suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri i fosfa i de
TRANSCRIPT
UNIVERSITATEA TEHNICĂ ldquoGHEORGHE ASACHIrdquo DIN IAŞI
Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Florina-Daniela Ivan (Cojocaru) Conducător de doctorat Prof Dr Ing Ionel Marcel Popa
IAŞI 2019
Cuprins
PARTEA TEORETICĂ
Introducere 1
Capitolul 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru
regenerarea osoasă
4
11 Ţesutul osos Structură Fiziologie Patologie 4
111 Funcțiile țesutului osos 4
112 Structura ţesutului osos 6
1121 Matricea extracelulară 7
1222 Celulele țesutului osos 8
113 Fiziologia ţesutului osos 9
1131 Osteogeneza și osteoliza 10
1132 Creşterea osului 11
1133 Remodelarea osului 12
114 Patologia osoasă 13
1141 Tumori osoase 13
12 Metode de tratament a defectelor osoase 16
121 Metode actuale de tratament a defectelor osoase 16
1211 Grefe osoase biologice 16
1212 Grefe osoase și substituienți sintetici 18
122 Ingineria tisulară și regenerarea osoasă 20
1221 Biomateriale utilizate la realizarea de suporturi pentru regenerarea osoasă 21
12211 Biopolimeri 21
12212 Polimeri sintetici 28
12213 Biomateriale cermice 30
1222 Suporturi biomimetice pentru ingineria tisulară şi regenerarea osoasă 33
12221 Caracteristici ale suporturilor pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă
33
12222 Metode de obținere a suporturilor pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă
34
12223 Suporturi biomimetie pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
pentru regenerarea osoasă
37
13 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice pentru regenerarea osoasă
39
131 Suporturi magnetice cu biopolimeri 41
1311 Suporturi magnetice cu proteine 41
1312 Suporturi magnetice cu polizaharide 45
132 Suporturi magnetice cu polimeri sintetici 46
133 Suporturi magnetice pe bază de biomateriale ceramice 49
1331 Sticle ceramice bioactive 49
1332 Fosafați de calciu 51
14 Concluzii 51
PARTEA EXPERIMENTALĂ
Capitolul 2 Materiale şi metode experimentale 53
21 Strategie experimentală Obiective 53
22 Materiale utilizate 55
221 Materiale utilizate pentru prepararea suporturilor 55
222 Materiale utilizate pentru caracterizarea suporturilor 56
23 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
61
231 Obţinerea particulelor magnetice 61
232 Obținerea suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de
particule magnetice
61
233 Program experimental 62
24 Metode de caracterizare 65
241 Caracterizarea structurală a suporturilor 65
2411 Analiza prin Spectroscopia icircn infraroşu cu transformată Fourier (FTIR) 65
2412 Spectroscopia de raze x prin dispersie de energie (EDS) 65
2413 Difracţie cu raze X (XRD) 66
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor 67
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM) 67
2422 Micro computer-tomografia (microCT) 68
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor 68
244 Propritățile magnetice ale suporturilor 70
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic 71
246 Studii de degradare enzimatică in vitro 72
247 Teste de citotoxicitate in vitro 76
2471 Testul MTT 78
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 79
248 Teste de citotoxicitatea in vivo 80
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
81
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi 82
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază
de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și
fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
83
31 Obţinerea suporturilor 85
32 Rezultate și discuții 86
321 Structura chimică a suporturilor 86
322 Compoziția suporturilor 87
323 Morfologia suporturilor 90
324 Proprietăţi magnetice 91
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 92
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 94
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 96
3271 Testul MTT 96
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 97
33 Concluzii 99
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
100
41 Obținerea suporturilor 100
42 Rezultate și discuții 103
421 Structura chimică a suporturilor 103
422 Morfologia suporturilor 105
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 106
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 108
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat 108
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat 109
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 110
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor 112
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro 113
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor 114
43 Concluzii 117
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
119
51 Obţinerea suporturilor 119
52 Rezultate și discuții 122
521 Structura chimică a suporturilor 122
522 Compoziția suporturilor 123
523 Morfologia suporturilor 124
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor 127
525 Proprietăţilor magnetice ale suporturilor 128
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 129
527 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 130
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat 130
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat 131
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 132
5281 Testul MTT 133
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 133
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor 134
53 Concluzii 139
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
141
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
141
611 Obținerea suporturilor 142
612 Rezultate şi discuţii 143
6121 Structura chimică a suporturilor 143
6122 Morofologia suporturilor 144
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 146
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 146
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor 147
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 148
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
150
621 Obținerea suporturilor 152
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor 152
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină 154
624 Rezultate și discuții 155
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor 156
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
158
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 160
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale 161
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
162
63 Concluzii 164
Concluzii generale 165
1
Introducere
Introducere
Impactul clinic cacirct şi cel economic pentru tratamentul afecţiunilor osoase este uluitor osul
fiind al doilea cel mai transplantat ţesut după transfuziile de sacircnge Numeroase metode de
reconstrucţie a defectelor osoase sunt disponibile icircn practica clinică fiind utilizate autogrefe
alogrefe matrice osoasă demineralizată materiale metalice sau ceramice proteine osoase
morfogenetice factori de creştere și altele Succesul acestor materiale este icircnsă unul limitat
fiecare din ele prezentacircnd dezavantaje considerabile Icircn icircncercarea de a oferi o soluție pentru
rezolvarea problemei menționate tot mai mulți cercetători și-au icircndreptat atenția spre realizarea
de noi materiale pentru ingineria tisulară și regenerarea țesutului osos materiale cu proprietăți și
interacțiuni controlabile Aceste materiale se găsesc sub diverse forme de prezentare suporturi
poroase tridimensionale sisteme injectabile capsule filmemembrane și matrici fibroase și
nano-fibroase hidrogeluri
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă constă icircn rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea
unui material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și
regenerare osoasă ar putea fi un suport compozit poros cu incluziune de particule magnetice
Principalul motiv pentru care se optează pentru un suport compozit este acela că osul natural la
racircndul său este un compozit matricea extracelulară a țesutului osos fiind reprezentată de 60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă
Particulele magnetice care urmează a fi incluse icircn suporturi vor fi funcționalizate cu diferiți
bio-agenți factori de creștere medicamente cu efect chimioterapic icircn vederea unei eliberări
țintite ale principiilor active enumerate Unul din marele dezavantaje ale chimioterapiei efectele
adverse asupra stării generale a pacienților ar putea fi astfel icircnlăturat medicamentele acționacircnd
controlat doar la locul tumori osoase
Obiectivul central al tezei de față vizează obținerea unor astfel de suporturi pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice Cele mai importante
proprietățile impuse unor astfel de suporturi sunt biocompatibilitate lipsa toxicității proprietăți
de suprafață adecvate incluziuni și proliferării celulare osteoconductivitate osteoinductivitate
rata de degradare controlată proprietăți mecanice comparative cu cele ale osului natural etc De
2
Introducere
asemenea foarte important este ca suportul să fie biomimetic icircn vederea integrării adecvate icircn
osul gazdă
Teza de față este structurată icircn două secțiuni principale stadiul actual al cercetărilor icircn
domeniul vizat și rezultate originale
Prima secțiune sintetizează date de literatură și este reprezentată de primul capitol A doua
secțiune este formată din 5 capitole capitolul 2 prezintă materialele și metodele utilizate pentru
obținerea rezultatelor originale prezentate icircn capitolele 3 4 5 și 6
Capitolul 1 prezintă pe scurt date despre anatomia fiziologia și patologia țesutului osos
deoarece fără cunoșterea acestor noțiuni ar fi imposibil de realizat un suport care să permită
regenerarea adecvată a țesutului osos Capitolul cuprinde informații despre materialele deja
utilizate icircn practica clinică pentru regenerarea osoasă și variantele aflate icircn stadiul de cercetare
fiind prezentate pe scurt o parte din cele mai utilizate biomateriale icircn domeniul vizat O atenție
deosebită este acordată suporturilor biomimetice prin prezentarea caracteristicilor acestora
metodelor de obținere a acestora și a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
După un studiu amănunțit a suporturilor magnetice realizate și caracterizate pacircnă icircn prezent icircn
literatura de specialitate s-a realizat o clasificare a acestora icircn funcție de biomaterialele de bază
utilizate icircn sinteza acestora
Capitolul 2 redă inițial strategia experimentală și obiectivele lucrării de față după care sunt
enumerate caracteristicile principale ale materialelor utilizate pentru prepararea suporturilor și a
celor utilizate pentru caracterizarea acestora De asemenea sunt prezentate etapele procesului de
preparare a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule
magnetice precum și metodele de caracterizare a suporturilor obținute Sub capitolul Metode de
caracterizare evidențiază principiile de bază ale tehnicilor folosite condițiile de lucru parametrii
și dispozitivile utilizate
Capitolul 3 a avut drept scop principal realizare și caracterizarea unor suporturi compozite
folosind patru combinații diferite de biopolimeri și trei concentrații diferite de nanoparticule
magnetice Icircn urma analizei structurii chimice a suporturilor a compoziției și morfologiei
acestora a proprietăților magnetice precum și a interacțiunii suporturilor cu fluide de interes
biologic enzime și celule se vor stabili biopolimerii și concentrația de nanoparticule ce vor fi
utilizate icircn capitolele următoare
3
Introducere
Un program experimental s-a utilizat pentru a obține 13 suporturi pe bază de colagen
chitosan acid hialuronic și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată capitolul 4 prezentacircnd prepararea și caracterizarea acestora Pe lacircngă analizele realizate
pentru suporturile din capitolul 3 s-au analizat și proprietățile mecanice ale celor 13 suporturi
precum și citotoxicitate lor in vivo ultimul experiment menționat avacircnd o durată de 21 zile
Același program experimental și aceeași compoziție a suporturilor a fost utilizată și pentru
prepararea suporturilor descrise icircn capitolul 5 diferența fiind dată de faptul că particulele au fost
icircncorporate sub formă de suspensie coloidală Morfologia acestor suporturi a fost studiată icircn
detaliu cu ajutorul tehnicii microCT iar testele de toxicitate in vivo realizate pe aceași specie de
animale utilizate icircn capitolul anterior a avut o durată de mai mare de 64 zile
Capitolul 6 este structurat icircn două părți Prima parte prezintă reproductibilitatea metodei de
preparare a suporturilor iar a doua parte studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircntr-o primă etapă suporturile au fost iradiate cu o doza
unică de raze X administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase fiind analizată apoi
influența radiațiilor asupra proprietăților fizico-chimice și biologice a suporturilor A doua etapă
a studiului a constat icircn icircncărcarea nanoparticulelor incluse icircn suporturi cu doxorubicină
(medicament utilizat icircn practica clinică pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor
osoase) urmată de caracterizarea suporturilor obținute
Lucrarea se icircncheie cu un capitol de concluzii generale și bibliografia cosultată pentru
realizarea acesteia
4
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice pentru regenerarea osoasă
Osul este un țesut conjuctiv specializat dinamic care este suspus unui proces de
remodelare continuă pe parcursul vieții Are rolul atacirct de țesut cacirct și de organ funcțiile sale de
bază fiind de protecție a organelor vitale din cavitatea craniană toracică și a măduvei spinării de
suport a sistemului locomotor Matricea extracelulară a țesutului osos are o componentă organică
și o component anorganică iar celulele țesutului osos sunt osteoblastele osteocitele celulele de
suprafață și osteoclastele Din punct de vedere morfologic osul este fie spongios (trabecular) fie
compact (cortical) Țesutul osos spongios este asociat cu funcțiile metabolice iar țesutul osos
compact este asociat cu rezistența mecanică [1]
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta aceste
defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare Chiar dacă decenii icircntregi autogrefele
au fost utilizate cu precădere dezavantajele acestora au condus la cercetări riguroase pentru
fabricarea unor grefe osoase realizate din biomateriale (polimeri materiale ceramice materiale
metalice) Ingineria tisulară combină cu succes principiile biologiei țesutului osos și principiile
disciplinelor inginerești contribuind la consolidarea pierderilor osoase prin intermediul unor
matrici numite suporturi [2] Icircncorporarea unor sisteme de eliberarea controlată de principii
biologice icircn interiorul suporturilor vor conduce la rezultate remarcabile Nanoparticulele
magnetice funcționalizate pot fi un exemplu de astfel de sisteme
11 Ţesutul osos Structură Fiziologie Patologie
Țesutul osos este un organ foarte important pentru organismul viu Formarea sa este
moderată de mecanisme centrale și locale prin intermediul cărora este remodelat constant icircncă
din viața intrauterină și pe tot parcursul vieții pentru menținerea arhitecturii sale
microstructurale Procesul de remodelare este coordonat de activitățile osteoblastelor și
osteoclastelor care la racircndul lor sunt reglementate de procesele fiziologice de la nivel tisular și
de răspunsul la stimuli biomecanici
5
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
111 Funcțiile țesutului osos
Osul oferă protecție unor organe vitale și joacă de asemenea un rol important icircntr-o serie
de funcții fiziologice hematopoieză menținerea echilibrului acido-bazic funcția de rezervă
minerală funcția de suport a sistemului locomotor
Figura 11 Funcțiile țesutului osos [3]
Canalele medulare ale oaselor lungi găzduiesc celule stem mezenchimale capabile să se
diferențieze icircn precursorii hematopoietici care icircn cele din urmă dau naștere celulelor sanguine
mature
Icircn ceea ce privește menținere echilibrului acido-bazic oasele asigură organismului soluții
tampon carbonat și fosfat icircn timpul acidozei metabolice cronice proces observat icircn acidoza
renală tubulară și acidoza uremică Carbonatul de calciu este cel mai important dintre
componentele acestor soluții tampon asiguracircnd rezervorul de ioni de bicarbonat
6
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Din punct de vedere al rezervei de minerale țesutul osos este rezervorul a aproximativ
85 din fosforul din organism și 99 din calciu din organism
Osul are o rezistență mare la compresiune dar la forțe mari de tracțiune sau tensiune poate
fi fracturat Procentul mare de colagen din matricea organică (90 ) conferă un grad de
elasticitate considerabil țesutului osos dar cu toate acestea osul este un compozit casant [4]
112 Structura ţesutului osos
Țesutul osos este un material compozit format dintr-o matrice extracelulară şi din celule
proprii organizat pe cinci niveluri ierarhice (figura 12) macrostructura osului microstructura
osului sub-microstructura osului nanostructura osului și sub-nanostructura osului [5] [6]
Macrostructura osului este reprezentată de cele două tipuri de țesut osos compact icircntalnit
icircn literatură și sub denumirea de țesut osos cortical și spongios icircntalnit și sub denumirea de țesut
osos trabecular iar microstructura osului (10-500 microm) este reprezentată de componentele celor
două tipuri de țesuturi Țesutul osos cortical are o structură densă fiind format din sistemul
Haversian care la racircndul său este format dintr-un spațiu ce conține vase de sacircnge numit canal
haversian icircnconjurat de lamele osoase ce reprezintă sub-microstructura țesutului osos (1-10
microm) Țesutul osos spongios are o densitate mai mică decacirct a țesutului osos compact și este
format din spații areolare neregulate delimitate de trabecule osoase Spațiile areolare conțin
măduvă hematogenă bogată icircn sacircnge Icircn general țesutul osos compact reprezintă 80 din
sistemul osos dar distribuția celor două tipuri de țesut diferă icircn funcție de regiune
Figura 12 Organizarea structural ierarhică a osului [5]
7
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Nanostructura osului (cacircteva sute de nanometri ndash 1 microm) este reprezentată de fibrele de
colagen și de faza minerală iar sub-nanostructura osului (mai puțin de cacircteva sute de nanometri)
este reprezentată de structura moleculară a componentelor [7] [8]
1121 Matricea extracelulară
Matricea extracelulară este compusă dintr-o componenta organică ce reprezintă 33 din
masa uscată a matricei și o componenta anorganică ce reprezintă 67 din masa uscată a matricei
Componenta organică este formată icircn proporție de 90 din proteine colagenice
predominant colagen de tip I iar restul compoziției reprezintă proteine non-colagenice factori de
creștere și proteine morfogentice osoase Din proteinele non-colagenice regăsite icircn os fac parte
ostocalcina osteopontina fibronectina și sialoproteina osoasă II Osteocalcina cea mai
abundentă proteină non-colagenică din ţesutul osos reprezentacircnd 10-20 din cantitatea totală
are un rol important icircn procesul de mineralizare deoarece se leagă de cristalele de hidroxiapatită
[9] Osteopontina este o glicoproteină fosforilată icircntacirclnită icircn aproape toate ţesuturile
organismului uman piele creier fluidul sanguin cartilaj şi o varietate de tumori Osteonectina
este o glicoproteină bogată icircn cisteină care icircn procesul de mineralizare leagă colagenul de
hidroxiapatită avacircnd rolul unui nucleu de mineralizare reglacircnd formarea şi creşterea cristalelor
de hidroxiapatită [10] De asemenea icircn matricea organică au fost identificați glicozaminoglicanii
nesulfataţi (acid hialuronic) şi sulfataţi (condroitinsulfatul şi keratansulfatul)
Glicozaminoglicanii sulfataţi sunt legaţi covalent de molecule proteice formacircnd proteoglicani icircn
țesutul osos cei mai de icircntacirclniți fiind proteoglicani bogați icircn leucină cu masă moleculară mică
Componenta anorganică este reprezentată icircn cea mai mare parte din ioni de fosfat și ioni
de calciu Pe lacircngă acești ioni se găsesc icircntr-o cantitate considerabilă și bicarbonat sodiu
potasiu citrat magneziu carbonat fluor zinc bariu și stronțiu Ionii de calciu și fosfat formează
cristale de hidroxiapatită care se depun pe matricea colagenică proces icircn urma cărui rezultă
proprietățile de rezistență și rigiditate a țesutului osos [10] [11]
Matricea extracelulară osoasă constituie un cadru complex și organizat care oferă suport
mecanic și exercită un rol esențial homeostaza osoasă Matricea osoasă poate elibera mai multe
molecule care influențează activitatea celulelor osoase și prin urmare influențează procesul
complex de remodelarea osoasă Studiile icircn domeniu au indicat că doar pierderea masei osoase
8
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
este insuficientă pentru a provoca fracturi osoase alți factori inclusiv modificări ale proteinelor
matricei osoase au o contribuție colosală icircn producerea fracturilor osoase [12] [13]
1122 Celulele țesutului osos
Țesutul osos are icircn componență patru tipuri de celule osteoblaste osteoclaste osteocite și
celule de suprafaţă (figura 13)
Figura 13 Celulele țesutului osos
Osteoblastele celule localizate pe suprafața osului sunt derivate din celule stem
mezenchimale reprezentacircnd 4-6 din totalul de celule osoase Se găsesc icircn țesuturile tinere dar
apar și icircn condiții patologice Din punct de vedere morfologic sunt celule cu formă cubică de
dimensiuni mari (15-20 microm) ce prezintă caracteristici specifice celulelor implicate icircn sinteza
proteinelor reticulul endoplasmatic rugos și complexul Golgi ambele bine dezvoltate precum și
numeroase vezicule de secreție ce conțin precursori de matrice osoasă incluziuni lipidice și
mucopolizaharide Osteoblastele au un rol foarte important icircn procesul de formare al osului
Sinteza matricei osoase are loc icircn două etape depunerea matricei organice urmată de
mineralizarea acesteia Icircn etapa de depunere a matricei organice osteoblastele secretă proteine
colagenice non-colagenice și proteoglicani iar etapa a doua cea de mineralizarea a matricii
organice are o faza veziculară și o fază fibrilară [11]
Osteocitele sunt cele mai abundente celule osoase reprezentacircnd aproximativ 95 din
totalul acestora Sunt osteoblaste mature care ocupă spațiul lacunar fiind icircnconjurate de matrice
osoasă Ca și particularitate structurală osteocitele au prelungiri citoplasmatice asemănătoare
dendritelor neuronilor care formează o rețea de comunicare icircntre ele și suprafața osoasă Durata
9
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de viață a osteocitelor a fost estimată de Frost și colaboratorii [14] la 25 de ani dar acest lucru
nu poate fi apreciat cu exactitate deoarece procesul de remodelare osoasă presupune o reicircnnoire
a țesutului osos cu 4-10 pe an Icircn orice caz durata de viață a osteocitelor este cu mult mai
mare decacirct a osteoblastelor care au un ciclu de viață de aproximativ 3 luni Totodată nici rolul
osteocitelor nu este icircnțeles pe deplin numeroase studii concentracircndu-se pe asta [15]
Osteoclastele denumite și macrofagele ţesutului osos sunt celule multinucleate
diferențiate din celule stem hematopoetice sub influența a numeroși factori cum ar fi factorul de
stimulare a coloniilor de macrofage (M-CSF) și factorul de legătură nucleic kappa-B (RANKL)
M-CSF este secretat de celulele mezenchimale osteoprogenitoare și de osteoblaste iar RANKL
este secretat de osteoblaste osteocite și celule stromale Acești factori susțin activarea
transcripției expresiei genice icircn osteoclaste Osteoclastele conţin următoarele enzime fosfatază
acidă protează enzime oxidoreducătare ale glicolizei datorită cărora au o activitate enzimatică
intensă şi fagocitară Resorbţia osului nemineralizat (osteoidul) nu este realizată de osteoclaste
ci de elemente macrofagice histiocitare Osteoclastele intra icircn stare de repaus cacircnd formarea
osului definitiv este terminată Celulele redevin active icircn caz de fractura cacircnd are loc formarea
calusului [11] [8]
Celulele de suprafaţă sau bordantă sunt celule ce acoperă suprafeţele osoase icircn locurile
unde nu are loc nici resorbția nici formarea osoasă doua etape importante ale procesului de
remodelare osoasă Din punct de vedere structural sunt celule cu nucleu turtit o citoplasmă care
se extinde pe suprafața osoasă și doar cacircteva organite citoplasmatice cum ar fi aparatul Golgi
sau reticulul endoplasmatic rugos Funcțiile acestor tipuri de celule nu sunt pe deplin icircnțelese dar
studiile icircn domeniu susțin ideea că aceste celule au un rol important icircn prevenirea interacțiunii
directe dintre osteoblaste și matricea osoasă și totodată participă la procesul de diferențiere a
osteoclastelor
113 Fiziologia ţesutului osos
Pe parcursul icircntregii vieţii osul este supus proceselor biologice complexe procese de
creştere icircn lungime şi grosime modelare şi remodelare La racircndul lor la baza acestora stau
procesul de osteogenză ce constă icircn producerea de țesusut osos și osteoliză ce constă icircn
distrucția de țesut osos [8]
10
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1131 Osteogeneza și osteoliza
Osteogeneza este procesul de formare a osului osteoblastele fiind elementele esențiale icircn
acest proces Funcţionalitate osteoblastelor este controlată de molecule semnal hormoni factori
de creştere şi citokine [10] Pe scurt osteogeneza are trei pași de bază sinteza matricei
extracelulare organice (osteoid) mineralizarea matricei ce conduce la formarea osului și
remodelarea osului prin procesele de resorbție și reformar [16] Prin acţiunea concentrată a
moleculelor semnal osteoblastele produc icircntr-o primă etapă toate componentele matricei
organice a ţesutului osos ce va fi eliberată pe icircntreaga suprafaţă sub forma de osteoid
nemineralizat Pe seama precursorilor preluaţi din mediul extracelular se realizează după
modelul sintezei proteice sinteza matricei organice Concomitent cu producerea de matrice
organică are loc procesul de mineralizare a acestei ce reprezintă legarea substanţei anorganice de
matricea proteică o legatură particulară icircntre sărurile minerale şi proteină fiind realizată icircn urma
acestui proces La procesul mineralizării contribuie numeroşi factori locali şi generali un rol
cheie fiind jucat de factorii inhibitori naturali ioni de magneziu citrați pirofosfați și nucleotide
Icircn țesuturile conjuctive nemineralizate factorii anterior enumerați au o concentrație superioară
comparativ cu țesuturile conjuctive mineralizate Icircn cazul țesutului osos fosfataza alcalină
secretată de osteoblaste distruge parțial acești factori făcacircnd posibil procesul de mineralizare
Procesul de osteoliză ce corespunde distrucției osoase este atribuit osteoclastelor Procesul
icircncepe cu demineralizarea matricei osoase urmată de hidroliza enzimatică a componentelor
organice formacircndu-se zone de eroziune osoasă Pentru realizarea resorbţiei osteoclastul trebuie
să adere la o suprafaţă osoasă şi să formeze compartimentul subosteoclastic Icircnsă suprafeţele
osoase au o peliculă fină de matricea extracelulară nemineralizată acoperită de un strat de
