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Técnicas de Purificação
Maria Alice Zarur Coelho
Priscilla Filomena Fonseca Amaral
Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Introdução• Meios de fermentação:
- produtos extracelulares (solúveis e insolúveis),- produtos intracelulares,- fragmentos de células,- microrganismos intactos- substratos ou demais componentes não convertidos em produto.
• Diversidade: métodos de separação passíveis de utilização é muito vasto.
• Quatro etapas similares, que ocorrem seqüencialmente:- remoção de material insolúvel- separação dos produtos- purificação- polimento (geralmente associado a cristalização)
Técnicas de Purificação
suspensão diluídaprocesso de separação e/ou purificação composto altamente
purificado
Separação
Purificação
Etapas de Recuperação
• Operações Unitárias:
- centrifugação- filtração- adsorção,- extração com solvente
• Duas etapas vêm sendo combinadas em um único estágio;
• Nota-se um grande aumento da concentração do produto nesta fase
Técnicas de Purificação
Separação
Remoção de material insolúvel
Separação de produtos
Etapas de Recuperação
• Enzimas extracelulares:- Resfria-se o meio fermentado a 5°C (estabilidade e evitar contaminação)- pH ajustado
• Fungos filamentosos: - centrifugação- ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo)
• Leveduras e Bactérias: - prévia floculação (sulfato de alumínio, CaCl2)- centrifugação - ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo)
Técnicas de Purificação
Separação
Etapas de Recuperação
• Enzimas hidrolíticas: centrifugação
- bactérias gram-positivas tais como Bacillus subtilis (produtora da protease subtisilina)- bactérias gram-negativas como Klebsiella pneumoniae (produtora da pululanase): presença de membrana externa – complicações: liberação apenas parcial da enzima no meio.
Técnicas de Purificação
Separação
Etapas de Recuperação
• Obtenção de enzimas intracelulares:
Técnicas de lise celular: - métodos físicos,- métodos químicos,- métodos enzimáticos
Técnicas de Purificação
Extração
Enzima localizada na parte externa da membrana celular
(mas não é extracelular)
liberação da enzima: destruição parcial ou total da célula
(exemplo: autólise das células a 50oC durante 14 horas).
Etapas de Recuperação
• Métodos enzimáticos:
- Utilização de enzimas que catalisam a digestão de parede celular: Lisozima – bactériasGlucanase, tripsina e protease – leveduras
- Pouco usado industrialmente: alto custo
Técnicas de Purificação
Extração
Etapas de Recuperação
• Métodos enzimáticos:
Técnicas de Purificação
Extração
Ação da lisozima: hidrólise das ligações glicosídicasbeta 1,4 entre resíduos do ácido N-acetilmurâmico(Mur2Ac) e N-Acetil-D-glucosamina (GlcNAc) num pepitídeoglicano
Tratamento prévio com EDTA
Etapas de Recuperação
• Métodos enzimáticos:
Técnicas de Purificação
Extração
Glucanase, tripsina e protease – leveduras
Etapas de Recuperação
• Métodos químicos:
- tratamentos com bases (NaOH) – enzima tolerante a alto pH
- choque osmótico (variação da concentração de soluto presente no tampão):
Extrato resultante com pouca contaminaçãoBactérias Gram-positivas: alta pressão osmótica interna
- tratamento com detergentes (Tween, laurilsulfato de sódio, triton)Agem sob condições de baixa força iônica, combinando as
lipoproteínas da membrana para formar micélios
- tratamento com solventes orgânicos (álcool isopropílico, etanol).
Técnicas de Purificação
Extração
Etapas de Recuperação
• Métodos físicos:
- Congelamento / descongelamento: formação de cristais degelo intracelulares
DemoradoPode inativar enzima
- Moagem com abrasivos: moinhos vibratórios com esferas de vidro
largamente empregadaOpera em batelada ou contínuoNecessita de sistema de resfriamento
- Mixers ou liquidificadores: tecidos animais e vegetais
Técnicas de Purificação
Extração
Etapas de Recuperação
• Métodos físicos:
- Cisalhamento líquido: passagem por pequenos orifícios sob alta pressão
- Sonicação: aparelhos de ultrassomaltíssimas frequênciasruptura das células por cavitaçãoNão muito aplicada em escala industrial
O extrato enzimático contém muitos componentes celulares. Em particular, as células bacterianas lisadas liberam elevadas quantidades de ácidos nucleicos.
