synthese van nieuwe n-acyl homoserine lacton analoga met ......faculteit bio-ingenieurswetenschappen...

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2011 – 2012

Synthese van nieuwe N-acyl homoserine lacton analoga met potentiële quorum sensing activiteit

Mathieu Balcaen Promotoren: Prof. dr. ir. Norbert De Kimpe Dr. ir. Sven Mangelinckx Tutor: Ir. Gert Callebaut

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Chemie en

bioprocestechnologie

De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik.

Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met

betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van

resultaten uit deze scriptie.

The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to

copy parts of it for personal use.

Every other use is subjected to the copyright laws, more specially the obligation to extensively

specify the source when using results from this thesis.

juni 2012

De promotor, De auteur,

Prof. dr. ir. N. De Kimpe Dr. ir. S. Mangelinckx Mathieu Balcaen

WOORD VOORAF

Nu het werk aan mijn thesis zich in het eindstadium bevindt, is het tijd om eens terug te kijken

op de jaren die tot dit moment geleid hebben. Ook de mensen die deze vijf studiejaren verlicht

en mogelijk gemaakt hebben wil ik hier bedanken.

Het valt niet te ontkennen dat van de vijf jaar studies bio-ingenieur het thesisjaar een van de

zwaarste, zo niet het zwaarste, was. Vele watertjes dienden te worden doorzwommen

aangezien niet altijd alles liep zoals gewenst. De steun die ik hierbij van verschillende mensen

kreeg was van het allergrootste belang.

Vooreerst wil ik Prof. dr. ir. N. De Kimpe bedanken voor het aanreiken van een interessant

thesisonderwerp alsook om het feit dat hij mij aanmoedigde te kiezen voor de

afstudeerrichting chemie en bioprocestechnologie. Van deze keuze heb ik achteraf geen spijt

gehad.

Ook wil ik Dr. ir. Sven Mangelinckx bedanken voor de begeleiding en hulp bij het afwerken

van dit werk. Ik ben hem ook dankbaar om zijn welwillendheid examens zo te regelen dat ik

niet in tijdsnood kwam voor de verdediging van mijn masterproef.

Mijn dankbaarheid gaat verder uit naar mijn begeleider, Ir. Gert Callebaut. Zijn onmetelijke

geduld en aanmoedigingsvermogen heb ik sterk bewonderd en ook nodig gehad.

Ten slotte wil ik ook specifiek mijn mede-studenten op ‘het vierde’, Elisabeth, Ewout en

Thybo bedanken voor de leuke werksfeer en de hulp. De andere doctoraats- en

thesisstudenten ben ik ook dankbaar voor de geboden hulp en leuke momenten.

Op niet-academisch vlak wil ik ten eerste mijn ouders bedanken voor de steun gedurende deze

vijf studiejaren. Ook wil ik ze bedanken voor het gestelde geduld op momenten wanneer ik er

nogal gejaagd bijliep.

Verder wil ik mijn goede vrienden en vriendinnen bedanken voor hun steun. Degenen die

’s avonds eens langskwamen toen ik tijdens de vakantie reeds aan het werk was aan mijn

thesis. De mensen die eveneens op kot zaten in Gent waarmee ik meer dan eens

gediscussieerd heb over onze thesis. Ten slotte wil ik ook mijn kotgenoten bedanken voor de

leuke kotavonden.

Om te besluiten ben ik iedereen dankbaar die mij op de een of andere manier bijgestaan of

geholpen heeft.

Mathieu Balcaen

Gent, juni 2012

INHOUDSOPGAVE

1 SITUERING EN DOEL.................................................................................................... 1

2 LITERATUURSTUDIE ................................................................................................... 7

2.1 Algemene inleiding betreffende gehalogeneerde natuurproducten ....................................... 7

2.2 Voorkomen van 4-chloorthreonine ....................................................................................... 7

2.3 Biologische activiteit van 4-chloorthreoninederivaten ........................................................... 9 2.3.1 4-Chloorthreonine.................................................................................................................. 9 2.3.2 Lipodepsinonapeptiden ....................................................................................................... 11 2.3.3 Actinomycinen ..................................................................................................................... 12

2.4 Synthese van 4-chloorthreoninederivaten ........................................................................... 13 2.4.1 Chemische stereoselectieve synthese van een 4-chloor-L-threoninederivaat .................... 13 2.4.2 Synthese van 4-chloorthreonine door middel van geïsoleerde threonine aldolasen ......... 14 2.4.3 Synthese van 4-chloorthreonine door middel van fermentatie door Streptomyces sp. OH-5093 ................................................................................................... 14

2.5 Reactiviteit ......................................................................................................................... 15

3 RESULTATEN EN DISCUSSIE .................................................................................. 16

3.1 Asymmetrische synthese van geacyleerde trans-α,β-diamino-γ-lactonen uitgaande van α-chloor-N-sulfinylaldiminen en N-(difenylmethyleen)glycinen ................................................... 16

3.1.1 Synthese van α-chloor-N-sulfinylaldiminen 4a, 4b en 4c .................................................... 18 3.1.2 Synthese van γ-chloor-α,β-diamino esters 5a, 5b en 5c via een Mannich-type additie (reactieweg A) ...................................................................................................................... 19 3.1.3 Ontscherming van de additieproducten 5a en 5b (reactieweg A) ....................................... 20 3.1.4 Acylering van de α-aminogroep van de γ-chloor-α,β-diamino esters 7a en 7b (reactieweg A) ...................................................................................................................... 21 3.1.5 Vorming van β,γ-aziridino-α-amino esters 37a en 37b uitgaande van de α-geacyleerde γ-chloor-α,β-diamino esters 10a en 10b (reactieweg A) .................................................... 23 3.1.6 Omlegging van β,γ-aziridino-α-amino ester 37a tot α-geacyleerd trans-α,β-diamino-γ- lacton 11a (reactieweg A) .................................................................................................... 25 3.1.7 Vorming van β,γ-aziridino-α-amino esters 6a en 6c via een intramoleculaire nucleofiele substitutie (reactieweg B) .................................................................................................... 26 3.1.8 Omlegging van β,γ-aziridino-α-amino esters 6a en 6c tot trans-α,β-diamino-γ-lactonen 12a en 12c (reactieweg B) .......................................................................................................... 28 3.1.9 Acylering van trans-α,β-diamino-γ-lacton 12a (reactieweg B) ............................................ 28

3.2 Synthese van N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen ........................................................... 29 3.2.1 Synthese van N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen 16a en 16b ....................................... 29 3.2.2 Dibromering van N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen 16a en 16b ................................. 30

3.3 Synthese van 4-chloorthreonine-analoga ............................................................................ 31 3.3.1 Synthese van ethyl-[5-(2-chloor-2-propyl)-2,2-difenyloxazolidin-4-yl]carboxylaat rac-43 . 31 3.3.2 Ontscherming van ethyl-[5-(2-chloor-2-propyl)-2,2-difenyloxazolidin-4-yl]carboxylaat rac-43 ................................................................................................................................... 35

3.4 Asymmetrische synthese van β,γ-aziridino-α-amino esters .................................................. 36 3.4.1 Vorming van β,γ-aziridino-α-amino ester 6d via een intramoleculaire nucleofiele substitutie ............................................................................................................................ 37 3.4.2 Reductie van de difenylmethyleenaminogroep tot de difenylmethylaminogroep van het aziridine 6d ........................................................................................................................... 39 3.4.3 Oxidatie van het N-(tert-butaansulfinyl)aziridine 6d tot het N-(tert-butaansulfonyl)aziridine 54 ..................................................................................... 41 3.4.4 Reductie van de difenylmethyleenaminogroep van aziridine 54 tot de difenylmethylaminogroep ................................................................................................... 41 3.4.5 Poging tot omlegging van het N-busylaziridine 55 naar N-busylazetidine 56 ..................... 42

3.5 Resultaten biotesting op Escherichia coli JB523 ................................................................... 43 3.5.1 Resultaten test op activatie ................................................................................................. 44 3.5.2 Resultaten test op inhibitie .................................................................................................. 45

4 EXPERIMENTEEL DEEL ............................................................................................... 46

4.1 Instrumentele methoden .................................................................................................... 46 4.1.1 Dunnelaagchromatografie............................................................................................... 46 4.1.2 Kolomchromatografie...................................................................................................... 46 4.1.3 Infraroodspectrometrie ................................................................................................... 46 4.1.4 Massaspectrometrie ........................................................................................................ 47 4.1.5 Nucleair Magnetische Resonantie (NMR) spectrometrie ............................................... 47 4.1.6 Smeltpuntbepaling .......................................................................................................... 47 4.1.7 HR-MS .............................................................................................................................. 47 4.1.8 Optische rotatie ............................................................................................................... 47 4.1.9 Droge solventen .............................................................................................................. 48 4.1.10 LC-MS ............................................................................................................................... 48

4.2 Synthese van α-geacyleerd trans-α,β-diamino-γ-lacton 11a ................................................. 49 4.2.1 Synthese van (SS,2R,3R) alkyl-4-chloor-2-hexanoylamino-4-methyl-3-(p-tolueensulfinylamino)pentanoaten 10a en 10b en (SS,2R,3R) ethyl-2-benzoylamino-4-chloor-4-methyl-3- (p-tolueensulfinylamino)pentanoaat 10c ............................................................................ 49 4.2.2 Synthese van (SS,2R,3R) ethyl-2-(2-broomhexanoylamino)-4-chloor-4-methyl-3-(p-tolueensulfinylamino)pentanoaat 10d ............................................................................................. 51 4.2.3 Synthese van (SS,Z) ethyl-2-hexanoylamino-4-methyl-4-(p-tolueensulfinylamino) pent-2-enoaat 41 ................................................................................................................. 53 4.2.4 Ringsluiting van (SS,2R,3R) alkyl-4-chloor-2-hexanoylamino-4-methyl-3- (p-tolueensulfinylamino)pentanoaten 10a en 10b tot (SS,2R,2’R) alkyl-2-hexanoylamino-2- (3,3-dimethyl-1-p-tolueensulfinylaziridin-2-yl)acetaten 37a en 37b ................................... 54 4.2.5 Ringtransformatie van (SS,2R,2’R) ethyl-2-hexanoylamino-2-(3,3-dimethyl-1- p-tolueensulfinylaziridin-2-yl)acetaat 37a tot (2’R,3’R) N-(3-amino-4,4- dimethylbutyrolacton-2-yl)hexaanamide hydrochloride 11a .............................................. 56

4.3 Synthese van gediacyleerd trans-α,β-diamino-γ-lacton 38a en trans-α,β-diamino-γ-lacton 12c .......................................................................................................................................... 57

4.3.1 Synthese van (SS,2R,3R) ethyl-4-chloor-4-ethyl-2-difenylmethyleenamino-3-(p-tolueensulfinylamino)hexanoaat 5c ................................................................................................. 57 4.3.2 Synthese van (SS,2R,2’R) ethyl-2-(3,3-diethyl-1-p-tolueensulfinylaziridin-2-yl)-2- (difenylmethyleenamino)acetaat 6c .................................................................................... 58 4.3.3 Ringtransformatie van (SS,2R,2’R) ethyl-2-(3,3-diethyl-1-p-tolueensulfinylaziridin-2-yl)-2- (difenylmethyleenamino)acetaat 6c tot (2’R,3’R) N-(3-amino-4,4-diethylbutyrolacton-2- yl)hexaanamide dihydrochloride 12c ................................................................................... 59 4.3.4 Acylering van (2’R,3’R) 2,3-diamino-4,4-dimethylbutyrolacton dihydrochloride 12a ......... 60

