
en la citogenética. Las técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH), y las
variantes más recientes de esta técnica, permiten la identificación de secuencias
específicas de ácidos nucleicos en una alta sensibilidad y de manera rápida (Micale
& Mohamed, 2012) y han permitido dilucidar nuevos reordenamientos cromosómicos
crípticos, origen y composición de los cromosomas marcadores.
Las alteraciones cromosómicas de un tamaño < 5 Mb o de las reorganizaciones
complejas son muy difíciles de identificar mediante las técnicas de bandas
convencionales. Las modernas técnicas de citogenética molecular, basadas en FISH
Marco de Referencia 80
y que combinan la citogenética convencional con la genética molecular, intentan
mitigar dicha limitación. La Gráfica 2-5 ilustra las tasas de detección de
anormalidades de los métodos seleccionados individuales e integrados (McGrattan
et al., 2008).
Gráfica 2 - 5 Tasa de Detección de anormalidades.
Detección de anormalidades con diferentes técnicas citogenéticas en pacientes con
LA (McGrattan et al., 2008).
2.13.2.1Hibridación In situ Fluorescente (FISH)
Hoy en día, las técnicas de FISH son de gran relevancia tanto en el campo de
investigación como en el diagnóstico clínico debido a su alta sensibilidad,
especificidad y la rapidez lo que ha hecho con esta técnica una importante estrategia
diagnostica con numerosas aplicaciones (Gozzetti & Le Beau, 2000).
81 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Tipos de sondas utilizadas en FISH convencional
Se reconocen cuatro tipos de sondas, determinadas por la función de las estructuras
que son capaces de detectar ya sea en el núcleo celular o en metafase: estas son
sondas gen o locus específicas, sondas centroméricas, sondas subteloméricas y
sondas de pintado cromosómico.
- Sondas Locus Específico
Estas sondas se caracterizan porque hibridan con una secuencia única de ADN, son
específicas para un locus determinado. Se conocen como sondas LSI (locus specific
identifier). En función de su diana, tienen un tamaño de 1-10 Kb (plásmidos) o son
vectores más largos 80Kb - 1Mb (Bacterial artificial chromosomes -BACs, Yeast
artificial chromosomes -YACs). Este tipo de sonda permite detectar reordenamientos
estructurales de genes o de regiones cromosómicas concretas e identificar
deleciones y duplicaciones submicroscópicas de hasta 3 Mb (Ledbetter y Ballabio,
1995).
- Sondas Centroméricas
Reconocen los centrómeros, los cuales a pesar de ser prácticamente idénticos para
todos los cromosomas, se distinguen en 2-3% de su secuencia, lo que permite que
la mayor parte de los centrómeros individuales puedan ser distinguidos a excepción
de los centrómeros de los cromosomas 13 y 21, y de los centrómeros de los
Marco de Referencia 82
cromosomas 14 y 22. Permiten detectar cromosomas concretos e identifica
alteraciones de tipo numérico, especialmente monosomías, trisomías y otras
aneuploidías en metafases y también en núcleos interfásicos. Se conocen como
sondas CEP (chromosome enumeration probe) (Gozzetti & Le Beau, 2000)
- Sondas de Pintado Cromosómico
Con la sonda de pintado cromosómico simple correspondiente a un determinado
cromosoma se consigue pintar sólo los cromosomas homólogos correspondientes,
permitiendo así detectar de forma rápida, alteraciones numéricas y estructurales
intercromosómicas que afecten a ese cromosoma específico (Cremer, Lichter,
Borden, Ward, & Manuelidis, 1988). Así, tras la hibridación aparece pintado
uniformemente todo el cromosoma. Estas sondas, también conocidas como sondas
WCP (whole chromosome painting) sirven fundamentalmente para detectar
translocaciones difíciles de identificar con las técnicas de citogenética convencional,
así como para identificar el origen de material adicional presente en un cromosoma
derivativo o en pequeños marcadores supernumerarios. Si bien se pueden utilizar
en interfase, se aconseja su uso sobre metafases. Los principales inconvenientes
de la utilización de estas sondas son la no detección de inversiones
paracentroméricas y su baja resolución, que impide detectar pequeñas deleciones,
duplicaciones y translocaciones (< 2-3 Mb) (Gozzetti & Le Beau, 2000).
2.13.2.2 Hibridación Genómica Comparativa
La técnica de CGH permite el rastreo de desequilibrios globales presentes en el
genoma en una única hibridación y sin necesidad de obtener células en división
83 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
(Kallioniemi et al., 1992). Ha sido una de las primeras técnicas combinadas de
citogenética e hibridación in situ fluorescente que ha permitido realizar un análisis
global del genoma. Aunque inicialmente se describió como una valiosa técnica para
el análisis de desequilibrios en el número de copias de ADN en tumores (Gray &
Collins, 2000; James, 1999; Kallioniemi et al., 1992), en la actualidad es de gran
utilidad para el análisis de desequilibrios cromosómicos constitucionales a partir de
cualquier tipo de muestra.
Básicamente, la técnica consiste en marcar los ADN’s genómicos de la muestra
problema y de un individuo control con fluorocromos distintos y cohibridizarlos en
presencia de Human Cot-1 ADN (bloquea regiones repetitivas de A-T) sobre una
preparación cromosómica de un individuo normal. Las señales fluorescentes son
detectadas y analizadas mediante análisis digital haciendo uso de un software
específico. De este modo se puede analizar las regiones de copia única de cada
cromosoma. A partir del análisis de un mínimo de 10-20 metafases se obtiene el
valor promedio y se generan los perfiles de ganancias y pérdidas (por encima del
umbral 1.25 se considera ganancia y por debajo del 0,75 pérdida) (Weiss et al., 1999)
Con esta técnica pueden detectarse un amplio rango de desequilibrios del genoma,
incluyendo duplicaciones y deleciones a nivel de banda o sub-banda cromosómica
en una única hibridación y con muy poca cantidad de ADN (200 ng-1 µg). Si bien
algunos autores (Joos et al., 1993) han podido detectar con esta técnica
amplificaciones de hasta 2 Mb, en general se acepta que la sensibilidad de este
método para la detección de ganancias y pérdidas es menor de 5Mb (Kallioniemi et
al., 1992; McGrattan et al., 2008). La ventaja principal de la aplicación de esta técnica
Marco de Referencia 84
es la identificación de pequeños desequilibrios genéticos sin la necesidad de obtener
metafases.
Entre las limitaciones que presenta esta técnica se destaca la imposibilidad de
detectar anomalías cromosómicas equilibradas (como translocaciones o
inversiones) o aquellas que afectan a regiones pericentroméricas, teloméricas o
ricas en heterocromatina (Kallioniemi et al., 1992). También hay problemas de
identificación en aquellos casos en los que el desequilibrio cromosómico se presenta
como un mosaicismos inferior al 30% (Lomax, Lestou, Barrett, & Kalousek, 1998).
Estas limitaciones evidencian la necesidad de combinar la utilización de la CGH con
las técnicas citogenéticas clásicas y FISH.
2.13.2.4 Hibridación Genómica Comparativa DeAlta Resolución
Tal como se ha comentado anteriormente, la CGH alcanza una resolución similar a
la citogenética convencional de alta resolución. La modificación del software, CGH
de alta resolución (HR-CGH), ha permitido aumentar dicha resolución pudiendo
identificar desequilibrios cromosómicos de hasta 2 Mb (Kirchhoff et al., 1999).
En la HR-CGH, las anomalías son detectadas con base a la utilización de un
intervalo dinámico de referencia estándar creado a partir de la media del análisis de
15-20 casos control. Este intervalo es especialmente amplio en aquellas regiones
donde los valores de CGH son generalmente conflictivos. Así se obtiene un perfil
característico para cada cromosoma, el cual se desvía en algunas regiones
85 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
cromosómicas sin por ello representar un desequilibrio cromosómico (Mentzlová,
Oltová, Filková, Slerba, & Kuglík, 2008; Weiss et al., 1999).
Umbrales fijados convencionalmente se utilizan para detectar aberraciones
cromosómicas en CGH. Sin embargo, se sabe que este método a menudo detecta
falsos positivos en ciertas regiones cromosómicas. En consecuencia, estas regiones
son a menudo excluidas de la interpretación. Se ha desarrollado un método de
detección en donde los perfiles de relación son evaluados por un intervalo de
referencia dinámico estándar en lugar de los umbrales fijos como en el caso de CGH
clásico. El intervalo de referencia dinámico estándar se basa en un promedio de 16
análisis CGH normal (Mentzlová et al., 2008) para normarlizar los umbrales. La base
para el uso de un estándar normal son observaciones de los perfiles relacionados
de hibridaciones con el ADN normal. El grado de desviación es diferente del análisis,
sin embargo, siempre se correlacionan todos los cromosomas en el análisis
individual. Las desviaciones características del intervalo de referencia dinámico
estándar se correlacionan con el patrón de bandas de los cromosomas con pintado
DAPI. El estándar de referencia dinámica se mueve normalmente a la izquierda en
bandas oscuras y hacia la derecha en las bandas claras. El intervalo dinámico de
referencia estándar se puede ampliar para adaptarse a cualquier análisis (Jeuken,
Sprenger, Wesseling, & Ph, 2002; Weiss et al., 1999).
Se compara la media de los perfiles de los ratios de cada caso, con un intervalo de
confianza del 95% a 99.9% según criterio del investigador, con la media de los
perfiles de controles normales con el mismo intervalo de confianza. Las regiones
Marco de Referencia 86
alteradas son aquellas en que los intervalos de confianza de la muestra y el control
no se superponen (Gráfica 2-6) (Mentzlová et al., 2008).
Gráfica 2 - 6 HR-CGH. Umbrales Fijos y dinámicos.
Se ha utilizado la HR-CGH en los estudios de varios tumores, así como en el
laboratorio de citogenética clínica siendo habitual desde 1997. Ambas aplicaciones
han demostrado que en comparación con los umbrales fijados HR-CGH detecta
aberraciones más pequeñas con mayor especificidad.
(http://www.chromosomelab.dk/cgh/cgh.html).
Metodología 89
3. METODOLOGÍA
3.1 Aprobación del estudio
El proyecto de investigación junto al asentimiento y consentimiento informado
(Anexo 1) fue aprobado por la Universidad Nacional de Colombia, y se sometieron
al Hospital de Bosa y al Instituto Nacional de Cancerología (INC). La aprobación
para la obtención del material biológico la realizó el INC junto a un nuevo
consentimiento informado (Anexo 2) y formatos de registros generales de
información (Anexo 3).
3.2 Grupo de Casos
Se obtuvieron muestras de pacientes con SMD y LMA de Novo, estas muestras
fueron facilitadas por el Instituto Nacional de Cancerología (INC) con el respaldo
del médico asesor Leonardo José Enciso Olivera. El reclutamiento de los pacientes
se realizó por consultas y rondas de piso por parte del médico y según los criterios
del mismo todos aquellos pacientes con sospecha de SMD y LMA fueron invitados
a participar en el estudio.
3.2.1 Criterios de Inclusión
Se tuvieron en cuenta pacientes mujeres y hombres mayores de edad, con
diagnóstico presuntivo de Síndrome Mielodisplásico o Leucemia Mieloide Aguda y
90 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
que se encuentren confirmados por la técnica de citometría de flujo junto al
asentimiento por parte de los mismos para participar en el estudio con la respectiva
firma del consentimiento informado (Anexo 2).
3.2.2 Criterios de Exclusión
Fue motivo de exclusión del estudio aquellos pacientes que ya hayan iniciado un
protocolo de tratamiento junto con la duda en el diagnóstico (leucemias agudas de
linaje ambiguo).
3.2.3 Registro de Pacientes
El registro de los pacientes que decidieron participar en el estudio inicio con la
asignación de un número aleatorio de modo tal que no se pudiera identificar los datos
como nombre, número de cédula o historia clínica para así mantener la privacidad
de los pacientes. La toma de muestra de biopsia de Médula ósea por parte del
médico y la toma de muestra sangre periférica por parte de la enfermera a cargo
fueron designados con el mismo número aleatorio puesto en el registro inicial, la
información de la historia clínica y de los resultados de laboratorio fueron ingresados
a los formatos de registros generales de información (Anexo 3) y de uso exclusivo
del médico tratante, investigador principal y de los miembros del equipo de
investigación con el fin de conocer las condiciones iníciales de la enfermedad y
tratamiento que siguió.
3.3 Toma de Muestra de Médula Ósea.
Este procedimiento fue realizado por el médico hematólogo asesor y no tuvo
Metodología 91
diferencias en cuanto a la técnica que se realiza habitualmente a los pacientes con
esta enfermedad. Para los pacientes que decidieron participar en el estudio y que
su condición lo permitió, se realizó un aspirado y biopsia de médula ósea (Anexo
4), se tomaron dos muestras adicionales de cuatro (4) centímetros cúbicos de
sangre obtenida a partir de la Médula ósea, las muestras se depositaron en tubos
con anticoagulante Heparina Sódica y EDTA para la obtención de las células
requeridas y del ADN necesario para la realización de las diferentes técnicas que
repercutirían en la correcta clasificación de la enfermedad, así como en los
procedimiento empleados en este estudio (Citogenética clásica, FISH, y CGH).
3.4 Toma de Muestra de Sangre Periférica
Este procedimiento fue ejecutado por la enfermera a cargo a los pacientes que
decidieron participar en el estudio y que su condición lo permitió, se realizó por
sistema de extracción con vacío (Anexo 5). Se tomaron dos muestra de cuatro (4)
centímetros cúbicos de sangre. Las muestras se depositaron en tubos con
anticoagulante Heparina Sódica y EDTA para la obtención de las células requeridas
y del ADN necesario para la realización de las diferentes técnicas empleadas en
este estudio (Citogenética clásica, FISH, y CGH).
3.5 Citometría de FlujoSe realizó citometría de flujo de los pacientes con diagnóstico presuntivo de SMD y
LMA, este procedimiento se realizó en el Laboratorio de Genética del Instituto
Nacional de Cancerología. Los análisis se practicaron utilizando el citómetro de 4
colores marca BECTON DICKINSONTM FACS CANTO II® y según protocolos
92 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Euroflow (van Dongen et al., 2012), se emplearon marcadores para determinar
inmunofenotipos ya sean células en diferenciación celular o maduración como lo son
CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD10, CD13, CD14, CD16, CD 9, CD20, CD22, CD33,
CD34, CD36, CD45, CD79, CD117, HLA-DR, MPO, Tdt y cadenas mu.
