Proje Yüklenicisi: Yrd. Doç. Dr. Melek ÖZKAN GEBZE YÜKSEK TEKNOLOJİ ENSTİTÜSÜ

MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ

© 2009-İstanbul. Bu araştırma projesi “Projem İstanbul” kapsamında İstanbul Büyükşehir Belediyesi tarafından hazırlatılmıştır. İstanbul Büyükşehir Belediyesi ve araştırmacının yazılı izni olmadan çoğaltılamaz ve kopyalanamaz.

i

ARAŞTIRMA PROJESİ

SELÜLOZ İÇEREN KAĞIT FABRİKASI ATIKLARININ VE

BİTKİSEL ATIKLARIN BİYOETANOL ÜRETİMİ İÇİN

DEĞERLENDİRİLMESİ

İÇİNDEKİLER DİZİNİ

İÇİNDEKİLER DİZİNİ.......................................................................................................İ

TABLOLAR DİZİNİ.........................................................................................................İV

ŞEKİLLER DİZİNİ ........................................................................................................... V

ÖZET..................................................................................................................................İX

ABSTRACT ..................................................................................................................... Xİİ

1. GİRİŞ................................................................................................................................ 1

2. YÖNTEM ......................................................................................................................... 5

2.1. DENEYDE KULLANILAN MİKROORGANİZMALAR ................................................................... 5

2.2. KULLANILAN BESİYERİ ........................................................................................................... 5

2.3. HÜCRELERİN EKİLMESİ ........................................................................................................... 5

2.4. ÖLÇÜM METODLARI................................................................................................................ 6

2.5. HÜCRE TUTUKLAMALI REAKTÖRÜN HAZIRLANIŞI................................................................. 6

2.6. LİGNOSELÜLOZİK KAYNAKLARIN ASİT HİDROLİZİ ................................................................ 8

2.7. TOPLAM ŞEKER VE SELÜLOZ MİKTARININ TESPİTİ...................................................................8

3. YAPILAN ÇALIŞMALAR VE BULGULAR .............................................................. 9

3.1. DEĞİŞİK LİGNOSELÜLOZİK KAYNAKLARIN C. THERMOCELLUM TARAFINDAN KULLANIMI . 9 3.2. FARKLI KONSANTRASYONLARDA KAĞIT VE BITKI KALINTISI IÇEREN NUMUNELERDE

GLUKOZ VE ETANOL ÜRETIMI………………………………………………………………….……14 3.3. S. CEREVİSİAE KULLANILARAK BİYOETANOL ÜRETİMİ......................................................... 18

3.3.1. S. cerevisiae ’nın üreme hızı ve etanol üretimini etkileyen parametrelerin

belirlenmesi ................................................................................................................. 18

3.3.2. Saccharomyces cerevisiea 26602 ile hücre tutuklamalı reaktörde etanol üretimi

..................................................................................................................................... 28

3.3.3. C. thermocellum kültür sıvısında biriken glukozun S. cerevisiae tarafından

kullanılması ve Etanol Üretimi (Kesikli sistem) .......................................................... 34

ii

3.3.4. C. thermocellum tarafından selülozun parçalanması sonucu üretilen glukozun

kesikli sistemde ve hücre tutuklamalı dolgulu yataklı sürekli reaktörde maya hücreleri

tarafından kullanılması ve etanol üretim veriminin hesaplanması ............................. 36

3.4. SELÜLAZ ENZİMİ KULLANILARAK ŞEKER ÜRETİMİNİN ARTTIRILMASI.................................. 41

3.5. ÖN İŞLEM METODLARININ KIYASLANMASI ........................................................................... 43 3.6. KARBON KAYNAĞI OLARAK MEYVE ATIKLARI KULLANILDIĞINDA S. CEREVİSİAE'NIN ETANOL ÜRETİMİ………………………………………………………………………………………46

3.7. KAĞIT FABRİKASI TORTU VE LİKİT ATIKLARININ C. THERMOCELLUM BAKTERİSİ

TARAFINDAN PARÇALANMASI VE ARITMA GİRİŞİ LİKİT ATIĞIN TOKSİK SEVİYESİNİN

BELİRLENMESİ.............................................................................................................................. 47

3.8. FARKLI KAĞIT ATIKLARINDAN ETANOL ÜRETİMİ.................................................................. 52

3.8.1. Farklı kağıt atıklarının C. thermocellum bakterisi tarafından parçalanması... 52

3.8.2. Atıkların parçalanmasından ortaya çıkan sıvıda maya tarafından etanol üretimi

..................................................................................................................................... 55

3.9. SELÜLOLİTİK ETANOL ÜRETİCİSİ MİKROORGANİZMALARIN İZOLASYONU VE

TANIMLANMASI ...................................................................................................................... 58

3.10. C.THERMOCELLUM 27405 KÜLTÜR SIVISINDAKİ EKSTRASELÜLAR SELÜLAZ ENZİM AKTİVİTESİNİN BELİRLENMESİ…………………………………...……………………………………64

4. TARTIŞMA/SONUÇ .................................................................................................... 67

EK (KULLANILAN BESİYERLERİ).…………………………………………………...75

KAYNAKLAR................................................................................................................... 77

iii

TABLOLAR DİZİNİ Tablo. 1. Saman kağıtlarının kullanım sonrası ortamda kalan selüloz miktarı 15

Tablo 2. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerinde zamana bağlı glukoz

birirkimi

15

Tablo 3. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerlerinde zamana bağlı son ürün miktarları

16

Tablo 4. Farklı konsantrasyonlarda bitki kalıntısı içeren kültürlerde elde edilen ürünler ve kullanım verimleri

18

Tablo 5. S. cerevisiae’nin etanol üretimi üzerinde etkisi incelenen besiyeri

bileşenlerinin konsantrasyonları ve pH değerleri

20

Tablo 6. Besiyeri optimizasyonunda incelenen mineral kombinasyonları 23

Tablo 7. Besiyeri optimizasyonunda etkisi incelenen fiziksel parametreler 27

Tablo 8. Farklı oranlarda taze besiyeri ile karıştırılmış C. thermocellum kültür

sıvısında maya hücrelerinin glukoz kullanım verimi ve etanol üretim miktarı

38

Tablo 9. Dolgu yataklı sürekli reaktörde selüloz ve lignoselüloz içeren C.

thermocellum kültür sıvıları ile etanol üretim verimliliği

41

Tablo 10. 50 g/L selüloz içeren besiyerinde C. thermocellum’un glukoz

üretiminin zamanla değişimi

41

Tablo 11. Selülaz enziminin selülozdan glukoz birikimine etkisi 42

Tablo 12. Bütünleştirilmiş proses ile (C. thermocellum + S. cerevisiae)

otoklavlama önişlemine tabi tutulmuş buğday saplarından etanol üretimi

46

Tablo 13 Meyve Atıklarının Etanol Üretimine Etkisi 47

Tablo 14. Besiyerlerinin sıvı kompozisyonu 51

Tablo 15. C. thermocellum hücrelerince biriktirilen glukoz ve üretilen

konsantrasyonlarının 20 gün sonundaki değerleri

56

Tablo 16. C. thermocellum tarafından biriktirilen glukozun mayalar tarafından

kullanımı ve etanol üretimi

57

Tablo 17. Üretilen yan ürünler ve konsantrasyonları 58

Tablo 18. Kültürler, kaynakları ve selüloz kullanım kapasiteleri 59

Tablo 19. Selüloz parçalayabilen kültürlerde glukoz birikimi ve fermentasyon son ürünleri

62

Tablo 20. 55 ve 37 C’de aerobik koşullarda ekstrasellülar enzim aktivitesi 64

iv

ŞEKİLLER DİZİNİ

v

Şekil 2.1 HPLC analizinde standart sellobiyoz, glukoz, laktik asit, asetik asit ve

etanol’e ait sinyal pikleri.

6

Şekil 2.2. Polimere tutuklanmış S. cerevisiea hücreleri ile etanol üretmek için

kullanılan Hücre Tutuklamalı Reaktör (Immobilized cell Reactor, ICR)

8

Şekil 3.1. Değişik kağıt atıklarının C. thermocellum tarafından kullanımı sonucu

biriken glukoz miktarı (A) ve etanol üretimi (B)

10

Şekil 3.2. Kaynatma ve alkali hidroliz işlemlerinden geçirilmiş tarımsal atıkların

C. thermocellum tarafından kullanımı; glukoz birikimi ve etanol üretimi Arpa

sapı (A), Buğday sapı (B), Sazlık otu (C), Mısır kabuğu (D), Palmiye ağacı

lifleri (E), Barbunya kabuğu (F)

12

Şekil 3.3. Farklı konsantrasyonlarda kağıt içeren C. thermocellum kültüründe

glukoz birikimi (A), etanol üretimi (B).

14

Şekil 3.4. Değişik oranlarda kağıt fabrikası atığı + ticari selüloz içeren C.

thermocellum kültüründe glukoz birikimi (A) ve etanol üretimi (B).

16

Şekil 3.5 20 g/l glukoz içeren besiyerlerinde S. cerevisiae’nin üremesi (A) ve

etanol üretimi (B)

19

Şekil 3.6 100 g/l glukoz içeren besiyerlerinde S. cerevisiae’nin üremesi (A) ve

etanol üretimi (B)

19

Şekil 3.7 Besiyerindeki fosfat konsantrasyonunun S. cerevisiae’nın üreme hızına

(A) ve etanol üretimine (B) etkisi

21

Şekil 3.8. Besiyerindeki ticari ve laboratuarda hazırlanmış maya özütü

konsantrasyonunun S. cerevisiae ‘nın üreme hızına (A) ve etanol üretimine (B)

etkisi

22

Şekil 3.9. Besiyerindeki mineral konsantrasyonunun S. cerevisiae ‘nın üreme

hızına (A) ve etanol üretimine (B) etkisi

23

Şekil 3.10 Besiyeri pH sının S. cerevisiae’nın üreme hızına (A) ve etanol

üretimine (B) etkisi

24

Şekil 3.11 Farklı şekerler içeren besiyerlerinde S. cerevisiae ‘nın üreme hızları 25

vi

Şekil 3.12 Kesikli sistemde glukoz konsantrasyonunun S. cerevisiae’nın etanol

üretimine (A) ve glukoz kullanım ve etanol üretim verimlerine (B) etkisi

26

Şekil 3.13 Atmosfer koşullarının S. cerevisiae’nın üreme hızına (A) ve etanol

üretimine (B) etkisi

27

Şekil 3.14 Sıcaklığın S. cerevisiae’nın üreme hızına (A) ve etanol üretimine (B)

etkisi

27

Şekil 3.15 Çalkalama koşullarının S. cerevisiae’nın üreme hızına (A) ve etanol

üretimine (B) etkisi

28

Şekil 3.16. 1 ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı 29

Şekil 3.17. 2 ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı 29

Şekil 3.18. 1,5 ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı 30

Şekil 3.19. 3 ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı 30

Şekil 3.20. Debinin kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarına (g etanol/dk)

etkisi

31

Şekil 3.21. Debinin etanol üretim verimine (gr etanol/gr glukoz) etkisi 31

Şekil 3.22. 20 g/L glukoz konsantrasyonunda farklı sıcaklıklarda glukoz

kullanım ve etanol üretim verimleri

32

Şekil 3.23. 7 g/L glukoz konsantrasyonunda farklı sıcaklıklarda glukoz

kullanım ve etanol üretim verimleri

32

Şekil 3.24. Dolgu yataklı reaktörde kullanılan polimer ve tutuklanmış maya

hücrelerinin SEM görüntüleri: Boş polyHIPE polimer (büyütme gücü 4000 X)

(A), maya hücreleri ile kaplanmış polimer yüzeyi (büyütme gücü 2000 X) (B)

ve polimer gözeneklerinde tutuklanmış maya hücreleri (büyütme gücü 5000 X)

(C)

33

Şekil 3.25. Farklı pH Değerlerine Sahip C. thermocellum Kültür Sıvısında S.

cerevisiea’nın Üreme hızı (A) ve etanol üretimi (B)

35

Şekil 3.26. Farklı Konsantrasyonlarda Fosfat İçeren C. thermocellum Kültür

Sıvısında S. cerevisiea’nın Etanol Üretimi

35

Şekil 3.27. 4.5g/l glukoz birikimine sahip C. thermocellum kültür sıvısında S.

cerevisiea’nın etanol üretimi

36

Şekil 3.28. C. thermocellum kültüründe zamana bağlı glukoz birikimi ve etanol

üretimi

37

vii

Şekil 3.29. Farklı konsantrasyonlarda glukoz içeren besiyerinde farklı akış

hızlarında reaktör verimi: %E: substrat giderim verimi (% dönüşüm)

=100*(Cso-Cs)/Cso; %Ep: etanol üretim verimi= 100*P/Cso: Cso=başlangıçtaki

glukoz miktarı, Cs=kalan glukoz miktarı

39

Şekil 3.30. Farklı karbon kaynaklarının kullanımı sonucu elde edilen sıvıların

farklı akış hızlarında reaktörden geçirilmesi ve verime etkisi: %E: substrat

giderim verimi (% dönüşüm) =100*(Cso-Cs)/Cso; %Ep: etanol üretim verimi=

100*P/Cso: Cso=başlangıçtaki glukoz miktarı, Cs=kalan glukoz miktarı. C : 10

g/L ticari selülozdan C. thermocellum un ürettiği şeker içerikli sıvı. L : 10 g/L

alkali hidrolize tabi tutulmuş buğday atıklarınından (lignoselüloz) C.

thermocellum un ürettiği şeker içerikli sıvı

40

Şekil 3.31. Farklı sıcaklıklarda selülaz enziminin glukoz birikimine etkisinin

zamanla değişimi (0. günde enzim içeren sıvılarda glukoz konsantrasyonu

yüksek bulunmuştur. Enzim ilavesi yapıldıktan sonra numuneler alınmış ve

ölçüm yapılana kadar +4 C de bekletilmişlerdir. Bu geçen sürede enzim aktivite

gösterdiği için glukoz miktarında artış olmuştur.)

42

Şekil 3.32 Lignoselülozik materyalin (buğday sapı) otoklav öncesi ve

otoklavlama işleminden sonraki görüntüleri

45

Şekil 3.33 Farklı konsantrasyonlarda kağıt fabrikası atığı (tortu kısmı) içeren C.

thermocellum kültüründe glukoz birikimi (A), etanol üretimi (B).

48

Şekil 3.34 Değişik oranlarda kağıt fabrikası atığı (tortu kısmı) + ticari selüloz

içeren C. thermocellum kültüründe glukoz birikimi (A) ve etanol üretimi (B).

49

Şekil 3.35. Farklı konsantrasyonlarda arıtma giriş ve çıkış likit atıklarının C.

thermocellum hücrelerinin glukoz birikimi üzerine etkisi.

51

Şekil 3.36. Farklı konsantrasyonlarda arıtma giriş ve çıkış likit atıklarının maya

hücrelerinin glukoz tüketim ve etanol üretim verimleri üzerine etkisi

52

Şekil 3.37. Değişik kağıt içeren besiyerlerinde C. thermocellum’un toplam şeker

üretimi

53

Şekil 3.38. Değişik kağıtlar içeren besiyerlerinde C. thermocellum’un etanol

üretimi

54

Şekil 3.39. Farklı kağıt atıkları içeren besiyerlerinde biriken glukoz ve diğer son

ürünlerin miktarları

55

Şekil 3.40 Maya hücrelerinin 24 saat sonunda ürettikleri etanol ve besiyerinde

kalan glukoz konsantrasyonları

56

Şekil. 3.41. C. thermocellum selülaz enzim sistemi 66

Şekil 3.42. 37 °C’de C. thermocellum kültür sıvısındaki selülolitik aktivite 66

viii

ÖZET

Günümüzde özellikle taşımacılık sektöründe en çok kullanılan yakıt olan petrolün

çevre kirliğine sebep olması, reservlerinin sınırlı olması ve fiyatının hergeçen gün

yükselmesi yeni yakıt ve enerji kaynaklarına duyulan ihtiyacı artırmaktadır. Yenilenebilir

kaynaklardan üretilen yakıtlar bu alternatif enerji kaynaklarının en önemlileri arasındadır.

Fermentasyonla üretilen etanol (biyoetanol) özellikle taşımacılık sektöründe benzin yerine

kullanılabilecek yenilenebilir bir enerji kaynağıdır. Biyoetanolün petrol ile rekabetini

güçlendirmek için üretim maliyetinin düşürülmesi gerekmektedir. Sellüloz içeren atık

maddelerin değerlendirilmesi etanolün ekonomik üretimi için üzerinde durulan konulardan

biridir.

Bu projede kağıt fabrikası atıkları ve bitkisel atıkların biyoetanol üretiminde

değerlendirilmesi ve etkin bir şekilde kullanılması hedeflenmiştir. Selüloz ve selüloz

içerikli katı atıkların (kağıt ve bitki sapları), Clostridium thermocellum ATCC 27405

suşunun selülolitik aktivitesiyle glükoz dimer ve monomerlerine dönüştürülmesi ve bu

işlem sonucunda oluşan şeker içeren besiyerinin Saccharomycess cerevisiae ATCC 26602

şusu tarafından gerçekleştirilecek olan biyoetanol fermentasyonunda karbon kaynağı ve

besiyeri olarak kullanımı araştırılmıştır.

ix

Projenin ilk aşamasında farklı kağıt atıklarının ve bitki saplarının bakteri tarafından

parçalanma kapasitesi ve glukoz üretimi incelenmiştir. C. thermocellum hücrelerinin kağıt

fabrikası atıkları ve bitki saplarını parçalayabildiği ancak ticari selüloza kıyasla bu

materyalleri parçalama veriminin daha düşük olduğu görülmüştür (4-5 g glukoz/10 g atık).

Lignoselülozik bitki atıklardan elde edilen glukoz miktarı 4g glukoz/10 g atık civarında

ölçülmüş, alkali hidroliz ön işlemi ile lignoselülozik atıklardan glukoz eldesi % 10-14

civarında artırılmıştır. Alkali hidrolizi yapılan bitki artıklarının birçoğunun C.

thermocellum tarafından daha kolay kullanıldığını ve bu kültürlerde etanol üretiminin

kontrole kıyasla daha yüksek olduğunu söyleyebiliriz. Alkali hidroliz yöntemi en çok arpa

sapında etki göstermiş, alkali hidrolizinden geçirilen bitki saplarını içeren numunelerde

glukoz birikiminin kontrole oranla %14 arttığı gözlenmiştir. Buğday sapı ve sazlık otu

içeren besiyerinde de alkali hidrolizin etkili olduğu kontrole kıyasla glukoz birikimini %10

ve 15 oranında arttırdığı görülmüştür.

Sonraki çalışmalarda besiyeri bileşen konsantrasyonlarının ve fiziksel koşulların S.

cerevisiae’nın etanol üretim kapasitesi üzerindeki etkileri incelenmiştir. S. cerevisiae’nın

etanol üretimini etkileyen faktörler incelendiğinde besiyerindeki maya özütü

konsantrasyonunun etanol üretimi için önemli olduğu ve en uygun konsantrasyonun 5 g/L

olduğu tespit edilmiştir. Yüksek metal konsantrasyonlarının mayanın etanol üretimine

olumsuz etki yaptığı görülmüştür. Sıcaklığın etanol üretimi üzerinde fazla etkili olmadığı,

ancak 30 ve 37 oC’de etanol üretiminin oda sıcaklığına kıyasla %7 oranında daha yüksek

olduğu görülmüştür. Laboratuarda hazırladığımız maya özütünün miktarı ticari maya özütü

miktarının iki katı olacak şekilde besiyerine eklendiğinde kontrol ile aynı seviyelerde

etanol üretildiği gösterilmiştir. Bu sonuç yüksek ölçekli fermentasyonda ortamda biriken

maya hücrelerinin kurutulup yıkandıktan sonra yeni hazırlanan besiyerine besin maddesi

olarak eklenebileceğini göstermektedir.

TOPRAK Kağıt fabrikasından alınan atık elyaf kalıntılarının C. thermocellum

tarafından parçalanması ve etanol üretimi incelenmiş farklı miktarlarda kağıt atığı içeren

kültürlerde en yüksek glukoz birikimi 20 g/l kağıt atığı içeren kültürde 5,9 g/l olarak

ölçülmüştür.

x

Maya hücrelerinin etanol üretimi için dolgu yataklı hücre tutuklamalı reaktör

kurulmuş ve sürekli kültür deneyleri bu reaktör kullanılarak gereçekleştirlmiştir. S.

cerevisiae hücreleri iç faz emülsiyonu yüksek bir polimer olan polyHIPE polimer üzerine

tutuklanmış ve sürekli sistemde etanol üretimi takip edilmiştir. Besiyerindeki farklı glukoz

konsantrasyonlarının sistemin performansına olan etkileri incelenmiştir. 6,7-250 g/L

aralığında glukoz konsantrasyonuna sahip besiyerleri 1 ml/dk akış hızıyla ve 50 g/L glukoz

içeren besiyeri 1, 2, 3, 6, 9, 12 ml/dk akış hızlarıyla çalışılmıştır. Farklı

konsantrasyonlarda glukoz içeren besiyerlerinin sabit akış hızı ile sisteme verildiği

deneyler sonucunda 50 g/L glukoz içeren besiyeri 1 mL/dk hızla geçirildiğinde reaktörün

en yüksek verimlilikte çalıştığı gözlenmiştir. Reaktör içerisindeki kuru hücre ağırlığı 2 gr

hücre/ gr polimer olarak hesaplanmıştır. Tarayıcı Elektron Mikroskobu ile yapılan

incelemeler polyHIPE polimer matrisinin maya hücrelerinin immobilizasyonu için son

derece kullanışlı olduğunu ve hücrelerin polimerin yalnızca yüzeyine tutunduğunu

göstermiştir.

C. thermocellum’un selülozu kullanımı sonucu ortaya çıkan glukozun tutuklanmış

maya hücreleri tarafından kullanımı ve etanol üretimi incelenmiş, yaklaşık 7 g/L glukoz

içeren C. thermocellum kültürü ile reaktörün beslenmesi sonucunda glukozun % 19

oranında etanole dönüştüğü görülmüştür. Kültür sıvısında metabolik artıklar ve besin

yetersizliği olabileceği düşünülerek %75 oranında taze besiyeri ilavesi yapılmış ve sürekli

sistemde etanol üretiminin % 83 oranında artığı görülmüştür.

Asit baz hidrolizi önişlem olarak kullanıldığında 15 g glukoz/70 g buğday sapı

olacak şekilde şeker açığa çıkmış ancak bu solusyonda hücreler sağlıksız üreme

göstermişlerdir. Hücre üremesi veya enzim aktivitesine negatif etki etmemesi nedeniyle

buhar ile yapılan önişlem kimyasal maddeler kullanılarak gerçekleştirilen önişlem

metodlarına kıyasla daha etkin bir yöntemdir. Proje çalışması kapsamında lignosellülozik

materyalin buhar ile zayıflatılması için 130 °C otoklavlama yapılmıştır. Otoklavdan sonra

lignoselülozik materyalin bulunduğu kap içinde biriken sıvının besiyeri olarak kullanıldığı

kültür ortamında gerçekleşen bütünleştirilmiş proses ve selülaz enzimi ilavesi sonucunda

7,3 g/l etanol üretilmiştir (7.3 g etanol/70 g buğday sapı). C. thermocellum hücrelerinin

glukoz üretimi ile etanol üretim verimine katkısı % 24 olarak hesaplanmıştır. Mikrobiyel

degredasyon özellikle tarımsal alanlarda kullanılmayan sap kalıntılarının, etanol üretim

tesislerinde açığa çıkan mısır koçanı atıklarının ve kağıt fabrikası atıklarının etanole

dönüştürülmesinde kullanılabilecek, selülaz enzimi miktarında yaklaşık %14 oranında kar

sağlayabilecek ek bir önişlem metodu olarak kullanılabilir.

Selülozu aktif bir şekilde parçalayabilen etanol üreticisi mikroorganizmaların

izolasyonu amacıyla Türkiye’nin çeşitli bölgelerinden 96 toprak veya gübre örneği

toplanmış ve bu örneklerden elde edilen kültürlerden 24’ünde selüloz kullanımı

gözlemlenmiştir. İzole edilen suşlar substrat kullanımı ve ürün üretimi yönleri ile

karakterize edilmiş ve C. thermocellum bakterisi ile aynı substratları kullanarak aynı

ürünleri ürettikleri gözlemlenmiştir. Yalova’dan alınmış örnekten elde edilen 5 numaralı

bakteri kültüründe ve Bursa’dan alınmış olan örnekten elde edilen 6 numaralı bakteri

kültüründe selüloz kullanımının ve etanol üretiminin endüstriyel bir suş olan C.

thermocellum ATCC 26602 suşu ile kıyaslanabilecek seviyelerde olduğu görülmüştür.

Anahtar Sözcükler: Biyoetanol, Clostridium thermocellum, Selülozik atıklar, Sacharomycess cerrevisia, Kesikli ve sürekli fermentasyon

xi

ABSTRACT

There is an increasing demand for alternative fuel and energy sources due to the

problems associated with petrollium, widely used fuel source especially in transportation

sector. It causes air pollution, its reserves are limited and its cost is increasing day by day.

The new fuel sources obtained from renewable materials are the most important alternative

energy sources today. Bioethanol produced by fermentation is a renewable fuel source

which can be used especially in trasportation sector. For producing bioethanol more

compatable with petrollium, cost of bioethanol production should be reduced. Researhers

are now focused on use of cellulose containing waste materials for low-cost ethanol

production.