4.4 Synthese van N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lacton analoga 17a en 17b................................. 61 4.4.1 Dibromering van N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen 16a en 16b ................................. 61

4.5 Synthese van 4-chloorthreoninederivaat rac-20 .................................................................. 62 4.5.1 Synthese van ethyl-[5-(2-chloor-2-propyl)-2,2-difenyloxazolidin-4-yl]carboxylaat rac-43 . 62 4.5.2 Ontscherming van ethyl-[5-(2-chloor-2-propyl)-2,2-difenyloxazolidin-4-yl]carboxylaat rac-43 met vorming van ethyl-2-amino-4-chloor-3-hydroxy-4-methylpentanoaat hydrochloride rac-20............................................................................................................ 64

4.6 Asymmetrische synthese van (RS,2R,2′S) ethyl-2-(3,3-dimethylaziridin-2-yl)-2-(amino)acetaten .......................................................................................................................................... 64

4.6.1 Reductie van (RS,2R,2′S) ethyl-2-(1-tert-butaansulfinyl-3,3-dimethylaziridin-2-yl)-2-(difenylmethyleenamino)acetaat 6d tot (RS,2R,2′S) ethyl-2-(1-tert-butaansulfinyl-3,3- dimethylaziridin-2-yl)-2-(difenylmethylamino)acetaat 21d ................................................ 64 4.6.2 Oxidatie van (RS,2R,2′S) ethyl-2-(1-tert-butaansulfinyl-3,3-dimethylaziridin-2-yl)-2-(difenylmethyleenamino)acetaat 6d tot (RS,2R,2′S) ethyl-2-(1-tert-butaansulfonyl-3,3- dimethylaziridin-2-yl)-2-(difenylmethyleenamino)acetaat 54............................................. 65 4.6.3 Reductie van (RS,2R,2′S) ethyl-2-(1-tert-butaansulfonyl-3,3-dimethylaziridin-2-yl)-2- (difenylmethyleenamino)acetaat 54 tot (RS,2R,2′S) ethyl-2-(1-tert-butaansulfonyl-3,3- dimethylaziridin-2-yl)-2-(difenylmethylamino)acetaat 55 ................................................... 66

5 SAMENVATTING EN BESLUIT ................................................................................ 68

6 REFERENTIES ............................................................................................................. 74

Situering en doel

1

1 Situering en doel

Quorum sensing (QS) is een communicatiesysteem dat bepaalde bacteriën gebruiken om de

expressie van specifieke genen te coördineren naargelang hun populatiedensiteit. Dit systeem

is gebaseerd op de synthese, diffusie en detectie van kleine signaalmoleculen, de zogenaamde

auto-inducers. Wanneer deze moleculen een kritische concentratie bereiken, interageren ze

met specifieke transcriptie regulatoren.1 Een grote waaier bacteriën maakt gebruik van het

QS-systeem om de expressie van vele verschillende genen te coördineren.2

Het systeem waarmee de meeste Gram-negatieve bacteriën aan quorum sensing doen bestaat

in essentie uit twee componenten: een LuxI homoloog dat N-acyl homoserine lacton (AHL)

auto-inducers synthetiseert en een auto-inducer afhankelijke transcriptie regulator namelijk

een LuxR homoloog.3 Deze LuxR transcriptie regulatoren bestaan uit een ligand-bindend

domein, waaraan de N-acyl homoserine lactonen binden, en een regulator domein dat met

DNA interageert.4

Het LuxI/LuxR systeem van de bioluminiscente mariene bacterie Vibrio fisheri was het eerste

AHL-gebaseerde QS-systeem dat beschreven werd.5 LuxI synthetiseert constitutief

N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lacton 1, een auto-inducer die bindt aan het LuxR eiwit

wanneer een kritische concentratie bereikt wordt. Door de binding van het AHL wordt LuxR

geactiveerd, waardoor die de transcriptie van het Lux operon initieert met als gevolg dat het

bioluminescente fenotype van Vibrio fisheri tot expressie komt.3

O(S)

ONH

OO

1

O

O

2

Br

BrH

Mutanten met defecten in hun QS-systeem zijn aanzienlijk minder virulent6 en de

QS-systemen worden daarom aanzien als een potentieel nieuw doelwit voor de ontwikkeling

van anti-inflammatoire geneesmiddelen.7 Een welbekend voorbeeld is de opportunistische

ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa die chronische longinfecties veroorzaakt bij

patiënten met cystische fibrose. P. aeruginosa produceert tal van extracellulaire

virulentiefactoren en expressie van veel van deze factoren wordt via quorum sensing

Situering en doel

2

geregeld.8 Onderzoek suggereert verder dat QS ook betrokken is bij de vorming van bacteriële

biofilms waarin bacteriën minder gevoelig zijn voor anti-inflammatoire geneesmiddelen.9

Een strategie die gebruik maakt van QS, is de toepassing van auto-inducer analogen die de

activering door natuurlijke auto-inducers doet afnemen. Een aantal publicaties beschrijven de

synthese en screening van auto-inducer analogen om de specificiteit van de interactie van

auto-inducers met de LuxR homologen te onderzoeken en om inhibitoren te identificeren.10

In

deze onderzoeken wordt vooral gefocust op het effect van het variëren van de vetzuurstaart

van de AHL-moleculen. Via deze benadering werden een beperkt aantal inhibitoren, specifiek

voor bepaalde bacteriële QS-systemen geïdentificeerd.

Een andere optie is de modificatie van de niet-variabele homoserine lacton-groep van de

auto-inducer molecule hetgeen potentieel een nieuwe en meer algemene klasse van

QS-inhibitoren zou kunnen genereren. Van gehalogeneerde furanon-type QS-inhibitoren 2 die

geïsoleerd werden uit Delisea pulchra, een alg levend in de Rode Zee, werd aangetoond dat

deze verschillende QS-systemen remmen die gebruik maken van verschillende auto-inducer

moleculen.11

De furanon-type inhibitoren hebben substituenten op de 3-, 4- en 5-plaatsen van

de furanon ring. De structurele gelijkenis tussen de furanon-type inhibitoren en

N-acyl homoserine lactonen suggereert het potentieel van AHL-analogen met substituenten op

de 3-, 4- en 5-plaatsen. Het invoeren van substituenten zou ook interessante informatie over

de interactie tussen LuxR homologen en de homoserine lacton-groep moeten opleveren.3

In de natuur worden N-acyl homoserine lactonen gevormd uitgaande van een

α-aminozuurderivaat met een ‘leaving group’ in γ-plaats, namelijk (S)-adenosylmethionine

(SAM). SAM is een biologische sulfoniumverbinding die betrokken is bij een groot aantal

biologische processen. Het is onder andere de biologische methyldonor bij uitstek in reacties

gekatalyseerd door methyltransferasen.12

Enzymologische studies hebben verder aangetoond

dat SAM niet alleen als methyldonor gebruikt wordt in biologische reacties maar bovendien

precursor is van een groot aantal natuurlijke verbindingen zoals 1-aminocyclopropaan-1-

carbonzuur (α-ACC), zelf de precursor van het plantenhormoon ethyleen, L-azetidine-2-

carbonzuur (L-Aze), het niet-proteïnogene aminozuur homoloog van proline en ten slotte ook

de N-acyl homoserine lactonen. 12c,13

Situering en doel

3

Naast de biosynthese van deze carbocyclische en heterocyclische verbindingen startend uit

SAM, is het ook mogelijk om deze te vormen uitgaande van γ-chloor-α-aminozuren.14

Een

voorbeeld van een belangrijk γ-chloor-α-aminozuur is 4-chloor-L-threonine. Het belang en

enkele synthesewegen van deze belangrijke molecule zullen worden uitgewerkt in de

literatuurstudie.

In een eerste luik van dit werk zal de asymmetrische synthese van α,β-diamino lactonen

worden uitgewerkt. Twee reactiewegen worden uitgetest, een eerste reactieweg (A) zal

beginnen met een Mannich-type additie van een N-(difenylmethyleen)glycine 3 aan een

chiraal α-chloor-N-sulfinylaldimine 4. Daarna zal de α-aminogroep van het additieproduct 5

selectief ontschermd worden waarna dit ontschermde additieproduct 7 zal gekoppeld worden

met een acylchloride 8 of een vetzuur 9. Ten slotte zal geprobeerd worden om uit deze

verbinding 10 een gesubstitueerd AHL-analoog 11 te vormen via een omlegging.

In een tweede reactieweg (B) zal opnieuw eerst een Mannich-type additie van een

N-(difenylmethyleen)glycine 3 aan een chiraal α-chloor-N-sulfinylaldimine 4 uitgevoerd

worden. Nu zal echter gequencht worden na een tijd bij hogere temperatuur waardoor de

vorming van aziridine 6 zal bevorderd worden na een intramoleculaire nucleofiele

substitutiereactie. Dit aziridine kan dan, zoals verwacht op basis van voorafgaand

onderzoek,15

omgelegd worden tot het lacton 12. Ten slotte zal het gevormde lacton

geacyleerd worden met als doel de vorming van een geacyleerd lacton 13, met speciale

aandacht voor de regioselectiviteit van de acylering.

R1

ClR1

H

NS

R2

O

OR3

O

N

Ph

Ph a) Quenchen bij lage temperatuurb) Quenchen na langere tijd bij hogere temperatuur

R1R1

Cl

O

OR3

NH

N Ph

Ph

SR2

O

Reactieweg (A)

O

OR3

N Ph

Ph

Reactieweg (B)

N

SOR2

1) base

2)

4 (R1 = Alkyl, R2 = t-Bu, p-Tol)

3

5

6

(R3 = Alkyl) R1

R1

Situering en doel

4

R1R1

Cl

O

OR3

NH

N Ph

Ph

SR2

O

ontscherming

R1R1

Cl

O

OR3

NH

NH2

SR2

O

R4

O

Cl

R1R1

Cl

O

OR3

NH

HN

SR2

O

O

R4

5 7 10

R4

O

OH

of

(R4 = Alkyl,

Fenyl)

9

8

ringtransformatie

11

OO

R1

R1 NHH2N

O

R4

Reactieweg (A)

O

OR3

N Ph

Ph

N

SOR2

R1

R1

ringtransformatieO

O

R1

R1 NH2H2N

R4

O

ClO

O

R1

R1 NHH2N

O

R4

6 12 13

8

Reactieweg (B)

In een tweede luik wordt de synthese van AHL-analogen met een ketogroep op de 3-plaats

van de vetzuurketen, de zogenaamde β-ketoamide AHL derivaten, onderzocht. In deze

synthese zal een carbonzuur 9 achtereenvolgens gekoppeld worden met Meldrum’s zuur 14 en

lacton 15. De beoogde β-ketoamide AHL derivaten 16 zullen vervolgens onderworpen

worden aan bromeringsreacties met als doel de vorming van potentiële QS-modulatoren 17.

Situering en doel

5

OH

O

( )n

1)

Meldrum's zuur 14

2) O

OH2NHBr. O

( )n

O

NH

O

O

9

15

16

O

( )n

O

NH

O

OBr Br

17

Br+

O

O

O

O

In het derde luik zal de synthese van 4-chloorthreoninederivaten 20 onderzocht worden. De

synthese zal via een aldol-type condensatie van een N-(difenylmethyleen)glycine 3 aan α-

chlooraldehyden 18 worden uitgevoerd gevolgd door een ontscherming van de verwachte

aldol-adducten 19 onder zure condities.

