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Gestión del gluten en la Industria Alimentaria
20 0ctubre 2006 Barcelona
Enrique MéndezCentro Nacional de Biotecnología
Técnicas necesarias para garantizar el gluten en alimentos
grupobonmacor
ATROFIA TOTAL-SUBTOTAL
GLUTEN
¿ComponentesTóxicos ?
α β γ ωGliadinas (trigo)Hordeinas (cebada)
Secalinnas (centeno)
La enfermedad Celiaca es una intolerancia a lasprolaminas de trigo de la cebada y del centeno
Prevalencia de 1-200
El único tratamiento para las personas con enfermedad celiaca es una dieta de por vida sin-gluten
Codex
Los alimentos sin-gluten para los celiacos tienen que estar exentos de los cereales tóxicos:trigo, cebada centeno (avena)
Sin-gluten por naturaleza (20 ppm)
Sin-gluten elaborados (200 ppm)
Para medir el gluten en alimentos sin-glutense necesitan métodos fiables
(100 ppm) PWG
Medicamento
celiacos
Para ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor TIFF (LZW).
No hay total garantíadel control del gluten en alimentos para celiacos
¿Donde está el gluten?
trigotrigo
maizmaiz
arrozarroz
centenocenteno
cebadacebada
avenaavena
+Falsos positivosFalsos negativos Extracción / Detección-
hidrolizados calentados modificados
gluten1. Los ingredientes de los alimento son muy complejos
Glutensin calor
harinas arrozalmidones
Glutencon calor
papillassojagalletaspaneschocolates
Glutenhidrolizado
siropes cervezasalmidones
Glutencon calor
hidrolizado
papillasalmidónalimentos ????cereales desayuno
Extracción de gluten de alimentos tratadosy no tratados con calor
almidones
TECNICAS COMPLEMENTARIAS NECESÁRIAS PARA CUANTIFICAR Y CONFIRMAR LOS NIVELES DE GLUTEN EN ALIMENTOS
No tratados calor
extracción
CocktailEtanol 60%
Tratados con calor
SandwichSandwichR5R5--ELISAELISA
Espectrometria de Masas
4x PCR cuantitativaDNA de trigoDNA de cebadaDNA de centeno
DNA trigo+cebada+centeno
Western Blot-R5
Técnicas Confirmatorias
ELISAELISA--R5R5CompetitivoCompetitivo
Hidrolizados
Etanol 60%
Gluten nativo
Gluten hidrolizado
ALIMENTOS
Gel agarosa
Glutensin calor
60% etanol
ELISA-R5Sandwich
harinas arrozalmidonessojaalforfón
Glutencon calor
cocktail
papillassojagalletaspaneschocolates
cocktail
ELISA-R5Competitivo
Glutenhidrolizado
60% etanol
siropes cervezasalmidones
Glutencon calor
hidrolizadopapillasalimentos/almidónalimentos ????cereales desayuno
60% etanolcocktail
Elección del tipo de extracción y del método de análisis para alimentos sin-gluten
MALDI-TOF Western blot PCR
Técnicas confirmatorias
Es insensible a la CEBADA
0
0,5
1,0
1,5
0,001 0,01 0,1 1 10
Trigo
Centeno
Cebada
Anticuerpo
ω
20 ppm
ELISA-ω
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
1 10 100 1000
Transia-GliadinPWG-GliadinSigma-GliadinGluten RM 8418
ω antibody
Cebada
Trigo
0,001 0,01 0,1 1 10
1,0
2,0
xx
xx
xx
Centeno
Anticuerpo R5
3 ppm
ELISA-R5
Detecta péptidos tóxicosQQPFP y el 33 mer
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 1 10 100 1000
Mea
n A
450
Sigma-Gliadin
PWG-Gliadin
R5 antibody
2001-2006
HolandaIrlanda
U.K
Alemania
España
ELISA-ω- Skerrit: Método oficial
Italia
Austria
Noruega Suecia Suiza Finlandia
2006ELISA- R5
R5
R5R5
R5
R5
R5
ω
No hay método oficial
R5 R5 R5
R5
1991-2006
Países del mundo que utilizan y distribuyen los kits ELISA-R5 de las casas comerciales Biopharm, Ingenasa and Diffchamb
Europa
America del Norte
America delSur
1. U. K 2. Belgium3. Sweden
4. Netherlands
5. Germany
6. France
7. Italy
8. Spain
9. Finland
10. Austria11. Switzerland
12. Ireland
13. Poland14. Croatia
20. Czech Republic
16. Slovakia
17. Slovenia
18. Hungary
19. Romania
15. Bulgaria
21. Serbia
28.USA29. Canada
32. Chile33. Brasil
27. Russia
24. Greece23. Portugal
26. Norway
25. Luxemburg
22. Malta
34. Mexico
35. Argentina
39. Japan
36. Hong Kong37. Israel38. Korea
Asia
Australia
30. Australia31. New Zealand
40. South Africa
Africa
R5 -ELISA kits
INGEZIM GLUTENGLIADIN KIT(R-7001)
FAST GLIADIN(R-7002)
Quit GLIADIN(R-7003)
R-Biopharm
Ingenasa
TRANSIA PROLAMIN