At start, degredation of paper waste and lignocellulosic plant waste by C.

thermocellum was analysed. C. thermocellum cells was able to degrade paper waste

however degredation yield was found to belower than that of commercial cellulose (4-5 g

glucose/10 g waste). The glucose from lignocellulosic plant waste degredation was

measured as 4 g/10g waste. Alcaline hydrolysis resulted in 10-14% increase in glucose

accumulation. Most of the plant waste hydrolized by alcaline solution were degredad by C.

thermocellum more easily as compared to un hydrolysed ones. It was shown that glucose

accumulation increased 14% and 10 % when alcaline hydrolysis applied to barley and

wheat, respectively

xii

The effect of medium component concentrations and environmental conditions on

ethanol production by S. cerecvisiea was investigated. Yeast extract was found to be

effective nutrient on ethanol production of S. cerevisiae. The most suitable yeast extract

concentration was determined to be 5 g/L in the medium for increased ethanol production.

High metal concentrations in the medium caused a decrease in the amount of ethanol. It

was also shown that ethanol production at 30-37 °C was higher as compared to those

obtained at room temperature. Nonetheless, the effect of incubation temperature on

production was not so remarkable. Yeast extract prepared in the laboratory was shown to

be usable as a media component instead of commercial yeast extract. The concentration of

yeast extract prepared in the laboratory should be twice the commercial yeast extrat for

obtaining same level of ethanol production.

S. cerevisiae cells were immobilized on polyHIPE polymer, which has high internal

phase emulsion, and ethanol production in continuous packed-bed reactor was monitored at

various glucose concentration in the feed medium. A large initial concentration range of

glucose between 6,7-250 g/L was studied at 1 mL/min and 50 g/L glucose gave the

maximum efficiency. The dried weight of the cells was found to be ca. two g for per gram

of cell supporting material. Scanning electron microscope photographs showed that the

polyHIPE polymer can successfully be used for yeast cell immobilization. A very

homogenous thick layer of yeast cells were seen from the scanning electron micrographs

only on the surface of the polymer giving rise to less diffusion limitations.

Glucose accumulated at the end of cellulose degradation was used as substrate for

immobilized S. cerevisiae cells in batch and packed-bed reactor. Cellulose was degraded

in Clostridium thermocellum culture and about 7 g/L glucose accumulated at the end of

this degradation process. It was observed that the culture was found to be usable by S.

cerevisiae. 19% of glucose in C. thermocellum culture was converted to ethanol by yeast

cells. It was thought that presence of some metabolic by products and nutrient limitation in

C. thermocellum culture might cause limited utilization of glucose. Ethanol production

increased by 83% when the culture mixed with 75% fresh medium was fed into the reactor.

xiii

C. thermocellum could degraded waste of paper pulp industry and lignocellulosic

materials and 4-5 g glu/10 g waste was produced at the end of the process. This value is

lower as compared to commercial cellulose degredation. Alcaline hydrolysis pretreatment

method increased the amount of glucose produced from lignocellulosic wastes about %10-

%14 with respect to the type of waste material. When acid base hydrolysis method was

used as pretreatment method 15 g glu/70 g lignocellulosic waste was produced. However,

bacteria and yeast cells did not grow well in the presence of acid hydrolized materials.

Steam treatment is more efficient pretreatment method since there is no chemical factor

affecting microbial growth and enzyme avtivity. We autoclaved the lignocellulosic waste

material at 130 C (steam process). The liquid accumulated in the container of

lignocellulosic waste materil was used as culture medium for C. thermocellum cells. At the

and of this consolidated bioprocessing and enzyme addition 7.3 g/l ethanol was produced

(7.3 g ethanol/70 g lignocellulose). It was calculated that 24% of total produced ethanol

was produced by the help of C. thermocellum cells in this process. The result of study

showed that microbial degredation of cellulose and lignocellulose containing materials can

be used as supplementary process in ethanol production rafineries. The waste materials like

corn fibers, other agricultural waste and waste from paper pulp industry can be converted

to ethanol by microorganisms. Cost of cellulase enzyme used for cellulose breakdown can

be decreased about %14 when microorganisms help degredation process.

For isolation of microorganisms with high cellulolytic acvtivity and ethanol

production capacity, 96 soil or dump samples were collected from various region of

Turkey. 24 cellulolytic cultures were obtained from those samples. The cultures numbered

as 5 and 6 from Yalova and Bursa, respectively, showed maximum cellulose degredation

and ethanol production capacities.

Key Words: Cellulosic waste, Biyoetanol, Clostridium thermocellum,

Sacharomycess cerrevisia, Batch and continious fermentation.

xiv

1. GİRİŞ

Fosil yakıta dayalı enerji kullanımı; fosil yakıt dışalımının büyümesi, ithalat

giderinin artması gibi olumsuzluklardan başka, çevre kirlenmesinin de artmasına neden

olmaktadır. İhtiyaç duyduğumuz yiyecek, yakıt ve kimyasal sınıfına giren maddelerin

tarım, yiyecek, mobilya veya kağıt sektöründen gelen ve çevre kirliliğine sebep olan

atıkların yapısında bulunan selülozun kullanılmasıyla üretimi atık maddelerin ortadan

kaldırılması problemine çözüm getirecek olması, çevre kirliliğinin azalmasına yardımcı

olması, insanlığın yakıt sağlamak için fosil kaynaklarına bağımlılığının azaltılması ve

hayat standartlarını geliştirecek olması sebebiyle önem taşımaktadır. 1991-1996 yıllarında

uluslararası kuruluşlar ve büyük şirketlerin yaptırdıkları araştırmalara göre, 2025 yılında

dünya genelinde modern biyokütle ile sağlanacak enerji jeotermal enerjinin 6.4 katı, rüzgar

enerjisinin 2.6-3 katı, güneş enerjisinin 1.6-2.2 katı olacaktır. Görüleceği gibi en büyük pay

modern biyokütleye ayrılmıştır.

Yeryüzündeki petrol kaynaklarının tükenmeye yüz tutmasıyla birlikte petrol dışında

alternatif enerji kaynakları üretme çalışmalarında dünya çapında bir artış gözlenmektedir.

Yaklaşık yirmi yıldır, taşıma sektöründe ihtiyaç duyulan, % 97 sini petrol kaynaklarının

oluşturduğu enerjinin değişik yollardan sağlanması için yeni teknolojiler geliştirilmeye

çalışılmaktadır (Mielenz, 2001). Atık maddelerin enerjiye dönüştürülmesi için yapılan

araştırmalar bu çalışmaların en güncel ve ümit verici örneğidir. Atığın enerjiye

dönüştürüldüğü güvenli ve doğaya zararsız olan bu işlemde kullanılan atığın hacminin

90% oranında azaldığı saptanmıştır (VanWyk, 2001).

1

Karada ve okyanuslarda yıllık fotosentez yoluyla üretilen biokütle 3x1021 joul

değerinde bir enerjiye sahiptir. Bu da insanların tüm dünya çapında harcadıkları yıllık

enerjinin on katıdır (Cowling, 1976). Yeryüzündeki bitki biyokütlesinin bol miktarda

bulunması ve doğal olarak sürekli yenilenmesi selülozun kullanımıyla elde edilecek

kimyasallar üzerindeki ilgiyi artırmıştır (Jeewon, 1997). Odunsu ve lifli bitkilerin

yapısında bulunan lignoselülozun % 45’i selüloz, % 30’u hemiselüloz, % 25’i ise

ligninden oluşur (Wiselogel ve ark, 1996) Hemiselüloz altı karbonlu (D-galaktoz, mannoz)

ve beş karbonlu (D-xylose, L-arabinoz) çok dallı şeker heteropolimerlerinden oluşur.

Lignin ise fenolik karakterde aromatik bir polimerdir. Enzimatik reaksiyonları engellediği

için sellülolitik atıkların mikroorganizmalar tarafından kullanılmadan önce ligninden

arındırılması gerekir (Zaldivar ve ark. 2001).

Selüloz ekosistemdeki karbon döngüsüyle sürekli üretilen ve yeryüzünde miktarı en

fazla olan polisakkarittir. Moleküler ağırlığı 200- 2000 kDa arasındadır. Sayıları 4000 ile

8000 arasında değişen β-1-4 bağlı D-glükoz moleküllerinin oluşturdukları zincirlerin

birbirine paralel plakalar halinde dizilmeleriyle oluşan bu yapının doğadan temizlenmesi

uzun bir süreç gerektirir. Tarımsal atıklar (mısır, buğday gibi bitkilerin sapları, patates ve

pancar gibi bitkilerin kullanılmayan kısımları) ya da belediye atıkları, kağıt atıkları ve

şeker fabrikası atıkları selüloz içeren biyokütle kaynaklarına örnek verilebilir. Selüloz

sellülolitik mikroorganizmalar tarafından karbon kaynağı olarak kullanılarak doğadan

temizlenebilir. Sellülaz enzimi birçok mikroorganizma tarafından üretilir. Bu

mikroorganizmalar arasında sellülolitik termofilik mikroorganizmalar sıcağa dayanıklı

enzimler üretmeleri sebebiyle önem taşırlar. Selüloz enzimlerinin çeşitliliği bakteriye özel

selüloz enzim aktivitelerinin kıyaslanmasını zorlaştırabilir ancak bakteriyel sellülaz

enzimlerinin spesifik aktiviteleri fungal sellülazlardan on kat daha yüksektir. (Himmel ve

ark., 1996).

Termofilik, anaerobik bir bakteri olan Clostridium thermocellum’un sellülolitik

enzim sistemi selülozu parçalayabilen anaerobik bakteriler ve funguslar için model teşkil

etmektedir (Johnson ve ark., 1982). C. thermocellum'un sellülaz enzim sisteminin spesifik

aktivitesi ticari değeri yüksek olduğu bilinen ve yaygın kullanıma sahip bir fungus olan

Trichoderma reseei'nin sellülaz enziminin seksen katıdır (Johnson, 1983). Sellülaz

enzimlerinin spesifik aktiviteleri aktif bölgelerinin yeterliliğine, son ürünlerin

inhibisyonuna ve selülozu dekristalize edebilmelerine bağlıdır. Bu özellikler belirli

sıcaklıklarda çalışılmıştır. Genellikle enzimatik reaksiyonların birçoğu yüksek

sıcaklıklarda difüzyon ve kataliz termodinamiğinden kaynaklanan avantajlardan yararlanır.

Bu yüzden termofilik sellülaz enzimleri ve termofilik sellülolitik bakteriler bu tip

uygulamalarda tercih edilirler (Sheehan ve Himmel, 1999). Üzerinde yapılan çalışmaların

derinliği ve spesifik aktivitesinin yüksek olması sebebiyle C. thermocellum'un sellülaz

enzim sistemi selülozun kimyasal maddelere dönüştürülmesi için fungal sellülazlar yerine

kullanılabilecek uygun bir alternatiftir. C. thermocellum selülozu karbon kaynağı olarak

kullanarak etanol, asetik asit, laktik asit ve hidrojen gazı (H2) üretir.

2

1998 yılında dünyadaki etanol üretiminin 31.2 milyar L civarında olduğu rapor

edilmiştir. Bunun % 7 si sentetik olarak üretilen etanol geri kalanı ise fermentasyonla elde

edilen etanoldür (Berg, 1999). Toplam üretimin 2/3’ünü yakıt olarak kullanılan etanol

oluşturur. Bölgesel üretim karşılaştırılacak olursa Amerika kıtası 20.3, Asya 5.5, Avrupa

4.7, Afrika 0.5 Okyanusya 0.2 milyar L etanol üretir. En fazla etanol üreten ülke

Birezilyadır (13.5 milyar litre). Amerika’nın etanol üretimi 3.9 milyar L dir. Avrupa

Birliği 2 milyar L etanol üretir ancak bunun yalnızca % 5’i yakıt olarak kullanılmaktadır.

Bu üretimin % 30’unu Fransa, %18’ini İngiltere, % 17’sini Almanya ve %9’unu İtalya

gerçekleştirmektedir. İsviçre ise % 0.22 lik bir paya sahiptir (Bothast ve ark., 1999).

Son 20 yılda etanol üretim maliyeti 4 kat düşmüştür. Etanol şu anda benzin ile

karışım olarak kullanılmak için çok uygundur ve birkaç şirket ilk fabrikalarını kurmak için

çalışmalarına başlamışlardır. Ancak etanolün benzin ile yarışabilmesi için daha yeterli bir

etanol üretim prosesine ve ucuz substratların kullanımı gerekmektedir (Zaldivar ve ark,

2001). Daha yüksek seviyede etanol üretimi için lignoselüloz gibi ucuz substratlar

değerlendirilebilir. Tarımsal kaynaklı selülozik atıkların kullanımıyla etanol üretimi daha

ekonomik hale getirildiğinde yakıt kaynaklarının teminindeki sıkıntı hafifleyeceği gibi

tarım sektörüne destek sağlayacak yeni bir pazar da sağlanabilir.

3

Lignoselülozik materyallerin hidrolizinden açığa çıkan şekerlerin fermentasyonunu

yapabilen yeterince mikroorganizma olmaması bu materyalin kullanımını engelleyen ana

faktörlerden biridir. Bazı termofilik bakteriler ve genetik araştırmalar sonucunda elde

edilen bazı suşlar selülozun etanole direk dönüşümünde önemli rol oynarlar (Jeewon,

1997). Optimum üreme sıcaklığı 60 °C olan ılımlı termofilik bakteriler etanol

fermentasyonu konusunda çok sık gündeme gelirler (Camganella ve Wiegel, 1993; Hogsett

ve ark., 1992; Kurose ve Tonomura, 1994; Lamed ve Bayer, 1988). Çünkü termofilik

fermentasyonun birtakım avantajları vardır. Örneğin yüksek sıcaklıklarda ortamda

yoğunluk ve yüzey direnci az, substrat çözünürlüğü ve reaksiyon hızı yüksek, bioreaktör

soğutması ekonomik, kontaminasyon riski düşük, oksijen çözünürlüğü az, ürünün elde

edilmesi kolay, substrat ünitesine düşen ürün üretimi yüksek, ve ürün birimine düşen hücre

miktarı düşüktür. Bakteriyel direk dönüştürme prosesi etanol üretim maliyetini düşürmenin

ümit verici bir yoludur. Bu proseste sellülaz enziminin üretimi ve etanol üretimi aynı

mikrobik bileşim tarafından gerçekleştirilir. Etkili bir direk dönüşüm prosesi için tek ya da

iki organizmanın birleşimiyle oluşan mikrobiyel sistemin aşağıdaki özelliklere sahip

olması gerekir: 1. Yüksek miktarda aktif selüloz ve hemiselüloz enzim sistemi

sentezlemesi 2. selüloz ve hemiselülozdan şeker fermentasyonu yapabilmesi 3. istenen

ürünü istenmeyen diğer yan ürünlerden daha fazla miktarda üretebilmesi ve bu ürünün saf

olarak ayrıştırılabilmesi. Yukarıda belirtilen tüm özelliklere sahip bir mikroorganizma

henüz mevcut değildir.

Termofilik anaerobik ve sellülolitik bakteriler lignoselüloz biyokütlede bulunan

karbonhidratların parçalanması işleminde çok aktiftirler ancak glükozdan etanol üretimi

konusunda S. cerevisiae veya Zymomonas mibilis ile yarışamazlar. S. cerevisiae altı

karbonlu şekerlerin fermentasyonuyla etanol üretiminde yüzyıllardan beri kullanılmaktadır.

Bu mikroorganzima etanole, diğer fermenytasyon yan ürünlerine ve lignoselüloz ve

hidrolizatında bulunan engelleyici maddelere karşı son derece dirençlidir. Bu yüzden

etanol üretim kapasitesi çok yüksektir (Hahn-Hagerdal ve ark, 2001; Olsson ve Hahn-

Hagerdal, 1993). Genellikle S. cerevisiae hücreleri lignosellülozik maddelerin

degredasyonundan açığa çıkan xyloz’un kullanımı konusunda yetersizdirler. Van Zyl ve

arkadaşları (1989) S. cerevisiae ATCC 26602 suşunun D-riboz varlığında xylozu

kullanabildiğini göstermişlerdir.

Termofilik anaerobik sellülolitik bakteri C. thermocellum ve S. cerevisiae nın en

etkili oldukları iki prosesin birleştirildiği bu projede selülozun parçalanmasıyla oluşan

glükozun maya tarafından kullanılmasıyla daha ekonomik bir etanol üretiminin sağlanması

amaçlanmıştır.

4

2. YÖNTEM

2.1. Deneyde Kullanılan Mikroorganizmalar

Bu çalışmada Amerikan Kültür Kolleksiyonu’ndan (American Type Culture

Collection) temin edilmiş olan Clostridium thermocellum ATCC 27405 suşu ve

Saccharomyces cerevisiea 26602 suşu kullanılmıştır. C. thermocellum RM sıvı besiyerine

periyodik olarak ekilmiştir. Uzun süre muhafaza için logaritmik faza kadar üretilen

hücreler % 20 gliserol içeren RM besiyerinde -20 °C de saklanmışlardır.

2.2. Kullanılan Besiyeri

Bakterilerin üretilmesi için RM (Russian Medium) besiyeri kullanılmıştır [Tsoi et

al, 1987]. RM besiyeri 10 g/l karbon kaynağı (selüloz veya selüloz içeren atık maddeler), 2

g/l üre, 2 g/l KH2PO4, 3 g/l K2HPO4, 5 g/l maya özütü, 0,2 g/l MgCl2.6H2O, 0,05 g/l

CaCl2.2H2O, 0,0025 g/l FeSO4.7H2O ve 1 g/l L-Sistin amino asiti içermektedir. Besiyeri

100 ml’lik septum şişelerinde karbon kaynağı (C), üre (RM I), tampon (RM II), maya

özütü (RM III) ve metaller ve sistin (RM IV) olmak üzere beş ayrı bileşen şeklinde

hazırlanıp anaerobik kabinde 15 dakika bekletilerek oksijenden arındırılmışlardır.

121°C’de 15 dakika otoklavlanarak steril edilen besiyerleri hücrelerin üretilmesi için

kullanılmıştır. Besiyerinin oksijenden arındırıldığının anlaşılması için RM II bileşenine 2

ml resazurin (1 g/l) indikatörü eklenmiştir. Anaerobik ortam sağlanması için anaerobik

kabin kullanılmıştır. Kabin atmosferi azot gazı içermektedir.

2.3. Hücrelerin Ekilmesi

Deneye başlanmadan önce hücreler üç gün boyunca RM besiyerinde 55oC’de

karışım gazı içeren anaerobik kabinde üretilmişlerdir. Tüm deneyler aynı şartlarda

hazırlanıp üretilmiş taze kültürden ekim yapılarak başlatılmıştır. Ekim yapmak için steril

enjektörler kullanılmış, 50 ml RM besiyeri içeren 100 ml’lik lastik kapaklı septum

şişelerine 5 ml kültür ekilmiştir. Tüm deneylerde başlangıç kültürü (aşı) miktarı toplam

kültür hacminin 1/11’i olacak şekilde ayarlanmıştır.

5

2.4. Ölçüm Metodları

Glukoz, Sellobiyoz, Etanol, Laktik Asit ve Asetik Asit Miktarının HPLC (High

Pressure Liquid Cromotography) kullanılarak Tespit Edilmesi

Kültür ortamında biriken glukoz ve üretilen etanol miktarları HPLC (Essence

system, Lab Alliance) cihazı kullanılarak ölçülmüştür. HPLC cihazına numune verilmeden

önce 1 ml numune 0.45 μm gözenek genişliğine sahip filtreden süzülmüştür. Süzülen

numune 45°C’de çalışan kolon fırını içine yerleştirilmiş polimer IEXH form 8 μm şeker

kolonu ve 45°C’de çalışan refraktif indeks dedektörü kullanılarak analiz edilmiştir. Mobil

faz olarak 9 mM sülfürik asit çözeltisi kullanılmıştır. Akış hızı 1 ml/dk olarak

ayarlanmıştır. Şekil 2.1’de HPLC analizlerine ait sellobiyoz, glukoz, laktik asit, asetik asit

ve etanol standartlarına ait sinyal pikleri gösterilmiştir.

Şekil 2.1 HPLC analizinde standart sellobiyoz, glukoz, laktik asit, asetik asit ve etanol’e ait

sinyal pikleri.

2.5. Hücre Tutuklamalı Reaktörün Hazırlanışı

Polimerin hazırlanışı

6

Bir biyofilm oluşturmak amacıyla kullanılan polimer 40 ml su, 0.5g

potasyumperoxidisulfat, 5.6 ml styrene, 2.6 ml divynilbenzen ve 1.8 ml span 80

içermektedir. 50 ml lik falkon tüp içerisine 1.8 ml span 80, 5.6 ml styrene ve 2.6 ml

divynil benzen eklenip iyice çalkalanmıştır. Bu karışım üzerine 5 dk boyunca manyetik

karıştırıcıyla karıştırılmış 40 ml %1.25 potasyumperoxidisulfat eklenmiş ve 5 dk boyunca

hızlı bir şekilde çalkalanmıştır. Karışım 5 dk 60 °C’deki etüve dik bir şekilde inkübasyona

bırakılmıştır. 5 dakikada bir etüvden çıkarılan falkon tüp içindeki karışım 2-3 dk hızla

çalkalanmış ve bu işlem 2 defa tekrarlanmıştır. Falkon tüp içerisinde 1 gün bekletilen

polimer daha sonra tüpten çıkarılıp 1 gün 60 °C’de etüvde kurumaya bırakılmıştır.

Kuruyan polimer el ile küçük parçalara ayırılarak elekten geçirilmiştir. 8 mesh

boyutundaki parçacıklar reaktör dolgu maddesi olmak üzere alınmıştır. Reaktör içerisine 8

gr polimer yerleştirildikten sonra reaktörün üst kısmına cam yünü konulmuş ve reaktör

kapatılmıştır. Kapatılan reaktör 121 °C’de 15 dk boyunca otoklavlanarak steril hale

getirilmiştir.

Reaktörün çalıştırılması

Paslanmaz çelikten yapılmış silindirik reaktör 180 ml iç hacim, 4.8 cm iç çap, 10

cm iç yükseklik, 7 cm dolgu maddesi yüksekliğine sahiptir (Şekil 2.2). S.cerevisiae

hücreleri 100 g/l glukoz içeren 1 litre YM besiyerinde 3 gün üretildikten sonra 8 gr

polimerin bulunduğu steril silindirik çelik reaktör içerisine peristaltik pompa (Masterflex,

Cole-Parmer) yardımıyla verilerek polimerik maddeye tutuklanmaları sağlanmıştır. Daha

sonra maya hücrelerinin üremesi için sisteme sırasıyla 20 g/l glukoz içeren YM ve 20 g/l

glukoz içeren RM besiyerleri 1 ml/dk debi ile verilmiştir. Bakteriyel kontaminasyonu

önlemek için besiyerlerine konsantrasyonu 5 μg /l olacak şekilde tetrasiklin ilave

edilmiştir.

7

Şekil 2.2. Polimere tutuklanmış S. cerevisiea hücreleri ile etanol üretmek için kullanılan

Hücre Tutuklamalı Reaktör (Immobilized cell Reactor, ICR)

2.6. Lignoselülozik Kaynakların Asit Hidrolizi

Lignoselülozik kaynak olarak buğday sapları kullanılmıştır. Saplar ince

parçalar halinde kesilmiş ve 55 °C’de 24 saat kurutulmuştur. Kurutulmuş atık

üzerine 14,2 ml/gr lignoselülozik atık olacak şekilde H2SO4 ilave edilmiştir.

Ağızları kapatılan şişeler otoklavlandıktan sonra NaOH ile pH değerleri 5’e

yükseltilmiştir.

2.7. Toplam şeker ve selüloz miktarının tespiti

8

Kültürlerde biriken şeker ve kalan selüloz miktarları fenol sülfürik asit metodu (Dubois ve

ark., 1956) ile tespit edilmiştir. 1 ml hücre kültürü 6500 rpm hızda 5 dakika çöktürüldükten

sonra sıvı kısmı (supernatant) indirgen uçlu şeker miktarının belirlenmesi için, çökelti

(pellet) kısmı ise selüloz miktarının tespiti için kullanılmıştır.

3. YAPILAN ÇALIŞMALAR VE BULGULAR

3.1. Değişik Lignoselülozik Kaynakların C. thermocellum Tarafından

Kullanımı

Projenin bu bölümünde, farklı kağıt atıkları ve tarımsal atıkların termofilik,

selülolitik ve anaerobik bir bakteri olan C. thermocellum un selülolitik kapasitesinden

yararlanılarak parçalanması sağlanmış ve bu parçalanma sonucunda ortamda biriken

glukoz miktarı ve üretilen etanol miktarı ölçülmüştür.

Öncelikle karbon kaynağı olarak 10 g/l olacak şekilde Whatman filtre kağıdı (no:1),

A4 kağıdı, havlu kağıt, pamuk ve selüloz tartılıp hiçbir kimyasal ön işlem yapılmadan

küçük parçalara bölünerek modifiye RM besiyerine eklenmiştir. Hazırlanan besiyerlerine

C. thermocellum hücreleri ekilmiş ve yirmi günlük fermentasyon süresince glukoz

konsantrasyonu ölçülmüştür. Proses sonunda kullanılamayan kağıt kalıntıları kurutulup

tartılarak parçalanan miktarları tespit edilmiştir.