OR3

O

N

Ph

Ph

R1

ClR1

H

O

1) base

2)

3

18 (R1=Alkyl)

R1R1

Cl

OH

NH2

O

OR3ontscherming

19 20

R1R1

Cl

OH

N Ph

Ph

O

OR3

In het vierde luik van dit onderzoekswerk zal geprobeerd worden om (2R,3S)-L-3-

aminoazetidine-2-carbonzuurderivaten 22 te vormen. Eerst zal opnieuw een Mannich-type

additie van een N-(difenylmethyleen)glycine 3 aan een chiraal α-chloor-N-sulfinylaldimine 4

uitgevoerd worden voor de vorming van aziridinen 6. De reductie van de

difenylmethyleenaminogroep zal daaropvolgend onderzocht worden voor de synthese van

aziridinen 21, als precursoren van de sterk gefunctionaliseerde analoga 22 van azetidine-2-

carbonzuur.

Situering en doel

6

R1

ClR1

H

NS

O

OR3

O

N

Ph

Ph

O

OR3

N Ph

Ph

N

SOR2

1) base

2)

4 (R1 = Alkyl, R2 =t-Bu, p-Tol)

3 6(R3 = Alkyl)

R1

R1

reductie ringtransformatie

N

Ph

Ph

OR3

O

HN

R1R1

S O

N

R1

O

OR3

S

HN

R1

O

21 22

Ph

Ph

R2 R2

R2

Ten slotte zullen een aantal geselecteerde verbindingen, bereid in dit onderzoekswerk,

biologische testing ondergaan betreffende activering en inhibitie van het QS-systeem van

bacteriële biosensor stammen. Hierbij wordt dus onderzocht of deze geteste verbindingen

agonisten of antagonisten zijn van het QS-systeem.

Literatuurstudie

7

2 Literatuurstudie

2.1 Algemene inleiding betreffende gehalogeneerde

natuurproducten

Terwijl organohalogeenverbindingen vroeger door wetenschappers aanzien werden als

isolatieartefacten, vertegenwoordigen ze heden ten dage een waardevolle en expanderende

klasse van natuurlijke verbindingen.16

Omdat de oceanen rijk zijn aan chloride- en

bromidezouten, incorporeren mariene organismen deze halogenen vrij vaak in hun

metabolieten. Van de ongeveer 4000 gekende natuurlijke organohalogenen worden de meeste

door deze mariene organismen geproduceerd.17,18

Gehalogeneerde natuurlijke verbindingen vertonen vaak significant verschillende

eigenschappen ten opzichte van hun niet-gehalogeneerde analoga.19

Het is dan ook geen

verassing dat gehalogeneerde aminozuren een aantal applicaties hebben in de medicinale

chemie, voornamelijk als intermediair in bepaalde organische synthesen. Bovendien zijn deze

aminozuurderivaten ook waardevol in het ontrafelen van bepaalde biologische

mechanismen.20

Van de 4-halogeenthreonine analoga werden er enkel derivaten van 4-chloor- en

4-fluorthreonine geïsoleerd als natuurlijke verbindingen.21,22

Vooral 4-fluorthreonine werd

reeds uitvoerig bestudeerd onder andere wegens de anti-microbiële activiteit,23

alsook de

mogelijke anti-tumoractiviteit.23,24

Verder werden enkele synthesen van 4-chloor- en

4-fluorthreonine beschreven alsook één enkele synthese van 4-broomthreonine.14d,21,22,25

2.2 Voorkomen van 4-chloorthreonine

Er werd ontdekt dat 4-chloorthreonine als dusdanig wordt geproduceerd door Streptomyces

sp. OH-5093.14d

Meestal wordt de 4-chloorthreonine-eenheid echter teruggevonden als

onderdeel van grotere structuren.

De verschillende stammen van de fytopathogene bacterie Pseudomonas syringae pv. syringae

produceren verschillende typen lipodepsinonapeptiden. 4-Chloorthreonine is één van de

ongewone, niet-proteïnogene aminozuren die deel uitmaken van deze

lipodepsinonapeptiden.26

De belangrijkste kenmerken van deze lipodepsinonapeptiden zijn:

(a) L-serine vormt het N-terminale residu en is N-geacyleerd met een 3-hydroxy- of

Literatuurstudie

8

3,4-dihydroxyvetzuurketen en O-geacyleerd met het eindstandige C-terminaal residu,

(b) het C-terminale tripeptide bestaat steeds uit de Z-dehydroaminobutyryl-3-hydroxy-L-

aspartyl-4-chloor-L-threonyl-eenheid, (c) de vijfde aminozuur eenheid is basisch.27

De lipodepsinonapeptiden die geproduceerd worden door Pseudomonas syringae pv. syringae

levend op het plantengeslacht Citrus worden syringotoxinen genoemd. De Pseudomonas

stammen levend op steenvruchten, peren en grassen synthetiseren syringomycinen

(e.g. syringomycine E) terwijl syringostatinen geproduceerd worden door de stammen levend

op het plantengeslacht Syringa.28

Tenslotte zijn er nog de pseudomycinen, dit zijn

metabolieten die aanwezig zijn in een via transposons gegenereerde mutant van P. syringae

namelijk Pseudomonas syringae MSU 16H.27 Er is achterhaald dat syringomycinen en

syringotoxinen door respectievelijk P. syringae pv. atrofaciens en P. fuscovaginae, kunnen

geproduceerd worden.29

Eveneens werd ontdekt dat ook Pseudomonas corrugate een

lipodepsinonapeptide produceert, namelijk cormycine A.30

HN

OH OO

O

Cl

HN

OHO

NH

OHHO2CO

HN

O

HN O

NH

NH2

NH

HN

O

NH2

NH

O

NH2

HN

O

HO

HN

O

Syringomycine E

De laatste besproken klasse van verbindingen zijn de actinomycinen, waarbij in bepaalde

vormen van het G-type, het Y-type en het Z-type, een 4-chloorthreonine-eenheid ingebouwd

zit in de structuur.31,32,33

Literatuurstudie

9

OHN

ONH

O

ON

HO O

NO

N

Me

Me

O O HN

O

O N

O

NO

N

Me

Me

O

O

OH

O NH

Cl

O

N

OHN

ONH

O

ON

HO O

NO

N

Me

Me

O O HN

O

O N

O

NO

N

Me

Me

O

O

OH

O NH

Cl

O

N

R

Actinomycine G2 Actinomycine Y, in Y1 is R = (=O), in Y2 is R = OH

OHN

ONH

O

ON

O

NO

N

Me

Me

O O HN

O

O N

NO

N

Me

Me

O

O

OH

O NH

Cl

O

N

O

R O

Actinomycine Z, in Z3 is R = OH, in Z5 is R = H

2.3 Biologische activiteit van 4-chloorthreoninederivaten

2.3.1 4-Chloorthreonine

Toen in 1994 ontdekt werd dat Streptomyces sp. OH-5093 4-chloorthreonine produceert, werd

in daaropvolgende testen vastgesteld dat deze verbinding herbicide activiteit bezit. Verder

werd ook een inhiberende activiteit ten opzichte van de gist Candida vastgesteld.

De herbicide activiteit van 4-chloorthreonine werd bepaald op radijzen (Rhaphanus sativus

L.) en sorghum (Sorghum bicolor Moench) en was vergelijkbaar met de activiteit van het

veelgebruikte herbicide Bialaphos. Het mechanisme van de herbicide activiteit werd niet

bepaald maar er werd gesuggereerd dat waarschijnlijk het aminozuurmetabolisme ontregeld

wordt.21

NH2

OH

O

Cl

OH

4-Chloor-L-threonine

Literatuurstudie

10

In een studie uit 1995 werd vervolgens vastgesteld dat 4-chloorthreonine een inhibitor van

serine hydroxymethyltransferase is. Dit zou eventueel ook de oorzaak kunnen zijn van de

herbicide activiteiten vermeld in voorgaande studie. Serine hydroxymethyltransferase

katalyseert namelijk de splitsing van een aantal β-hydroxy-L-aminozuren waarbij glycine en

aldehyden geproduceerd worden. 4-Chloor-L-threonine bleek serine

hydroxymethyltransferase te inhiberen op een tijds- en concentratie-afhankelijke manier en

bovendien is er verzadiging van de inactivatiesnelheid bij hogere concentraties.14d

De resultaten van de studie suggereren dat 4-chloorthreonine een retro-aldolreactie ondergaat

met generatie van chlooraceetaldehyde in de actieve site van het enzym, leidend tot

inactivatie. Serine en glycine beschermen het enzym tegen inactivatie door 4-chloorthreonine

terwijl tetrahydrofolaat (H4folaat) dit niet doet. Deze studie suggereert dat gehalogeneerde

threoninederivaten die elektrofiele aldehyden genereren, effectieve inhibitoren van serine

hydroxymethyltransferase zullen zijn en daardoor een toepassing kunnen vinden als potentiële

chemotherapeutische agentia.

Serine hydroxymethyltransferase is een pyridoxal-5’-fosfaat-afhankelijk enzym dat de

reversibele conversie tussen serine en glycine katalyseert.14d

L-Serine + H4folaat Glycine + 5,10-CH2-H4folaat

serine hydroxymethyltransferase

Het enzym introduceert een koolstofeenheid op H4folaat dat door enzymen gebruikt wordt in

de de novo synthese van deoxythymidylaat en purinen en bij de methylering van

homocysteïne tijdens de vorming van methionine. Omdat deoxythymidylaat en purinen

noodzakelijk zijn in de DNA-synthese, en zo dus bij de celdeling, is het mogelijk dat serine

hydroxymethyltransferase de groeisnelheid van cellen doet afnemen. Een aantal studies

toonden reeds aan dat er een hogere activiteit van het serine hydroxymethyltransferase is in

hepatoma- en myeloma cellen in vergelijking met normale cellen. Vandaar zou dit enzym een

mogelijk doelwit kunnen zijn voor chemotherapeutische agentia, met als reden dat

sneldelende tumorcellen meer gebruik maken van de de novo biosynthese van DNA en dus

een hogere activiteit van het serine hydroxymethyltransferase nodig hebben dan traagdelende

cellen.34

Naast de transfer van een hydroxymethylgroep van serine naar H4folaat, wat het een

doelwit voor chemotherapie maakt, reageert serine hydroxymethyltransferase ook met

Literatuurstudie

11

β-hydroxyaminozuren in afwezigheid van H4folaat. Dit leidt tot retro-aldolreactie van deze

aminozuren tot het overeenkomstige aldehyde en glycine.35

Er dient opgemerkt te worden dat 4-chloor-L-threonine waarschijnlijk niet geschikt zal zijn

voor toepassing in de chemotherapie omdat het leidt tot de vrijstelling van een te reactief

elektrofiel na reactie met serine hydroxymethyltransferase. Gefluoreerde derivaten zoals