osteoblaste icircntre care se stabilesc joncţiuni distanţate icircngreunacircnd fixarea osteoclastelor pe
suprafeţe osoase Osteoblastele au receptori pentru parathormon și 125-dihidroxicolecalciferol
prin stimularea cărora are loc restricția osteoblastelor urmată de eliberarea suprafeței osoase Prin
cuplarea substanțelor stimulante cu receptori specifici se declanșează sinteza de activator al
plasminogenului și sinteza de colagenază latentă urmate de activarea colagenazei latente de
către plasmină Activarea colagenazei va avea drept consecință icircndepărtarea peliculei de matrice
nemineralizată continuacircnd cu atașarea osteoclastelor [8]
11
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1132 Creşterea osului
Creşterea osului icircntacirclnită și sub denumirea de organogeneză osoasă este etapa care
urmează procesului de osteogeneză normală avacircnd drept rezultat formarea osului și a
articulaţiilor Mai precis constă icircn formarea şi creşterea oaselor icircn lungime icircn grosime şi
asigurarea formei epifizelor Pentru fiecare element osos există un punct de osificare specific icircn
care icircncepe formarea osoasă la o anumită vacircrstă [17] Se poate vorbi de două tipuri de osificare
osificarea endoconjunctivă sau intramembranară și osificarea endocondrală
Osificarea intramembranară este caracterizată de invazia capilarelor icircn zona mezenchimală
și de diferențierea celulelor mezenchimale icircn osteoblaste mature care vor depozita matrice
osoasă conducacircnd la formarea de corpusculi osoși Acești corpusculi vor crește și se vor
dezovolta iar apoi vor fuziona cu alți corpusculi și vor forma trabecule ososase Pe măsură ce
trabeculele osoase cresc icircn dimensiune și icircn număr devin interconectate formacircnd o formă de țesut
osos Această formă de țesut osos este o structură fără rezistență dezorganizată și are un număr
mare de osteocite Osificarea intramembranară are loc icircn timpul dezvoltării embrionare și este
implicată icircn formarea oaselor plate din structura cutiei craniene unele oase faciale o parte din
mandibulă și claviculă și adăugarea de țesut osos nou la diafiza majorității oaselor
Osificarea endocondrală utilizează proprietățile funcționale ale cartilajului și osului pentru
a asigura un mecanism de formare și creștere a scheletului Combinarea condrogenezei și a
osteogenezei icircn vederea osificării osoase este dependent de nivelul de vascularizare a cartilajului
de creștere Icircn figura 14 sunt prezentate la general etapele procesului de osificare endocondrală
[18] Osificarea endocondrală are 6 etape Celule mezenchimale se vor concentra (A) și se vor
diferenția icircn condrocite formacircnd un cartilaj nevascularizat (B) Icircn centrul cartilajului format
condrocitele se vor opri din proliferare și vor deveni hipertrofice (C) Condrocitele din
vecinătatea celor hipertrofice se vor diferenția icircn osteoblaste acestea din urmă formacircnd un colier
osos (D) Icircn continuare condrocitele hipertrofice vor regla formarea de matrice mineralizată Icircn
același timp icircn această etapă are loc eliberarea de factori angiogenetici care vor atrage vase de
sacircnge după care condrocitele hipertrofice vor intra icircn apoptoză (E) Coordonarea osteoblastelor
și invazia vaselor de sacircnge vor avea drept rezultat formarea țesutului spongios primar
Condrocitele se vor prolifera icircn continuare și icircn același timp va avea loc vascularizarea osului
aceste două etape contribuind la creșterea icircn lungime a osului Osteoblastele din colierul osos vor
12
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
contribui la formarea osului cortical pe cacircnd cele din țesutul spongios primar vor contribui la
formarea țesutului spongios final (F)
Figura 14 Osificarea endocondrală [18]
1133 Remodelarea osului
Osul este un organ activ remodelat pe tot parcursul vieții Procesul de remodelare osoasă
cuprinde patru faze distincte ce se desfăşoară permanent icircn anumite locuri faza de repaus faza
de resorbţie osoasă faza de inversie şi faza de formare reprezentate schematic icircn figura 15 Icircn
faza de repaus suprafaţa ţesutului osos este acoperită de celule de suprafaţă ancorate icircn matricea
mineralizată Icircn faza de resorbţie osoasă rolul principal revine osteoclastelor care vor forma o
cavitate numită lacună de resorbţie (lacuna Howship) Resorbţia are loc icircn două etape
demineralizarea fazei osoase și distrugerea fazei osoase Icircn faza de inversie are loc apariția
osteoblastelor icircn zona erodată ce vor acoperi lacuna de resorbţie printr-o depozitare activă de os
nemineralizat osteoid Osteoidul se depune pacircnă cănd grosimea acestuia ajunge la 20 microm
urmacircnd faza de mineralizare Pe măsură ce osteoidul este mineralizat locul unde a avut loc
remodelarea va fi icircnlocuit cu un os nou [19]
13
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 15 Remodelarea ţesutului osos
114 Patologia osoasă
Patologia osoasă poate fi de cauza traumatică ndash fractură sau netraumatică Icircn funcţie de
cauza fracturii putem vorbi de fracturi determinate de un accident traumtic fracturi de oboseală
şi fracturi de os patologic Cauzele netraumatice care pot cauza o anumită patolgie osoasă sunt
infecţiile osului tumorile osului și deformaţiile osului [17]
1141 Tumori osoase
Icircn literatura de specialitate tumorile sunt icircntalnite și sub denumirea de neoplasme și se
definesc ca proliferări tisulare anormale autonome persistente neconcordante cu ţesuturile din
jur care se dezvoltă continuu chiar și după icircncetarea stimului care a determinat proliferarea și nu
răspund la mecanisme normale de control ce guvernează creştere Icircn funcție de caracteristicile
morfo-funcționale și de evoluția acestora tumorile se clasifică icircn tumori begine şi tumori
maligne Cele benigne sunt caracterizate prin margini bine definite au o creştere lentă şi locală
sunt neinvazive şi compresive circumscrise şi icircncapsulate prezintă mitoze rare nu diseminează
icircn alte ţesuturi şi organe (non-metastazante) avacircnd un prognostic bun Tumorile maligne sunt
14
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
caracterizate prin margini nedefinite au o creştere rapidă fiind infiltrative şi icircncapsulante
invazive şi distructive sunt metastazante şi au un prognostic rezervat
Metastazarea reprezintă răspacircndirea celulelor maligne din tumora primară icircn organele
ţesuturile sau cavităţile organismului Comună majorităţii cancerelor umane metastazarea
transformă o tumoră de organ icircntr-o boală sistemică Este un proces complex multistadial şi
dinamic avacircnd la bază o serie de procese subtile interconectate ce rezultă din interacţiunile
gazdei cu tumora Fiecare etapă metastatică este subiectul unor influenţe multiple indispensabile
celulei maligne pentru a supravieţui variaţiilor de mediu (prin dobandirea de noi mutaţii) ce icirci
permit acesteia să invadeze ţesuturile vecine să patrundă icircn sistemul circulator (calea majoră de
răspacircndire prin vasele de sacircnge şisau limfatice) să extravazeze icircn ţesuturi noi să dezvolte un
sistem vascular propriu care să icircicirc suţină dezvoltarea şi chiar uneori să permită metastazei să dea
naştere la noi metastaze [20] [21]
Figura 16 Clasificarea tumorilor osoase
15
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Domeniul de patologie osteoarticulară icircn care se icircncadrează şi tumorile osoase este un
domeniu foarte vast şi delicat nu este constant fiind adesea descoperite noi metode de
diagnostic şi tratament ce ameliorează sau chiar schimbă radical prognosticul multor tumori
osoase Una din principalele probleme icircn ceea ce priveşte diagnosticul şi tratamentul tumorilor
osoase este aceea că nu există o separare netă icircntre tumora benignă şi tumora malignă
Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) propune o clasificare a tumorilor osoase bazată pe
capacitatea de diferenţiere a acestora ceea ce icircnseamnă că sunt grupate din punct de vedere
histologic şi citologic al ţesutului pe care acestea icircl reproduce clasificare redată icircn figura 16
[22]
Metastazele sunt cele mai icircntalnite tumori din os Acestea sunt considerate tumori
secundare osoase deoarece tumora primară nu icircşi are originea icircn os tipurile de cancer care dau
cel mai frecvent metastaze osoase fiind cancerul de prostată cancerul de sacircn şi cancerul
pulmonar Tumorile osoase primare cum sunt osteosarcoamele sau condrosarcoamele sunt
destul de rare statisticile sugeracircnd că doar icircn 1 din 20 cazuri de tumori osoase este vorbă de o
tumoră primară Cea mai frecvent intalnită tumoră osoasă primară este mielomul cu celule
plasmatice ce apare la pacienţi cu vacircrstă peste 40 ani urmată de diverse sarcoame Dintre
sarcoamele osoase primare ce reprezintă 02 din toate neoplasmele cele mai comune sunt
osteosarcoamele ndash 35 condrosarcoamele ndash 25 sarcomul Ewing ndash 16 condroamele ndash 8 şi
histiocitoamele maligne fibroase ndash 5
Incidenţa tumorilor primare benigne este mai dificil de determinat deoarece nu se
realizează biopsie pentru toate leziunile nou descoperite Atacircta timp cacirct leziunile pot fi complet
caracterizate ca şi bengine pe baza datelor clinice şi imagistice biopsia sau rezecţia sunt
nepotrivite şi neadecvate Cele mai comune tumori osoase benigne sunt următoarele
osteocondroamele ndash 35 encondroamele ndash 20 tumorile cu celule gigante ndash 15 osteomul
osteoid ndash 10 şi displazia fibroasă (maladia Jaffeacute) ndash 5 Icircn ciuda caracterului benign al
tumorilor tratamentul acestora trebuie să fie cacirct mai eficient posibil De exemplu o tumoră cu
celule gigante extinsă icircn suprafaţa articulară tibială poate duce la o fractura patologică dacă nu
este tratată adecvat
Tratamentul fiecărei tumori osoase depinde de mai mulţi factori caracterul benign sau
malign localizarea leziunii istoricul afecţiunii nivelul durerii Icircn cazul tumorilor benigne
icircndepărtarea leziunea urmată de grefarea sau biopsia excizională conduc icircn general la rezultate
16
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
bune Totuşi aceste două metode de tratament pot fi inadecvate icircn cazul tumorilor maligne atacircta
timp cacirct celule tumorale reziduale rămacircn la marginea leziunii Limfoamele osoase pot fi tratate
cu chimioterapie sau radioterapie fără a fi necesară o intrevenţie chirurgicală Alte tumori cum
ar fi de exemplu osteosarcoamele convenţionale sunt supuse icircntr-o primă etapă chimioterapiei
sau radioterapiei cu scopul de a micşora masa tumorală următoarea etapă fiind rezecţia
chirugicală Condrosarcoamele sunt tratate doar chirurgical chimioterapia dovedindu-se
ineficientă Multe procese maligne sau procese benigne agresive pot fi tratate prin rezecţie
chirurgicală atacirct a tumorii cacirct şi a unei margini de ţesut normal sau icircn cele mai grave cazuri prin
icircndepărtarea totală a osului muşchiului sau altor ţesuturi afectate de tumoră [23]
12 Metode de tratament a defectelor osoase
Spre deosebire de alte ţesuturi osul are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn
cazul unor afecţiuni minore fără formare de cicatrici Icircn schimb icircn cazul fracturilor patologice
sau a celor grave precum şi icircn pierderi mari de ţesut osos ce pot conduce la defecte osoase
grave procesele de regenerare şi reparare proprii vor avea nevoie de support [24] Principalii
factori ce conduc la defecte osoase grave sunt rezecţia de tumoră osoasă malformaţiile
congenitale unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita După sacircnge osul
este al doilea cel mai transplantat organ anual fiind efectuate la nivel mondial aproximativ 22
milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă [25] Materiale de substituţie osoasă
pot fi clasificate icircn mai multe categorii după cum urmează grefe de origine naturală (autogrefe
alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria tisulară
precum şi diverse combinaţii ale acestora [26]
121 Metode actuale de tratament a defectelor osoase
1211 Grefe osoase biologice
Icircn funcție de originea lor grefele biologice se clasifică icircn xenogrefe alogrefe și autogrefe
[27] Xenogrefe prelevate de la o specie diferită de a primitorului au fost utilizate o scurtă
perioada de timp deoarece după cacircteva decenii de studii icircndelungate s-au dovedit a fi cele mai
puţin adecvate grefe [28] Alogrefele sunt utilizate pentru reconstrucţia unor defecte osoase
grave Astfel alogrefele se utilizează icircn timpul intervenţiilor de revizie a artoplastiilor totale
17
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
pentru reconstrucţia pierderilor osoase Alogrefele sunt prelevate fie de la pacienţi vii fie de la
cadavre Icircn cazul icircn care donatorii sunt pacienţi vii o sursă foarte utilizată este capul femural
alogrefele fiind preluate icircn acest caz icircn timpul intervenţiilor primare de artoplastie totală de şold
Icircn cazul icircn care alogrefele sunt preluate de la cadavre oasele lungi şi pelvisul sunt sursele cele
mai utilizate [29] Icircn tabelul 11 sunt prezentate principalele avantaje și dezavantaje ale celor trei
tipuri de grefe osoase biologice
Tabel 11 Principalele avantaje și dezavantaje ale autogrefelor alogrefelor și xenogrefelor [24]
Grefă
osoasă
biologică
Avantaje Dezavantaje
Autogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
osteoconductivitate și osteogenice
histocompatibilie
nu există risc de imunogenicitate
sau transmitere de boli infecțioase
durere la locul prelevării și
moartea patului donator
sursă limitată de
disponibilitate și cantitate
timpi chirurgicali mai mari
ce implică pierderi de sacircnge
posibile infecții
Alogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
și osteoconductivitate
nu apare problema morbidității
patului donator
ușor de manevrat
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
osteoinductivitate variabilă
pierderea proprietăților
biologice și mecanice
respinse icircn anumite regiuni
geografice datorită unor aspecte
religioase
cost crescut
Xenogrefe
proprietăți osteoinductive și
osteoconductive
cost scăzut
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
risc imunogenic crescut
rezultate slabe
Un tip specializat de alogrefe este reprezentat de matricea osoasă demineralizată (DBM)
DBM se obține prin extracția acidă a alogrefelor și conține colagen de tip I proteine
18
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
noncolagenice și un număr variabil de factori de creștere osteoconductivi (de exemplu proteine
morfogenetice osoase - BMP) Concentrația de DBM este direct proporțională cu
osteoinductivitatea DBM se poate folosi fie singură fie icircn combinație cu alte alogrefe sau cu
grefe sintetice [27]
Autogrefele sunt utilizate pentru refacerea defectelor osoase primitorul și donatorul fiind
aceași persoană Sunt utilizate icircntr-un număr mare de intervenţii chirurgicale ortopedice
stomatologice şi maxilo-faciale cu scopul de a spori şi grăbi regenerarea osoasă sau de a restaura
defectele osoase Creasta iliacă este locul de unde se prelevă cel mai frecvent autogrefe datorită
accesului uşor şi a unei bune calităţi De asemenea autogrefele se mai pot preleva din tibia
proximală femurul distal coaste radiusul distal Şi canalul intramedular al oaselor lungi poate
reprezenta o potenţilă sursă de autogrefe precum şi o sursă bogată de celule şi factori de creştere
[30] [31]
1212 Grefe osoase și substituienți sintetici
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din biomateriale
sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea celulelor osoase icircn timpul
procesului de regenerarea osoasă [26] O gamă variată de materiale sintetice sunt utilizate ca și
substituenți osoși metale cum sunt tantalul titanul fierul sau magneziul polimeri sintetici cum
sunt poli acidul lactic poli acidul glicolic poliuretani sau poli ε-caprolactona și ceramice sum
sunt sticlele bioactive fosfații de calciu sau sulfați de calciu hidratați Icircn timp dintre toate aceste
materiale cele mai potrivite s-au dovedit a fi cele pe bază de fosfați de calciu datorită asemănării
cu compoziția osului natural (ce conține mai mult de 60 fosfați de calciu)
Substituenți sintetice sunt disponibili fie sub formă de granule (majoritatea au un diametru
cuprins icircntre 01 și 5 mm) fie sub formă suporturi cu porozitate variabilă icircn funcție de diverse
aspecte ce țin de locul unde vor fi implantate perioada necesară refaceriiregenerării complete
etc De asemenea icircn practica curentă se folosesc și substituienți injectabili denumiți adesea
cementuri un mare avantaj ala acestora fiind tehnica de implantare minim invazivă
Resorbabilitatea este o caracteristică esențială a substituienților osoși fiind intens studiată
Icircn tabelul 12 sunt prezentate principalele clase de substiutuenți osoși utilizați icircn prezent precum
și mecanismele de resorbție ale acestora
19
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Tabel 12 Principale tipuri de substituenți osoși și mecanismul de resorbție al acestora [32]
Clasa de
Material Tipul de material Mecanismul de resorbție
Materiale
Ceramice
Bioglas Resorbţie limitată
Sulfat de calciu hemihidrat (CSH)
Gips
Sulfat de calciu dehidrat (CSD)
Solubilizare
Solubilizare şisau conversie icircn
apatită
Fosfat dicalcic (DCP)
Fosfat octocalcic (OCP)
β-Fosfat tricalcic (β-TCP)
Fosfat de calciu bifazic (BCP)
Cristale de hidroxiapatită
precipitate
β-Pirofosfat de caciu (β-CPP)
Mediat cellular
Hidroxiapatită sinterizată Nu se resoarbe
Materiale
Metalice
Magneziu (aliaj) Coroziune
Fier (aliaj) Coroziune
Tantal titan Nu se resoarbe
Polimeri
Poli acid lactic poli acid glicolic
Poli ε-caprolactona Hidroliză
Celuloză
Hialuronan
Fibrină
Colagen
Chitosan
Transport la ganglioni limfatici
Hialuronidază
Plasmină
Colagenază
Lizozim
Icircn mod ideal un substituent osos ar trebui să fie icircnlocuit icircn timp de țesust osos nativ fără
pierderea suportului mecanic oferit de acesta Icircn unele cazuri defectele osoase sunt stabilizate
utilizacircnd fixarea metalică neresorbabilă defectul osos propriu-zis fiind completat cu un
substituent osos Rata de resorbție a substituienților osoși poate fi controlată prin optimizarea
geometriei materialului Prezența unei rețele cu pori interconectați sau a unor canale icircn structura
sa este o caracteristică cheie a unui substituent osos regăsindu-se inclusiv la cementurile
20
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
injectabile Icircn cazul substituenților pe bază de polimeri rata de resorbție poate fi controlată prin
unele modificări chimice [32]
122 Ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Dezavantajele substituenților osoși sintetici au condus la necesitatea unei metode
alternative şi efective avacircnd drept scop principal regenerarea osoasă S-au evidenţiat
următoarele alternative a substituenţilor osoşi utilizarea factorilor de creştere osteogenici (cum
ar fi proteienele morfogenetice osoase ndash BMPs) suporturi osteoinductive terapia genică
utilizarea celulelor stem toate acestea reprezentacircnd componentele inginerie tisulare (figura 17)
Figura 17 Triada ingineriei tisulare și aplicarea produsului rezultat icircn procesul de
regenerarea al țesutului osos afectat de tumoriinfecții
Componentele ingineriei tisulare o matrice sau un suport celule și molecule semnal au
fost stabilite plecacircnd de la structura țesuturilor biologice [33]
Matricea sau suportul este componenta cheie a ingineriei tisulare Acționează iniţial ca un
suport temporar pentru adeziunea și creșterea celulară apoi are rol definitoriu pentru sinteza de
matrice extracelulară iar icircn ultimă etapă contribuie la formarea de neo-țesut [34]
21
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau regenerarea
ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor artificiale și a suporturilor
Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase sisteme injectabile capsule
filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri etc [35]
1221 Biomateriale utilizate la realizarea de suporturi pentru regenerarea osoasă
La realizarea suporturilor pentru regenerarea osoasă sunt utilizate mai multe tipuri de
biomateriale biopolimeri polimeri sintetici și biomateriale ceramice
Polimeri atacirct de origine naturală cacirct și sintetică sunt utilizați pentru o varietate de aplicații
biomedicale Din clasa polimerilor naturali sau bioplomeri fac parte polizaharidele proteine și
poliesteri proveniți atacirct din regnul vegetal cacirct și din regnul animal Biopolimeri sunt utilizați
icircntr-o multitudine de domenii industria alimentară industria farmaceutică (foarte des ca și
excipienți) la realizare unor proteze icircn sisteme de eliberare controlată de medicamente etc
Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul biologic fiind dirijați spre degradarea metabolică
Datorită similarității dintre polimerii naturali și matricea extracelulară (ECM) aceste materiale
nu vor provoca o reacție imunologică cronică sau toxică reacții deseori icircntalnite icircn cazul
utilizării polimerilor sintetici [36]
12211 Biopolimeri
Printre cei mai utilizați biopolimeri se numără colagenulgelatina acidul hialuronic
chitosanulchitină albumina serică bovină fibroina din mătase [37]
Colagenul
Colagenul ndash Col proteina cea mai abundentă din organismul uman se remarcă ca
biopolimer printr-o serie de proprietăţi precum biocompatibilitatea excelentă
biodegradabilitatea rezistenţa mecanică ridicată toxicitatea scăzută reacţii imunologice slabe
fiind unul din cele mai utilizate biomateriale icircntr-o varietate de aplicaţii medicale
Din punct de vedere al structurii chimice colagenul are structură de triplu helix
macromolecula de colagen fiind formată din trei lanţuri α răsucite icircmpreună de la stacircnga la
dreapta icircn jurul unui ax comun [38] Există mai multe tipuri de colagen fiecare tip avacircnd
22
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
particularității proprii de structură precum și localizare icircn organe specific icircn organism Nu se ştie
cu exactitate cacircte tipuri de colagen există Cel mai intalnit colagen icircn racircndul vertebratelor este
colagenul de tip I de aceea este și cel mai utilizat și studiat icircn diverse domenii
Figura 18 Structura colagenului
Poate fi prelucrat sub o mare varietate de forme filme fibre structuri poroase
nanoparticule şi microparticule atacirct singur cacirct şi icircn combinaţie cu alte materiale Deoarece
structura sa chimică permite combinarea colagenului cu factori de creştere sau alţi agenţi
bioactivi una din cele mai importante aplicaţii ale colagenului este utilizarea lui icircn sisteme de
eliberarea controlată de medicamente membrane de colagen pentru aplicaţii oftalmice structuri
poroase pentru răni şi arsuri diferite geluri etc Remarcabilă este și utilizarea colagenului icircn
ingineria tisulară pentru realizarea unor substituenţi pentru piele a unor substituenţi osoşi sau a
unor valve artificiale [39]
Icircn domeniul ingineriei repararării şi regenerării ţesutului osos colagenul a fost unul dintre
primele biomateriale studiate fiind totodată şi unul din cele mai utilizate materiale de cele mai
multe ori utilizat icircn combinaţie cu alţi biopolimeri şi fosfaţi de calciu sub diverse forme de
prezentare hidrogeluri injectabile membranefilme suporturi poroase microsfere nanosfere
Un hidrogel pe bază de colagen reprezintă un candidat excelent pentru icircncapsularea de celule
datorită capacității sale de umflare icircn apă proprietăților fizice adecvate (de exemplu proprietăți
mecanice capacitatea de gelifiere) conținutului ridicat de apă ce facilitează transportul și
difuzia proprietăților biologice excelente și sensibilitații la degradarea enzimatică [40] De
23
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
exemplu hidrogeluri conținacircnd diferite rapoarte masice chitosancolagenul au fost fabricate icircn
următoarele condiții de sinteză gelifiere inițiată de utilizarea β-glicerofosfat utilizarea unui
mediu osteogenic suplimentar și a unei baze slabe și temperatură variată Prezența colagenului icircn
hidrogel a fost asociată cu creșterea proliferării celulare hidrogelul a fost mai compact rezultacircnd
o matrice rezistentă [41]
Membrane resorbabile pe bază de colagen au fost utilizate icircn ingineria tisulară și
regenerarea osoasă ghidată deoarece de-a lungul timpului numeroase studii au arătat că acestea
sunt biocompatibile și sporesc rata de regenerare Acestea sunt fabricate prin tehnici diverse
fiind adesea utilizate alături de polimeri sintetici de exemplu poli (tetrafluoroetilienă)
Variantele comerciale cele mai icircntalnite de membrane pe bază de colagen utilizate icircn practica
clinică sunt Bio-Gidereg (GeistlichPharma AG Wolhusen Elveția) DuraMatrix-Onlaytrade ndash
membrană pe bază de colagen pentru repararea țesutului dura mater (Collagen Matrix Inc NJ
SUA) TenoMendtrade (Collagen Matrix Inc) OssiPatchtrade ndash membrană protectoare pe bază de
colagen pentru regenerarea osoasă (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) și Collatenetrade
Fibrillar Collagen ndash pansament utilizat pentru afecțiuni maxilo-faciale (Ace Surgical Supply Co
Inc MA SUA)
Suporturile poroase pe bază de colagen au icircn componența lor și particule ceramice icircn acest
fel icircncercacircndu-se o imitare a structurii osului natural Din variantele comerciale cele mai des
utilizate se pot aminti Collagrafttrade (Collagen Corp SUA) ndash care combină hidroxiapatită fosfa
tricalcic cu măducă osoasă de la pacinet și colagen de origine bovină OssiMendtrade Bone Graft
Matrix (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) ndash combină minerale osoase sub formă poroasă
cu colagen și INFUSEreg Bone Graft (Medtronic Sofamor Danek Inc USA) ndash care pe langă un
suport poros pe bază de colagen conțin protein morfogenetice umane recombinate (rhBMP-2)
[40]
Gelatina
Gelatina este un derivat denaturat al colagenului Polielectrolit amfoteric gelatina este un
amestec de fragmente de proteine solubile icircn apă avacircnd aceleaşi secvenţe de aminoacizi ca şi
colagenul structura sa chimică fiind redată icircn figura 19 Colagenul diferă de gelatină prin aceea
că are mai multe structuri terţiare fiind mai puţin solubil icircn soluţii apoase decacirct gelatin [42]
Gelatina poate fi fabricată din diverse surse sursa de provenienţă a gelatinei influențacircnd
24
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţile acesteia Cel mai adesea se fabrică din piele porcină (46) piele bovină (294)
sau oase de origine porcină sau bovină (231) [43] Gelatina este un polimer biodegradabil
biocompatibil non-antigenic are cost scăzut susţine adeziunea celulară migrarea diferenţierea
şi proliferarea celulară Un dezavantaj al acestei proteine este acela că are proprietăţi mecanice
slabe De aceea pentru a fi utilizat la realizarea unor matrici suport pentru ingineria tisulară icircn
special a ţesuturilor dure gelatina se utilizează icircmpreună cu alţi polimeri de exemplu chitosan
unele ceramic (hidroxiapatită fosfat tricalcic) etc [44] [45]
Figura 19 Structura chimică a gelatinei
Albumina serică bovină
Albuminile serice sunt cele mai abundente proteine din sistemul circulator pentru o mare
varietate de organism fiind principalele molecule complexe care contribuie la presiunea arterială