3.6 Cultivo y Cosecha de Cromosomas Metafásicos apartir de Sangre Periférica y Médula Ósea
3.6.1 Descripción del Procedimiento.
Los cultivos se realizaron por triplicado de corto y mediano plazo (24 y 48 Horas) sin
Fitohemaglutinina (agente mitogénico) y de largo plazo (72 horas) con
Fitohemaglutinina. Cada cultivo contenía 4.5 ml de medio McCoy´s 5A (médula
ósea) o RPMI 1640 (sangre periférica), 0.5 ml de suero fetal bovino, 100 ul penicilina
y 75 ul del agente mitogénico (Fitohemaglutinina) en el caso de cultivos de 72 horas
(Anexo 6), la cantidad de muestra dependió del estado médico del paciente siendo
el rango normal de 4000 a 10000 y agregando para estos 500 ul. Los cultivos fueron
incubados a 37°C por 24, 48 o 72 horas según corresponda.
Se realizaron cultivos a las 72 con estimulo (Fitohemaglutinina) con el fin de
determinar si las anormalidades vistas en los pacientes con SMD y LMA son
constitutivas o se pueden atribuir a la evolución clonal propia de la malignidad. Es
de mencionar que para estudios citogenéticos en enfermedades mieloides existen
mitógeno específicos que estimulen cada una de las líneas que se ven afectadas
con estas enfermedades, entre ellos están G-CSF, GM-CSF, IL-3, SCF,
Thrombopoietein y Erythropoietin.
Metodología 93
Completado el tiempo de incubación se procedió a realizar la cosecha y extracción
de cromosomas metafásicos, añadiendo 80 ul de colchicina a los cultivos de 24 y 48
horas por 45 minutos y 80 ul por 20 minutos a cultivos de 72 horas, posterior a esto
se separaron las células del medio y demás sustancias por centrifugación, se
descartó el sobrenadante y se agregó 8 ml de solución hipotónica KCl 0.075M por
un tiempo de 30 minutos para cultivos de 24/48 horas y 10 minutos para cultivos de
72 horas, la fijación del contenido celular se efectuó con fijador Carnoy (metanol:
ácido acético proporción 3:1), seguido de 3 lavados para eliminar rastros
citoplasmaticos.
Se extendieron 2 portaobjetos o láminas por cada cultivo (24, 48 y 72 Horas) las
cuales se utilizaron para citogenética convencional y 2 porta objetos o láminas para
la técnica de hibridación in situ (FISH) con sondas t(8;21) y t(16;16).
3.7 EVALUACIÓN CITOGENÉTICA
3.7.1 Descripción del Procedimiento.
Los pacientes remitidos fueron evaluados por citogenética tradicional con las
láminas obtenidas en los cultivos cortos (24 y 48 horas) y largos (72 horas), se realizó
bandeo G con colorante wright (Anexo 7).
El análisis inicial se realizó en 25 metafases y la presencia de clones implicaba
ampliar el conteo a 100 metafases por individuo si las condiciones médicas del
paciente lo permitían. La nomenclatura se realizó según el ISCN 2013 (Shaffer, L.
94 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
G. et al., 2013). Se empleó el microscopio (ZEISS Axiophot); la organización del
cariotipo se hizo con el software LUCIA G 2.85 KARYO y se tomaron imágenes de
los diferentes clones hallados con la cámara ProgRes® C3- Jenoptikpara así tener
un reporte por cada individuo.
3.8 Hibridación in situ Fluorescente (FISH)
Se realizó análisis de Hibridación in situ Fluorescente (FISH) para detectar
translocaciones en pacientes con SMD y LMA, evaluando las sondas AML1/ETO
(RUNX1/RUNX1T1) Translocation, Dual Fusion t(8;21) y CBFß/MYH11
Translocation, Dual Fusion inv(16), Esta técnica demanda dos días de tratamiento
siguiendo los protocolos descritos por el proveerdor (Cytocell) (Anexo 8).
Para cada paciente se seleccionaron con filtro azul 10 metafases y 100 interfases,
dependiendo del tipo de sonda usada y del color de la misma se cambia el filtro a
la longitud de onda deseada ya sea DAPI (358 nm) anteriormente mencionado o
SpectrumGreen (495 nm) y Spectrumred (558 nm) (ZEISS), se verificó la cantidad
de señales observadas y ubicación de las mismas. Las imágenes se digitalizaron y
evaluaron usando el software LUCIA G 2.85 FISH.
Metodología 95
Gráfica 3 - 1 Ejemplo sonda AML1/ETO dual fusión.
3.9 Hibridación Genómica Comparada (CGH)
3.9.1 Preparación de Metafases Normales - LaminasBlanco para CGH
Se obtuvieron las metafases de 10 pacientes normales (5 hombres y 5 mujeres) que
decidieron donar 4 ml de sangre periférica y que previamente fueron analizados por
citogenética convencional. Estas metafases se prepararon de acuerdo con los
protocolos estándares basados en la estimulación de linfocitos agregando
fitohemaglutinina y extendidos sobre laminas limpias. Se procedió a desnaturalizar
la lámina blanco después de gotear o máximo un día después.
Se precalentó en baño de maría un coplin con formamida 70%/2XSSC a una
temperatura de 50°C, se colocó la lámina blanco en esta solución durante 2 minutos,
se sacó la lámina e inmediatamente se pasó a deshidratar en una serie de etanoles
96 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
fríos al 70, 80 y 100% seguido de etanol al 100% a temperatura ambiente por 2
minutos cada uno (Anexo 10).
3.9.2 Realización Sonda
La primera fase de la estandarización de la técnica fue la obtención de ADN
mediante extracción con cloroformo de sangre periférica y/o médula ósea (Anexo 9)
de un grupo de 10 controles y a los que se les realizo también citogenética
convencional para determinar posibles anormalidades, la extracción también se
realizó a pacientes con SMD/LMA, la pureza del ADN (relación 260/280) debió estar
entre 1.8 a 2.0 para garantizar que el marcaje se hiciera sobre ADN y no en proteínas
o RNA, la cuantificación de ADN se realizó en el equipo NanoDrop (Thermo
Scientific). El ADN genómico de los controles antes mencionados, el ADN de
pacientes y el ADN de referencia que consiste en un pool de 10 individuos normales
(Promega) fueron digeridos en fragmentos de tamaño de 100-2000 pb, incubados
por 4 horas con DpnII (New England Biolabs Inc) a 37°C y revisados en un gel de
agarosa al 2%. Los fragmentos de ADN fueron purificados usando QIAquick PCR
purification kit (Qiagen GmbH). Un microgramo (1 µg) del ADN digerido por DnpII y
purificado fue marcado directamente por Universal Linkage System ULS, en el caso
del ADN del paciente con PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit (495 Green) y
para el ADN de referencia PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit (550
Red/Orange) siguiendo protocolos de la casa fabricante (Kreatech) y con 20
reacciones cada uno. Los fragmentos de ADN tanto de paciente como de control
fueron mezclados junto a 10 µg de Human Cot1-ADN (Solución de Bloqueo de
regiones de secuencias repetitivas A-T centrómeros y telómeros - Invitrogen) y
Metodología 97
precipitados con etanol. El pellet fue secado al aire y resuspendido en buffer de
hibridación dependiendo de la concentración de ADN (Jeuken et al., 2002; Weiss et
al., 1999).
3.9.3 Desnaturalización de la sonda e hibridación de lasonda a la lámina objetivo o blanco
Se procedió a desnaturalizar la mezcla en calor a 75°C por 10 minutos en el baño
de maría, se agregó de 5 a 10 µl de la mezcla dependiendo de la concentración de
ADN sobre la lámina blanco previamente punteada y desnaturalizada como se indica
en la sección 3.9.1, inmediatamente se cubrió con una laminilla y se sellaron los
bordes con pegante a base de caucho, se colocó la lámina sellada en una cámara
húmeda con 2XSSC y se dejó incubando por 92 horas a 37°C.
3.9.4 Post lavados de la Lámina
Previamente se calentó un coplin con 0.4 X SSC (solución de lavado) a 73°C,
posterior a esto se removió el pegante y la laminilla de la lámina e inmediatamente
se colocó en la solución de lavado por 2 minutos, sin dejar secar se pasó la lámina
a un coplin con solución 2 X SSC a temperatura ambiente por 30 segundos (Anexo
10).
98 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
3.9.5 Visualización de la Hibridación
Se aplicó 4 µl de DAPI sobre la zona hibridada y se cubrió con una laminilla limpia
para su posterior visualización y evaluación.
3.9.6 Evaluación e Interpretación de los Resultados
La evaluación de la hibridación genómica comparada (CGH) se realizó con el
software de análisis de imagen LUCIA 2.85 CGH, este software se usó para adquirir
10 imágenes de metafases, en su mayoría sin cruces entre cromosomas para así
determinar los perfiles de relación de las intensidades de fluorescencias junto a un
análisis estadístico de los mismos. Los cromosomas fueron contrastados con DAPI
lo que dio como resultado patrones de banda Q que fueron empleados para la
identificación cromosómica. Después de organizar cada metafase, el software
calculó los perfiles de intensidad tanto en verde (495 nm)(Paciente) como en rojo
(550 nm)(Control de referencia) para cada cromosoma.
Las regiones cromosómicas fueron consideradas como pérdidas o como ganancias
cuando la relación verde (paciente): rojo (control) excede los perfiles de los intervalos
dinámicos de referencia, usando un intervalo de confidencia del 95% o 99.5% para
el caso de Hibridación Genómica Comparada de Alta Resolución.
Metodología 99
3.9.7 Estandarización y Validación
La estandarización y validación se realizó con diez (10) muestras de individuos, cinco
(5) mujeres y cinco (5) hombres, a estos controles previamente se les realizaron
cariotipo convencional (Bandas G de alta resolución) para determinar anormalidades
si era posible. Los botones o pellet con las metafases de los individuos normales
confirmados citogenéticamente fueron utilizados como controles para las láminas
blanco, para la obtención de los perfiles característicos de cada cromosoma y a su
vez la estandarización de los umbrales del software.
3.10 Análisis Descriptivo Univariado de los Datos
Este es un estudio de corte descriptivo longitudinal y el número de muestras a
evaluar fue determinado a conveniencia.
Se realizó un análisis descriptivo de cada una de las variables, medidas de
tendencia central (media, moda y mediana) de la edad, del sexo, frecuencia
de las aberraciones cromosómicas y otras variables evaluadas (Anexo 11).
Caracterización de la supervivencia global: Se realizó un modelo de riesgos
proporcionales como función de sobrevida Weibull (Sayehmiri, et al.,
2008).
Análisis de regresión logística (Jovell, 1995) para evaluar tasas de
remisión con tratamiento.
100 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Los datos obtenidos en el presente estudio fueron organizados y procesados con el
paquete estadístico R (http://www.r-project.org/) y weibull
(http://www.isograph.com/software/availability-workbench/weibull-
analysis/?gclid=Cj0KEQjwy7qrBRC4lp7_hM3dgIoBEiQA72pCnmflFZ3rCKsyM3bS3
vsFWkDP9A2M94gp7JPaYMrbgsIaAmlT8P8HAQ).
Resultados 100
4. RESULTADOS
Se recibieron 24 muestras de pacientes con diagnóstico presuntivo de Síndrome
Mielodisplásico (SMD) y Leucemia Mieloide Aguda (LMA), de estos, cinco (5)
pacientes fueron confirmados por citometría de flujo como SMD y de la misma
manera seis (6) pacientes para LMA; los marcadores para diferenciación se
relacionaron anteriormente.
Un total once (11) pacientes fueron incluidos en el estudio cumpliendo los criterios
de inclusión. Seis (6) pacientes de género femenino y cinco (5) de género masculino.
De los cuales cinco (5) presentaban SMD (3 hombres y 2 mujeres) y seis (6) LMA (2
hombres y 4 mujeres) (Gráfica 4-1).
Gráfica 4 - 1 Diagrama de Barras eje X género, eje Y enfermedad primaria
En la tabla 4-1 se puede observar que dos (2) pacientes mujeres con SMD
presentaron transformación a LMA, dos (2) pacientes masculinos fueron
diagnosticados con subclase areb-1 y uno (1) con areb-2, mientras que los pacientes
101 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
con LMA se subclasificaron de la siguiente manera: dos (2) pacientes con M2
(femenino y masculino), uno (1) con M4 (femenino), uno (1) con M5b (masculino) y
dos (2) con M6 (femenino).
Tabla 4-1. Frecuencia absoluta de los datos para las variables de
género/subclasificación para SMD y LMA
CUENTA SEXO
Enfermedad Primaria Subclasificación F M Total FilaLMA
M2 1 1 2M4 1 1M5b 1 1M6 2 2
TOTAL LMA 4 2 6SMD AREB-1 2 2
AREB-2 1 1LMAt 2 2
TOTAL SMD 2 3 5TOTAL COLUMNA 6 5 11
Se presentó un rango de edad para SMD de 24 a 64 años con una media de 48
años. Se realizó conteo celular de leucocitos con intervalos de 580 a 8400 con una
mediana de 1390 (Cel/µl), linfocitos de 280 a 3050 con una mediana de 1050 (Cel/µl),
neutrófilos de 60 a 5020 con una mediana de 140 (Cel/µl) en sangre periférica y el
porcentaje de blastos en médula ósea mostró un promedio de 12,92%. El nivel de
hemoglobina presentó un promedio de 8,5 g/dL (Tabla 4-2).
Resultados 102
El intervalo de edad para pacientes con LMA fue de 32 a 70 años con una media de
48,2 años. Para pacientes con LMA, el conteo celular en sangre periférica presentó
un intervalo de 4230 a 60090 con una mediana de 27165 leucocitos (Cel/µl), de 2403
a 11681 con una mediana de 4067 linfocitos (Cel/µl), de 250 a 19750 con una
mediana de 1745 neutrófilos (Cel/µl), el porcentaje de blastos en médula ósea
evidenció un promedio de 56,6% y el nivel de hemoglobina presentó un promedio de
8,3 g/dL (Tabla 4-2).
Tabla 4-2. Datos Hematimétricos LMA/SMD
Característica LMA SMDEdadIntervalo 32-70 24-64Media 48,2 48Leucocitos(Cel/µl)Intervalo 4230-60090 580-8400Mediana 27165 1390Linfocitos (Cel/µl)Intervalo 2403-11681 280-3050Mediana 4067 1050Neutrófilos(Cel/µl)Intervalo 250-19750 60-5020Mediana 1745 140CantidadHemoglobina(g/dl)
Intervalo 7,5-10 6,6-9,6Media 8,3 8,5Blastos (%)Total 5-92,6 2,6-28% Blasto 56,5 12,9
103 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
4.1 Citogenética Convencional
De once pacientes recibidos, se analizaron por citogenética convencional nueve (9)
los cuales presentaron una (1), dos (2) o tres (3) alteraciones cromosómicas en su
cariotipo (81,8%), mientras que los dos (2) pacientes restantes no presentaron índice
mitótico para el respectivo análisis (18,2%) (Tabla 4-3).
Tabla 4-3. Número de anormalidades cromosómicas por enfermedad primaria
Número deAnormalidades
en Cariotipo
LMA SMD
Cariotipo Normal1 5 12 1 13 1
No Índice Mitótico 2
La Tabla 4-4 muestra los porcentajes para cada anormalidad cromosómica y para
cada enfermedad primaria.