Técnicas de Purificação
Extração
Etapas de Recuperação
• Extração a partir de Tecidos Animais e Vegetais
- Tecidos animais: similares às técnicas empregadas em leveduras
Homogeneização do tecido selecionado em uma solução tampão adequada é a técnica mais amplamente empregada.
Segundo passo: se utiliza a centrifugação diferencial para selecionar a subfração celular apropriada.
- Tecidos vegetais: Forças necessárias são elevadasPresença de compostos fenólicos facilmente oxidados
Técnicas de Purificação
Extração
Etapas de Purificação
• As características das etapas de um processo de purificação são, em grande parte, determinadas pela natureza do produto final e pela sua aplicação
• Existe necessidade para a purificação completa de uma enzima?
• Maioria das aplicações: suficiente um menor grau de purificação ainda que existam algumas atividades contaminantes desde que não afetem substrato(s), produto(s) ou enzima(s) envolvido(s) em um processo específico.
• Existem algumas aplicações (na medicina clínica, área farmacêutica, análises específicas, projeto de biosensores, engenharia genética) onde é essencial que a proteínas contaminantes sejam reduzidas ou completamente eliminadas.
Técnicas de Purificação
Etapas de Purificação
• Cuidados devem ser tomados para que ao passar de uma etapa a outra mínimas alterações nas condições de estabilidade, pH, temperatura, etc. sejam promovidas.
• As enzimas são moléculas de elevado peso molecular, cujas funções dependem de uma estrutura altamente ordenada.
Técnicas de Purificação
• Tamanho, carga, hidrofobicidade, solubilidade e atividade biológica são as principais características proteicas utilizadas na etapa de purificação das proteínas
Etapas de Purificação
Precipitação
- A solubilidade de uma proteína é o resultado de:interações polares com o solvente aquoso,interações iônicas com os sais presentes,forças eletrostáticas de atração e repulsão.
- O desempenho do processo de precipitação depende também da composição da solução, incluindo as propriedades das demais proteínas presentes (co-precipitação).
- Outros fatores determinantes na solubilidade das proteínas: pH, temperatura e força iônica.
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Concentração
Etapas de Purificação
• Precipitação Isoelétrica:
- Ponto isoelétrico: pH no qual as proteínas apresentam a carga líquida igual a zero.não ocorre migração das molécula se submetidas a um campo elétrico. Abaixo do PI: forma catiônicaAcima do PI: forma aniônica.
- Quanto maior o caráter iônico:maior a tendência à solvatação.
Técnicas de Purificação
Concentração
Etapas de Purificação
• Precipitação com sais inorgânicos:
- Sais inorgânicos neutros (NaCl, (NH4)2SO4) que promovam a precipitação seletiva das proteínas.
- Efeito salting-out: dependente da hidrofobicidade das proteínas.
- Distribuição de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da molécula de proteína: afeta enormemente sua solubilidade frente a vários solventes.
Grupos hidrofóbicos: papel importante no comportamento das moléculas proteicas, devido à carga e aos grupos polares que apresentam;
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Concentração
Etapas de Purificação
• Precipitação com sais inorgânicos:
- A força iônica mede a concentração das cargas em solução. Variação da força iônica (concentração do sal) no meio.Solubilidade aumenta exponencialmente com a concentração do sal,
passa por um máximo e depois decresce.
Técnicas de Purificação
Concentração
Etapas de Purificação
• Precipitação com sais inorgânicos:
- Salting-in: forças de atração entre os íons da proteína e os íons do sal;íons do sal: muito hidratados - contribuem para o aumento da camada de
hidratação da molécula, favorecendo o aumento da solubilidade.
- Salting-out:
O fenômeno da salting out é bastante apreciável no ponto isoelétrico, onde a repulsividade eletrostática passa por um mínimo.
Técnicas de Purificação
Concentração
Ptn´s mais susceptíveis àaglomeração
redução das interações entre a água e os
grupos polares das proteínas
decréscimo na atividade
da água
Aumento da concentração
iônica
• Precipitação com sais inorgânicos:
Sulfato de amônio:- barato e de fácil obtenção;
- não é tóxico;
- alta solubilidade mesmo em baixas temperaturas;
- efeito estabilizante em algumas proteínas, sendo normalmente utilizado no processo de armazenagem de enzimas comerciais;
- alta concentração deste sal previne ação proteolítica e bateriana, o que reduz as perdas de atividade enzimática.
