técnicas basadas en el adn para la identificación de cefalopodos (pcr-rflp)

MEMORIA del PROYECTO

Bachillerato de Investigación y Excelencia. Curso 2016-2017

I.E.S. “Félix Rodríguez de la Fuente”

“Técnicas basadas en el ADN para la identi-“Técnicas basadas en el ADN para la identi-

ficación de Cefalópodos (PCRficación de Cefalópodos (PCR--RFLP)”RFLP)”

Alumnas: AÍda Álvarez Pardo, Jimena Vadillo Corcuera

Coordinador: Luis de Benito Aparicio.

Técnicas basadas en el ADN para la identificación de cefalópodos (PCR-RFLP)

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ÍNDICE 1. Introducción

2. Objetivo

3. Materiales y métodos

3.1. Muestras utilizadas

3.2. Extracción de ADN

3.3. Cuantificación y calidad de ADN por espectrofotometría

3.4. Amplificación del ADN mediante PCR convencional

3.5. Digestión de los productos de PCR mediante enzimas de restricción (ER)

4. Resultados y discusión

4.1. Cuantificación y calidad de ADN extraído

4.2. Visualización de los productos de PCR

4.3. Visualización de las digestiones

5. Conclusiones

6. Bibliografía

7. Bibliografía online


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1. ABSTRACT

In order to provide a tool for the prevention of commercial frauds in fish products, a polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method has been developed. This method allows us to clearly differentiate molluscs belonging to the family Loliginidae from those belonging to the family Ommastrephidae. Cephalopods‟ 16S r-DNA was amplified with PCR using a „„universal‟‟ primer pair, and the amplification product was digested with Dra I and Mbo II restriction enzymes. The resulting electrophoretic patterns of families Loliginidae and Ommastrephidae showed characteristic 200 bp band and 600–700 bp band, respectively. With this methodology, the 4 analysed species belonging to the genus Loligo have also been differentiated.

2. INTRODUCCIÓN

Los cefalópodos (palabra de raíz griega que significa “pies en la cabeza”) son un grupo de animales invertebrados marinos muy habituales en la cocina mediterránea y oriental. En este grupo de animales podemos encontrar el pulpo, el calamar, la sepia, el chopo, etc. Desde el punto de vista nutricional, un cefalópodo es un alimento muy beneficioso para el organismo, ya que aunque presenta una gran variedad de nutrientes (Tabla 1) su aporte calórico es relativamente bajo (80 calorías/100 g).

Tabla 1. Valor nutricional de algunos cefalópodos.

Por cada 100 gramos

Calamar Pulpo Sepia

Proteínas 16,1 g 17,9 g 16,1 g

Hidratos de carbono

0,7 g 1,4 g 0,7 g

Grasa total 1,40 g 1,4 g 0,9 g

Colesterol 167,5 mg 48 mg 110 mg

Agua 81,70 g 79,30 g 82,3 g

Zinc 1,2 mg 1,7 mg 1,2 mg

Selenio 65 mg 44,8 mg 65 mg

Vitamina B12 2 mg 3 mg 2 mg

Fuente: http://www.dietas.net/tablas-y-calculadoras/tabla-de-composicion-nutricional-de-los-alimentos.


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A pesar de las escasas diferencias nutricionales entre los diferentes tipos de cefalópodos su precio en el mercado es muy distinto (Tabla 2).

Tabla 2. Precio en lonja de los cefalópodos.

Calamar Pulpo Sepia Pota-volador

Precio 7,50 €/kilo 4 €/kilo 2,5 €/kilo 1,3 €/kilo

Fuente: Lonja del puerto Vigo. Precios del día 18 de noviembre de 2016. http://www.apvigo.com.

La producción mundial en el 2012, según la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura), alcanzó 4.027.627 Tm. España ocupa el lugar 17 en el ranking mundial con unas capturas de 57.797 Tm volumen superior al de 2009 (46.134 Tm). La variedad de precios y la diversidad de cefalópodos que se capturan obligan a un proceso de regulación de estos productos para evitar fraudes alimentarios.