Tabla 4-4. Clasificación de Moorman. Frecuencias de Anormalidades
Cromosómicas (Moorman et al., 2001).
Clasificación deMoorman
LMA (n=80) SMD (n=56)
Monosomías 62 (77,50) 33 (58,93)Trisomías 2 (2,50) 6(10,71)Translocaciones 1 (1,25) 4 (7,14)Inversiones 3 (3,75) 4 (7,14)Isocromosomas 0 (0,0) 3 (5,36)Poliploidías 5 (6,25) 2 (3,57)Nulisomías 7 (8,75) 4 (7,14)
Resultados 104
4.1.1 Síndrome Mielodisplásico
Se observó por citogenética convencional cinco (5) pacientes de los cuales el 60%
presenta anormalidades cromosómicas numéricas y estructurales y se describirán a
continuación iniciando con monosomías recurrentes en pacientes con SMD (Gráfica
4-2).
Gráfica 4 - 2 Pérdida Material Genético SMD. En el eje X número de células con la
alteración y eje Y cromosoma implicado.
El 58,93% de anormalidades cromosómicas en estos pacientes son pérdidas de
información genética ya sea total o parcial en el cromosomas sexual X
representando el 21,21% del total de las monosomías halladas seguido de los
cromosomas 21 con 18,18% y 17 con 9,09%.
En cuanto a las ganancias del material genético se observó que correspondían al
11,32% del total de anormalidades cromosómicas, la trisomía del cromosoma 8
105 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
(33,33%) seguido de las ganancias de los cromosoma 1, 2, 9 y 18 (16,67%) son las
más frecuentes de estos pacientes (Gráfica 4-3).
Gráfica 4-3 Ganancia Material Genético SMD. En el eje X número de células con la
alteración y eje Y cromosoma implicado
4.1.1.1 Caracterización Pacientes SMD
4.1.1.1.1CP 498620
Clínica
Paciente del género femenino con 41 años de edad diagnosticada el 28/11/2013
con Síndrome Mielodisplásico en transición a Leucemia Mieloide Aguda, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 1390 cel/µl
de leucocitos, 810 cel/µl de linfocitos, 430 cel/µl de neutrófilos (Leucopenia
marcada, linfopenia absoluta y neutropenia absoluta), porcentaje de blastos en
médula ósea del 22% y la concentración de hemoglobina de 9,6 g/dL (anemia
Resultados 106
moderada), no inicia tratamiento y la última fecha de contacto fue el 03/12/2013
el estado vital para la fecha era muerto.
Citogenética
Debido a las condiciones clínicas en las que se encontraba el paciente no fue
posible la obtención de cultivos positivos para el análisis citogenético.
4.1.1.1.2 CP 323008
Clínica
Paciente del género femenino con 64 años de edad diagnosticada 26/12/2013
por citometría de flujo con Síndrome Mielodisplásico en transición a Leucemia
Mieloide Aguda, el hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico
reporta 3290 cel/µl de leucocitos, 2790 cel/µl de linfocitos, 80 cel/µl de neutrófilos
(Leucopenia marcada y neutropenia absoluta), porcentaje de blastos en médula
ósea del 28% y la concentración de hemoglobina de 9,3 g/dL (anemia
moderada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con Citarabina el 23/01/2014 y
a las cuatro semanas no logra remisión, la última fecha de contacto fue el
26/02/2014 el estado vital para la fecha era vivo.
Citogenética
Paciente con complemento cromosómico anormal en cultivos de 24 y 48 horas
sin estimulo, presenta cariotipo 45,X,-X[5]/45,XX,-21[2]/44,X,-X,-21[2] (Gráfica
4-5), se observaron 3 líneas celulares en 9 células analizadas, en la primera se
evidencia la pérdida recurrente del cromosoma sexual X en 5 células, en la
segunda línea se observó la pérdida del cromosoma 21 en 2 células, en la
107 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
tercera línea 2 células presentaron pérdidas de los cromosomas X y 21 lo que
indica una evolución clonal (Gráfica 4-4). En el cultivo de 72 horas con estimulo
se observó un cariotipo con complemento cromosómico normal femenino 46,XX
en 91 células analizadas.
El número de pérdidas totales de este paciente fueron 14 (100%) donde la
pérdida más representativa fue la del cromosoma sexual X (50%), seguido del
cromosoma 21 (28,6%) y 10 (14,3%) la última no fue definida como clon y se
halló en cultivos de 24 y 48 horas
Gráfica 4 - 4 Evolución Clonal Paciente 323008
Gráfica 4 - 5 Fotos cariotipos 323008. 45,X,-X / 44,X,-X-21. LUCIA 2.8 KARYO
46,XX
45,X,-X 45,XX,-21
44,X,-X,-21
Resultados 108
El pronóstico para este paciente según lo propuesto por García, 2008 y Haseen
et al., 2007 fue BUENO ya que la mediana de supervivencia para la pérdida total
del X fue 56.4 meses mientras que para la monosomía 21 de 32 meses. Según
Schanz et al., 2012 todas aquellas dobles anormalidades que no incluyan -5/-
5q, -7/7q o inv(3)/t(3q) son consideradas de pronóstico INTERMEDIO y con una
mediana de supervivencia de 28 meses.
4.1.1.1.3 CP 640124
Clínica
Paciente del género masculino con 24 años de edad diagnosticado el 07/03/2014
por citometría de flujo con Síndrome Mielodisplásico, subclasificación areb-1, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 8400 cel/µl
de leucocitos, 3050 cel/µl de linfocitos, 5020 cel/µl de neutrófilos, porcentaje de
blastos en médula ósea del 5% y la concentración de hemoglobina de 9,3 g/dL
(anemia moderada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con Azacitidina el
27/06/2014 y a las cuatro semanas no logra remisión, la última fecha de contacto
fue el 20/07/2014 el estado vital para la fecha era vivo.
Citogenética
Paciente con complemento cromosómico masculino anormal en cultivos de 24 y
48 horas sin estimulo, presenta cariotipo
46,XY,i(17)(q10)[1]/46,XY,idem,t(4;9)(p15;p23)[2]/46,XY[18] (Gráfica 4-7), se
observaron 3 líneas celulares en 21 células analizadas, en la primera se evidencia
un isocromosoma del brazo largo del cromosoma 17 en 1 célula, en la segunda
109 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
línea se observa el mismo isocromosoma 17 junto una translocación
posiblemente balanceada entre brazos cortos de los cromosomas 4 y 9 en las
regiones p15 y p23 en 2 células, la tercera línea muestra normalidad en el
complemento cromosómico 46,XY en 18 células, este proceso indico evolución
clonal en el paciente (Gráfica 4-6). En el cultivo de 72 horas con estimulo se
observó un cariotipo con complemento cromosómico masculino normal 46,XY en
79 células analizadas.
El número de pérdidas totales de este paciente fueron 14 (100%) donde se
encontraron monosomías en el cromosoma 17 (20%) los cromosomas 8, 21 y Y con
46,XY
46,XY,i(17)(q10)
46,XY,ídem,t(4;9)(p15;p23)
Gráfica 4-6 Evolución Clonal Paciente 640124
Resultados 110
el 13 % para cada una. Ganancia total del cromosoma 8 fue evidente en una célula.
Estas pérdidas y la ganancia no fueron definidas como clones y se hallaron en
cultivos de 24 y 48 horas.
El pronóstico para este paciente según propuesto por Haseen et al., 2007 y
Greenberg et al., 2012 fue INTERMEDIO con una mediana de supervivencia para
isocromosoma del brazo largo del cromosoma 17 de 28 meses sin conocer la
mediana de supervivencia de la translocación por no estar reportada en estudios
previos.
4.1.1.1.4 CP 656335
Clínica
Paciente del género masculino con 47 años de edad diagnosticado el 14/03/2014
por citometría de flujo con Síndrome Mielodisplásico, subclasificación AREB-1, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 580 cel/µl
Gráfica 4-7.Fotos cariotipos 640124. 46,XY,i(17)(q10)[1]/46,XY,idem,t(4;9)(p15;p23)[2].
LUCIA 2.8 KARYO
111 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
de leucocitos, 280 cel/µl de linfocitos, 1400 cel/µl de neutrófilos (leucopenia
marcada, linfopenia absoluta, y neutropenia absoluta), el porcentaje de blastos
en médula ósea fue del 7% y la concentración de hemoglobina de 6,6 g/dL
(anemia marcada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con esquema 7+3 el
26/03/2014 y a las cuatro semanas no logra remisión, la última fecha de contacto
fue el 06/04/2014 el estado vital para la fecha era muerto.
Citogenética
Debido a las condiciones clínicas en las que se encontraba el paciente no fue
posible la obtención de cultivos positivos para el análisis citogenético.
4.1.1.5 CP 191286
Clínica
Paciente del género masculino con 64 años de edad diagnosticado el 07/07/2014
por citometría de flujo con Síndrome Mielodisplásico, subclasificación areb-2, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 971 cel/µl
de leucocitos, 1050 cel/µl de linfocitos, 60 cel/µl de neutrófilos (Leucopenia
marcada, linfopenia absoluta y neutropenia absoluta), el porcentaje de blastos en
médula ósea del 2,6% y la concentración de hemoglobina de 7,7 g/dL (anemia
marcada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con Azacitidina el 08/07/2014 y a
las cuatro semanas no logra remisión, la última fecha de contacto fue el
22/07/2014 el estado vital para la fecha era vivo.
Resultados 112
Citogenética
Paciente con complemento cromosómico masculino anormal en cultivos de 24 y
48 horas sin estimulo, presenta cariotipo 46,XY,inv(7)(p21p15)[4]/46,XY[20]
(Gráfica 4-9), se observaron 2 líneas celulares en 24 células analizadas, en la
primera se evidencia una inversión del brazo corto del cromosoma 7 de las
regiones p21 y p15 en 4 células, la segunda línea muestra normalidad en el
complemento cromosómico 46,XY en 20 células (Gráfica 4-8). En el cultivo de 72
horas con estimulo se observó un cariotipo con complemento cromosómico
masculino normal 46,XY en 29 células analizadas. Adicionalmente se observó un
aumento en el tamaño de la heterocromatina terminal del brazo largo del
cromosoma Y (Yqh+), este hallazgo considerado como un polimorfismo es decir
una variante normal.
El número de pérdidas totales de este paciente fueron 5 (100%) donde se
encontraron monosomías totales en los cromosomas 5 y 7 representando el 40%
para cada una, así mismo fue evidente ganancias totales de los cromosomas 2 y
46,XY
6,XY,inv(7)(p21p15)
Gráfica 4-8 Evolución Clonal Paciente 191286
113 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
8, se observó una duplicación del cromosoma 9 en las regiones q21 y q22 estas
alteraciones representaron el 33.3% para cada uno. Las pérdidas y ganancia no
fueron definidas como clones y se hallaron en cultivos de 24 y 48 horas.
Gráfica 4-9 Fotos cariotipos 191286 LUCIA 2.8 KARYO
El pronóstico para este paciente según propuesto por Haseen et al., 2007 y
Greenberg et al., 2012 es INTERMEDIO ya que no se tiene reporte alguno sobre
esta anormalidad y el pronóstico de la misma.
Resultados 114
4.1.2 Leucemia Mieloide AgudaPara los pacientes con LMA se encontró que el 67% de ellos presentaron
anormalidades cromosómicas, las pérdidas representaron el 77,5% del total de
anormalidades presentes en estos pacientes, las más recurrentes se presentaron
en el cromosoma 11 (16,13%), 21 (11,29%) y X (11,29) (Gráfica 4-10).
Gráfica 4-10 Pérdida Material Genético LMA. En el eje X número de células con
la alteración y eje Y cromosoma implicado
Las ganancias cromosómicas encontradas en LMA (Gráfica 4-11) representan el
2,50% del total de anormalidades cromosómicas, se evidencio trisomía del
cromosoma 2 (100%) en dos pacientes diferentes.
115 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Gráfica 4-11 Ganancia Material Genético LMA. En el eje X número de células con la
alteración y eje Y cromosoma implicado
Para cada uno de los pacientes se realizara una descripción de los hallazgos
clínicos y citogenéticos:
4.1.2.1 Caracterización Pacientes LMA
4.1.2.1.1 CP 607410
Clínica
Paciente del género masculino con 32 años de edad diagnosticado por citometría
de flujo con Leucemia Mieloide Aguda el 27/11/2013, subclasificación M2, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 21120 cel/µl
de leucocitos, 510 cel/µl de neutrófilos (leucocitosis moderada y neutropenia
marcada), porcentaje de blastos en médula ósea del 92,6% y la concentración de
hemoglobina de 7,8 g/dL (anemia marcada). Inicia el primer ciclo del tratamiento
con esquema 7+3 el 04/12/2013, el 31/12/2013 se realizó una valoración a la
Resultados 116
respuesta el tratamiento y para la fecha tenía 53% blastos en médula ósea por lo
cual no logra remisión, la última fecha de contacto fue el 24/01/2014 el estado
vital para la fecha era muerto.
Citogenética
Paciente con complemento cromosómico masculino anormal en cultivos de 24 y
48 horas sin estimulo, presenta cariotipo 46,XY,del(11)(q21q23)[6] en 6 células
analizadas, se observó una deleción parcial del cromosoma 11 en las regiones
q21 a q23 (Gráfica 4-12 y 4-13). En el cultivo de 72 horas con estimulo se observó
un cariotipo con complemento cromosómico masculino normal 46,XY en 94
células analizadas.
46,XY
46,XY,del(11)(q21q23) [6]
Gráfica 4-12. Evolución Clonal Paciente 607410
117 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
El número de pérdidas totales de este paciente fueron 21 (100%) donde se
encontraron pérdidas en los cromosomas 11 (28,6%), 9, 18 y cromosoma sexual
Y con un 9,5% cada uno. La deleción del cromosoma 11 fue la más significativa
y la que permitió confirmar clonalidad en cultivos de 24 y 48 horas.
Gráfica 4-13 Fotos cariotipos 607410. 46,XY,del(11)(q21q23)[6]. LUCIA 2.8
KARYO
El pronóstico para este paciente según propuesto por la clasificación de riesgo
European LeukemiaNet (ELN) es ADVERSO con una mediana de supervivencia
12.2 meses (Mrózek et al., 2012), según Grimwade, et al., 2010 lo clasifica como
de riesgo INTERMEDIO.