Selülozun doğada en saf halde bulunduğu madde olan pamuk içeren besiyerinde en

yüksek glukoz konsantrasyonuna ulaşılmıştır (9,13 g/l) fakat üretilen etanol miktarında

fazla bir artış görülmemiştir (Şekil 3.1 B). Whatman filtre kağıdında en yüksek glukoz

konsantrasyonu onuncu günde 7,9 g/l olarak ölçülmüştür, etanol miktarı ise 0,5 g/l olarak

tespit edilmiştir. 10g/l selüloz içeren besiyerinde ve havlu kağıt içeren besiyerinde on

beşinci günde sırasıyla 6,4 ve 8 g/l glukoz birikimi olduğu görülmüştür. A4 kağıdının ise

C. thermocellum tarafından parçalanma hızının çok düşük olduğu tespit edilmiştir. Havlu

kağıt içeren besiyerinde asetik asit üretiminde artış görülmüştür beşinci günden itibaren

asetik asit miktarı 1,1 g/l’ ye çıkmıştır. Etanol konsantrasyonu ise on beşinci günde 0,6 g/l’

ye çıkabilmiştir.

9

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20zaman (gün)

gluk

oz

kons

antra

syon

u (g

/l)

selüloz A4whatman pamukhavlu kağıt

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 5 10 15 20zaman (gün)

etan

ol k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)selüloz A4whatman pamukhavlu kağıt

(A) (B)

Şekil 3.1. Değişik kağıt atıklarının C. thermocellum tarafından kullanımı sonucu biriken

glukoz miktarı (A) ve etanol üretimi (B)

Yirmi günlük proses sonunda ortamda 0,071 g/l havlu kağıt, 0,05 g/l whatman filtre

kağıdı, 0,09 g/l pamuk, 0,36 g/l A4 ve 0,43 g/l selüloz kullanılmadan kalmıştır. Proses atık

kağıtların ortadan kalıdırılması açısından bakıldığında oldukça başarılıdır.

Çalışmanın ikinci kısmında bitki kalıntılarının C. thermocellum tararfından

kullanımı incelenmiş, selülozik atıkların işlem öncesi kaynatılmasının ve alkali hidrolizine

tabi tutulmalarının degredasyona olan etkisi araştırılmıştır. Tarımsal kaynaklı

lignoselülozik atıklardan; arpa sapı, buğday sapı, sazlık otu, mısır kabuğu, palmiye ağacı

lifi ve barbunya kabuğu C. thermocellum kültürleri için selüloz kaynağı olarak kullanılmış

ve bu atıkların parçalanması sonucu biriken glukoz miktarları tespit edilmiştir.

10

Arpa sapı içeren besiyerlerinde en fazla glukoz konsantrasyonu ön işlem (alkali

hidroliz) görmüş olan numunelerde elde edilmiştir. Alkali hidroliz edilen numunelerdeki

glukoz miktarı onuncu ve on beşinci günler için sırasıyla 4,6 ve 4,1 g/l olmuştur (Şekil 3.2.

A). En yüksek glukoz değeri onuncu günde elde edilmiştir. Kontrole oranla glukoz

konsantrasyonu alkali hidroliz yapılmış numunelerde onuncu günde alınan değerlere göre

% 14 artmıştır. Kaynatılmış numunelerde ilk beş gün içinde glukoz konsantrasyonu artmış

daha sonra düşüş göstermiştir (Şekil 3.2. A).

Etanol üretiminin alkali hidroliz yapılan arpa sapının karbon kaynağı olarak

kullanıldığı kültürlerde daha yüksek olduğu gözlemlenmiş, fermentasyonun onuncu ve on

beşinci günlerinde 0,5 g/l olarak ölçülmüştür (Şekil 3.2. A).

Alkali hidrolizinin buğday sapının parçalanma hızını ve sonuç olarak glukoz

miktarını arttırdığı görülmüştür. Kontrole kıyasla alkali hidrolizine tabi tutulan buğday

saplarını içeren besiyerinde glukoz birikimi %10 oranında artış göstermiştir.

Fermentasyonun beşinci gününde 4,2 g/l glukoz birikimi olmuştur (Şekil 3.2. B). Ayrıca

alkali hidrolizine tabi tutulmuş buğday sapının bulunduğu kültürlerde diğerlerine kıyasla

biraz daha fazla etanol üretimi olmuş ve on beşinci günde 0,5 g/l olarak ölçülmüştür (Şekil

3.2. B).

Alkali hidroliz uygulamasının sazlık otunun hidrolizini kolaylaştırdığı ve glukoz

birikimini arttırdığı gözlemlenmiştir. Bu kültürde onuncu günde 4 g/l glukoz biriktiği

görülmüştür. Fermentasyonun onuncu gününde etanol konsantrasyonu yaklaşık 0,7 g/l’ye

ulaşmıştır (Şekil 3.2. C).

Mısır kabuğu içeren besiyerlerinin tümünde fermentasyonun on beşinci gününde

glukoz konsantrasyonu en yüksek değerine ulaşmıştır. En yüksek glukoz birikimi kontrol

numunesinde gerçekleşmiştir on beşinci günde glukoz miktarı 4,7 g/l olarak ölçülmüştür

(Şekil 3.2. D). Ancak kontrolde etanol üretimi kaynatılmış ve alkali hidroliz uygulanmış

örneklerdekine kıyasla düşüktür.

11

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20zaman (gün)

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

etan

ol k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

kontrol (glukoz) kaynat ılmış (glukozalkali hidroliz (glukoz) kontrol (etanol)kaynat ılmış (etanol) alkali hidroliz (etan

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20zaman (gün)

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

etan

ol k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

kontrol (glukoz) kaynatılmış (glukoz)alkali hidroliz (glukoz) kontrol (etanol)kaynatılmış (etanol) alkali hidroliz (etanol)

(A) (B)

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20zaman (gün)

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

etan

ol k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

kontrol (glukoz) kaynatılmış (glukoz)alkali hidroliz (glukoz) kontrol (etanol)kaynatılmış (etanol) alkali hidroliz (etanol)

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20zaman (gün)

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

etan

ol k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

kontrol (glukoz) kaynatılmış (glukoz)alkali hidroliz (glukoz) kontrol (etanol)kaynatılmış (etanol) alkali hidroliz (etanol)

(C) (D)

Şekil 3.2. Kaynatma ve alkali hidroliz işlemlerinden geçirilmiş tarımsal atıkların C.

thermocellum tarafından kullanımı; glukoz birikimi ve etanol üretimi Arpa sapı (A),

Buğday sapı (B), Sazlık otu (C), Mısır kabuğu (D), Palmiye ağacı lifleri (E), Barbunya

kabuğu (F) (Şekil arka sayfada devam ediyor).

12

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20zaman (gün)

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

etan

ol k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

kontrol (glukoz) kaynatılmış (glukoz)alkali hidroliz (glukoz) kontrol (etanol)kaynatılmış (etanol) alkali hidroliz (etanol)

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20zaman (gün)

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

etan

ol k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

kontrol (glukoz) kaynatılmış (glukoz)alkali hidroliz (glukoz) kontrol (etanol)kaynatılmış (etanol) alkali hidroliz (etanol)

(E) (F)

Şekil 3.2. Devamı.

Palmiye ağacı lifi için uygulanan ön işlemlerin glukoz birikimi için etkili olmadığı

görülmüştür. Ancak kontrolde hiç etanol üretimi görülmezken alkali hidrolize tabi tutulan

örneklerde etanol konsantrasyonu onuncu günde 0,4 g/l’ye ulaşmıştır (Şekil 3.2. E). En

yüksek glukoz konsatrasyonu onuncu günde kontrol numunesinde 4,4 g/l olarak

ölçülmüştür.

Benzer şekilde barbunya kabuğu için uygulanan ön işlemlerinde glukoz birikimine

faydalı olmadığı görülmüştür. En yüksek glukoz konsantrasyonuna beşinci günde kontrol

numunesinde ulaşılmış ve 4,2 g/l olarak ölçülmüştür. Kaynatma işlemi uygulanan

numunelerde onuncu günde 4 g/l glukoz elde edilmiştir. Uygulanan ön işlemler etanol

konsantrasyonunda da bir artış sağlamamıştır (Şekil 3.2. F)

Bitki kalıntılarının C. thermocellum tararfından parçalanması işlemini özetleyecek

olursak alkali hidrolizi yapılan bitki artıklarının birçoğunun C. thermocellum tarafından

daha kolay kullanıldığını ve bu kültürlerde etanol üretiminin kontrole kıyasla daha yüksek

olduğunu söyleyebiliriz. Alkali hidroliz yöntemi en çok arpa sapında etki göstermiş,

alkali hidrolizinden geçirilen bitki saplarını içeren numunelerde glukoz birikiminin

kontrole oranla %14 arttığı gözlenmiştir. Buğday sapı ve sazlık otu içeren besiyerinde

de alkali hidrolizin etkili olduğu kontrole kıyasla glukoz birikimini %10 ve 15 oranında

arttırdığı görülmüştür.

13

3.2. Farklı Konsantrasyonlarda kağıt ve bitki kalıntısı içeren numunelerde glukoz ve etanol üretimi

Farklı Konsantrasyonlarda kağıt atığı içeren numunelerde glukoz ve etanol üretimi

Çalışmanın bu bölümünde farklı miktarlarda saman kağıdı içeren besiyerlerinde C.

thermocellum hücreleri tarafından kağıt kullanımı incelenmiş, glukoz ve etanol miktarı on

beş günlük fermentasyon sonucunda tespit edilmiştir. Şekil 3.3. A’da görüldüğü gibi en

yüksek glukoz birikimi (4,5 g/l) 30 g/l kağıt içeren kültürde gerçekleşmiştir. Kağıt

miktarının yükseltilmesi glukoz birikiminde bir artışa neden olmuştur ancak bu artış

ortamdaki kağıt miktarı ile doğru orantılı bir artış değildir. Etanol üretimi ise 20 ve 30 g/L

kağıt içeren besiyerlerinde diğerlerine kıyasla daha yüksektir ve yaklaşık 0,45 g/L olarak

ölçülmüştür (Şekil 3.3. B). Proses sonucunda ortamda kalan selüloz miktarı Tablo 2. de

verilmiştir.

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

5

5 10 15 20 30

kağıt miktarları (g/L)

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/L)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

5 10 15 20 30

kağıt miktarları (g/L)

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/L)

(A) (B)

Şekil 3.3. Farklı konsantrasyonlarda kağıt içeren C. thermocellum kültüründe glukoz

birikimi (A), etanol üretimi (B).

14

Tablo. 1. Saman kağıtlarının kullanım sonrası ortamda kalan selüloz miktarı

Kağıt miktarı (g/l) Kalan selüloz miktarı (g/l) 5 0.8 10 4.5 15 9 20 14 30 22

Farklı miktarlarda bitki kalıntısının glukoz ve etanol üretimine olan etkisini

incelemek amacıyla buğday sapı kullanılmıştır. Buğday sapı lignin içeriği yüksek ve zor

parçalanan bir bitki kalıntısıdır. 5, 10, 20, 30, 50 ve 70 g/L alkali hidrolize tabi tutulmuş

buğday parçalarını içeren RM besiyerine üzerine C. thermocellum hücreleri ekilmiş ve 55

°C’de anaerobik kabin içerisinde inkübe edilmiştir. Bu besiyerlerinde glukoz birikiminin

zamana bağlı değişimi Tablo 2 de gösterilmiştir. Şekil 3. 4 te ise bu veriler grafik olarak

gösterilmiştir. Grafiği incelediğimizde en yüksek glukoz miktarı 50 g/L buğday sapı içeren

besiyerinde elde edilmiş ve 6 g/L olarak ölçülmüştür. Besiyerine eklenen bitki

miktarındaki artış glukoz birikimini artırmıştır ancak bu artış çok yüksek seviyelere

çıkmamıştır. 10 g/L bitki kalıntısı içeren besiyerinde 14. günde ölçülen glukoz miktarı 2,7

civarında iken 50 g/L bitki kalıntısı içeren besiyerinde bu miktar 6 g/L olarak ölçülmüştür.

C. thermocellum bakterisi selulozu glukoza parçalarken oluşan glukozun bir kısmını Tablo

3 de görülen asetik asit, laktik asit ve etanol gibi ürünlere dönüştürmektedir. Oluşan glukoz

kullanıldığı için 50 g/L nin altındaki konsantrasyonlarda bitki kalıntısı içeren

besiyerlerinde glukoz miktarında kayda değer bir artış görülmemiştir.

Tablo 2. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerinde zamana bağlı glukoz birirkimi

Farklı Lignoselüloz Konsantrasyonlarında Glukoz Birikimi zaman 5g/l 10g/l 20g/l 30g/l 50g/l 70g/l

0.gün 2,3 2,4 2,9 2,3 2,6 3,0 4.gün 2,4 1,9 2,3 2,1 2,6 2,7 8.gün 2,6 2,6 2,6 2,2 3,3 3,3 14.gün 1,9 2,7 2,7 2,9 6 4,8

15

0

1

2

3

4

5

6

7

0.gün 4.gün 8.gün 14.günzaman

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/L)..

5g/l 10g/l 20g/l 30g/l 50g/l 70g/l

Şekil 3.4. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerinde zamana bağlı glukoz

birirkimi

Tablo 3. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerlerinde zamana bağlı son ürün miktarları

5g/l 10g/l 20g/l

zaman Laktik asit

Asetik asit

Etanol Laktik asit

Asetik asit

Etanol Laktik asit

Asetik asit

Etanol

0.gün 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4.gün 0 0 0 0 0,4 0 0 0 0 8.gün 0 0,3 0,2 0,1 0,5 0,3 0,2 0,5 0,3 14.gün 0,075 0,3 0,3 0,2 0,7 0,4 0,3 0,7 0,4

30g/l 50g/l 70g/l

zaman Laktik asit

Asetik asit

Etanol Laktik asit

Asetik asit

Etanol Laktik asit

Asetik asit

Etanol

0.gün 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4.gün 0 0 0 0,1 0,7 0,5 0,1 0,5 0,3 8.gün 0 0,2 0,5 0,1 0,7 0,3 0,1 0,4 0,3 14.gün 0 0,3 0,4 0,1 0,7 0,3 0,1 0,7 0,3

16

Şekil 3.4 te 10 g/L bitki kalıntısı içeren besiyerinde 14. günde elde edilen glukoz

miktarı Şekil 3.1 de 10 g/L selüloz içeren besiyerinde biriken glukoz miktarı ile

karşılaştırılacak olursa biriken glukoz miktarlarında yaklaşık 2.5 g/L lik bir fark olduğu

görülür. Çünkü işlenmiş selüloz bakteri tarafından çok daha kolay parçalanabilmektedir.

Buğday sapı ise ortama herhangi bir enzim ilavesi yapılmaksızın yalnızca bakteriyel

aktivite ile parçalanması zor bir bitki kalıntısıdır. İçeriğinde fazla miktarda lignin olması

parçalanmasını zorlaştırmakta ve içeriğinde bulunan selülozun bakteri tarafından

kullanımını engellemektedir. Bu tip maddeler dışarıdan yapılacak olan lignin parçalayıcı

enzimler ve selülaz enzimi ilavesi ile daha etkin bir şekilde parçalanabilir ve ortamda

biriken glukoz miktarı artırılabilir.

Bitki kalıntısı içeren besiyerlerinde kalan selüloz miktarının tespit edilmesi

Farklı konsantrasyonlarda lignoselülozik madde içeren besiyerlerinin 14 gün

boyunca C. thermocellum hücrelerince kullanımı sonucunda oluşan ürünler ve kullanılan

selülozik madde miktarları Tablo 5 de gösterilmiştir. Deneylerimizde lignoselüloz içeren

madde olarak buğday sapı kalıntıları kullanılmıştır. Literatürde yapılan çalışmalar buğday

çöpündeki toplam selüloz miktarının % 30, hemiselüloz miktarının % 50, lignoselüloz

miktarının ise % 15 olduğunu göstermektedir (Sun ve ark., 2002). Deneyimizde kalan

toplam selülozik madde miktarı proses sonucu ortamda kullanılmadan kalan selülozik

maddelerin kurutulup tartılması ile bulunmuştur. Kalan bu selülozik maddeler

kullanılmayan bitki kalıntıları olup içerik olarak selüloz, hemiselüloz ve lignoselülozdan

oluşmaktadır. Selüloz ve hemiselüloz bakteriler tarafından kolay parçalanan selüloz

kaynaklarıdır. Lignoselüloz ise lignin içermesi nedeniyle zor parçalanmakta ve

kullanılmadan kalmaktadır. Dolayısı ile üretilen tüm ürünler (glukoz selobioz, laktik asit,

asetik asit ve etanol) bitki kalıntısı içinde bulunan selüloz ve hemiselülozun kullanılması

ile üretilmektedirler.

17

Tablodaki değerler incelendiğinde kullanılan selülozik madde miktarı arttıkça

kullanım veriminin düştüğü görülmektedir. 5 g/L lignoselüloz (buğday atığı) ile yapılan

deneyde kullanım verimi selüloz ve hemiselüloz miktarları baz alındığında %94; toplam

selülozik madde miktarı (lignoselüloz dahil) baz alındığında %75 olarak bulunmuştur.

Bitki kalıntısı miktarı 70 g/l ye çıkartıldığında ise ortamdaki toplam selüloz ve

hemiselülozun yeterince kullanılamadığı görülmektedir. Kullanım verimi toplam selülozik

madde miktarı göz önüne alındığında % 15,8 dir. 70 g/l bitki kalıntısının yaklaşık 12,6 g/l

si kullanılabilmiştir, 57,4 g/l sinin kullanılmadan kaldığı gözlemlenmiştir.

Deneylerimizde kullandığımız buğday sapı kalıntılarında bulunan selülozik

maddelerden hemiselüloz ve selülozun özellikle düşük konsantrasyonlarda (5-10 g/l

civarında) verimli bir şekilde kullanıldığı görülmüştür. Bitki kalıntılarına ön arıtma olarak

uyguladığımız alkali hidroliz işleminin de giderimdeki verimin iyi olmasında etkisinin

olduğu görülmüştür. Lignoselüloz içeren atıklara uygulanan alkali hidroliz gibi ön arıtma

işlemlerinin iyileştirilmesi ile -özellikle yüksek miktarlarda bitki kalıntısı kullanılan

proseslerde- selüloz kullanım verimi ve buna bağlı olarak glukoz birikimi ve etanol üretimi

artırılabilir.

3.3. S. cerevisiae kullanılarak biyoetanol üretimi

3.3.1. S. cerevisiae ’nın üreme hızı ve etanol üretimini etkileyen parametrelerin

belirlenmesi

18

Etanol üretimi için en ekonomik besiyerinin seçilmesi amacıyla S. cerevisiae

hücrelerinin dört farklı besiyerinde üreme ve etanol üretimi takip edilmiştir. İçerikleri EK

de verilmiş olan RM, YM, CA ve ZZ besiyerlerinin pH ları 5.5’e ayarlandıktan sonra S.

cerevisiae hücreleri ekilmiş ve 30 oC’de 150 rpm’de çalkalanarak üretilmişlerdir.

Besiyerleri iki farklı glukoz konsantrasyonu kullanılarak hazırlanmış ve S. cerevisiae’nın

bu besiyerlerinde üremesi ve etanol üretimi takip edilmiştir

Şekil 3.5 A, S. cerevisiae’nın 20 g/L glukoz içeren dört farklı besiyerindeki üreme

eğrilerini göstermektedir. En yüksek hücre konsantrasyonuna ZZ besiyerinde ulaşılmıştır.

Şekil 2.1 B’ de görüldüğü gibi bu besiyeri etanol üretimi açısından da diğer besiyerlerine

kıyasla daha verimlidir. RM besiyerinde ise etanol üretimi fermentasyonun ilk gününde 5,8

g/l olarak ölçülmüştür. Glukoz konsantrasyonu 100 g/l ye çıkarıldığında (Şekil 3.6) ise

üreme ve etanol üretiminin zengin bir besiyeri olan YM besiyerinde maksimum seviyelere

ulaştığı görülmüştür.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 50 100 150

Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

..

RM YM CA ZZ

01234567

0 50 100 150

Zaman (saat)

Etan

ol (

g/l).

RM YM CA ZZ

(A) (B)

Şekil 3.5 20 g/l glukoz içeren besiyerlerinde S. cerevisiae’nin üremesi (A) ve etanol

üretimi (B)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 50 100 150

Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

..

RM YM CA ZZ

05

1015202530354045

0 50 100 150

Zaman (saat)

Etan

ol (g

/l).

RM YM CA ZZ

(A) (B)

19

Şekil 3.6 100 g/l glukoz içeren besiyerlerinde S. cerevisiae’nin üremesi (A) ve etanol

üretimi (B)

En yüksek üreme hızı ve etanol üretimi YM besiyerinde gerçekleşmiştir. Ancak bu

besiyeri zengin bir besiyeridir ve ekonomik değildir. 100 g/L glukoz içeren RM

besiyerinde etanol üretiminin oldukça yüksek olduğu gözlenmiştir (Şekil 3.6 B).

Besiyerleri 20 g/l glukoz konsantrasyonuna sahip olduklarında ise ZZ besiyerinin etanol

üretimi ve üreme hızını artırdığı görülmüştür (Şekil 3.5 A ve B). ZZ besiyeri RM den farklı

olarak daha fazla üre, maya özütü, MgSO4 içermektedir, fosfat konsantrasyonu ise

düşüktür. Ekonomik açıdan değerlendirildiğinde RM besiyeri üretim için daha uygun

görülmektedir. CA besiyerinin ise etanol üretimi açısından diğer besiyerlerine kıyasla

elverişsiz olduğu tespit edilmiştir.

RM besiyerinde bulunan besin maddelerinin konsantrasyonlarının etanol üretimine

olan etkisini incelemek amacıyla fosfat, mineral ve maya özütü değişen

konsantrasyonlarda besiyerine eklenmiş ve S. cerevisiae hücreleri ekilerek üreme ve etanol

üretimi takip edilmiştir. Bunun yanı sıra üç farklı sıcaklık ve üç farklı atmosfer koşulunun

etkisi de incelenmiştir. Çalışmada etkisi incelenen besiyeri bileşen konsantrasyonları ve pH

değerleri Tablo 5’de verilmiştir.

Tablo 5 S. cerevisiae’nin etanol üretimi üzerinde etkisi incelenen besiyeri bileşenlerinin konsantrasyonları ve pH değerleri

Besiyeri bileşeni Etkisi incelenen değerler

Fosfat 0, 5, 10, 32, 50, 100, 200 mM

Maya özütü 1, 3, 5, 10 g/L ticari maya özütü

1, 5, 10 g/L laboratuarda hazırlanmış maya özütü

Mineral Bkz. Tablo 3.2 B

pH 3, 3.5, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8

Şeker kaynağı (20 g/L) Glukoz, Ksiloz, Selobioz ve Şekersiz

Glukoz 5, 10, 20, 50, 100, 150,170, 200, 250 g/L

20

Farklı konsantrasyonlarda fosfat ve 100 g/L glukoz içeren RM besiyerinde S.

cerevisiae’nın üremesi ve etanol üretimi izlenmiştir. Şekil 3.7 A ve B‘de fosfat

konsantrasyonunun üreme ve etanol üretimine etkisi görülmektedir. Üremenin 2. gününden

itibaren 0-10 mM aralığındaki fosfat miktarlarında hücre miktarının daha düşük olduğu

gözlemlenmiştir. Etanol üretim hızının 32 mM fosfat içeren besiyerinde (kontrol) diğer

besiyerlerindekine kıyasla daha yüksek olduğu görülmüştür. Bu besiyerinde

fermentasyonun 35. saatinde 32 g/L etanol üretilmiştir. Daha düşük ve daha yüksek fosfat

miktarlarının etanol üretim hızını düşürdüğü görülmektedir. Ancak fermentasyonun ileriki

saatlerine bakıldığında besiyerinde bulunan fosfat miktarının etanol üretimi üzerinde çok

etkili olmadığı görülmektedir. Fermentasyonun 4. ve 5. günlerinde fosfat içermeyen

besiyerinde en yüksek etanol üretimi gerçekleşmiştir.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 50 100 150Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

..

0mM 5mM10mM 32mM (Kontrol)50mM 100mM200mM

05

10152025303540

0 50 100 150Zaman (saat)

Etan

ol (g

/L).

0mM 5mM10mM 32mM (Kontrol)50mM 100mM200mM

(A) (B)

Şekil 3.7 Besiyerindeki fosfat konsantrasyonunun S. cerevisiae’nın üreme hızına (A) ve

etanol üretimine (B) etkisi

21

Laboratuarda hazırlanmış maya özütünün etanol üretimi ve üreme üzerine etkisi

ticari maya özütü ile kıyaslanmıştır (Şekil 3.8 A ve B). RM besiyerinde maya hücrelerinin

üremesi için en uygun maya özütü konsantrasyonunun kontroldeki maya özütü miktarıyla

aynı (5 g/l) olduğu görülmüştür. Laboratuar koşullarında hazırladığımız maya özütünü

içeren besiyerinde üreme bulanıklıktan dolayı sağlıklı olarak ölçülememiştir, 0. saatte

alınan numunelerdeki absorbans değerlerinin çok yüksek olduğu Şekil 3.8 A’ da

görülmektedir. Laboratuar koşullarında hazırlanmış maya özütü içeren besiyerinde etanol

üretiminin çok düşük olduğu saptanmıştır. S. cerevisiae hücreleri 5 g/L laboratuarda

hazırlanmış maya özütü içeren besiyerinde fermentasyonun 48. saatinde yaklaşık 28 g/L

etanol üretilebilmişlerdir. Laboratuar koşullarında hazırlanmış maya özütü miktarı 10

g/L’ye çıkartıldığında ise hücreler kontrol besiyerindeki (ticari maya özütü konsantrasyonu

5 g/L) etanol üretim kapasitelerine ulaşabilmişlerdir.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 20 40Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

..