Por ejemplo, la Agencia Catalana de Consumo (ACC) sancionó en 2011 a seis compañías del sector conservero español por la comercialización, bajo diferentes marcas, de latas que anunciaban pulpo o calamar pero que en realidad contenían otra especie de cefalópodos. Las sanciones ascendieron a un total de 102.000 euros. En realidad, los productos envasados eran de las especies Dosidicus gigas e Illex argentinus, conocidas comercialmente como potón del pacífico y pota argentina, un tipo de cefalópodos de tamaño más grande que el pulpo y el calamar.

Figura 1. En la parte superior se muestra a la izquierda la pota argentina (Illex argentinus) y a la derecha el potón del pacífico (Dosidicus gigas). Tomado de http://zomufish.com.pe.

Según la ACC, la escasez de pulpo provocó que algunas empresas envasasen potón en vez de pulpo y calamar, a pesar de que su precio sea sensiblemente inferior. Información extraída de la noticia del periódico “online” www.elperiodico.com. La taxonomía dota de herramientas que permiten diferenciar los animales por ejemplo, el género Octopus (pulpo) posee ocho apéndices alrededor de la boca mientras que el resto de los géneros estudiados tienen diez, la estructura del ojo sirve para separar el género Illex de Loligo y Sepia, la forma de las aletas natatoria sirven para distinguir estos dos últimos

http://zomufish.com.pe/


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géneros, el procesamiento industrial hace que estas características se pierdan, por lo que resulta necesario utilizar otros métodos para poder diferenciarlos.

Figura 2. En la imagen se muestra la diferenciación taxonómica de distintas especies de cefalópodos aunque el suborden Oegopsida incluye a los géneros Illex y Dosidicus que se han mencionado anteriormente.

En este sentido, la identificación genética de las especies de cefalópodos

mediante técnicas moleculares ha sido uno de los métodos más desarrollado. En

los trabajos previos que se encuentran en la literatura científica se trató de

asignar a un valor taxonómico (familia, género, especie, etc.), un patrón de

bandas de ADN característico obtenido por la técnica PCR-RFLP. Esta técnica se

basa en amplificar una región de un gen que presente una baja variabilidad

genética y tratarlo con enzimas que lo cortan en fragmentos por sitios

específicos (enzimas de restricción). Posteriormente, los fragmentos que se

obtienen de esta digestión se separan por tamaños utilizando para ello una

electroforesis en gel de agarosa. El resultado final es una distribución de

diferentes bandas que corresponden a los diferentes tamaños de ADN

obtenidos y que se asemejan a un código de barras.

Colombo et al. (2002) utilizaron esta técnica con el gen ADN-r 16S, una

pareja de cebadores “universales” y la enzimas de restricción Asn I, les

permitió reconocer dos familias: Loliginidae (Loligo) y Ommastrephidae

(Ilex) (Figura 3).


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Figura 3. Datos de la electroforesis del ADN en gel obtenidos por la técnica

PCR-RFLP de las familias de cefalópodos. En la foto podemos observar como

las especies de la familia Loliginidae (11-12, 14-17) presenta una banda a 200 bp

(base pair: pares de bases) y 600 bp que no presenta la familia Ommatrephidae (1-

5, 7-8). Mientras que la familia Ommastrephidae se diferencia de Loliginidae por

unas características bandas a 300 bp y 700 bp.

De Luna et al. (2011), amplificaron el gen ADN-r 5S y para simplificar el

proceso no los trataron con enzimas de restricción, a la espera de que los

tamaños de los amplicones obtenidos en la PCR fueran suficientes para

diferenciarlos. Con el resultado obtenido llegaron a la conclusión de que

era posible reconocer los individuos analizados a nivel de especie,

género y familia (Figura 4).

Figura 4. Análisis de la PCR del gen 5S rDNA de seis especies de cefalópodos:

1- Loligosurinamensis, 2- Loligosanpaulensis, 3- Lolliguncilabrevis, 4-

Sepiotheuthissepioidea, 5-Ornithoteuthisantillarum, 6- Illexargentinus. Las cuatro

primeras especies son de la familia Loliginidae y todas tienen una banda a 650

bp, las otras dos son de la familia Ommatrephidae que presenta una banda

característica a 500 bp.