4-trifluor-L-threonine of het corresponderende allo-threoninederivaat zouden wel geschikt

kunnen zijn voor chemotherapie omdat ze hoogstwaarschijnlijk zeer traag met serine

hydroxymethyltransferase zullen reageren.14d

2.3.2 Lipodepsinonapeptiden

Zoals reeds vermeld zijn er een aantal typen lipodepsinonapeptiden, die voornamelijk

geproduceerd worden door Pseudomonas syringae pv. syringae. Er zijn syringomycinen,

syringotoxinen, syringostatinen en pseudomycinen die allen een 4-chloorthreonine-eenheid

bevatten maar verschillen in specifieke aminozuursamenstelling.36

De lipodepsinonapeptiden worden gekarakteriseerd door een sterke anti-fungale activiteit,37

waarvan aangetoond werd dat deze gecorreleerd is met de aanwezigheid van

4-chloorthreonine.38

Daartegenover staat wel dat de lagere anti-fungale activiteit die

geobserveerd werd in de niet-gechloreerde analoga van syringomycine en syringotoxine, duidt

op de relevantie van nog andere componenten aanwezig in deze structuren.38

Ook

anti-microbiële activiteit wordt waargenomen, waarbij de efficiëntie varieert naargelang de

verbinding.39

In vitro studies van het werkingsmechanisme hebben aangetoond dat de verstoring van de

integriteit van celmembranen aan de basis ligt van de biocidale activiteit op planten-, dieren-

en microbiële cellen. De interactie met lipide dubbellagen vormt slechts een deel van een

complex proces. Specifieke mechanismen, waarin de rol van de gemodificeerde,

niet-proteïnogene aminozuren nog verder moet worden onderzocht, kunnen plaatsvinden bij

het werkingsmechanisme.40

Verschillende biologische activiteiten van pseudomycine zijn minder uitgesproken dan die

gevonden voor de andere typen en dit is een verschil dat te wijten kan zijn aan het grotere

aantal en de distributie van geladen groepen in de peptide-eenheid.41

Pseudomycine wordt

eveneens voorgesteld als middel in de biocontrole van Ophiostoma ulmi, de oorzaak van de

sterk destructieve iepziekte.42

Literatuurstudie

12

Van het lipodepsinonapeptide cormycine A, geproduceerd door Pseudomonas corrugate,

werd ontdekt dat het significant actiever is dan de andere lipodepsinonapetiden. Dit verschil

in biologische activiteit wordt toegeschreven aan de zwakke positieve nettolading bij neutrale

pH. De eigenschappen van cormycine A suggereren dat cormycinederivaten toepassingen

zouden kunnen vinden als anti-fungale verbindingen en eveneens als middel in naoogst

biocontrole.30

2.3.3 Actinomycinen

Actinomycinen vormen een bekende klasse chromopeptiden die geproduceerd worden door

een aantal streptomyceten.31

Er zijn een 20-tal natuurlijk voorkomende actinomycinen en

meer dan 40 varianten zijn verkregen via precursor-gestuurde biosynthese.43

Al deze

actinomycinen delen hetzelfde actinoyl chromofoor (2-amino-4,6-dimethylfenoxazine-3-on-

1,9-dicarbonzuur) maar verschillen in aminozuursamenstelling van de twee

pentapeptidolacton residu’s.44

Deze chromopeptiden vertonen sterke anti-neoplastische en anti-bacteriële activiteit.

Actinomycine D vond reeds een applicatie in chemotherapie, namelijk als geneesmiddel tegen

niertumoren bij kinderen (Wilms-tumor).45

Het werkingsmechanisme is gebaseerd op het

plaatsen van het fenoxazinon chromofoor tussen twee guanine/cytosine baseparen in de DNA

dubbele helix.46

Er werd ontdekt dat Streptomyces iakyrus DSM 41873 vijf nieuwe actinomycinen produceert

namelijk actinomycine G2 tot G6. Van deze verbindingen bevat enkel actinomycine G2 een

4-chloorthreonine-eenheid en dit actinomycine G2 vertoont de grootste cytotoxische en

anti-bacteriële activiteit van alle G-type actinomycinen. De activiteit is wel lager dan die van

actinomycine D, dewelke als referentie gebruikt werd.31

Verder werd vastgesteld dat ook Streptomyces sp. Gö-GS12 vijf nieuwe actinomycinen

produceert namelijk Y1-Y5 waarvan Y1 en Y2 een 4-chloorthreonine-eenheid bevatten. Deze

actinomycinen vormen een belangrijke klasse antibiotica en het is zo dat Y1 de grootste

activiteit vertoont.32

De 4-chloorthreonine-eenheid vormt ook een onderdeel van actinomycinen Z3 en Z5. Van de

Z-type actinomycinen hebben de gechloreerde Z3- en Z5-derivaten de hoogste cytotoxiciteit.

Bovendien bleken de actinomycinen Z3 en Z5 werkzamer te zijn dan actinomycine D in een

test met drie tumorcellijnen. Ten slotte was ook de MIC (minimale inhibitie concentratie) ten

Literatuurstudie

13

opzichte van Bacillus subtilis voor actinomycine Z3 lager dan voor actinomycine D en gelijk

aan actinomycine D voor actinomycine Z5.33

2.4 Synthese van 4-chloorthreoninederivaten

Er zijn slechts een handvol synthesen van 4-chloorthreoninederivaten gerapporteerd waarvan

er slechts één gebruik maakt van een stereoselectieve syntheseroute,14d

terwijl de andere een

biosynthetische route gebruiken.21, 22

2.4.1 Chemische stereoselectieve synthese van een 4-chloor-L-

threoninederivaat

De stereoselectieve synthese van 4-chloorthreoninederivaat 27 begint met een oxidatieve

decarboxylering van een beschermd glutaminezuurderivaat 23, resulterend in

vinylglycinederivaat 24. Dit vinylglycinederivaat 24 wordt in hoog rendement omgezet tot

epoxide 25 door middel van m-chloorperbenzoëzuur. Deze epoxidering resulteerde in de

vorming van meer dan 95% van het syn-diastereomeer. Het epoxide 25 wordt daarna

regiospecifiek geopend met behulp van Li2CuCl4 om het beschermde chloorhydrine 26 te

bekomen. Ten slotte wordt het Cbz-beschermde chloorhydrine 26 ontschermd door middel

van zure hydrolyse om het stabiele hydrochloridezout van het benzylester van

4-chloor-L-threonine 27 te bekomen.14d

O

OH

HCO2Bn

CbzHN

23

Pb(OAc)4Cu(OAc)2

benzeenH

CO2Bn

CbzHN

24

mCPBA

CH2Cl2

(30%)

HCO2Bn

CbzHN

OH

(~100%, >95% syn)

25

Li2CuCl4THF

HCO2Bn

CbzHN

Cl

(83%)

HOH

26

6M HCl, 80 °C

HCO2Bn

H2N

ClH

OH

HCl.

27

(94%)

ref. 14d

Literatuurstudie

14

2.4.2 Synthese van 4-chloorthreonine door middel van geïsoleerde

threonine aldolasen

Biotransformaties zijn waardevolle methoden om tot 4-gehalogeneerde threoninen te komen.

De reacties hebben nood aan PLP (pyridoxal-5'-fosfaat) en kunnen gekatalyseerd worden door

L-threonine aldolase, afkomstig van Pseudomonas putida, wat leidt tot de analoge

gehalogeneerde L-aminozuren. Een andere optie is het gebruik van D-threonine aldolase van

Alcaligenes xylosoxidans wat de overeenkomstige D-aminozuren oplevert. De

stereoselectieve additie van glycine aan α-chlooracetaldehyde geeft vooral

syn-diastereomeren 30 en 32.22

O

HCl +

NH2

O

OH

L-threoninealdolase

D-threoninealdolase

Cl

O

OH

NH2

OH

+ Cl

O

OH

NH2

OH

Cl

O

OH

NH2

OH

+ Cl

O

OH

NH2

OH

L-syn 30 L-anti 31

D-syn 32 D-anti 33

(65%, 70% syn)

(26%, 89% syn)

28 29

ref. 22

2.4.3 Synthese van 4-chloorthreonine door middel van fermentatie door

Streptomyces sp. OH-5093

4-Chloorthreonine 34 kan tenslotte ook geproduceerd worden als metaboliet van Streptomyces

sp. OH-5093 via fermentatie. De productie ligt echter vrij laag, uit 40 liter vloeistof die

bekomen wordt uit filtratie van de cultuurvloeistof, wordt 140 mg 4-chloorthreonine

bekomen.21

NH2

OH

O

Cl

OH

34

http://nl.wikipedia.org/w/index.php?title=Pyridoxal_5%27-fosfaat&action=edit&redlink=1

Literatuurstudie

15

2.5 Reactiviteit

Incubatie van 4-chloor-L-threonine 34a in een buffer die 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-

1-piperazine-ethaansulfonzuur) bevatte en een pH van 7,5 had, bleek te leiden tot de vorming

van een afbraakproduct. Na massaspectrometrie en 1H-NMR spectrometrie werd besloten dat

4-chloor-L-threonine 34a zich had omgelegd tot α-amino-β-hydroxy-γ-lacton 35.14d

NH2

OH

O

Cl

OH buffer

O

HO

H2N

O

34a 35

ref. 14d

Het is interessant te vermelden dat uit een andere studie bleek dat zowel trans- als cis-α-(N-

hexanoyl)-β-hydroxy-γ-lacton 36a en 36b, als geacyleerde derivaten van lacton 35, activators

te zijn van een LuxR-gebasseerd QS-screening systeem.3

O

HO

NH

O

O

HO

NH

O

O O

36a 36b

Resultaten en discussie

16

3 Resultaten en discussie

3.1 Asymmetrische synthese van geacyleerde trans-α,β-diamino-

γ-lactonen uitgaande van α-chloor-N-sulfinylaldiminen en N-

(difenylmethyleen)glycinen

In deze masterproef zullen twee mogelijke reactiewegen naar N-geacyleerde

trans-α,β-diamino-γ-lactonen worden onderzocht waarbij uitgegaan wordt van een

stereoselectieve Mannich-type additie tussen een N-(difenylmethyleen)glycine-ester 3 en een

α-chloor-N-sulfinylaldimine 4.

Uit eerder onderzoek aan de Vakgroep Duurzame Organische Chemie en Technologie, FBW,

UGent is immers gebleken dat een Mannich-type additie tussen een

N-(difenylmethyleen)glycine-ester 3 en een chiraal α-chloor-N-(p-tolueensulfinyl)aldimine 4

(R1 = Me, R

2 = p-Tol) kan worden uitgevoerd in een uitstekende diastereoselectiviteit. Bij

gebruik van LiHMDS werden syn-γ-chloor-α,β-diamino esters 5 bekomen wanneer de reactie

gequencht werd met NH4Cl (aq.) na 15 minuten bij -78 °C. Wanneer de reactie eerst 15

minuten bij -78 °C doorging en vervolgens twee uur bij kamertemperatuur geroerd werd

vooraleer te quenchen met NH4Cl (aq.), werd het overeenkomstige syn-β,γ-aziridino-α-amino

ester 6 verkregen. Beide producten 5 en 6 werden hierbij bekomen in meer dan 94% ee.15

De syn-β,γ-aziridino-α-amino esters 6 konden eveneens gesynthetiseerd worden uitgaande van

de syn-γ-chloor-α,β-diamino esters 5 via een intramoleculaire nucleofiele substitutie waarbij

geen isomeratie optreedt en zo dus de syn-stereochemie behouden blijft. Selectieve

ontscherming van de beschermde groep op het Nα-atoom van het syn-γ-chloor-α,β-diamino

ester 5 (R3 = Et) was eveneens mogelijk via een zure behandeling met TFA. Wanneer het

syn-β,γ-aziridino-α-amino ester 6 (R3 = Et) geroerd werd in HCl (aq.) leverde dit het

overeenkomstige trans-α,β-diamino-γ-lacton 12 op.15


17

N

Ph

Ph

R1

ClR1

H

NS

1) LiHMDS, THF

2)

O

R2

A. Quenchen bij lage temperatuur B. Quenchen na langere tijd bij hogere temperatuur

R1R1

Cl

O

OR3

NH

N Ph

Ph

SR2

O

*O

OR3

N Ph

Ph

N

SOR2

R1

R1

*

H

1) TFAaceton/water (2:1)2) NH4OH

R1R1

Cl

O

OR3

NH

NH2

SR2

O

0,5M HCl in H2O/EtOAc (4:1)

OO

R1

NH2.HCl

H2NHCl.