1g/L Laboratuarda Hazırlanmış Maya Özütü5g/L Laboratuarda Hazırlanmış Maya Özütü10g/l Laboratuarda Hazırlanmış Maya Özütü1g/l Maya Özütü3g/l Maya Özütü5g/L Maya Özütü (Kontrol)10g/l Maya Özütü

05

101520253035

0 20 40 60 80Zaman (saat)

Etan

ol (g

/L).

1g/L Laboratuarda Hazırlanmış Maya Özütü5g/L Laboratuarda Hazırlanmış Maya Özütü10g/l Laboratuarda Hazırlanmış Maya Özütü1g/l Maya Özütü3g/l Maya Özütü5g/L Maya Özütü (Kontrol)10g/l Maya Özütü

(A) (B)

Şekil 3.8. Besiyerindeki ticari ve laboratuarda hazırlanmış maya özütü konsantrasyonunun

S. cerevisiae ‘nın üreme hızına (A) ve etanol üretimine (B) etkisi

Besiyerindeki mineral konsantrasyonlarının etkisini incelemek amacıyla Tablo 6 da

görülen 12 farklı mineral konsantrasyonuna sahip besiyerleri (A-O) hazırlanmış ve maya

hücreleri ile ekim yapılmıştır.

22

Tablo 6. Besiyeri optimizasyonunda incelenen mineral kombinasyonları

Mineral Kombinasyonları (g/l)

Mineraller A B C D E F G H I İ J OFeSO4. 7H2O 0 0,00025 0,025 0,25 0,0025 0,0025 0,0025 0,0025 0,0025 0,0025 0,0025 0

CaCl2. 2H2O 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0 0,05 0,1 0,5 0

MgCl2.6H2O 0,2 0,2 0,2 0,2 0 0,5 1 0,2 0,2 0,2 0,2 0

0

5

10

15

20

25

A B C D E F G H I İ J O

Mineral kombinasyonları

Etan

ol K

onsa

ntra

syon

u (g

/L)..

.

etanol konsantrasyonu

A) B)

Şekil 3.9. Besiyerindeki mineral konsantrasyonunun S. cerevisiae ‘nın üreme hızına (A)

ve etanol üretimine (B) etkisi

Besiyerindeki demir miktarındaki artış maya hücrelerinin etanol üretiminde düşüşe

neden olmuştur (Şekil 3.9. B, Tablo 6 sütun D). Mineral içermeyen besiyerinde (O

kombinasyonu) maya hücrelerinin etanol üretiminin kontroldeki (I kombinasyonu) etanol

üretimi ile aynı seviyelerde olduğu gözlemlenmiştir (Şekil 3.9 B). Bu durumda maya

hücrelerinin etanol üretmek için test edilen minerallerden (Fe+2, Mg+2 ve Ca+2) hiçbirine

ihtiyaç duymadığı söylenebilir. Üreme eğrilerine bakıldığında en yüksek hücre miktarına

demir içermeyen besiyerinde (A kombinasyonu) ulaşılmıştır. Besiyerindeki MgCl2.6H2O

miktarının 0.2 g/L den 0.5 g/L (F kombinasyonu) ye yükseltilmesi üremeye olumsuz etki

etmiştir.

23

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

.

A B CD E FG H I (Kontrol)İ J O

Besiyerindeki pH değerinin S. cerevisiae’nın üremesi ve etanol üretimi üzerine

etkisini gözlemlemek amacıyla farklı pH değerlerine sahip 100 g/L glukoz içeren RM

besiyerleri kullanılmıştır. Gerçekleştirilen deneyde pH değerleri steril asit (1,2 M HCl) ve

baz (10 M KOH) solusyonları kullanılarak ayarlanmış ve bu besiyerlerindeki üreme ve

etanol üretimindeki farklılıklar izlenmiştir. Sonuçlar Şekil 3.10 A ve B ile gösterilmiştir.

En yüksek üreme hızlarına pH sı 7, 7.5 ve 8 olan besiyerlerinde ulaşılmıştır. En yüksek

etanol üretimi ise pH 6, 7 ve 8 iken gerçekleşmiş ve fermentasyonun ikinci gününde

yaklaşık 34 g/L olarak ölçülmüştür.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

..

pH 3,5 pH 4,5pH 5 pH 5,5 (Kontrol)pH 6 pH 6,5pH 7 pH 7,5pH 8

0

5

10

15

20

25

30

35

40

3,5 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8

pH

Etan

ol K

onsa

ntra

syon

u (g

/L)...

etanol konsantrasyonu

(A) (B)

Şekil 3.10 Besiyeri pH sının S. cerevisiae’nın üreme hızına (A) ve etanol üretimine (B)

etkisi

S. cerevisiae 26602 hücrelerinin selülozik katı atıkların parçalanması sonucu ortaya

çıkan ksiloz ve selobioz gibi şekerleri kullanma kapasitesini araştırmak amacıyla söz

konusu şekerleri içeren RM besiyerlerindeki üreme hızları aynı miktarda glukoz içeren

besiyerindeki üreme hızları ile kıyaslanmıştır. Şekil 3.11’de de görüldüğü gibi ksiloz ve

selobioz hücreler tarafından tercih edilen ve kullanılan şekerler değildir. Bu şekerleri

içeren besiyerinde üremenin sağlıksız olduğu görülmüştür. Karbon kaynağı içermeyen ve

karbon kaynağı olarak selobioz, ksiloz içeren besiyerlerinden alınan örnekler HPLC de

analiz edilmiş ve etanol üretiminin gerçekleşmediği saptanmıştır.

24

(Kontrol)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

selobioz ksilozglukoz şekersiz

Şekil 3.11 Farklı şekerler içeren besiyerlerinde S. cerevisiae ‘nın üreme hızları

Etanol üretimini daha ekonomik olarak gerçekleştirmek için oda sıcaklığında

çalkalama olmaksızın yapılan deneylerle kesikli bir sistem için uygun glukoz

konsantrasyonu belirlenmeye çalışılmıştır. 5-250 g/L aralığında glukoz içeren 50 ml’lik

RM besiyerlerinde S. cerevisiae’nın glukoz kullanım ve etanol üretim miktarı

belirlenmiştir. Dört günlük fermentasyon sonucunda yapılan analizler yüksek glukoz

konsantrasyonlarında (175, 243 g/L) glukoz kullanım ve etanol üretim veriminin düşmekte

olduğu (Şekil 3.12 A), üretilen etanol miktarının azaldığı görülmüştür (Şekil 3.12 B).

Glukoz kullanım verimi (%E) ve etanol üretim veriminin (%Ep) hesaplanması için

aşağıdaki eşitlikler kullanılmıştır.

100% ×−

=So

SSo

CCCE (3.1)

100% ×=SoC

PEp (3.2)

%E : Glukoz kullanım verimi, %Ep : Etanol üretim verimi, CSo : Giriş glukoz konsantrasyonu, CS : Çıkış glukoz konsantrasyonu,

25

P : Çıkış etanol konsantrasyonu.

01020304050607080

8 50 123

Glukoz Konsantrasyonu (g/L)

Dör

t Gün

Son

unda

Biri

ken.

.. Et

anol

.Mik

tarı

(g/L

)

Etanol

0

20

40

60

80

100

8 25 96 123 243

Glukoz Konsantrasyonu

Glu

koz

Kul

lanı

m V

erim

i, .E

(%)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Etan

ol Ü

retim

Ver

imi,

.Ep

(%)

E Ep

(A) (B)

Şekil 3.12 Kesikli sistemde glukoz konsantrasyonunun S. cerevisiae’nın etanol üretimine

(A) ve glukoz kullanım ve etanol üretim verimlerine (B) etkisi

Fiziksel parametrelerin etanol üretimine etkisinin incelenmesi amacıyla S.

cerevisiae hücreleri Tablo 7’te verilmiş olan şartlarda üretilmişlerdir. Değişik atmosfer

koşullarının S. cerevisiae’nın etanol üretimi üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı Şekil

3.13 B’de görülmektedir. Yüksek etanol üretimi için 30-37 oC’nin uygun olduğu tespit

edilmiştir. Bu sıcaklıklarda yaklaşık 32 g/L etanol üretilmiştir. Hücrelerin 37 oC’ de

fermentasyonun ileriki saatlerinde parçalandıkları görülmüştür (Şekil 3.14 A). Oda

sıcaklığında ise etanol üretiminin diğer sıcaklıklardaki etanol üretimine kıyasla daha düşük

olduğu gözlenmiştir (Şekil 3.14 B). Oda sıcaklığında etanol üretimi 37 oC’ye kıyasla

fermentasyonun üçüncü gününde % 7 oranında daha düşüktür.

26

Tablo 7 Besiyeri optimizasyonunda etkisi incelenen fiziksel parametreler

Fiziksel Parametreler İncelenen Değerler

Atmosfer gazları Argon, Azot, Karışım (%5 H2, %10 CO2, %85 N2)

Sıcaklık 30 oC, 37 oC, oda sıcaklığı

Çalkalama koşulları 150 rpm’de çalkalamalı ve çalkalamasız

Basınç Basınçlı ve basınçsız

0

0,5

1

1,5

2

0 50 100 150

Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

..

Argon Azot Karışım (Kontrol)

0

10

20

30

40

50

0 50 100 150

Zaman (saat)

Etan

ol (g

/L).

Argon Azot Karşım (Kontrol)

(A) (B)

Şekil 3.13 Atmosfer koşullarının S. cerevisiae’nın üreme hızına (A) ve etanol üretimine

(B) etkisi

0

0,5

1

1,5

2

0 50 100 150

Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

..

30 °C (Kontrol) 37 °C

Oda sıcaklığı

01020304050

0 100

Zaman (saat)

Etan

ol (g

/L).

30 °C (Kontrol) 37 °COda sıcaklığı

(A) (B)

Şekil 3.14 Sıcaklığın S. cerevisiae’nın üreme hızına (A) ve etanol üretimine (B) etkisi

27

Şekil 3.15 çalkalamanın maya hücrelerinin üreme ve etanol üretimine etkisini

göstermektedir. Kültürlerin çalkalanması etanol üretimini özellikle fermentasyonun ilk

günlerinde arttırmaktadır. Hücrelerin birbirlerine yapışmamasının ve çökelek

oluşturmamalarının yüksek üretim için gerekli olduğu görülmüştür.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80Zaman (saat)

600

nm a

bsor

bans

..

30 °C 150 rpm (Kontrol) 30 °C

05

1015202530354045

0 20 40 60 80 100

Zaman (saat)

Etan

ol (g

/l).

30 °C 150 rpm (Kontrol) 30 °C

(A) (B)

Şekil 3.15 Çalkalama koşullarının S. cerevisiae’nın üreme hızına (A) ve etanol üretimine

(B) etkisi

3.3.2. Saccharomyces cerevisiea 26602 ile hücre tutuklamalı reaktörde etanol üretimi

28

Ucuz ve yenilenebilir substratlardan yüksek etanol verimi almak ve üretim

işleminde enerji ihtiyacını düşürmek alkolik fermentasyon çalışmalarında üzerinde durulan

önemli iki faktördür. Bu amaca ulaşabilmek için sürekli kültür, tutuklanmış hücreler ve

hücrelerin tekrar kullanımı gibi işlemler geliştirilip kullanılmıştır. Tutuklanmış hücrelerin

kullanılması genellikle katalizör aktivitesini iyileştiren bir işlemdir. Bir matrise

tutturulduklarında normal bir süspanse kültürdekinde olduğundan daha yoğun bir hücre

konsantrasyonuna ulaşmak mümkündür. Canlı hücre miktarının artırılması reaktörün

verimini artıran bir etmendir. Bunun yanısıra kütle transferinin iyileştirilmesiyle besinlerin

hücrelere ulaşmasını ve ürün alımını daha etkin hale getirmek amacıyla immobilizasyon

destek matrisi değişik geometrilerde hazırlanabilir. İmmobilize hücreler etanol üretimi için

bir çok araştırmacı tarafından kullanılmıştır (Glazzo ve Bailey 1990; Tyagi ve ark. 1992;

Nolan ve ark 1994; Roca ve ark 1996; Nigam 2000; Najafpour ve ark 2004). Literatür

bilgileri ışığı altında, daha ekonomik ve daha verimli bir etanol üretimi için proje

kapsamında kullanılması düşünülen sürekli kültür ortamı sağlayacak otomatik reaktörler

yerine oda sıcaklığında daha az enerji ile çalışan hücre tutuklamalı bir reaktörün

kullanılmasının daha uygun olacağı düşünülmüştür. Aşağıdaki sonuçlar polimere

tutturulmuş maya hücrelerinin bulunduğu reaktör ile yapılan çalışmalarından elde

edilmiştir.

Reaktör değişik konsantrasyonlarda glukoz içeren RM besiyeri ile farklı akış

hızlarında beslenmiştir. Şekil 3.16 ve 3.17 de görüldüğü gibi reaktöre giren glukoz

konsantrasyonu arttıkça üretilen etanol miktarında da artış gözlemlenmiştir. Besiyerindeki

glukoz konsantrasyonu 250 gr/l olduğunda ise hücrelerin glukozu verimli kullanamadıkları

ve etanol üretim kapasitelerinin de düştüğü görülmüştür. Yüksek glukoz

konsantrasyonlarında ozmotik basınçtan dolayı hücrelerin fizyolojik olarak zarar gördüğü

önceki çalışmalarda (Hartmeier 1972) rapor edilmiştir.

29

020406080

100120140

5 20 100

250

Giriş Glukoz Konsantrasyonu (g/L)

Kul

lanı

lan

Glu

koz

Kon

sant

rasy

onu

(g/L

)

0

5

10

15

20

25

30

Üre

tilen

Eta

nol

Kon

sant

rasy

onu

(g/L

)

kullanılan glukoz üretilen etanol

Şekil 3.16. 1 ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı

Şekil 3.17. 2 ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı

020406080

100120140160

5 20 100

250

Giriş Glukoz Konsantarsyonları (g/L)

Kul

lanı

lan

Glu

koz

Kon

sant

rasy

onu

(g/L

)

0510152025303540455055

Üre

tilen

Eta

nol

Kon

sant

rasy

onu

(g/L

)

kullanılan glukoz üretilen etanol

Reaktöre gönderilen besiyerindeki glukoz miktarı arttıkça dakikada çıkan etanol

miktarında da bir artış görülmüştür (Şekil 3.16). Ancak yüksek etanol üretiminin yanısıra

glukozun verimli kullanılması da önemli bir faktördür. Reaktörde yapılan deneyler

sonucunda besiyeri düşük akış hızı (1 ml/dk) ile reaktöre verildiğinde glukozun daha

verimli kullanıldığı ve etanol üretim veriminin de daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir

(Şekil 3.16, 3.17). Maksimum glukoz tüketim değeri olan % 97,36 değerine besiyerindeki

giriş glukoz konsantrasyonu 100 g/l ve debi 1 ml/dk iken ulaşılmıştır (Şekil 3.16).

Maksimum ethanol üretimi ise (3,72 g/saat) 250 g/l glukoz konsantrasyonuna sahip

besiyeri 2 ml/dk debiyle reaktörden geçtiğinde elde edilmiştir.

Genellikle 30 C de ve 130 rpm hızda 100 g/l glukoz içeren RM besiyerinde kesikli

kültür koşullarında 20. saat sonunda yaklaşık 30-35 g/l etanol elde edilmektedir. Hücre

tutuklamalı reaktörde ise debi 1 ml/dk olduğunda oda sıcaklığında etanol üretimi 50 g/l

civarındadır.

Reaktör düşük glukoz miktarına sahip (5 g/l glukoz içeren) besiyeri ile

beslendiğinde debi arttıkça birim zamanda üretilen etanol miktarı da artmıştır (Şekil 3.18

ve Şekil 3.19) ancak debi 3ml/dk iken verimlilik (g etanol/g kullanılan glukoz) düşmüştür

(Şekil 3.20 ve Şekil 3.21). Reaktör 10 g/l ve 20 g/l glukoz içeren besiyerleri ile

beslendiğinde ise birim zamanda en fazla etanolün 2 ml/dk debide üretildiği görülmüştür

(Şekil 3.20). Verimlilik 10 g/l glukoz içeren besiyeri reaktörden düşük hızla (1 ml/dk)

geçtiğinde en yüksek değerini bulmuştur (% 73,89) (Şekil 3.21).

30

Şekil 3.18. 1,5 ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı

Şekil 3.19. 3 ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı

02468

10121416

5 10 20

Giriş Glukoz Konsantrasyonu (g/L)

Kul

lanı

lan

Glu

koz

Kon

sant

rasy

onu

(g/L

)

0

2

4

6

8

10

Üre

tilen

Eta

nol

Kon

sant

rasy

onu

(g/L

)

kullanılan glukoz üretilen etanol

05

101520253035

5 10 20 50Giriş Glukoz Konsantrasyonu (g/L)

Kul

lanı

lan

Glu

koz

Kon

sant

rasy

onu

(g/L

)

0

2

4

6

8

10

12Ü

retil

en E

tano

l K

onsa

ntra

syon

u (g

/L)

kullanılan glukoz üretilen etanol

0

0,1

0,2

Reaktörün optimum çalışma sıcaklığını tespit etmek amacıyla reaktör 25, 30 ve 37

°C’de 20 ve 7 g/L glukoz konsantrasyonlarında 1 ml/dk akış hızında çalıştırılmıştır.

Gerçekleştirilen deneyde değişik sıcaklıkların glukoz kullanım verimine (%E) kaydadeğer

bir etkisinin olmadığını göstermiştir. Etanol üretim verimi ise (%Ep) 20 g/L giriş

konsantrasyonunda sıcaklık artışıyla azalmakta, 7 g/L glukoz konsantrasyonunda ise

sıcaklık artışıyla artmaktadır (Şekil 3.22, Şekil 3.23.).

Şekil 3.21. Debinin etanol üretim verimine (gr etanol/gr glukoz) etkisi

Şekil 3.20. Debinin kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarına (g etanol/dk) etkisi

0,l/K 3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 1 2 3 4

Debi (ml/dk)

Üre

tilen

Eta

noul

lanı

lan

Glu

ko(g

/ g)

5g/L 10g/L 20g/L

31

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

1 1,5 2 3Debi ml/dk

Subs

tura

t Kul

lanı

mı (

g/dk

)

00,0020,0040,0060,0080,010,0120,014

Etan

ol Ü

retim

i (g/

dk

5g/L 10g/L20g/L 5g/L eth10g/L eth 20g/L eth

0102030405060708090

100

25 C 30 C 37 C

Sıcaklık

%E

ve %

Ep

%E %Ep

Bu çalışmada kullanılan sürekli reaktör içerisinde hücrelerin immobilize edildikleri

polyHIPE polimer materyalinin maya hücrelerinin tutuklanması için son derece verimli bir

matris olduğu saptanmıştır. Polimer matrisinin her gramı başına tutunan hücrelerin kuru

ağırlığı 2 gram olarak hesaplanmıştır. Alınan polimer örneklerinin tarayıcı elektron

mikroskobundan (SEM) alınmış görüntüleri (Şekil 3.24) maya hücrelerinin polimer

yüzeyine yoğun bir şekilde tutunmuş olduklarını göstermektedir.

32

01020304050607080

25 C 30 C 37 C

Sıcaklık

%E

ve %

Ep

%E %Ep

Şekil 3.22. 20 g/L glukoz konsantrasyonunda farklı sıcaklıklarda glukoz kullanım (%E) ve etanol üretim verimleri(%Ep)

Şekil 3.23. 7 g/L glukoz konsantrasyonunda farklı sıcaklıklarda glukoz kullanım (%E) ve etanol üretim verimleri (%Ep)

A

B

C

Şekil 3.24. Dolgu yataklı reaktörde kullanılan polimer ve tutuklanmış maya hücrelerinin SEM görüntüleri: Boş polyHIPE polimer (büyütme gücü 4000 X) (A), maya hücreleri ile kaplanmış polimer yüzeyi (büyütme gücü 2000 X) (B) ve polimer gözeneklerinde tutuklanmış maya hücreleri (büyütme gücü 5000 X) (C)

33

3.3.3. C. thermocellum kültür sıvısında biriken glukozun S. cerevisiae tarafından

kullanılması ve Etanol Üretimi (Kesikli sistem)

10 g/L selüloz içeren RM besiyerinde 14 gün boyunca 55 °C’de üretilmiş C.

thermocellum hücrelerinin selülozu parçalamaları sonucu oluşan glukoz S. cerevisiea

tarafından kullanılmış ve bazı koşullarda yüksek verimde etanol üretimi gerçekleşmiştir.

Anaerobik koşullarda septum şişelerinde üretilen 14 günlük C. thermocellum kültürleri

anaerobik kabın dışına alınarak S. cerevisiea hücreleri ile aşılanmışlar ve 30 °C’de 160 rpm

de çalkalamalı inkübatörde 3 gün boyunca inkübe edilmişlerdir. Aşağıdaki şekillerde

değişik koşullarda üretilmiş olan C. thermocellum kültürlerinde S. cerevisiea tarafından

üretilen etanol miktarları görülmektedir. Şekil 3.25. B de görüldüğü gibi maya hücreleri

en verimli etanol üretimini pH sı 7.5 ve 8 olan C. thermocellum kültüründe

gerçekleştirmişlerdir (50. saatte 3.5 g/l etanol üretimi). Yapılan deneylerde C.

thermocellum kültüründe en yüksek glukoz birikiminin (6 g/l glukoz) besiyeri pH sı 7-

8 iken gerçekleştiği görülmüştür. S. cerevisiae hücreleri pH sı 7.5 ve 8 olan kültür

sıvılarında birikmiş olan glukozu daha verimli kullanıp daha yüksek miktarlarda

etanol üretimi gerçekleştirmişlerdir. Bu kültürlerde maya hücrelerinin ortamda

birikmiş olan glukozu kullanarak gerçekleştirdikleri etanol üretim verimi %50

civarındadır ve bu değer teorik verime çok yakın bir veridir (3,5 g/l etanolün 0,5 g/l

si C. thermocellum tarafından üretilmiştir). C. thermocellum un selülozu parçalaması

sonucu oluşan şeker miktarı 6 g glukoz/10 g seluloz olarak ölçülmüştür. Bu durumda

etanol üretim verimi 3,5 g etanol/10 g selüloz olarak hesaplanmıştır (%35). Ortamda

enzim olmadan elde edilen bu sonuç oldukça yüksek bir değerdir.

34

A) B) Şekil 3.25. Farklı pH Değerlerine Sahip C. thermocellum Kültür Sıvısında S. cerevisiea’nın Üreme hızı (A) ve etanol üretimi (B)

Farklı fosfat konsantrasyonlarına (5, 50, 100, 150 mM) sahip C. thermocellum

kültüründe S. cerevisiae hücreleri en yüksek etanol üretimini 50 mM fosfat içeren kültürde

gerçekleştirmişlerdir (5. gün sonunda 3,6 g/l etanol) (Şekil 2.22). C. thermocellum

kültüründe de en yüksek miktarda glukoz (4,2 g/l) besiyeri 50 mM fosfat içerdiğinde

birikmiştir.

Şekil 3.26. Farklı Konsantrasyonlarda Fosfat İçeren C. thermocellum Kültür Sıvısında S. cerevisiea’nın Etanol Üretimi

35

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 50 100 150

Zaman (saat)

OD

600

pH=5,5 pH=6 pH=6,5

pH=7 pH=7,5 pH=8

pH=9

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 50 100 150

Zaman (saat)

Etan

ol (g

/L)

pH=5,5 pH=6 pH=6,5

pH=7 pH=7,5 pH=8

pH=9

-0,50

0,51

1,52

2,53

3,54

0 50 100 150

Zaman (saat)

Etan

ol (g

/L)

5mM 50mM 100mM 200 mM

C. thermocellum hücreleri 10 g/l selüloz içeren 500 ml besiyerinde üretildiğinde

kültürde biriken glukoz miktarı 25. gün sonunda 4.5 g/l olarak ölçülmüştür. Kültür

hacminin 10 kat yükseltilmesi selülozun kullanımını ve buna bağlı olarak glukozun birikim

hızını düşürmüştür. Şekil 3.27 4.5 g/l glukoz içeren C. thermocellum kültür sıvısında S.

cerevisiea hücrelerinin zamana bağlı olarak etanol üretimini göstermektedir. 18. saat

sonunda 1.4 g/l etanol üretilmiş ve etanol miktarı daha sonraki saatlerde artmamıştır. Bu

kültürde başlangıç pH sı 7 dir. Şekil 3.25 B de görüldüğü gibi pH sı 7,5 ve 8 olan C.

thermocellum kültüründe S. cerevisiae hücreleri etanol üretminde daha etkindirler.

0

1

2

3

4

5

0 6 18 21 24

Zaman (saat)

g G

luko

z/L

00,20,40,60,811,21,41,6

g Et

anol

/L

Glukoz Konsantrasyonu (g/L)

Etanol Konsantrasyonu (g/L)

Şekil 3.27. 4.5g/l glukoz birikimine sahip C. thermocellum kültür sıvısında S.

cerevisiea’nın etanol üretimi

3.3.4. C. thermocellum tarafından selülozun parçalanması sonucu üretilen

glukozun kesikli sistemde ve hücre tutuklamalı dolgulu yataklı sürekli

reaktörde maya hücreleri tarafından kullanılması ve etanol üretim veriminin

hesaplanması

36

Çalışmanın bu bölümünde C. thermocellum’un selülozu parçalaması sonucu kültür

ortamında biriken glukozun maya hücreleri tarafından etanol üretimi için kullanım

potansiyeli kesikli sistemde ve maya hücrelerinin tutuklanmış olduğu hücre tutuklamalı

sürekli reaktör sisteminde incelenmiştir.

