TEMA 6. RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS

BACTERIANAS MEDIANTE TINCIONES SELECTIVAS

2°ENFERMERÍA

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍAPROF. PATRICIA NARBÓN

Tinciones selectivas

• Las tinciones selectivas nos permiten observar estructuras

de las células gracias a su mayor afinidad por los colorantes

utilizados

• Se pueden observar estructuras como la pared celular,

cápsula, flagelos, material nuclear, e inclusiones como

depósitos de materiales de reserva de poli-ß-hidroxibutirato,

glucógeno y gránulos metacromáticos.

Observación de esporas• Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas.

• Las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una tinción, se observan al microscopio como cuerpos altamente refringentes y sin teñir. Sin embargo, las endosporas se pueden teñir aplicando calor a la preparación previamente cubierta con una solución de colorante que en la técnica de Shaeffer y Fulton es el verde de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de las células vegetativas y la aplicación de un colorante de contraste permitirá distinguir claramente a las esporas de color verde.

La detección de esporas debe realizarse en cultivos con condiciones estresantes para la célula. Suelen utilizarse cultivos viejos en los que la escasez de nutrientes provoca la esporulación de las bacterias.La presencia de esporas en el ámbito clínico nos dirige hacia los géneros Clostridium y Bacillus. Algunas esporas se desarrollan sin deformar a la célula vegetativa. Otras si lo hacen y generan según la disposición formas centrales o terminales (palillo de tambor). La posición relativa y la morfología de la espora constituyen caracteres taxonómicos en las especies de ambos géneros.

POSICIÓN DE ENDOSPORAS EN LAS BACTERIAS

terminal subterminal

central

Bacillus

Observación de cápsula

•Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cápsula. Está compuesta de azúcares y proteínas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cápsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cápsula dificulta de algún modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cápsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos.

• La tinción de cápsula se denomina tinción negativa porque tiñe el fondo de la preparación y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tinción propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece más a una preparación en fresco. Su realización consiste en colocar la muestra húmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la preparación a excepción de las cápsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cápsula sin color.

Método de la tinta china para cápsula

• 1.-En el centro de un

portaobjetos se coloca una gota

de agua, otra de tinta china y un

poco del cultivo de una cepa

capsulada. Se mezcla

suavemente sin extender.

• 2.-Se coloca un cubreobjetos

sobre la suspensión y se presiona

suavemente evitando que queden

burbujas.

• 3.-Observar inmediatamente al

microscopio.

• 4.-Desechar la preparación en un

recipiente con antiséptico.

• La cápsula se observa como una

gran estructura alrededor de la

célula delimitada por los

pequeños fragmentos de carbón

de la tinta china.

TINCIÓN FLAGELOS

• Los flagelos pueden ser teñidos, pero debido a su diámetro tan pequeño, se requieren técnicas especiales.

• 1. Hacer un círculo en un portaobjetos perfectamente limpio para lo cual previamente fue sumergido en mezcla crómica durante 24 horas, lavado posteriormente con agua destilada, enjuagado con alcohol y secado con un trozo de tela limpio. Desengrasarlo pasando por una flama varias

veces.• 2. Colocar dentro del círculo con pipeta Pasteur, una gotita

de la suspensión bacteriana e inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la muestra.

• 3. Fijar la preparación al aire ya que si esta operación se hace usando la flama del mechero se pueden destruir los flagelos.

• 4. Humedecer la preparación con el Colorante de Leifson y dejarla en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso o en la incubadora.

• 5. Lavar con agua corriente.

• 6. Secar y observar con objetivo de inmersión.

• INTERPRETACION:

• · Los flagelos se tiñen bien de color rojo en aquellas bacterias que no presentan flagelos extremadamente delicados.

Otras técnicas de tinción

• Colorante primario. Para-rosa anilina.

• Mordiente. Acido tánico

• Colorante de contraste. Azul de metileno

Vibrio cholerae

Proteus sp.