3 (R3 = Alkyl)

4 (R1 = Alkyl,

R2 = t-Bu, p-Tol)

*

5

7

6

12

R1

O

OR3

*

ref. 15

Voortbouwend op deze resultaten wordt hierin onderzoek uitgevoerd om uit deze recent

beschreven verbindingen en nieuw gesynthetiseerde analoga, geacyleerde trans-α,β-diamino-

γ-lactonen 11 en 38 te synthetiseren. In een eerste benadering tot het monogeacyleerde

trans-α,β-diamino-γ-lacton 11 (reactieweg A), wordt de acylering van diamino esters 7

onderzocht voorafgaand aan de ringsluiting van esters 10 of de omlegging van aziridine 37 tot

lacton 11. In een tweede benadering (reactieweg B), wordt eerst het lacton 12 gevormd

alvorens de acylering tot lacton 38 wordt bestudeerd.

In beide reactiewegen zal bij de acylering voornamelijk een Schotten-

Baumannkoppelingsreactie met zuurchloriden 8 worden onderzocht aangezien uit de literatuur


18

blijkt dat deze koppeling doorgaat met hoge efficiëntie en reeds gebruikt werd bij de synthese

van een aantal N-acyl homoserine lactonen.47

Daarnaast zal ook de koppeling van de

ontschermde γ-chloor-α,β-diamino esters 7 met vetzuren worden bestudeerd.

O

OR3

HNClR1

NHS

O

O

base O

OR3

HN

R4

O

N

SO

R1

R1 H

R2

R2

R1

* *

10

11

37

R4

OO

R1

NHH2N

R4

O

R1

R1R1

Cl

O

OR3

NH

NH2

SR2

O

*

base

8 (R4 = Alkyl, Fenyl)

R4

O

Cl

7

ringtransformatieO-alkylering

Reactieweg (A)

OO

R1

NH2.HCl

H2NHCl.

base

R4

O

Cl

12 38

8 OO

R1

R1 NHNH

R4

O

R4

OR1

Reactieweg (B)

3.1.1 Synthese van α-chloor-N-sulfinylaldiminen 4a, 4b en 4c

De startproducten voor de Mannich-type addities werden gesynthetiseerd volgens analoge

proceduren als beschreven in het voorafgaand onderzoek.15


19

Het reeds beschreven α-chloor-N-(tert-butaansulfinyl)aldimine 4c werd gesynthetiseerd

(60% rendement) door reactie van 1,2 equivalenten α-chloorisobutyraldehyde 18a met één

equivalent (RS)-tert-butaansulfinamide 39 in de aanwezigheid van twee equivalenten Ti(OEt)4

in THF onder reflux gedurende vier uur.48

Op gelijkaardige wijze werd het, eveneens reeds

beschreven, α-chloor-N-(p-tolueensulfinyl)aldimine 4a bekomen (86% rendement) door

condensatie van 1,2 equivalenten, α-chloorisobutyraldehyde 18a met één equivalent

(SS)-p-tolueensulfinamide 40 in aanwezigheid van twee equivalenten Ti(OEt)4 in

dichloormethaan bij kamertemperatuur gedurende 18 uur.15

Ten slotte werd

α-chloor-N-(p-tolueensulfinyl)aldimine 4b (74% rendement) op exact dezelfde wijze

gesynthetiseerd als α-chloor-N-(p-tolueensulfinyl)aldimine 4a, uitgaand van 2-ethylbutanal

18b.

R1

ClR1

H

O

1,2 equiv. R1

ClR1

H

NS

(S)

O

4a (86%)4b (74%)

1) 2 equiv. Ti(OEt)4

2) 1 equiv.S

(S)O

CH2Cl2, kt, 18 u

40

18a (R1 = Me)

18b (R1 = Et)

1) 2 equiv. Ti(OEt)4

2) 1 equiv.S

(R)O

THF, 4 uCl

H

NS

(R)

O

4c (60%)

39

H2NH2N

3.1.2 Synthese van γ-chloor-α,β-diamino esters 5a, 5b en 5c via een

Mannich-type additie (reactieweg A)

Uit eerder onderzoek van de Vakgroep Duurzame Organische Chemie en Technologie, FBW,

UGent bleek het mogelijk te zijn om syn-additieproducten 5a en 5b van

N-(difenylmethyleen)glycinederivaten 3a en 3b aan α-chloor-N-(p-tolueensulfinyl)aldimine

4a in hoog rendement te synthetiseren.15

Op analoge wijze werd ook additieproduct 5c

bekomen, uitgaande van ethyl-N-(difenylmethyleen)glycine 3a en α-chloor-N-

(p-tolueensulfinyl)-aldimine 4b.

Bij de uitvoering van de Mannich-type additie werden 1,1 equivalenten

N-(difenylmethyleen)glycine ester 3a of 3b gedeprotoneerd door behandeling met 1,1

equivalenten LiHMDS en dit gedurende één uur bij -78 °C in THF. Daarna werd

α-chloor-N-(p-tolueensulfinyl)aldimine 4a of 4b toegevoegd, tevens bij -78 °C en verder


20

geroerd gedurende 15 minuten bij deze temperatuur. Het reactiemengsel werd ten slotte met

een verzadigde (aq.) NH4Cl-oplossing gequencht bij -78 °C.

Opzuivering door middel van kolomchromatografie en omkristallisatie in diethylether,

leverde de overeenstemmende enantiomeer zuivere syn-additieproducten 5a, 5b en 5c in hoog

rendement (60-84%). De syn-additieproducten zijn immers kristallijn terwijl de

anti-derivaten, aanwezig als minor verbinding in de reactiemengsels, onder de vorm van oliën

voorkomen.

OR3

O

N

Ph

Ph1,1 equiv.

1) 1,1 equiv. LiHMDS, -78 °C, 1 u

2) 1 equiv. , -78 °C, 15 min

3) NH4Cl (aq.)

R1

ClR1

H

NS

(S)

O

(R)(R)

O

OR3

N Ph

Ph

Cl

R1

R1

NHS(S)

5a (R1 = Me, R3 = Et) (84%, dr 99:1)

5b (R1 = Me, R3 = Me) (60%, dr 99:1)

5c (R1 = Et, R3 = Et) (79%, dr 99:1)

3a (R3 = Et)

3b (R3 = Me)

4a (R1 = Me)

4b (R1 = Et)O

THF

3.1.3 Ontscherming van de additieproducten 5a en 5b (reactieweg A)

De ontscherming van de difenylmethyleengroep op het Nα-atoom van de γ-chloor-α,β-diamino

esters 5 dient selectief te gebeuren om zodoende in een latere stap een specifiek α-geacyleerd

derivaat te kunnen bekomen. Zoals voorafgaand onderzoek heeft uitgewezen is de selectieve

Nα-ontscherming van deze γ-chloor-α,β-diamino esters mogelijk door gebruik te maken van

trifluorazijnzuur (TFA).15

De γ-chloor-α,β-diamino esters 5a en 5b werden opgelost in een hoeveelheid aceton waaraan

half zoveel water werd toegevoegd. Het mengsel werd daarna hevig geroerd tot een heldere

suspensie bekomen werd waaraan vijf equivalenten TFA toegevoegd werden. Daarna werd 15

minuten geroerd en vervolgens werd de pH van het reactiemengsel op

pH = 10 gebracht door toevoeging van NH4OH (aq.). Nadat deze pH-correctie uitgevoerd

werd, werden de gewenste ontschermde diamino esters 7 als zuivere producten bekomen via


21

extractieve opwerking en chromatografische scheiding van het gevormde benzofenon als

nevenproduct. De ontscherming van 5a en 5b verliep met behoud van de stereochemie en in

hoog rendement (74-90%).

(R)(R)

O

OR3

N Ph

Ph

Cl

NHS(S) 1) 5 equiv. TFA

aceton/H2O (2:1), kt, 15 min

2) NH4OH (tot pH = 10)(R)

(R)

O

OR3

NH2Cl

NHS(S)

7a (90%, dr 99:1)7b (74%, dr 99:1)

5a (R3 = Et, dr 99:1)

5b (R3 = Me, dr 99:1)

O

O

3.1.4 Acylering van de α-aminogroep van de γ-chloor-α,β-diamino esters

7a en 7b (reactieweg A)

De gevormde γ-chloor-α,β-diamino esters 7a en 7b met vrije α-aminofunctie werden

geacyleerd met het oog op de verdere transformatie naar een specifiek α-geacyleerd

trans-α,β-diamino-γ-lacton.

Er werden twee methoden gebruikt waarbij enerzijds acylchloriden 8 worden geëvalueerd als

acylerend reagens en andezijds een gehalogeneerd vetzuur 9d als koppelingspartner wordt

onderzocht.

Uit de literatuur bleek de Schotten-Baumannkoppelingsreactie door te gaan met hoge

efficiëntie bij de synthese van een aantal N-acyl homoserine lactonen.47

Deze

koppelingsreactie werd uitgevoerd door eerst het ontschermde additieproduct 7a of 7b op te

lossen in dichloormethaan waarna één equivalent Na2CO3, opgelost in een gelijke hoeveelheid

water, toegevoegd werden. Er werd één minuut geroerd waarna het acylchloride 8 toegevoegd

werd. Het mengsel werd daarna gedurende twee uur geroerd bij kamertemperatuur. De

geacyleerde additieproducten 10a-c werden na opwerking en omkristallisatie in een matig tot

goed rendement bekomen (32-73%). De stereochemie werd tijdens de koppelingsreactie

behouden.


22

(R)(R)

O

OR3

NH2Cl

NHS(S)

1 equiv. Na2CO3

1 equiv.

H2O/CH2Cl2 (1:1), kt, 2 u

R4

O

Cl

(R)(R)

O

OR3

HNCl

NHS(S)

10a (R3 = Et, R4 = Hexyl) (73%, dr 99:1)

10b (R3 = Me, R4 = Hexyl) (32%, dr 99:1)

10c (R3 = Et, R4 = Fenyl) (72%, dr 99:1)

7a (R3 = Et, dr 99:1)

7b (R3 = Me, dr 99:1)

8a (R4 = Hexyl)

8b (R4 = Fenyl)O O

O

R4

Een tweede methode die getest werd, start met het oplossen van een vetzuur, hier

2-broomhexaanzuur 9d, in ethylacetaat bij 0 °C waaraan N,N’-dicyclohexylcarbodiimide als

koppelingsreagens werd toegevoegd. Het mengsel werd tien minuten geroerd waarna 0,8

equivalenten van het ontschermde additieproduct 7a, opgelost in ethylacetaat, over een

periode van tien minuten toegedruppeld werden. Na deze toevoeging werd de reactie

gedurende 16 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na opwerking werd het geacyleerde product

10d bekomen in 51% rendement als mengsel van twee diastereomeren (dr 1:1). Het diamino

ester 10d met een gebromeerde vetzuurzijketen wordt beschouwd als precursor voor

gefunctionaliseerde AHL-analoga met potentiële QS-modulerende eigenschappen.52,53,54

OH

O

Br

1) 1 equiv. DCC, 0 °C, 10 min

2) 0,8 equiv. , 0 °C, 10 min

EtOAc, kt, 16 u

(R)(R)

O

OEt

HNCl

NHS(S)

O

9d

7a (dr 99:1)

10d (51%, dr 1:1)

(R)(R)

O

OEt

NH2Cl

NHS(S)O O

Br


23

3.1.5 Vorming van β,γ-aziridino-α-amino esters 37a en 37b uitgaande van

de α-geacyleerde γ-chloor-α,β-diamino esters 10a en 10b

(reactieweg A)

Uit het onderzoek bleek dat de directe omlegging van het α-geacyleerde γ-chloor-α,β-diamino

ester 10a tot het lacton 11a onder invloed van HCl, in analogie met de omleging van

aziridinen 6,15

onmogelijk was. De chloridesubstituent in γ-plaats bleek een te slechte ‘leaving

group’ te zijn voor deze omlegging en de reactiviteit van een gespannen aziridinering bleek

noodzakelijk te zijn.