10 g/L selüloz içeren RM besiyerinde C. thermocellum’un selülozu parçalaması

sonucu biriken glukoz ve üretilen etanolün zamana bağlı değişimi Şekil 3.28 ‘de

verilmiştir.

02468

10

0 5 10 14

Zaman (gün)

Biri

ken

Glu

koz

Kon

sant

rasy

onu

(g/L

).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

Biri

ken

Etan

ol

Kon

sant

rasy

onu

(g/L

).glukoz etanol

Şekil 3.28. C. thermocellum kültüründe zamana bağlı glukoz birikimi ve etanol üretimi

37

C. thermocellum 10 g/l selüloz içeren besiyerinde ortalama 7 g/l glukoz

üretmektedir. Çalışmada yaklaşık 7 g/L glukoz içeren C. thermocellum kültürü taze

besiyeri ile karıştırılmadan veya karıştırılarak S. cerevisiae için besin maddesi olarak

kullanılmıştır. Bu deneylerde besiyerlerinin pH sı kontaminasyon riskine karşı 5.5 e

ayarlanmıştır. pH 5.5 te maya hücrelerinin etanol üretimi pH 8 e kıyasla daha düşüktür.

Tablo 8’de farklı oranlarda taze besiyeri ile karıştırılmış C. thermocellum kültür sıvısında

maya hücrelerinin glukoz kullanım verimi ve etanol üretim miktarı verilmiştir (0.5 ml/dk

akış hızında). C. thermocellum kültürü taze besiyeri ile karıştırılmadan veya 1:3 oranında

karıştırılarak S. cerevisiae için besin maddesi olarak kullanılmıştır. C. thermocellum kültür

ortamı glukozun yanı sıra başka yan ürünler ve hücresel atıklar da içermektedir. Bu

nedenle kültür taze besi yeri ile % 25 (% 75 taze besiyeri+ % 25 C. thermocellum kültürü)

oranında karıştırılarak kullanıldığında kesikli sistemde glukoz kullanım verimi % 44’ten %

68’e ve etanol üretimi 1,3 g/L’den 1,44 g/L’ye çıkmıştır. 7 g/L glukoz içeren C.

thermocellum kültürü glukoz miktarı 20 g/L olacak şekilde % 75 taze besiyeri ile

karıştırıldığında glukoz kullanım verimi % 89’a ulaşmıştır. Dolgu yataklı sürekli reaktörde

glukoz kullanım veriminin kesikli sisteme kıyasla daha düşük olduğu ve glukoz kulanım

veriminin ve etanol üretiminin taze besiyeri miktarıyla oldukça ilişkili olduğu görülmüştür.

Taze RM besiyeri içermeyen C. thermocellum kültüründe maya hücrelerinin glukozu

kullanma verimleri %47 iken bu değer 7 g/L glukoz içeren taze RM besiyerinde % 67

olarak bulunmuştur. Yüksek glukoz konsantrasyonunda (20 g/L) bu oran % 78 olarak

hesaplanmıştır. Kesikli sistem çalışmalarında 20 g/L glukoz içeren besiyerinde taze

besiyeri miktarının substurat kullanım verimine olan etkisinin sürekli sistemdekine kıyasla

daha düşük olduğu saptanmıştır.

7 g/L glukoz içeren C. thermocellum kültürünün glukoz miktarı dışardan ticari

glukoz eklemesi yapılarak 20 g/L ye çıkarıldığında (13 g/L glukoz eklemesi

yapıldığında) 5,5 g/L etanol üretimi olmuştur. Bu deneyde ortama eklenen glukozun

%35 lik bir kısmı C. thermocellum un selulozu parçalaması sonucu oluşan glukozdur.

20 g/L ticari glukoz içeren kontrol besiyerinde %18 oranında daha fazla etanol üretimi

olmaktadır (7,3 g/L etanol üretimi).

Yapılan deneyler sonucunda C. thermocellum kültürünün taze besiyeri ile

karıştırıldığında S. cerevisiae tarafından daha verimli bir şekilde kullanıldığı

görülmüştür. Selülozik atıkların parçalanması sonucunda oluşan glukozun biyoetanol

üretiminde değerlendirilmesinin özellikle yüksek ölçekte üretim yapıldığında üretim

maliyetini önemli ölçüde düşüreceği söylenebilir.

Tablo 8. Farklı oranlarda taze besiyeri ile karıştırılmış C. thermocellum kültür sıvısında maya hücrelerinin glukoz kullanım verimi ve etanol üretim miktarı (sürekli reaktörün akış hızı 0.5 ml/dk dır)

Besiyeri

C. thermocellum kültürü : Taze

RM, Glukoz

Konsantrasyonu

Kesikli

Sistemde Glukoz

Kullanım Verimi

(%)

Kesikli

Sistemde Etanol Üretimi

(g/L)

Reaktördeki

Glukoz Kullanım

Verimi (%)

Reaktördeki Çıkış Etanol

Konsantrasyonu (g/L)

Reaktördeki

Etanol Üretkenliği

(g/L.gün)

1 : 0, 7 g/L 44 1,30 47 1,2 17 1 : 3, 7 g/L 68 1,44 48 2,2 31,2 0 : 1, 7 g/L (Kontrol)

81 1,45 67 2 28,4

1 : 3, 20 g/L 89 6,20 78 5,5 78 0 : 1, 20 g/L (Kontrol)

88 5,73 87 7,3 103,6

38

Reaktördeki akış hızının mayanın glukoz kullanım verimine etkisini görmek

amacıyla 7 g/L ve 20 g/L glukoz konsantrasyonlarına sahip RM besiyeri 0,5 ml/dk ve 1

m/dk akış hızlarında reaktörden geçirilmiştir. Deney sonucunda özellikle düşük glukoz

konsantrasyonlarında (7g/L) düşük akış hızının glukoz kullanım vermini düşürdüğü etanol

üretim veriminin ise % 4 oranında arttığı gözlenmiştir (Şekil 3.29). 20 g/L glukoz içeren

besiyerinde ise akış hızı verim üzerinde etkili olmamıştır.

Reaktör 1 ml/dk ve 0.5 ml/dk akış hızlarında çalıştırılmış ve 0.5 ml/dk akış hızında

karışım kültür için (C. thermocellum kültür sıvısı +RM besiyeri) etanol üretimi daha

yüksek ölçülmüştür. 0.5 ml/dk akış hızı için elde edilen sonuçlar Tablo 8 de verilmiştir. C.

thermocellum kültür sıvısının taze besiyeri ile 1:3 oranında karıştırılması sonucu elde

edilen kültür sıvısı reaktörden 1 ml/dk akış hızıyla geçirildiğinde 7 ve 20 g/l glukoz

miktarları için etanol üretimi (reaktördeki çıkış etanol konsantrasyonu (g/L)) sırasıyla 1.8

g/l ve 4.8 g/l olarak ölçülmüştür. Çok daha yüksek akış hızlarında ise glukozun hücrelerle

temas süresi azaldığı için verimli kullanılamamakta ve etanol üretimi düşmektedir.

0102030405060708090

100

7 g/L 0,5 ml/dk

7 g/L 1 ml/dk

20 g/L 0,5 ml/dk

20 g/L 1 ml/dk

Besiyeri Giriş Glukoz Konsantrasyonu ve Akış Hızı

%E ve %Ep Değerleri

%E %Ep

Şekil 3.29. Farklı konsantrasyonlarda glukoz içeren besiyerinde farklı akış hızlarında

reaktör verimi: %E: substrat giderim verimi (% dönüşüm) =100*(Cso-Cs)/Cso; %Ep:

etanol üretim verimi= 100*P/Cso: Cso=başlangıçtaki glukoz miktarı, Cs=kalan glukoz

miktarı.

39

C. thermocellum kültür sıvısının dolgu yataklı sürekli reaktörde etanol üretimi için

kullanılması sonucunda ticari glukoz içeren besiyeri ile elde edilen sonuçlara benzer

sonuçlar elde edilmiştir. Ticari selülozun C. thermocellum tarafından kullanılması

sonucunda ortamda biriken glukoz içerikli kültür 0,5 ml/dk akış hızında reaktörden

geçirildiğinde glukoz kullanım verimi %E, 1 ml/dk akış hızında elde edilen verime kıyasla

daha düşük olmasına karşın etanol üretim verimi %Ep daha yüksektir (Şekil 3.30). 0,5

ml/dk akış hızında 4.5 g/L glukozdan 1,28 g/L etanol üretimi gerçekleşirken, 1 ml/dk

akış hızında 1,1 g/L etanol üretimi olmuştur. 10 g/L buğday sapı içeren C. thermocellum

kültüründe yaklaşık 3 g/L glukoz birikimi olmuş, reaktörün bu kültürle beslenmesi

sonucunda 1 ml/dk akış hızında üretilen etanol miktarı 0,45 g/L olarak ölçülmüştür.

Selülaz enzimi kullanılmadan alkali hidrolize tabi tutulmuş lignoselülozik materyallerin C.

thermocellum hücrelerinin sellülolitik aktivitesi ile parçalanması sonucunda oluşan sıvıda

etanol üretim verimi 4,5 gr etanol/100 gr lignosellülozik materayal (buğday sapı) dir.

Şekilde gösterilen verim değerlerinin hesaplanmasında substrat olarak glukoz miktarı göz

önüne alınmıştır (Tablo 9). Bu düşük değer lignoselülozik atıklardan etanol üretilebilmesi

için ortama düşük miktarda da olsa selülaz enzimi eklenmesinin gerekliliğini ortaya

koymaktadır.

0

10

20

30

40

50

60

C 0,5 ml/dk C 1 ml/dk L 0,5 ml/dk L 1 ml/dk

Farklı Karbon Kaynaklarının Kullanımı Sonucu Elde Edilen Sıvıların Kullanımı ve Akış Hızları

%E

ve %

Ep D

eğer

leri

%E %Ep

Şekil 3.30. Farklı karbon kaynaklarının kullanımı sonucu elde edilen sıvıların farklı akış hızlarında reaktörden geçirilmesi ve verime etkisi: %E: substrat giderim verimi (% dönüşüm) =100*(Cso-Cs)/Cso; %Ep: etanol üretim verimi= 100*P/Cso: Cso=başlangıçtaki glukoz miktarı, Cs=kalan glukoz miktarı. C : 10 g/L ticari selülozdan C. thermocellum un ürettiği şeker içerikli sıvı. L : 10 g/L alkali hidrolize tabi tutulmuş buğday atıklarınından (lignoselüloz) C. thermocellum un ürettiği şeker içerikli sıvı

40

Tablo 9. Dolgu yataklı sürekli reaktörde selüloz ve lignoselüloz içeren C. thermocellum

kültür sıvıları ile etanol üretim verimliliği Etanol üretimi

(g/l) (Sürekli rekatörden çıkış)

% Verimlilik

(g etanol/g seluloz veya lignoseluloz)

Reaktörde

Üretilen Etanol (g etanol/l gün)

C.thermocellum Kültürleri

Glukoz miktarı (g/L)

Etanol miktarı (g/l)

(C.thermocellum kültüründe) 0,5

ml/dk akış hızı

1 ml/dk akış hızı

0,5 ml/dk akış hızı

1 ml/dk akış hızı

0,5 ml/dk akış hızı

1 ml/dk akış hızı

C 4,5 0,203 1,62 1,18 16,2 11,8 11,49 16,74 L 3 0,282 0,31 0,44 3,1 4,4 2,19 6,24 C : 10 g/L ticari selülozdan C. thermocellum un ürettiği şeker içerikli sıvı L : 10 g/L alkali hidrolize tabi tutulmuş buğday atıklarınından (lignoselüloz) C. thermocellum un ürettiği şeker içerikli sıvı

3.4. Selülaz enzimi kullanılarak şeker üretiminin arttırılması

Clostridium thermocellum hücrelerinin 50 g/L glukoz içeren besiyerinde 40 günlük

inkübasyonları sonucunda yaklaşık 14,3 g/L glukoz ürettikleri gözlenmiştir (Tablo 10). 10

ml hacme sahip şişelerde 50 g/L selüloz içeren besiyerinde 14 günlük inkübasyonu

sonucunda C. thermocellum tarafından degredasyon sonucu biriken glukoz yaklaşık 7 g/L

olarak ölçülmüştür. Bu besiyerleri içine konsantrasyonu 20mg/ml olacak şekilde enzim

ilave edilmiş, 55 ve 37 °C’de inkübasyona bırakılarak sıcaklığın enzim aktivitesi

üzerindeki etkileri incelenmiştir. Zamanla glukoz konsantrasyonundaki değişim Şekil

3.31’de gösterilmiştir.

Tablo 10. 50 g/L selüloz içeren besiyerinde C. thermocellum’un glukoz üretiminin

zamanla değişimi

41

Zaman Biriken Glukoz Konsantrasyonu

(g/L)

14. gün 7,05

20. gün 10,30

30. gün 10,98

40. gün 14,34

Tablo 11. Selülaz enziminin selülozdan glukoz birikimine etkisi

Glukoz miktarı % glukoz/gr seluloz

C. thermocellum kültüründe 7 g/l %14

C. thermocellum kültürüne

enzim ilavesinden sonra (20

mg/ml) 37 C de

33 g/l %66

Enzimden kaynaklanan glukoz

birikimi

33-7=26 g/l %52

0

5

10

15

20

25

30

35

0.gün 4.gün 8.gün 14.gün 22.günzaman

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/L)..

37 C kontrol 37 C enzim 55 C kontrol 55 C enzim

Şekil 3.31. Farklı sıcaklıklarda selülaz enziminin glukoz birikimine etkisinin zamanla

değişimi (0. günde enzim içeren sıvılarda glukoz konsantrasyonu yüksek bulunmuştur.

Enzim ilavesi yapıldıktan sonra numuneler alınmış ve ölçüm yapılana kadar +4 C de

bekletilmişlerdir. Bu geçen sürede enzim aktivite gösterdiği için glukoz miktarında artış

olmuştur.)

42

Enzim ilavesi ile yapılan deneylerde 37 C de 22. günde oluşan glukoz miktarı 33 g/l

olarak ölçülmüştür (33g glukoz/50 g selüloz). Aynı gün 55 C de yapılan deneyde ölçülen

glukoz miktarı ise 25 g/l dir. Şekil 3.31‘e baktığımızda enzimin ilk on gün boyunca 55 C

de daha aktif olduğu ancak daha sonra bu sıcaklıkta aktivite kaybettiği görülmüştür. Enzim

ilavesi selüloz parçalama işlemini kolaylaştırmakta ve daha yüksek miktarlarda şeker

birikimi olmaktadır. Bu deney sonucunda 20 mg/l enzim ilavesinin ticari selülozdan

glukoz üretim verimine olan katkısı %52 olarak hesaplanmıştır (Tablo 11). Kalan %

14 oranındaki glukoz üretimi C. thermocellum hücrelerinin katkısıdır (7 gr glukoz/50

gr selüloz). Deneylerimizde kullanmış olduğumuz enzimin fiyatı gram fiyatı 200 YTL

civarındadır. Bu fiyat enzim yurtdışından çok düşük miktarlarda getirildiği için oldukça

yüksek bir fiyattır. Yüksek ölçekli bir proseste enzim kullanımı artacağından enzimin

ülkemizde üretilip saflaştırılması daha doğru olacaktır. Ancak enzim kullanımı selülozdan

etanol üretim maliyetini artıran bir faktördür. Tabloya bakıldığında mikrobiyel hidroliz ile

birlikte enzim kullanımının yaklaşık %20 oranında düştüğü görülmektedir.

Lignoselülozik atıklardan daha yüksek miktarlarda glukoz elde edebilmek amacıyla

atıklar asit hidrolizine tabi tutulmuş ve bu ön işlem sonrasında 70 g/L lignoselülozdan

15 g/L glukoz üretilebileceği görülmüştür. Elde edilen sıvının glukoz

konsantrasyonunu arttırmak için 10 mg ve 25 mg selülaz enzimi ilave edilmiş ve bir

hafta inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda glukoz konsantrasyonları 10

mg selülaz ve 20 mg selülaz içeren hidroliz edilmiş lignoselüloz solusyonlarında

sırasıyla 22 ve 20 g/l değerlerine ulaşmıştır. Selülaz enziminin lignoselülozik maddeleri

parçalama kapasitesinin ticari selüloza kıyasla daha düşük olması şaşırtıcı bir sonuç

değildir. Enzimin düşük aktivite göstermesinin diğer bir nedeni ise hidroliz sonrası

ortamda biriken asit ve bazların oluşturduğu tuzların selülaz enziminin aktivitesinde düşüşe

neden olması olabilir.

3.5. Ön işlem metodlarının kıyaslanması

Asit hidrolizine tabi tutulmuş sıvılardaki glukozun maya hücreleri tarafından

kullanımını incelemek için inkübasyon sonunda şişelerin içerisine katı besiyerinden maya

hücreleri ekimi gerçekleştirilmiş ve günlük olarak örnek alımı yapılmıştır. Numunelerin

ölçümleri sonucunda maya hücrelerinin elde edilen glukozu kullanamadıkları ve etanol

üretimi gerçekleştiremedikleri görülmüştür.

Yapılan deneyler sonucunda alkali hidroliz yönteminin asit hidrolizine kıyasla daha

verimli olduğu görülmüştür. Asit hidroliz yöntemi çevreye ve reaktör tanklarına verdiği

zarar nedeniyle de tercih edilen bir yöntem değildir.

43

Mikrobiyel aktivite ile lignoselülozik materyallerin parçalanması etanol üretiminde

maliyeti düşürmesine rağmen yüksek glukoz eldesi için az miktarda da olsa enzim

44

kullanılması gerekmektedir. Yaptığımız deneyler sonucunda uygulanan ön işlem

metodunun hücre üremesi ve enzim aktivitesi için çok önemli olduğu, asit hidroliz

yönteminin sağlıklı hücre üremesi için ve enzim aktivitesi için uygun olmadığı ortaya

çıkmıştır. Yine alkali hidroliz önişleminden sonra ortama eklenen enzimin aktivite

göstermediği görülmüştür. Lignoselülozik maddelerin buhar gücü ile lif yapısının

zayıflaması sonucu enzimatik hidrolize daha yatkın hale geldikleri bilinmektedir.

Hücre üremesi veya enzim aktivitesine negatif etki etmemesi nedeniyle buhar ile

yapılan önişlem kimyasal maddeler kullanılarak gerçekleştirilen önişlem metodlarına

kıyasla daha etkin bir yöntemdir. Proje çalışması kapsamında lignosellülozik

materyalin buhar ile zayıflatılması için 130 °C otoklavlama yapılmıştır Lignoselülozik

atık olarak deneylerimizde kullandığımız buğday sapları küçük parçalara bölünüp 6 saat

130 C de buharlı ortamda otaklavlanmışlardır. Lignoselülozik materyalin otoklav öncesi,

otoklavdan üç saat ve altı saat sonraki görüntüleri Şekil 3.32’de gösterilmiştir. Bu deneyde

bugday sapları alkali hidroliz işlemine tabi tutulmadan C. thermocellum hücrelerinin

kullanımı için besiyerine eklenmişlerdir. C. thermocellum’un aktivitesi sonucu

ortamda biriken glukoz ve etanol miktarları Tablo 12’ de verilmiştir. Bu solusyon

üzerine enzim ilavesi yapılmış ve bir hafta sonra ortamda biriken glukoz ölçülmüştür.

Glukoz konsantrasyonunun 12,5 g/l değerine yükseldiği görülmüştür. Buğday

saplarının otoklavda buharla eritilmesi sonucunda Şekil 3.32’de görüldüğü gibi kabın

içinde bir miktar sıvı birikmiştir. Bu sıvının da şeker içerebileceği düşünülerek kültür

ortamını hazırlamak için RM besiyeri hazırlamak yerine bu sıvı kültür ortamı olarak

kullanılmıştır. Tablo 12’de görüldüğü gibi 14 günlük inkübasyon sanucunda C.

thermocellum hücreleri 70 g/l buğday sapından 2 g/l glukoz ve 0,8 g/l etanol

üretebilmişlerdir. Otoklavdan sonra lignoselülozik materyalin bulunduğu kap içinde

biriken sıvının besiyeri olarak kullanıldığı kültür ortamında gerçekleşen proses

sonucunda maya hücreleri 7,3 g/l etanol üretmişlerdir. Besiyeri sıvısı olarak RM

besiyerinin kullanıldığı kültürlerde ise etanol miktarı 4,1 g/l olarak ölçülmüştür. Bu

durumda otoklavlanarak yapılan buhar önişleminde lignosellülozik materyalin lif yapısı

parçalanırken bazı şekerlerin açığa çıktığı söylenebilir. Bu bütünleştirilmiş proseste etanol

üretim verimi toplam lignoselülozik madde miktarından elde edilen etanol miktarları göz

önünde bulundurularak hesaplanmıştır ve %10,4 olarak bulunmuştur (7,3 g etanol/70 g

lignoselüloz*100). Buğday sapları yaklaşık %85 oranında selüloz ve hemiselüloz

içermektedir ve bu polimerler C. thermocellum hücrelerinin enzimleri tarafından

parçalanmaktadır. Bu durumda selüloz miktarı başına etanol üretim verimi % 12.3

tür (7,3 g etanol/59 g selülozik materyal*100) C. thermocellum hücrelerinin selülozdan

etanol üretim verimine katkısı % 1.4olarak hesaplanmıştır (0,81 g etanol/59 g *100).

Teorik olarak 2 g glukozdan yaklaşık 1 g etanol üretimi gerçekleştiği kabul edilirse

mikrobiyel hidrolizin bu proseste etanol üretimine katkısı % 24,5 tir (0,808 g etanol +

1 g etanol /7,3 g etanol*100). Bu işlemde etanol üretim veriminin düşük çıkmasının

nedenlerinden biri de ortamdaki buğday sapı miktarının fazla olmasıdır. Prosesin 70 g/l

yerine 20 g/l buğday sapı içermesi durumunda etanol üretim verimi %43’e yükselecektir.

Bu bütünleştirilmiş proseste daha verimli bir buhar önişlemi ve daha yüksek miktarlarda

enzim ilavesi yapılarak etanol üretim verimi % 43 değerlerine yükseltilebilir. Bu işlemde

kullandığımız enzim miktarı 10 mg/60 g selüloz civarındadır.

Otoklavlama işleminden önce 130 C’de 3 saat otoklavdan

sonra 130 C’de 6 saat otoklavdan sonra

Şekil 3.32 Lignoselülozik materyalin (buğday sapı) otoklav öncesi ve otoklavlama

işleminden sonraki görüntüleri

45

Tablo 12. Bütünleştirilmiş proses ile (C. thermocellum + S. cerevisiae) otoklavlama

önişlemine tabi tutulmuş buğday saplarından etanol üretimi

6 saat otoklavlanmış buğday sapları (otoklav sırasında buğday saplarının bulunduğu kabın içinde biriken sıvı kültür ortamı olarak kullanılmıştır)

6 saat otoklavlanmış buğday sapları (distile su ile hazırlanmış RM besiyeri kültür ortamı olarak kullanılmıştır)

İşle

m sı

rası

Proses basamakları

Proses süresi

Glukoz (g/L)

Etanol (g/L)

Glukoz* (g/L)

Etanol (g/L)

0.saat 0,5 - 0,3 - I

C. thermocellum kültürü ile anaerobik kabin içerisinde 55 C’de inkübasyon (kontrol)

14.gün 2 0,808 1,5 0,818

7.gün 1,8 0,412 1,2 0,405 II

7 günlük C. thermocelum kültürlerine 10 mg/ml selülaz enzim ilavesi ve 37 C inkübasyon

14.gün 12,5 0,415 8 0,478

14.gün 12,5 0,415 8 0,478 III

Enzimatik hidroliz sonrası oluşan kültüre S. cerevisiae hücrelerinin ekilmesi ve 30 C’de inkübasyon

15.gün 1 7,280 2,1 4,136

3.6. Karbon Kaynağı Olarak Meyve Atıkları Kullanıldığında S.

cerevisia’nın Etanol Üretimi Meyve atıklarından etanol üretim kapasitesinin araştırılması amacıyla maya hücreleri

rendelenmiş farklı meyve atığı içeren besiyerlerine ekilmiştir. Atıklar besiyerine

konsantrasyonları 10 g/l olacak şekilde eklenmişlerdir. Oda sıcaklığında gerçekleşen

proses sonucunda maya hücrelerinin üretmiş oldukları etanol miktarları Tablo 13’ de

gösterilmiştir.

46

Tablo 13 Meyve Atıklarının Etanol Üretimine Etkisi

0.saat 3. gün Karbon Kaynağı

(10 g/L) Glukoz(g/L) Etanol(g/L) Glukoz(g/L) Etanol(g/L) Armut kabuğu 2,814 - 2,332 1,804 Elma kabuğu 3,295 - 2,271 1,648 Havuç 3,150 - 2,98 1,404 Uzum 4,187 - 2,686 3,101 Pancar 3,256 - 2,517 1,188 Glukoz (kontrol) 7,281 - 2,260 3,335

Tablodan da görüldüğü gibi en yüksek glukoz üzüm atığı içeren besiyerinde ölçülmüş

ve bu besiyerinde 3,1 g/l etanol üretimi olmuştur. Üzüm atıklarının başlangıçtaki glukoz

içerikleri oldukça yüksektir. Teorik olarak 10 g glukozdan üretilecek etanol miktarı 5 g/l

civarındadır. Yapılan çalışmalar şeker içeren meyve atıklarının maya tarafından etanol

üretmek amacıyla etkin bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Teorik etanol üretim

verimine yaklaşmak için ortama selülozu glukoz monomerlerine parçalayan selülaz enzimi

eklemek gerekmektedir. Böyle bir prosesten elde edilecek biyoetanolün birim fiyatı

piyasada satılan diğer yakıtlara kıyasla daha yüksek olabilir. Bu durumda enzim miktarının

üretilecek etanol miktarı ile kıyaslanması ve enzim miktarının buna göre belirlenmesi

gerekmektedir.