R5 R5R5
1
2
5
3
Diffchamb
4
Operon
STICKS GLUTEN 6
Kits comerciales de ELISA y tiras basados en el anticuerpo R5
Heat
Nuevo sistema eficaz de extracción de Gluten en alimentos tratados y no tratados con calor
95-98 % Gluten
Cocktail
1 2 4 50
200
ppm
3Alimentos tratados con calor
% recuperados con 60% etanol
Valores reales de gluten
98 94
94
95
98
% recuperados con Cocktail
Límite de detección : 3 ppm gliadinas
Recuperación: 90-96 %
Reproducibilidad :
Repetitividad :
7.7 %
4.7 %
Basado en el anticuerpo R5
Sistema de ELISA competitivo para medir gluten hidrolizado
Cervezas Extractos de maltaSiropes
Papillas infantiles
50
CervezasELISA Sandwich-R5
ppmgiuten
Czech Republic Spain
Belgium France Ireland Denmark
50
25
USA HollItaly
AustrGermEngl
Mexico
Finland
20
10
ppmgluten
ELISA Competitivo -R5
cervera Lote ELISA R5Sándwich
ELISA R5Competitivo
Laitila primera cerveza de malta de cebada sin gluten del mundo
12342 TGX-629
12343 EKX-752
12344 YAN-898
12345 EKX-752
12346 TGX-629
12347 UIK-448
12348 YAN-898 / A
12349 YAN-898 / B
12350 TGX-629
12351 YAN-898
12352 EKX-752
12353 YAN-898
12354 TGX-629
12355 TGX-629
12356 EKX-752
12357 TGX-629
< 6
< 6
9
< 6
< 6
9
10
< 6
< 6
< 6
< 6
< 6
< 6
< 6
7
8
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
< 3
0
10
20
1 2 3 4 5 6 7 8 1510 11 12 13 14 169
Tratados con calorParcialmentehidrolizados
ppmgluten
R5 Sandwich
Papillasinfantiles
Nativas
1917 gliadinas
Hidrolizadas
18 19 2017 21
R5 competitivo
Detección de gliadinss en alimentos por Espectrometría de Masas MALDI-TOF M S
Basado on observación directa del típico pérfil de gliadinas permitiendo la identificación de gliadinas en alimentos
α γgliadinss
Alimento
Alimento
Espectrómetro de Masas
31394
33981
38638(6208)
56 ppm gliadins(R5-ELISA)100
18000 60000
100
3154135191
38637
4185254852
164 ppm gliadins (R5-ELISA)
(6683)
Mass (m/z)
α, β, γ
18000 60000
100
Mass (m/z)
ω
31310 35101
(7700)
50 ppm gliadins (R5-ELISA)
Identificación directa de gliadinas en alimentos por
Espectrometría de masas MALDI-TOF MS
DNA
Sensibilidad0.5 ppm
PCR
Geles de agarosa
systemas de PCR
3. Centeno
1. Trigo
2. Cebada
4. Trigo +Cebada+Centeno
Sistema de PCR cuantitativo en tiempo real para la detección de DNA de trigo, de cebada y de centeno
(método no inmunológico)
Sirope 1
Cerveza 3
Cerveza 2
Cerveza 1
Muestra
Valores en ppm de gluten y en ng DNA/mg
Sirope 2
Sirope 3
Extracto de malta 1
Extracto de malta 3
Extracto de malta 2
Extracto de malta 4
Cereales desayuno 1
Cereales desayuno 2
Cereales desayuno 3
Limitaciones de la PCR como “única” técnica para la cuantificación de gluten en alimentos en los que el ADN está hidrolizado
ELISA-R5
105
32
48
51
10257
4755
55
487
600
697
23
25
Gluten intacto
ELISA-R5
PCR
< 0,5
< 0,5
< 0,5
< 0,5
< 0,5< 0,5
< 0,5
< 0,5
< 0,5
< 0,5
< 0,5
< 0,5
< 0,5
ADN hidrolizado
PCR
Cornflakesmaíz
Aceptados para su consumoen países nórdicos
Alimento Extracción
Sin-gluten
hidrolizados
complejos
Cereales de desayunoPapillas infantiles
Lácticos
Embutidos
calor
Preparación de la muestrasmolienda
Especiales
1000
3000
5000
7000
9000
11000
13000
1 2 3 4 5 13121176 8 9 10 14 15 16 17 18 2625242019 21 22 23 27 28 29 30 31 3332 34 35 36 37 38 4039 41 42 43 44 45 46 47
CNB ELISA-R5
Suecia ELISA-R5
Efecto de la preparación de la muestra en la cuantificación de gluten
Glu
ten
(ppm
)CNB
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
CNB ELISA-R5
Suecia ELISA-R5
Suecia
Suecia
Sin-gluten
hidrolizados
complejos
Cereales de desayunoPapillas infantiles
Lácticos
Embutidos
Lab7Lab1 Lab6Lab5Lab4Lab3Lab2
Los laboratorios existentes en España tienen capacidad tecnólogica y conocimiento suficiente para garantizar con fiabilidad el gluten
en alimentos
Sin-gluten
hidrolizados
complejos
Cereales de desayunoPapillas infantiles
Lácticos
Embutidos
Lab7Lab1 Lab6Lab5Lab4Lab3Lab2
Las empresas que elaboran alimentos sin-gluten o aptos para celiacostienen información real de los problemas analíticos del gluten?