Cl

(R)

NHS(S)O

(R)

O

OEt

HN

O

0.5M HCl in H2O/EtOAc (4:1)

kt, 30 min

O

(R)

(R)

O

NH

OH2NHCl.

10a 11a

X

Derhalve werd eerst geprobeerd de transformatie tot het overeenkomstig aziridine te

bewerkstelligen door middel van de sterke base LiHMDS. Het α-geacyleerde

γ-chloor-α,β-diamino ester 10a werd opgelost in THF en de oplossing werd afgekoeld tot

0 °C. Daarna werd LiHMDS toegevoegd en twee uur geroerd waarna tenslotte gequencht

werd met een verzadigde (aq.) oplossing NH4Cl. Deze reactie resulteerde echter in de

vorming van enamide 41 in een rendement van 63% na kolomchromatografie.


24

1) 2 equiv. LiHMDS, 0 °C, 2 u

THF

2) NH4Cl (aq)

41 (63%)10a (dr 99:1)

(R)(R)

O

OEt

HNCl

NHS(S)O

O

(Z)

O

O

HN

O

HN

S(S)O

O

OEt

NH

N

SO

H

O

HBase

O

O

HN

O

N

SO

NH4Cl (aq.)

37a

Door behandeling van γ-chloor-α,β-diamino ester 10a met LiHMDS werd in eerste instantie

het aziridine 37a gevormd, maar dit aziridine werd opnieuw gedeprotoneerd in α-plaats wat

resulteerde in ringopening met vorming van enamide 41. Dergelijke reactiviteit was tijdens

voorafgaand onderzoek ook al vastgesteld bij de behandeling van de overeenkomstige

N-tosyl β,γ-aziridino-α-amino esters met een sterke base.49

In overeenstemming met de

ringsluiting van de syn-γ-chloor-α,β-diamino esters 5,15

werden de α-geacyleerde

γ-chloor-α,β-diamino esters 10a en 10b opgelost in aceton waarna K2CO3 als mildere base

toegevoegd werd. De suspensie werd hevig geroerd bij refluxtemperatuur gedurende 48 uur.

Na filtratie, indampen van het solvent en kolomchromatografie werden aziridinen 37a en 37b

beiden in een rendement van 74% en met behoud van stereochemie bekomen.


25

3 equiv. K2CO3

aceton, , 48 u

(R)(R)

O

OR3

NH

N

S(S)O

37a (74%, dr 99:1)37b (74%, dr 99:1)

H

10a (R3 = Et, dr 99:1)

10b (R3 = Me, dr 99:1)

(R)(R)

O

OR3

HNCl

NHS(S)O

O O

3.1.6 Omlegging van β,γ-aziridino-α-amino ester 37a tot α-geacyleerd

trans-α,β-diamino-γ-lacton 11a (reactieweg A)

De omlegging van een β,γ-aziridino-α-amino ester 6 tot een trans-α,β-diamino-γ-lacton 12

werd reeds beschreven in voorafgaand onderzoek.15

De omlegging van β,γ-aziridino-α-amino

ester 37a werd op analoge wijze onderzocht voor de synthese van α-geacyleerd trans-α,β-

diamino-γ-lacton 11a.

Bij de uitvoering van de ringtransformatie werd β,γ-aziridino-α-amino ester 37a opgelost in

ethylacetaat waarna vier maal het volume van een 0,5M HCl-oplossing in water werd

toegevoegd. De oplossing werd dan 30 minuten geroerd bij kamertemperatuur waarna de

ethylacetaat ingedampt werd en het reactiemengsel met diethylether gewassen werd. Het

bekomen poeder na indampen werd vervolgens opgezuiverd via omkristallisatie in droge

methanol/droge diethylether aanleiding gevend tot het beoogde α-geacyleerd trans-α,β-

diamino-γ-lacton 11a in een rendement van 55%.


26

0.5M HCl in H2O/EtOAc (4:1)

kt, 30 min

(R)

N

S(S)O

(R) NHH

O O

Et

(R)

N

(R)

NHH

O O

Et

H H

Cl

HCl

H2O

(R)(R)

O

OEt

NH

N

S(S)O

O

(R)

(R)

O

NH

OH2NH HCl.

O

OO

37a (dr 99:1)

37a (dr 99 :1)

11a (55%)

3.1.7 Vorming van β,γ-aziridino-α-amino esters 6a en 6c via een

intramoleculaire nucleofiele substitutie (reactieweg B)

De synthese van β,γ-aziridino-α-amino ester 6a verliep analoog aan de synthese van

γ-chloor-α,β-diamino esters 5. Hierbij werd echter pas gequencht na twee uur reactie bij

kamertemperatuur waardoor het γ-chloor-atoom als ‘leaving group’ reactief genoeg was voor

een intramoleculaire nucleofiele substitutiereactie.15

Bij de synthese van β,γ-aziridino-α-amino ester 6a werden dus 1,1 equivalenten

N-(difenylmethyleen)glycine 3a gedeprotoneerd met 1,1 equivalenten LiHMDS en dit

gedurende één uur bij -78 °C in THF. Daarna werd α-chloor-N-(p-tolueensulfinyl)aldimine 4a

toegevoegd, tevens bij -78 °C en verder geroerd gedurende 30 minuten bij deze temperatuur.

Het reactiemengsel werd daarna naar kamertemperatuur gebracht en na twee uur roeren bij

kamertemperatuur werd tenslotte met een verzadigde (aq.) NH4Cl-oplossing gequencht. Na

opwerking en kolomchromatografie werd syn-β,γ-aziridino-α-amino ester 6a bekomen in een

rendement van 51% (dr 99:1).


27

OEt

O

N

Ph

Ph1,1 equiv.

1) 1,1 equiv. LiHMDS, -78 °C, 1 u

2) 1 equiv. ,-78 °C, 30 min kt, 2 u

THF

3) NH4Cl (aq)

Cl

H

NS

(S)

O

(R)(R)

O

OEt

N Ph

Ph

N

S(S)O

H

6a (51%, dr 99:1)3a

4a

(R)(R)

O

OEt

N Ph

Ph

Cl

NS

(S)

O

Uit voorafgaand onderzoek is eveneens gebleken dat syn-additieproduct 5a via een

intramoleculaire nucleofiele substitutie kan ringgesloten worden tot het overeenkomstige

azirdine 6a in goed rendement.15

Op analoge wijze werd de synthese van β,γ-aziridino-α-

amino ester 6c uitgevoerd. Voor de ringsluiting werd additieproduct 5c behandeld met K2CO3

in aceton onder refluxcondities en dit gedurende 48 uur. Na affiltreren van K2CO3 en

opwerking via kolomchromatografie werd β,γ-aziridino-α-amino ester 6c bekomen met

behoud van stereochemie en in uitstekend rendement (94%).

3 equiv. K2CO3

aceton, , 48 u

5c (dr 99:1) 6c (94%, dr 99:1)

N

(R)

S(S)O

(R)OEt

O

N

Ph

Ph

H

(R)(R)

O

OEt

N Ph

Ph

Cl

NHS(S)O


28

3.1.8 Omlegging van β,γ-aziridino-α-amino esters 6a en 6c tot trans-α,β-

diamino-γ-lactonen 12a en 12c (reactieweg B)

Zoals eerder aangehaald werd de synthese van trans-α,β-diamino-γ-lacton 12a uitgaande van

β,γ-aziridino-α-amino ester 6a reeds beschreven in voorafgaand onderzoek.15

Op analoge

wijze werd de synthese van trans-α,β-diamino-γ-lacton 12c (R1 = Et) in deze scriptie

uitgevoerd.

β,γ-Aziridino-α-amino ester 6c werd hiertoe opgelost in in ethylacetaat en behandeld met een

0,5M HCl-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na extractieve opwerking

om organisch oplosbare bijproducten te verwijderen werd het trans-α,β-diamino-γ-lacton 12c

bekomen na omkristallisatie uit droge methanol/droge diethylether in een rendement van

84%.

(R)(R)

O

OEt

N Ph

Ph

N

R1

S(S)O

H 0,5M HCl in H2O/EtOAc (4:1), kt, 30 min

O

(R)(R)

O

NH2.HClH2N

R1

R1HCl.

6a (R1 = Me, dr 99:1)

6c (R1 = Et, dr 99:1)12a (83%)12c (84%)

R1

3.1.9 Acylering van trans-α,β-diamino-γ-lacton 12a (reactieweg B)

Het gesynthetiseerde trans-α,β-diamino-γ-lacton 12a werd vervolgens aan een Schotten-

Baumannkoppelingsreactie met hexanoylchloride 8a onderworpen. In de literatuur werden

reeds Schotten-Baumannkoppelingsreacties van het HCl-zout van (S)-(-)-α-amino-γ-

butyrolacton 15 aan acylchloriden beschreven.47

In dit laatste geval bevat het lacton echter

slechts één vrije amino-groep en er zal dus aandacht besteed moeten worden aan de

regioselectiviteit van de koppelingsreactie van diaminolacton 12a.

Eerst werd trans-α,β-diamino-γ-lacton 12a in dichloormethaan opgelost, vervolgens werden

drie equivalenten Na2CO3 in water toegevoegd en 15 minuten geroerd om het HCl-zout van

trans-α,β-diamino-γ-lacton 12a vrij te stellen. Ten slotte werd één equivalent

hexanoylchloride 8a toegevoegd.


29

O

(R)(R)

O

NH2.HClH2NHCl.

1) 3 equiv. Na2CO3, kt, 15 min

2) 1 equiv. , kt, 2 u

O

Cl

O

(R)(R)

O

HNNH

38a (49%)

8a

12a

OO

H2O/CH2Cl2 (1:1)

De Schotten-Baumannkoppelingsreactie van trans-α,β-diamino-γ-lacton 12a met

hexanoylchloride 8a bleek na twee uur reactie echter zonder regioselectiviteit het dubbel

geacyleerde lacton 38a te leveren in een rendement van 49%. Wellicht wordt het mono-

geacyleerde product sneller geacyleerd dan geneutraliseerd lacton 12a omdat het

waarschijnlijk beter oplosbaar is in het organisch solvent waardoor een dubbele acylering

makkelijker zal plaatsvinden. Het rendement van 49% ligt hierbij dicht in de buurt van het, in

dit geval, maximum haalbare rendement van 50%.