3.7. Kağıt fabrikası tortu ve likit atıklarının C. thermocellum bakterisi

tarafından parçalanması ve arıtma girişi likit atığın toksik seviyesinin

belirlenmesi

47

Çalışmanın bu bölümünde TOPRAK KAĞIT (Bilecik, Türkiye) fabrikasından

alınan kağıt atığı örneklerinin C. thermocellum hücreleri tarafından kullanımı incelenmiş,

glukoz ve etanol miktarı on beş günlük fermentasyon sonucunda tespit edilmiştir. Alınan

atık örneğinde bulunan selülozun C. thermocellum tarafından kullanımı ve etanol

üretiminin belirlenmesi amacıyla alınan örneklerdeki selüloz miktarı fenol sülfürik asit

metodu ile tespit edilmiştir. Bu yöntem ile kağıt atığı tortu kısmının selüloz içeriği 0,17

g/ml olarak hesaplanmıştır. Likit arıtma girişindeki selluloz 0,007 g/ml, arıtma çıkışı

selüloz konsantrasyonu ise 0 g/ml olarak ölçülmüştür. Kağıt atığı tortu kısmından

selüloz miktarları 5, 10, 20, 30, 50, 100, 150 g/l olacak şekilde alınarak besiyerlerine

eklenmiş, C. thermocellum hücreleri ile ekim yapılmıştır. Şekil 3.33 A’da görüldüğü gibi

en yüksek şeker birikimi (5,9 g/l) 20 g/l kağıt atığı içeren kültürde gerçekleşmiştir. Proses

sonunda kalan selüloz miktarı ise Tablo 3.11. de verilmiştir.

Atık miktarının yükseltilmesi glukoz birikimini arttırmamıştır. Etanol üretimi ise

100 ve 150 g/l kağıt atığı içeren kültürlerde yaklaşık aynı değerlerde olup diğerlerine

kıyasla daha yüksektir. Bu kültürlerde etanol konsantrasyonu 1,3 g/l’ye ulaşmıştır (Şekil

3.33 B)

Hücrelerin üremelerini desteklemek amacıyla kağıt atıkları selüloz ile 1/4, 1/2, 3/4

ve 1/1 oranında karıştırılarak karbon kaynağı miktarı toplam 10 g/l olacak şekilde

besiyerine eklenmiştir. Şekil 3.34 A’da görüldüğü gibi en yüksek parçalanma en fazla

ticari selüloz içeren besiyerinde (kağıt atığı/ticari selüloz: 1/4) gerçekleşmiştir. Bu kültürde

fermentasyon sonuncunda 6 g/l glukoz birikimi olmuştur.

0

2

4

6

8

10

5g/l

10g/l

20g/l

30g/l

50g/l

100g

/l15

0g/l

farklı konsantrasyonlarda kağıt fabrikası atıkları

gluk

oz k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

00,20,40,60,8

11,21,41,6

5g/l

10g/l

20g/l

30g/l

50g/l

100g

/l15

0g/l

farklı konsantrasyonlarda kağıt fabrikası atıkları

etan

ol k

onsa

ntra

syon

u (g

/l)

(A) (B)

48

Şekil 3.33 Farklı konsantrasyonlarda kağıt fabrikası atığı (tortu kısmı) içeren C.

thermocellum kültüründe glukoz birikimi (A), etanol üretimi (B).

02468

10

1/4 1/2 3/4 1

kağıt fabrikası atıklarının ticari selüloz ile karışım oranı

gluk

oz

kons

antra

syon

u (g

/l)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1/4 1/2 3/4 1

kağıt fabrikası atıklarının ticari selüloz ile karışım oranı

etan

ol

kons

antra

syon

u (g

/l)

(A) (B) Şekil 3.34 Değişik oranlarda kağıt fabrikası atığı (tortu kısmı) + ticari selüloz içeren C.

thermocellum kültüründe glukoz birikimi (A) ve etanol üretimi (B).

Yalnızca kağıt fabrikası atığı içeren ortamda toplam şeker konsantrasyonu 1/4

oranında kağıt fabrikası atığı içeren ortama göre %94 düşüş göstermiştir. Kağıt fabrikası

içeriğinin yükseltilmesi glukoz birikimini engellerken en yüksek etanol konsantrasyonu

3/4 atık içeren besiyerinde 0,4 g/l olarak belirlenmiştir. Yapılan deneyler sonucunda

kağıt fabrikası atıklarının tortu kısmının ticari seslüloza kıyasla bakteriler tarafından

daha yavaş kullanıldığı, % 100 tortu atık içrene ortamda bakteri üremesinin

yavaşladığı ancak bakterilerin ölmediği görülmüştür.

Şekil 3.33 A ya bakıldığında kağıt atığı konsantrasyonu 20 g/L olacak şekilde

besiyerine eklendiğinde glukoz miktarı 5,9 g/L ye ulaşmıştır. Sonuçlar bize kağıt fabrikası

atıklarının şeker üretimi için kullanılabileceğini göstermektedir. Ancak kağıt atıkları

bakteriler tarafından kullanılsa da saf selüloz kadar kolay parçalanamadıkları da gözden

kaçmamaktadır. Atık miktarının 100 g/L ye çıkartılması bakterilerin üretmiş olduğu etanol

miktarını artırmıştır. Atık miktarının 150 g/L ye çıkartılması bakterilerin üremelerini

engellememiştir. Bu ortamda bakteriler yaklaşık 4 g/L glukoz, 1.3 g/L etanol üretmişlerdir.

49

Fabrikanın likit atıkları ile yapılan çalışmalarda öncelikle arıtma giriş ve

çıkışından alınan likit örneklerdeki selüloz miktarları belirlenmiştir. Bu sıvıların

kaydadeğer seviyede selüloz içermedikleri görülmüştür. Arıtma giriş sıvısındaki selüloz

konsantrasyonu 0,007g/ml, çıkışından alınan sıvıda ise selüloz konsantrasyonu 0 g/ml

olarak bellirlenmiştir. Bu selüloz içerikleri likit kısmın etanol üretimi için gereken şekerin

üretiminde kullanılamayacağını göstermektedir. Likit atığın bakterilere olan toksik

etkisinin olup olmadığının incelenmesi ve bu sıvıların etanol üretim prosesinde

besiyeri hazırlama sıvısı olarak kullanılıp kullanılamayacağının ölçülmesi amacıyla

arıtma giriş ve çıkış likit atıklarının farklı yüzdeleri ile besiyerleri hazırlanmış ve

bakteriler ekilmiştir. Bu besiyerlerine karbon kaynağı olarak 10 g/L olacak şekilde

selüloz eklenmiştir.

Besiyerleri farklı konsantrasyonlarda arıtma giriş ve çıkış likit sıvılarını

içerdiğinden besiyerlerinin kompozisyonları Tablo 14 ile özetlenmiştir. Bu besiyerlerinde

inkübe edilen sıvılarda bakteri hücrelerinin 14 gün sonunda biriktirdikleri glukoz

konsantrasyonları Şekil 3.35’te görülmektedir. Şekilden de alaşılacağı üzere arıtma girişi

sıvılarının inkübasyonundan elde edilen glukoz konsantrasyonları arıtma çıkışı sıvılarına

göre daha yüksektir. Özellikle %100 oranında arıtma çıkışı sıvısı içeren besiyerinde (100

L) glukoz üretimi diğer besiyerlerine oranla oldukça düşüktür (3,95 g/L) . En yüksek

glukoz konsantrasyonu olan 8 g/L değerine %50 arıtma girişi sıvısı içeren besiyerinde

ulaşılmıştır (Şekil 3.35). C. thermocellum hücrelerinin biriktirdikleri glukozdan etanol

üretimi amacıyla glukoz içeren besiyerleri 100 ml lik steril flasklar içerisine aktarılmış ve

üzerlerine maya hücreleri ekilerek 37 C’de inkübe edilmiştir. Maya hücrelerinin 24 saatlik

inlübasyonları sonucunda en yüksek etanol üretim konsantrasyonuna (2,9 g/L) yine %50

oranında arıtma girişi sıvısı içeren besiyerinde ulaşılırken en düşük etanol

konsantrasyonuna (0,9 g/L) benzer şekilde %100 oranında arıtma çıkışı sıvısı içeren

besiyerinde (100 L) ulaşılmıştır. Maya hücrelerinin glukoz tüketim ve etanol üretim

verimleri Şekil 3.36’da görülmektedir.

50

Tablo 14. Besiyerlerinin sıvı kompozisyonu

Besiyeri ismi

Saf su yüzdesi

%

Arıtma giriş

sıvısı yüzdesi

%

Arıtma çıkış

sıvısı yüzdesi

%

0 KONTROL 100 - -

25 L 75 - 25

50 L 50 - 50

75 L 25 - 75

100 L - - 100

25 AG 75 25 -

50 AG 50 50 -

75 AG 25 75 -

100 AG - 100 -

0123456789

0 KONTROL25

L50 L 75 L

100 L

25 AG

50 AG

75 AG

100 A

G

Besiyeri Kompozisyonu

Biri

ken

Glu

koz

Kon

sant

rasy

onu...

(g/L

)

Biriktirilen glukoz konsantrasyonu (g/L)

51

Şekil 3.35. Farklı konsantrasyonlarda arıtma giriş ve çıkış likit atıklarının C. thermocellum

hücrelerinin glukoz birikimi üzerine etkisi.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 KONTROL25 L 50 L 75 L

100 L

25 A

G50 A

G75

AG

100 AG

Besiyeri KompozisyonuGlu

koz

Kul

lanı

m v

e Et

anol

Üre

tim....

Ver

imle

ri (%

)

glukoz kullanım verimi etanol üretim verimi

Şekil 3.36. Farklı konsantrasyonlarda arıtma giriş ve çıkış likit atıklarının maya

hücrelerinin glukoz tüketim ve etanol üretim verimleri üzerine etkisi

3.8. Farklı kağıt atıklarından etanol üretimi

3.8.1. Farklı kağıt atıklarının C. thermocellum bakterisi tarafından parçalanması

C. .thermocellum’un değişik kağıtları parçalayabilme özelliğini incelemek amacıyla

bakteri karbon kaynağı olarak kağıt içeren RM besiyerinde üretilmiştir. Şekil 3.37 değişik

kağıt içeriklerinde C. thermocellum’un toplam indirgen uçlu şeker üretimini

göstermektedir. C. thermocellum karbon kaynağı olarak değişik kağıt türlerinden 10 g/l

(whatman filtre kağıdı no:1, A4 kağıdı, koli kağıdı ve gazete kağıdı) ve 2 g/l selüloz

içeren RM besiyerinde 55oC'de üretilmiş ve oluşan şeker miktarı tespit edilmiştir.

Hücrelerin kağıdı parçalamaları zor olduğu için ilk günlerde kolay çoğalabilmelerini

sağlamak amacıyla besiyerine 2 g/l selüloz eklenmiştir. Kontrol yalnızca 2 g/l selüloz

içermektedir.

52

Şekil 3.37. Değişik kağıt içeren besiyerlerinde C. thermocellum’un toplam şeker üretimi

En yüksek şeker üretimi Whatman filtre kağıdı içeren besiyerinde görülmüş ve 5.

gün sonunda 3,5 g/l olarak tespit edilmiştir. A4 ve koli kağıdı içeren besiyerinde ise 10.

gün sonunda 2.4 g/l şeker biriktiği saptanmıştır. Filtre kağıdının yapısı A4 ve koli kağıdına

kıyasla daha az kompakttır bu özelliği ile suda daha kolay çözünebilir ve bakteriler

tarafından daha kolay parçalanabilir.

Değişik kağıt içeriğine sahip besiyerlerinde C. thermocellum’un etanol üretimi

Şekil 3.38’ de görülmektedir. En yüksek etanol üretimi A4 kağıdı içeren besiyerinde 1.5 g/l

olarak ölçülmüştür. Bu sonuçlar kağıt fabrikası atıkları içeren besiyerinde alınan sonuçlarla

kıyaslanacak olursa kağıt fabrikası atıklarının bakteriler tarafından daha düşük bir verimle

kullanıldığı ortaya çıkmaktadır. Şekil 3.39’da da görüldüğü gibi 10 g/l selüloz olacak

şekilde kağıt fabrikası atığı içeren besiyerinde yalnızca 0,3 g/L etanol üretimi

gerçekleşmiştir. Bu durum kağıt fabrikası atıklarının içinde bulunan farklı kimyasal

maddelerden kaynaklanabilir. Kağıt fabrikası tortu atığı bakterilere toksik etki göstermese

bile bakterilerin metabolik faaliyetlerini etkilemektedir.

53

Şekil 3.38. Değişik kağıtlar içeren besiyerlerinde C. thermocellum’un etanol üretimi

Selüloz içeriğine sahip kağıtların kullanımı ticari ve işlenmiş selüloza kıyasla

çok daha zordur. Daha yüksek şeker üretimi için kağıtların çok daha ince parçalara

bölünmesi, buhar ile muamele edilmesi veya kimyasal hidrolize tabi tutulması

gerekmektedir. II: rapor kapsamında yapılan deneyler de göstermiştir ki, buhar ile

muamele ve enzim kullanımı selülozik atıkların daha verimli bir şekilde etanole

dönüştürülebilmesi için kesinlikle gereklidir.

Aşağıdaki deneyde tuvalet kağıdı, saman kağıdı ve kağıt fabrikası atıklarının

bakteri tarafından kullanımı kıyaslanmıştır. Bu amaçla 100 ml anaerobik serum şişeleri

içerisinde yukarıda sıralanan karbon kaynaklarını içeren 50 ml RM besiyeri hazırlanmıştır.

Şişeler içerisinde bulunan 50 ml besiyeri üzerine 5 er ml C. thermocellum kültürü ekilmiş

ve 55 C ‘de anaerobik kabin içerisinde 14 gün boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyon

sonunda besiyerlerinde biriken metabolitlerin konsantrasyonları Şekil 3.39’ da

gösterilmiştir.

54

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

kontrol whatman A4 koli kağıdı gazete kağıdı

etan

ol m

ikta

rı g/

l

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

ticari selüloz tuvalet kağıdı saman kağıt kağıt atığı

Karbon kaynağı (10 g/L)

14 g

ün b

oyun

ca b

irike

n m

add

kons

antra

syon

ları..

(g/L

).

glukoz etanol asetik asit laktik asit

Şekil 3.39. Farklı kağıt atıkları içeren besiyerlerinde biriken glukoz ve diğer son ürünlerin

miktarları

Yukarıdaki şekilden de anlaşıldığı üzere en yüksek glukoz birikimi tuvalet kağıdı

içeren besiyerinde gerçekleşmiştir. 14 gün sonunda HPLC ile ölçülen glukoz

konsantrasyonu bu besiyerinde 4,4 g/L olarak ölçülmüştür. Ticari selüloz, tuvalet kağıdı,

saman kağıt ve kağıt atığının karbon kaynağı olarak kullanıldığı besiyerlerinde ise üretilen

glukoz konsantrasyonları sırasıyla 3, 6, 0,4 ve 0,4 g/L dir.

3.8.2. Kağıt Atıklarının parçalanmasından ortaya çıkan sıvıda maya

tarafından etanol üretimi

55

Kağıt fabrikası atıksuyu çökeltisinden elde edilen kağıt atıkları (tortu kısmı)

ve tuvalet kağıdı ufak parçalara ayrıldıktan sonra 10, 20 ve 40 g/L olacak şekilde serum

şişelerine karbon kaynağı olarak konulup standart otoklavlama işlemi gerçekleştirildi.

Otoklavdan çıkarılan şişelere steril 50 ml RM besiyeri ilave edildi ve C. thermocellum

kültürü ile 55 C’de inkübasyona bırakıldı. Besiyerleri yüksek konsantrasyonlarda karbon

kaynağı içerdiklerinden inkübasyon süresi 20 gün olarak belirlendi. 20 günlük inkübasyon

sonrasında şeker ihtiva eden sıvılara Saccharomyces cerevisiae (maya) hücreleri katı

besiyerinden alınarak ekilmiş ve 30 C’de inkübasyona bırakılmıştır. C. thermocellum

hücrelerince biriktirilen glukoz konsantrasyonlarının 20 gün sonundaki değerleri Tablo

15’de görüldüğü gibidir. Maya hücrelerinin biriken glukozu kullanarak etanol üretimini

gerçekleştirmesi sonucunda 24 saat sonunda kalan glukoz ve üretilen etanol

konsantrasyonları Şekil 3.40’da gösterilmiştir.

Tablo 15. C. thermocellum hücrelerince biriktirilen glukoz ve üretilen etanol

konsantrasyonlarının 20 gün sonundaki değerleri

10 g/L

KA

20 g/L

KA

40 g/L

KA

10 g/L

TK

20 g/L

TK

40 g/L

TK

KONTROL

10 g/L

Selüloz

Glukoz

(g/L)

1,7 3,7 7,5 5,3 6,5 4,7 6,7

Etanol

(g/L)

0,37 0,44 0,35 0,30 0,30 0,32 0,30

* KA : Kağıt atığı (tortu kısmı)

** TK : Tuvalet kağıdı

012345678

10 g/L KA 20 g/L KA 40 g/L KA 10 g/L TK 20 g/L TK 40 g/L TK KONTROL10 g/LSelüloz

Karbon kaynakları

Glu

koz

ve e

tano

l ko

nsan

trasy

onla

rı.. (g

/L)

0. sa glukoz 24. sa glukoz 0. sa etanol 24. sa etanol

Şekil 3.40 Maya hücrelerinin 24 saat sonunda ürettikleri etanol ve besiyerinde kalan

glukoz konsantrasyonları

56

Şekil 3.40’ta da görüldüğü gibi C. thermcoellum’un kağıtları kullanması sonucu

biriktirmiş olduğu glukozlar (0. saattaki glukoz miktarları) maya hücreleri tarafından

kullanılarak etanole dönüştürülmüştür. Maya hücreleri en yüksek etanol üretimini 40 g/L

Kağıt atığı ve 20 g/L tuvalet kağıdı içeren besiyerlerinde gerçekleştirmişler ve yaklaşık 3

g/L etanol üretmişlerdir.

Maya hücreleriyle gerçekleştirilen etanol üretiminin ve glukoz kullanımının

verimleri aşağıdaki tabloda özetlenmiştir. Tablo 16’ya bakıldığında 20 g/L kağıt atığı ve 40

g/L tuvalet kağıdı içeren besiyerlerinde üretilen glukozların en verimli şekilde kullanıldığı

görülmektedir. Etanol üretim verimi (%etanol/kağıt) ise 20 ve 40 g/L kağıt atığında

yaklaşık %7.5 olarak hesaplanmıştır. 20 g/L tuvalet kağıdı ise %15 oranında etanole

dönüşmüştür. Bu oranlar dışarıdan enzim eklemeksizin yalnızca bakterilerin aktiviteleri

sonucunda elde edilen oranlardır. Dışarıdan enzim ilavesi atığın biyoetanole

dönüştürülmesinde verimi artıran çok önemli bir etmendir.

Tablo 16. C. thermocellum tarafından biriktirilen glukozun mayalar tarafından kullanımı

ve etanol üretimi

Besiyeri Karbon Kaynağı ve

Konsantrasyonları

Glukoz

Kullanım

Verimi (%)

Glukozdan

Etanol Üretim

verimi (%)

Kağıttan etanol

üretim

verimi(%)

10 g/L Kağıt Atığı 96,7 17 5

20 g/L Kağıt Atığı 97,9 37 7.5

40 g/L Kağıt Atığı 93,3 30,2 7.5

10 g/L Tuvalet Kağıdı 100 35,6 5

20 g/L Tuvalet Kağıdı 92,8 44,4 15

40 g/L Tuvalet Kağıdı 92,6 58,6 7.3

KONTROL 10 g/L Selüloz 86,6 27,7 20

57

Proses sonunda ortamda biriken laktik asit ve asetik asit de endüstriyel önemi olan

yan ürünlerdir. Biriken yan ürünlerin konsantrasyonları aşağıdaki tabloda gösterilmiştir

(Tablo 17).

Tablo 17. Üretilen yan ürünler ve konsantrasyonları

Yan

ürünler

10 g/L

KA

20 g/L

KA

40 g/L

KA

10 g/L

TK

20 g/L

TK

40 g/L

TK

KONTROL

10 g/L

Selüloz

Laktik asit

(g/L)

0,381 0,248

0,770 0,386 0,650 0,416

0,757

Asetik asit

(g/L)

0,476 0,612 0,801 0,203 0,310 0,382 0,464

3.9. Selülolitik etanol üreticisi mikroorganizmaların izolasyonu ve

tanımlanması

Aşağıdaki tabloda proje kapsamında toplanan toprak veya gübre numuneleri ve

yapılan izolasyon çalışmaları sonucunda elde edilen kültürlerdeki selüloz kullanımı

gösterilmiştir. 96 numuneden 24’ünde selüloz kullanımı gözlemlenmiştir (Tablo 18).

Ancak bu karışık kültürlerin çoğu laboratuar ortamında hazırlanan besiyerinde sağlıklı

üreme gösteremedikleri ölmüşlerdir. Doğadan izole edilen bakterilerin çoğu

deneylerimizde kullandığımız RM besiyeri içeriğinden daha fazlasına (örneğin toprakta

bulunan bazı maddeler ve mineralller gibi) hatta simbiyotik bir şekilde yaşadıkları diğer

mikroorrganizmaların aktivitelerine ihtiyaç duymaktadırlar. Literatürde toprakta yaşayan

bakterilerin yalnızca %1 lik bir kısmının laboratuar ortamında kültüre alınabildiği rapor

edilmektedir (Reina ve Meier, 2002). Taze besiyerine transfer tekrarlandıkça Tablo 18’de

görülen birçok yabanıl bakterinin ortam şartlarına uyum sağlayamadığı ve üreyemedikleri

tespit edilmiştir.

58

Tablo 18. Kültürler, kaynakları ve selüloz kullanım kapasiteleri

59

Kültür no Kaynak

Selüloz kullanımı

Kültür 1 Toprak, Kara Mustafa Alışveriş Merkezi Karşısı Termal Bölge (Bursa)

+

Kültür 2 Toprak, Sapanca Göl Kenarı - Kültür 3 Kara Mustafa Termal (Bursa) - Kültür 4 Toprak, Kara Mustafa (Bursa) -

Kültür 5 Toprak, Kara Mustafa Alışveriş Merkezi Karşısı Termal Bölge (Bursa)

+

Kültür 6 Toprak, Kara Mustafa Alışveriş Merkezi Karşısı Termal Bölge (Bursa)

+

Kültür 7 Toprak, Kara Mustafa Alışveriş Merkezi Karşısı Toprak, Termal Bölge (Bursa)

-

Kültür 8 Toprak, Çekirge (Bursa) - Kültür 9 Kaynarca Hamam Artezyen (70°C) (Bursa) +

Kültür 10 Termal Çekirge Kaynak (Hüsnü Güzel Otel) Vakıfbahçe Memba (Bursa)

-

kültür 11 Toprak, Butal tesisi yanı (Bursa) - kültür 12 Toprak, Butal tesisi yanı (Bursa) - kültür 13 Toprak, Gemlik (Bursa) - kültür 14 Toprak, Gemlik (Bursa) - kültür 15 Toprak, Gemlik (Bursa) + kültür 16 Toprak, Önder Plaza Önü(1) (Yalova) - kültür 17 Yüksek Sitesi İnşaat Toprağı (Yalova) - kültür 18 Toprak, Önder Plaza Önü(2) (Yalova) - kültür 19 Toprak, Aydın Sitesi Önü (Yalova) - kültür 20 Toprak, Kaplıca (Afyon) - kültür 21 Toprak, Kaplıca Dışı (Afyon) - kültür 22 Toprak, Maşukiye - kültür 23 Toprak, örneği (Afyon) + kültür 24 Toprak, örneği (Antalya) + kültür 25 Toprak, Yuvacık (İzmit) - kültür 26 Toramanlar Koyun Gübresi (İzmit) - kültür 27 İnek Gübresi, Camili Köyü, (Adapazarı) - kültür 28 Toprak, Şile (1) (İstanbul) - kültür 29 Toprak, Şile (2) (İstanbul) + kültür 30 Toprak, Kaynarca (Adapazarı) - kültür 31 Toprak, (Adapazarı) - kültür 32 Toprak, Altınova - kültür 33 Toprak, (Yalova) - kültür 34 Toprak, Zonguldak - kültür 35 Kandıra Manda Gübresi - kültür 36 Toprak, Devrek (Zonguldak) - kültür 37 Toprak, Akyazı (Adapazarı) - kültür 38 Toprak (Karabük) - kültür 39 Koyun Gübresi Bozcaada (Çanakkale) +

60

kültür 40 Toprak, Kocaali -(Adapazarı) - kültür 41 Toprak, Karasu -(Adapazarı) - kültür 42 Toprak, Gölcük - kültür 43 Toprak, Kandıra (1) - kültür 44 Toprak, Kirazlı Yalı Palmiye - kültür 45 Kandıra İnek Gübresi - kültür 46 Toprak, Bartın - kültür 47 Toprak, Ferizli -Adapazarı - kültür 48 Toprak, Bartın - kültür 49 Toprak, Değirmendere + kültür 50 Toprak, Ereğli-Karadeniz - kültür 51 Toprak, Karamürsel - kültür 52 Toprak, Kuzuluk -Adapazarı - kültür 53 Toprak, Ulaşlı + kültür 54 Toprak, Kirazlıyalı - kültür 55 Toprak, Bozcaada -Ayazma - kültür 56 Toprak (1) (Trabzon) - kültür 57 Toprak (2) (Trabzon) - kültür 58 Toprak (Bolu-Düzce) + kültür 59 Koyun Gübresi (Ankara-Elmadağ) - kültür 60 Gübre-(Ankara) - kültür 61 Kuru Gübre, Elmadağ Yakup Abdal (Ankara) - kültür 62 Toprak, Elmadağ (Ankara) - kültür 63 Toprak (3) (Trabzon) - kültür 64 Kuru Gübre, Elmadağ (Ankara) - kültür 65 İnek Gübresi, Kandıra Bollu - kültür 66 Koyun Gübresi, Kandıra Bollu + kültür 67 Bitki kompostu I (Bolu) - kültür 68 Humus (Kavakçılık Araştırma Enstitüsü-

İzmit) -

kültür 69 Torf (Pendik-İstanbul) - kültür 70 Toprak 0-30 cm (Kavakçılık Araştırma

Enstitüsü-İzmit) -

kültür 71 Hindistan cevizi elyafı (Yalova) + kültür 72 Torf (Güzelbahçe-İzmir) + kültür 73 Bitki kompostu II (Bolu) - kültür 74 Toprak 30-60cm(Kavakçılık Araştırma

Enstitüsü-İzmit) -

kültür 75 Toprak GYTE Muallimköy Kampüsü (Gebze) - kültür 76 Toprak GYTE Muallimköy Kampüsü (Gebze) - kültür 77 Manda Gübresi (Çayırköy-İzmit) + kültür 78 Toprak (Mamak –Aankara) + kültür 79 İnek Gübresi (Yuvacık-İzmit) + kültür 80 İnek Gübresi (M.köy-Gebze) + kültür 81 Koyun Gübresi (M.köy-Gebze) - kültür 82 Toprak (Ankara) - kültür 83 Koyun Gübresi (Ç.köy-Gebze) -

kültür 84 Koyun Gübresi (Mamak–Ankara) - kültür 85 İnek Gübresi (Yakacık-Ankara) - kültür 86 Koyun Gübresi (Yakacık-Ankara) + kültür 87 İnek Gübresi (Ağrı) - kültür 88 İnek Gübresi (Ardahan) + kültür 89 İnek Gübresi (Tokat) + kültür 90 İnek Gübresi (Niksar-Tokat) + kültür 91 İnek Gübresi (Sivas) - kültür 92 İnek Gübresi (Kars) + kültür 93 İnek Gübresi (Muş) - kültür 94 İnek Gübresi (Eezurum) - kültür 95 İnek Gübresi (Giresun) - kültür 96 İnek Gübresi (Afyon) -

Selüloz kullanımı görülen ve yaşayan bakteri kültürlerinden 10 g/l selüloz içeren 5

ml RM besiyerine 1 ml ekim yapılarak 20 gün boyunca 55 °C de üretilmişlerdir.