Chapela et al. (2003) y Santaclara et al. (2007) también han aplicado las

técnicas moleculares también se han aplicado al gen para el citocromo

“b” con distintas combinaciones de enzimas de restricción (Tsp509 I y Nsi

I, Chapela et al. (2003) y Sfc I, Hph I, y Hinf I, Santaclara et al. (2007) así


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como distintos tipos de cebadores. Los resultados han permitido

diferenciar 8 especies de cefalópodos en el estudio de Chapela et al.,

mientras que el de Santaclara et al. abarca 20 especies entre Lologinidae y

Ommastrephidae, y, además, incluye una especie de la familia Sepiidae y

dos de la familia Octopodidae (Figura 5).

Figura 5. Resultados de la técnica PCR-RFLP del gen citocromo “b” con

enzimas Tsp509 I según Chapela et al. (2003).

3. OBJETIVO

Como podemos ver por la bibliografía, la técnica PCR-RFLP lleva muy poco

tiempo practicándose para la detección de fraudes alimentarios. El estudio de

genes y enzimas de restricción que permitan un análisis rápido y fiable está

todavía en desarrollo. Esto explica el hecho de que, aunque han transcurrido

quince años desde el inicio de esta metodología, el número de especies a las que

se le ha aplicado es muy reducido. Por todo ello, el presente proyecto estudia la

identificación de cuatro especies habituales en el mercado español: calamar

común (Loligo vulgaris), pota (Illex spp), sepia (Sepia spp) y pulpo común

(Octopus vulgaris). Para lograrlo amplificaremos un fragmento del gen ADN-r

16S presente en las mitocondrias y los fragmentos ampliados serán tratados con

las enzimas de restricción Dra I y Mbo II.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Muestras utilizadas

Para la realización del proyecto se han empleado ejemplares frescos de cuatro especies de cefalópodos comprados en un local comercial de Burgos llamado Alimerka: calamar común (Loligo vulgaris), pota (Illex spp), sepia (Sepia spp) y pulpo común (Octopus vulgaris). Se ha elegido un individuo de cada especie conservado en un frigorífico del laboratorio a una temperatura de -20º C hasta el proceso de extracción del ADN.


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3.2. Extracción de ADN

El ADN genómico de todos los ejemplares descritos previamente había sido extraído de una muestra de 30-50 mg de tejido conectivo de acuerdo al protocolo basado en CTAB fenol-cloroformo descrito por Roger y Bendich (1988), aunque con ligeras modificaciones. Este protocolo consta de las siguientes etapas:

Homogeneización del tejido y la lisis celular. Consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético. Para ello se añade 100 µL de proteinasa K (20 mg/mL) y 200 µL de tampón de extracción CTAB 2X (bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) 2% (p/v), 100 mM tris(hidroximetil)aminometano (Tris) 20 mM ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1,4% (p/v) NaCl, 1% (p/v) PVP). A continuación se incuban los tubos a 55º C durante 12 horas a 150 rpm (Figura 5).

Figura 5. Esquema del proceso de homogeneización y lisis celular.

Purificación del ADN. En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y los lípidos teniendo en cuenta la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfatos presentes en el ADN. Con este objetivo se utiliza un solvente orgánico compuesto por un volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para diferenciar la fase acuosa de la orgánica se centrifuga a 14800 rpm durante 5 minutos. Al final del proceso, las proteínas y los lípidos quedan retenidos en la fase orgánica, mientras que el ADN permanece en la fase acuosa. Se extrae esta fase y se transfiere a un nuevo tubo donde se repite el proceso con la finalidad de garantizar la pureza del ADN, algo que se consigue añadiendo de nuevo un volumen de CTAB 2X. Posteriormente, se deja incubar el tubo en un baño María durante 10 minutos a 65ºC para que el detergente actúe, se añade también un volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y se centrifuga a 14800 rpm durante 5 minutos. Después de ser eliminados los lípidos y las proteínas se recupera el ADN (Figura 6).


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Figura 6. Esquema del proceso de purificación del ADN.

Precipitación del ADN. Al ADN recuperado se le añade un volumen de tampón de precipitación CTAB (1% CTAB (p/v), 50 mM Tris, 10 mMEDTA). A continuación se centrifuga a 14.800 rpm durante 10 minutos, lo que permite que el ADN permanezca en forma de “pellet” en el fondo del tubo. Se elimina el sobrenadante y se le adiciona al “pellet” dos volúmenes de etanol al 95%, además de un tampón TE alto en sal, con altas concentraciones de sodio o amonio, (10mM Tris, 1 mM EDTA, 1 M NaCl). La incorporación de estos cationes permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndose insoluble al reducir las fuerzas repulsivas que hay entre las cadenas debido a los grupos fosfato. Posteriormente se centrifuga a 14800 rpm durante 15 minutos, proceso que permite la precipitación del ADN mientras que el etanol es desechado. Los restos de etanol del “pellet” se eliminan lavándolo con etanol al 70% y el remanente con su evaporación en una estufa a 35ºC (Figura 7).