Resultados 118
4.1.2.1.2 CP 746799
Clínica
Paciente del género femenino con 49 años de edad diagnosticada por citometría
de flujo con Leucemia Mieloide Aguda el 07/02/2014, subclasificación M6, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 4230 cel/µl
de leucocitos, 3300 cel/µl de linfocitos, 250 cel/µl de neutrófilos (leucopenia ligera
y neutropenia absoluta), porcentaje de blastos en médula ósea del 5% y la
concentración de hemoglobina de 8 g/dL (anemia moderada). Inicia el primer ciclo
del tratamiento con esquema 7+3 el 08/02/2014, el 07/03/2014 se realizó una
valoración a la respuesta el tratamiento y para la fecha no tenía blastos en médula
ósea por lo cual logra remisión, la última fecha de contacto fue el 08/03/2014 el
estado vital para la fecha era vivo.
Citogenética
Paciente con complemento cromosómico femenino normal en cultivos de 24 y 48
horas sin estimulo, presenta cariotipo 46,XX[5] en cinco células de 7 analizadas
(Gráfica 4-15), es importante resaltar que se observaron 2 células con pérdida de
uno de los cromosomas 19, las cuales no representan evolución clonal. En el
cultivo de 72 horas con estimulo se observó un complemento cromosómico
femenino normal 46,XX en 93 células analizadas. Adicionalmente es evidente un
aumento en el tamaño de la heterocromatina del brazo lago del cromosoma 1
(1qh+).
119 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
El número de pérdidas totales de este paciente fueron 6 (100%) donde se
encontraron pérdidas casuales en los cromosomas 19 (33,3%), 5, 17, 22 y
cromosoma sexual X representando el 6,7% cada uno, sin ser definidos como
clones. No se evidenciaron ganancias totales o parciales de cromosomas en este
paciente.
Gráfica 4-15 Fotos cariotipos 746799. 45,XX,-19[2]. LUCIA 2.8 KARYO
Gráfica 4-14. Paciente 746799
46,XX
45,XX,-19
Resultados 120
El pronóstico para este paciente según propuesto por la clasificación de riesgo
European LeukemiaNet (ELN) es INTERMEDIO (Mrózek et al., 2012) ya que el
mismo grupo de clasificación tiene un ítem donde integran “algún otro clon
independiente”.
4.1.2.1.3 CP 826210
Clínica
Paciente del género femenino con 46 años de edad diagnosticada por citometría
de flujo con Leucemia Mieloide Aguda el 25/02/2014, subclasificación M2, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 24030 cel/µl
leucocitos, 2403 cel/µl linfocitos, 3604 cel/µl neutrófilos (leucocitosis moderada),
porcentaje de blastos en médula ósea del 77% y la concentración de hemoglobina
de 8,2 g/dL (anemias moderadas). Inicia el primer ciclo del tratamiento con
esquema 7+3 el 27/02/2014, el 17/03/2014 se realizó una valoración a la
respuesta el tratamiento y para la fecha tenía 12% blastos en médula ósea por lo
cual no logra remisión, la última fecha de contacto fue el 25/03/2014 el estado
vital para la fecha era vivo.
Citogenética
Paciente con complemento cromosómico femenino normal en cultivos de 24 y 48
horas sin estimulo, presento cariotipo 46,XX en 37 células. En el cultivo de 72
horas con estimulo un complemento cromosómico femenino anormal se observó
mos 45,X,-X[4]/46,XX[63] (Gráfica 4-16 y 4-17), es evidente la pérdida recurrente
del cromosoma sexual X (30%) en 4 células sin definirse como clon y 63 células
121 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
presentaron complemento cromosómico normal 46,XX. El pronóstico para este
paciente con cariotipo normal en cultivos de 24 y 48 horas propuesto por Foran,
et al., 2010 es INTERMEDIO.
El número de pérdidas totales de este paciente fueron 13 (100%) donde se
encontraron pérdidas adicionales a la ya antes mencionada en cultivos directos
de los cromosomas 2, 7, 11 (7,7% cada uno) y 13, 18, 21 (15,4% cada uno) estas
pérdidas no se definieron como clones.
Gráfica 4-17 Fotos cariotipos 826210. Mos 45,X,-X[4]/46,XX[63]. LUCIA 2.8
KARYO
46,XX
45,X,-X
72 HORAS
Gráfica 4-16 Paciente 826210
Resultados 122
4.1.2.1.4 CP 212580
Clínica
Paciente del género masculino con 70 años de edad diagnosticado por citometría
de flujo con Leucemia Mieloide Aguda el 21/04/2014, subclasificación M5b, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 30300 cel/µl
de leucocitos, 3780 cel/µl de linfocitos, 2980 cel/µl de neutrófilos (leucocitosis
marcada), porcentaje de blastos en médula ósea del 70% y la concentración de
hemoglobina de 10 g/dL (anemia ligera). Inicia el primer ciclo del tratamiento con
Citarabina el 23/04/2014, no logra remisión y la última fecha de contacto fue el
07/05/2014 el estado vital para la fecha era vivo.
Citogenética
Paciente con complemento cromosómico masculino normal en cultivos de 24 y
48 horas sin estimulo 46,XY en 5 células. En el cultivo de 72 horas con estimulo
se observó un complemento cromosómico masculino normal 46,XY en 61 células
(Gráfica 4-18), se evidencio en todas las células analizadas la inversión o el
heteromorfismo del cromosoma 9 en las regiones p12 y 13. El número de pérdidas
totales de este paciente fueron 7 (100%) en los cromosomas 18, 19 y 20 (28,6%
cada uno) estas pérdidas no fueron definidas como clones. El pronóstico para
este paciente con cariotipo normal propuesto por la European LeukemiaNet (ELN)
y Foran, et al., 2010 es INTERMEDIO.
123 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Gráfica 4-18 Fotos cariotipos 212580. 46,XY. LUCIA 2.8 KARYO
4.1.2.1.5 CP 099690
Clínica
Paciente del género femenino con 59 años de edad diagnosticada por citometría
de flujo con Leucemia Mieloide Aguda el 25/04/2014, subclasificación M6, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 50790 cel/µl
de leucocitos, 11681 cel/µl de linfocitos, 507 cel/µl de neutrófilos (leucocitosis
marcada y neutropenia absoluta), porcentaje de blastos en médula ósea del 79%
y la concentración de hemoglobina de 8,1 g/dL (anemia moderada). Inicia el
primer ciclo del tratamiento con esquema 7+3 el 05/05/2014, no logra remisión y
la última fecha de contacto fue el 26/05/2014 el estado vital para la fecha era
muerto.
Resultados 124
Citogenética
Paciente con complemento cromosómico femenino anormal en cultivos de 24 y
48 horas sin estimulo, presento cariotipo 46,XX,del(11)(q21q23)[1]/46,XX,idem,
inv(3)(p26q22)[2]/46,XX[24] (Gráfica 4-20), se evidencian 3 líneas clonales la
primera en 1 célula y que presento una deleción parcial del cromosoma 11 en las
regiones q21 y q23, en la segunda línea se presentó 2 células con la misma
deleción junto a la inversión en el cromosoma 3 entre las regiones p26 y q22 y
una tercera línea presento cariotipo normal 46,XX en 24 células (Gráfica 4-19).
En el cultivo de 72 horas con estimulo un complemento cromosómico femenino
normal se observó en 37 células 46,XX.
46,XX
46,XX,del(11)(q21q23)
46,XX,ídem,inv(3)(p26q22)
Gráfica 4-19. Evolución Clonal Paciente 099690
125 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
El número de pérdidas totales de este paciente fueron 10 (100%) de los
cromosomas 11 (27,3%) y X, 10, 19 y 21 (18,2% cada uno) este último grupo no
se definieron como clones. El pronóstico para este paciente según propuesto por
la clasificación de riesgo European LeukemiaNet (ELN) es ADVERSO con una
mediana de supervivencia 12.2 meses (Mrózek et al., 2012), mientras que
Grimwade, et al., 2010 lo clasifica como de riesgo INTERMEDIO esta relación se
realizó con base en la pérdida del brazo largo del cromosoma 11 ya que no se
encontró reporte para la inversión acá presentada entre brazo corto y largo del
cromosoma 3, más sin embargo el mismo grupo de clasificación tiene un ítem
donde integran “algún otro clon independiente”.
Gráfica 4-20 Fotos cariotipos 099690.
46,XX,del(11)(q21q23)[1]/46,XX,idem,inv(3)(p26q22)[2]. LUCIA 2.8 KARYO
Resultados 126
4.1.2.1.6 CP 466066
Clínica
Paciente del género femenino con 33 años de edad diagnosticada por citometría
de flujo con Leucemia Mieloide Aguda el 16/07/2014, subclasificación M4, el
hemograma en sangre periférica al momento del diagnóstico reporta 60090 cel/µl
de leucocitos, 7870 cel/µl de linfocitos, 19750 cel/µl de neutrófilos (leucocitosis
marcada, linfocitosis absoluta y neutrofilia absoluta), porcentaje de blastos en
médula ósea del 16% y la concentración de hemoglobina de 7,5 g/dL (anemia
marcada). Inicia el primer ciclo del tratamiento con esquema 7+3 el 19/07/2014,
el 11/08/2014 se realizó una valoración a la respuesta del tratamiento y para la
fecha no tenía blastos en médula ósea por lo cual logra remisión y el estado vital
era vivo.
Citogenética
Paciente con complemento cromosómico femenino normal en cultivos de 24 y 48
horas sin estimulo, presento cariotipo 46,XX[20]. En el cultivo de 72 horas con
estimulo un complemento cromosómico femenino normal se observó en 80
células 46,XX (Gráfica 4-21). Las pérdidas totales de este paciente fueron 5
(100%) de los cromosomas 11 y 21 con el 40% cada uno sobre el total de las
pérdidas es de resaltar que no se definieron como clones. El pronóstico para este
paciente según propuesto por Foran, et al., 2010 para cariotipos normales es
INTERMEDIO.
127 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Gráfica 4-21 Fotos cariotipos 466066. 46,XX. LUCIA 2.8 KARYO
Resultados 128
Tabla 4-5 Consolidado Citogenética Convencional
Nota: E.P: Enfermedad Primaria
CODIGOPACIENTE
E.P CARIOTIPO COVENCIONAL DE 24 y 48HORAS
CARIOTIPOCONVENCIONAL 72HORAS
CARIOTIPO
607410 LMA 46,XY,del(11)(q21q23)[6] 46,XY[94] 46,XY,del(11)(q21q23)[6]/46,XY[94]498620 SMD N/M No Índice Mitótico N/M No Índice Mitótico N/M No Índice Mitótico323008 SMD 45,X,-X[5]/45,XX,-21[2]/44,X,-X,-21[2] 46,XX[91] 45,X,-X[5]/45,XX,-21[2]/44,X,-X,-21[2]/46,XX[91]746799 LMA 46,XX[5] 46,XX[93] 46,XX[98]826210 LMA 46,XX[37] mos 45,X,-X[4]/46,XX[59] mos 45,X,-X[4]/46,XX[96]640124 SMD 46,XY,i(17)(q10)[1]/46,XY,idem,t(4;9)(p15;p
23)[2]/46,XY[18]46,XY[79] 46,XY,i(17)(q10)[1]/46,XY,idem,t(4;9)(p15;p23)[2]/
46,XY[97]656335 SMD N/M No Índice Mitótico N/M No Índice Mitótico N/M No Índice Mitótico212580 LMA 46,XY[5] 46,XY [61] 46,XY[66]191286 SMD 46,XY,inv(7)(p21p15)[4]/46,XY[20] 46,XY[29] 46,XY,inv(7)(p21p15)[4]/46,XY[49]099690 LMA 46,XX,del(11)(q21q23)[1]/46,XX,idem,
inv(3)(p26q22)[2]46,XX[37] 46,XX,del(11)(q21q23)[1]/46,XX,idem,
inv(3)(p26q22)[2]/46,XY[61]466066 LMA 46,XX[20] 46,XX[80] 46,XX[100]
Resultados 129
4.1.3 Caracterización de Supervivencia
La caracterización de supervivencia realizada a través de un modelo de riesgos
permitió identificar en el caso de los pacientes con SMD que el intervalo de días
dado por la supervivencia desde la fecha de diagnóstico hasta la última fecha de
contacto fue de 15 a 62 días y que la presencia de pérdidas y ganancias totales y
parciales de cromosomas generan un riesgo en los pacientes con relación a los días
de supervivencia y el estado vital. De igual manera para los pacientes con LMA las
pérdidas totales y parciales fueron consideradas como riesgosas y el intervalo de
días fue 16 a 58, indicando mayor riesgo de muerte para los pacientes de este
estudio con LMA.
4.1.4 Análisis de Regresión Logística
Este análisis se realizó solo a pacientes con LMA ya que en este grupo fue mayor la
proporción que alcanzaron la remisión completa y esto cuando se aplicó el esquema
7+3 en comparación con los que se les recibieron tratamiento con Citarabina.
130 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Tabla 4-6: En las siguientes matrices se relacionan las fechas de diagnóstico, de inicio de tratamiento y de último contacto, junto a la relación en días delas mismas, estado vital a las cuatro semanas, Clasificación de Moorman anormalidades cromosómicas y tratamiento.
Matriz de Datos SMD
Matriz de Datos LMA
CP: Código del Paciente; EP: Enfermedad Primaria; FDX: Fecha Diagnóstico; DS: Días Supervivencia; FIT: Fecha Inicio Tratamiento; UC: Ultimo Contacto; DST: Días Supervivencia Tratamiento; EV: Estado Vital (V: vivo, M: muerto);RC: Remisión completa (0: No; 1: Si); Mono: Monosomías; Triso: Trisomías; Trans: Translocaciones; Inv: Inversiones; Iso: Isocromosoma; Pol: Poliploidia; Nul: Nulisomia; Inducción 7x3; Citarabina; Decitabine; Azacitidine; Otros (0:No; 1: Si)
CP EP FDX DS FIT UC DST EV RC Mono Triso Trans Inv Iso Pol Nul Inducción7x3
Citarabina Deitabine Azacitidine Otros
498620 SMD 28/11/2013 5 NA 03/12/2013 NA M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
323008 SMD 26/12/2013 62 23/01/2014 26/02/2014 34 V 0 14 2 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
640124 SMD 11/06/2014 39 27/06/2014 20/07/2014 23 V 0 14 1 2 0 3 1 2 0 0 0 1 0
656335 SMD 14/03/2014 23 26/03/2014 06/04/2014 11 M 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
191286 SMD 07/07/2014 15 08/07/2014 22/07/2014 14 V 0 5 3 1 4 0 0 2 0 0 0 1 0
CP EP FDX DS FIT UC DST EV RC Mono Triso Trans Inv Iso Pol Nul Inducción7x3
Citarabina Deitabine Azacitidine Otros
607410 LMA 27/11/2013 58 04/12/2013 24/01/2014 51 M 0 21 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
746799 LMA 07/02/2014 29 08/02/2014 08/03/2014 28 V 1 6 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0
826210 LMA 25/02/2014 28 27/02/2014 25/03/2014 26 V 0 13 1 0 0 0 1 4 1 0 0 0 0
212580 LMA 21/04/2014 16 23/04/2014 07/05/2014 14 V 0 7 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
099690 LMA 25/04/2014 31 05/05/2014 26/05/2014 21 M 0 10 0 1 3 0 1 3 1 0 0 0 0
466066 LMA 16/07/2014 26 19/07/2014 11/08/2014 23 V 1 5 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
Resultados 132
4.2. Hibridación In Situ Fluorescente
Once (11) pacientes fueron evaluados con las sondas AML1/ETO
(RUNX1/RUNX1T1) Translocation, Dual Fusion y CBFß/MYH11 Translocation, Dual
Fusion (Cytocell). A nueve (9) pacientes se les realizo análisis por FISH en 10
metafases y 100 interfases y a dos pacientes con cultivos negativos para metafases
se les realizó el análisis en 100 interfases. Los resultados obtenidos para los once
(11) pacientes fueron negativos para estas dos sondas que son consideradas como
los rearreglos frecuentes (Tabla 4-6).