Kültürlerin selüloz kullanım oranı, üretilen etanol ve diğer yan ürünlerin miktarları ayrıca

ortamda biriken toplam şeker ve glukoz miktarları Tablo 19’de verilmiştir. Elde edilen

bakteri kültürlerinden bazıları etanol üretimi ve selüloz kullanımı açısından C.

thermocellum 27405 suşundan daha aktif görünmektedir. Proje kapsamında özellikle

selülaz aktivitesi ve alkol üretim kapasitesi yüksek olan izolatlar üzerinde durulmuş, düşük

aktivite gösteren, hiç aktivite göstermeyen veya zamanla transfer edildikçe üreme

kabiliyetini kaybeden izolatların hücresel özellikleri incelenmemiştir.

Proje kapsamında yapılan çalışmalar kağıt veya bitki kalıntılarının etanole

dönüştürülmesinde selülolitik etanol üreticisi mikroorganizmaların kullanılabileceğini

göstermektedir. Doğadan bakteri izolasyou yapılmasının temel amacı yüksek selulaz enzim

aktivitesine ve yüksek etanol üretim kapasitesine sahip mikroorganizmaların bulunmasıdır.

Çünkü bu tip mikroorganizmalar selülozik maddelerin biyoetanol üretiminde

değerlendirilmesine yönelik endüstriyel proseslerde kullanılabilme potansiyeline

sahiptirler. Bu nedenle bizim proje kapsamındaki tanımlama çalışmalarımız genel

karakterizasyon seviyesindedir. Amacımız endüstriyel kullanımı olabilecek izolatların

temel özelliklerinin belirlenmesidir. Cins ve tür isimlerinin belirlendiği identifikasyon yani

kimlik belirleme işlemi ise çok daha kapsamlı ve detaylı karakterizasyon ve tanımlama

çalışmalarını içermektedir (biyokimyasal testler ve gen seviyesinde karakterizasyon gibi).

Elimizdeki bakterileri tanımlamak için kullandığımız yöntemler ve elde edilen sonuçlar

aşağıda verilmiştir.

61

Tablo 19. Selüloz parçalayabilen kültürlerde glukoz birikimi ve fermentasyon son ürünleri

Glukoz (g/L)

Etanol (g/L)

Laktik Asit(g/L)

Selobioz (g/L)

Asetik asit(g/L)

Toplam Şeker (g/L)*10

Kalan Selüloz (g/L)

kültür 1 4,5 2,64 0,11 0,43 - 7,8 1,1 kültür 15 2,5 2,87 0,07 - 1,69 1,3 0,2 kültür 23 2,3 2,02 1,19 0,06 0,44 2,8 0,3 kültür 24 0,1 2,03 0,21 - 1,60 5,2 0,2 kültür 29 4,3 2,09 0,1 0,01 0,94 7,2 1,7 kültür 39 3,6 1,95 0,21 0,20 0,99 8,3 1,1 kültür 49 2,5 1,74 0,08 - 1,77 6,6 0,2 kültür 71 2,4 1,85 0,37 - 1,14 9,2 0,2 kültür 53 3,1 2,26 0,07 0,05 1,17 7,9 1,1 kültür 58 2,2 3,07 0,21 - 1,10 7,7 0,21 kültür 6 2,2 1,94 - 0,01 1,57 12,9 0,18 kültür 66 2,1 1,78 0,66 - 1,85 12,6 0,21 kültür 9 2,7 0,34 - 0,99 0,87 8,7 0,9 C.t. 6 2,65 - 0,28 0,12 6,9 2,1

İzole edilen bakterilerin tanımlanması amacıyla kullandıkları substrat ve

ürettikleri ürünler HPLC cihazı kullanılarak ölçülmüştür. Tablo 19 da görülen

termofilik izolatların ürettikleri son ürünlere bakıldığında endüstriyel bir suş olan C.

thermocellum 27405 ile benzer oldukları görülmektedir. Test edilen on üç kültür selüloz

kullanımı açısından C. thermocellum’dan daha aktif görülmektedirler (Tablo 19). Etanol

üretim kapasitesi C. thermocellum’dan daha yüksek olan kültürler ise 58 ve 15 numaralı

kültürlerdir. Bu bakteri kültürlerinden Yalova’dan alınmış olan Hindistan cevizi

elyafından ön zenginleştirme yapılmış olan 71 numaralı bakteri kültürü ve Bursa

Kara Mustafa Alışveriş Merkezi Karşısı Termal Bölgeden alınan toprak örneğinden

ön zenginleştirme yapılmış olan 6 numaralı bakteri kültüründe selüloz kullanımı

sonucu biriken şeker miktarı oldukça yüksek bulunmuştur.

62

İzolasyonu yapılan bir suşun birçok özelliği geniş bir bakteri grubunun özellikleri

ile çakışıyorsa farklı tanımlama yöntemleri kullanılarak eleme yapılması ve bakterinin ait

olduğu doğru türün belirlenmesi gerekir. Farklı yöntem ve gereçler gerketiren ve pahalı bir

tanımlama yöntemi olan genetik tanımlama teknikleri DNA dizi analizi ve DNA’nın belirli

enzimlerle kesilmesi sonucu ortaya çıkan bantların kıyaslanması gibi yöntemleri

içermektedir. Proje çerçevesinde sahip olduğumuz laboratuar imkanları da dikkate alınarak

elde ettiğimiz bakteriler metabolik özelliklerine (ürettikleri ürünler, sahip oldukları

enzimler, aerobik veya anaerobik olmaları, üreme sıcaklıkları), hücresel yapılarına

(mikroskop altında gözlemlenen hücrelerin büyüklükleri, şekilleri ve hareketlilikleri),

sporlanma özelliklerine bakılarak tanımlanmışlardır. Tablo 19’a bakıldığında bu türlerin

çoğunluğu (23 numaralı kültür hariç) düşük miktarda laktik asit üretirken asetik asit

üretimleri oldukça yüksektir. Bu özellik C. thermocellum bakterisinin temel metabolik

özelliklerinden biridir. C. thermocellum’un diğer özellikleri ise sporlanması ve kısa

çubuksu yapıda hücrelerinin olmasıdır. Ayrıca selüloz parçacıkları üzerine yapışan

hücreler parçalanma sırasında sarı bir madde oluştururlar. Yapılan mikroskobik

incelemeler sonucunda 51 ve 6 numaralı izolatların çubuksu hücre yapısına sahip

sporlanan bakteriler olduğu görülmüştür. Bunun yanı sıra laktikasit/asetik asit oranları çok

düşüktür ve hücreler selüloz parçacıklarına yapışarak sarı madde üretmektedirler.

Literatürde 55-60 °C’de üreyebilen, anaerobik, selülolitik etanol üreticisi türler arasında C.

thermocellum, Thermoanaerobacterium brooki, Clostridium thermohydrosulfiricum ve

Moorella thermoacetica türleri sayılmaktadır. T. brooki bakterisi metabolizması yüksek

laktik asit/asetik asit oranı ile dikkat çekmektedir (Lamed ve Zeikus, 1980). M.

thermoasetica ise selüloz yüzeyine yapışmadan, enzimlerini kültür sıvısına salgılamak

suretiyle selülozu parçalamaktadırlar. Bu özellikleri dikkate alındığında elimizdeki 71 ve 6

nolu bakterilerin C. thermocellum türü bakterilere benzer özellikler gösterdikleri

söylenebilir. 23 numaralı izolat metabolik özellikleri ile daha çok T. brooki’ye

benzemektedir (yüksek laktik asit üretimi). 58 ve 15 nolu kültürler ise sporlanma özelliğine

sahip olmadıkları için Clostridium cinsi bakteriler değildirler. Sporlanamayan bakteriler

endüstriyel kullanıma uygun değildirler çünkü uzun süre kültürde bekledikleri zaman spor

oluşaturamayan hücreler ölürler ve sürekli -20 C’de saklanan gliserol stoğundan

bakterilerin alınarak tekrar ekim yapması gerekir. Bu da endüstriyel bir proses için bir

dezavantajdır. Tablo 19 da verilen diğer izolatlar besiyerinde bulunan sülfatı kullanarak

demirsulfit oluşturmuşlardır (besiyerinde siyah çökelek oluşumu). C.

thermohydrosulfiricum optimum üreme sıcaklığı 68 C olan, ancak 40 C’ye kadar üreme

gösterebilen, sülfürü kullanabilen anaerobik termofilik bir etanol üreticisidir. (Wiegel ve

ark. 1979). Sülfür metabolizmasına sahip izolatların C. thermohydrosulfiricum olma

olasılığı vardır. C. thermocellum kültüründe demir, sulfürle birleşerek çökmez ve siyah

presipitasyon gözlemlenmez.

63

3.10. C. thermocellum 27405 kültür sıvısındaki ekstrasellülar selulaz

enzim aktivitesinin belirlenmesi

C. thermocellum kültür sıvısındaki ekstraselülar enzim aktivitesi 55 °C ve 37 °C ’lerde

öncelikle aerobik koşullarda test edilmiştir. Bu deneyin gerçekleştirilmesi amacıyla

üretilen C. thermocellum kültüründen 10 ml alınmış içine 10 g/l seluloz eklenmiş, ekleme

anında numune alınarak glukoz konsantrasyonu HPLC ile ölçülmüştür. Daha sonra bu sıvı

aerobik şartlarda 55 ve 37 C lerde inkübasyona bırakılmıştır. 15 günlük inkübasyon

süresince 4. 7. ve 14. günlerin sonunda numune alınarak HPLC de şeker analizi

yapılmıştır. Bu deney başlatılırken C. thermocellum aerobik şartlarda üreyemediği için

hücre kültürünün filtreden geçirilmesine gerek duyulmamıştır. Ancak aerobik inkübasyon

sonucunda kontaminasyon meydana gelmiş ve bu sıvıda C. thermocellum dışında farklı

aerobik mikroorganizmalar üremiştir. Bu nedenle deney tekrar edilmiş, kontaminasyonu

önlemek amacıyla C. thermocellum kültürü 0.2 μm por çapında filtrelerden süzülmüş ve

antibiyotik ilavesi yapılmıştır. 10 g/l selüloz ilavesinden sonra 37 °C ve 55 °C’lerde

aerobik ve anaerobik şartlarda inkübasyona bırakılmıştır. Ancak aerobik şartlardaki

kültürden ölçüm için sürekli numune alınması yine kontaminasyona neden olmuştur.

Aşağıdaki tabloda inkübasyonun 4. gününde ölçülen glukoz, selobioz ve toplam şeker

miktarları verilmiştir. İlk ölçüm numunesi 4. gün alınmış olduğu için kontaminasyon 4.

günden sonra meydana gelmiştir.

Tablo 20. 55 C ve 37 C’de aerobik koşullarda ekstraselular enzim aktivitesi

(0. saat) (her iki sıcaklık için aynıdır)

55 C (4. gün) 37 C (4. gün)

glukoz 2 2.1 2.2

Selobioz

(g/L)

0.4 0.5 0.3

Toplam

şeker (g/L)

2.5 3.4 3.5

64

Anaerobik koşullarda ise deney 55 C ve 37 C’de 10 g/l selüloz ilave edilerek yapılmıştır.

Elde edilen sonuçlar bu sıcaklıklarda kültür sıvısında (hücrelerden arındırılmış kültür

sıvısı) selülaz enzim sisteminin endobetaglukonaz (EBG) enziminin çalıştığını destekler

niteliktedir; yani glukoz ve selobioz miktarında bir artış olmazken toplam şeker miktarı

artmıştır. Bu sonucun alınmasının en önemli nedenlerinden biri C. thermocellum

hücrelerinin selulaz enzim sistemlerinin çoğunluğunun hücre yüzeyine yapışık olması

olabilir. Kültür hücrelerden arındırıldığında sıvı kısımda kalan ekstraselülar selülaz

enzimlerinin miktarı selülozun parçalanması için yeterli olmayabilir. Bunun yanı sıra

genellikle hücre yüzeyinden ayrılıp sıvıya karışan enzimler yaşlı hücrelerin enzimleridir.

Bilindiği gibi enzimler biyolojik yapılardır ve kullanım ömürleri kısıtlıdır. Yapılan

deneyler sonucunda glukoz ve selobioz miktarında değişim gözlenmemesi nedeniyle

şekilde gösterilmiş olan sellobiohidrolaz (CBH) ve beta glukosidaz (bu enzimler selülaz

enzim sisteminin üyeleridir) enzimlerinin C. thermocellum hücrelerinin yüzeyinde iken

daha aktif olduğu ve kültür sıvısına bırakılmış olan enzimlerinin aktivite göstermediği

düşünülmüştür. Ancak toplam şeker miktarındaki artış (toplam şekerler 3 ve daha fazla

glukoz monomerinden oluşan diğer şekerleri de içermektedir) uzun selüloz zincirlerini

rastgele parçalayan endobetaglukonaz (EBG) enzimlerinin kültür sıvısına bırakıldıklarında

da aktivite gösterdiğine işaret etmektedir.

65

Hem selüloz hem de kağıt parçaları ile 37 °C de ve anerobik koşullarda

gerçekleştirdiğimiz deneyde de benzer bulgular elde edilmiştir. Bu deneyde 5 gün 55 °C

de anaerobik kabin içinde üretilen C. thermocellum kültüründen belli miktarlarda alınarak

anaerobik koşullarda ve 37 °C selüloz parçalanması ve şeker birikimi bir hafta süreyle

incelenmiştir. Selobioz, glukoz ve toplam şeker miktarlarına yalnızca kültür sıvısı, kültür

sıvısı + 10 g/l selüloz ve kültür sıvısı + 10 g/l kağıt içeren üç farklı koşulda bakılmıştır. 37

°C de olabilecek herhangi bir bakteriyel kontaminasyonu engellemek amacıyla kültür

sıvısına 100 μg/ml olacak şekilde amfisilin eklenmiştir. Şekil 3.42 de de görüldüğü gibi üç

farklı koşulda da glukoz ve selobioz miktarlarında kaydadeğer bir artış gözlenmemiştir.

Ancak toplam şeker miktarları 2,4 g/l iken yedinci gün sonunda 3 g/l nin üzerine çıkmıştır.

Toplam şeker miktarındaki artış bize ortamda bulunan selülozik maddenin kültür

sıvısında bulunan selülaz enzim aktivitesi ile daha küçük şekerlere parçalandığını

göstermektedir. 37 °C de hücre üremesi olmadığı için şeker miktarındaki bu artış

ortamda önceden üretilmiş olan enzimlerin aktivitesinden kaynaklanmaktadır.

Ancak glukoz ve selobioz miktarlarının değişmemesi yukarıda da açıklanmış olduğu

gibi C. thermocellum selülaz enzim sisteminin yalnızca bazı üyelerinin 37 °C de aktif

olduğunu göstermektedir. Selulolitik bakterilerde selülozun parçalanmasında görev alan

enzimler Şekil 3.41 de gösterilmiştir. Ortamda bulunan selülolitik maddeler endo beta 1,4

glukanaz (EBG) enzim aktivitesi ile parçalanmıştır. Glukoz miktarında ve selobioz

miktarında bir artış gözlemlenmemesi kültür sıvısında bulunan selobiohidrolaz ve

beta glukosidaz enzimlerinin 37 °C de uzun süre aktif olmadığı fikrini

doğurmaktadır.

Şekil 3.41. C. thermocellum selülaz enzim sistemi

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

selob glu

toplam

şeke

rse

lob glu

toplam

şeke

rse

lob glu

toplam

şeke

r

0. gün 5. gün7. gün

Kültür sıvısı Kültür sıvısı Kültür sıvısı + + 10 g/l selüloz 10 g/l kağıt Şekil 3.42 37 °C de C. thermocellum kültür sıvısındaki selulolitik aktivite

66

4. TARTIŞMA/SONUÇ

Dünya çapında yılda yaklaşık 1,3×1010 milyon ton bitki atığı üretilmektedir

(Demain ve ark., 2005). Bu bitki kalıntılarının ve diğer selülozik atıkların hidrolizi ve

biyoetanol gibi endüstriyel ürünlere dönüştürülmesi büyük bir ekonomik potansiyele

sahiptir. Ayrıca, lignoselülozik atıkların biyoetanol üretiminde kullanımı fosil yakıtlara

olan bağımlılığı azaltacak olması nedeniyle çevrenin korunmasında da pozitif etki

yaratacaktır.

Bugün biyoetanol büyük çapta şeker pancarı veya nişasta açısından zengin

materyallerden üretilmektedir. Eğer tarımsal yan ürünler ham madde olarak kullanılabilirse

hem biyoetanol üretimi için ham madde miktarı artacak hem de maliyeti düşürecektir.

Ancak biyoetanolün lignoselülozik ham maddelerden üretimi şeker ve nişastadan üretimine

kıyasla çok daha zordur. Lignoselülozun monomerik şekerlere dönüştürülmesi birkaç

proses içermektedir. Lignoselülozik materyal buharla muamele edildikten sonra enzimatik

hidroliz ile ortamda bulunan selüloz molekülleri monomer şekerlere parçalanır (Ohgren ve

ark., 2006) ve bu şekerler daha sonra etanol üretimi için kullanılır. Enzimatik hidroliz

dışarıdan selülaz enzimi eklenerek veya selülolitik bir mikroorganizma kullanılarak

gerçekleştirilebilir (Haan ve ark., 2006).

Maya hücrelerinin şeker pancarı ve mısır ve buğday nişastasından etanol üretim

kapasitesi çok yüksektir. Bol miktarda üretilen buğday ve mısır gibi bitkilerin sap ve koçan

kısımlarının değerlendirilmesi etanol üretim sektörüne ekonomik olarak büyük katkı

sağlayacak olması nedeniyle tüm dünya ülkeleri tarafından önem verilen bir konu haline

gelmiştir. Öyle ki artık biyodizel veya biyoetanol üretimi için özel bitki yetiştirilmesi

amacıyla boş arazilerin değerlendirilmeye alınması sözkonusudur.

67

Bu proje kapsamında termofilik anaerobik selüloz parçalayabilen ve etanol üretim

kapasitesine sahip bir bakteri olan C. thermocellum’un selülozdan ve selüloz içeren bazı

atıklardan (kağıt sanayinden artan kağıt elyafı (tortusu), buğday, mısır ve diğer bitkilerin

sap kısımları gibi) glukoz üretebilme kapasitesi incelenmiştir. Dünya çapında atıklardan

biyoetanol üretimi yapan tesislerde lignoselüloz içeren atıkların şekere dönüştürülmesi için

selülaz enzimi kullanılmaktadır. Selülaz enzimi üretim maliyeti yüksek bir enzimdir.

Mikrobiyel degredasyonda selüloz bakterilerin kültür içinde üretmiş oldukları enzimler ile

parçalanırlar. Mikrobiyel degredasyon enzim aşamasından önce veya sonra enzim

maliyetini düşürmek amacıyla ara basamak amacıyla kullanılabilir. Proje kapsamında

yapmış olduğumuz çalışmalar sonucunda mikrobiyel degredasyonun enzim kullanımı ve

etanol üretimine olan katkıları tespit edilmiştir.

Etanol üretim maliyetinin geniş bir kısmını selülaz enziminin üretim maliyeti

oluşturur. Bu yüzden selülaz enzimini daha ucuz üretmenin yolları araştırılmaktadır

[Szijarto ve ark., 2004]. Saddler ve Mes-Hartree’nin 1984 yılında aspenağacının buhar

gücü ile küçük parçalara ayrılmasından sonra Trichoderma ve Clostridium thermocellum

tarafından selülaz enzimi üretmek için substrat olarak kullanılabilme kapasitelerini

ölçmüşlerdir. Bu suşların aspenağacını kullanabildiklerini ve selülaz enzimi ürettiklerini

tespit etmişlerdir. En yüksek selülaz aktivitesini % 1 konsantrasyonda substrat

eklediklerinde gözlemlemişlerdir yüksek substrat konsantrasyonunun (% 10-20) selülaz

aktivitesini engellediğini rapor etmişlerdir. T harzianum kültürüne dışarıdan % 0.1 g/l

olacak şekilde glukoz eklenmesi ise selülaz aktivitesini engellemiştir. Yüksek glukoz

konsantrasyonunun selülaz aktivitesini engellediği diğer çalışmalarla da gösterilmiştir (Sun

ve Cheng, 2002).

Lignoselülotik atıklardan yüksek miktarda şeker elde edilebilmesi için pretreatment

(önişlem) aşamalarının da kullanılması gerekmektedir. Özellikle bitki saplarının

yumuşatılmasını ve selüloz fiberlerinin birbirinden ayrılmalarını sağlayan yüksek basınçta

buhar ile muamele en çok kullanılan önişlem yöntemidir. Bir diğer yöntem ise asit baz

hidrolizidir. Bu aşamalardan sonra elde edilen lignoselülolitik atıklar selülaz enzimi ile

şekere dönüştürülmektedirler. Dünyanın farklı bölgelerinde bulunan atıklardan biyoetanol

üretim tesislerinde en çok kullanılan önişlem basamağı buhar ile muameledir. Asit

kullanımı çevreye verdiği zarardan dolayı tercih edilmemektedir. Bu proje kapsamında

laboratuarımızda yüksek sıcaklıkta buhar elde edebileceğimiz bir reaktörümüzün olmaması

nedeniyle önişlem basamağı olarak otoklavlama ile birlikte asit veya baz hidrolizi

yöntemleri kullanılmıştır.

68

Proje kapsamında mikrobiyel degredasyon için termofilik-anaerobik, selülolitik

etanol üreticisi bir bakteri olan C. thermocellum ATCC 27405 suşu seçilmiştir. C.

thermocellum’un etanol üretim kapasitesi çok yüksek değildir. 10 g/l selüloz içeren

besiyerinde etanol üretimi çoğu zaman 1 g/l’yi geçememektedir. Literatürdeki diğer

çalışmalarda farklı C. thermocellum suşlarının ürettiği etanol miktarlarının yaklaşık 0,5-1

g/l civarında olduğu rapor edilmiştir [Lamed ve Zeikus, 1980; Rani ve ark., 1997]. Ancak

Rani ve arkadaşları (1997) izole etmiş olduğu C. thermocellum suşlarının 2,8 g/l etanol

ürettiklerini rapor etmiştir. Selüloz ve selüloz içeren atıkların C. thermocellum kullanılarak

etanole dönüştürülmesi verimliliği düşük bir işlemdir. Bu nedenle selülozik atıkların C.

thermocellum ve selülozik enzimler kullanılarak parçalanması ve ortamda biriken

glukozun daha etkin bir etanol üreticisi mikroorganizma tarafından etanole dönüştürülmesi

lignoselülozik atıklardan biyoetanol üretim işlemini daha verimli hale getirecektir.