Figura 7. Esquema del proceso de precipitación del ADN.

Rehidratación del “pellet”. Para mantener el ADN en solución se añaden 40µL de TE 0,1X (10 nM Tris-HCl (pH 8,0), 1mM EDTA) lo que previene la degradación del ADN (Figura 3).


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3.3. Cuantificación y calidad del ADN por espectrofotometría

Utilizando un espectrofotómetro de microplacas se ha medido la absorbancia a 260 nm para determinar la concentración y la pureza del ADN según la relación de absorción UVA 260/ A280 nm (Figura 8).

Figura 8. Espectrofotómetro de microplacas (Bioteck, Power Wave 52).

3.4. Amplificación y visualización de los productos de la PCR

Las secuencias del gen que codifica para el 16S del ADN mitocondrial estaban disponibles en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) correspondiente a las especies: Loligovulgaris, Illex spp, Sepia spp y Octopusvulgaris. Estas secuencias han sido alineadas con BLAST y, a partir de ellas, el Área de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Burgos ha diseñado una pareja de “primers” denominada C16S. Las secuencias del “primer” F (forward) y R (reverse) se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. “primers” usados en la amplificación del sistema C16S. W: A, T.

F 5' G G T A T T W T A A C T G T A C T A A G 3’

R 3' G G T A T C C C T A T T G T C G C A T T 5'

Las amplificaciones han sido llevadas a un volumen final de 50 µl que contenía: el ADN obtenido en el proceso de extracción, la ADN polimerasa llamada Taq-polimerasa, “buffer” (tampón) que hace que se mantenga el pH apropiado para que se lleve a cabo la síntesis y cloruro de magnesio (MgCl₂) que actúa como cofactor de la enzima. Además, se ha añadido los 4 tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs) que sirven para crear las cadenas molde del ADN y los “primers”. Al final del proceso lo que se ha obtenido son cinco tubos diferentes de 50 µl, conteniendo cuatro de ellos el ADN de las cuatro especies de cefalópodos respectivamente y el quinto, denominado NTC (No Template Control), al que no se le añade el ADN sino agua para saber si los cebadores o los otros componentes están contaminados con ADN del exterior.


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Tabla 5. Cantidades óptimas para la realización de la PCR.

Cantidad inicial Cantidad final

Buffer 10 x 1x

MgCl₂ 25 µM 2µM

dNTPs 10 µM 0,8µM

Taq pol 5 U/µl 1 U

C16S F 10000 nM 800 nM

C16S R 10000 nM 800 nM

DNA 10 ng

H₂O Vol final: 50 µl

Con el objetivo de amplificar una región concreta de ADN mediante las condiciones mencionadas anteriormente, se ha procedido a la realización de una PCR (Tabla 6).

Tabla 6. Programa de ciclos de la PCR.

Programa

Temperatura (ºC) Tiempo (mins) Repeticiones

95 3:00

95 0:30

49 1:00

72 0:30 35X

72 7:00

Generalmente, la PCR se inicia con la desnaturalización o separación de la doble hélice del ADN mediante el calentamiento de la muestra a una temperatura de 95°C para romper los puentes de hidrogeno que las unían. De esta manera cada cadena queda como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria de ADN. Una vez separadas las cadenas del ADN, se alinean los “primers” a sitios específicos complementarios de las cadenas sencillas de la región que se va a amplificar, bajando la temperatura a 49°C para permitir la unión (alineamiento) de los “primers”. Finalmente, se consigue sintetizar una nueva cadena incrementando la temperatura a 72°C porque es la temperatura óptima a la cual la ADN polimerasa se une a los “primers” y comienza la replicación. Estas tres etapas (desnaturalización, alineamiento y extensión del ADN) se repiten sucesivamente en cada nuevo ciclo amplificando simultáneamente la región de interés de las dos cadenas complementarias. Los productos generados aumentan su concentración de manera exponencial porque cada nueva copia sirve de molde en los ciclos subsecuentes, dando origen a millones de copias del fragmento seleccionado.