Tabla 4-7. Resultados sondas FISH AML1/ETO y CBFß/MYH11
CODIGOPACIETE
ENFERMEDADPRIMARIA
FISHt(8;21)
AML1/ETO
FISH t(16;16)CBFß/MYH11
607410 LMA N N498620 SMD N N323008 SMD N N746799 LMA N N826210 LMA N N640124 SMD N N656335 SMD N N212580 LMA N N191286 SMD N N099690 LMA N N466066 LMA N N
133 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
4.2.1 Caracterización FISH Pacientes SMD
Sonda AML1/ETO
Gráfica 4 - 22 Fotos núcleos y metafases sonda AML1/ETO. LUCIA 2.85 FISH
AML1 Cromosoma 21 señal roja; ETO Cromosoma 8 señal verde
Sonda CBFß/MYH11
Gráfica 4 - 23 Fotos núcleos y metafases sonda CBFß/MYH1. LUCIA 2.85 FISH
CBFβ Cromosoma 16 señal roja; MYH11 Cromosoma 16 señal verde
Resultados 134
4.2.2 Caracterización FISH Pacientes LMA
Sonda AML1/ETO
Gráfica 4 - 24 Fotos núcleos y metafases AML1/ETO. LUCIA 2.85 FISH
AML1 Cromosoma 21 señal roja; ETO Cromosoma 8 señal verde
Sonda CBFß/MYH11
Gráfica 4 - 25 Fotos núcleos y metafases sonda CBFß/MYH1. LUCIA 2.85 FISH
CBFβ Cromosoma 16 señal roja; MYH11 Cromosoma 16 señal verde
135 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
4.3 Hibridación Genómica Comparada(CGH)
4.3.1 Extracción ADN
La obtención de ADN se realizó con el método de extracción con cloroformo en
muestras de sangre periférica y médula ósea, las concentraciones de ADN con este
método fueron entre 50 y 5000 ng/µl dependiendo del estado de la muestra del
paciente. Cabe resaltar que esta cantidad de ADN es la óptima para tener buenos
resultados y que se ha determinado por diferentes protocolos. La pureza es también
un factor crítico que hace referencia a la relación de absorbancia entre 260nm y
280nm, ya que permitió asegurar que no se estuviera marcando proteínas o ARN;
por lo tanto para poder procesar las muestras, estas debían estar en un rango de
1.8 a 2.0 de pureza. Las muestras de ADN se congelaron a -20°C.
Tabla 4-8. Cuantificación ADN
PACIENTE T.MUESTRA CONCENTRACIÓN A230 A260 A280 A320 A260/A280 A260/A230
CTR 1 SP 1305,00 12,1 26,24 14,93 0.126 1,76 2,10
CTR 2 SP 153,00 3,71 3,73 2,49 0,67 1,68 1,00
CTR 3 SP 864,30 8,02 17,61 9.91 0,32 1,80 2,24
CTR 4 SP 623,00 5,79 12,87 7,34 0,41 1,79 2,31
CTR 5 SP 364,50 3,39 7,26 3,98 -0,03 1,81 2,13
CTR 6 SP 161,00 3,17 3,45 2,03 0,23 1,78 1,09
CTR 7 SP 176,00 1,81 3,48 1,91 -0,03 1,80 1,90
CTR 8 SP 628,00 5,98 12,98 7,39 0,42 1,80 2,25
CTR 9 SP 699,50 6,58 13,86 8,14 0,86 1,78 2,27
CTR 10 SP 615,00 5,68 12,60 7,30 0,39 1,76 2,29
607410 SP 537,50 5,33 11,72 6,92 0,97 1,80 2,46
498620 SP 59,00 1,82 2,08 1,54 0,90 1,84 1,28
498620 M 6,90 0,33 0,23 0,17 0,09 1,87 0,58
323008 M 528,50 5,14 11,23 6,55 0,66 1,79 2,35
323008 SP 246,50 1,81 3,48 1,91 -0,03 1,80 1,90
746799 SP 808,00 6,85 16,11 8,84 -0,04 1,81 2,34
Resultados 136
4.3.2 Digestión con Enzima DpnII
Con esta enzima se obtuvieron fragmentos de ADN entre 100 a 2000 pb que
permitieron la realización de la sonda de pacientes y controles.
Gráfica 4-26.
M.Marcador 100-1000 pb; 1.1-1.2.Digestión DpnII Control 1; 2.1-2.2. Digestión DpnII Control 2; 3.1-3.2.Digestión DpnII Control 3; 4.1-4.2. Digestión DpnII Control 4; 5.1-5.2. Digestión DpnII Control 5; 6.1-6.2. Digestión DpnII Paciente 607410; 7.1-7.2. Digestión DpnII Paciente 323008; M.Marcador 100-1000pb; 8.1-8.2. Digestión DpnII Paciente 498620; 9.1-9.2 Digestión DpnII Paciente 746799; 10.1-10.2Digestión DpnII Paciente 746799; 11.1-11.2 Digestión DpnII Paciente 826210; 12.1-12.2 DigestiónDpnII Paciente 640124; 13.1-13.2 Digestión DpnII Paciente 212580; 14.1-14.2 Digestión DpnII Paciente099690.
826210 SP 1565,00 14,41 31,65 18,45 0,35 1,72 2,26
826210 M 757,00 6,55 15,18 8,41 0,04 1,80 2,32
640124 SP 1508,00 18,44 31,18 21,79 1,01 1,45 1,73
656335 M 6,30 0,26 0,17 0,14 0,04 1,31 0,58
212580 M 3666,00 33,82 73,70 42,06 0,38 1,75 2,10
099690 SP 5109,00 62,00 102,24 72,34 0,05 1,07 1,42
099690 M 3345,00 2,86 6,50 3,57 0,19 1,80 2,25
191286 M 930,0 3,4 7,3 4,0 0,0 1,8 2,1
191286 SP 750,0 8,0 17,6 9.91 0,3 1,8 2,2
466066 SP 1000,0 3,4 7,3 4,0 0,0 1,8 2,1
466066 M 830,0 5,7 12,6 7,3 0,4 1,8 2,3
Gráfica 4 - 26 Foto digestión enzima DpnII 100-2000 pb
M 1.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.24 5.1 5.2
466.1 6.2 7.1 7.2
M 8.1 8.2 9.1 9.2 10.1 10.2 11.1 11.2 12.1 12.2 13.1 13.2 14.1 14.2
137 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Los fragmentos de ADN de pacientes (Verde) y ADN de referencias (Rojo) fueron
purificados y marcados directamente (PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit -
Kreatech). La sonda y la lámina blanco se desnaturalizaron por separado según
anexo 10 después de las 92 horas se visualizó de la siguiente manera (Gráfica 4-
27).
Gráfica 4-27 Hibridación Genómica Comparada. LUCIA 2.85 CGH
A.Visualización con DAPI (Contraste). B. Visualización con verde (495 nm). C. Visualización con rojo(547 nm). D. Superposición de los tres paneles A, B y C.
Este procedimiento se realizó para obtener la base de datos de controles (5
femeninos y 5 cinco masculinos) con el fin de determinar los perfiles de relación de
las intensidades de fluorescencias junto a un análisis estadístico de los mismos que
permitió obtener la normalización de los perfiles característicos de cada cromosoma
Resultados 138
y a su vez la estandarización de los umbrales del software ya sean fijos (CGH) o
móviles (HR-CGH).Para umbrales o intervalos fijos el número de controles
evaluados fue suficiente para obtener normalidad en los perfiles y la posterior
detección de pérdidas y ganancias. No fue posible la normalización de los intervalos
dinámicos, debido a que el software LUCIA-CGH 2.85 no permitió el ingreso de más
de 15 controles (10 controles realizados por el laboratorio y 5 que venían incluidos
en el software).
Gráfica 4-28 CGH intervalos fijos –X. LUCIA 2.85 CGH
139 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Gráfica 4-29 HR-CGH umbrales móviles LUCIA 2.85 CGH: Se observa pérdida
parcial del cromosoma X
Como ya se había mencionado la caracterización de pérdidas y ganancias se realizó
en 10 controles (Tabla 4-8) evaluando 10 metafases (fotos) para cada uno de ellos,
uno (1) de género femenino presento pérdida parcial del cromosoma sexual X.
Resultados 140
Tabla 4-9. Controles CGH. LUCIA 2.85 CGH
Control CGH HR-CGH1 rev ish XX rev ish XX2 rev ish XX rev ish XX3 rev ish XX rev ish XX4 ish cgh dim (X)(q21q25) ish cgh dim (X)(q21q25)5 rev ish XX rev ish XX6 rev ish XY rev ish XY7 rev ish XY rev ish XY8 rev ish XY rev ish XY9 rev ish XY rev ish XY10 rev ish XY rev ish XY
Posteriormente a la normalización de los perfiles por el software se procesaron las
muestras de los 11 pacientes siguiendo el mismo protocolo de los controles,
obteniendo resultados negativos para la hibridación de las sondas.
Discusión 141
5. Discusión
Este estudio proporciona la oportunidad de generar un espacio en la investigación
en cuanto a la identificación anormalidades cromosómicas en pacientes que
conforman una enfermedad que es considera la novena causas de muerte en
población colombiana (http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx).
En el país la información apropiada y completa sobre el comportamiento clínico y
epidemiológico de estas enfermedades es escaso, lo que dificulta la identificación
de los grupos, perfiles de riesgo, así como el diagnóstico temprano y el tratamiento
oportuno que repercute directamente en el pronóstico de los pacientes, por esto nace
la necesidad de dar un primer paso en el campo y si bien es cierto que en los últimos
años se han realizado esfuerzos para mejorar el panorama de leucemias agudas en
el país implementando programas como el PILAC (Programa de investigación e
innovación en Leucemia Aguda y Crónica) donde su principal objetivo es desarrollar,
mejorar e implementar estrategias de vigilancia, diagnóstico, tratamiento y
evaluación del pronóstico aún faltan políticas, investigaciones y recursos que
permitan fortalecer estos factores.
En este estudio se presentaron las características clínicas y citogenéticas
(convencional y molecular) de un grupo de pacientes con Síndrome mielodisplásico
(SMD) y Leucemia mieloide Aguda (LMA), es importante resaltar que los datos
citogenéticos en el 81.8% de los pacientes fueron exitosos y en el 18.2% fallaron
como resultado de las condiciones clínicas propias de los pacientes (leucopenia
marcada, linfopenia absoluta, neutropenia absoluta y anemia).
142 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Queda claro que estas enfermedades son grupos heterogéneos y que cada una
tiene sus características clínicas, morfológicas, fenotípicas y citogenéticas. Las
anomalías cromosómicas y los reordenamientos moleculares resultantes pueden
proporcionar información sobre la patogenia de cada enfermedad en cada paciente.
En el presente estudio el rango de edad al diagnóstico en pacientes con SMD fue 24
a 64 con una media de 48 años, otros estudios reportan una edad media de 65-70
años (Schlegelberger, Göhring, Thol, & Heuser, 2012) para los pacientes con LMA
incluidos el intervalo fue de 32 a 70 con una media de 48,2 años, otros estudios
reportan esta enfermedad en pacientes de más de 70 años (Morrissette & Bagg,
2011). Lo que indicaría que en el grupo de pacientes de este estudio el diagnóstico
de la enfermedad fue más temprano comparando con lo reportado en la mayoría de
la literatura.
En cuanto la información clínica de los pacientes con SMD cuatro (4) presentan
leucopenia, tres (3) linfopenia, cuatro (4) neutropenia y todos (5) presentaron
anemia. Para LMA cinco (5) presentaron leucocitosis, tres (3) presentan neutropenia,
uno (1) neutrofilia y todos (6) anemia, lo que concuerda con las características
clínicas de cada enfermedad previamente reportado (Jaffe & Harris, 2011; Schmaier,
Alvin H., 2012).
En este proyecto las anormalidades cromosómicas fueron detectadas en el 60% de
los pacientes con SMD y que concuerda con lo mencionado por Tiu en el 2011, que
describió anormalidades en el cariotipo del 46-50% de los casos, contrastando con
el 14% que reporta Schanz en el 2012. En pacientes con LMA se evidenciaron
Discusión 143
anormalidades en el cariotipo en un 67%; Cheng en el 2009 y Dohner en el 2008
reporta que para adultos con LMA de Novo, aproximadamente el 56% de
anormalidades cromosómicas fueron detectadas.
El número de anormalidades presentes en el cariotipo juegan un papel importante
como indicador pronóstico de los pacientes, permitiendo clasificarlos en cariotipos
monosomales y cariotipos complejos (Chin, Noor, Ismail, Ahid, & Zakaria, 2013). En
nuestro estudio el número de anormalidades cromosómicas presentes en el cariotipo
de los pacientes con SMD fue de una (1), dos (2) o tres (3) y en pacientes con LMA
de una (1) o dos (2), así que no se presentaron cariotipos monosomales ni
complejos.
En SMD dos pacientes linfopenicos presentaron cultivos celulares sin índice mitótico,
los demás presentaron cultivos positivos, evidenciado pérdidas cromosómicas
frecuentes de X (21,21%), 21 (18,18%) y 17 (9,09%), en LMA las seis (6) muestras
cultivos presentaron índice mitotico, las pérdidas recurrentes fueron en cromosoma
11 (16,13%), 21 (11,29%) y X (11,29%).
La pérdida de los cromosomas sexuales (pérdida de Y en los hombres y X en las
mujeres) es un fenómeno relacionado con la edad avanzada según varios autores
pero también puede ser asociado con malignidades hematológicas, la pérdida del
cromosoma Y está contemplada dentro de los cambios citogenéticos y se ha
evaluado el pronóstico o la escala de riesgo del mismo en LMA, mas sin embargo,
no está claro si la anormalidad es un marcador para el clon leucémico (Bakshi, 2004).
En dos (2) de nuestros pacientes de género masculino (1 SMD y 1 LMA) se
144 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
identificaron células con la única pérdida del cromosoma Y (640124 y 607410); esta
pérdida se reporta como característica de pacientes con LMA-M2 siendo el caso
para el paciente 607410.