osmotică Datorită potențialului său antioxidant albumina are un rol esențial icircn prepararea
mediilor pentru culturi de celule de mamifere atacirct icircn domeniul cercetării cacirct și icircn domenii
comerciale [46]
Icircn domeniul ingineriei tisulare și domeniul medicinei regenerative albumina serică bovină
ndash BSA este una dintre cele mai studiate proteine din punct de vedere al interacțiunii cu
polizaharidele datorită stabilității sale semnificative a faptului că este ușor accesibilă are o
solubilitate bună icircn apă și datorită asemănării structurale și funcționale cu albumina serică umană
[47]
Icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos albumina serică bovină este utilizată icircn
sisteme complexe pe bază de materiale ceramice Un studiu care evidențiază influența utilizării
albuminei alături de materiale ceramice a fost publicat de Chew și colaboratorii care au
25
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
demonstrat că adăugarea unei concentraţii scăzute de albumină serică bovină este utilă deoarece
susţine creşterea cristalelor de fosfaţi de calciu fiind astfel utilă procesului de mineralizare a
ţesutului osos Icircn comparaţie o concentraţie mare de albumină inhibă cristalizarea fosfaţilor de
calciu [48] Această proprietate a albuminei serice bovine precum și cele menționate anterior a
făcut ca aceasta să fie utilizată de unii autori la sinteza de cimenturi pe bază de fosfaţi de calciu
[49] [50]
De asemnea această proteină a fost utilizată ca adjuvant icircn studii vizacircnd regenerarea
osoasă cu ajutorul unor microsfere hibride alături de poliacrilatalginat de calciu [51]
Fibroină din mătase
Fibroina din mătase produsă de viermi de mătase Bombyx mori este o proteină naturală
cu o foarte bună biocompatibilitate non-toxică biodegradabilă De asemenea prezintă
proprietăţi intrinseci remarcabile şi o bună rezistenţă mecanică Datorită proprietăţilor
menţionate icircn ultimii ani a avut loc o creştere a interesului pentru utilizarea fibroinei din mătase
la obţinerea de suporturi poroase tridimensionale Studii recente au dovedit capacitatea unor
suporturi tridimensionale pe bază de fibroină de a susţine proliferarea celulară icircn aplicaţii vizacircnd
ingineria tisulară a osului a cartilajului şi a vaselor de sacircnge [52]
Figura 110 Structura chimică a fibroinei din mătase
Chitosan
Chitosanul ndash Cs descoperit icircntamplător de către Rouget la mijlocul secolului al XIX lea
este una din cele mai utilizate polizaharide icircn ingineria tisulară şi regenerare osului Acesta este
obţinut din chitină polizaharid structural ce are rol analog cu cel al colagenului icircn regnul animal
superior şi al celulozei icircn plantele Plantele produc celuloză icircn pereţii plantelor iar insectele şi
crustaceele produc chitină icircn aripi respectiv scoici Prin deacetilarea icircntre 40 şi 100 a
chitinei rezultă un polimer format din unităţi de β-(1-4)-2-acetamino-D-glucoză (N-acetil-D-
26
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
glucozamină) şi β-(1-4)-2-amino-D-glucoză (N-D-glucozamină) Icircn afara diferenţei de structură
dintre chitină şi chitosan o altă diferenţă este dată de solubilitatea celor doi biopolimeri chitina
este insolubilă icircn solvenţii uzuali chitosanul dizolvacircndu-se icircn aceştia Structura sa unică
biocompatibilitatea proprietăţi fizico-chimice (solubilitatea biodegradabilitate) versatilitate icircn
termeni de prelucrare proprietăţi multidimensionale şi funcţionalitate icircnaltă fac ca acest
biopolimer să aibă o multitudine de aplicaţii icircntr-o gamă variată de domenii domeniul
biomedical industria farmaceutică industria cosmetică biotehnologii industria alimentară
agricultură şi protecţia mediului [53] [54]
Figura 111 Structura chimică a chitosanului
Icircn ceea ce privește utilizarea chitosanului icircn domeniul regenerării osoase sunt elaborate
studii complexe icircncă de acum cacircteva deceni Borah şi colaboratorii fiind primii care au
demonstrate potenţialul osteogenic al acestuia [55] Au urmat apoi Muzarelli şi colaboratorii care
au realizat studii publicate icircn anii 1993 şi 1994 remarcante din punct de vedere al proprietăţilor
de regenerare osoasă ale chitosanului [56]
Acid hialuronic
Acidul hialuronic ndash Hya este un mucopolizaharid ce face parte din clasa
glicozaminoglicanilor ndash GAG avacircnd cea mai simplă structură chimică din această clasă de
compuși biologici și fiind singurul glicozaminoglican nesulfatat Icircn organismul uman acidul
hialuronic se găseşte icircn lichidul sinovial umoarea vitroasă matricea extracelulară a ţesutului viu
iar icircn cea mai mare cantitate se regăsește icircn piele Hya este componentul principal al matricei
extracelulare a cartilajului articular acţionacircnd ca o ancoră pentru GAG sulfataţi din cartilaj [57]
27
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Este neramificat și inert din punct de vedere imunologic iar spre deosebire de alți GAG
este sintetizat ca un polizaharid liber și nu substituit la o miezul unei proteine [58] Structura
acidului hialuronic este reprezentată de unităţile dizaharidice polianionice acid D-glucoronic şi
N-acetil-D-glucozamină unite alternant prin legături β ndash 14 și β ndash 1-3 glicozidice (figura 112)
Figura 112 Structura acidului hialuronic
Hya se extrage adesea din surse de origine animală creastă de cocoș și umoare vitroasă de
origine bovină icircnsă procesul de izolare din aceste surse este dificil deoarece acesta formează
complexe stabile din punct de vedere chimic cu proteoglicani prezenți icircn țesutul animal fiind
foarte greu de controlat masa moleculară a acesti biopolimer Extragerea acidului hialuronic din
surse microbiene reprezintă o alternativă la metoda de extragere menționată anterior bacteriile
din familia Streptococcilor grupurile A și C producacircnd icircn mod natural o capsulă mucoidă de
acid hialuronic [59]
Icircn ciuda faptului că acidul hialuronic se găsește icircntr-o cantitate mică icircn matricea
extracelulară a ţesutului osos acest polimer este implicat icircn procesele biologice importante ale
osului Poate fi produs de osteoblaste şi osteoclaste fiind găsit şi icircn citoplasma celulelor
osteoprogenitoare și poate lega hidroxiapatita fără să afecteze dezvoltarea minerală Are un rol
important icircn osificarea endocondrală şi a platoului de creştere epifizar fiind găsit icircntr-o
concentraţie mare icircn zona condrocitelor hipertrofice Important de menționat este că acidul
hialuronic se găsește icircn concentraţie mare icircn calusul fracturilor nou formate [57]
28
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Alginații
Alginatul este un polimer anionic natural obținut din diverse specii de alge brune
(Phaeophyceae Laminaria hyperborea Laminaria digitata Laminaria japonica Ascophyllum
nodosum Macrocystis pyrifera) prin tratament cu soluții alcaline apoase cel mai adesea
utilizacircndu-se NaOH De-a lungul timpului a fost intens studiat fiind utilizat icircn prezent icircn
multiple aplicații biomedicale datorită proprietăților care le deține biocompatilitate toxicitate
scăzută costuri de obținere și procesare relativ scăzute [60]
Icircn literatură sunt prezentate rezultatele unor studii prinvind utilizarea alginatului la
fabricarea de suporturi pentru igineria tisulară [61] Hye-Lee și colaboratorii prezintă un studiu
cu privire la prepararea și caracterizarea de suporturi compozite pe bază de nano-hidroxiapatită
alginat și chitosan cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos [62] Icircntr-un alt studiu
Sharma și colaboratorii prezintă fabricare de suporturi nano-biocompozite a căror componente
sunt același ca icircn studiul publicat de Hey-Lee la care se adaugă gelatină procedeul de fabricare
al nano-biocompozitelor fiind unul complex [63]
12212 Polimeri sintetici
Două din cele mai mari avantaje ale polimerilor sintetici sunt reproductibilitate mare şi
posibilitatea de a fi fabricaţi pe scară largă De asemnea pot fi fabricați sub o gamă foarte variată
de forme Icircn comparație cu polimerii naturali este foarte important de menționat faptul că
polimerilor sintetici li se pot controla proprietăţile mecanice şi biodegradabilitatea icircnsă ridică
probleme deoarece nu au activitate biologică şi sunt foarte hidrofobi [64]
Poli (acidul lactic)
Poli (acidul lactic) ndash PLA este unul din cei mai utilizați polimeri sintetici datorită
proprietăților sale mecanice foarte bune fiind utilizat cu succes icircn diverse implanturi medicale
Datorită faptului că PLA are o viteză de degradare in vivo scăzută este cel mai adesea utilizat
pentru fixarea ososă [65] Deoarece prezintă doi carboni asimetrici PLA are trei forme izomerice
D(-)- PDLA L(+)-PLLA şi (DL)- PDLLA Ușurința icircn procesare cristalinitatea precum și viteza
de degradare depind de structura și compoziția lanțurilor polimerice icircn mod particular de
raportul izomerilor PLLA este considerat un homoplimer izotactic semicristalin avacircnd cea mai
mare temperatură de topire dintre cei trei izomeri ai PLA [66]
29
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 113 Structura PLA
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA este un copolimer al poli (acidului lactic) ndash PLA şi
al poli (acidului glicolic) ndash PGA Este utilizat la realizarea de produse farmaceutice și diverse
suporturi pentru ingineria tisulară fiind un polimer biocompatibil și biodegradabil [67]
Suporturile pentru inginerie tisulară pe bază de PLGA au avantajul de a fi degradate icircn mediul de
cultură celular produșii de degradare rezultați fiind lipsiți de toxicitate [68]
Figura 114 Structura PLGA
unde n ndash numărul de unităţi structural de acid lactic şi m ndash numărul de unităţi structurale de acid
glycolic
Poli (caprolactona)
Poli (caprolactona) ndash PCL este un polimer termoplastic biocompatibil avacircnd temperaturile
de topire şi de vitrifiere scăzute Este cristalin şi hirofob caracteristici ce conduc la o viteză de
degradare scăzută De asemenea are proprietăţi mecanice constante icircn timp Proprietăţile
prezentate fac ca acest polimer să fie adesea utilizat icircn ingineria tisulară [69]
30
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 115 Structura PCL
Poli (3- hidroxibutiratul)
Poli (hidroxialcanoaţii) ndash PHA sunt o clasă de poliesteri naturali produși de o varietate de
microorganisme Primul polihidroxialcanoat descoperit și totodată cel mai studiat este poli-3-
hidroxibutiratul ndash P(3HB) a cărui structură chimică este redată icircn figura 116 [70]
Figura 116 Structura P(3HB)
12213 Biomateriale cermice
Din categoria suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă biomaterialele
ceramice reprezintă o categorie foarte importantă cele mai multe variante comerciale pentru
aplicația vizată icircncadracircndu-se icircn această categorie Compoziţia şi morfologia acestor
biomateriale au o influență esențială asupra răspunsului tisular Icircn majoritatea cazurilor sunt non-
imunogenice nu provoacă reacții inflamatoare și sunt non-citotoxice Icircn practica clinică
ceramicele sunt utilizate icircntr-o mare varietate de aplicații biomateriale pentru regenerarea
articulaţiei artificiale a şoldului biomaterialele de reconstrucţie osoasă implanturi pentru
icircnlocuirea celor trei oscioare de la nivelul urechii (ciocănş nicovală şi scăriţă) rădăcini dentare
artificiale şi ceramice pentru diverse tratamente medicale [71]
31
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Ceramicile utilizate la fabricarea de implanturi se clasifică icircn ceramice neresorbabile
(bioinerte) ceramice bioactive sau cu suprafaţa activă (semi-inerte) şi ceramice biodegradabile
sau resorbabile (non-inerte)
Ceramicele neresorbabile inerte sunt stabile la interacţiunea cu mediul fiziologic şi nu
prezintă bioactivitate sau efecte dăunătoare pentru organismul uman cele mai reprezentative
fiind alumina ndash Al2O3 zirconia ndash ZnO2 carbonul și nitrura de siliciu Ceramicele bioactive
semi-inerte sunt ceramice desemnate să inducă o activitate biologică specifică avacircnd
capacitatea de a se lega direct la os caracteristică deosebit de importantă şi unică icircn racircndul
tuturor tipurilor de biomateriale Din categoria ceramicelor bioactive semi-inerte fac parte
apatitele sticlele bioactive şi sticlele ceramice bioactive Fosfaţii de calciu chiar daca fac parte
din clasa apatitelor se icircncadrează icircn categoria ceramicelor resorbabile [72] [73]
Sticlele bioactive au fost inventate de către Hench Universitatea din Florida icircn 1971
Acestea au drept compoziţie de bază SiO2-CaO-Na2O-P2O5 și la fel ca ceramicile bioactive au
capacitatea de a se lega de os fară a exista conexiuni tisulare fibroase icircntre ele Bioglassreg
45S5
este prima şi cea mai studiată sticlă bioactivă Bioglassreg S53P4 este o altă sticlă bioactivă
utilizată icircn ortopedie ca şi substituent osos sub varianta comercială BonAlivereg (Vivoxid
Finlanda) [74]
Sticlele bioactive ceramice se obţin prin precipitarea icircn sticlele bioactive a unei faze
cristaline rolul acestei etape de sinteză fiind de a mări rezistenţa mecanică a acestora din urmă
Spre deosebire de sticlele bioactive obișnuite au o bioactivitate mai scăzută dar au o rezistenţă
mecanică superioară Sunt utilizate la realizare vertebrelor artificiale spaţiului intervertebral
artificial şi a unor materiale de umplere poroase sau granulare [75]
Fosfați de calciu
Fosfații de calciu reprezintă componenta majoră a țesutului dur al vertebratelor
componenta anorganică (minerală) a osului avacircnd icircn compoziție nanocristale non-
stoichiometrice de apatită avacircnd următoarea formulă chimică
Ca10-x(PO4)6-x(HPO4CO3)x(OHF)2-x
unde 0lexle2 O particularitate aparte a structurii apatitelor este capacitatea lor de a putea
icircncorpora multe tipuri de ioni organici sau anorganici Astfel s-a dovedit că fosfați de calciu
32
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanocristalini non-stoichiometrici atacirct biologici cacirct și sintetici icircncorporează icircn structura lor ioni
din mediu chimic care nu corespund apatitelor acești ioni fiind denumiți non-apatitici [76] Icircn
tabelul 13 sunt prezentați diferite tipuri de fosfați de calciu
Tabel 13 Diferite forme de fosfaţi de calciu abrevierea lor formula chimică raportul
CaP mineral (dacă există) [77] [78]
Denumire Abreviere Formulă chimică Raport
CaP Mineral
Fosfat monocalcic
monohidrat MCPM Ca(H2PO4)2 H2O 05 ndash
Fosfat monocalcic
anhidru MCPA Ca(H2PO4)2 05 ndash
Fosfat dicalcic
anhidru DCPA CaHPO4 100 Moneit
Fosfat dicalcic
dihidrat DCPD CaHPO4 2H2O 100 Bruțit
Fosfat octocalcic OCP Ca8H2(PO4)6 5H2O 133 ndash
α-Fosfat tricalcic α-TCP α-Ca3(PO4)2 15 ndash
β-Fosfat tricalcic β-TCP β-Ca3(PO4)2 15 ndash
Hidroxiapatită
deficită icircn calciu CDHap Ca9(HPO4)(PO4)5OH 15 ndash
Hidroxiapatită
precipitată Hap
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x
unde 0lexle2
xx(OH)2-x
133 ndash167 ndash
Hidroxiapatită
sinterizată SHA Ca10(PO4)6(OH)2 167 Hidroxiapatită
Oxiapatită OXA Ca10(PO4)6O 167 ndash
Fosfat tetracalcic TeTCP Ca4(PO4)2O 20 Hilgenstockite
Hidroxiapatita este utilizată destul de des icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos
datorită similarității dintre compoziția sa și cea a fazei minerale a osului uman Faza minerală a
osului uman are formula chimică asemănătoare ce cea a hidroxiapatitei deficitară icircn calciu avacircnd
grupările OH- parțial substituite cu grupări CO3
2- Structura cristalină a hidroxiapatitei poate fi
descrisă ca un aranjament hexagonal unde cationii sunt orientați pe planurile tetraedral și
octaedral Icircn ultimii ani diverse suporturi ceramice pe bază de hidroxiapaptită au fost realizate
Cu toate că acestea prezintă proprietăți foarte bune pentru aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului
osos porozitate ridicată osteointegrare bună totuși au diverse neajunsuri icircn ceea ce privește o
refacere completă a defectelor ososoase [79]
33
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1222 Suporturi biomimetice pentru ingineria tisulară şi regenerarea osoasă
12221 Caracteristici ale suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Suporturile realizate pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă trebuie să aibă o serie
de proprietăți foarte importante pentru a putea fi utilizate cu succes proprietăți prezentate
schematic icircn figura 117
Figura 117 Proprietățile unui suport ideal realizat pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Icircn primul racircnd suporturile trebuie să aibă o serie de proprietăți biologice care sunt
esențiale pentru obținerea unor rezultate promițătoare biocompatibilitatea și bioactivitatea fiind
două din cele mai importante Un suport este considerat biocompatibil dacă nu are răspuns
imunogenic și nu are componente toxice sau inflamatoare care vor conduce la o rejecție
imunologică Bioactivitatea se referă la interacțiunea suportului cu țesutul gazdă și integrarea
acestuia De asemenea din punct de vedere al bioactivității suporturile trebuie să fie
osteoconductive osteoinductive și osteogenice Biodegradabilitatea o altă proprietate biologică
foarte important constă icircntr-o degradare controlată a suportului pe măsură ce se formează țesut
34
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nou menținacircnd totodată suport suficient pentru regenerarea completă a țesutului afectat Lipsa
unor produși de degradare toxici este o altă caracteristică care definește biodegradabilitatea [80]
Proprietăţile de suprafaţa sunt și ele esențiale la fel și proprietăţile morfologice pori
interconectați structură tridimensională microporozitatea macroporozitatea dimensiunea
porilor adaptată fiecărui tip de țesutcelule Porii trebuie să fie interconectați pentru a permite
difuziunea și migrarea celulelor iar dimensiunea porilor trebuie să fie adaptată fiecărui tip de
țesutcelule Microporozitate oferă o suprafață care permite interacțiunile celule-matrice și
macroporozitate permite migrarea celulelor și invazia vaselor de sacircnge Porozitate adecvată
permite creșterea celulelor fără să afecteze proprietățile mecanice
Suporturile trebuie să aibă proprietăţi mecanice similare cu cele ale ţesutului lacircngă care
sunt implantate mai concret trebuie să aibă rezistență la diverse solicitări biomecanice
comparabile cu ale osului uman pentru a permite mecano-reglarea celulară și păstrarea
integrității in vivo [34] [35]
12222 Metode de obținere a suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Metodele convenționale de obținere a suporturilor includ prelucrarea prin turnare icircn
solvent și solubilizarea a particulelor liofilizarea separarea fazelor indusă termic metoda de
formare a spumelor din fază gazoasă formarea prin pulverizare formarea prin tehnica sol-gel
electrofilarea și altele
Icircn cazul metodei prin turnarea icircn solvent și solubilizare a particulelor o soluție de polimer
este introdusă icircntr-o solvent cu particule de săruri avacircnd dimensiuni specifice dispersate
uniform Solventul se va evapora rezultacircnd un suport cu particule icircncorporate Suportul este
imersat apoi icircn apă particulele fiind solubilizate uneori se folosește și icircncălzirea pentru o
solubilizare completă rezultacircnd icircn final o structură cu porozitate ridicată Rezprezentarea
schematică a metodei este redată icircn figura 118 Dezavantajele metodei de formare a suporturilor
sunt formarea unor suporturi cu formă prestabilită și citotoxicitatea suporturilor datoră
rezidurilor de solvent
35
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 118 Obținerea suporturilor prin turnare icircn solvent și solubilizarea particulelor
Liofilizarea are la bază procesul de sublimare care se referă la trecerea apei din fază solidă
icircn fază gazoasă Suporturile obținute prin liofilizarea prezintă o structură poroasă cu pori
interconectați avacircnd dimensiuni medii icircn jur de 300 nm (figura 119) dimensiuni ce depind de
natura componentelor suportului Dezavantajele acestei metode sunt timpul icircndelungat necesar
obținerii suportului și faptul că pori rezultați nu au dimensiuni regulate
Figura 119 Obținerea suporturilor prin liofilizare
36
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Metoda de formare a suporturilor din spume gazoase a fost dezvoltată pentru a icircnlătura
utilizarea solvenților organici citotoxici Polimeri biodegradabili dizolvați icircn apă sau fluoroform
sunt ținuți sub presiune cu diverși agenți gazoși inerți (azot dioxid de carbon) pacircnă cacircnd soluția
este saturată și plină de bule de gaz Tehnica are drept rezultat suporturi poroase cu dimensiuni
medii a porilor icircn intervalul 30-700 microm și o porozitate ridicată de pacircnă la 85
Tehnica sol-gel se bazeză pe polimerizarea anorganică a metalelor alcaloide O soluție (sol)
este format prin adăugarea unui surfactant după care vor urma reacțiile de condensare și
gelifiere [81]
Tehnica de electrofilare a fost inventată icircn 1934 de către Formhals și se bazează pe un
cacircmp electric ce impune o icircntindere uniaxală a unui jet vacircscoelastic provenit dintr-o soluție de
polimer ce icircși reduce continuu diametrul icircn final rezultacircnd nanofibre Este o tehnică simplă și
rentabilă pentru prepararea nanofibrelor polimerice cu diameter cuprinse icircntre 3 nm și 5 μm
(figura 120) Proprietățile nanofibrelor electrofilate sunt influențate de mulți factori cum ar fi
proprietățile polimerului proprietățile solventului aditivii concentrația polimerului proprietățile
soluției și așa mai departe [82]
Figura 120 Obținerea suporturilor prin liofilizare
Există și tehnici moderne de sinteză a suporturilor pentru regenerarea osoasă denumite
tehnici de prototipare rapide Dintre acestea cele mai utilizate și cele care oferă pacircnă icircn present
rezultatele cele mai promițătoare sunt sinterizarea selectivă cu laser stereolitografia imprimarea
tridimensională (3D) bio-imprimarea [81]
37
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
12223 Suporturi biomimetie pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu pentru
regenerarea osoasă
Suporturi biomimetice
Icircn general metodele de regenerare osoasă sunt de preferat metodelor de icircnlocuire osoasă
datorită neajunsurilor celor din urmă Un număr mare de studii icircn domeniul ingineriei tisulare și
regenerare a osului au evidenţiat importanţa critică a caracteristicilor arhitecturii suporturilor
utilizate icircn domeniu
Ţesuturile vii sunt caracterizate de o arhitectură ierarhică tridimensională şi un
micromediu unic ce uşurează intercaţiunea celulelor cu molecule semnal componentele matricei
extracelulare şi unele molecule mici Acest micromediu complex controlează procesele celulare
importante pentru morfogeneza ţesutului şi menţine proliferarea diferenţierea şi migrarea
celulară Ingineria tisulară convenţională a icircncercat să imite proprietăţile ţesutului osos nativ doar
la nivel micromolecular şi macromolecular fiind neglijate icircnsă structurile de la nivel
submicromolecular şi nanomolecular [83]
De asemenea numeroase studii icircn acest domeniu au arătat că nu este suficientă realizarea
unor suporturi pentru regenerarea osoasă luacircnd icircn considerarea doar compoziţia chimică a
osului deoarece acestea nu vor avea proprietăţi mecanice similare cu ale osului natural şi vor
afecta metabolismul acestuia cacircnd vor fi implantate in vivo
Pentru realizarea unui substituent osos care să poată fi aplicat cu succes pentru tratarea
unor defecte osose de diferite cauze trebuie să se ţină cont atacirct de compoziţia naturală a osului
dar cel mai important trebuie să se imite nanostrucutura lui deoarece arhitectura nanostructurală
a osului este esenţa lui atacirct icircn ceeea ce priveşte proprietăţile mecanice cacirct şi bioresorbabilitatea
Realizarea unor matrici de colagen icircn care s-a icircncercat reproducerea mineralizării intrafibrilare a
dus la obţinerea unor suporturi ce pot fi aplicate cu succes icircn ingineria tisulară și regenerarea
ţesutului osos [84]
Avacircnd icircn vedere aspectele mai sus menționate se poate spune că suporturilor preparate
plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important imitacircnd nanostructura sa sunt
suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg procesele substanţele dispozitivele
sistemele facute de om care imită natura [85]
38
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Suporturi compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
Compozitele sunt materiale solide ce au la bază o combinație de minim două materiale cu
propietăți diferite dezavantajele individuale ale acestora sunt diminuate fiind păstrate și puse icircn
valoare doar avantajele fiecărui componet al compozitului
Icircn ingineria tisulară și medicina regenerativă se utilizează mai multe varinte de
compozite co-polimeri polimer ndash polimer sau polimer ndash ceramice Unul din cei mai utilizați co-
polimeri icircn ingineria tisulară osoasă este poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA Compozitele
polimer sintetic ndash polimer sintetic sunt amestecuri de minim doi polimeri sintetice un exemplu
fiind compozitul pe bază de PLGA și polifosfazene asocierea acestora avacircnd drept obiectiv
principal obținerea unor produși de degardare neutri Se pot combina și polimeri sintetici cu
polimeri naturali pentru realizarea de compozite de exemplu PLGA și colagen
Compozitele polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje
care pleacă de la faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele
matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă) De-a lungul timpului au fost studiate și compozite
polimeri sintetici ndash ceramice de exemplu compozite pe bază de poli (acid lactic) poli (acidul
lactic-co-glicolic) hidroxiapatită dar studiile concentrate pe compozitele polimeri naturali ndash
ceramice au avut cele mai bune rezultate de-a lungul timpului [34]
Avantajele unui compozit pe bază de biopolimeri și ceramice ar fi pe de o parte
proprietățile mecanice variabile degradarea controlată și structura fizică a polimerilor iar pe de
altă parte rezistența și natura biomimetică a ceramicelor Combinarea de biopolimeri cu
ceramice elimină un mare dezavantaj al acestora din urmă și anume faptul că sunt casante dar
totodată crește bioactivitatea și capacitatea de transport și eliberare de agenți bioactivi [75]
Compozitele pe bază de colagen și hidroxiapatită au fost de-a lungul timpului cele mai
studiate compozite biopolimeri ndash ceramice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
13 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Icircn ultimii ani interesul pentru nanotehnologie a crescut semnificativ Particulele magnetice
fac parte din grupul materialelor utilizate icircn nanotehnologii cu un impact considerabil icircn diverse
domenii chimie biosenzori nanomedicină etc Cele mai importante aplicații ale lor sunt legate
39
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de obținerea particulelor de dimensiuni nanometrice denumite nanoparticule magnetice ndash MNPs
utilizate ca metode de diagnostic prin separarea magnetică a unor entități biologice utilizarea icircn
scop terapeutic și ultima aplicație aceasta fiind una din cele mai des folosite icircn medicină
utilizarea la rezonanța magnetică nucleară [86]