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Una vez finalizada la PCR, se procede a visualizar los productos de amplificación mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1,5% (p/v) en 1X TAE (trihidroxiaminometano 40µM tris-acetato, 1mMEDTA etilendietilentetracético) y 0,33X de SYBR®Safe (Invitrogen). Puesto que la agarosa es insoluble en el tampón TAE a una temperatura ambiente, se calienta durante 2 minutos en un microondas. Como marcador de pesos moleculares se utiliza PerfectTM 100-1000bp (0,05 μg/μl), pinchando 6 μl en el gel. En cada pocillo del gel se cargan 15 μl de los productos de amplificación junto con 3 μl de tampón de carga 6X (30% (v/v) glicerol, 0,25% (p/v) azul de bromofenol) y se somete el gel a una corriente eléctrica constante de 120 V. El resultado final se observa con luz UV en un transiluminador Molecular Imager Gel Doc XR (software QuantityOne v 4.5.2).

3.5. Digestión de los productos de PCR mediante enzimas de restricción (ER)

El término RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción). Para desarrollar el siguiente método se han empleado las enzimas de restricción Dra I y Mbo I (Figura 9).

Dra I Mbo II

5‟ …TTT AAA … 3‟ 5‟ …GAAGANNNNNNNN NNNN…3‟

3‟… AAA TTT …5‟ 3‟ …CTTCTNNNNNNN NNNNN…5‟

Figura 9. La secuencia de la izquierda muestra el punto de corte de la enzima de

restricción Dra I y la secuencia de la derecha el lugar de reconocimiento de la enzima

de restricción Mbo II.

Se han utilizado las muestras obtenidas en la PCR del método anterior. Sobre

los amplicones obtenidos se han preparado dos mezclas de reacción, una por

cada enzima de restricción (ER), con una concentración de reactivos

determinada (Tablas 7 y 8).

Tabla 7. Condiciones de digestión para la enzima Dra I.

Cantidad inicial Cantidad final Rxn 5

Buffer 10X ONE 10x 1x 25 µL

Dra I ER 15 U/µl 2U 0,7 µL

BSA 100x 1x 2,5 µL

H2O 171,8µl 171,8 µL


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Tabla 8. Condiciones de digestión para la enzima Mbo II.

Cantidad inicial Cantidad final Rxn 5

Buffer 10X ONE 10x 1x 25 µL

Mbo II ER 10 U/µl 2U 0,7 µL

BSA 100x 1x 2,5 µL

H2O 171,5 µL

Se han elaborado cinco muestras de las cuales cuatro contienen entre 0,1 y 2 µg del producto de PCR obtenido en el método anterior. Una quinta muestra se ha añadido con agua con el fin de servir como muestra de control. La función del BSA (bovine serum albumine: albúmina de suero bovino) es estabilizar la enzima de restricción. Para realizar la digestión los tubos han sido incubados a 37ºC. En la secuencia de los amplicones obtenidos, una enzima de restricción puede producir un gran número de cortes en los lugares donde reconozca la secuencia específica para hacerlo. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de los amplicones de las diferentes especies de cefalópodos, por lo que se considera que las especies son polimórficas para estos fragmentos de restricción. Para la visualización de la RFLP se sigue el siguiente método: los fragmentos de restricción se separan mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 2% (p/v) en 1X TAE y 0,33X de SYBR®Safe (Invitrogen) a través del cual corren debido a un campo eléctrico constante de 120 V. Su disociación obedece a la masa que depende de la longitud del fragmento. Se utiliza como marcador de pesos moleculares PerfectTM 100-1000bp (0,05 μg/μl), pinchando 6 μl en el gel. Este marcador de pesos moleculares genera una banda cada 100 pb, siendo la banda más marcada la que corresponde a 500 pb. En cada pocillo de gel se cargan 15 μl de los productos de digestión junto con 3 μl de tampón de carga 6X. El resultado final se observa con luz UV en un transiluminador Molecular Imager Gel Doc XR (software QuantityOne v 4.5.2). Este patrón de bandas puede servir por tanto para reconocer la especie, aunque esta haya sido transformada y las características morfológicas que la distinguían hayan desaparecido.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Cuantificación y calidad del ADN extraído

Dado que la espectrofotometría se basa en la relación que existe entre la absorción de la luz por parte de un compuesto y su concentración, analizando la siguiente tabla de resultados podemos llegar a las siguientes conclusiones (Tabla 9).