3.2 Synthese van N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen

De synthese van dit type N-acyl homoserine lactonen met een extra 3-ketofunctie in de

vetzuurstaart werd reeds beschreven in de literatuur.50

Twee vertegenwoordigers van deze

N-acyl homoserine lactonen werden gesynthetiseerd volgens een in de literatuur beschreven

procedure.

Daarna werden de bekomen verbindingen gedibromeerd op het koolstof-atoom tussen de twee

carbonylfuncties in de vetzuurstaart met het oog op hun verdere evaluatie als QS-modulators.

Hiervoor werd een in de literatuur beschreven methode voor halogenering van

β-dicarbonylverbindingen geëvalueerd.51

3.2.1 Synthese van N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen 16a en 16b

De synthese van N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen 16a en 16b begon met het oplossen

van octaanzuur 9a of decaanzuur 9b, in dichloormethaan. Aan deze oplossing werd

achtereenvolgens Meldrum’s zuur 14, het koppelingsreagens N,N’-dicyclohexylcarbodiimide

(DCC) en 4-dimethylaminopyridine (DMAP) toegevoegd. Dit mengsel werd gedurende 18

uur geroerd waarna het gefiltreerd werd om het als nevenproduct gevormde

dicyclohexylureum (DCU) te verwijderen. Na indampen van de gefiltreerde oplossing werd

N,N-dimethylformamide toegevoegd als solvent, waarna het hydrobromidezout van


30

(S)-α-amino-γ-butyrolacton 15 toegevoegd werd. De bekomen oplossing werd vier uur

geroerd bij 60 °C. Na kolomchromatografie werd N-β-ketoacyl-L-homoserine lacton 16a

(ODHL) in 43% rendement bekomen, terwijl 16b (OdDHL) werd bekomen in 37%

rendement. Deze rendementen zijn conform de literatuur waar rendementen van 40-50%

beschreven werden.50

OH

O

( )n

1) 1 equiv.

1.1 equiv. DCC

1.1 equiv. DMAP

CH2Cl2, kt, 18 u

2) 1 equiv.

DMF, 60 °C, 4 u

O

(S)O

H2NHBr.

O

( )n

O

NH

(S) O

O

9a (n = 6)9b (n = 8) 15

16a (43%) (ODHL)16b (37%) (OdDHL)

O

O

O

O 14

3.2.2 Dibromering van N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen 16a en 16b

Een procedure voor de halogenering van β-dicarbonylverbindingen uit de literatuur werd

toegepast op AHL-derivaten 16 met aanpassing van de reactietijd en het aantal equivalenten

NaOBr.51

De gevormde N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen 16a en 16b werden gedibromeerd omdat

in een aantal studies aangetoond werd dat gedibromeerde N-(β-ketoacyl)-L-homoserine

lactonen een tussenschakel vormen in de metabolische degradatie van 3-oxo-N-acyl

homoserine lactonen door haloperoxidase enzymen. Een aantal organismen gebruiken de

halogenering van 3-oxo-N-acyl homoserine lactonen als defentiemechanisme tegen bacteriële

biofilmvorming.52,53,54

De natriumhypobromietoplossing werd vers aangemaakt door broom langzaam toe te

druppelen aan 2M NaOH (aq.) bij 0 °C. De N-(β-ketoacyl)-L-homoserine lactonen 16a en 16b

werden opgelost in aceton waarna azijnzuur toegevoegd werd. Deze oplossing werd afgekoeld

tot 0 °C en vervolgens werden zes equivalenten van de natriumhypobromietoplossing

druppelgewijs toegevoegd waarna het reactiemengsel twee uur geroerd werd. Na


31

kolomchromatografie werd het gedibromeerde lacton 17a (diBr-ODHL) bekomen in 50%

rendement terwijl lacton 17b (diBr-OdDHL) bekomen werd in 49% rendement.

O

( )n

O

NH

(S) O

O

6 equiv. NaOBr in H2O

aceton/azijnzuur (5:2), 0 °C, 2 u

O

( )n

O

NH

(S) O

OBr Br

16a (n = 6)16b (n = 8)

17a (50%) (diBr-ODHL)17b (49%) (diBr-OdDHL)

3.3 Synthese van 4-chloorthreonine-analoga

Aangezien 4-chloorthreoninederivaten aanzienlijke aandacht genieten in diverse toepassingen,

zoals in de literatuurstudie beschreven, werd geprobeerd om nieuwe 3,3-dimethyl-

gesubstitueerde analoga van 4-chloorthreonine te synthetiseren via aldolcondensatie van

ethyl-N-(difenylmethyleen)glycinaat 3a aan α-chloorisobutyraldehyde 18a.

3.3.1 Synthese van ethyl-[5-(2-chloor-2-propyl)-2,2-difenyloxazolidin-4-

yl]carboxylaat rac-43

Bij de optimalisatie van de aldolcondensatie werden 1,1 equivalenten

N-(difenylmethyleen)glycine 3a gedeprotoneerd door behandeling met een aantal

equivalenten LiHMDS en dit gedurende één uur bij -78 °C in THF. Het aantal equivalenten

LiHMDS werd gevarieerd om te kijken of dit een invloed heeft op de ratio van de gevormde

producten. Daarna werd α-chloorisobutyraldehyde 18a toegevoegd, tevens bij -78 °C en

verder geroerd gedurende een bepaalde tijd bij deze temperatuur. Vervolgens werd het

reactiemengsel al dan niet verder gereageerd bij kamertemperatuur en gequencht met een

verzadigde waterige NH4Cl-oplossing.

In tabel 1 worden de resultaten van deze optimalisatie weergegeven waarbij de verhoudingen

tussen de verschillende reactieproducten bepaald werden via LC-MS analyse van de

reactiemengsels.

In een eerste reactie (Tabel 1, nr. 1) werd de aldolcondensatie uitgevoerd door gebruik te

maken van 1,1 equivalenten LiHMDS. Het reactiemengsel werd eerst drie uur geroerd bij

-78 °C gevolgd door 15 uur roeren bij kamertemperatuur waarna gequencht werd met een

verzadigde (aq.) NH4Cl-oplossing. Onder deze condities werd volgens LC-MS analyse vooral

α-amino-β-hydroxy-γ-lacton rac-45 gevormd ten gevolge van spontane ringsluiting van

adduct 19a via reactieweg b tot epoxide rac-44 en verdere ringtransformatie via O-alkylering.


32

In een tweede poging (Tabel 1, nr. 2) werd hetzelfde aantal equivalenten LiHMDS gebruikt

als in de eerste. Het reactiemengsel werd eerst vijf minuten geroerd bij -78 °C gevolgd door

18 uur roeren bij kamertemperatuur. Hierbij werd het α,β-onverzadigde lacton 46 gevormd via

dehydratatie van lacton rac-45.

Een derde reactie (Tabel 1, nr. 3) werd uitgetest waarin opnieuw 1,1 equivalenten LiHMDS

gebruikt werden en eerst 15 minuten geroerd bij -78 °C gevolgd door tien minuten bij

kamertemperatuur. Onder deze condities werd opnieuw vooral α-amino-β-hydroxy-γ-lacton

rac-45 gevormd maar ook een aanzienlijke hoeveelheid van het oxazolidine rac-43 bleek

aanwezig te zijn.

Het zou mogelijk zijn om oxazolidine rac-43 te gebruiken bij de synthese van foldameren.

Een aantal analoge trans-2-oxazolidinonen werden reeds aangewend als

foldamere bouwsteen.56

In de literatuur werden een aantal analoge trans-imidazolidinen

gesynthetiseerd via een 1,3-dipolaire cyclo-additie van N-(benzylideen)glycine ester enolaten

aan N-sulfinyl aldiminen in de aanwezigheid van een Lewiszuur.55

Ook de synthese van

overeenkomstige 2-oxazolidinonen en oxazolinen werd reeds beschreven.55,56

Omdat het reduceren van de reactietijd bij kamertemperatuur een toename oplevert van de

vorming van oxazolidine rac-43, werd besloten om de reactie verder niet meer op te warmen

naar kamertemperatuur.

In een vierde reactie (Tabel 1, nr. 4) werd nog steeds gebruik gemaakt van 1,1 equivalent

LiHMDS en werd er 15 minuten geroerd bij -78 °C. Onder deze reactiecondities werd vooral

oxazolidine rac-43 gevormd, naast een significante hoeveelheid α-amino-β-hydroxy-γ-lacton

rac-45.

Om de invloed van het aantal equivalenten LiHMDS na te gaan werd de voorgaande reactie

herhaald met twee equivalenten LiHMDS (Tabel 1, nr. 5). Onder deze reactiecondities bleek

er meer oxazolidine rac-43 en minder α-amino-β-hydroxy-γ-lacton rac-45 gevormd te zijn

dan bij het gebruik van 1,1 equivalent LiHMDS. Uit dit reactiemengsel kon oxazolidine

rac-43 na kolomchromatografie bekomen worden in 20% rendement.


33

Ten slotte werd een reactie getest (Tabel 1, nr. 6) die analoog verliep als de voorgaande maar

nu bij -90 °C. De verhouding tussen de voornaamste producten oxazolidine rac-43 en

amino-β-hydroxy-γ-lacton rac-45 is vrij gelijkaardig als voor de twee voorgaande condities.

Na kolomchromatografie werd oxazolidine rac-43 bekomen in 6% rendement.

Uit de bekomen resultaten valt te concluderen dat uit het aldol-additieproduct 19a van

N-(difenylmethyleen)glycine 3a aan α-chloorisobutyraldehyde 18a ofwel het oxazolidine-

anion 42 (reactieweg a) ofwel het epoxide rac-44 (reactieweg b) gevormd wordt op

reversibele wijze. Uit het epoxide rac-44 wordt na omlegging, onder invloed van het

vrijgestelde chloride, α-amino-β-hydroxy-γ-lacton rac-45 gevormd op irreversibele wijze. Dit

α-amino-β-hydroxy-γ-lacton rac-45 ondergaat bij kamertemperatuur een eliminatiereactie van

water waarbij α,β-onverzadigd-α-amino-γ-lacton 46 gevormd wordt waardoor het

thermodynamisch evenwicht in de richting van rac-45 en 46 komt te liggen en waardoor de

concentratie oxazolidine rac-43 na quenchen lager ligt dan wanneer gequencht na 15 minuten

bij -78 of -90 °C.

OEt

O

N

Ph

1) LiHMDS, -78 °C, 1 u

2) 1 equiv.

temperatuur, tijdTHF

Cl

H

O

O N

OH

OPh

Ph

3a 18a

rac-45 46

O

O

O

N

Ph

Ph

rac-44

O N

OPh

Ph

O N

O

OEt

Cl

O

N

O

OEt

Cl

Ph

PhM

a

bM

rac-43

O NH

O

OEt

Cl

Cl

45 5 4

19a rac-42

NH4Cl (aq.)

NH4Cl (aq.)a

b

-H2O

Ph

1,1 equiv.


34

Tabel 1. Overzicht van de aldol-type reactie van α-chloorisobutyraldehyde 18a met

N-(difenylmethyleen)glycine 3a.