Utilizate icircn scop terapeutic nanoparticulele magnetice au fost evaluate pentru eliberarea
controlată de medicamente Prin utilizarea atracției magnetice sau a direcționării specifice a unor
biomarkeri tumorali nanoparticulele magnetice oferă o soluție atractivă pentru terapia directă cu
agenți chimioterapici care vor fi eliberați icircntr-un loc specific doză de medicament care ar fi fost
utilizată icircn mod curent fiind astfel redusă semnificativ și o dată cu ea efectele adverse asociate
cu absorbția de către țesuturi sănătoase a medicamentului [87]
MNPs folosite icircn aplicaţiile biomedicale trebuie să fie superparamgnetice adică să aibă
proprietatea de a putea fi magnetizate doar icircn prezenţa unui cacircmp magnetic extern De asemenea
trebuie să aibă dimensiuni mici pentru a nu fi eliminate din circulaţie de către ficat sau splină
după ce cacircmpul magnetic este icircnlăturat Icircn general cu cacirct particulele au dimensiuni mai mari cu
atacirct este mai mic timpul lor de icircnjumătăţire icircn plasma
Cele mai utilizate surse de materiale magnetice sunt oxizii de fier cu structură de miez ce
au mai multe forme cristaline polimorfe hematită α-Fe2O3 maghemită β-Fe2O3 γ- Fe2O3 şi
magnetită ε-Fe2O3 Fe3O4 precum şi alte forme amorfe Singurele utilizate icircn aplicaţiile medicale
sunt maghemita şi magnetita Pentru realizarea miezului magnetic a unor nanoparticule
magnetice se utilizează icircn unele aplicaţii şi fierul carbonil datorită dimensiunilor mici ale
particulelor sale [88] [89]
Pentru a icircmbunătăţi proprietăţile fizice şi chimice ale particulelor magnetice acestea sunt
adesea acoperite cu silica polimeri anumiţi surfactanţi sau diverşi compuşi organici Acoperirea
cu polimeri oferă o serie de avantaje nanoparticulelor magnetice numărul mare de grupări
funcţionale ale polimerilor permite alte funcţionalizări ale particulelor toxicitatea este complet
redusă are rol icircn stoparea procesului de oxidare etc Datorită atracţiei puternice dipol-dipol
dintre particule MNP tind să se aglomereze dar pentru a icircnlătura acest dezavantaj MNP sunt
acoperite cu polimeri hidrofilici cum sunt dextranul şi chitosanul Grupările funcționale ale
chitosanului permit funcționalizarea nanoparticulelor cu diverși agenți bioactivi prin stabilirea de
legături chimice icircntre grupările chitosanului și cele ale agentului
Reprezentarea unei nanoparticule magnetice acoperită cu polimer este redată icircn figura 121
40
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 121 Reprezentarea schematică a unei nanoparticule acoperite cu polimer cu funcții
aminice
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular cercetările
științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind cel de eliberarea
de principii active controlată și țintită
Nanoparticulele sunt integrate prin diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale
pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă
creștere deorece studii mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația
vizată
Icircn urma unui studiu de literatură amănunţit se poate realiza o clasificarea a suporturilor
magnetice pe bază de biomateriale cu aplicaţii icircn ingineria tisulară şi regenerarea osoasă icircn
funcţie de compoziție și icircn funcție de forma de prezentare
Icircn funcție de compoziție suporturile magnetice se pot clasifica icircn suporturi magnetice cu
biopolimeri care se clasifică la racircndul lor icircn suporturi magnetice pe bază de proteine şi suporturi
magnetice pe bază de polizaharide suporturi magnetice cu polimeri sintetici suporturi magnetice
cu materiale ceramice Icircn funcție de forma de prezentare suporturile magnetice se clasifică icircn
suporturi magnetice poroase hidrogeluri magnetice membrane magnetice nanofibroase și sticle
bioactive magnetice (figura 122)
41
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 122 Clasificarea suporturilor magnetice
131 Suporturi magnetice cu biopolimeri
1311 Suporturi magnetice cu proteine
Colagenul gelatina și fibroina din mătase sunt trei din proteinele cele mai utilizate icircn
sinteza de suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi magnetice cu colagen
Unul din primele studii ce prezintă conceptul de suporturi magnetice a fost publicat icircn
2010 de Bock şi colaboratorii [90] prezentacircnd realizarea şi caracterizarea a două tipuri de
suporturi magnetice Primul tip de suport a fost obţinut din hidroxiapatită şi colagen (7030 ww)
reticulat cu 14-butandiol diglicidil eter sub formă de structuri liofilizate microporoase şi
macroporoase avacircnd diametrul de 122plusmn08 mm şi icircnălţimea 47plusmn08 mm Al doilea tip de suport
a fost obţinut din 100 colagen liofilizat sub formă de structuri poroase omogene cu diametrul
42
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de 123plusmn1 mm şi icircnălţime 28plusmn09 mm Icircn vederea magnetizării ambele tipuri de suporturi au
fost imersate pentru 15 min icircn 1ml fero-fluid trei tipuri diferite de fero-fluide fiind utilizate
(figura 123) Fero-fluidele reprezentacircnd nanoparticule magnetice cu dimensiunea de 200 nm
dispersate icircn apă au fost notate FF-DXS (nanoparticule de magnetită acoperite cu sulfat de
dextran și funcționalizate cu grupări funcționale de sulfat de sodiu) FF-PAA (nanoparticule de
magnetită acoperite cu acid poli-DL-aspartic și funcționalizate cu carboxilat de sodiu) și FF-DP
(nanoparticule de magnetită acoperite cu amidon și funcționalizate cu grupări fosfat)
Figura 123 Reprezentarea schematică a procedeului de preparare a suporturilor magnetice [90]
Valorile obținute pentru magnetizarea suporturilor sunt considerate potrivite pentru
generarea de gradient magnetic icircn suport precum și icircn vecinătatea acestuia Studiile in vitro de
biocompatibilitate au dovedit că suporturile magnetice obținute susțin adeziunea și proliferarea
celulelor stem Icircn concluzie suporturile obținute au potențialul de a fi considerate substituenți
osoși avacircnd ca și noutate față de variantele standard proprietatea de a atrage particule magnetice
funcționalizate cu medicamente [91]
Icircn 2013 Panseri și colaboratorii [92] descriu icircntr-un studiu obținerea și caracterizarea de
suporturi magnetice obținute prin două metode diferite metoda A și metoda B Metoda A are la
bază magnetizarea in situ și constă icircn nucleația de apatită biomimetică și 7 nanoparticule
magnetice (cu dimensiunea mai mică de 50 nm achiziționate de la Sigma Aldrich) pe fibrile de
colagen autoasamblate Metoda B reproduce procedeul de obținere descris icircn studiul mai sus
43
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
menționat (Bock și colaboartorii) un suport poros pe bază de hidroxiapatită și colagen fiind
imersat icircn fero-fluidul FF-DP Din datele de microscopie electronică de baleiaj (SEM) autorii au
observat icircn cazul suporturilor obținute prin metoda A o distribuție omogenă a nanoparticulelor
magnetice pe fibrele de colagen iar icircn cazul suporturilor obținute prin metoda B o aglomerare a
nanoparticulelor Teste in vivo complexe au fost realizate utilizacircnd suporturile obținute
rezulatele indicacircnd potențialul acestora de a fi utilizate icircn aplicații ale ingineriei tisulare a
țeustului osos Icircntr-un studiu următor autorii funcționalizează hidroxiapatita cu ioni de fier (Fe2+
şi Fe3+
) conferindu-i astfel proprietăţi superparamagnetice şi totodată diminuacircnd potenţialul
citotoxic ce poate fi uneori dat de magnetită sau de unii oxizi de fier
Suporturi magnetice cu gelatină
Samal şi colaboratorii [93] evidenţiază obţinerea şi caracterizarea de suporturi magnetice
pe bază de gelatină Soluţii de gelatină amestecate cu concentraţii diferite de fero-fluid (particule
de magnetită acoperite cu acid poli-acrilic dispersate icircn apă) au fost transferate icircn plăci de
polistiren cu mai multe straturirezultacircnd membrane ce au fost apoi legate chimic cu ajutorul
carbodiimidelor icircn vederea obţinerii suporturilor
Gelatina a fost utilizată şi de Dashnyam şi colaboratorii [94] pentru obţinerea unor
suporturi magnetice hibride Suporturile au fost obţinute din gelatină şi siloxan printr-un
procedeu sol-gel icircn timpul căruia au fost icircncorporate 3 nanoparticule magnetice ultimul pas
pentru obţinerea unor suporturi foarte poroase a fost liofilizarea Icircn urma unor teste mecanice
efectuate autorii au observat o icircmbunătăţire semnificativă a proprietăţilor mecanice ale
suporturilor datorită icircncorporării de nanoparticule magnetice icircn strucura acestora Icircn cadrul
studiului au fost realizate teste de populare cu celule (stem mezenchimale izolate din şobolan) a
suporturilor avacircnd nanoparticule magnetice icircncorporate precum şi a suporturilor fară
nanoparticule magnetice icircncorporate rezultatele indicacircnd o proliferare celulară icircmbunătăţită icircn
cazul primelor suporturi menţionate
Suporturi magnetice cu fibroină din mătase
Icircntr-un studiu publicat recent fibroina a fost utilizată icircmpreună cu chitosan şi nanoparticule
magnetice pentru realizarea unor suporturi cu porozitate controlată cu aplicaţii icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos O soluţie de fibroină şi chitosan a fost preparată avacircnd raportul masic
44
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
31 şi reticulată cu o soluţie 08 glutaraldehidă Patru fero-fluide avacircnd concentraţiile
nanoparticulelor magnetice 0 05 1 şi 2 au fost adăugate icircn soluţia de polimeri iar
soluţiile astfel obţinute au fost transferate icircntr-o matriţă de politetrafluoretilină aşezată icircntr-o
placă de cupru rece a cărui temperatură a fost controlată cu azot lichid Cristale de gheaţă
unidirecţionale s-au format cu o viteză de solidificare de 1degCminut soluţia icircngheţată rezultată
fiind icircntr-o ultimă etapă liofilizată (figura 124)
Activitatea fizico-chimică a suporturilor obţinute a fost studiată icircn soluţii saline de tampon
fosfat pentru a determina retenţia de fluide şi biodegradarea Stabilitatea nanoparticulelor
magnetice din suporturile obţinute a fost analizată utilizacircnd Spectroscopie de absorbţie atomică
Toate cele patru suporturi realizate s-au dovedit a avea o bună biocompatibilitate icircn urma
testelor MTT [95]
Figura 124 a) Reprezentarea schematică a procesului de obținere asuporturilor b) Structurile
chimice al polimeriloragentului reticulant și interacțiunile dintre aceștia c) Dimensiunea
suporturilor și diferența de culoare dată de variația concentrației de nanoparticule magnetice
d) Suportul este atras de un magnet permanent [95]
Suporturi magnetice pe bază de fibroină din mătase au fost realizate şi caracterizate de
Samal şi colaboratorii Nanoparticulele magnetice au fost integrate icircn suporturi prin imersare
rezultacircnd diferite grade de magnetizare Suporturile obţinute s-au dovedit a avea foarte bune
45
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţi de hipertermie ajungacircnd la temperaturi ce au crescut cu 8degC icircn 100 secunde Testele
de biocompatibilitate au indicat lipsa citotoxicităţii suporturilor precum şi capacitatea acestora de
a susţine adeziune şi proliferarea celulară [96]
Hidrogeluri magnetice au fost obţinute printr-un proces de electro-gelifiere a unui soluţii
concentrate de fibroină din mătase (8 ) cu scopul de a fi utilizate ca şi suporturi icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos Patru feluri de suporturi au fost realizate suporturi avacircnd icircncorporate
nanoparticule magnetice (Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice acoperite
cu albumină serică umană (HSA-Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice
acoperite cu albumină serică umană şi conjugate fizic cu factori de creştere fibroblastici bazali
(HSA-Fe3O4-bFGF) şi suporturi fără niciun fel de nanoparticule magnetice Morfologia
suporturilor a fost studiată cu ajutorului microscopiei electronice de baleiaj Citotoxicitatea lor a
fost analizată printr-un test MTT realizat pe osteoblaste de linie iar activitatea osteogenică a fost
studiată din punct de vedere a fosfatazei alcaline a cantităţii de calciu mineralizat şi a
colagenului Analizacircnd rezultatele testelor menţionate autorii consideră că suporturile obţinute
pot fi utilizate pentru aplicaţia vizată [97]
1312 Suporturi magnetice cu polizaharide
Chitosanul este polizaharidul cel mai utilizat icircn studiile privind sinteza și caracterizarea de
suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi biocompozite magnetice pe bază de chitosan şi carboximetilceluloză au fost
obţinute şi caracterizate de către Grumăzescu şi colaboratorii [98] Carboximetilceluloza cel mai
utilizat eter de celuloză este o polizaharidă cu lanţ liniar solubilă icircn apă datorită grupărilor
carboximetil (CH3COONa) introduse icircn molecula de celuloză Deoarece are icircncărcătură electrică
opusă chitosanului reacţionează puternic cu acesta utilizacircndu-se ca agent de reticulare ionic la
anumite valori ale pH-ului Autorii au studiat morfologia suporturilor eficacitatea utilizării
acestora ca şi sisteme de eliberare controlată de antibiotice in vitro precum şi intercaţiunea lor cu
celule eucariotice Rezultate studiilor menţionate au demonstrat că suporturile magnetice
biocompozite propuse de autori pot fi utilizate cu succes icircn viitor icircn domeniul medical icircn
special icircn ingineria tisulară
Heidari şi colaboratorii [99] prezintă icircntr-un studiu recent prepararea in situ a unor
nanoparticule de oxid de fier icircn matrici de hidroxiapatităchitosan pentru aplicaţii icircn ingineria
46
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
ţesutului osos Atacirct hidroxiapatita cacirct şi chitosanul au fost extrase din surse naturale os cortical
bovin pentru hidroxiapatită respectiv creveţi pentru chitosan Două cloruri de fier (FeCl2 FeCl3)
au fost dizolvate icircn soluţie de acid acetic sub agitare magnetică pentru 30 min S-a adăugat apoi
pulbere de hidroxiapatită iar după dizolvarea pentru o oră a acesteia s-a adăugat chitosan şi s-a
lăsat la solubilizat pentru icircncă o oră Alte etape au urmat obţinacircndu-se o matrice gel ce a fost
uscată icircn etuvă la 60degC pentru 24 ore Compozitele tridimensionale obţinute au fost supuse unui
număr foarte mare de analize distribuţia particulelor magnetice icircn funcţie de mărime a fost
analizată cu ajutorul unui analizor de particule şi cu ajutorul microscopiei electronice de
transmisie (TEM) morfologia probelor a fost analizată utilizacircnd SEM proprietăţile magnetice au
fost studiate cu ajutorul unui magnetometru cu vibraţii simple (VSM) şi multe altele
Y Wei și colaboratorii [100] publică un studiu icircn care prezintă fabricarea și caracterizarea
de membrane nanofibroase pe bază de oxizi de fier (Fe3O4) chitosan și polialcool vinilic
Chitosanul (CS) și alcoolul polivinilic (PVA) au fost dizolvate separat icircntr-o soluție de acid
acetic iar apoi au fost amsetecate icircn raport de masă CSPVA= 23Nanoparticule pe bază de
Fe3O4 obținute printr-o metodă de co-precipitare au fost adăugate icircmpreună cu etanol icircn
amestecul polimeric Membranele magnetice nanofibroase Fe3O4CSPVA au fost obținute prin
electrofilarea soluției polimerice conținacircnd Fe3O4 Datorită procesului de electrofilare s-a obținut
o porozitate foarte bună a membranelor 839-851 Datele TEM au arătat o distribuiție uniform
a nanoparticulelor magnetice Datele de spectroscopiei icircn infraroșu cu transformată Fourier
(FTIR) și datela de difracției cu raze X (XRD) au demonstrat că structura chimică și
cristalinitatea probelor nu a fost afectată de procesul de electrofilare De asemenea proprietățile
mecanice proprietățile magnetice și interacțiunea cu osteoblaste aparținacircnd linie de celule
tumorale MG-63 au sugerat că membranele magentice obținute au un real potential pentru
viitoare aplicații privind regenerarea osoasă
132 Suporturi magnetice cu polimeri sintetici
Icircn ultimii 100 ani materialele sintetice sunt utilizate pentru repararea şi regenerarea unei
varietăţi de ţesuturi şi organe [101] Deoarece in vivo osul este adesea supus forţelor mecanice
rezultate icircn urma acţiunii muşchilor şi a mişcărilor corpului una din cerinţele de bază impuse
unui suport realizat cu scopul de a fi utilizat icircn ingineria tisulară a ţesutului osos este aceea de a
fi capabile să suporte stimulii mecanici Biomaterialele sintetice rezultate icircn urma polimerizării
47
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
acidului lactic a acidului glicolic sau a caprolactonei sunt studiate pentru realizarea de suporturi
compozite de obicei icircn combinaţie cu polimeri naturali [102]
Poli (acidul lactic)
Suporturile magnetice pe bază de PLA sunt icircn prezent puțin studiate unul din puținele
studii pe această temă fiind publicat icircn 2007 Lucrarea respectivă se concentrează pe analiza
influenței orientării fibrelor unui suport magnetic pe bază de poli (acid L-lactic) ndash PLLA obținut
prin procedeul de electrofilare asupra proprietăților sale mecanice Pentru realizarea suportului
o soluție de 3 PLLA icircn hexafluoro-2-propanol a fost amestecată cu nanoparticule de magnetită
(Fe3O4) icircn raport PLLAFe3O4 - 955 Amestecul a fost sonicat și apoi electrofilat S-a studiat
morfologia suporturilor obținute interacținuea cu celule precum și rezistența mechanică [102]
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Suporturi nano-compozite superparamagnetice pe bază de PLGA pentru ingineria tisulară
au fost realizate de Lai și colaboratorii Icircntr-o primă etapă PLGA și nanoparticule de magnetită
superparamagnetice hidrofobe (MNPs) au fost amestecate separat icircn diverse rapoarte masice (19
și 11) Icircn a doua etapă cele două amestecuri au fost transferate separat icircntr-o seringă de sticlă de
10 ml conectată la un ac cu dimensiunea de 6 gauge Un electrod a fost montat la ac iar
amestecul respectiv a fost electrofilat icircn timpul procesului tensiunea fiind păstrată constantă la
20 kV viteza de filare fiind de 1 mlH Icircn funcție de raportul PLGA MNPs s-au obținut două
suporturi diferite PLGA-10 MNPs și PLGA-50 MNPs Datele SEM și TEM au evidențiat o
dimensiune a fibrelor suporturilor de 400-600 nm cu MNPs distribuite uniform Suporturile
compozite s-au dovedit a avea o biocompatibilitate excelentă susținacircnd semnificativproliferarea
celulară [103]
Poli (caprolactona)
Unul dintre primele studii care prezintă suporturi magnetice pe bază de PCL a fost
prezentat de Kim și colaboratorii [104] Pentru realizarea suporturilor s-a preparat icircntr-o primă
etapă o soluție de 10 PCL (cu masa molară 80 kDa) icircn cloroform După solubilizare completă
icircn soluția de 10 PCL s-au adăugat două concentrații diferite de nanoparticule magnetice
(MNPs) 05 și 10 față de cantitatea de PCL solubilizată Icircn funcție de concetrația de
48
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanoparticule adăugate suporturile au fost notate PCL-MNP5 (5 MNP) PCL-MNP10 (10
MNP) și PCL (nu conține MNPs) După ultrasonicare soluțiile au fost icircnghețate la -70degC iar
apoi liofilizate pentru 3 zile Adăugarea de MNPs icircn suporturile pe bază de PCL a condus la o
icircmbunătățire a hidrofilicității precum și a proprietăților mecanice a acestora Autorii au
demonstrat că suporturile PCL-MNP au capacitatea de a susține adeziunea celulară precum și
mineralizarea avacircnd o bună biocompatibilitate Suporturi realizate după același protocol
prezentat icircn studiul menționat mai sus sunt riguros studiate in vitro și in vivo din punct de vedere
al biocompatibilității și al interacțiunii cu celule și țesuturi Rezultatele obținute icircn respectivul
studiu indică un potențial considerabil al acestor suporturi de a fi utilizat pentru repararea și
regenerarea osoasă [105]
Suporturi magnetice nanofibroase pe bază de PCL sunt prezentate și icircntr-un studiu publicat
icircn 2016 Icircntr-o soluție de 10 PCL icircn diclometan-etanol s-au icircncorporat două concentrații
diferite de nanoparticule magnetice conjugate cu COOH (10 și 20 COOH-MNPs)
amestecurile obținute fiind electrofilate la temperatura camerei obținuacircndu-se astfel suporturi
magnetice nanofibroase Microstructura și nanostructura suporturilor a fost analizată cu ajutorul
SEM și a microscopiei electronice de transmisie TEM Structura chimică a fost studiată prin
intermediul FTIR iar cristalinitatea prin intermediul XRD S-au studiat de asemenea
proprietățile hidrofile al suporturile proprietățile magnetice și foarte important
biocompatibilitatea acestora și interacțiunea cu celulele [106]
Gloria și colaboratorii [107] prezintă realizarea și caracterizarea de suporturi magnetice pe
bază de PCL cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos După solubilizarea PCL (masa
molară 65 kDa) icircn tetrahidrofuran s-au adăugat separat 3 concentrații diferite de nanoparticule
magnetice (hidroxiapatită dopată cu ioni de fier ndash FeHA) cu diametrul de 20 nm respectacircndu-se
următoarele rapoarte masice PCLFeHA 9010 8020 și 7030 Pentru o distribuție uniformă a
nanoparticulelor magnetice icircn soluția polimerică cele trei amestecuri polimer-nanoparticule au
fost ultrasonicate Următoarea etapă pentru obținerea suporturilor a fost turnarea amestecului icircn
matrițe speciale obținacircndu-se icircn final suporturi cu diametrul de 64 mm și o grosime de 05 mm
Icircn urma analizei datelor XRD autorii au observat că procesul de formare al suporturilor nu
afecteză structura și cristalinitatea acestora Analiza biologică a substraturilor a evidențiat
abilitatea acestora de a susține diferențierea osteogenică
49
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
De remarcat este studiul publicat de Santis și colaboratorii icircn care prezintă realizarea și
caracterizarea unui suport hibrid pe bază de PCL și polietilen glicol (PEG) și nanoparticule
magnetice cu potențiale aplicații icircn regenerarea țesutului osteocartilaginos Suportul hibrid
multistrat a fost obținut prin combinarea a două tehnici de formare a suporturilor imprimare 3D
și stereolitografie [108]
Poli (3- hidroxibutiratul) ndash P(3HB)
Akaraonye și colaboratorii [109] prezintă realizarea și caracterizarea de nanocompozite
magnetice pe bază de P(3HB) cu potențiale aplicații icircn ingineria țesutului osos Două tipuri de
nanocompozite magnetice au fost realizate nanocompozite pe bază de P(3HB) și nanoparticule
magnetice ndash P(3HB)MNP și nanocompozite pe bază de P(3HB) și ferofluid - P(3HB)FF S-a
observat o icircmbunătățire a cristalinității suporturilor compozite ca urmare a icircncorporării
nanoparticulelor magnetice și a ferofluidului icircn suportul polimeric un grad de cristalintate ridicat
al suporturilor fiind benefic regenerării ososoase Propritățile termomecanice favorabile precum
și biocompatibilitatea suporturilor realizate icircn lucrare indică o potențială utilizare a acestora icircn
aplicații ce vizează repararea și regenerarea țesutului osos
133 Suporturi magnetice pe bază de biomateriale ceramice
1331 Sticle ceramice bioactive
Datorită biocompatibilității lor ridicate sticlele bioactive pe bază de siliciu sunt utilizate
pentru refacerea unor defecte mici și chiar medii fiind adesea utilizate cu rolul de grefe icircn
intervenții chirurgicale parodontale și maxilofaciale De asemenea se utilizează pentru refacerea
unor defecte osoase ale urechii medii sau ale coloanei vertebrale Superioare sticlelor bioactive
non-mezoporoase icircn ceea ce privește volumul nanoporos bioactivitatea și degradarea sticlele
bioactive mezoporoase (MBG) au fost fabricate pentru prima dată icircn 2004 de Yan și
colaboratorii avacircnd formula chimică SiO2-CaO-P2O5 [110] Loacutepez-Noriega și colaboratorii au
demonstrat icircntr-un studiu capacitatea sticlelor MBG de a lega și elibera medicamente anti-
osteoporotice [111]
Wu și colaboratorii [112] publică un studiu ce are drept obiectiv principal realizarea unor
suporturi multifuncționale pe bază de MBG și fier (Fe) cu potențiale aplicații icircn terapia
hipertermică (hipertermie) și eliberarea controlată de medicamente pentru tratamentul unor
50
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
afecțiuni osoase maligne Suporturile poroase Fe-MBG (avacircnd icircncorporat 5 sau 10 Fe) au
fost pregătite utilizacircnd co-șabloanele copolimerului tribloc Pluronic P123 (utilizat pentru a
conferi o structură mezoporoasă avacircnd o dimensiune de cacircțiva nanometri) și bureți de
poliuretan(utilizați pentru a creea pori mari avacircnd dimensiuni de cacircteva sute de micrometri)
Prima etapă pentru obținerea celor două suporturi magentice 10 Fe-MBG (10Fe-MBG) și 5
Fe-MBG (5Fe-MBG) a fost solubilizarea icircn etanol de cantități diferite de P123
tetraetilortosilicat (TEOS) Ca(NO3)2∙4H2O FeCl3 trietilfosfat (TEP) și HCl sub agitare
magnetică pentru 24 ore Bureți de poliuretan au fost imersați pentru 10 min icircn soluția obținută icircn
prima etapă iar după icircndepărtarea soluției icircn exces au fost lasați la uscat la temperatura camerei
pentru 24 ore Această etapă a fost repetată de 5 ori după care bureții au fost calcinați la 700degC
pentru 5 ore Pe lacircngă cele două suporturi a fost realizat și un suport 0Fe-MBG care după cum
indică și numele nu conține fier Suporturilor obținute au fost caracterizate utilizacircnd diferite
tehnici SEM și EDS (figura 125) precum și XRD și TEM
Figura 125 a) c) e) Rezultatele SEM b) d) f) Rezultatele EDS [112]
De asemenea s-au realizat diverse teste pentru analiza proprietăților magnetice a
proprietăților mecanice a eliberării controlate de medicament din suport și a contactului cu
51
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
celule stem din măduvă osoasă umană Rezultatele obținute icircn urma studiilor menționate indică
faptul că suporturile sunt magentice degradabile bioactive și au capacitatea de eliberare
controlată de medicamente
1332 Fosafați de calciu
Panseri și colaboratorii [113] prezintă icircntr-un studiu realizarea și caracterizare in vitro a
unor suporturi compozite ceramice poroase Trei tipuri diferite de suporturi au fost fabricate din
hidroxiapatită (HA) ce icircncorporează magnetită (Mgn) avacircnd următoarele rapoarte HAMgn
955 HAMgn 9010 și HAMgn 5050 De asemenea s-a realizat un suport avacircnd raportul
HAMgn 1000 ce a fost utilizat drept control Diverse teste in vitro de biocompatibilitate au fost
realizate utilizacircnd linii celulare de osteoblaste umane Saos-2 teste de proliferare celulară teste
privind activitatea fosfatazei alcaline a celulelor teste de viabilitate celulară livedead etc
Rezultatele acestor teste au indicat o foarte bună biocompatibilitate a suporturilor ceea ce indică
faptul că adăugarea de magnetită icircn structura suporturilor nu a condus la efecte negative asupra
celulelor De asemenea suporturile au fost implantate in vivo la iepuri obținacircndu-se rezultate
bune
14 Concluzii
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta
aceste defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din
biomateriale sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea
celulelor osoase icircn timpul procesului de regenerarea osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau
regenerarea ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor
artificiale și a suporturilor Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase