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Tabla 9. Determinación espectrofotométrica de la cantidad de ADN extraído.

Muestra

Absorbancia:

260

Absorbancia:

280

Ratio:

260/280

Concentración:

µg/µL

Calamar 3,684 2,227 1,654 3,684

Pulpo 1,892 0,962 1,967 1,892

Pota 0,784 0,45 1,742 0,784

Sepia 1,068 0,574 1,862 1,068

La evaluación de la concentración y pureza del ADN se ha llevado a cabo mediante la determinación de la absorbancia a 260 y 280 nm:

A260: permite estimar la concentración de ADN teniendo en cuenta que una unidad de densidad óptica a esta longitud de onda equivale a 50 µg/mL de ADN de doble cadena.

A260/A280 ratio: esta relación de absorbancia permite valorar la pureza del ADN extraído. Valores entre 1,75–1,85 indican que el ADN extraído es puro, valores inferiores a 1,75 sugieren contaminación por proteínas y valores superiores a 1,85, contaminación por ARN u oligonucleótidos.

Dado que el ADN presenta una absorbancia a 260 nm se puede ver como la muestra de calamar es la que más cantidad de ADN presenta, seguida del pulpo, la sepia y, finalmente, la pota. Por otro lado, como las proteínas presentan una absorbancia a 280 nm, la relación 260/280 muestra el grado de pureza obtenido en las muestras. En este caso, el mayor grado de pureza se obtiene en el pulpo, seguido de la sepia, la pota y el calamar.

La concentración de ADN es suficiente para preparar disoluciones de 10 ng/mL con el objetivo de ser utilizadas posteriormente en la PCR, siempre que se garanticen 100 ng de ADN en cada una de las mezclas.

4.2. Amplificación y visualización de los productos de la PCR

Las diferentes especies de cefalópodos estudiados presentan similitudes en su genoma, variando en algunos pares de bases, por lo cual los cebadores utilizados presentan ciertas modificaciones (R, Y, M, K…). Por tanto, en vez de presentar una única base nitrogenada, dicha modificación hace posible que se codifique para dos o más bases nitrogenadas. De esta manera un mismo cebador puede ser utilizado para diversas especies. La nomenclatura según las reglas de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC). W es: A, T. El sistema C16S, diseñado en el Área de Bioquímica y Biología Molecular de


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la Universidad de Burgos, amplifica un fragmento que codifica 16S ARN en cefalópodos. El gen escogido ha sido el que codifica para el sistema 16 S ARNr. Por su parte, el ARN ribosómico 16S es un componente de la subunidad 30S de los ribosomas procariontes. Su presencia en los genes mitocondriales de eucariontes se explica según la teoría endosimbiótica, ya que este orgánulo habría surgido en su origen de un procarionte.

Debido a la carga negativa proporcionada por los fosfatos, las moléculas de ácidos nucleicos se mueven cuando están expuestos a una corriente eléctrica constante de 120 V. La velocidad de migración de los fragmentos de ADN es proporcional a la carga de las macromoléculas e inversamente proporcional a su masa y conformación. Como los ácidos nucleicos tienen un esqueleto fosfato de carga negativa, la razón carga/masa es constante para todos los tamaños, lo que hace que migren en un campo eléctrico en función de su tamaño (Figura 10).

Figura 10. La fotografía muestra la imagen obtenida en el transiluminador molecular (Tabla 10). Se observan las bandas numeradas que corresponden con el 1: calamar, 2: pota, 3: pulpo y 4: sepia. En la columna de la derecha aparecen las bandas correspondientes a los marcadores de pesos moleculares (PerfectTM 100-1000bp). Este marcador de pesos moleculares genera una banda cada 100 pb, siendo la banda más marcada la que corresponde a 500 pb.

Tabla 10. Comparativa entre los tamaños de los amplicones teóricos y experimentales para las especies analizadas.