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Concentração
OBS: a adição do sal deve ser lenta e sob agitação para favorecer a homogeneização
Etapas de Purificação
• Precipitação com solventes orgânicos:
- A adição de solventes orgânicos (acetona e álcool): diminui a sua solubilidade. abaixamento da constante dielétrica da solução, ou seja, diminuição da atividade da água.
- Constante dielétrica: medida da polaridade do solvente, ou seja, da capacidade que ele apresenta de se colocar entre dois íons de cargas opostas e separá-los, solvatando-os.
Constante dielétrica da água: muito elevadaA água separa os íons de carga oposta, solvatando-os, e mantendo a
proteína em solução.O solvente já o faz com mais dificuldade, permitindo maior atração
entre as moléculas proteicas.
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Concentração
Etapas de Purificação
• Precipitação com solventes orgânicos:
- Os solventes devem ser usados somente a baixas temperaturas (< 0 oC);
- O uso de solventes tem diminuído nos últimos anos;
- Mais usados: metanol, etanol e acetona – inflamáveis;
- Vantagem: recuperação do solvente para reutilização.
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Concentração
Etapas de Purificação
• Precipitação com polímeros:
- Polietilenimidas e polietilenoglicóis de diferentes pesos moleculares.
- Mecanismo de precipitação: é similar ao existente com solventes orgânicos e resulta da mudança na solvatação das moléculas proteicas pela água.
- Acredita-se que as moléculas de polímero ocupem o lugar das moléculas proteicas na solvatação.
- Muitas enzimas precipitam com concentrações de polímero variando entre 15 e 20%.
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Concentração
Etapas de Purificação
• Ultrafiltração:
- Princípio: Uma membrana semi-permeável permite a separação das moléculas de solvente das moléculas enzimáticas grandes porque apenas as moléculas pequenas podem penetrar na membrana quando a pressão osmótica éexcedida.
- O processo de ultrafiltração éempregado para concentração, dessalinização e fracionamento.
- A força motriz é a diferença de pressão entre os lados da membrana.
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Concentração
Etapas de Purificação
• Ultrafiltração:
Vantagens do processo:- utiliza baixas pressões hidrostáticas;- não ocorre mudança de fase;- não utiliza reagentes químicos;- mantém força iônica e pH da solução concentrada;- evita desnaturação e inativação das enzimas.
Desvantagens:- Concentração por polarização (acúmulo de moléculas grandes perto da
superfície da membrana),- Formação de camadas de géis na membrana (reduz-se através da
manutenção de escoamento turbulento ou laminar com alta vazão)- fouling (deposição) na membrana (especialmente agentes anti-espumantes
usados nas fermentações ocasionam depósitos).
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Concentração
Etapas de Purificação
• Ultrafiltração:
- Materiais: Acetato de celulose e polímeros orgânicos (polisulfonas e polipropileno)
- Fluxo inversamente proporcional a resistência. Como minimizar a resistência?
- Aumentando o tamanho dos poros (até o máximo)
- Aumentando a quantidade de poros;
- mínima expessura da membrana;
- Máxima hidratação da membrana;
- Mínima viscosidade da solução;
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Concentração
Etapas de Purificação
• Liofilização:
- Concentração dos sais presentes na solução inicial
- Pode provocar perda na atividade enzimática
- Uma vez ativa em forma de pó: mais estável do que em solução aquosa
- Cuidado: não descongelar durante o processo
Técnicas de Purificação
Concentração
Etapas de Purificação
• A cromatografia pode ser considerada como uma separação diferencial dos componentes de uma amostra entre uma fase móvel e uma fase estacionária.
• Fase estacionária: partículas esféricas de um material insolúvel empacotado em uma coluna;
• A mistura de enzimas é introduzida na coluna pela fase móvel e forçada a migrar através da coluna;
• As enzimas que possuem maior atração pela fase estacionaria irão migrar de forma diferenciada das que tem maior afinidade pela fase estacionária.
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Cromatografia
Etapas de Purificação
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração (permeação em gel, exclusão por tamanho ou peneira molecular)
- Para o fracionamento e purificação de proteínas e aplicável à determinação de seus pesos moleculares.
- Moléculas são separadas de acordo com seu tamanho efetivo quando em solução, utilizando matrizes (ou géis) com porosidade definida.Estabilidade, rigidez, tamanho de partícula, distribuição de poros e inércia química são fatores que podem afetar o tamanho da coluna, a vazão a ser adotada e a eficiência de separação.