52
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
sisteme injectabile capsule filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte
tuburi geluri etc
Suporturilor preparate plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important
imitacircnd nanostructura sa sunt suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg
procesele substanţele dispozitivele sistemele facute de om care imită natura Compozitele
polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje care pleacă de la
faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele matricei
extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă)
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular
cercetările științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind
cel de eliberarea de principii active controlată și țintită Nanoparticulele sunt integrate prin
diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă creștere deorece studii
mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația vizată
53
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Obținerea și caracterizarea de suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi
de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Capitolul 2 Materiale şi metode experimentale
21 Strategie experimentală Obiective
Regenerarea osoasă și inginerie tisulară a țesutului osos sunt două domenii intens studiate
datorită creșterii numărului de afecțiuni osoase infecții osoase pierderi de cauză traumatică ale
masei de țesut osos tumori osoase Autogrefele au fost o perioadă mare de timp cele mai
utilizate materiale pentru regenerarea și substituția osoasă icircnsă au multiple dezavantaje
ingineria tisulară atragacircnd tot mai mult atenția icircn special unele suporturi complexe pentru
ingineria tisulară a țesutului osos Icircn capitolul 1 au fost prezentate limitările metodelor actuale de
tratament şi necesitatea reală de găsire a unei metode alternative efective care să aibă drept scop
regenerarea osoasă
Ingineria tisulară domeniu interdisciplinar de mare actualitate oferă soluţii promiţătoare
pentru realizarea de materiale pentru regenerarea tisulară Plecacircnd de la structura țesuturilor
biologice componentele ingineriei tisulare sunt următoarele o matrice sau un suport celule și
molecule semnal suportul fiind componenta cheie
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă este rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea unui
material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și regenerare
osoasă ar putea fi un suport magnetic biomimetic
Icircn urma analizei rezultatelor stiinţifice din domeniul ingineriei tisulare și regenerării osoase
s-a ales pentru lucrarea de faţă o strategie de cercetare care a avut ca obiectiv central
Avacircnd icircn vedere componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă) au fost selectate biomaterialele
utilizate icircn studiile de față după cum urmează pentru componenta organică au fost selectați
biopolimeri adesea utilizaţi icircn studii ce vizează regenerarea țesutului osos şi fosfați de calciu
54
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
pentru componenta anorganică Noutatea tezei este dată de adăugarea de particule magnetice
(magnetită funcţionalizată cu chitosan) icircn amestecul supus procedeului de co-precipitare ce vor
fi funcționalizate cu diverși bioagenți (medicamente) și vor avea rolul de transportori ai acestora
Un suport magnetic biomimetic cu design adecvat este dispozitivul ideal pentru a ghida
formarea de neo-ţesut atacirct in vitro cacirct şi in vivo Suporturile pentru ingineria tisulară a osului
trebuie să fie biocompatibile să mimeze structura şi funcţia biologică a matricei extracelulare şi
să ofere suport mecanic pentru ţesutul icircn formare şi de asemenea să elibereze icircn locul unde are
loc repararea ţesutului diverse molecule celule factori de creştere Totodată suportul trebuie să
fie osteoconductiv şi osteoinductiv şi să aibă o rată de degradarea controlată
O mare parte din suporturile propuse de unele studii icircn domeniu nu mimează şi arhitectura
matricii extracelulare naturale acesta fiind motivul pentru care rezulatele unor astfel de studii nu
sunt satisfăcătoare Suportul trebuie să fie biomimetic adică să mimeze nu doar compoziția
osului ci cel mai important nano-structura sa Astfel pentru tema de cercetare abordată s-a ales
un procedeu biomimetic de co-precipitare in situ a fosfaţilor de calciu icircn soluţii de biopolimeri
inspirat din procesul natural de mineralizare unde mineralele sintetizate de către organism sunt
combinate cu componentele organice ale matrici extracelulare a ţesutului osos
Pentru partea organică a suporturilor s-au utilizat diverși polimeri naturali chitosan acid
hialuronic gelatină albumină şi colagen
Pentru partea anorganică a suporturilor s-au utilizat fosfaţi de calciu sintetici deoarece
prezintă o strucutură similară cu cea a mineralului primar din componenţa ţesutului osos avacircnd
rolul de stimuli osteoconductivi şi osteoinductivi Aceştia s-au obţinut prin precipitarea din
precursori azotat de calciu ndash Ca(NO3)2 CaCl2 şi fosfat monosodic ndash NaH2PO4
Utilizarea particulelor magnetice este un concept intens studiat icircn domeniul inginerie
tisulare Acesta implică utilizarea de nanoparticule magnetice care sunt funcționalizate cu factori
de creștere medicamente sau alți agenți bioactivi care vor fi preluate de către suportul magnetic
ca urmare a acțiunii unui camp magnetic icircn apropierea zonei unde este implantat suportul
Nanoparticulele magnetice funcţionalizate acţionează ca transportatori de agenţi bioactivi către şi
icircn interiorul suportului magnetic După ce patrund icircn suportul magnetic aceste particule
magnetice eliberează succesiv moleculele pe care le transportă Suporturile obţinute au fost
riguros analizate din punct de vedere fizico-chimic şi biologic
55
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
22 Materiale utilizate
221 Materiale utilizate pentru prepararea suporturilor
Analizacircnd icircn amănunt proprietăţile biopolimerilor utilizaţi icircn studii ce vizează obţinerea de
suporturi pentru regenerarea osoasă prezentate icircn capitolul 1 cinci biopolimeri au fost utilizaţi
pentru prepararea loturilor de suporturi două polizaharide şi trei proteine
Fosfaţi de calciu se vor obţine din precursori lor
Polizaharide
Chitosan ndash Cs CAS 9012-76-4 cu masă molară medie M = 309900 Da grad de
deacetilare 792 achiziţionat de la Vascon Co Canada
Hialuronat de sodiu din Streptococcus equindash Hya CAS 9067-32-7 M = 15-18 x
10E6
Da solubilitate = 5 mgml (H2O)Sigma Aldrich Germania
Proteine
Colagen ndash Col tip I+III acido-solubil extras din derm bovin 096 ρ= 097 gcm3
obţinut de la firma Lohmann amp Rauscher Newied Germania
Gelatină ndash G CAS 9000-70-8 pH 38 ndash 76 solubilitate = 10 gL (H₂O 25degC) Merck
Germania
Albumină serică bovină ndash Bsa CAS 9048-46-8 pulbere liofilizată ge 98
(electroforeză icircn gel de agaroză) Sigma-Aldrich Germania
Precursori de fosfaţi de calciu (CP)
Azotatul de calciu ndash Ca(NO3)2∙4H2O CAS 13477-34-4 M = 23615 gmol Sigma-
Aldrich Germania
Clorură de calciu ndash CaCl2middot2H2O CAS 10035-04-8 M = 14701 gmol solubilitatea =
1280 gL ρ = 185 gcm3 (20degC) Merck Germania
Fosfatul monosodic ndash NaH2PO4∙ 2H2O CAS 13472-35-0 pH=41-45 (25degC 5 icircn
soluţie) M = 13799 gmol Sigma-Aldrich Germania
Amoniac soluţie ndash NH4OH CAS 1336-21-6 soluţie 25 Sigma-Aldrich Germania
56
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Particule magnetice (MNPs)
Magnetită ndash Mag sintetizată printr-un procedeu de co-precipitare [114]
Chitosan ndash Cs low CAS 9012-76-4 chitosan cu masă moleculară mică M = 50000-
190000 Da (icircn funcţie de vacircscozitate) vacircscozitate 20-300 cP pentru o soluţie 1 icircn acetic acid
(1 25degC) Sigma-Aldrich Germania
Pluronicreg F-127 CAS 9003-11-6 pH= 6-7 Sigma-Aldrich Germania
Tripolifosfat de sodiu ndash TPP CAS 7758-29-4 Na5P3O10 85 M = 36786 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Doxorubicin hydrochloride ndash DOX CAS 25316-40-9 C27H29NO11 ∙HCl M = 57998
gmol utilizată la pentru studiul de eliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi Sigma-
Aldrich Germania
222 Materiale utilizate pentru caracterizarea suporturilor
Soluţie tampon fosfat pH=72 001 M
Pentru prepararea soluţie tampon fosfat (PBS) pH=72 001 M s-au utilizat
Fosfat monosodic ndashNaH2PO4middot2H2O CAS 13472-35-0 M = 15601 gmol Sigma
Aldrich Germania
Fosfat disodic ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 gmol Sigma Aldrich
Germania
S-au preparat soluţii de fosfat monosodic şi fosfat disodic ambele de concentraţie 001 M
după care cele două soluţii s-au amestecat conform tabel 21
Tabel 21 Proporţiilor de amestecare pentru obţinerea soluţiei PBS pH=72 001M
Fosfat monosodic (ml) Fosfat disodic (ml) pH
28 72 72
Soluţie tampon fosfat (PBS) cu pH 72 şi concentraţie 001 M s-a utilizat pentru
determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic şi la studiile in vitro de
degradare enzimatică
57
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Soluție fluid biologic simulat
Soluția de fluid biologic simulat (SBF) a fost preparată prin dizolvarea icircn apă deionizată a
reactivilor NaCl NaHCO3 KCl Na2HPO4∙2H2O MgCl2∙6H2O CaCl2∙2H2O and Na2SO4 [115]
Reactivii achiziționați de la Merck Germania și Sigma-Aldrich Germania s-au adăugat
unul cacircte unul după ce fiecare reactiv s-a dizolvat complet icircn 700 ml apă deionizată strict icircn
ordinea precizată icircn tabelul 22
Tabel 22 Compoziția chimica a fluidului biologic simulat (SBF)
Ordinea
componentului Reactivi
Cantitate
(gL)
1 NaCl CAS 7647-14-5
M = 5844 gmol 6547
2 NaHCO3 CAS 144-55-8
M = 8401 gmol 2268
3 KCl CAS 7447-40-7
M = 7455 gmol 0373
4 Na2HPO4∙2H2O CAS 10028-24-7
M = 17799 gmol 0178
5 MgCl2∙6H2O CAS 7791-18-6
M = 20330 gmol 0305
6 CaCl2∙2H2O CAS 10035-04-8
M = 14701 gmol 0368
7 Na2SO4 CAS 7757-82-6
M = 14204 gmol 0071
8 (CH2OH)3CNH2 CAS 77-86-1
M = 12114 gmol 6057
Soluția obținută după amestecarea reactivilor s-a ajustat la pH = 74 utilizacircnd o soluție 1M
HCl Din volumul total de acid o parte (aproximativ 20 ml) s-a introdus icircnainte de adaosul celui
de-al șaselea component (CaCl2∙2H2O) pentru a evita apariția fenomenului de precipitare După
adaosul celui de-al 8-lea component [tris (hidroximetil) amino metan] s-a ridicat temperatura
soluției la 37ordmC
58
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Această soluție s-a titrat ulterior cu 1M HCl pacircnă la pH=74 la 37ordmC Icircn timpul procesului
de titrare soluția a fost diluată continuu prin adaos consecutiv de apă deionizată pentru a rezulta
volumul final de 1 L
Concentrația ionilor icircn SBF-ul realizat sunt apropiate de cele care se găsesc icircn plasma
umană așa cum se poate observa icircn tabelul 23
Tabel 23 Concentrațiile ionilor icircn SBF și icircn plasma umană
Concentrație (mM)
Na+
K+
Ca2+
Mg2+
HPO42-
Cl-
HCO32-
SO42-
Plasma umană 1420 50 25 15 10 1030 270 05
SBF 1422 502 247 151 102 1250 272 052
Soluţie tampon fosfat-citrat pH=5
Pentru prepararea soluţiei tampon fosfatndashcitrat pH=5 (după metoda Perse 1980) s-au
utilizat
Fosfat disodic anhidru ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 Sigma-Aldrich
Germania
Acid citric ndash C6H8O7 CAS 77-92-9 M = 19212 gmol Honeywell Riedel-de Haeumln
Germania
S-au preparat o soluţie de Na2HPO4 de concentraţie 02M și o soluție C6H8O7 de
concentraţie 01M după care s-au amestecat volumele specificate icircn tabel 24
Tabel 24 Proporţiile de amestecare pentru obţinerea a 100 ml tampon fosfat-citrat pH=5
Fosfat disodic (ml) Acid citric (ml) Apă distilată (ml) pH
257 243 50 5
59
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Studii in vitro de degradare enzimatică
Tabel 25 Reactivi utilizați pentru studiile in vitro de degradare enzimatică
Determinarea concentrației de
chitosan degradat
Determinarea concentrației de
colagen degradat
Enzime
utilizate
Lizozim ndash 100000 unităţimg
CAS 12650-88-3
M = 143 kDa (a unui singur lanţ)
Sigma-Aldrich Germania
Colagenază clostridium histolyticum
CAS 9001-12-1
M = 68 ndash 125 kDa
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
determinarea
produșilor de
degradare
Fericianură de potasiundash
K3Fe(CN)6
CAS13746-66-2 ge990
M = 32924 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Ninhidrină ndash C9H6O4
CAS 485-47-2
M = 17814 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Clorură de staniu ndashSnCl2
CAS 7772-99-8
M = 1896 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
realizarea
curbei etalon
N-acetil-D-glucozamină ndash
C8H15NO6
CAS 7512-17-6
M = 22121 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Glicină ndash C2H5NO2
CAS 56-406-6
M = 7507 gmol
Fluka Elveţia
Solvenți
Carbonat de sodiu ndash Na2CO3
CAS497-19-8
M = 10599 gmol
Chemical Company Iaşi
2-metoxietanol ndash CH3OCH2CH2OH
CAS 109-86-4
M = 7609 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Teste de citotoxicitate in vitro
Cu excepția solvenților care au fost achiziționați de la Chemical Company Iaşi toate
celelalte materiale prezentate icircn tabelul 26 au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich
Germania
60
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Tabel 26 Reactivi utilizați pentru studiile de citotoxicitate in vitro
Medii de cultură și soluții
de completare
Reactivi pentru
determinare
citotoxicității in vitro
Soluţie salină
Hanksrsquo Balanced
(HBSS)
Solvenți
Mediu de cultură DMEM
(Dulbeccorsquos Modified
Eaglersquos Medium) cu
4500 mgl glucoză
L-glutamat şi bicaronat
de sodiu
Tripsină din pancreas
de porc
CAS 9002-07-7
M = 238 kDa HBSS cu roşu fenol
fără clorură de calciu
şi sulfat de magneziu
Alcool isopropilic
(CH3)2CHOH
CAS 67-63-0
M = 6001 gmol
Mediu de cultură DMEM
F-12 HAM
(amestec de nutrienţi)
cu L-glutamat piruvat de
sodiu 055 gl
glucoză 315 gl
Acid etilen-diamino-
tetraacetic ndash EDTA
CAS 60-00-4
M = 29224 gmol
PSN ndash amestec de
penicilină streptomicină
neomicină
5000 unităţi penicilină 5
mg streptomicină 10
mgml neomicină
MTT ndash C18H16BrN5S
[bromură de (3-[45-
dimetiltiazol-2-il]-25-
difenil) tetrazoliu
CAS 298-93-1
M = 41432 gmol
HBSS cu clorură de
calciu şi sulfat de
magneziu
fără roşu fenol
Alcool etilic
absolut C2H5OH
CAS 64-17-5
M = 4607 gmol
Ser fetal bovin ndash BFS
Calceină AM
CAS 148504-34-1
Teste de citotoxixictate in vivo
Șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28plusmn3
grame materialul biologic provenit din Biobaza INCDMI Cantacuzino București - filiala
Băneasa Reactivi utilizați au fost aleși conform standardului ISO 10993
Betadină ndash soluție cutanată 10
Isofluran 4 ndash soluție pentru inducția anesteziă
Aldehidă formică 10 parafină colorant Tricromic Masson ndash pentru examenul
histopatologic
61
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
23 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu
incluziune de particule magnetice
231 Obţinerea particulelor magnetice
Particulele magnetice au fost obţinute conform protocolului descris de Bălan şi
colaboratorii [116] proprietățile lor fiind prezentate icircn tabelul 27
Tabel 27 Proprietățile particulelor magnetice
Dimensiunea medie
(nm)
Indicile de
polidispersitate
Potențialul Zeta
icircn soluție apoasă de
surfactant (mV)
Magnetizarea
(emug)
178 027 -186 4365
Pe scurt un volum de soluţie de chitosan de masă moleculară mică ndash Cs low a fost
amestecat cu un volum de magnetită ndash Mag şi pluronic F-127
După omogenizare amestecului se va adăuga o soluţie TPP icircn picătură Amestecul final se
va dializă contra apei distilate pentru mai multe zile
232 Obținerea suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu
incluziune de particule magnetice
Suporturilor magnetice au fost obţinute utilizacircnd o metodă biomimetică de co-precipitare a
fosfaţilor de calciu din precursorii săi icircn soluţii de biopolimeri inspirată din procesul natural de
mineralizare etapele procesului de obţinere fiind prezentate icircn figura 21
Soluţiile apoase de precursori de fosfaţi de calciu au fost adăugate icircn amestecul de soluţii
de polimeri Icircnainte de adăugarea precursorilor de fosfaţi de calciu icircn amestecul de soluţii de
polimeri s-au adăugat particule magnetice fie sub formă uscată fie sub formă de suspensie
coloidală
Co-precipitarea s-a realizat icircn prezenţa unei soluţii de amoniac NH4OH (25 ) pacircnă la
obținerea unei valori a pH-ului de 72-74 Fiecare amestec a fost spălat de 3 ori cu apă distilată
prin centrifugare (5000 rpm timp de 10 minute) iar icircn final amestecurile au fost liofilizate 24h la
-55degC
62
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Figura 21 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
233 Program experimental
Specialiștii din foarte multe domenii de activitate se confruntă deseori cu provocarea de a
face compromisuri icircntre diferiți factori pentru a obține rezultatele dorite optimizare fiind
procesul de a alege aceste compromisuri icircn cel mai eficient mod posibil Noțiunea de diferiți
factori face referire la existența unor diferite soluții posibile iar noțiunea de realizare a
rezultatelor dorite se referă la obiectivul de a căuta icircmbunătățirea modului de identificare a
soluției optime Prin urmare icircntr-o problemă de optimizare diferitele soluții posibile sunt
comparate calitatea soluției fiind fundamentală deoarece aceste soluții sunt de multe ori icircn
contrast [117]
Programe experimentale factoriale sunt foarte eficiente pentru studierea a doi sau mai mulți
factori Efectul unui factor poate fi definit ca schimbarea răspunsului produs de o modificare a
nivelului factorului acesta fiind considerat efectul principal Icircn unele experimente se poate
63
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
constata că diferența de răspuns dintre nivelurile unui factor nu este aceeași la toate nivelurile
celorlalți factori numit efect de interacțiune icircntre factori Icircn mod colectiv efectele principale și
efectele de interacțiune sunt numite efectele factoriale Un design factorial complet poate estima
toate efectele principale și interacțiunile de ordin superior
Programe experimentale factoriale sunt folosite icircn ingineria tisulară și icircn domeniul
biomaterialelor [118] icircn domeniul farmaceutic [119] etc
Icircn teza de față s-a utilizat un program experimental multifactorial icircn vederea optimizării
compoziției suporturilor Programul menționat este caracterizat prin faptul că fenomenul
procesul este urmărit prin intermediul unui număr finit de variabile variabile ce pot avea fiecare
un număr discret de valori icircntr-un domeniu de variaţie prestabilit Compoziția suporturilor a fost
optimizată din punct de vedere al raportului biopolimerbiopolimer un program experimental
factorial central compus rotabil de ordinul 2 fiind utilizat [120] Ecuația următoare stabilește
numărul total de experiențe posibile
NE = 2k + 2k + n0 icircn cazul icircn care k lt 5 (1)
sau
NE = 2k-1
+ 2k + n0 icircn cazul icircn care k gt 5 (2)
unde k este numărul de variabile iar n0 numărul de experiențe dispuse icircn centrul domeniului
experimental valoare sa fiind cuprinsă icircn intervalul 3 ndash 7
Structura programului experimental reprezentată de dispunerea punctelor generate de
valorile diferite acordate factorilor are drept ipoteză posibilă ajustarea suprafeţei de răspuns ce
corespunde unui indicator icircn raport cu variabilele independente prin intermediul unor expresii
matematice de tip polinomial de ordinul 2 de forma
Y = a0 + ndash
+
ndash (3)
unde a0 este coeficientul de regresie iar xi si xj sunt variabilele independente care influenţează
variabila răspuns F Valorile discrete ce se atribuie variabilelor sunt alese astfel icircncat printr-o
codificare simetrică faţă de centrul planului experimental să fie posibilă ortogonalizarea matricii
experimentale corespunzătoare si inducerea unei erori minime cu ocazia calculelor aferente
coeficienţilor prin metoda celor mai mici pătrate [121]
64
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Icircn lucrarea de față s-a optat pentru o codificare a valorilor discrete aferente variabilelor
independente conform datelor din tabelul 28
Tabelul 28 Codificarea variabilelor independente icircn cazul exprimării multifactoriale libere
Valoare codificată -1414 -1 0 -1 14141
Valoare reală
Valorile discrete se estimează din valorile ce definesc intervalul de variaţie al variabilei
independente xi conform următoarelor relaţiilor de atribuire
= rarr ndash2 (4)
= rarr +2 (5)
= ( + ) 2 rarr 0 (6)
= ( + ) rarr ndash1 (7)
= ( + ) rarr 1 (8)
Icircn contextul obiectivelor de cercetare s-a folosit un program factorial cu două variabile
(X1 X2) a cărei matrice experimentală este prezentată in Tabelul 29 [122]
Tabel 29 Matrice experimentală a programului factorial cu 2 variabile
Nr Crt X1cod X2 cod
1 ndash1 ndash1
2 1 ndash1
3 ndash1 1
4 1 1
5 ndash1414 0
6 1414 0
7 0 ndash1414
8 0 1414
9 0 0
10 0 0
11 0 0
12 0 0
13 0 0
65
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
24 Metode de caracterizare
241 Caracterizarea structurală a suporturilor
2411 Analiza prin Spectroscopia icircn infraroşu cu transformată Fourier (FTIR)
Spectroscopia FTIR se utilizează icircn vederea determinării grupărilor funcţionale ale probei
analizate Metoda se bazează pe vibraţia legăturilor chimice rezultată icircn urma absorbţiei energiei
luminoase infraroşii la frecvenţe caracteristice FTIR este o metodă uzuală icircn stabilirea structurii
şi identificarea unui compus chimic [123]
Pentru caracterizarea probelor solide există trei metode de pregătire a probelor pastilarea
icircn prezenţa unei sări suspensia icircn nujol utilizarea unui solvent Metoda de pregătire a probelor
este aleasă icircn funcţie de natura probei de analizat de exemplu icircn cazul probelor dificil de mojarat
se va utiliza un solvent pentru pregătirea probelor Acest solvent trebuie să aibă cacirct mai puţine
benzi şi intensitatea mică (exemplu sulfura de carbon şi tetraclorura de carbon)
Icircn ceea ce priveşte suspensia icircn nujol (ulei de parafină) cacircteva miligrame de probă se
amestecă cu 1-3 picături de ulei de parafină pacircnă la obţinerea unei suspensii omogene Icircn cazul
pastilării cel mai adesea se utilizează bromura de potasiu (KBr) Aproximativ 2-3 mg probă se
mojarează şi se amestecă cu 200 mg bromură de potasiu mojararea probei fiind un aspect
important de care trebuie să se ţină cont Pulberea obţinută se va introduce icircntr-o matriţă şi se va
comprima cu ajutorul unei prese hidraulice obţinacircndu-se un disc a cărui grosime este un alt
aspect important de care trebuie să se ţine cont o grosime de aproximativ 1 mm fiind
recomandată pentru rezultate cacirct mai bune [124]
Suporturile obţinute au fost pregătite pentru analiza FTIR prin metoda pastilării cu KBr
2412 Spectroscopia de raze x prin dispersie de energie (EDS)
Icircn general dispozitivele pentru microscopia electronică de baleiaj (SEM) sunt echipate cu
un spectroscop de raze X cu dispersie de energie (EDS) șisau un Spectroscop cu raze X cu
dispersie pe lungime de undă (WDS) utile pentru analiza elementală sau caracterizarea chimică
Atacirct EDS cacirct și WDS se bazează pe detectarea și investigarea razelor X caracteristice produse de
electronii primari Icircn timpul iradierii un electron din stratul intern al atomul țintă poate fi scos
66
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
din icircnvelișul electronic rezultacircnd o gaură de electroni Ulterior un electron din straturile
exterioare va umple gaura iar diferența de energie dintre electronii din icircnvelișul intern și cei din
icircnvelișul extern va fi emisă sub formă de rază X Deoarece energia acestei razei X este
caracteristică structurii atomice a elementului din care este emisă prin măsurarea cantității și a
energiei razele X emise dintr-un eșantion se poate determina compoziția elementală a probei
EDS este o metodă utilizată cel mai adesea pentru analiza de suprafața a unui material [125]
Pentru analiza probelor s-a utilizat un microscop electronic cu scanare SEM model VEGA
II LSH produs de firma TESCAN Cehia cuplat cu un detector EDX tip QUANTAX QX2
produs de firma BRUKERROENTEC Germania
2413 Difracţie cu raze X (XRD)
Spectrul XRD a fost icircnregistrat utilizacircnd aparatul XRD-6000 SHIMADZU (figura 22)
Difracţia cu raze X este o metodă simplă şi uşor de realizat pentru analiza fazei cristaline a
probelor oferind totodată şi date despre dimensiune şi orientarea cristalelor acesteia
Figura 22 Difractometru de raze X [126]
Principiul de bază al acestei metode implică cuantificarea precisă a lărgimii picurilor de
difracţie Plecacircnd de la acest principiu s-au dezvoltat mai multe tehnici pentru estimarea fazei
67
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
anorganice formate şi a dimensiunii cristalelor cele mai icircntacirclnite icircn literatură fiind ecuaţia lui
Scherrer analiza lui Hall-Williamson şi metoda Fourier a lui Warren-Averbach [127]
Pentru identificarea fazelor anorganice din suporturile obţinute au fost utilizate standardele
Centrului Internaţional pentru Difracţie (JCPDS)
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM)
Microscopia electronică de baleiaj se utilizează pentru a studia icircn detaliu suprafaţa
probelor Datele SEM sunt foarte importante deoarece oferă informaţii despre morfologia
probelor ce are o influenţă remarcabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale acestora (gradul de
retenţie a fluidelor biologic simulate proprietăţile mecanice adeziunea şi proliferarea celulară
etc) Icircn vederea studiului morfologiei suporturilor obţinute s-a utilizat microscopul TESCAN
VEGA SBH II prezentat icircn figura 23 Tensiunea de lucru a fost de 30 kV
Figura 23 Microscopul TESCAN VEGA SBH II [128]
Analiza constă icircn scanarea suprafaţei probelor de către un fascicul de electroni de energie
icircnaltă fascicul ce porneşte dintr-un filament de tungsten aflat icircn structura microscopului Icircnainte
68
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
de a fi analizate probele trebuie să se acoperite cu un film subţire de aur sau platină pentru un
contrast icircmbunăţit Pe măsură ce fasciculul de electroni trece de-a lungul probei interacţiunea
dintre probă şi fascicul are drept rezultat diferite tipuri de semnale de electroni emise la suprafaţa
probei sau icircn apropierea acesteia Semnalele sunt culese procesate şi redate pe un monitor ca şi
pixeli ceea ce duce la formarea unei imagini a suprafeţei probei imagine ce apare
tridimensională [129]
2422 Micro computer-tomografia (microCT)
Micro-computer tomografia (microCT) este o analiză de icircnaltă precizie a morfologiei
suporturilor oferind date precise şi informații despre dimensiunea şi distribuţia porilor icircntr-un
suport Tehnica este asemănătoare cu cea utilizată icircn sistemele de tomografie cu raze X folosite
icircn medicină doar că are o rezoluţie mult mai bună Această tehnică studiază interiorul suportului
icircn mare detaliu fără a fi utilizate substanţe toxice sau fără a fi necesară o pregătire specială a
probei Astfel după scanare proba intactă poate fi analizată prin alte tehnici
Icircn timpul scanării micro CT proba este icircmpărțită icircntr-o serie de secţiuni transversale 2D