Ahora bien, presentar la pérdida del cromosoma X en mujeres es una rara
anormalidad en SMD y LMA y se ha descrito que ocurre como una sola anormalidad
en el 0.2 - 0.3% de pacientes con estas malignidades hematológicas y en 1,5%
acompañada de otras alteraciones (Schanz et al., 2012). En la evaluación
citogenética inicial en grupos de pacientes jóvenes con LMA de novo se ha
comprobado que presentan cariotipo con monosomía del X y después del
tratamiento este clon desaparece (Abruzzese et al., 1997; Bakshi, 2004; Mohanty,
2004; Zeidana & Phatakb, 2008), por lo tanto, estos resultados sugieren que éstas
pérdidas pueden no ser un efecto de la edad y se apoya la hipótesis de que la pérdida
de cromosomas sexuales se debe a la evolución de un clon maligno que
acompañado de otras anormalidades hace pensar que éste puede ser la base para
dar origen a eventos neoplásicos, como en nuestro caso la paciente 323008.
Monosomías del cromosoma 21 presentes en 1, 2 o 3 células por paciente fueron
recurrentes en SMD (18,18%) (323008-640124) y LMA (11,29%) (826210-099690-
466066). Dicha monosomía es una anormalidad rara con frecuencia en SMD de
0,3% cuando se presenta sola, también puede ocurrir en combinación con más
alteraciones cromosómicas en una frecuencia de 0,5% (Bacher, Schanz, Braulke, &
Haase, 2015).Uno de los genes que se ve afectado por la pérdida o rearreglo del
mismo es el AML1 (RUNX1) que se cree, participa en el desarrollo de la
hematopoyesis normal (Hirai, 2002).
Discusión 145
El isocromosoma de 17 se presentó en el paciente 640124 con SMD; según reportes,
anormalidades en el cromosoma 17 se presentan en un 2% de pacientes con SMD
de novo, y tienen un pronóstico intermedio ya que esta anomalía citogenética es
producto de la rotura o división inadecuada de la región pericentromérica
conduciendo a la duplicación de brazo largo y a la pérdida del brazo corto del
cromosoma 17; así pues, la pérdida del gen supresor tumoral TP53 ubicado en ese
brazo, puede ocurrir sola o acompañada de otra anormalidad como en el caso de
este paciente que presento una t(4;9)(p15;p23) de la cual no aparece reporte en el
atlas Genetics Oncology ni artículos. Se ha reportado que en la región 4p15 se
encuentra el gen CD38 un receptor leucocitario con función inmunitaria y mediador
de apoptosis (Ferrero, Saccucci, & Malavasi, 1999) la mutación en el gen y por tanto
en la expresión del mismo, puede derivar en la enfermedad en estudio. En el locus
9p23 se encuentra un gen llamado JAK2 y sus mutaciones son tumorogénicas en
neoplasias mieloproliferativas, las translocaciones que implican los locus de JAK2
son de importancia oncogénica en leucemias agudas y síndromes
mielodisplásicos/mieloproliferativos (Hoeller, Walz, Reiter, Dirnhofer, & Tzankov,
2011), esta es una forma de caracterizar la translocación encontrada y brindar una
posible causa al fenotipo que presenta el paciente, por otro lado no existe reporte
alguno de la supervivencia relacionada con esta anormalidad pero si para el
i(17)(q10).
Se conoce que las deleciones dificultan la identificación de los genes que están
interviniendo en el proceso tumorigénico y que muy posiblemente pueden incluir
genes supresores tumorales (Fröhling, Scholl, Gilliland, & Levine, 2005). Las
pérdidas de información cromosómica se consideran raras en enfermedades
146 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
mieloides con una prevalencia reportada de 0.7% en LMA y SMD. La deleción del
cromosoma 11, es de gran importancia ya que permitió conocer la heterogeneidad
a nivel molecular de la región q23, allí se ubica un gen llamado MLL que
dependiendo de los puntos de ruptura, puede o no guardar su integridad o
presentarse en forma monoalélica lo que podría relacionarse con la iniciación o
progresión de malignidades mieloides (Ma et al., 2002); como es el caso de los
pacientes 607410 (46,XY,del(11)(q21q23)[6]) y 099690 (46,XX,del(11)(q21q23)[1]/
46,XX,idem, inv(3)(p26q22)[2]).
Las inversiones se caracterizan básicamente por presentar dos puntos de ruptura y
la región ubicada entre ellos realiza un giro de 180°, lo que genera un
reordenamiento de la información genética, cambios en la expresión de proteínas y
diferentes asociaciones génicas que puedan estar provocando la malignidad. Los
cromosomas implicados en estas anormalidades fueron el 7 y 3. La inversión del
cromosoma 7 y la inversión del cromosoma 3 se presentaron en el brazo corto y de
estas no se tienen reportes que indiquen características, genes implicados y factor
pronóstico de las mismas para SMD y LMA. Se conoce que el cromosoma 7 activa
oncogenes e inactiva genes supresores tumorales que juegan roles críticos en la
génesis y progresión de neoplasias (K. Döhner et al., 1998).
En cultivo de 72 horas estimulado con fitohemaglutinina, una paciente presento
alteraciones cromosómicas (monosomías), este resultado se considera extraño ya
que la fitohemaglutinina es un mitógeno que reconoce línea celular linfoide
específicamente linfocitos T, que se esperaría, no verse afectada tratándose de
enfermedades de línea mieloides; por tal motivo se realizó la revisión por segunda
Discusión 147
vez del caso pensando que podría ser constitutivo del paciente; se logró identificar
que la muestra recibida era de sangre periférica con un porcentaje promedio de
blastos del 70%, esta podría estar explicando en parte la presencia de células -X en
estos cultivos. Cabe resaltar que la única diferencia entre los cultivos directos e
indirectos es el agregar el mitógeno, de resto todas las demás condiciones son las
mismas para inducir el crecimiento y proliferación celular, lo que pudo haber
generado un ambiente propicio para mantener las células blasticas, mas sin
embargo también se sugiere que la perdida pueda estar relacionada con la edad
propia del paciente.
Las Ganancias cromosómicas se presentaron en menor proporción en LMA en
comparación con SMD donde se observó ganancias frecuentes del cromosoma 8
que concuerda con lo reportado por la literatura para estos pacientes, pero estas
ganancias no fueron significativas para el paciente como tal ya que no se
consideraron clones por su presencia en una o dos células, más sin embargo al
realizar el análisis en todos los pacientes esta resultaba ser la más frecuente.
Si bien es cierto los resultados para las dos sondas de FISH evaluadas t(8;21) y
t(16;16) fueron negativos para los 11 pacientes, es importante mencionar que para
el paciente (323008) se presentaron seis (6) interfases con una única señal roja
indicando la posible pérdida del gen AML1 ubicado en cromosomas 21, cabe resaltar
que la pérdida del gen no está directamente relacionado con la pérdida total del
cromosoma 21 para así asociarlo con los resultados obtenidos por citogenética
convencional, también podría sugerirse una aberración más compleja (translocación
148 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
criptica) o considerando el número de interfases con la presencia de la anormalidad
a la sobreposición como tal de la señal.
Para la técnica de CGH es de resaltar que los controles se realizaron con el protocolo
mencionado en el capítulo 3 pero al momento de procesar los pacientes con
SMD/LMA se presentaron dificultades como:
La reconstitución de citoplasma en las láminas blanco lo que pudo haber
interferido en la desnaturalización de la lámina y por tanto la hibridación de
la sonda. Ante esta situación se decidió realizar nuevos cultivos de linfocitos
de controles de láminas blanco y trabajar con botón o pellet fresco agregando
lavados con fijador carnoy (1:1). Según (Karhu et al., 1997) la preparación de
las láminas blanco influye dramáticamente en la hibridación y
consecuentemente en el análisis de CGH.
Gráfica 5-1. Interferencia Citoplasma con metafase/sonda
Identificando que el posible problema de la no hibridación era el citoplasma
se decide controlar dentro de lo posible los niveles de temperatura y
Discusión 149
humedad con calentadores y deshumidificadores; por otro lado se
implementó un método de digestión enzimática con pepsina para mejorar la
calidad de las láminas blanco y se procede a desnaturalizar de la manera ya
mencionada sin obtener resultados positivos de hibridación. Según Karhur
(1998) las condiciones ambientales resultan ser críticas y difíciles de
mantener.
Al trabajar con botones frescos el proceso de desnaturalización de la lámina
blanco se complica, ya que el tratamiento con formamida al 70% a 50°C
empleado previamente generó una sobre-desnaturalización sobre los
cromosomas blanco lo que se vio reflejado en la hibridación de la sonda pero
en los bordes del cromosoma (scaffold) ya que no tenían en si la estructura
cromosómica.
Gráfica 5-2. Sobredesnaturalización metafase blanco
Se procede a aumentar la temperatura de incubación de 37°C a 42°C por 92
horas, lo que posiblemente acrecentó la hibridación inespecífica obteniendo
150 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
como resultado la hibridación a lo largo de los cromosomas de manera no
homogénea (moteada) y no apta para el análisis con el software.
Gráfica 5.3. Aumento de temperatura en incubación
Se buscó dar solución al problema de la desnaturalización de la lámina
blanco implementando otro método basado en la desnaturalización con
NaOH mejorando los resultados de hibridación pero sin ser óptima para los
respectivos análisis.
Gráfica 5.4. Desnaturalización con NaOH
Discusión 151
Los post lavados se modificaron para no hacerlos tan astringentes sin
obtener resultados uniformes en la hibridación y aumentando en el
background (exceso de la sonda no hibridada) condiciones no óptimas para
el análisis.
Gráfica 5.5. Modificación post lavados
Cabe mencionar que también se modificó la realización de las sondas
marcadas directamente al aumentar el tiempo y la temperatura de
desnaturalización de la misma, efectuando un pre-annealing a 37°C por 1
hora antes de colocar la sonda en la lámina blanco, diluyendo los ADNs en
menor cantidad de solución de hibridación para así aumentar la
concentración, pero estas modificaciones no permitieron obtener resultados
positivos para la hibridación de manera uniforme y óptima para el análisis por
el software como si se tuvieron en los controles.
Se hace importante señalar que este método no es utilizado de manera rutinaria en
el diagnóstico clínico debido a lo dispendiosa y a los inconvenientes de la técnica
152 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
per se (Lichter& Bentz, 2000), tal vez esto pueda ser la causa de su aplicación solo
en investigación o casos especiales y posiblemente del desuso de la técnica en
países desarrollados, ya que se realizó contacto con diferentes universidades y
hospitales internacionales con el fin de buscar asesoría al respecto y muchos de
ellos informaron que la técnica ya no se estaba realizando por las mismas causas
mencionadas anteriormente, pero sin embargo se realizaron sugerencias con el fin
de dar solución a los inconvenientes antes mencionados. (Laboratoř molekulár ní
cytogenetiky, OLG FN Brno – Republica Checa; Laboratory Imaging, LUCIA -
Republica Checa; Grupo de Biología Celular, UAB – Barcelona; Grupo de Biología
Evolutiva, UBA - Buenos Aires).
Estos resultados permiten sugerir la implementación nuevas técnicas de análisis
como CGH array que sin necesidad de depender de metafases fortalecería el
diagnóstico, pronóstico, posible tratamiento y evolución de los pacientes con
enfermedades tan complejas como el cáncer. De igual manera resaltar la necesidad
de implementar guías internacionales en citogenética que permitan generar
estándares o unificar criterios entre los laboratorios que prestan estos servicios
sobre el manejo de la muestra y el análisis de la misma.
La supervivencia y tasa de remisión de los pacientes participantes en este estudio
fue relativamente bajo ya que 4 pacientes fallecieron (2 (40%) SMD y 2 (33,3%)
LMA) sin alcanzar a cumplir las 4 semanas de terapia de inducción y de observación.
Lo que revela problemas en elección del tratamiento para estos pacientes, que esta
se hace muchas veces por análisis citogenético clásico y molecular, lo que
Discusión 153
posiblemente se relacione con fallas en el desarrollo y análisis de las técnicas que
permita identificar marcadores cromosómicos para cada una de las enfermedades.
La baja tasa de remisión (2 LMA) de los pacientes permite confirmar la problemática
en la elección del tratamiento. Una de estas remisiones se presentó en un paciente
con cariotipo normal y que para la clasificación de riesgo ELN es intermedio. Es
entendible que en el país se dificulte realizar investigaciones en este campo por
factores como la financiación, la tecnología y demás limitantes, pero también es
importante resaltar que la mayoría de estos pacientes no superan la terapia de
inducción, que es muy probable que se desencadene en pérdidas fatales y que las
manifestaciones de la enfermedad se están dando tempranamente a diferencia de
otras regiones del mundo.
Conclusiones y Recomendaciones 154
6. Conclusiones y Recomendaciones Se identificaron anormalidades cromosómicas recurrentes en el 82% de los
pacientes con SMD y LMA lo que permitió analizar la evolución clonal en
cultivos directos (24 y 48 horas), La presencia de alteraciones cromosómicas
tuvieron mayor frecuencia en pacientes con LMA lo que se relaciona con la
progresión tumorogénica y el daño genómico que se pueda estar
presentando.
Monosomías frecuentes –X y -21 se encontraron presentes en este estudio
tanto para SMD como para LMA, indicando asociación entre enfermedades
y en el caso de SMD la evolución a LMA.
Las monosomías totales y parciales son las más recurrentes y riesgosas para
los paciente que conforman este estudio, lo que se evidencia con la
del(11)(q21q23) presente en dos pacientes y los cuales fallecieron antes de
terminar el ciclo de inducción, por lo que se ratifica el pronóstico ADVERSO
La identificación por citogenética convencional de (una) translocación y dos
(2) inversiones que no se habían reportado previamente, permiten proponer
posibles genes candidatos que expliquen el desenlace leucemogénico.
155 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
La descripción de estos hallazgos podrían llevar al desarrollo de nuevas
estrategias terapéuticas que beneficien la supervivencia de los pacientes con
SMD y LMA.
Aumentar el número de muestras que permitan caracterizar la población
colombiana para estas enfermedades y dar respuesta a la posible función
tumorogénica de los cromosomas sexuales.
Dar a conocer la importancia que tiene el realizar un análisis citogenético
integral, cumpliendo normativas internacionales como la European gen Test
(Hastings, Howell, Bricarelli, Kristoffersson, & Cavani, 2012). Esto debido a
que a nivel nacional no se cuentan con las guías que garanticen el buen
desarrollo tanto de la técnica como del análisis.
Resaltar la importancia de cada una de las técnicas desarrolladas en este
proyecto, ya que cada una brinda información que permite la caracterización
de los pacientes, por tanto no son técnicas que se reemplacen entre ella si
no por lo contrario son técnicas complementarias que permitirán refinar la
clasificación de los pacientes.