Nr. Equiv. LiHMDS

Temperatuur en tijd rac-

43a

rac-

44a

rac-

45a

46a Rendement van

rac-43

1 1,1 -78 °C, 3 u → kt, 15 u 27% 3% 53% 17% -

2 1,1 -78 °C, 5 min → kt, 18 u - 5% 32% 63% -

3 1,1 -78 °C, 15 min → kt, 10 min 39% 3% 56% 2% -

4 1,1 -78 °C, 15 min 65% 1% 34% - -

5 2 -78 °C, 15 min 69,6% 0,3% 30,1% - 20%

6 2 -90 °C, 15 min 64,2% 0,4% 35,5% - 6%

apercentages in deze tabel werden bepaald via LC-MS analyse

Er kan aangenomen worden dat de substituenten op plaats vier en vijf in oxazolidine rac-43

trans-gepositioneerd zijn ten opzichte van elkaar omdat de koppelingsconstante

3JH4-H5 = 4,95 Hz en de

1H NMR chemische shift van H5 (4,35 Hz) in hetzelfde bereik liggen

als sterk gerelateerde trans-2-oxazolidinonen 47a en 48a.57

Hierbij kan opgemerkt worden dat

deze trans-2-oxazolidinonen 47 en 48 een sp2-gehybridiseerd koolstofatoom bevatten in de

ring terwijl oxazolidine rac-43 enkel uit sp3-gehybridiseerde atomen bestaat, wat de

ruimtelijke structuur beïnvloedt.

HN O

O

HN O

O

O

MeO

trans-47a

O

MeO

cis-47b

HN O

O

O

HO

HN O

O

O

HO

cis-48btrans-48a

4 5 4 5

4 5 4 5

O O

Tabel 2: 1H NMR gegevens van 2-oxazolidinonen 47 en 48

trans-47aa cis-47b

a trans-48a

b cis-48b

b

3JH4-H5 5 8,5 5 9,2

δ H5 4,47 4,69 4,67 4,91

a 1H NMR analyse met CDCl3 als solvent

b 1H NMR analyse met DMSO-d6 als solvent


35

Om de invloed van het tegenion (lithium) te onderzoeken werd de reactie herhaald mits

toevoeging van ZnCl2.58

Na deprotonering van ethyl-N-(difenylmethyleen)glycinaat 3a met

LiHMDS, werden 1,1 equivalenten ZnCl2 toegevoegd waarna 15 minuten geroerd werd bij

-78 °C voor transmetalering alvorens α-chloorisobutyraldehyde 18a toe te voegen. Op deze

wijze kon, na kolomchromatografie, ethyl-[5-(2-chloor-2-propyl)-2,2-difenyloxazolidin-4-

yl]carboxylaat rac-43 bekomen worden in 33% rendement. Het belang van ZnCl2 situeert zich

waarschijnlijk in de extra stabilisatie van het intermediair gevormde gemetaliseerde

oxazolidine rac-42.

OEt

O

N

Ph

Ph1,1 equiv.

1) 1,1 equiv. LiHMDS, -78 °C, 1 u

2) 1,1 equiv. ZnCl2, -78 °C, 15 min

3) 1 equiv. ,-78 °C, 15 min

THF

4) NH4Cl (aq)

Cl

H

O

rac-43 (33%)3a

18a

O NH

O

OEt

Cl

3.3.2 Ontscherming van ethyl-[5-(2-chloor-2-propyl)-2,2-

difenyloxazolidin-4-yl]carboxylaat rac-43

Het cyclisch 4-chloorthreoninederivaat rac-43 werd onderworpen aan een behandeling met

een 0,5M HCl-oplossing. Hierbij werd een analoge omlegging verwacht zoals bij de

β,γ-aziridino-α-amino esters 6 maar dan hier met vorming van het overeenkomstige α-amino-

β-hydroxy-γ-lacton. Dit type omlegging vond echter niet plaats en enkel de beschermende

benzofenoniminegroep van het additieproduct rac-43 werd gehydrolyseerd wat het ethyl-2-

amino-4-chloor-3-hydroxy-4-methylpentanoaat hydrochloride rac-20 in 91% rendement

opleverde na omkristallisatie in droge methanol/droge diethylether.

0,5 equiv. HCl in H2O/EtOAc (4:1)kt, 30 min

Cl

OH

NH2.HCl

O

OEt

rac-43 rac-20 (91%)

O NH

O

OEt

Cl


36

In verder onderzoek dient de N-acylering en ringsluiting van ester rac-20 naar het

overeenkomstige N-acyl β-hydroxy-γ-dimethyl gesubstitueerde homoserine lacton te worden

bestudeerd.

3.4 Asymmetrische synthese van β,γ-aziridino-α-amino esters

In voorafgaand onderzoek werd reeds de synthese van een

(2S,3R)-3-(N-tosylamino)azetidine-2-carbonzuurderivaat 53 beschreven.15

Dit (2S,3R)-3-(N-tosylamino)azetidine-2-carbonzuurderivaat 53 werd efficiënt

gesynthetiseerd startende van een Mannich-type additie tussen een α-chloor-N-(p-

tolueensulfinyl)aldimine 4a en een N-(difenylmethyleen)glycine 3a. Wanneer deze Mannich-

type additie werd uitgevoerd met LDA als base bij -90 °C, leverde dit selectief het

anti-γ-chloor-α,β-diamino ester 49 op. Na ringsluiting onder basische omstandigheden tot het

overeenkomstige anti-β,γ-aziridino-α-amino ester 50, werd de p-tolueensulfinylgroep van dit

aziridine 50 geoxideerd naar een p-tolueensulfonylgroep met behulp van mCPBA. Reductie

van de difenylmethyleengroep van anti-aziridine 51 en de daaropvolgende regioselectieve

intramoleculaire ringopening van de β,γ-aziridinering via nucleofiele aanval van het Nα-atoom

door verhitting in acetonitril onder microgolf (MW) omstandigheden leverde het (2S,3R)-3-

(N-tosylamino)azetidine-2-carbonzuurderivaat 53 op. Alle pogingen om de N-tosyl groep van

azetidine 53 te splitsen kenden echter geen succes.15

In dit gedeelte zal onderzocht worden of de synthese van chirale aziridinen en azetidinen

mogelijk is door een Mannich-type additie tussen een chiraal α-chloor-N-(tert-

butaansulfinyl)aldimine 4c en een N-(difenylmethyleen)glycine 3a, met speciale aandacht

voor de enantio- en diasteroselectiviteit van de Mannich-type additie.


37

N

Ph

Ph

N

S

(S)O

H

OEt

O

(S)(R)

(R)

N

Tos

(S)

N

H

Ph

Ph

OEt

O

(R)

N

Tos

(S)

HN

H

Ph

Ph

OEt

O

N (S)(R)

Ph

Ph

COOEt

NH

Tos

OEt

O

N

Ph

Ph

3a

Cl

H

NS

(S)

O

4a

1) LDA, THF

2)

THF, -90 °C, 5 min(R)

(S)

O

OEt

N Ph

Ph

Cl

NHS

(S)O K2CO3 in aceton

mCPBA

NaCNBH3CH3CN, 120 °C

MW

49 50

515253

3.4.1 Vorming van β,γ-aziridino-α-amino ester 6d via een

intramoleculaire nucleofiele substitutie

Bij de synthese van β,γ-aziridino-α-amino ester 6d werden 1,1 equivalenten

N-(difenylmethyleen)glycine 3a gedeprotoneerd met 1,1 equivalenten LiHMDS en dit

gedurende één uur bij -78 °C in THF. Daarna werd α-chloor-N-(tert-butaansulfinyl)aldimine

4c toegevoegd, tevens bij -78 °C en verder geroerd gedurende 30 minuten bij deze

temperatuur. Het reactiemengsel werd vervolgens naar kamertemperatuur gebracht om

ringsluiting naar het overeenkomstige aziridine 6d te bevorderen. Na twee uur roeren bij

kamertemperatuur werd tenslotte met een verzadigde (aq.) NH4Cl-oplossing gequencht.59

Het

zuivere anti-β,γ-aziridino-α-amino ester 6d (dr 99:1) werd in 49% bekomen na opwerking en

kolomchromatografie.


38

1) 1,1 equiv. LiHMDS, -78 °C, 1u

2) 1 equiv. , -78 °C, 30 min kt, 2u

THF

3) NH4Cl (aq.)

N

(S)(R)

O

OEt

S(R)

N

Ph

Ph

Cl

H

NS

(R)

O

O

HOEt

O

N

Ph

Ph

6d (49%, dr 99:1)

1,1 equiv.

3a

4c

Uit de structuur die bekomen werd na X-stralen diffractie analyse (Prof. R. Sillanpää,

Department of Chemistry, University of Jyväskylä, Finland) van het kristallijne β,γ-aziridino-

α-amino ester 6d bleek dat het gesynthetiseerde aziridine 6d, het (RS,2R,2′S) ethyl-2-(1-tert-

butaansulfinyl-3,3-dimethylaziridin-2-yl)-2-(difenylmethyleenamino)acetaat 6d was

(Figuur 1). De stereochemie van dergelijke anti-aziridinen is in principe gunstig voor de

synthese van de overeenkomstige trans-azetidinen, die ook onderzocht werd.


39

Figuur 1: Kristalstructuur van aziridine 6d.

3.4.2 Reductie van de difenylmethyleenaminogroep tot de

difenylmethylaminogroep van het aziridine 6d

De reductie van de difenylmethyleenaminogroep van het N-(tert-butaansulfinyl)aziridine 6d

werd uitgevoerd met het oog op de verdere ringtransformatie naar het azetidine 22d. Er werd

uitgegaan van de veronderstelling dat het vrije elektronenpaar van het Nα-atoom na reductie

reactief genoeg zou zijn om onder microgolfomstandigheden een intramoleculaire

substitutiereactie te bewerkstelligen.

Hierbij werd aziridine 6d opgelost in methanol waarna één equivalent azijnzuur en twee

equivalenten van het reductans NaCNBH3 toegevoegd werden. Daarna werd het mengsel zes

uur geroerd bij kamertemperatuur. Na opwerking werd het zuivere (RS,2R,2′S) ethyl-2-(1-tert-

butaansulfinyl-3,3-dimethylaziridin-2-yl)-2-(difenylmethylamino)acetaat 21d bekomen in

80% rendement (dr 99:1).

(S)

NS(S)

O

(R)

O

O N

H

6d


40

N

(S)(R)

O

OEt

S(R)

N

O

H2 equiv. NaCNBH31 equiv. AcOH

MeOH, kt, 6 u

N

(S)(R)

O

OEt

S(R)

HN

O

H

21d (80%, dr 99:1)6d (dr 99:1)

(S)

N

(R)

Ph

Ph

OEt

O

HN

S(R) O

22d

Ph

Ph

Ph

Ph

Vervolgens werden een aantal pogingen ondernomen om aziridine 21d om te leggen naar het

overeenkomstige azetidine 22d (Tabel 3). In een eerste poging werd het aziridine 21d

opgelost in methanol en gedurende 30 minuten bij 70 °C geroerd met behulp van de

microgolfreactor, hierbij vond er echter geen reactie plaats (Tabel 3, nr. 1). Bij een tweede

poging in de microgolfreactor werd aziridine 21d opnieuw opgelost in methanol waarna het

reactiemengsel tien minuten geroerd werd bij 120 °C (Tabel 3, nr. 2). Na afloop werd terug

vastgesteld dat er geen reactie had plaatsgevonden.

Ten slotte werd gekozen om een reactie onder drastischere omstandigheden uit te proberen.

Hierbij werd aziridine 21d opgelost in ethanol waaraan één equivalent Et3N w

synthese van nieuwe n-acyl homoserine lacton analoga met ......faculteit bio-ingenieurswetenschappen...

Documents