Asociaciones Celiacos
Empresas
Administración
Laboratorios análisis
Información ?
LabLabLabLabLabLab
Laboratorios análisispropios- Consumo
- Consejerías
-Ayuntamientos
ELISA R5 la técnica más común de análisis de gluten en España
¿Todos los laboratorios analíticos trabajan con la misma fiabilidad?
¿ Son comparables los resultados?
Alimento Pesada Extracción ELISA
Sin glutenEspeciales (chocolates)
Balanza Pipetas Pipetas
Placa de ELISA
Aptos-celiacos?(Ingredientes complejos)
Nº muestras por Placa
2 diluciones x 2
1 diluciones x 2
1 dilución
S8S8
S7S7
S6S6
S5S5
S4S4
S3S3
1/25S2S2
1/25S1S1
S8S8
S7S7
S6S6
S5S5
S4S4
S3S3
1/501/25S2S2
1/501/25S1S1
BlS8S8
C+S7S7
S6S6
S5S5
S4S4
S3S3
S2S2
1/25S1S1
Blanco
Control +
Control +
Blanco
2 x 1/25
2 x 1/5018 muestras
2 x 1/25 38 muestras
1 x 1/25 78 muestras
Factor
Precio/muestra
X 4
X 2
X 1
Est
ánda
rE
stán
dar
Est
ánda
r
2 diluciones x 2
1 dilución x 2
1 dilución
1/50
1/25
Media 14 49 47
99
107
14
13
Media 112 81 103
2 Diluciones
1/25
1/50
1/100
1/200
A
49
48
B C
1/200
1/100
D E F
43
50
120
104
82
80
1/100
1/50
Media 736 644 615
301
291
600
873
Media 311 304 296
2 Diluciones1/501/100
1/400
1/800
A
514
775
B C
1/800
1/400
D E F
526
705
314
308
295
313
Media 66
92
110
63
112
Media 113 101
1/50
1/25
119
106
119
189
2 Diluciones
1/100
1/50
1/251/50G H I
1/100
1/200
65
67
168
204
1/50
1/100
1/200
1/100
1/50
1/25
112
Media 66
189 204
92
110
63
112112
Media 113
189
101
1/50
1/25
1 Dilución
204
119
189
2 Diluciones
1/100
1/50
1/251/50
G
65
67
H
168
204
I G H I
(1 Dilución)
Media66 113 101
1/200
1/100
(2 Diluciones)
1/100
1/200
1/50
1/100
119
106
Importante
Dilución 1/25 38 ppm
Dilución 1/25 37 ppm
Dilución 1/50 40 ppmDilución 1/50 39 ppm
media 38 ppm de gluten
Hacer 2 diluciones por duplicado por muestrasy en informe indicar los 4 valores y la media
(aunque el coste sea mayor)
2000
Ayuda del CSIC y la C.A.M a la Unidad de Gluten del CNB para la implantación del Sistema de Calidad
ISO/17025/2000-12-05
ELISA-R5 Western BlotEspectrometría de Masas MALDI-TOF
Responsable Técnico y de CalidadAuditoría por AENOR en 2004-5
Normas ISO
Técnicas analíticas
ELISA R5 Sandwich (Comercial)ELISA R5 Competitivo (No Comercial)PCR T/Cb/ Cn (No Comercial)E. Masas (No Comercial)
Servicio
Al Campo
Mercadona
etc.
Campofrio
C.Tarradellas
Nestle
DanonePizzas
Embutidos
Potitos
Jamones
Lacticos
Zumos
Papillas
Productos que salen con el etiquetado de sin-glutenaptos para celiacos
H. inversores(Joss SRL)
Alimentos de alta complejidadaptos para celiacos
¿Se puede analizar con “garantía” el contenido de gluten de estos alimentos que sale al mercado con la etiqueta de aptos para celiacos?
Sin-gluten
hidrolizados
complejos
Cereales de desayunoPapillas infantiles
Lácticos
Embutidos
Lista de FACE
Lista de SMAP
¿ Actualmente tienen “total” garantía los productos de las lista de lasAsociaciones de Celiacos para ser consumidos por los celiacos ?
El símbolo
No da garantía el control
si no hay responsabilidad
De quien depende la garantía y la responsabilidad
MedicamentoPara ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor TIFF (LZW).
Control
Responsabilidad Administración
Empresas
Recomendar
Medicamento
celiacos
Responsabilidad Administración
Empresas Recomendar
AsociaciónCeliacos
Control
Administración MédicosCientíficosAsociaciones de. Celiacos
Control del gluten en alimentos
FACE SMAP
Empresas
sin-gluten
Laboratorios
análisis
CeliacosConsultoras
Gracias
¿ Con o sin gluten la cuestiónestá en el análisis