Como recomendación para la técnica de CGH se sugiere controlar las
condiciones ambientales del laboratorio.
Anexos 156
1.Anexos
Anexo 1. Consentimiento informado para participar enun estudio de investigación médica
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA- SEDEBOGOTÁ
INSTITUTO DE GENÉTICA
LABOTARIO DE CITOGENÉTICA
FECHA HORA CODIGO
Título del protocolo: ANÁLISIS CROMÓSOMICO POR MEDIO DE TÉCNICASCITOGENÉTICAS CLÁSICAS Y MOLECULARES EN UN GRUPO DEPACIENTES COLOMBIANOS CON LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA
Investigador Principal: Julia Samanda Martínez RicoSede donde se realizará el estudio: Universidad Nacional de Colombia SedeBogotá – Instituto de GenéticaNombre del Paciente:
A usted se le está invitando a participar en este estudio de investigación médicatitulado ANÁLISIS CROMÓSOMICO POR MEDIO DE TÉCNICASCITOGENÉTICAS CLÁSICAS Y MOLECULARES EN UN GRUPO DE PACIENTESCOLOMBIANOS CON LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA. Antes de decidir si participao no, debe conocer y comprender cada uno de los siguientes apartados.
Este proceso se conoce como consentimiento informado. Siéntase con absolutalibertad para preguntar sobre cualquier aspecto que le ayude a aclarar sus dudas alrespecto. Una vez que haya comprendido el estudio y si usted desea participar,entonces se le pedirá que firme esta forma de consentimiento, de la cual se leentregará una copia firmada y fechada.
Se le está invitando a participar en un estudio de investigación que tiene comoobjetivos Analizar cromosómicamente un grupo de pacientes colombianos conLeucemia Mieloide Aguda (LMA) por medio de técnicas citogenéticas clásicas ymoleculares para la detección de nuevas alteraciones a nivel cromosómico y asídelimitar nuevas regiones donde se puedan encontrar genes responsables de laaparición de esta enfermedad ofreciendo un soporte en el pronóstico y ladeterminación de la evolución de los pacientes con Leucemia Mieloide Aguda (LMA).
157 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Como quiera que usted ha sido recientemente diagnosticado con LMA y aún no seha iniciado su tratamiento, si acepta participar, le solicitaremos que nos done unamuestra de 5 ml de sangre y si en el proceso su Médico Hematólogo decide para eldiagnóstico preciso de su condición, extraerle material de la médula ósea, lesolicitaremos adicionalmente a él, que nos facilite parte de ese material.
Queremos explicarle que la toma de muestra de sangre será llevada a cabo porpersonal capacitado de la Institución Hospitalaria en condiciones adecuadas dehigiene, lo cual hace que este procedimiento tenga un riesgo mínimo, sin ningunaconsecuencia en la mayoría de los casos. En cuanto a la biopsia de médula ósea,este es un procedimiento que realizará su Hematólogo tratante de acuerdo con losestrictos protocolos de la Institución Hospitalaria y solo se llevará a cabo si él loconsidera indicado como parte del proceso de diagnóstico y de seguimiento, enningún caso se tomará solo para propósitos de la presente investigación.
En cuanto al beneficio derivado de su participación, este, le ofrecerá un soporte enla determinación de la evolución y el pronóstico de su enfermedad a través de uncompleto estudio citogenético con técnicas clásicas y moleculares que permitandetectar las diferentes alteraciones cromosómicas presentes y será de utilidad a suHematólogo para observar el desarrollo de la enfermedad y la respuesta altratamiento.
Adicionalmente, el grupo de investigación se compromete a tomar las medidasnecesarias para preservar su privacidad y la confidencialidad de sus datospersonales y los de su historia clínica. Sin embargo, tal como lo hemosmencionado, los datos derivados del presente estudio serán enviados a su MédicoHematólogo por la utilidad que ellos representan en el manejo de su enfermedad yserán entregados a usted personalmente en caso de solicitarlos.
Igualmente le reiteramos que su participación es voluntaria y que si aceptaparticipar, en cualquier momento puede retirarse, sin que esto cambie el tratamientomédico o la buena disposición de su médico tratante
En ningún caso las pruebas realizadas tendrán costo para usted o su familia, puestoque este proyecto será presentado para su financiamiento a la División deinvestigación de la Universidad Nacional y de obtener los recursos, estos cubriránla totalidad de la investigación, siendo los resultados finales, propiedad de la mismaUniversidad Nacional.
En caso de cualquier duda sobre su participación en la investigación o los adelantosde los resultados puede contactarse directamente con la Doctora Marta Bueno o
Anexos 158
con la Doctora Samanda Martínez, investigadoras principales, en el Instituto deGenética de la Universidad Nacional en el teléfono 3165000 extensión 11631.
Una vez leída y comprendida esta información y resueltas mis dudas con losinvestigadores, acepto participar en la presenta investigación
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADOYo,______________________________________________he leído ycomprendido la información anterior y mis preguntas han sido respondidas demanera satisfactoria. He sido informado y entiendo que los datos obtenidos en elestudio pueden ser publicados o difundidos con fines científicos. Convengo enparticipar en este estudio de investigación con la toma de muestra de 5 ml desangre periférica o 2 ml de médula ósea según lo indique el médico tratante.Recibiré una copia firmada y fechada de esta forma de consentimiento.
Nombre del Paciente Firma del Testigo
C.C
Firma del Paciente / Representante Legal Firma del Testigo C.CC.C
Fecha
159 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Anexo 2. Consentimiento informado INC
¿QUE SE ESTA BUSCANDO CON LA REALIZACION DE ESTE ESTUDIO?
El propósito de esta investigación en convenio con la Universidad Nacional deColombia es determinar mediante pruebas citogenéticas de laboratorio que secaracterizan por ser el estudio de los cromosomas y que contienen la informacióngenética, este estudio se realizará en las muestras tomadas de biopsia en médulaósea y de sangre que se realiza normalmente a todos los pacientes con leucemia;el fin del mismo es la detección de nuevas alteraciones a nivel cromosómico paraasí delimitar nuevas regiones donde se puedan encontrar genes responsables de laaparición de esta enfermedad y a su vez relacionarlos con la tasa de remisión a las4 semanas. Este proceso ofrecerá (1) la confirmación del diagnóstico, (2) lainformación útil para la clasificación, la estadificación y el pronóstico, (3) lainformación para guiar la elección apropiada de la terapia, y (4) la prueba de laremisión o la recaída en leucemias.
¿QUE CONDICIONES DEBO CUMPLIR PARA INGRESAR AL ESTUDIO?
Ser paciente hombre o mujer mayor de 18 años de edad y tener diagnósticopresuntivo de leucemia y que durante el procedimiento de aspirado y biopsia demédula ósea realizada para confirmar el diagnóstico de su enfermedad, se puedaobtener una muestra adicional para el análisis citogenético. Así mismo, es necesarioque se confirme el diagnóstico de leucemia mieloide aguda por un método especialllamado citometría de flujo.
¿QUE TIPO DE PROCEDIMIENTOS ME REALIZARAN?
Los pacientes con sospecha de leucemia aguda requieren para su diagnóstico, larealización del procedimiento conocido como aspirado y biopsia de médula ósea.Durante este procedimiento se toman muestran para realizar diferentes técnicasnecesarias para una adecuada clasificación de la enfermedad lo que permite planearun tratamiento
CONSENTIMIENTO INFORMADO
COMITÉ DE ETICA INDEPENDIENTE
VERSIÓN 1.0: INSTITUTO NACIONAL DECANCEROLOGIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA –SEDE BOGOTÁ
FECHA: 25 DE SEPTIEMBRE DE 2013PAGINA: 2/4
CONFIDENCIAL
Anexos 160
adecuado. Para los pacientes que voluntariamente acepten participar, se les tomarádurante el mismo procedimiento una muestra adicional consistente en dos tubos(Heparina EDTA) de tres centímetros cúbicos cada uno con sangre obtenida a partirde la médula ósea, este procedimiento será realizado por el médico hematólogo -investigador secundario del estudio (Dr. Leonardo Enciso) y no tendrá diferencias encuanto a la técnica con la que se realiza habitualmente para los pacientes con estaenfermedad, así mismo se tomarán dos tubo de cuatro centímetros cúbicos desangre periférica tomada por la enfermera a cargo para posteriormente sertransportadas a la Universidad Nacional de Colombia – Instituto de Genética –Laboratorio de Citogenética (6).
¿QUE BENEFICIO ESPERO RECIBIR POR PARTICIPAR EN ESTE ESTUDIO?
No recibirá ningún beneficio económico por su participación en este estudio deinvestigación. Al participar en el mismo, tendrá la posibilidad de colaborar con lainvestigación en esta área en pacientes colombianos. El conocimiento que se generede este tipo de investigaciones puede permitir a los médicos y otros científicosdesarrollar formas de diagnóstico, tratamiento y seguimiento más efectivas para estaenfermedad. Esto podrá beneficiar a otros pacientes con esta misma enfermedad ygenerar nuevo conocimiento sobre la misma. Si tiene alguna inquietud o preguntaconcerniente a sus derechos, por favor comunicarse con el investigador olaenfermera/coordinadora del estudio (datos adjuntos).
¿EN QUE CASO DE TENER ALGUN DAÑO POR PARTICIPAR EN ESTEESTUDIO QUE DEBO HACER?
Como no se realizarán procedimientos adicionales a los que usted requiere para eldiagnóstico de su enfermedad y únicamente se tomará una pequeña muestraadicional durante el primer procedimiento que se le realice, no se espera ningúndaño por la participación en este estudio. En caso de dudas preguntarle alinvestigador principal/secundario o a cualquiera de los miembros del equipo deinvestigación.
CONSENTIMIENTO INFORMADO
COMITÉ DE ETICA INDEPENDIENTE
VERSIÓN 1.0: INSTITUTO NACIONAL DECANCEROLOGIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA – SEDEBOGOTÁ
FECHA: 25 DE SEPTIEMBRE DE 2013PAGINA: 3/4
CONFIDENCIAL
161 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
¿DE QUE MANERA SE PROTEGERA MI PRIVACIDAD?
Si usted decide participar en este estudio, el médico del estudio y el equipo deinvestigación utilizarán la información de su historia clínica y los resultados delaboratorio, para conocer la evolución de su enfermedad.
Las muestras que se tomen para los análisis requeridos para el estudio seránidentificadas con un número asignado completamente al azar de manera que no sepueda identificar quien es el dueño de cada muestra. Esta información será deconocimiento exclusive del investigador principal/secundario y de los miembros delequipo de investigación que el mismo designe. A sus muestras no se les realizaráningún procedimiento adicional al análisis citogenético como se ha explicado en esteconsentimiento.
Los datos que se obtengan serán registrados en un formulario que estará identificadocon el mismo número de sus muestras el cual será asignado completamente al azary en ningún caso se identificara por su nombre, número de cedula o de historiaclínica.
¿QUE ACEPTO AL FIRMAR ESTE DOCUMENTO?
• Que he leído y comprendido este formato de consentimiento• Que he tenido la oportunidad de formular preguntas y estas han sidocontestadas• Que entiendo que mi participación en este estudio es voluntaria• Que doy permiso para que se use y comparta la información sobre mí salud,tal como se describe en este formato• Que doy permiso para que se recoja una muestra adicional de mí médulaósea durante el mismo procedimiento de aspirado y biopsia de médula óseay una muestra adicional de sangre periférica necesarias para mi diagnósticoy para que se analicen cromosómicamente.• Puedo elegir no participar en el estudio o abandonarlo en cualquiermomento, comunicándoselo al médico del estudio. No perderé ningúnbeneficio.• Recibiré una copia firmada de este formato de consentimiento
CONSENTIMIENTO INFORMADO
COMITÉ DE ETICA INDEPENDIENTE
VERSIÓN 1.0: INSTITUTO NACIONAL DECANCEROLOGIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA –SEDE BOGOTÁ
FECHA: 25 DE SEPTIEMBRE DE 2013PAGINA: 4/4
CONFIDENCIAL
Anexos 162
NÚMERO DE ASIGNACIÓN EN ESTE ESTUDIO __________________________
SE DEBE DILIGENCIAR ESTE FORMATO EN EL ORDEN EN QUE APARECE
IMPORTANTELA FIRMA, FECHA Y HORA DE ESTA SECCIÓN DEL FORMATO DEBEN SER DILIGENCIADOS SOLO POR ELPACIENTE VOLUNTARIO/A QUE ACEPTE PARTICIPAR EN LA INVESTIGACIÓN
NOMBRES Y APELLIDOS
FIRMA
N° DE DOCUMENTO DE IDENTIFICACIÓN
FECHADD/MM/AAAA
HORA/MINUTOS
AM/PM
IMPORTANTELA FIRMA, FECHA Y HORA DE ESTA SECCIÓN DEL FORMATO DEBEN SER DILIGENCIADOS SOLO POR LOSTESTIGOS
TESTIGO 1
NOMBRES Y APELLIDOS
FIRMA
N° DE DOCUMENTO DE IDENTIFICACIÓN
FECHADD/MM/AAAA
RELACIÓN CON PACIENTE
DIRECCIÓN
TESTIGO 2
NOMBRES Y APELLIDOS
FIRMA
N° DE DOCUMENTO DE IDENTIFICACIÓN
FECHADD/MM/AAAA
RELACIÓN CON PACIENTE
DIRECCIÓN
CONSENTIMIENTO INFORMADO
COMITÉ DE ETICA INDEPENDIENTE
VERSIÓN 1.0: INSTITUTO NACIONAL DECANCEROLOGIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA –SEDE BOGOTÁ
FECHA: 25 DE SEPTIEMBRE DE 2013PAGINA: 5/5
CONFIDENCIAL
163 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Anexo 3. Formatos
Anexos 164
165 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Anexos 166
167 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Anexo 4. Toma de Muestra de Médula Ósea.
Descripción del Procedimiento.
- Posicionamiento en decúbito lateral izquierdo o derecho
- Ubicación de los reparos anatómicos e identificación de la cresta iliaca
posterior superior. En casos excepcionales se realizara aspirado esternal
siendo imposible realizar biopsia en esta localización anatomía.
- Asepsia y antisepsia con técnicas estándar y colocación de campos estériles
- Aplicación de anestesia local que incluye piel, tejido celular subcutáneo y
periostio
- Punción con aguja de aspirado de médula ósea de acuerdo a técnicas
estándar y aspiración con jeringa de 20 cc
- Una vez realizadas las láminas para el laboratorio de morfología, se tomaran
las muestras para diagnóstico y para el estudio. Distribución de tubos.