Selülozun parçalanması sonucu ortamda biriken glukoz etanol üretim kapasitesi

daha yüksek bir mikroorganizma tarafından substrat olarak kullanılabilir. Ticari bir selülaz

enzimi kullanılmaksızın gerçekleştirdiğimiz deneyler sonucunda ortamda biriken glukozun

sürekli birikimi sağlanmıştır. Dışarıdan selülaz enzimi eklenerek veya selülozik maddelere

ön işlem uygulanarak daha yüksek miktarlarda selüloz veya selülozik maddenin

parçalanması ve daha yüksek glukoz eldesi sağlamak mümkündür. Elde edilen glukoz

içeriği yüksek kültürün biyoetanol üretim prosesinde kullanılması besiyeri maliyetini

önemli ölçüde düşürecektir.

Stevenson ve Weimer (2005) düşük üreme hızlarında C. thermocellum 27405

kültüründe fermentasyonun homoasetojenik olduğunu ve etanol üretimin düşük olduğunu

vurgulamışlardır. Bizim deneylerimide C. thermocellum 27405 hücrelerinin üreme hızının

yüksek miktarlarda glukoz birikimi için elverişli olduğu ancak yüksek miktarlarda etanol

üretimi için düşük bir hız olduğu söylenebilir.

Bu proje kapsamında tarımsal atıkların değerlendirilmesi amacıyla lignoselülozik

içerikli atıkların mikrobiyel olarak (C. thermocellum ile) parçalanma potansiyelleri

incelenmiştir. Atıkların parçalanması sonucu biriken glukoz miktarları ve etanol üretimleri

tespit edilmiştir. Bu amaçla arpa sapı, buğday sapı, sazlık otu, mısır kabuğu, palmiye ağacı

lifi ve barbunya kabuğu kullanılmıştır. Bu kaynakların içeriğinde enzimatik hidrolizi

engelleyen lignin bulunması nedeniyle fiziksel ve kimyasal ön işlemlerden geçirilerek

besiyerine eklenmiştir.

69

Alkali hidrolizi yapılan bitki artıklarının birçoğunun C. thermocellum tarafından

daha kolay kullanıldığı ve bu kültürlerde etanol üretiminin kontrole kıyasla daha yüksek

olduğu tespit edilmiştir. Arpa sapı içeren besiyerinde alkali hidrolizinden geçirilen

numunelerde glukoz birikiminin kontrole oranla %14 arttığı gözlenmiştir. Buğday sapı ve

sazlık otu içeren besiyerinde de alkali hidrolizin etkili olduğu kontrole kıyasla glukoz

birikimini %10 ve 15 oranında arttırdığı görülmüştür. Alkali hidrolizinin yanı sıra tarımsal

atıkların hidrolizini kolaylaştırmak amacıyla kullanılan ön işlemler tezin kuramsal temeller

bölümünde listelenmiştir. Tarımsal atıkların daha etkin bir şekilde parçalanabilmesi için

diğer ön işlemlerin de test edilmesi ve en uygun işlemin tespit edilmesi gerekmektedir. Bu

tez çalışmasındaki bulgular daha sonra yapılacak olan detaylı ön işlem uygulamalarına ışık

tutacaktır.

Saccharomyces cerevisiae içecek ve biyoyakıt üretmek amacıyla şekerleri etanole

dönüştürmek için kesikli sistemlerde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Etanol üretim

prosesinin önemi bilinmesine rağmen glikoliz ve etanol üretimini limitleyen fizyolojik

baskılar tam olarak anlaşılamamıştır (Casey ve Ingledev, 1984; Ingram ve Buttke, 1984;

Moulin ve ark., 1984). Bu baskıların belirlenmesi proses koşullarının ve kullanılan

organizmaların geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için önemli birer adımdır. Bu gelişmeler

varolan fermentasyon ünitelerindeki etanol üretim kapasitelerinin artmasını ve gelecekteki

proseslerin maliyetinin azaltılmasını sağlayabilir (Dombek ve Ingram, 1987). S. cerevisiae

optimum koşullar sağlandığında çok hızlı glikoliz ve etanol üretim hızına ulaşabilir ve 50

mmol etanol/saat/gram hücre proteini üretebilir (Dombek and Ingram, 1986).

Besiyeri bileşen konsantrasyonlarının ve fiziksel koşulların S. cerevisiae ATCC

26602 suşunun kesikli sistemde etanol üretimi üzerindeki etkileri incelenmiştir. Test edilen

dört farklı besiyeri arasından hazırlanış maliyetinin düşük olması ve yüksek etanol

üretiminin elde edilmesi nedeniyle RM besiyeri seçilmiş ve optimizasyon deneyleri bu

besiyeri kullanılarak yapılmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda besiyeri bileşenlerinden

fosfat konsantrasyonundaki değişimin etanol üretimi üzerinde çarpıcı bir etkisinin olmadığı

gözlenmiştir. Besiyerinde nitrojen kaynaklarından biri olan maya özütü varlığının

hücrelerin çoğalması ve etanol üretimi en önemli faktörlerden olduğu görülmüştür.

Nitrojen kaynağının etanol üretimi için önemi farklı çalışmalarda da rapor

edilmiştir (Chandel ve ark, 2007; Bai, 2007). Literatürdeki bilgiler [Dombek ve Ingram,

1986] magnezyum elementinin fermentasyon prosesi için önemli olduğunu göstermesine

rağmen bu tez çalışmasında besiyerinde MgCl2.6H2O varlığının S. cerevisiae hücrelerinin

etanol üretimini artırmadığı görülmüştür.

Deney sonuçları çalkalamanın ve sıcaklığın etanol üretimi üzerinde etkili olduğunu

göstermiştir. Çalkalamasız koşullarda hücrelerin birbirine yapışmalarının etanol üretimi

açısından elverişsiz bir ortam yarattığı sonucuna varılabilir. En yüksek etanol üretimi 30 ve

37 oC’de gerçekleşmiş, oda sıcaklığında etanol üretiminin 37 oC’deki üretime kıyasla %7

oranında azaldığı görülmüştür.

70

C. thermocellum kültür ortamınmda bulunan selülaz enzimlerinin 37 °C ve 55 °C

derecelerde aktivitesi incelenemiştir ancak kültür sıvısındaki enzimlerin selülozu

parçalama işleminde çok aktif olmadıkları görülmüştür. Ortamda bulunan selülozdan

oluşan glukoz ve selobioz miktarlarında kaydadeğer bir artış gözlenmemiştir. Yalnızca

toplam şeker miktarları 2,4 g/l iken yedinci gün sonunda 3 g/l nin üzerine çıkmıştır.

Toplam şeker miktarındaki artış bize ortamda bulunan selülozik maddenin kültür sıvısında

bulunan selülaz enzim aktivitesi ile daha küçük şekerlere parçalandığını ancak glukozun

oluşmasından sorumlu olan selobiohidrolaz ve beta glukosidaz enzimlerinin aktivite

göstermediğini göstermektedir. 37 °C de hücre üremesi olmadığı için şeker miktarındaki

bu artış ortamda önceden üretilmiş olan enzimlerin aktivitesinden kaynaklanmaktadır.

Selüloz parçalama işleminden sonra oluşan C. thermocellum kültür sıvısı selülozik

atıkların ön işlemi için kullanıldığı taktirde toplam şeker miktarında 0,6 g toplam şeker/10

g selüloz olacak şekilde bir artış sağlayabilir. Bu duırumda yüksek ölçekli üretimde C.

thermocellum kültür sıvısın atıkların bekletileceği bir ortam olarak kullanılabilir. Bekleme

esnasında ortamdaki düşük olan selülolitik aktivite ile selülozik yapının az da olsa

çözünmesine katkı sağlanabilir. Zaten yüksek ölçekte biyoetanol üretimi yapan tesislerde

proses sonunda artan su tekrar kullanılmaktadır.

Proje kapsamında maya ile etanol üretiminde sürekli sistem olarak dolgu yataklı

reaktör kullanılmış maya hücreleri hidrofobik bir yapıya sahip olan polyHIPE polimere

tutuklanmışlardır. Farklı substurat konsantrasyonlarının ve farklı akış hızlarının polyHIPE

polimer materyaline tutuklanmış maya hücrelerinin substurat kullanım ve etanol üretim

verimlerine olan etkisi incelenmiştir. Çekilen SEM görüntüleri polimer yüzeyinde çok

yoğun miktarda maya hücresi bulunduğunu, maya hücrelerinin polimer yüzeyine başarılı

bir şeklide tutunduklarını göstermiştir.

Reaktörün en yüksek verimliliğe 50 g/L glukoz içeren besiyeri 1 ml/dk akış hızıyla

verildiğinde ulaşmıştır. Reaktöre giren glukoz konsantrasyonu arttıkça üretilen etanol

miktarında da artış gözlemlenmiştir. Besiyerindeki glukoz konsantrasyonu 150 g/L’yi

geçtiğinde ise şiddetli inhibisyon etkisi gözlemlenmiş, hücrelerin glukozu verimli

kullanamadıkları ve etanol üretim kapasitelerinin düştüğü görülmüştür. Önceki

çalışmalarda yüksek glukoz konsantrasyonlarında etanol üretiminin düştüğü (Najafpour ve

ark. 2004) ve ozmotik basınçtan dolayı hücrelerin fizyolojik olarak zarar gördüğü

(Hartmeier, 1972) rapor edilmiştir.

71

50 g/L glukoz konsantrasyonuna sahip besiyeri reaktöre farklı akış hızlarıyla

verildiğinde ise çıkış etanol konsantrasyonunun yüksek akış hızlarında düştüğü

gözlemlenmiştir. Ancak üretkenlik 6 ml/dk debide 929 g etanol/gün olarak en yüksek

değerini bulmuştur. İmmobilize reaktörler için üretkenlik ve substurat parçalama hızları

difüzyonel sınırlamalar nedeniyle başlangıçta akış hızının artmasıyla artmaktadır. Kütle

transfer rezistansı biyofilm çevresinde düşük akış hızlarında nispeten daha etkilidir (Erhan

ve ark., 2004). Bu yüzden yüksek akış hızları üretkenliğin arttırımı için tercih edilir.

Bu projede hedefimiz C. thermocellum’un kültür ortamında bulunan selülozu

parçalaması sonucu oluşan glukozun S. cerevisiae tarafından kullanılması ve etanole

üretiminin incelenmesi idi. Bu amaç doğrultusunda yapılan deneyler sonucunda C.

thermocellum kültür sıvısında oluşan glukozun maya hücreleri tarafından etanole

dönüştürülebildiği görülmüştür. Glukoz içerikli C. thermocellum kültür sıvısı taze besiyeri

ile %25 oranında karıştırıldığında maya hücrelerinin glukoz kullanım verimininin % 22

oranında artırdığı gözlemlenmiştir. Glukoz oranı 7 g/l den 20 g/l ye çıkarıldığında ise

glukoz kulanım verimi %89 a çıkmıştır. Dolgu yataklı reaktörde glukoz kullanım veriminin

kesikli sisteme kıyasla daha düşük olduğu görülmüştür. Hücre tutuklamalı reaktörün akış

hızı veya reaktör boyutu bu verimi etkileyen faktörler arasındadır.

C. thermocellum degredasyon prosesinin süresi 40-50 güne çıkarıldığında glukoz

üretim verimi yaklaşık 16 gr glukoz/50 gr selüloz olarak hesaplanmıştır. 14 günlük proses

sonunda ise bu değer 7 g/l civarındadır. 50 gr selüloz içeren ortamda 20 mg/l selülaz

enzimi kullanılması 33 gr şeker üretimi ile sonuçlanmıştır (%66). Bu durumda mikrobiyel

degredasyon yardımı ile enzim miktarı %14 azaltılabilir. Yüksek ölçekli bir üretimde bu

değer enzim maliyetini düşüren önemli bir katkıdır.

Yaptığımız deneyler sonucunda lignoselülozik bitki atıklarının şekere

dönüştürülmesi için uygulanan ön işlemlerden asit baz hidroliz yöntemi ile 70 gr/l

lignoselülozik materyalden 15 gr/l glukoz açığa çıkmıştır. Enzim ilavesi ile bu değer 22

gr/l ye yükselmiştir. Ancak yapılan deneyler sonucunda mayanın asit hidrolizatında etanol

üretemediği ve alkali hidroliz yönteminin asit hidrolizine kıyasla daha verimli olduğu

görülmüştür. Asit hidroliz yöntemi çevreye ve reaktör tanklarına verdiği zarar nedeniyle de

tercih edilen bir yöntem değildir.

72

Selülozik atıkların C. thermocellum aktivitesi ile parçalanması sonucu olşan

şekerlerin verimli kullanılabilmesi için taze besiyeri veya glukoz ile karışım halinde etanol

üretim reaktörüne verilmesi gerekmektedir. C. thermocellum kullanılarak selülozik

maddelerin parçalanması işleminin gerçekleştiği reaktörün mısırdan veya şeker

pancarından etanol üretimi yapılan tesislerde kurulması etanol üretim işlemine ekonomik

katkı sağlayacaktır. 1 tonluk bir reaktörde 10 kg selülozdan 7 kg şeker açığa çıkacaktır.

Mayanın etanol üretim verimi teorik olarak %51 dir. Pratikte bu verimin en yüksek değeri

%48 civarındadır. Lignoselülozik materyalin glukoza dönüştürülmesi ticari selüloza

kıyasla çok daha zor bir işlemdir, gelişmiş ön işlem reaktörlerinin (buhar reaktörleri),

öğütme reaktörlerinin gerekli olduğu ön işlem prosedürü sonucunda lignoselülozik atıklar

parçalanması daha kolay selüloz yığınlarına dönüştürülebilmektedirler. Biz proje

kapsamında lignoselülozik atıklarla yapmış olduğumuz deneylerimizi bu gelişmiş ön işlem

metodlarını kullanmadan gerçekleştirmiş bulunmaktayız. Yapılan deneyler sonucunda

alkali hidroliz yöntemine tabi tutulmuş lignoselülozik atıkların C. thermocellum bakterisi

ile degredasyonu sonucunda ortam şartlarına göre 10 gr/l buğday sapından 4,2 gr/l glukoz

üretilebilmiştir. Buğday sapı için alkali hidroliz sonrası mikrobiyel degredasyon ile elde

edilen en yüksek glukoz miktarı 4,2 g/l dir. Mısır kabuğu için bu değer 4,7 gr/l dir.

Yaptığımız deneylerde kesikli sitemde bütünleştirilmiş proseste, mayanın C. thermocellum

kültür sıvısında pH7,5 iken 7 g/l glukozdan 3,5 g/l etanol ürettiği görülmüştür. Bu değer

enzim kullanmadan ticari selülozdan elde edilen en yüksek etanol miktarıdır (%35, 35 gr

etanol/100 gr selüloz). Ancak 10 gr/l gibi düşük lignoselülozik atık konsantrasyonlarında

problem yüksek besiyeri hacmi nedeniyle distilasyon maliyetinin yüksek olmasıdır. Daha

kısa sürede daha yüksek konsantrasyonda lignoselülozik atık dönüştürmek için enzim ve

hidroliz yöntemlerinden yaralanılması gerekmektedir. Mikrobiyel dönüşüm etanol üretim

tesislerinde etanol üretim prosesinin maliyetini düşürecek önemli bir basamaktır.

73

Tarımsal atıklarının yanı sıra kağıt fabrikası atıkları da C. thermocellum kültürleri

için selüloz kaynağı olarak kullanılmıştır. Kağıt fabrikası atıklarının, selüloz içeriği fenol

sülfürik asit metodu ile tespit edilmiş ve besiyerlerine farklı konsantrasyonlarda ilave

edilerek fermentasyon sonucunda glukoz birikimi ve etanol üretimi tespit edilmiştir. Kağıt

fabrikası atıklarının ticari selüloz kadar kullanılabilir olduğu görülmüştür. 20 g/l kağıt

fabrikası atığı içeren besiyerinde 6 g/l glukoz biriktiği tespit edilmiştir. Ticari selüloz gibi

kağıt fabrikası atıklarının besiyerindeki konsantrasyonunu arttırmanın glukoz birikimine

bir katkısı olmamıştır.Yapılan deneyler sonucnda C. thermcoellum bakterilerinin kağıt

fabrikası atıklarını parçalayarak glukoza dönüştürebildikleri gözlemlenmiştir. Biriken bu

şekerleri maya hücrelerinin kulandığı ve etanol üretimi yaptığı saptanmıştır. Ancak kağıt

fabrikası çıkış likitinin bakterilerin üremesini yavaşlamasına ve düşük miktarlarda glukoz

birikimi ve etanol üretimine neden olan bir toksik etki gösterdiği saptanmıştır. Arıtma

girişi likit atığın ve yüksek miktarda selüloz içeren katı atığın bakteriler üzerinde toksik bir

etkisi görülmemiştir.

Proje kapsamında farklı kağıt türlerinin ve kağıt fabrikası atıklarının C.

thermocellum tarafından parçalanabilme kapasitesi incelenmiş bu bakterinin whatman filtre

kağıdı, A4 kağıdı ve koli kağıdını parçalayabildiği görülmüştür. On günlük fermentasyon

sonucunda bakterinin selülolitik aktivitesi ile kağıtlarda kağıdın cinsine göre %10-%20

civarında parçalanma gözlemlenmiştir. 20 g/l kağıt fabrikası içeren kültürde ise % 29,5

civarında bir dönüşüm olmuş yaklaşık 5,9 g/l glukoz üretilmiştir. Ancak kağıt miktarındaki

artış bakterinin aktivitesinde bir artışa neden olmamıştır. C. thermocellum’un selülolitik

aktivitesinden yüksek seviyede yararlanmak için sürekli veya yarı sürekli kültür ortamı

oluşturulması gereklidir.

Türkiyenin farklı bölgelerinden izole edilen selülozu parçalama yeteneğine sahip

mikroorganizmalar arasında selüloz parçalama ve etanol üretme kapasitesi C.

thermocellum ile eşdeğer olan iki suş elde edilmiştir. Selüloz parçalama yeteneğine sahip

olan bu suşlar üreme sıcaklıkları, ürettikleri son ürünlere bakılarak karakterize

edilmişlerdir. Suşların C. thermocellum ile aynı ürünleri ürettikleri, sporlanabildikleri,

çubuksu bi hücre yapısına sahip oldukları saptanmıştır.

74

EK

KULLANILAN BESİYERLERİ

CA (Sitrik Asit) BESİYERİ YNB 1,6 g/L

Amonyum sülfat 5,1 g/L

Sitrik Asit 20 g/L

KH2PO4 0,5 g/L

Glukoz Gerekli konsantrasyonlarda eklenmiştir

Besiyeri pHsı 5,5 e ayarlandıktan sonra ergosterol ve Tween 80 son konsantrasyonları

0,01 g/L ve 0,42 g/l olacak şekilde besiyerine eklenmiştir.

YM (Yeast Medium) BESİYERİ (KATI) % 0,3 Maya özütü

% 0,3 Malt özütü

% 0,5 Pepton

% 1 Glukoz

%1,5 Agar

YM (Yeast Medium) BESİYERİ Maya özütü 3 g/L

Malt özütü 3 g/L

Pepton 5 g/L

Glukoz Gerekli konsantrasyonlarda eklenmiştir

ZZ BESİYERİ Maya özütü 3 g/L

Malt özütü 3 g/L

Pepton 5 g/L

75

Glukoz Gerekli konsantrasyonlarda eklenmiştir

RM (Russian Medium) BESİYERİ Son Konsantrasyon

Karbon Kaynağı Gerekli konsantrasyonlarda eklenmiştir

RM I

Üre 2 g/L

RM II

KH2PO4 2 g/L

K2HPO4 3 g/L

RM III

Maya özütü 5 g/L

RM IV

MgCl2.6H2O 0,2 g/L

CaCl2.2H2O 0,05 g/L

FeSO4.7H2O 0,0025 g/L

C. thermocellum üretimi için besiyerinin oksijenden arındırılması amacıyla RM IV

bileşenine besiyerindeki son konsantrasyonu 1 g/L olacak şekilde L-Sistein ve RM II

bileşenine son konsantrasyonu 0.002 g/L olacak şekilde resazurin indikatörü eklenmiştir.

5X konsantre hazırlanan yukarıdaki bileşenler ayrı ayrı otoklavlanmış ve soğutulduktan

sonra birleştirilmiştir.

76

KAYNAKLAR Berg, C. 1999. World ethanol production and trade to 2000 and beyond.

http://www.distill.com/berg/

Bothast, R.J., Nichols, N.N., Dien, B.S., 1999. Fermentation with new recombinant

organisms. Biotechnol Prog 15: 875

Cabganella, F. and Wiegel, J. 1993. The potential of thermophilic clostridia in

biotechnology. In:Woods, D.R., The Clostridia in Biotechnology. Butterworth-

Heinemann, Boston. Pp 393-429

Cowling, E.B. and Kirk, T.K. 1976. Properties of cellulose and lignocellulosic materials as

substartes for enzymatic conversion processes. Biotechnology and Bioengineering

Symposium 6: 95.

Hahn-Hagerdal, B., Wahlbom, C.F., Gardonyi, M., Van Zyl, C., Cordero, W.H., Otero,

R.R. and Jo¨nsson LJ. 2001. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for

xylose utilization. Adv Biochem Eng Biotechnol 73: 53.

Himmel, M.E., Adney, W.S., Baker, J.O., Nieves, R.A., Thomas, S.R. 1996. Cellulases:

Structure, functions and applications p.143-161. In C. E. Wyman (ed.) Handbook on

Biotechnology. Taylor and Francis, Washington D. C.

Hogsett, D.A., Ahn, H.-J., Hill, P.W., South, C.R. and Lynd, L.R.. 1992. Direct microbial

conversion: Prospects, Progress, and Obstacles. Appl. Biochem. Biotechnol. 34/35:527

Jeewon, L. 1997. Biological conversion of biomass to ethanol. J. Biotechnol. 56: 1.

Johnson, E.A. 1983 Regulation of cellulase activity and synthesis in Clostridium

thermocellum. Ph.D thesis, Massachussetts Institute of Technology, Cambridge, MA.

Johnson, E.A., Sakajoh, M., Halliwell, G., Madia, A. and Demain, A.L. 1982.

Saccharification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from

Clostridium thermocellum. Appl. Environ. Microbiol. 43: 1125.

77

Kurose, N. and Tonomura, K. 1994. In Y. Murooka, T. Imanaka (eds.) Recombinant

Microbes for Industrial and Agricultural Applications. Marcel Dekker, New York, p

741

Lamed,R. and Bayer, E.A. 1988. The cellulosome of Clostridium thermocellum. In Laskin,

A.I. (ed.) Adv. Appl. Microbiol. 33:2.

Lamed R., Zeikus, J. G. 1980. Ethanol Production by Thermophilic Bacteria: Relationship

Between Fermentation Product Yields of and Catabolic Enzyme Activities in

Clostridium thermocellum and Thermoanaerobium brockii. J. Bacteriology.

144(2):569-578.

Mielenz, J.R. 2001. Ethanol production from biomass: technology and commercialization

status. Curr. Oppin. Microbiol. 4:324.

Olsson, L. and Hahn-Hagerdal. B. 1993. Fermentative performance of bacteria and yeasts

in lignocellulose hydrolysates. Proc Biochem 28:249.

Sheehan J, Himmel ME (1999) Enzymes, Energy, and the Environment: Cellulase

Development in the Emerging Bioethanol Industry. Biotechnol. Progress 15:817.

Sun Ye, Jiayang Cheng, “hydrolisis of lignocellulosic materials for ethanol production” a

review, Bioresource Technology, 83 (2002), 1-11

Tsoi, T.V., Chuvil`skaya, A., Atakishieva, Y. Y., Dzhavakhishvili, T. D., Akimenko, V.K.

and Boronin, A.M. 1987. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya

11:18.

Van Wyk, V. and Jacobus, P.H., 2001. Biotechnology and the utilization of biowaste as a

resource for bioproduct development. Trends in Biotechnol. 19(5):172.

Van Zyl, C., B. A. Prior, S. G. Kilian, and J. L. F. Kock. 1989. D-xylose utilization by

Saccharomyces cerevisiae. J. Gen. Microbiol. 135:2791.

Wiegel, J.,Ljungdahl, L. G., Rawson, J. R. 1979. Isolation from soil and properties of

extreme thermophile Clostridium thermohydrosulfiricum. J. Bacteriology. Sept: 800-

810.

Wiselogel, A, Tyson J, and Johnsson, D. 1996. Biomass feedstock resources and

composition. In: Wyman CE (ed) Handbook on bioethanol: production and utilization.

Taylor and Francis, Washington, DC, pp 105.

78

Zaldivar, J, Nielsen, J. and Olsson, L. 2001 Fuel ethanol production from lignocellulose: a

challenge for metabolic engineering and process integration. Appl Microbiol

Biotechnol. Jul;56(1-2):17.

II. Proje Başvurusunda Sunulan Çalışma Programında, Değişiklikler Veya

Sapmalar: Proje başvurusunda belirlenen çalışma programında yapılması planlanan tüm deneyler

yapılmıştır. Farklı bölgelerden izole edilen suşlardan yalnızca yüksek selülolitik aktivite

gösteren izolatların metabolik tanımlamaları yapılmıştır ve endüstriyel suş olan C.

thermocellum ile kıyaslanmıştır.

Proje Yürütücüsünün Adı-Soyadı

İMZASI TARİH

Y. Doç. Dr. Melek ÖZKAN

02/03/2009

79