Muestra Tamaño teórico (pb) Tamaño observado (pb)

Calamar 360 400

Pota 353 380

Pulpo 352 390

Sepia 328 380


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El tamaño teórico de los amplicones es para el calamar común (Loligo vulgaris) de 360 pb, la pota (I. illecebrosus) de 353 pb, el pulpo común (Octopus vulgaris) de 352 pb y la sepia (Sepia officinalis) 328 pb. En la imagen obtenida en el transiluminador no se puede discriminar por debajo de los 100 pares de bases que nos indican los marcadores de pesos moleculares pero si se puede apreciar un orden de tamaño de ADN, siendo el de mayor tamaño el del calamar, próximo a la banda de 400 pb, seguido del pulpo con 390 pb y la pota, con cerca de 380 pb al igual que la sepia. Se observa cómo no existe ninguna coincidencia entre los valores teóricos y los experimentales aunque se mueven en un margen muy próximo de pares de bases.

Al no haber grandes diferencias entre los amplicones, se hace necesario utilizar otro método, enzimas de restricción, que permitan una mejor discriminación de las especies estudiadas.

4.3. Patrones de discusión

Este patrón de bandas puede servir por tanto para reconocer la especie aunque esta haya sido transformada y las características morfológicas que la distinguían hayan desaparecido.

En la secuencia de los amplicones obtenidos, una enzima de restricción puede producir un gran número de cortes en los lugares donde reconozca la secuencia específica para hacerlo. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de los amplicones de las diferentes especies de cefalópodos, por lo que se dice que las especies son polimórficas para estos fragmentos de restricción (Figura 11).

C16S + Dra I C16S + Mbo II


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Figura 11. Digestión del amplicon obtenido para el gen con la enzima Dra I (fotografía de la izquierda) y la enzima Mbo II (fotografía de la derecha). Carriles: 1: calamar, 2: pota, 3: pulpo, 4: sepia y pm: marcador de pesos moleculares.

Tabla 11. Tamaño de los fragmentos generados por las enzimas Dra I y Mbo II.

Observando la tabla 11 vemos que utilizando un solo tipo de endonuclesa, por ejemplo la Dra I, no es posible identificar las cuatro especies que se habían propuesto pues el número de bandas y su tamaño coincide para pota y sepia. Lo mismo ocurre con Mbo II para el calamar y la sepia, pues la discriminación por debajo de los 100 pares de bases es dudosa y ambas presentan patrones muy parecidos. En conclusión, es necesario utilizar al menos dos endonucleasas diferentes para obtener un patrón de bandas fiable que permita distinguir las cuatro especies estudiadas.

El método utilizado para identificar distintos tipos de cefalópodos tiene tanto ventajas como inconvenientes. Una de las principales limitaciones es que hasta el momento no pueden aplicarse a productos enlatados. Además, el tratamiento por calor que requiere este tipo de manufacturas produce la degradación de ADN y esto limita su posible amplificación por PCR. En este sentido, Quinteiro et al. (1998) ya había señalado que el tamaño máximo de los fragmento de ADN en productos enlatados estaban alrededor de 170 bp.

5. CONCLUSIONES

A partir del método empleado se ha conseguido obtener una cantidad óptima de ADN de calidad. Este método permite una rápida identificación del material fresco aunque hayan desaparecido sus características morfológicas pues en aproximadamente unas 15 horas de laboratorio nos permite verificar la autenticidad del material. Para las cuatro especies estudiadas se ha logrado amplificar el C16S obteniéndose distintas bandas. A diferencia del trabajo de Sales et al. (2011), el tamaño y distribución de los amplicones no nos ha permitido diferenciar las cuatro especies estudiadas. Para poder discriminarlas se han utilizado dos enzimas de las cuales Mbo II ha sido la que mostró un

Tamaño de bandas de ADN (pb)

Muestra Digestión con Dra I. Digestión con MboII.

Calamar 275 450 y 250

Pota 200 250

Pulpo 250 y 100 300

Sepia 200 400 y 250


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patrón de bandas distintas entre las especies. La gran distancia genética que existe entre las cuatro familias de las especies estudiadas (Loliginidae, Ommastrephidae, Sepiidae y Octopodidae) nos impide descubrir un patrón común que probablemente podía ser descrito si se continúa estudiando especies que pertenecen a la misma familia como muestran los trabajos de Santaclara et al. (2007), Chapela et al. (2003) y Colombo et al. (2002). Este método se presenta como válido y ofrece dos posibles vías por las que se puede continuar investigando: realizar más estudios ampliando el número de especies de cefalópodos estudiadas o avanzar en la investigación de nuevas técnicas de extracción de ADN. Ambas opciones podrían tomar de referencia este estudio realizado y mejorarlo para aumentar su efectividad.