care sunt iradiate din margine cu raze X La trecerea prin secţiune razele X sunt atenuate iar
razele X emergente avacircnd intensități reduse sunt capturate de un detector din componenţa micro-
computer tomografului Traictoriile razelor X sunt calculate și coeficienții de atenuare sunt
derivați O hartă bidimensională cu pixeli este creată utilizacircnd datele obţinute și fiecare pixel este
notat cu o valoare de prag care corespunde atenuării coeficientul măsurat la un punct similar icircn
interiorul specimen Deoarece coeficientul de atenuare este corelat cu densitatea materialului
hărțile 2D rezultate oferă o imagine a fazelor materialului analizat Calitatea imaginilor obţinute
este dependentă de rezoluţia de scanare care este cuprinsă icircntre 1 şi 50 microm precum şi de
software-ul utilizat [130]
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor
Testul de compresiune a fost realizat cu ajutorul dispozitivului Texture Analyzer
TAXTplus Dispozitivul poate fi utilizat pentru teste fundamentale sau empirice cum ar fi cele
legate de analiza texturii ştiinţa materialelor şi reologia solidelor semi-solidelor lichidelor
vacircscoase pudrelor sau materialelor granulate Numeroase proprietăţi pot fi analizate cu ajutorul
69
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
acestui dispozitiv dintre care enumerăm duritate fragilitatea aderența rezistența la tracțiune
extensibilitate Icircn funcţie de proprietate testată şi tipul probei dispozitivul are o serie de
platforme şi accesorii Pentru testul de compresiune la dispozitiv se va ataşa platforma pentru
greutate mare (figura 24)
Figura 24 Ansamblu pentru testul de compresiune Texture Analyzer TAXTplus [131]
Datele sunt achiziționate de software-ul Exponent icircn timpul procedurii şi prezentate sub
formă de grafice ce oferă detalii despre comportamentul fiecărei probe la forţe specificate
Dispozitivul este utilizat icircn numeroase domenii alimentar farmaceutic cosmetic medical etc
Accesoriile ce se ataşează de partea de sus a dispozitivului printr-un adaptor special pot
avea forme diverse Majoritatea au formă cilindrică și suprafața de acțiune plată cu diametrul
cuprins icircntre 2 mm şi 50 mm şi sunt realizate din diverse materiale oţel inoxidabil aluminiu
polioximetilenă (cunoscut şi sub denumirea de poliacetal şi comercializat sub marca Delrin) şi
poli (metacrilat de metil) sub denumirea comercială Perspex Atacirct diametrul variabil cacirct şi faptul
că sunt realizate din patru tipuri diferite de material fac posibilă utilizarea pentru numeroase teste
a unor probe diferite [132]
Pentru realizarea testului de compresiune a suporturilor obţinute s-a utilizat accesoriul
cilindric fabricat din aluminiu cu diametrul de 1 inch (337 mm) Suporturile au fost tăiate icircn
70
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
fragmente aproximativ egale iar după ce s-au determinat dimensiunile au fost supuse testului de
compresiune folosind următorii parametrii
viteza de pre-test ndash 01 mmsec
viteza de testare ndash 05 mmsec
distanța de icircntoarcere ndash 6 mm
Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru fiecare
fragment s-au calculat
A = L times l ( ) (9)
unde A este aria probei L este lungimea probei iar l este lățimea probei
F =
(N) (10)
unde Fmax este valoarea forţei măsurată de dispozitiv iar F este forţa de greutate
(11)
unde σ este rezistenţa la compresiune iar icircn final s-a calculat modulul de elasticitate icircntacirclnit
adesea icircn literatură sub denumirea de modulul lui Young (Legea lui Hooke)
(12)
unde ε este deformarea
244 Propritățile magnetice ale suporturilor
Susceptibilitatea magnetică este o măsură a proprietăţilor magnetice a unui material
Această mărime este o constantă adimensională ce indică gradul de magnetizare a unui material
ca răspuns la aplicarea unui cacircmp magentic
Icircn literatură se mai icircntacirclneşte şi termenul de magnetizare şi reprezintă raportul dintre
momentul magnetic şi densitatea de flux magentic Există trei mărimi ale susceptibilităţii
magnetice susceptibilitatea magnetică de masă susceptibilitatea magnetică molară şi
71
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
susceptibilitatea magnetică de volum Susceptibilitatea magnetică de volum se mai numeşte şi
permeabilitatea [133]
Susceptibilitatea magnetică a suporturilor notată cu χm a fost determinată utilizacircnd balanţa
de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto prezentată icircn figura 25
Figura 25 Balanţa de susceptibilitate magnetic Sherwood Scientific MSB Auto [134]
Dacă valoarea obţinută este pozitivă atunci materialul se numeşte paramagnetic iar dacă
este negativă se numeşte diamagnetic [135] Măsurarea susceptibilităţii magnetice s-a făcut la o
intensitatea a campului magnetic H= 45 kGauss (1 Gauss = 1 Oestred) Cunoscacircnd valorile
susceptibilităţii magnetice a unui material se poate calcula magnetizarea acestuia notată cu M
utilizacircnd formula
χm∙H (emug) (13)
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic
Acestă analiză este foarte importantă pentru că oferă informaţii despre cantitatea de fluide
reţinute de suporturi in vitro Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes
biologic s-a realizat cu ajutorul metodei volumetrice prin contactul suporturilor cu soluție PBS
și cu o soluție SBF icircn paralel
72
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Un fragment din suportul analizat a fost pus icircn contact cu PBSSBF pH=72 001 M icircntr-o
microcoloană QIAquickregSpin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o seringă de 1 ml prin
intermediul unei membrane de silicon (figura 26)
Figura 26 Ansamblu de dispozitive utilizat pentru determinarea gradului de retenţie maxim
Dispozitivele au fost incubate la 37degC pentru un interval de timp determinat după care s-a
stabilit volumul de soluţie reţinut de fiecare probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim
notat GRmax utilizacircnd formula
GRmax =
times100 () (14)
unde mf=mi+mabs mabs reprezintă masa de solvent absorbită după intervalul de timp stabilit
iar mi este masa iniţială a probei Densitatea PBS-ului respectiv a SBF-ului se consideră avacircnd
valoarea 1
246 Studii de degradare enzimatică in vitro
Suporturile pe bază de biopolimeri pentru ingineria tisulară şi regenerarea ţesutului osos
sunt degradate in vivo de către enzime icircn mod particular cum ar fi de exemplu hialuronidaza
pentru acidul hialuronic lizozimul pentru chitosan şi colagenaza pentru colagen şi gelatină
Pentru a studia şi cuantifica procesul de biodegradarea al suporturilor pentru ingineria tisulară icircn
literatură există două metode
73
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- metoda directă prin care se cacircntăreşte suport analizat icircnainte şi după ce este supus
procesului de degradare pentru un anumit interval de timp şi se face raportul dintre
greutatea iniţială şi greutatea finală
- metoda indirectă prin care se analizează compuşii rezultaţi icircn urma procesului de
degradare [136]
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd fie lizozim
(enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al chitosanului icircn organismul uman) fie un
complex de lizozim și colagenază (enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al
colagenului icircn organismul uman) Primul pas a fost imersarea unui fragment din fiecare probă
icircntr-un volum de PBS cu lizozim (1200 μgml) sau lizozim cu colagenază (100 μgml) aflată
icircntr-o membrană de dializă introdusă apoi icircn soluţie PBS fără enzime Probele au fost apoi
incubate la 37degC iar la anumite intervale de timp un volum din soluţia de PBS icircn care este
imersată membrana de dializă cu proba de analizat a fost extras şi analizat
Determinarea concentrației de chitosan degradat
Cs este predominat degradat de enzime care hidrolizează legăturile glucozamină ndash
glucoazamină glucozamină ndash N-acetil-glucozamină şi N-acetil-glucozamină ndash N-acetil-
glucozamină Lizozimul şi enzimele bacteriene din colon sunt principalele enzime implicate icircn
procesul de degradare al Cs-ului Lizozimul poate hidroliza atacirct chitina cacirct şi Cs viteza de
degradare fiind invers proporţională cu cristalinitatea polimerilor şi cu gradul de deacetilare al
Cs-ului Icircn corpul uman lizozimul se găseşte icircn diferite concentraţii icircn ser lacrimi salivă şi
urină unde are activitate antibacteriană importantă
Figura 27 Ruperea legăturii β-(1-4) glicozidică din structura chitosanului de către lizozim
74
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Chiar dacă lizozimul din corpul uman este diferit din punct de vedere structural de cel
utilizat icircn testele in vitro studiile au demonstrat că are activitate similară icircn procesul de
biodegradare al chitosanului Activitatea lizozimului creşte o dată cu creşterea gradului de
acetilare al chitosanului sugeracircnd că la locul de acţiune al lizozimului trebuie să existe un minim
de unităţi acetilate pentru a se obţine o rată de degradare iniţială maximă Lizozimul este prezent
icircn mod natural icircn serul uman salivă și alte fluide hidrolizacircnd legătura β-(1-4) glicozidică dintre
N-acetilglucozamină (NAGA) și reziduri ale acidului N-acetil-muramic ce se depun pe pereții
celulei bacteriei [137]
Icircn ceea ce priveşte analiza concentraţiei de chitosan degradat s-a determinat cantitatea de
produşi de biodegradare enzimatică prin evaluarea complexului format cu o soluţie de
K3Fe(CN)6 Soluţia de fericanură de potasiu s-a obţinut prin solubilizarea a 05 g K3Fe(CN)6 icircn
1000 ml de 05 M Na2CO3
1 ml extras din probele de analizat s-a incubat cu 4 ml de K3Fe(CN)6 icircntr-o eprubetă icircn apă
adusă la fierbere timp de 15 minute Soluţia din eprubete s-a răcit la temperatura camerei s-a
transferat icircntr-un flacon de 25 ml s-a adus la semn cu soluţie carbonat de sodiu 05 M după care
s-a citit absorbanţa soluţiei la spectrofotometru UV-VIS la o lungime de undă de 420 nm
Concentraţia de chitosan degradat s-a calculat utilizacircnd o curbă etalon (figura 28)
Figura 28 Curba etalon pentru determinarea concentraţie de chitosan degradat
y = -92591x + 02402 Rsup2 = 09964
0
005
01
015
02
025
0 0004 0008 0012 0016 002 0024
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația N-acetil-D-glucozamină ()
75
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Pentru realizarea curbei etalon s-a preparat o soluţie de N-acetil-D-glucozamină de
concentraţie 002 după care s-au realizat 10 diluţii şi s-a determinat absorbanţa fiecărei soluţii
utilizacircnd aceaşi metodă spectofotometrică menţionată anterior
Determinarea concentrației de colagen degradat
Ninhidrina este o pulbere albă si cristalină solubilă icircn apă si alcool Reacţiile ninhidrinei
utilizacircnd tehnici manuale sau automate sunt folosite pentru analiza şi caracterizarea amino-
acizilor peptidelor proteinelor precum şi a unui număr mare de compuşi icircn numeroase domenii
biomedical clinic alimentar microbiologic histochimic şi altele Icircn ceea ce priveşte
caracterizarea proteinelor icircn urma reacţiei ninhidrinei cu grupările amino rezultă cromoforul
ninhidrinei icircntalnit icircn literatură sub denumirea de violet Ruhemann ndash RP (figura 29) după
numele cerecetătorului care a descoperit reacţia icircn 1910 ce absoarbe radiaţia luminoasă la o
lungime de undă de 570 nm Icircn unele cazuri cantitatea de cromofor formată nu e
stoechiometrică de aceea pentru obţinerea unor rezultate reproductibile icircn reacţie se introduce
un agent reducător cum este de exemplu SnCl2 ce are ca rezultat creșterea intensităţii culorii
[138]
Figura 29 Reacţia dintre ninhidrină şi aminoacizi
Reactivul de ninhdrină s-a preparat prin solubilizarea a 0283times10-3
moli de SnCl2∙2H2O icircn
500mL soluţie tampon citrat-fosfat pH = 5 urmat de adăugarea a 500 mL de 2-metoxietanol care
conţine 20 g de ninhidrină 1 mL extras din probele de analizat probă s-a incubat cu 5 ml reactiv
ninhidrinăicircntr-o eprubetă icircn apă adusă la fierbere timp de 20 minute Soluţia s-a răcit imediat
latemperatura camerei apoi s-au adăugat 20 ml de soluţie amestec apă distilată2 - propanol
(11) Absorbanţa a fost măsurată la 570 nm in celulă de cuarţ cu spectrofotometrul UV-VIS
76
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Curba de calibrare pentru determinarea concentraţiei de grupări NH2 terminale din colagen s-a
realizat utilizacircnd glicină (figura 210)
Figura 210 Curba etalon pentru determinarea concentraţiei de colagen degradat
247 Teste de citotoxicitate in vitro
Un material realizat cu scopul de a fi utilizat icircn contact direct cu un ţestut viu trebuie să fie
obligatoriu citocompatibil Primele teste ce trebuie realizate pentru a analiza această
caracteristică sunt testele in vitro de biocompatibilitate pe culturi de celule Doar după testări
riguroase a unui material pe diverse culturi de celule se poate merge mai departe la realizarea de
teste de citotoxicitate in vivo
Icircntr-un laborator de culturi de celule conservarea celulelor primare sau a liniilor celulare
este o condiţie esenţială deoarece permite atacirct păstrarea calităţii materialului biologic cacirct şi o
organizare eficientă a activităţilor De aceea celulele primare şi liniile celulare sunt criostocate
fie la -86degC fie la -196degC icircn prezenţa de soluţii crioprotectoare evitacircndu-se astfel formarea
cristalelor de gheaţă
Celule care au fost utilizate pentru a testa in vitro biocompatibilitatea suporturilor obţinute
au fost păstrate la -86degC utilizacircndu-se drept agent crioprotectant dimetilsulfoxid ndash DMSO
Suporturile au fost testate pe mai multe linii celulare
- fibroblaste primare NHDF LONZA
- celule stem isolate din ţesut adipos de iepure
y = 16194x + 00799 Rsup2 = 09968
0
01
02
03
04
05
0 00005 0001 00015 0002 00025
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația de glicină ()
77
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- pre-osteoblaste din linia celulară MC-3T3
- osteoblaste din linia celulară MG-63 (celule tumorale)
Prima etapă pentru realizarea unui test de biocompatibilitatea a fost dezgheţarea celulelor
Icircn funcţie de numărul de material testate şi de tipul plăcilor de cultură utilizate s-au folosit fie
flacoane de cultură medii cu suprafaţa de cultură de 75 cm2 fie flacoane de cultură mari cu
suprafaţa de cultură de 175 cm2 Flacoanele s-au incubat(la 37degC 55 CO2 şi umiditate relative
96) cu un anumit volum de mediu de cultură complet (mediu de cultură care se suplimentează
cu 10BFS şi 1 PSN) icircn funcţie de dimensiunea flaconului cu aproxiamtiv 2 ore icircnainte de
dezgheţarea celulelor Criotubul s-a scos de la -86degC s-a imersat rapid icircn apă avacircnd temperatura
37degC şi s-a agitat uşor pacircnă la dezgheţare completă Celule din criotub s-au centrifugat cu mediu
de cultură complet pentru icircndepărtarea agentului crioprotectant după care supernatantul s-a
icircnlocuit cu mediu de cultură complet După ce s-au numărat celulele s-a adăugat icircn flaconul de
cultură un volum potrivit de suspensie celulară Mediul de cultură din flacon a fost icircnlocuit zilnic
cu mediu proaspăt pacircnă la formarea unui monostrat confluent
După formarea monostratului următoare etapă a fost popularea cu celule a plăcilor de
cultură pe care au fost testate suporturile Pentru a desprinde celulele din flacon şi a realiza o
suspensie celulară s-a utilizat o soluţie de tripsină 025 EDTA 002 Icircnainte de adăugarea
soluţie tripsinăEDTA s-a icircndepărtat mediului de cultură din flacon iar apoi suprafaţa de cultură
a fost spălată de cateva ori cu HBSS cu roşu fenol fără calciu pentru a fi icircndepărtate urmele de
mediu care ar icircngreuna acţiunea tripsinei După centrifugare cu mediu de cultură complet icircn
vederea icircndepărtării resturilor de tripsină s-a icircnlocuit supernatantul cu mediu complet după care
s-au numărat celulele cu ajutorul unei camere de numărat celule Neubauer s-a realizat o
suspensie de celule icircn mediu complet după care s-a distribuit icircn fiecare godeu al plăcilor de
cultură un anumit volum de suspensie conţinacircnd numărul de celule calculat icircn funcţie de tipul de
celule şi numărul de godeuri al plăcilor de cultură
Icircn funcţie de tipul materialului analizat (pudre nanoparticule emulsii suporturi compacte
suporturi poroase etc) se pot realiza teste de biocompatibilitate prin contact direct prin metoda
eluţiei (contact indirect) sau prin metoda difuziei Contactul direct presupune adăugarea propriu-
zisă a fragmentelor din materialul testat icircn godeurile plăcilor de cultură cultivate cu celule
contactul indirect presupune adăugarea unui extract din materialul analizat analizacircndu-se de cele
mai multe ori diverse concentraţii ale extractului iar metoda difuziei constă icircn acţiunea
78
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
compusului analizat asupra celulelor printr-un strat de gel de agaroză ce acoperă cultura de
celule Suporturile obţinute icircn studiul de faţă au fost analizate prin contact direct şi prin contact
indirect [139]
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare după ce suporturile au fost sterilizate
fragmente de suportextract de suport au fost puse pe plăcile de cultură conţinacircnd celule ce au
fost incubate icircn placi cu 24 ore icircnainte
Testele realizate pentru studiul biocompatibilităţii suporuturilor au fost testul MTT la 24
48 și 72 ore de contact şi testul de viabilitate celulară cu Calceina-AM
2471 Testul MTT
Pentru realizarea testului MTT ndash [bromură de (3-[45-dimetiltiazol-2-il]-25-difenil)
tetrazoliu] fragmentele de material au fost extrase şi mediul de cultură icircnlocuit cu soluție de
lucru MTT (MTT 5 icircn mediu de cultură fără BFS şi amestec de antibiotice) Testul MTT se
bazează pe capacitatea celulelor viabile cu metabolism activ să reducă MTT-ul icircn cristale de
formazan de culoare albastru-violet (figura 211) [140]
Figura 211 Structura bromurii de tetrazolium MTT şi a produsului redus formazan
Celulele cu soluția MTT au fost incubate la 37degC pentru un anumit interval de timp icircn
funcţie de tipul de celule după care s-a extras soluţia MTT cristalele de formazan formate fiind
solubilizate cu alcool izopropilic Absorbanța soluției de formazan rezultată (culoare albastru-
violet) a fost măsurată spectrofotometric la λ=570nm cu ajutorul unui cititor de plăci (Tecan
Sun-rise Plate Reader) Rezultatele citirii spectrofotometrice din godeurile experimentale au fost
79
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
raportate la godeurile de control icircn care nu au fost prezente fragmente de materialextract
Raportul calculat a constituit viabilitatea celulară (V)
V =
(15)
unde abs suport este absorbanța din godeul conţinacircnd fragment de suportextract iar abs control
este absorbanța controlului
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Calceina AM este un colorant care are capacitatea de a colora icircn verde doar celule viabile
icircn mod particular citoplasma acestora După ce pătrunde icircn celulă calceina AM substanţă
incoloră este hidrolizată de esteraza din citoplasmă icircntr-un produs verde fluorescent (figura
212) [139] Pentru realizarea testului mediul de cultură din godeuri a fost extras iar apoi celule
au fost spălate de două ori cu HBSS cu calciu fără roşu fenol Icircn final s-a adăugat soluţie de
calceină (1-2 microL calceină la 1 mL HBSS cu calciu fără roşu fenol) iar placa de cultura a fost
introdusă icircn incubator pentru 20 min După cele 20 min celulele s-au vizualizat la microscop
confocal cu fluorescenţă (Leica Germania) şi s-au preluat imagini Testul s-a realizat la intervale
de timp diferite icircn funcţie de metoda de contact şi tipul celulelor
Figura 212 Schema de legare a Caleinei ndash AM la celulele viabile
80
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
248 Teste de citotoxicitatea in vivo
Pentru a demonstra siguranța unui material medical după o caracterizare riguroasă acesta
trebuie testat din punct de vedere al citotoxicității in vivo
Testele de citotoxicitate in vivo au fost realizate conform recomandărilor ISO Standard
10993 la Facultate de Medicină Veterinară din Iaşi sub coordonarea domnului Prof Dr Mareş
Mihai Studiile au fost realizate conform Directivei UE 632010 și cu acordul comitetului de
etică din cadrul instituției
S-au utilizat șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie
de 28 plusmn 3 grame materialul biologic provenind din Biobaza INCDMI Cantacuzino București
- filiala Băneasa Animalele au fost ţinute icircn condiții zooigienice corespunzătoare speciei și
vacircrstei temperatură și umiditate constante regim de iluminare 12 orezi acces liber la hrană
(furaj combinat complex) manipularea animalelor fiind făcută cu blacircndețe fără a le produce
stres sau durere Cu 3 zile icircnainte de icircnceperea experimentului animalele au fost mutate icircn
laborator pentru a se acomoda cu mediul ambiant
Pentru implant materialele au fost secționate sub diverse forme pătrate sau discuri apoi
au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 4 ore Animalele au fost grupate
icircn loturi icircn funcţie de numărul de suporturi analizate fiecare lot cuprinzacircnd un anumit număr de
animale
Icircnainte de intervenția chirurgicală zona de implant a fost tunsă și aseptizată cu betadină
soluție cutanată 10 Implantarea fragmentelor de suporturi s-a realizat subcutanat icircn condiții
aseptice prin incizia sterilă a pielii din regiunea dorsală a șoarecilor Inducția anestezică (15-30
de secunde) s-a realizat cu isofluran 4 iar pentru a se asigura liniștea intraoperatorie pe
parcursul a 15 minute (timp necesar inciziei depunerii fragmentului de suport și suturii pielii) a
fost utilizată concentrația de 15
Durata experimentului a fost diferită icircn funcție de lotul de suporturi testate După
sacrificarea animalelor s-au efectuat examene histopatologice Icircn vederea realizării preparatelor
microscopice fragmentele de țesut (cu sau fară material) au fost fixate icircn soluţie de formaldehidă
10 timp de 7 zile şi apoi incluse icircn blocuri de parafină prin metoda rapidă de includere
Blocurile de parafină au fost secţionate apoi icircn secţiuni de 5 microm cu ajutorul microtomului de
laborator Secţiunile rezultate au fost etalate pe lame histologice cu ajutorul albuminei Mayer
81
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
colorate Tricromic Masson și examinate microscopic Preparatele au fost examinate la microscop
şi interpretate
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
La nivel mondial cancerul rămacircne a doua cea mai comună cauză de deces icircn ciuda
icircncercărilor avansate de prevenție diagnosticării icircn stadiu incipient și a protocoalelor de
tratament riguroase [141] Icircn ceea ce privește tumorile osoase acestea sunt diagnosticate icircn
special la pacienți adulți sau vacircrstnici excepție făcacircnd osteosarcomul tumoră icircntacirclnită
preponderent la pacienți cu vacircrste cuprinse icircntre 10 și 20 și destul de rar la vacircrstnici
Icircn unele cazuri tratamentul tumorilor osoase maligne are drept primă etapă rezecția
chirurgicală a tumorii iar icircn a doua etapă pacientul urmează ședințe de radioterapie Cele două
tehnici nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral chimioterapia precedacircndu-le de regulă
Plecacircnd de la această schemă de tratament s-au realizat studii privind potențiala aplicație a
suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircntr-o primă fază suporturile au fost expuse la raze X după care au fost caracterizate din
punct de vedere fizico-chimic și biologic icircn vederea analizei influenței radiațiilor asupra
proprietăților suporturilor
Iradierea suporturilor cu raze X s-a realizat cu ajutorul dispozitivului CT-Sim Siemens
Somatom Definition figura 213 Deoarce grosimea materialului iradiat a fost de aproximativ 12
mm acesta a fost fixat pe un suport de 5 mm a cărui dimensiune a fost inclusă icircn calculul
parametrilor de iradiere
Figura 213 Dispozitivul CT-Sim Siemens Somatom Definition (stacircnga)Simularea CT
(dreapta)
82
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi
Sistemele de eliberare controlată de medicamente sunt studiate pentru tratamentul
alternativ a unor tipuri diferite de cancer Cele mai studiate sisteme sunt cele pe bază de polimeri
ceramice sau compozite ale acetora Polimerii cei mai utilizați la realizarea de sisteme de
eliberare sunt polietilen glicolul (PEG) polietilen oxidul poli (caprolactona) chitosanul
alginatul alcoolul polivinilic polimetil metacrilatul celuloza etc Și unele proteine
preponderant colagenul sunt utilizate pentru realizarea de sisteme de eliberare controlată dar
instabilitate lor chimică și fizică ridică anumite probleme tehnice [141]
Doxorubicina a fost medicamentul chimioterapic avut icircn vedere pentru studiul de față
Pentru prepararea de suporturilor cu potențial de utilizare ca sistem de eliberare de medicament
icircntr-o suspensie coloidală de nanoparticule magnetice (1 ) obținute conform protocolului
descris anterior (subcaptiol 231) s-a solubilizat 0125 doxorubicină Nanoparticulele
icircncărcate cu medicament au fost folosite la prepararea de suporturi după protocolul descris icircn
subcapitolul 23
Eliberarea in vitro a medicamentului a fost studiată cu atenție Primul pas a fost imersarea
a 20 mg din fiecare probă icircn PBS pH = 72 001M icircntr-o memebrană de dializă care a fost
complet imersată icircntr-un alt volum de PBS Studiul de eliberare a fost efectuat la 37ordmC pe o
perioadă de 14 zile La anumite intervale de timp un volum de PBS icircn care a fost imersată
membrana de dializă a fost extras pentru analiza UV-Vis și icircnlocuit cu același volum de PBS
proaspăt Absorbanța fiecărui volum de PBS extras a fost analizată utilizacircnd spectrofotometrul
NanoDrop ND 1000 (Thermo Fisher) la 480 nm Pentru trasarea curbei etalon s-au preparat
soluţii de diferite concentraţii de medicament (pe domeniul 1 microg ndash 10 microg) icircn PBS
83
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe
bază de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic
gelatină) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și apatite hidroxiapatite sau alți fosfați de
calciu cu aplicații icircn ingineria tisualră a țesutului osos sunt studiate icircn detaliu de aproape două
decenii Imitarea matricei extracelulare a țesuturilor umane a devenit o provocare pentru
ingineria tisulară datorită complexității sale fizice chimice și biologice prin urmare este
esențială alegerea biopolimerilor care să satisfacă criterii de compatibilitate chimică
biocompabibiltate biodegradabilitate controlată Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul
biologic și degradați metabolic Chitosanul colagenul gelatina alginatul condroitin sulfatul și
acidul hialuronic sunt printre cei mai studiați biopolimeri datorită argumentelor menționate
anterior și a similarității lor cu componentele matricei extracelulare [142-144]
Chitosanul ndash Cs un biopolimeri foarte versatil este unul din cei mai studiaţi pentru
ingineria tisulară a țesutului osos datorită proprietăţilor sale remarcabile biocompatibilitate
biodegradabilitate proprietăţi antibacteriene hemostatice şi antitumorale [55 56 145-148] De