- Definição: partição difusional das moléculas de soluto entre a fase móvel, constituída pelo solvente, e a fase estacionária formada pelos poros do gel.
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Cromatografia
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração
- Gel: matriz tridimensional, aberta, formada por ligações cruzadas, contendo poros de diferentes tamanhos que permitem o acesso de apenas algumas moléculas.
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Cromatografia
Ex.: matrizes formadas por ligações cruzadas de dextranas(Sephadex):
Moléculas maiores: eluídas mais rapidamente;
Moléculas menores: movem-se mais lentamente por terem um maior caminho a percorrer.
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração
-Escolha do gel: depende da finalidade- Separação de moléculas maiores (enzima) de menores (sais): geis com
poros pequenos - Separação de moléculas de tamanho próximo: géis que fracionam várias
faixas de peso molecular
- Parâmetros críticos para a otimização do processo de gel-filtração:- volume da amostra;- concentração da amostra;- vazão adotada;- altura do leito da coluna.
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Cromatografia
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração
- Vantagens:- não utilização de energia,- forças cisalhantes desprezíveis,- sistemas simples de automação- altas recuperação aliadas a máxima resolução.
- Desvantagens: - quantidade de amostra aplicada: máx 1-2% do volume total da coluna; - géis, Sephadex e Sepharose (agarose), tendem a empacotar;- problemas de diluição no processo de eluição da coluna.
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Cromatografia
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração
- Equipamento: coluna,detector de UVcoletor de fraçõesControle de fluxo (bomba peristáltica)
- Utilizada para etapas finais de purificação, mas pode ser usada na dessalinização e na determinação de pesos moleculares.
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Cromatografia
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Fracionamento de substâncias biológicas que apresentem semelhanças em suas propriedades químicas e fisico-químicas,
- Método de fracionamento baseado na fixação de substâncias carregadas a um suporte que contém uma carga oposta.
A separação ocorre porque as interações eletrostáticas entre os grupos são reversíveis e dependentes da afinidade de cada substância pelo trocador.
Esta afinidade é função do pH do meio, da temperatura, da força iônica, do tampão, etc.
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Cromatografia
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Suportes: trocadores iônicos ou resinas, sendo normalmente empregados em colunas.As resinas são obtidas pela introdução de grupamentos polares em matrizes insolúveis em água. Ex.: Celulose, poliacrilamida, géis de dextrana e copolímeros de estireno e divinilbenzeno.
- Classificação:Permutadores de cátions:
grupamentos ácidos (ativos em pH > pK)Permutadores de ânions:
grupamentos básicos (ativos em pH < pK)
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Cromatografia
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Ativação do trocador catiônico:
Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma sódica, ou seja:
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Cromatografia
tratamento com tampão cujo pH deve ser superior ao pK do grupa-mento trocador
trata-se com uma base forte (NaOH)
lava-se com água deionizada
Trata-se a resina com um ácido
forte (HCl)
lava-se com água deionizada
R-COOH NaOH R-COO- Na+
Forma Inativa Forma Ativa
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Ativação do trocador aniônico:
Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma cloreto, ou seja:
Técnicas de Purificação
Cromatografia
tratamento com tampão cujo pH
deve ser inferior ao pK do grupamento
trocador
trata-se com uma base forte (NaOH)
lava-se com água deionizada
Trata-se a resina com um ácido
forte (HCl)
lava-se com água deionizada
R-COOH HCl R-CO+ Cl-
Forma Inativa Forma Ativa
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Caso uma solução contendo um cátion X+ for colocada em contato com um trocador catiônico ativo, este deslocará o cátion presente no trocador e será
fixado:
- Capacidade total de troca: função do tipo de trocador. Importância deste parâmetro: se excedido, os íons não serão totalmente retidos. “capacidade disponível ou real de troca”: capacidade de cada trocador em
uma determinada condição experimental (pH, natureza do tampão, força iônica, etc.).
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R-COO-Na+ + X+ R-COO- X+ + Na+
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• Cromatografia de Troca-iônica
- Escolha do tipo de resinaProteínas com cargas positivas e negativas:
Carga é função do pH do meio,Fator principal: estabilidade da
molécula nos diferentes pH’s. Proteínas labéis: trocadores fracos
- Trocador catiônico (p.ex. CM-celulose), uma força iônica baixa e um pH = 5 são condições ideais para fixar as proteínas.