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6. BIBLIOGRAFÍA

Chapela, M., & Sotelo, C. P.-M. (2003). Molecular identification of cephalopod species by FINS and PCR-RFLP of a cytochrome b gene fragment. European Food Research and Technology, volume 217, pp 524-529. Revisado en diciembre de 2016.

Colombo, F., Cerioli, M., Colombo, M. M., & Malandra, R. R. (2002). A simple polymerase chain reaction-restriction fragment lenght polymorphism (PCR-RFLP) method for the differentiation cephalod mollusc families Loliginidae from Ommastrephidae, to avoid substitutions in fishery field. Food control, pp 185-190. Revisado en diciembre de 2016.

Guerra, A. (2006). “Estrategias evolutivas de los cefalópodos” . Investigación y Ciencia. Pag. 54. Revisado en octubre de 2016.

Roger, S., & Bendich, A. J. (1988). “Extraction of DNA from plant tissues”. Plant. Mol. Biol. (A6), 1-10. Revisado en octubre de 2016.

Sales, J. B., Rodrigues-Filho, L., & Haimovici, M. S. (2011). “Molecular differentiation of the species of two squid families (Lologinidae and Ommastrephidae) based on a PCR study of the 5S rDNA gene”. Food control 22, pp. 96-98. Revisado en octubre de 2016.

Santaclara, F., & Espiñeira, M. & Vieites, J.M. (2007). “Genetic Identification of Squids (Families Ommastrephidae and Loliginidae) by PCR-RFLP and FINS Methodologies” . Journal of Agricultural and Food Chemestry. 55, pp 9913-9920. Revisado en septiembre de 2016.

7. BIBLIOGRAFÍA ONLINE

Dietas.Net, tu portal de salud y bienestar. (2014). www.dietas.net/tablas-y-calculadoras/. Revisado en diciembre de 2016.

Lonja del puerto de Vigo. Autoridad portuaria de Vigo . www.apvigo.com/ . Revisado el 18 de noviembre de 2016.

Ministerio de Agricultura y Pesca, Alimentacion y Medio Ambiente (2014). www.mapama.gob.es/ “Mercado de cefalópodos”, pag.7. Revisado en diciembre de 2016.

INIDEP (Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero) http://www.inidep.edu.ar/ “Calamar (Illex argentinus) “.Revisado en diciembre de 2016.

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Josep M. Berengueras (2011). www.elperiodico.com/ “Pulpos que no son pulpos”. Revisado en diciembre de 2016.

Dr. Antonio López Farré (2014). http://www.teinteresa.es/ “Los cefalópodos y sus beneficios en la salud”. Revisado en diciembre de 2016.


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8. AGRADECIMIENTOS

Queremos dar las gracias al IES Félix Rodríguez de la Fuente por la oportunidad que nos ha brindado de iniciarnos en el campo de la investigación. También a la Universidad de Burgos por poner a nuestra disposición las instalaciones del Área de Bioquímica y Biología Molecular. Además, de forma personal, damos las gracias por su tiempo y dedicación a nuestras tutoras, Sonia Ramos y Natividad Ortega, quienes durante estos cinco meses siempre han estado a nuestra disposición a pesar de las dificultades que conlleva el año académico en la universidad. Agradecemos igualmente a los profesores del instituto que se han ofrecido a colaborar con nosotros. Es especial, a nuestro tutor, Luis Vidal, del Departamento de Biología y Geología, que nos ha guiado y ayudado incondicionalmente con su paciencia, constancia e imaginación. También a María de la Zarza, del Departamento de Lengua Castellana y Literatura, por encargarse de la corrección ortotipográfica de esta memoria. A Jesús Pavón, del Departamento de Ingles, por la ayuda en la elaboración del abstract. Toda esta coordinación con el profesorado no hubiera sipo posible sin Juan Manuel Rojo, del Departamento de Tecnología, que ha ejercido como coordinador. A todos ellos, gracias.

técnicas basadas en el adn para la identificación de cefalopodos (pcr-rflp)

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