asemenea susţine in vitro adeziunea şi proliferarea celulară a osteoblastelor precum şi formarea
de matrice osoasă mineralizat [149] Icircn ceea ce priveşte comportamentul in vivo un număr
semnificativ de studii au demonstrat faptul că suporturile pe bază de chitosan susţin
osteoconductivitatea icircn defecte osoase obţinute chirurgical [150]
Gelatina ndash G proteină derivată din colagen este un biopolimer degradabil cu
biocompatibilitate excelentă adesea utilizată icircn domeniile biomedical şi farmaceutic Icircn
combinaţie cu alţi biopolimeri adesea cu chitosanul gelatina contribuie la creşterea adeziunii
celulare [151] [152]
Acidul hialuronic ndash Hya susţine regenerarea tisulară la locul defectelor osoase prin
stimularea formării de calus [153] De asemenea rezultatele unor studii in vitro și in vivo au
sugerat o legătură icircntre creștere sintezei de acid hialuronic după tratatamentul cu parathormon și
resorbția osoasă ulterioară ceea ce ar putea indica o posibilă relație icircntre sinteza biopolimerului
și creșterea activității osteoclastelor [154]
Studiile icircn domeniu au evidenţiat faptul că o concentraţie scăzută de albumină serică
bovină ndash Bsa poate susţine mineralizarea ţesutului osos prin stimularea creşterii cristalelor de
84
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
fosfaţi de calciu [155] [156] icircn schimb o concentraţie mare de albumină poate chiar inhiba
creşterea lor [157]
Avacircnd icircn vedere proprietăţile menţionate mai sus ale celor patru biopolimeri (chitosan
acid hialuronic gelatină şi albumină) s-a emis ipoteza că prin realizarea unor combinații ale
acestora cu fosfați de calciu și particule magnetice se pot obține suporturi magnetice cu
performanțe crescute icircn regnerarea tisulară osoasă (Figura 31)
Figura 31 Suporturi pe bază de biopolimeri fosfați de calciu și nanoparticule magentice
Fosfații de calciu componenta fazei anorganice a țesutului osos uman stimulează
osteoconductivitatea și osteoinductivitatea Importanța utilizării nanoparticulelor magnetice icircn
suporturi compozite pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost detaliată icircn capitolul 1
Alegerea unei concentrații de nanoparticule adecvată este o provocare o concentrație prea mică
poate avea riscul de a nu conferi proprietăți magnetice suportului icircn care sunt incluse iar o
concentrație prea mare poate duce la un eventual caracter citotoxic al suportului Studiile icircn
85
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
domeniu prezintă prepararea de suporturi magnetice ce au icircncoporate concentrații diferite de
particule 05 1 2 3 7 5 sau 10 [9091 92] etc
Pentru a putea concluziona care ar fi concentrația optimă de particule introdusă icircn sinteză
s-au selectat trei concentraţii diferite de particule magentice 1 3 și 5 astfel icircncacirct să se
evite efectele toxice menținacircndu-le pe cele magnetice icircn domeniile terapeutice
31 Obţinerea suporturilor
Suporturile s-au obţinut printr-o metodă biomimetică de co-precipitare a fosfaţilor de
calciu din precursorii săi icircn prezențicirc de biopolimeri și particule magnetice Astfel soluții de
Ca(NO₃)₂∙4H2O(40 icircn apă distilată) şi NaH2PO4middotH2O (25 icircn apă distilată) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri (Cs (1 icircn soluție 15 HCl) Hya (2 in apă distilată)
Bsa (2 in apă distilată) G (2 in apă distilată)) Soluţia de Cs (1) a fost obţinută prin
dizolvare de Cs icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Separat s-au adăugat soluții de Hya (2)
Bsa (2) și G (2) (icircn apă distilată) astfel icircncacirct concentraţia să fie 10 faţă de cantitatea totală
de chitosan introdusă icircn sinteză Icircn fiecare amestec de biopolimercombinaţii de biopolimeri şi
precursori de fosfaţi de calciu s-au integrat concentraţii diferite de particule magnetice 1 3
şi 5 raportat faţă de cantitatea de substanţă uscată introdusă icircn procesul de sinteză pH-ul
amestecului final a fost ajustat la 72-74 prin adaos de soluţie de amoniac NH4OH (25 )
Raportul CaP a fost menținut la 165 icircn toate suporturile valoare comparabilă cu cea din ţesutul
osos uman [158]
Fiecare amestec compozit a fost spălat de 3 ori cu apă distilată separat prin centrifugare
(5000 rpm 10 minute) iar ultimul pas a constat icircn liofilizarea amestecurilor timp de 24 h
Cele patru tipuri diferite de suporturi au fost codificate icircn funcţie de compoziţia lor după
cum se observă icircn tabelul 31
Tabel 31 Compoziţia şi codificarea suporturilor
Denumirea
Suportului
ChitosanAlt biopolimer Concentraţia de
MNPs
Cs 1
Cs
1
Cs 3 3
Cs 5 5
Cs-Hya 1 Cs-Hya 1
86
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs-Hya 3 3
Cs-Hya 5 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa
1
Cs-Bsa 3 3
Cs-Bsa 5 5
Cs-G 1
Cs-G
1
Cs-G 3 3
Cs-G 5 5
Suporturile biomimetice pe bază de diferite amestecuri de chitosan și biopolimeri
(albumină acid hialuronic gelatină) cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei (spectroscopia IR cu
transformată Fourier ndash FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de energie ndash EDS) difracţie
cu raze X (XRD) și morfologic (microscopie electronică de baleiaj ndash SEM) De asemenea s-a
urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au
analizat proprietăţile magnetice Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi
printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
32 Rezultate și discuții
321 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR picuri caracteristice
biopolimerilor din compoziţie fosfaţilor de calciu şi particulelor magnetice fiind identificate pe
spectrele FTIR (figura 32)
Icircn ceea ce priveşte spectrul FTIR al suportului Cs 3 s-au observat benzile caracteristice
Cs-ului după cum urmează gruparea -OH la 3430 cm-1
gruparea ndashCH2 la 2923 cmminus1
amida I la
1655 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii CndashN la 1322 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării
CndashO la 1029 cm-1
[159] Pentru acelaşi suport s-au mai putut observa picuri specifice grupării
fosfat PO43-
icircn regiunea 600 cm-1
[99] şi grupării FendashO din particulele magnetice la 560 cm
-1
[160]
87
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Icircn cazul suportului Cs-Bsa 3 s-a observat o creştere semnificativă a intensităţii picului
1657 cmminus1
ce corespunde amidei I drept rezultat a vibraţiei de icircntindere a grupării C=O din
legătura peptidică Picul de la numărul de undă 1546 cm-1
corespunde amidei II iar picul de la
1240 cm-1
amidei III din componenta proteică [161]
Figura 32 Spectrele FTIR ale suporturilor
Pe spectrul FTIR pentru suportul Cs-Hya 3 s-au observat următoarele picuri picul pentru
vibraţia de icircntindere a grupăriindashOH la 3422 cm-1
picul pentru gruparea -CH2 la 2923 cm-1
picul
pentru amida primară I la 1654 cm-1
picul pentru COO- la 1420 cm
-1 şi picul pentru C-O la 1029
cm-1
[162]
322 Compoziția suporturilor
Icircn figura 33 este redată difractograma XRD pentru suporturile obţinute datele XRD
oferind informaţii despre faza anorganică şi despre cristalinitatea acestora
88
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
S-au observat următoarele picuri caracteristice 303ordm 356ordm 535ordm şi 574ordm ce pot fi
associate planelor (220) (311) (422) şi (511) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF
No 65-3107) Picuri specifice fosfaţilor de calciu de la unghiurile 23ordm 26ordm 28ordm 32ordm 335ordm 40ordm
48ordm şi 50ordm sunt corelate cu planurile (121) (002) (210) (112) (300) (310) (203) (213) şi
confirmă formarea următoarelor tipuri de fosfaţi de claciu Ca(H2PO4)22H2OmCaHPO4
Ca4(HPO4)3 25 H2O respectiv Ca3H2(P2O7)24H2O [47]
De asemenea un aspect foarte important care a fost observat a fost acela că principalul tip
de fosfat de calciu format icircn structura suporturilor compozite este hidroxiapatita
(Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul de calciu cu cele mai bune proprietăţi pentru formarea de ţesut osos
Figura 33 Spectrul XRD pentru suporturile obţinute
Compoziţia chimică a suporturilor a fost studiată cu ajutorul analizei EDX rezultatele fiind
redate icircn figura 34 Principalele tipuri de fosfați de calciu identificati pe spectrele XRD și EDX
sunt prezentați icircn tabelul 32
Tabel 32 Diferite forme de CP prezente icircn compozitele Cs-CP conform datelor XRD și EDX
Forme de fosfați de
calciu Formulă chimică Raport CaP
MCPM Ca(H2PO4)2middotH2O 05
Fosfat monocalcic
anhidru Ca(H2PO4)2 05
89
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Fosfat dicalcic
anhidru CaHPO4 100
Hidroxiapatită Ca10(PO4)6(OH)2 167
Fosfat tricalcic Ca3(PO4)2 15
Figura 34 Spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3
Pe spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3 s-au observat semnale intense icircn
regiunea elementelor Ca P O C Fe ceea ce confirmă compoziţia suporturilor fosfaţi de calciu
biopolimeri particule magnetice De asemenea din datele EDX obţinute s-a calculat raportul
molar al fazei minerale dintre calciu şi fosfor rezultatele indicacircnd formarea de diferite tipuri de
fosfaţi de calciu icircn structura suporturilor evidenţiindu-se fosfatul tricalcic (CaP = 152) icircn cazul
suportului Cs-Bsa 3 şi hidroxiapatita icircn cazul suportului Cs-G 3 [163]
90
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
323 Morfologia suporturilor
Icircn figura 35 sunt prezentate datele SEM obținute pentru suporturile Cs 3 Cs-Hya 3
Cs-Bsa 3 și Cs-G 3 la diferite grade de mărire Morfologia a fost studiată icircn secţiunea
suporturilor imaginile evidenţiind o porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea
fosfaţilor de calciu pe structura polimerică Particulele magnetice sunt complet integrate icircn
structura compozită
Figura 35 Morfologia suporturilor la două ordine diferite de mărire
Suporturile sintetizate pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară a ţesutului osos trebuie să aibă o
structură poroasă specifică şi o dimensiune a porilor adecvată aplicaţiei vizate Icircn primul racircnd
porii suportului trebuie să fie interconectaţi pentru a promova adeziunea şi creşterea
osteoblastelor migrarea nutrienţilor şi vascularizarea precum şi infiltrarea icircn matricea biologică
[164] [165] Icircn ceea ce priveşte dimensiune porilor icircn literatură există date contradictorii acest
aspect fiind explicat de complexitatea procesului de regenerare osoasă in vivo Astfel unele
studii recomandă utilizarea suporturilor cu dimensiunea a porilor cuprinsă icircntr-un interval foarte
larg de la 20 microm pacircnă la 1500 microm [166] [167] alte studii recomandă o dimensiune a porilor
icircntre 150 şi 600 microm sau icircntre 400 şi 1500 microm [168]
91
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Dimensiunile porilor suporturilor sintetizate (tabel 33) au fost calculate din imaginile
SEM prin analiza cantitativă a parametrilor imaginilor utilizacircnd funcția threshold a programului
ImageJ
Pentru fiecare imagine SEM măsurătorile au fost repetate de 10 ori la final fiind calculate
dimensiunea maximă a porilor dimensiunea medie a porilor dimensiunea minimă a porilor și
deviația standard S-a observat că dimensiunile maxime ale porilor au fost icircnregistrate pentru
suportul Cs-Hya 3 iar dimensiunile minime pentru suportul Cs-Bsa 3 Cel mai mic interval
dintre minimul și maximul dimensiunilor unui suport a fost calculat pentru suportul Cs-Bsa 3
ceea ce indică că acest suport are cea mai uniformă distribuție a porilor
Tabel 33 Dimensiunea porilor (microm)
Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
Deviația
standard 99458plusmn18938 111525plusmn16967 75084plusmn9075 92383plusmn13549
Dimensiunea
minimă 398541 451762 319411 456391
Dimensiunea
maximă 1946331 213656 1121936 154929
Dimensiunea
medie 952598 988953 672699 8149395
324 Proprietăţi magnetice
Deoarece obiectivul tezei de faţă implică utilizarea de particule magnetice ce vor fi
funcţionalizate cu medicamente rolul particulelor fiind de transportori a principiilor active ce
vor fi eliberate controlat studiul proprietăţilor magnetice ale suporturilor este esenţială Pentru a
stabili concentraţia optimă de particule introduse icircn sinteză icircn acest prim studiu s-au analizat trei
concentraţii diferite Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 34
Tabel 34 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Susceptibilitatea
magnetică de
masă
Magnetizarea
(emug)
Cs 1 1 0016middot e-4
132
Cs 3 3 009middot e-4
742
92
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs 5 5 0123middot e-4
1014
Cs-Hya 1 1 0003middot e-4
025
Cs-Hya 3 3 minus minus
Cs-Hya 5 5 0152middot e-4
1253
Cs-Bsa 1 1 0027middot e-4
226
Cs-Bsa 3 3 0074middot e-4
610
Cs-Bsa 5 5 0099middot e-4
816
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de masă a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 025 şi 1253 emug au fost mai mici decacirct cele ale
particulelor magnetice (4365 emug) [160] ce nu au fost icircncorporate icircn suport sau icircn oricare altă
structură compozită complexă
Icircntr-un studiu publicat de Heidari şi colaboratorii [99] s-au obţinut şi caracterizat nano-
suporturi magnetice pe bază de chitosan şi hidroxiapatită cu o valoare a magnetizării de 304
emug măsurată la o intensitate a cacircmpului magnetic H = 5189 kOe la temperatura camerei Un
alt studiu publicat de Bock şi colaboratorii [90] prezintă sinteza şi caracterizarea de suporturi pe
bază de hidroxiapatită şi colagen cu incluziune de tipuri diferite de fero-fluide magnetice La o
intensitate a cacircmpului magnetic de 10 kOe s-au obţinut valori ale magnetizării cuprinse icircntre 12
şi 15 emug pentru toate tipurile de suporturi sintetizate S-a observat că pentru o concentrație de
1 particule magnetice valorile obținute pentru magnetizare sunt prea mici comparabile cu cele
din literatură pentru concentrația de 5 fiind obținute valorile cele mai apropiate Comparacircnd
valorile obţinute cu datele de literatură s-a putut afirma că suporturile obţinute sunt
superparamagentice
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Interacţiunea suporturilor cu fluidele de interes biologic este un aspect important icircn ceea ce
priveşte potenţialele aplicaţii ale acestora icircn domeniul ingineriei tisulare a osului Pentru
suporturile obținute s-a studiat interacțiunea suporturilor cu două fluide soluție tampon fosfat-
PBS și fluid biologic simulat - SBF
93
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de aproximativ 5 mg din fiecare suport a fost pus icircn contact cu o soluţie PBSSBF pH = 72
001M icircntr-o microcoloană QIAquickreg
Spin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o
seringă de 1 ml prin intermediul unei membrane de silicon Dispozitivele au fost incubate la
37ordmC pentru un interval de 48 ore după care s-a stabilit volumul de PBSSBF reţinut de fiecare
probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din capitolul 2
Rezultatele obţinute cu privire la acest studiu sunt redate icircn tabelul 35
Tabel 35 Gradul de retenţie PBS și SBF () al suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Gradul de
retenţie PBS
()
Grad de retenție
SBF
()
Cs 1 1 704plusmn22 680plusmn35
Cs 3 3 645plusmn12 632plusmn14
Cs 5 5 676plusmn21 530plusmn25
Cs-Hya 1 1 784plusmn24 667plusmn31
Cs-Hya 3 3 714plusmn45 630plusmn29
Cs-Hya 5 5 490plusmn22 475plusmn17
Cs-Bsa 1 1 700plusmn39 654plusmn41
Cs-Bsa 3 3 454plusmn61 567plusmn16
Cs-Bsa 5 5 806plusmn78 515plusmn20
Cs-G 1 1 465plusmn35 421plusmn34
Cs-G 3 3 805plusmn42 625plusmn09
Cs-G 5 5 755plusmn27 722plusmn15
Pentru toate suporturile s-au obţinut valori mari ale gradului de retenţie PBS () acestea
fiind cuprinse icircntre 400 şi 800 Aceste valori au fost corelate pe de o parte cu structura
poroasă tridimensională a suporturilor iar pe de altă parte cu proprietăţile hidrofile ale
biopolimerilor atribuite grupărilor lor funcţionale
Icircn cazul suporturilor icircn care matricea polimerică este reprezentată doar de chitosan s-a
observat o variaţie foarte mică a valorile gradului de retenţie cea mai mare valoare fiind
măsurată la suporturile cu o concentraţie minimă de particule magnetice Icircn schimb icircn cazul
94
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
suporturilor Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G s-a observat o influenţă semnificativă a particule magnetice
asupra gradului de retenție Astfel icircn cazul suporturilor care au Hya icircn compoziţie s-a observat o
descreştere a gradului de retenţie pe măsură ce concentraţia de particule magnetice creşte pe
cacircnd pentru suporturile ce conţin albumină s-a observat o valoare maximă a gradului de retenţie
pentru suportul cu cea mai mare concentraţie de particule magnetice Suporturile Cs-G au
valorile gradului de retenţie apropiate pentru concentraţiile de particule magnetice de 3
respectiv 5 valoarea minimă fiind icircn cazul suportului Cs-G 1
Icircn ceea ce privește interacțiunea suporturilor cu soluția SBF prezența ionilor pozitivi (Na+
K+ Ca
2+ Mg
2+) și a ionilor negativi (HPO4
2- Cl
- HCO3
2- SO4
2- ) precum și abilitatea acestora
de a interacționa cu componentele suporturilor diminuează retenția de fază apoasă a suporturilor
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea suporturilor a fost studiată in vitro icircn prezenţa lizozimului pentru o perioadă
de 16 zile rezultatele studiului fiind prezentate icircn figura 36 A fost utilizată o concentraţie de
lizozim cu valoare apropiată de concentraţia lizozimului icircn serul uman [169]
Figura 36 Degradarea suporturilor
Analizacircnd rezultatele (tabel 36) s-a observat că procesul de degradare are practic două
etape Icircn prima etapă ce corespunde primelor 8 zile a avut loc o degradare mai accentuată a
suporturilor pe cacircnd icircn a doua etapă a urmat o icircncetinire a procesului de degradare Acest proces
de degradare icircn două etape a fost prezentat şi icircn alte studii şi poate fi explicat de faptul că
02
0
4
06
0
8
Cs 1 Cs 3 Cs 5 Cs-Hya 1
Cs-Hya 3
Cs-Hya 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa 3
Cs-Bsa 5
Cs-G 1
Cs-G 3
Cs-G 5
Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat
m
moli
L
2 zile 8 zile 16 zile
95
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
lizozimul conține un loc de legare hexameric iar secvențele hexazaharidice conținacircnd 3-4 sau
mai multe unități acetilate au o puternică influenţă asupra vitezei inițiale de degradare a
chitosanului După o pierdere mare de masă inițială viteza de degradare a suporturilor a scăzut
considerabil ca rezultat al pierderii secvențelor de hexazaharidă [170]
Tabel 36 Degradarea in vitro a suporturilor icircn prezenţă de lizozim
Denumirea
suportului
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
2 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
8 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
16 zile (mmoliL)
Cs 1 04045plusmn00014 06800plusmn00042 07452plusmn00028
Cs 3 04081plusmn00007 06292plusmn00028 06727plusmn00057
Cs 5 03791plusmn00064 06510plusmn00014 07343plusmn00021
Cs-Hya 1 03574plusmn00049 05132plusmn00028 06075plusmn00014
Cs-Hya 3 03827plusmn00028 07017plusmn00028 07379plusmn00071
Cs-Hya 5 03755plusmn00064 07742plusmn00028 07814plusmn00014
Cs-Bsa 1 03175plusmn00042 05640plusmn00085 07162plusmn00028
Cs-Bsa 3 03538plusmn00028 06510plusmn00035 06655plusmn00014
Cs-Bsa 5 03538plusmn00028 06582plusmn00028 06655plusmn00014
Cs-G 1 04226plusmn00049 07669plusmn00014 07814plusmn00014
Cs-G 3 04154plusmn00007 07887plusmn00042 08032plusmn00014
Cs-G 5 05024plusmn00035 07887plusmn00014 08249plusmn00042
După cum se poate observa icircn tabelul 36 pentru toate cele patru tipuri diferite de suporturi
Cs Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G concentraţia de particule magntice adăugate nu influenţează
semnificativ degradarea acestora Pentru toate cele trei intervale de timp la care s-a analizat
concentraţia de Cs degradat cele mai mari valori au fost obţinute pentru matricile Cs-G 5
96
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
3271 Testul MTT
Pentru evaluarea citotoxicității in vitro pe culturi de celule s-a utilizat metoda contactului
indirect realizacircndu-se un extract din suporturile obținute care icircn prealabil au fost sterilizate 10
mg din suporturile Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3 au fost introduse icircntr-o membrană
de dializă conținacircnd 4 ml alcool etilic 70 membrana de dializă fiind introdusă la racircndul ei icircntr-
un flacon steril conținacircnd 25 ml alcool etilic 70 După 30 minute alcool din flacon a fost
evacuat membrana de dializă fiind lasată icircn hotă pentru evaporarea alcoolui după care a fost
spălată icircn repetate racircnduri prin imersare icircn 25 ml PBS Fiecare probă din membrană de dializă a
fost imersată icircn 4 ml mediu de cultură complet și lasată la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului După cele 24 ore extractul a fost filtrat printr-un filtru de 70 microm
după care s-a măsurat volumul rezultat şi s-au adăugat 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost adus icircn contact cu două linii celulare diferite preosteoblaste MC3T3
(figura 37) și fibroblaste din derm uman (figura 38) icircn placi de 96 godeuri fiecare godeu
conținacircnd 3000 celule Cele două tipuri de celule au fost incubate pentru 24 ore icircn mediu de
cultură DMEM conținacircnd 10 BFS și 1 PSN Mediul complet a fost icircnlocuit complet după
cele 24 ore cu 150 μL extract Testul MTT s-a realizat la 24 48 și 72 ore calculacircndu-se
viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (15) din capitolul 2
Figura 37 Viabilitatea celulară a preosteoblatelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
97
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 38 Viabilitatea celulară a fibroblastelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
După 24 ore viabilitatea preosteoblastelor a fost cuprinsă icircntre 91 (Cs 3) şi 95 (Cs-
Bsa 3) pe cacircnd viabilitatea fibroblastelor a fost icircn jur de 96 pentru toate cele patru suporturi
analizate diferenţa foarte mică de procente fiind explicată de sensibilitatea crescută a
preosteobastelor Pentru ambele linii celulare s-a observat o uşoară scădere icircn timp a viabilităţii
celulare cea mai mică valoare calculată 88 fiind pentru suportul Cs-Hya 3 după 72 de ore
de contact a extractului cu fibroblastele
Datele obţinute icircn urma testului MTT au indicat faptul că suporturile nu au eliberat
compuşi citotoxici icircnglobaţi icircn structura suporturilor icircn momentul sintezei sau neicircndepărtaţi
care să influenţeze negativ ataşarea şi proliferarea celulară
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată biocompatibilitatea suporturilor şi lipsa unor efecte adverse a
acestora asupra celulelor s-a realizat un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM rezultatele
testului fiind redate icircn figura 39 Acelaşi extract utilizat la testul MTT a fost incubat cu
fibroblaste pentru 24 respectiv 96 ore
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
98
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 39 Viabilitatea celulară icircn urma testului cu Calceină-AM
Comparacircnd imaginile reprezentacircnd celulele incubate cu extractul suporturilor Cs-Bsa 3
respectiv Cs-G 3 cu imaginile reprezentacircnd celule care au fost incubate fără extract s-a
observat că nu există diferenţe de densitate celulară la niciunul din cei doi timpi de contact ceea
ce indică lipsa efectelor adverse a suporturilor asupra fibroblastelor
Atacirct rezultatele obţinute icircn urma testului MTT cacirct şi rezultatele obţinute icircn urma testului
cu Calceină-AM au evidenţiat un comportament bun al suporturilor la contactul cu cele două linii
celulare (fibroblaste şi preosteoblaste) ceea ce a condus la concluzia că suporturilor sunt
biocompatibile in vitro
99
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
33 Concluzii
Icircn capitolul de față s-au obținut și caracterizat suporturi compozite pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de concentrații diferite de particule magentice
Chitosanul unul din biopolimeri cei mai utilizați icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost
combinat cu acid hialuronic albumină serică bovină sau gelatină
Analizacircnd structura chimică a suporturilor s-a observat icircn spectrele FTIR
prezența picurilor caracteristice tuturor componentelor introduse icircn sinteza Diferite tipuri de
fosfați de calciu au fost identificate icircn faza cristalină a suporturilor cel mai impotant dintre
aceștia fiind hidroxiapatita identificată icircn suportul Cs-G 3
Morfologia a fost studiată icircn secţiunea suporturilor imaginile evidenţiind o
porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea fosfaţilor de calciu pe structura polimerică
Particulele magnetice sunt complet integrate icircn structura compozită Dimensiunea minimă a
porilor a fost icircn jur de 300 microm iar dimensiunea maximă icircn jur de 2000 microm
Comparacircnd valorile obţinute pentru magnetizarea suporturilor cu datele de
literatură concentrația de 5 particule magnetice s-a dovedit a fi cea mai apropiată de datele
regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective De asemenea se poate afirma că suporturile sunt
superparamagnetice
Retenția fluidelor biologice simulate este influențată de morfologia suporturilor și
proprietățile hidrofile ale suporturilor iar viteza de degradare enzimatică in vitro este corelată cu
conținutul de fază polimerică
Testele de citotoxicitate in vitro indică faptul că suporturile obținute nu eliberează
substanţe citotoxice care să influenţeze negativ proliferarea celulară
100
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub
formă uscată
Icircn ingineria tisulară a ţesutului osos polizaharidele (chitosan acid hialuronic) şi proteinele
(colagengelatină fibroină din mătase albumină) se numără printre cele mai utilizate
biomateriale pentru sinteza de suporturi [37]
Chitosanul ndash Cs este unul din cei mai utilizaţi biopolimeri icircn ingineria tisulară datorită
proprietăţilor sale remarcabile Numeroase studii prezintă rezultate foarte bune ale acestui
biopolimer icircn aplicaţii vizacircnd regenerarea şi repararea ososă [56 148 151 171] Colagenul ndash
Col este un alt biopolimer adesea utilizat icircn ingineria tisulară proprietăţile ce icircl recomandă
pentru ingineria tisulară a ţesutului osos icircn mod particular fiind osteoconductivitatea şi
biocompatibilitatea Asocierea cu fosfaţi de calciu ajută la o integrare foarte bună a unui suport
pe bază de colagen şi fosfaţi de calciu icircn ţesutul osos icircn studii in vivo [90] Acidul hialuronic ndash
Hya un alt biopolimer cu proprietăţi foarte bune ce susţine regenerarea tisulară la locul defectelor
osoase contribuind la formarea de calus Icircn aplicaţii pentru regenerarea osoasă acidul hialuronic
este combinat cu fosfaţi de calciu şi cu alţi biopolimeri [142 172]
Plecacircnd de la componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă
anorganică 20-30 componentă organică și apă) cei trei biopolimeri mai sus menţionaţi au fost
amestecaţi cu fosfaţi de calciu din precursori Icircn sinteză a fost integrată şi o concentraţie de 5
particule magneticendash MNPs concentraţie stabilită icircn urma rezultatelor obţinute icircn capitolul 3 icircn
care au fost studiate trei concentraţii diferite de MNPs