Tubo 1 (EDTA): Laboratorio citometría de Flujo INC
Tubo 2 (EDTA): Laboratorio de Genética Molecular INC
Tubo 3 (Heparina): Laboratorio Citogenética INC
Tubo 4 (Heparina): Laboratorio Citogenética UNAL
Tubo 5 (EDTA): Laboratorio Citogenética UNAL
- Punción con aguja de biopsia de médula ósea realizando la misma técnica
estándar
- Verificación de hemostasia y colocación de vendaje compresivo
- Retiro de campos y tras lado del paciente a la habitación
Anexos 168
Anexo 5. Toma de Muestra Sangre Periférica.
Se realizó la toma de esta muestra por sistema de extracción con vacio, para el
mismo se necesitaron los siguientes materiales:
- Guantes
- Algodón
- Alcohol
- Torniquete
- Agujas
- Soporte Vacutainer
- Tubos Vacutainer con Heparina Sodica (Tapa Verde)
- Tubos Vacutainer con EDTA (Tapa Lila)
Procedimiento
Se seleccionó el lugar del cuerpo donde se realizó la punción para tomar la muestra,
sea en región venosa antecubital o región venosa superficial del dorso de la mano:
Golpear suavemente la vena (solo en caso de venas no prominentes)
Limpiar el área seleccionada para la extracción de la muestra con una torunda
impregnada de alcohol antiséptico, empezando desde el centro y extendiéndose en
forma circular hasta la periferia. Repetir el procedimiento las veces que sea
necesario para asegurar la asepsia de la zona.
Dejar secar el alcohol.
169 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Provocar un extasis venoso con un torniquete, durante no más de un minuto
Venopunción: Enrroscar la aguja en el portatubos o soporte vacutainer y después
canalizarla en la vena del paciente, con la mano libre, introducir el tubo de vacío con
tapa verde (heparina) en portatubos (con el tapón del tubo hacia arriba), asegurarse
que la goma del tapón sea perforado completamente.
Extraer entre 1 a 5 ml de sangre.
Repetir el procedimiento con el tubo tapa lila (EDTA)
Retirar el torniquete tan pronto como la sangre empiece a fluir.
Extraer la aguja cuidadosamente y hacer presión fuerte con un algodón humedecido
con alcohol antiséptico en el lugar de punción.
Desechar la aguja empleada durante el procedimiento en el guardián
Mezclar suavemente la muestra por inversión para evitar su coagulación.
Rotular el tubo que contiene la muestra con el código asignado. Guardar la muestra
en el contenedor (triple embalaje) destinado para dicho propósito.
Transporte al Laboratorio 6 Universidad Nacional de Colombia según normativa para
el transporte de muestras biológicas (triple embalaje).
Las muestras serán procesadas el mismo día de la toma y en el caso que exista
algún cultivo negativo la muestra se guardara por un periodo de 4 días a una
temperatura de 4°C, en caso que se requiera un segundo cultivo.
Anexos 170
Anexo 6.Cultivo y Cosecha de CromosomasMetafásicos a partir de Sangre Periférica y Médula Ósea
Reactivos y Materiales.
- Incubadora de Co2
- Frascos de cultivo 25 cm2
- Falcon de 15 mL
- Pipetas Pasteur
- Pipetas de 5 y 10 mL
- Puntas de 100 ul
- Medio de Cultivo McCoy´s 5A (médula ósea) o RPMI 1640 (sangre periférica)
- Suero fetal bovino
- Fitohemaglutinina
- Penicilina
- Solución Hipotonica KCl 0.075M
171 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Anexo 7. Bandas G
Reactivos y Materiales
- Colorante Wright
- Buffer Fosfato M/15 pH6,8
- Solución salina citratada 1X(1xSSC).
- Solución ácido clorhídrico HCl 0,025N.
- Agua destilada desionizada.
- Láminas porta objetos extendidas con la preparación cromosómica a tratar.
- Frasco ámbar.
- Probeta de 50ml.
- Pipeta de1mly10ml.
- Pipeta pasteur plástica.
- Jarras Coplin con capacidad de 10 láminas.
- Pinzas.
- Pera para secado.
Descripción del Procedimiento.
Se realizó bandas G con colorante Wright, técnica basada en digestión enzimática
diferencial para visualización de las láminas predispuestas para citogenética
convencional. Según protocolos expuestos por (Sole y Woessner, 1992).
- Las láminas de 2 o 3 días de extendidas son llevadas al Horno100°C, durante3
horas.
Anexos 172
- Marcar tres Jarras Coplin con esparadrapo. La primera marcada como
“1xSSC”,la segunda (que debe ser de vidrio) como “HCl0,025N” y la tercera
como “agua destilada”
- Agregar en la jarra Coplin“HCl0,025N”,80ml de la solución. Llenos los
siguientes coplins con agua destilada desionizada fresca y“1xSSC”.
- Se precalentó lajarraCoplin“1xSSC” al horno ajustado a 45±1°C, por 30 minutos
antes de su uso para permitir que la solución alcance la temperatura deseada.
Manteniendo la jarra en el horno durante todo el proceso
- Una vez cumplido el tiempo de incubación de las láminas, se retiraron del horno
y permitir que enfríen completamente.
- Con pinzas, se sumergieron las láminas en la jarra Coplin “HCl 0,025N”, por 3
segundos.
- Se lavó inmediatamente con abundante agua corriente, posteriormente se
sumergieron las láminas en el agua contenida en la jarra coplin“agua destilada”.
- Se sacaron las láminas de la jarra y se secaron con pera de secado.
- Las láminas se llevaron al Horno45°C y sumergir las láminas en la
solución1XSSC contenida en la jarra marcada“1xSSC”. Dejar por 10 minutos.
- Se sacaron las láminas y lavaron con abundante agua corriente
- Se secaron con pera de secado.
173 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
- Las láminas se colocaronsobre un soporte para coloración y preparar la solución
colorante de Wright.
- Enfrasco ámbar se agregaron y mezclaron Buffer fosfato M/15 pH 6,8 y
colorante Wright previamente filtrado en proporción 3:1.
- Con Pipeta Pasteur, se tomó el colorante recién preparado y se cubrió las
láminas con la mezcla; dejar el colorante por 2 minutos.
- Lavado y Secado con pera de secado.
Anexos 174
Anexo 8. Hibridación in situ Fluorescente (FISH)
Gotear láminas a trabajar con un día de anticipación
DIA 1:
Reactivos y Materiales
- Solución 2xSSC a temperatura ambiente
- Alcoholes al 70, 90 y 100%
- Plancha calentadora a 74°C
- Laminillas
- Pegante a base de caucho
Descripción del Procedimiento.
- Se colocó la lámina del paciente en el Coplin con la solución de 2xSSC y se dejó
allí durante 2 minutos.
- Se quitó el exceso de solución de la lámina, sin secar, con ayuda de una gasa.
- Se sumergió la lámina en alcohol al 70%, sin secar, se pasó al alcohol de 90% y
por ultimo al alcohol de 100% cada uno por 2 minutos.
- Se realizó un proceso de secado de la lámina con ayuda de una pera o al
ambiente
- Vortex a las sondas empleadas con la máxima agitación por 5 segundos
- Un spin del vial que contenía la sonda (esto con el fin de precipitar todo el
contenido de la sonda al fondo del vial) durante 5 segundos
- Con la micropipeta se succiono 4 µl de la sonda
175 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
- La sonda se agregó en el área demarcada para hibridación
- La lámina se montó con una laminilla limpia del tamaño del área de hibridación
- Se sellaron los bordes de la laminilla con pegante a base de caucho
- El montaje se colocó en plancha calentadora a 74°C y se dejó allí por 3 minutos.
- Se sacó la preparación y llevó a cámara húmeda a 37°C por 17 horas (OverNight)
DIA 2:
- Se retiró la cámara húmeda del homo y la laminilla con pinzas.
- Se colocó la lámina en un Coplin con 0.4xSSC a 73°C, que se encontraba en el
baño de María por un tiempo de 2 minutes
- La lámina se retiró y sin secar se llevó a un Coplin con 2XSSC a temperatura
ambiente por 30 segundos.
- Con la micropipeta se succionaron 3 µl de contrastante DAPI sobre el área
hibridada
- Se montó con la laminilla limpia del tamaño del área de trabajo,
- Se mantuvo en oscuridad hasta el momento de observación al microscopio de
fluorescencia.
Anexos 176
Anexo 9. Extracción por Cloroformo de ÁcidoDesoxirribonucleico (ADN) Controles y Pacientes
Para la extracción del ADN en sangre periférica y en médula ósea de pacientes y
controles metafásicos (CGH) se realizó el siguiente protocolo.
LISIS DE ERITROCITOS (Lavado de la Muestra)
En tubos de 10 mL agregar
- 4 mL de sangre o médula ósea
- 6 mL de suero fisiológico
- Centrifugar 8 min a 2500 rpm a 4 °C
Aspirar el sobrenadante
- Se adiciono hasta 10 mL con TLE
- Posteriormente se agito suavemente hasta deshacer el pellet y se dejó
en hielo de 5 a 10 min
- Centrifugar 15 min a 3000 rpm y a 4 °C
Aspirar el sobrenadante
- Se realizaron lavados adicionando hasta 10 mL con TLE
- Agitando suavemente hasta disolver el botón
- Se centrifugó 15 min a 3000 rpm y a 4 °C
- Se realizó el mismo procedimiento de 3 o 4 veces (hasta que el pellet
quede blando)
Aspirar sobrenadante
LISIS DE LEUCOCITOS (Digestión de Proteínas)
- Resuspender el pellet
177 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
- Se añadió a cada tubo 3 mL de TLL
- 200 µL de SDS 10%
- 50 µL de PK
- Agitación por vortex hasta obtener una solución de aspecto homogéneo
- Dejar en la estufa a 37 °C todo la noche
EXTRACCIÓN DE ADN- Se agregó 1 mL de solución saturada de NaCl 5M
- Agitando en el vortex 15-20 seg hasta obtener una emulsión
- Centrifugar 15 min a 3000 rpm a 4 °C (eliminar sales)
- Se repartió el sobrenadante a un tubo de polipropileno de 10 mL (resistente al
cloroformo)
- Se agregó cloroformo v/v
- Agitando manualmente 15-20 segundos hasta obtener una emulsión homogénea
- Se centrifugo 15 min a 3500 rpm a 4 °C
- Se transfirió con una pipeta Pasteur la parte superior de la muestra
- Se agregó etanol absoluto 2 v/v, agitando con suavidad hasta que aparezca la
medusa de ADN
- Pescar el ADN con una pipeta Pasteur y se pasó a un epperdorf que contiene 1
mL de etanol absoluto 100%
- Centrifugar a 1200 rpm por 5 min
- Decantar el etanol del epperdorf y añadir 1 mL de etanol al 70%
- Centrifugar a 1200 rpm por 5 min
- Decanto y se secó el exceso al aire
- Se disolvió el ADN en agua ultrapura previamente calentado a 37 °C
Anexos 178
- Guardar el ADN a 4 °C
Anexo 10. Hibridación Genómica Comparada de AltaResolución (HR-CGH)
Reactivos y Materiales
- ADN paciente concentración 1 µg
- ADN control (mujer y hombre). Promega
- Enzima DpnII. NEB
- Kit de purificación Qiaquick. Qiagen GmbH
- Human Cot- 1 ADN. Invitrogen
- PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit (495 Green). Kreatech
Biotechnology
- PlatinumBrightTM Nucleic Acid Labeling Kit (550 Red/Orange). Kreatech
Biotechnology
- Laminas Control
- Formamida al 70%
- Etanol 70%, 80%, 100% (fríos)
- Pegante a base de caucho
- Cámara Húmeda
- 0.4 X SSC
- 2 X SSC
- DAPI. Kreatech Biotechnology
179 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Anexo 11. Variables
VARIABLE TIPO DE VARIABLE VALORESDEFINICIÓN DE LAS
VARIABLES
EdadVariable Cuantitativa
discreta Rango Años Cumplidos
SexoVariable Cualitativa
nominalFemenino Género con el que llega
el pacienteMasculino
Diagnóstico Definitivo Variable Cualitativanominal
M0
Ultimo diagnóstico dadoal paciente después dehaber realizado pruebas
confirmatoria
M1M2M3M4M5M6M7
Leucocitos Variable CuantitativoContinua
Células/µl
Linfocitos Variable CuantitativoContinua Células/ µl
Neutrófilos Variable CuantitativoContinua Células/ µl
Hemoglobina enSangre
Variable CuantitativoContinua
Mujeres: 12.1 a15.1 gm/dL
Hombres: 13.8 a17.2 gm/dL
Porcentaje de Blastosen Médula
Variable CuantitativoContinua
Análisis Citogenético Variable CualitativaNORMAL Reporte del Cariotipo
convencional por bandasGANORMAL
Cariotipo AnormalVariable Cuantitativo
discreta
1Presencia de 1, 2 o 3anormalidades en un2
Anexos 180
3mismo individuo con SMD
o LMA
No clasificado
MonosomíasVariable Cuantitativo
discreta
1
Determinar frecuencia depérdidas cromosómicastotales o parciales porenfermedad primaria y
por paciente
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
X
181 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
Y
Trisomía Total oParcial
Variable CuantitativoDiscreta
1
Determinar frecuencia deganancias cromosómicas
totales o parciales porenfermedad primaria y
por paciente
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
X
Anexos 182
Y
TranslocacionesVariable Cuantitativo
Discreta
Determinar lastranslocaciones más
frecuentes porenfermedad primaria y
por paciente
InversionesVariable Cuantitativo
Discreta
Determinar inversionesmás frecuentes por
enfermedad primaria ypor paciente
IsocromosomasVariable Cuantitativo
Discreta
Determinar frecuencia deisocromosomas por
enfermedad primaria ypor paciente
PoliploidíasVariable Cuantitativo
DiscretaEstablecer frecuencias de
poliploidias 3n, 4n …
NulisomíasVariable Cuantitativo
Discreta
1
Establecer frecuencias denulisomías porcromosomas …
2
3
4
5
6
7
8
9
183 Análisis Cromosómico en un grupo de pacientes con SMD y LMA
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
21
22
X
Y
FISH Variable Cualitativa
Presencia deAlteración
Se determinó por lapresencia o ausencia dealteraciones según las
señales de hibridación decada una de las sondas
empleadasAusencia deAlteración
Datos HR-CGH Variable Cualitativa
Determinarmicrodeleciones omicroduplicaciones
Variable Cualitativa ordinal FAVORABLE
Anexos 184
PronósticoCitogenético
INTERMEDIO Jerarquización de loshallazgos citogenético deacuerdo a la malignidad
de la patología conrespecto al tiempo de
sobrevida en un periodomáximo de 4 semanas
DESCONOCIDO
DESFAVORABLE
Tasas de Remisión Variable Cualitativa
Remisión Se evaluó la tasa deremisión de los 11
pacientes evaluados a las4 semanas de
diagnosticados.No remisión
Supervivencia Global Variable Cuantitativa Días
Evaluación de lasupervivencia vs
tratamiento y alteracióncromosómica
Bibliografía 185
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