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Cromatografia
(pK típico dos grupos carboximetílicos = 4) e a maioria das proteínas se encontrariam positivamente carregadas (abaixo do seu ponto isoelétrico).
• Cromatoenfoque:
- As proteínas são eluídas de uma coluna de troca iônica utilizando-se um enfraquecedor
- Efeito de enfoque: concentra a enzima de interesse
- A coluna é equilibrada com um tampão e, depois da aplicação da amostra, se utiliza um segundo tampão, enfraquecedor de pH (para a eluição).
- Geração de um gradiente linear de pH “in situ” como conseqüência da capacidade enfraquecedora da resina.
- Este gradiente de pH tem efeito de enfoque e as moléculas com o ponto isoelétrico específico se concentram conjuntamente.
Etapas de Purificação
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• Cromatografia de adsorção:
- Os componentes da amostra serão retidos ou não sobre a superfície da fase estacionária por forças do tipo van der Waals, ligações hidrogênio ou interações eletrostáticas.
- O deslocamento das partículas adsorvidas será função da maior ou menor interação destas com a fase estacionária.
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• Cromatografia de afinidade:
- Cromatografia de adsorção onde o suporte apresenta afinidade específica com a substância a ser isolada.
- É capaz de fornecer um alto grau de purificação.
- Acopla-se covalentemente uma molécula ligante apropriada a uma matriz insolúvel.
- A molécula ligante adsorve da solução a substância a ser isolada, sendo eliminadas as que não apresentam nenhuma afinidade com o suporte.
- Dessorção: mudanças nas condições experimentais ([substrato] , coenzimas).
- Isolamento de substâncias de acordo com sua função biológica
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• Interação hidrofóbica:
- Observou-se: proteínas são retidas nos géis de afinidade contendo “braços” de hidrocarbonetos (C2 a C10).
- As interações hidrofóbicas são mais fortes em alta força iônica sendo, portanto, convenientemente utilizadas após a precipitação com sais ou cromatografia de troca iônica.
- A eluição pode ser efetuada alterando o pH do solvente, a força iônica ou usando um modificador orgânico (como etilenoglicol).
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Cromatografia
• Eletroforese:
- Existência de grupos ionizáveis nas moléculas biológicas
- Quando em solução podem existir como espécies eletricamente carregadas.
- A taxa de migração destas partículas, quando submetidas a um campo elétrico, é proporcional a força do campo e a carga efetiva das partículas e inversamente proporcional ao atrito, dependo da sua forma e tamanho.
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Cromatografia
• Eletroforese:
- Papel: simples e mais usado Em alguns casos, não se obtém uma
boa separação.
- Em gel:amido, agarose e poliacrilamidaUtilização de outros fatores como a
difusão e a separação por peneiramento molecular, além do campo elétrico.
Mais conhecida: SDS-poliacrilamida usada na determinação de peso molecular e dapureza da amostra.
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• Eletroforese:
- Sódio dodecilsulfato (SDS): detergente aniônico que se liga fortemente as proteínas causando sua desnaturação e fornecendo uma carga negativa constante por unidade de massa.
- Os complexos SDS-proteína: movem-se para o anodo durante a eletroforese.
- Propriedades de peneira molecular do gel: mobilidades são inversamente proporcionais ao logaritmo de seus pesos moleculares.
- Proteínas padrão de peso molecular conhecido são aplicadas: o peso molecular das amostras proteicas pode ser determinado.
- Relevação do gel: Comassie Brilliant Blue, Bromofenol – ZnSO4 – ácido acético ou Nitrato de prata.
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Cromatografia
• Géis bidimensionais:
- Amostras são parcialmente separadas por diferenças entre pontos isoelétricos, usando uma coluna cilíndrica.
- O anodo possui um pH menor que o catodo e um gradiente estável de pH émantido.
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Cromatografia
- Proteínas abaixo do seu pI: carregadas negativamente e migrarão para o catodo, até uma região onde o pH corresponda a seu pI, cessando o movimento de migração. Oposto: proteínas acima do seu pI.
- Esta técnica é conhecida como enfoque isoelétrico.
• Géis bidimensionais:
- Após separação parcial: eletroforese em SDS no sentido perpendicular àprimeira separação - separação baseada nas diferenças de peso molecular.
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