41 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute printr-un procedeu biomimetic prin precipitarea de fosfați de
calciu (CP) din precursorii CaCl2 şi NaH2PO4 icircntr-o amestec de biopolimeri CsndashColndashHya
(chitosan ndash colagen ndash acid hialuronic) icircn prezenţă de soluţie apoasă de amoniacSoluţia de Cs
(1) a fost obţinută prin dizolvare de Cs purificat icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Soluția
de Col (tip I + III) a fost obţinută de la LohmannampRauscher GmbH Germania Concentraţia de
Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză Icircnainte de
procesul de precipitare icircn soluția de polimeri CsndashColndashHya s-au adăugat 5 particule magnetice
101
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sub formă uscată (5 față de cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza
suporturilor) Soluţiile apoase de CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost adăugate peste
amestecul de soluţii de biopolimeri şi particule magnetice şi omogenizate prin agitarea mecanică
după care pH-ul soluţiei a fost adus la valoarea de 72-74 cu ajutorul soluţiei de NH4OH (25)
S-a urmărit menţinerea pH la valoare menţionată pentru 24 orePentru eliminarea compuşilor
nereacţionaţi amestecul final a fost spălat cu apă distilată prin centrifugare la 5000 rotații pe
minut timp de 10 minute etapă repetată de trei ori Ultima etapă icircn obţinerea suporturilor a fost
liofilizarea la temperatura de -55ordmC timp de 24 h Etapele procesului de obţinere sunt prezentate
icircn figura 41
Figura 41 Obţinerea suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat un program
experimental cu două variabile (concentrația de Col - raporată la concentrația de Cs
respectiv raportul CaP) Icircn tabelul 41 este prezentată codificarea variabilelor independente ale
programului experimental iar icircn tabelul 42 domeniile de variaţie precum şi codificarea
suporturilor (P1 - P13)
102
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Tabel 41 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 42 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Cod suport X1 X2 Col Cs CaP
P1 -1 -1 35 65 16
P2 1 -1 65 35 16
P3 -1 1 35 65 17
P4 1 1 65 35 17
P5 -1141 0 2879 7121 165
P6 1141 0 7121 2879 165
P7 0 -1141 50 50 1579
P8 0 1141 50 50 1721
P9 0 0 50 50 165
P10 0 0 50 50 165
P11 0 0 50 50 165
P12 0 0 50 50 165
P13 0 0 50 50 165
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii chimice utilizacircnd
analiza FTIR iar din punct de vedere al morfologiei prin SEM De asemenea s-au analizat
comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora proprietăţile
mecanice și proprietăţile magnetice al suporturilor Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată
printr-un test MTT in vitro (contact indirect) şi in vivo pe şobolani Wistar
Deoarece orice suport ce se dorește a fi implantat icircn organismul uman trebuie sterilizat
icircnainte de implantare se urmărește realizare de suporturi care să nu-și modifice morfologia și
structura fizică şi chimică după sterilzare Icircn acest scop suporturile P5 P6 P7 P8 și P9 au fost
103
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru 4 ore Pentru suporturile sterilizate au
fost studiate morfologia și structura chimică
42 Rezultate și discuții
421 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR La fel ca icircn cazul
morfologiei suporturilor au fost analizate prin FTIR suporturile icircnainte şi după expunere la UV
pentru 4 ore
Icircn figura 42A se pot observa spectrele suporturilor P5 P6 P7 P9 şi a particulelor
magnetice ndash MNPs sub formă uscată icircnainte de expunere la UV iar icircn figura 42B spectrele
suporturilor P5 P6 P7 P8 P9 după expunere la UV
Structura chimică a MNPs a fost confirmată de prezenţa benzilor de absorbţie caracteristice
chitosanului gruparea -OH la 3431 cm-1
amida I la 1637 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii
CndashN la 1384 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1072 cm-1
precum şi grupării FendashO
a magnetitei la 560 cm-1
[160]
Pe spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P9 (icircnainte de expunere la UV) au putut fi
identificate benzi de absorbţie caracteristice celor trei biopolimeri după cum urmează gruparea -
OH la 3429 cm-1
(P6) 3430 cm-1
(P7) 3431 cm-1
(P5 P9) gruparea ndashCH2 la 2924 cmminus1
(P5 P9)
şi la 2925 cm-1
(P6 P7) amida I la 1637 cmminus1
(P5) 1638 cm-1
(P9) 1653 cm-1
(P6) 1655 cm-1
(P7) amida II la 1555 cmminus1
(P7) 1563 cm-1
(P6) amida III la 1240 cmminus1
(P7 P9) 1242 cmminus1
(P5) 1246 cmminus1
(P6) şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1031 cmminus1
(P5 P7) 1032 cmminus1
(P9) 1035 cmminus1
(P6) Icircn cazul suportului P6 care conţine cea mai mare cantitate de colagen s-a
observat o intesitate mai mare a benzilor amidelor I II şi III după cum era de aşteptat Icircn plus icircn
toate spectrele s-a observat prezenţa picului asociat grupării COO- a hialuronatului de sodiu la
1405 cmminus1
(P7 P9) 1406 cmminus1
(P6) şi 1410 cmminus1
(P5) [173]
Benzile caracteristice magnetitei din particulele magnetice icircncorporate icircn suporturi au fost
observate la 561 cm-1
(P5 P7 P9) şi 562 cm-1
(P6) Icircn toate spectrele se pot observa picuri
specifice grupării fosfat PO43-
la 603 cm-1
(P5) şi 604 cm-1
(P6 P7 P9) Datorită faptului că
benzile caracteristice magnetitei sunt foarte aproape de cele caracteristice grupării fosfat
sugerează o suprapunere a acestora şi faptul că nu pot fi separate [99]
104
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 42 Spectrele FTIR ale suporturilor A icircnainte de expunere UV B după expunere UV
Icircn figura 42B sunt redate spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P8 şi P9 după
sterilizare prin expunere la radiaţii UV La fel ca icircn cazul suporturilor care nu au fost sterilizate
s-a observat prezenţa picurilor caracteristice celor trei biopolimeri a picurilor caracteristice
fosfaţilor de calciu şi a picurilor caracteristice particulelor magnetice la numere de undă
apropiate de cele ale picurilor caracteristice componentelor suporturilor nesterilizate ceea ce a
indicat faptul că procesul de sterilizare utilizat nu influenţează structura chimică a suporturilor
obţinute
105
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
422 Morfologia suporturilor
Datele SEM oferă informaţii importante despre suporturile realizate pentru ingineria
tisulară a ţesutului osos deoarece studiază morfologia lor aceasta avacircnd o influenţă
considerabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale suporturilor Morfologia a fost studiată icircn
secţiunea suporturilor Pentru o privire de ansamblu 5suporturi cu compoziţii diferite au fost
analizate la diverse ordine de mărire De asemnenea s-au analizat suporturi ce au fost expuse
pentru 4 ore la radiaţii UV pentru a vedea dacă acest proces de sterilizare influenţează
morfologia suporturilor
Icircn figura 43 sunt prezentate datele SEM ale suporturilor P5 P6 P7 şi P8 icircnainte de
expunere la UV iar icircn fugura 44 după expunere la UV la două ordine de mărire diferite Se
observă o structură poroasă tridimensională cu pori interconecaţi
Figura 43 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 icircnainte de expunere la UV
La ambele ordine de mărire s-a observat o distribuţie uniform a particulelor magnetice şi a
fosfaţilor de calciu icircn structura compozită polimerică Distribuţia uniformă a particulelor
magnetice se datorează procedeului de icircncorporarea directă a acestora icircn sinteză date
106
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
asemănătoare ce susţin acestă metodă de icircncorporarea fiind regăsite şi icircn alte studii din literatura
de specialitate
Figura 44 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 după expunere la UV
Comparacircnd imaginile din figura 43 cu cele din figura 44 nu s-au observat diferenţe de
morfologie a suporturilor aceaşi structură tridimensională poroasă fiind prezentă şi icircn acest caz
ceea ce indică faptul că procesul de sterilizare prin expunere la radiaţii UV pentru 4 ore nu
influenţează morfologia suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de 5 mg din fiecare probă a fost imersat icircn PBS pH= 72 icircntr-o microcoloană (QIAquickreg
Spin
Colummn 50 diametru 10 mm) ataşată la o microseringă de 1 ml icircntreg sistemul fiind incubat la
37ordmC pentru 72 ore după care s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din
capitolul 2 S-au analizat două fragmente din fiecare tip de suport şi s-a calculat deviaţia
standard Rezultatele obținute icircn urma acestui studiu sunt redate icircn figura 45
107
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Gradul de retenție al suporturilor preparate pentru aplicații icircn inginerie tisulară influențează
răspunsul suporturilor la difuziunea celulelor nutrienților și medicamentelor caracteristici foarte
importante pentru aplicația vizată [174]
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor ce
a fost observată pe imaginile SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei biopolimeri
utilizați icircn procesul de sinteză O parte din PBS este implicat icircn interacțiunea cu matricea
polimerică iar o altă parte este reținută fizic icircn porii suporturilor Cea mai mare valoare a
gradului de retenție a fost calculată pentru P7 suport ce are cel mai mic raport CaP = 1579 iar
una din cele mai mici valori ale gradului de retenţie a fost calculată pentru P8 suport ce are cel
mai mare raport CaP = 1721 ceea ce indică o influenţă semnificativă a raportului CaP asupra
retenţie de fluide biologice simulate Practic fosfaţi de calciu acoperă matricea polimerică
icircngreunacircnd pătrunderea soluţie PBS icircn interior
Figura 45 Gradul de retenție maxim PBS () pentru suporturile obținute
Se poate observa de asemenea că valorile gradului de retenție măsurate pentru suporturile
cu aceași compoziție teoretică sunt apropiate ceea ce indică reproductibilitatea metodei utilizate
pentru sinteza suporturilor
108
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat reacția cu enzime utilizacircnd lizozim și
colagenază Primul pas a fost imersarea a aproximativ 10 mg din fiecare probă icircn 5 mL soluţ ie de
PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de dializă
introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS Două mostre din fiecare probă au fost supuse degradării
Probele au fost apoi incubate la 37ordmC La intervale de 4 ore 48 ore 72 ore 7 zile și 14 zile de la
incubare un volum de 2 ml din fiecare probă a fost extras şi analizat din soluţia de PBS icircn care
este imersată membrana de dializă cu proba de analizat din punct de vedere al concentraţiei de
chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la intervalele de timp mai sus
menţionate datele obţinute icircn urma studiului fiind redate icircn figura 46 Icircn toate cazurile s-a
observat o creștere a ratei de degradare icircn timp avantajul suporturilor biodegradabile icircn
comparaţie cu cele care nu se degradadează este resorbţia materialului icircn timp fiind astfel exclus
riscul de rejecţie a suportului de către organism
Suporturile P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri (65 Cs 35 Col) şi raport
CaP diferit P1 are raportul CaP = 16 iar P3 are raportul CaP = 17 Icircn cazul suporturile P2 şi
P4 a fost aceeaşi situaţie ca icircn cazul suporturilor P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri
(35 Cs 65 Col) diferenţa dintre ele fiind dată de raportul CaP P2ndash CaP = 16 P4ndash CaP =
17 Nu au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute pentru cele patru suporturi fiind
observată o degradare ce creşte gradual icircn timp
Icircn cazul suporturilor P7 şi P8 suporturi ce au cel mai mic raport CaP (1579) ndash P7 și cel
mai mare raport CaP (1721) ndash P8 şi aceeaşi compoziţie polimerică nu au fost observate
diferențe semnificative icircn ceea ce priveşte cantitatea de chitosan degradat la niciunul din cele 5
intervalele de timp Icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 care au aceeaşi compoziţie nu au fost
observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute icircn toate cazurile fiind observată o degradare
constatantă icircn timp
109
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 46 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturi
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat
Rezultatele privind analiza concentraţia de colagen degradat au fost redate icircn figura 47 Icircn
cazul suporturilor P1ndash P4 s-a observat o legătură evidentă icircntre concentrația de colagen degradat
și compoziția polimerică a suporturilor
Icircn acest studiu pentru a determina viteza de degradare a suporturilor s-a utilizat colagenaza
bacteriană o enzimă specifică pentru degradarea in vivo a colagenului care hidrolizează
preferențial legăturile X-Gly icircn următoarele grupe de aminoacizi glicină-leucină (Gly-Leu)
glicină-izoleucină (Gly-Ile) alanin-prolină-glicină (Ala-Pro-Gly)
Icircn ceea ce privește concentraţia de colagen degradat pentru suporturile P5 ndash P9 s-a
observat şi icircn acest caz o legătură stracircnsă icircntre concentrația de colagen degradat și compoziția
polimerică a suporturilor cele mai mari valori fiind obţinute pentru suportul P6 ce conţine 7121
colagen şi doar 2879 chitosan şi cele mai mici valori pentu suportul P5 ce conţine 7121
chitosan şi 2879 colagen
La fel ca şi icircn studiul concentraţie de chitosan degradat icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 nu
au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute ceea ce confirmă reproductibilitatea
metodei
110
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 47 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturi
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ egale iar după ce s-au
determinat dimensiunile au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii specificaţi icircn
capitolul 2 Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru
fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a calculat modulul lui Young iar
la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind prezentate grafic icircn figura 48
Oasele sunt organe rigide formate din ţesut osos măduvă osoasă endost periost cartilaj
nervi şi canale vertebrale Icircn funcţie de structura sa ţesutul osos este de două tipuri ţesut osos
compact (cortical) şi ţesut osos spongios (trabecular) Ţesutul osos compact este localizat la
suprafaţa osului şi după cum sugerează şi denumirea sa are o macrostructură omogenă şi
compactă Se găseşte la diafiza oaselor iar grosimea sa variază icircn funcţie de localizarea
anatomică Ţesutul osos spongios este o reţea de pori interconectaţi volumul de spaţiu gol fiind
cuprins icircntre 50 şi 90 şi este localizat icircn epifiza oaselor lungi
Cele două tipuri de ţesuturi spongios şi compact au o influenţă semnificativă asupra
proprietăţilor mecanice ale osului Scheletul uman este supus zilnic la diferite forţe icircn funcţie de
activităţile icircntreprinse forţele de tensiune forţele de compresiune şi forţele de forfecare fiind
cele care acţionează cel mai adesea asupra ţesutului osos Solicitările mai complexe cum ar fi de
111
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
exemplu icircncovoierea osului pot fi descompuse la racircndul lor icircn cele trei forţe menţionate
anterior Pentru a studia solicitările la care este supus ţesutul osos proprietăţile mecanice ale
osului cum sunt modulul de elasticitate (Young) rezistenţa la compresiune şi tensiunea trebuie să
fie pe deplin icircnţelese Icircn ceea ce priveşte modului lui Young notat cu E acesta are valori diferite
pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut osos astfel E este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru
ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru ţesutul osos spongios [168]
Figura 48 Modulul lui Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de
calciu cu incluziune de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young icircn cazul suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi
fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice au fost cuprinse icircntre 3841 MPa şi
22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător
valorilor Modulului Young al ţesutului osos spongios Asemănarea suporturilor obţinute cu
ţesutul osos spongios poate fi susţinută şi de datele SEM care au evidenţiat o structură poroasă
tridimensională
Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru suportul P5 suport ce are cea mai mare
cantitate de chitosan icircn compoziţie (7121 Cs 2879 Col) iar cea mai mică valoare s-a
obţinut pentru P2 unul din suporturile cu cea mai mică cantitate de chitosan (35 ) ceea ce
indică o icircmbunătăţire a rezistenţei la compresiune a suporturilor prin adăugare de chitosan icircn
sinteza suporturilor Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie P9 ndash P13 valorile obţinute
112
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
pentru E sunt apropiate ceea ce indică faptul că metoda de sinteza a suporturilor este
reproductibilă
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 rezultatele obținute fiind prezentate icircn tabelul 43
Tabel 43 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire
suport
Susceptibilitate
magnetică (volum)
Magnetizarea
(emug)
P1 0160 middot e-4
1319
P2 0154 middot e-4
1269
P3 0135 middot e-4
1113
P4 0254 middot e-4
2093
P5 0160 middot e-4
1319
P6 0047 middot e-4
387
P7 0242 middot e-4
1995
P8 0112 middot e-4
923
P9 0257 middot e-4
2118
P10 0254 middot e-4
2093
P11 0432 middot e-4
3561
P12 0810 middot e-4
6676
P13 0514 middot e-4
4236
S-a observat că valorile obținute sunt cuprinse icircntre 387 şi 6676 emug amintind că s-a
introdus in sinteză o concentrație de 5 particule magnetice sub formă uscată (5 față de
cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor) ceea ce indică că
suporturile obţinute sunt superparamagentice
113
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare s-a utilizat metoda contactului indirect
realizacircndu-se un extract din suporturile P5 şi P6 care icircn prealabil au fost sterilizate după aceeaşi
metodă descrisă icircn capitolul 3 subpunctul 327 Fragmentele de suporturi sterilizate au fost
ulterior imersate icircn 4 ml mediu de cultură DMEM și lăsate la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului urmacircnd apoi filtrarea extractului printr-un filtru de 70 microm
măsurarea volumul final şi adăugarea a 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost pus icircn contact cu două linii celulare diferite fibroblaste din derm uman
(NHDF Lonza) și preosteoblaste MC3T3 icircn placi de 96 godeuri 3000 celule godeuCele două
tipuri de celule au fost incubate separat pentru 24 ore icircn mediu de cultură DMEM complet
icircnlocuit după cele 24 ore cu 150 μl extract Testul MTT a fost realizat la 24 48 și 72 ore
calculacircndu-se viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (7) din capitolul 2 rezultatele testului fiind
prezentate icircn figura 49 pentru contactul indirect al suporturilor cu fibroblaste şi icircn figura 410
pentru contactul indirect al suporturilor cu preosteoblaste
Figura 49 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu fibroblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea fibroblastelor s-a observat o uşoară creştere icircn timp a
acesteia pentru ambele suporturi analizate Icircn cazul suportului P5 valorile calculate pentru
viabilitate au fost cuprinse icircntre 964 şi 979 valori ce au sugerat lipsa unor efecte adverse
ale extractului asupra fibroblastelor deci suportul a fost considerat biocompatibil Pentru
114
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
suportul P6 s-au calculat valori uşor mai scăzute ale viabilităţii celulare icircntre 88 şi 924 dar
chiar şi aşa acestea s-au icircncadrat icircn limitele care au permis să se afirme că suportul este
biocompatibil
Figura 410 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu preosteoblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea preosteoblastelor s-au calculat valori mai mici decat icircn
cazul fibroblastelor S-a observat o tendinţă de scădere a viabilităţii icircn timp cea mai mică
valoare de 83 fiind calculată pentru suportul P6 Icircn cazul suportului P5 cea mai mică valoare
calculată a fost de 87 Rezulatele obţinute icircn urma contactului indirect cu preosteoblastele au
indicat faptul că suporturile nu au eliberat compuşi citotoxici acestea fiind biocompatibile
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor
Testele in vivo pentru determinarea citotoxicității s-au realizat pe femele icircn vacircrstă de 6
săptămacircni Animalele au fost grupate icircn 2 loturi lotul martor format din 9 șoareci a fost utilizat
ca bază de comparație pentru lotul cu implant (II) ndash suportul P9 compus din 18 șoareci Cu
excepţia celor de control tuturor celorlalţi li s-au implantat subcutanat fragmente de suporturi cu
dimensiunea 1 cm x 1 cm
Durata experimentului a fost de 21 de zile La finalul primelor 7 zile de experiment au fost
sacrificați 3 șoareci din lotul martor și 6 din lotul II Inițial animalele au fost supuse zilnic unei
observații clinice amănunțite pentru a depista eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca
115
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
urmare a intolerabilității implantului după care au fost sacrificate iar tesuturile adiacente
implantului au fost examinate histologic La fel s-a procedat si pentru ceilalți șoareci sacrificați
la 14 și respectiv 21 de zile
Preparatele au fost citite la microscop şi interpretate Macroscopic nu s-au remarcat
modificări locale evidente Microscopic pe probele de ţesut recoltat ce includeau implantul şi
ţesutul din jur imaginile au indicat o reacţie inflamatorie cronică uşoară infiltraţie limfoidă
difuză şi capsulă conjunctivă icircn jurul implantului La loturile testate suportul compozit a icircnfaţişat
aspecte de biodegradare superficială La lotul martor fals implantat unul din animale a dezvoltat
o reacţie inflamatorie uşoară cu infiltraţii limfocitare perivasculare restul secţiunilor au relevat
o vindecare normală a plăgii chirurgicale
După 7 zile de la implantare icircn jurul materialului implantat se remarcă un infiltrat
inflamator moderat reprezentat de leucocite neutrofile histiocite și macrofage (figura 411A)
Totodată icircn țesutul conjunctiv din jurul implantului se observă un infiltrat celular mononuclear
interfibrilar susținut de o congestie a capilarelor limitrofe ce se regăsește și icircn structura
materialului implantat (figura 411B) Structurile profunde ale pielii (dermul și hipodermul) nu
suferă modificări alterative Se remarcă o ușoară densificare a țesutului conjunctiv subcutanat
printr-o sporire a elementelor celulare (fibroblastele) și fibrilare (fibrele de colagen ) ale acestuia
(fugura 411C)
Figura 411 Examen histopatologic după 7 zile de la implantare Colorare tricromic Masson
După 14 zile de la implantare materialul implantat are o structură mai ldquoaerisitărdquo probabil
consecință a resorbției tisulare a unor constituienți Icircn jurul materialului implantat se observă o
veritabilă capsulă conjunctivă formată din țesut conjunctiv tacircnăr ce are tendința de sechestrare a
acestuia și care trimite scurte travei spre zona centrală a materialului implantat (figura 412A)
Se observă la periferia materialului implantat travei (septe) conjunctive pornite din capsula
116
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
conjunctivă periferică ce infiltrează materialul implantat remarcacircndu-se tendința de icircnglobare a
acestuia (figura 412B) icircntr-un țesut conjunctiv neoformat lax icircncă imatur reprezentat din
fibroblaste și fibre de colagen tinere (figura 412C)
Figura 412 Examen histopatologic după 14 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
După sacrificarea animalelor la 21 zile de la intervenția chirurgicală de implantare
subcutatantă macroscopic (figura 413A) nu există modificări locale evidente icircn structurile
cutanate din dreptul implantului la nici unul dintre animalele examinate histopatologic
Microscopic s-a observat un țesutul conjunctiv neoformat icircncă imatur dezorganizat
constituit din fibroblaste active și fibre de colagen cu un aranjament anarhic repezentat de
vacircrtejuri și cordoane (figura 414A) De asemenea au fost remarcate mici depozite de fosfat de
calciu sechestrate icircn masa conjunctivă neoformată (figura 414B) și septe conjunctive constituite
din țesut conjunctiv cu dispoziție diametrală și care străbat materialul implantat cu tendința de a-
l icircngloba
Figura 413 Analiza macroscopică a implantului
117
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 414 Examen histopatologic după 21 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
Drept concluzie a studiilor in vivo ce au urmărit interacțiunile dintre suporturi și țesuturile
vii s-a remarcat o lipsă de citotoxicitate a implantului subcutanat susținută de absența oricărei
reacții locale sau sistemice de respingere
43 Concluzii
Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu au fost obținute
prin precipitarea de fosfați de calciu din precursori CaCl2 și NaH2PO4 icircntr-un amestec de trei
biopolimeri cu proprietăți remarcabile pentru regenerarea osoasă Cs Col și Hya Un program
experimental a fost folosit pentru optimizarea metodei 13 suporturi fiind preparate P1 ndash P13 Icircn
sinteză a fost integrate o concentrație de 5 MNPs
Structura chimică a suporturilor precum și morfologia acestora au fost studiate și
pentru suporturi ce au fost expuse la radiații UV timp de 4 ore procedeu utilizat icircn unele aplicații
biomedicale pentru sterilizare
Benzi de frecvență caracteristice biopolimerilor CP și MNPs au fost observate icircn
toate spectrele FTIR Nu au fost observate diferențe icircntre spectrele suporturilor expuse la radiații
UV și cele normale ceea ce icircnseamnă că acest proces de sterilizare nu influențează structura
chimică a suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată icircn secțiune cu ajutorul SEM S-a remarcat
o structură poroasă a suporturilor cu CP și MNPs distribuite uniform pe scheletul polimeric
Distribuția uniform a MNPs este atribuită procedeului de icircncorporare direct a acestora icircn etapa de
118
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sinteză La fel ca icircn cazul structurii chimice radiațiile UV nu infleunțează morfologia
suporturilor astfel acest proces de sterilizare poate fi utilizat pentru testele in vitro și in vivo
Determinarea gradului de retenție PBS s-a realizat utilizacircnd o metodă
volumetrică valorile obținute după 72 ore de la interacțiunea suportului cu fluidul la 37degC
indicacircnd o influență semnificativă a raportului CaP asupra proprietății studiate
Pentru studiile de degradare in vitro s-a studiat interacțiunea cu un complex de
două enzime lizozim și colagenază enzime implicate in vivo icircn procesele de degradarea a
chitosanului respectiv colagenului Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul
ambilor biopolimeri
Modului lui Young are valori diferite pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut
osos este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru
ţesutul osos spongios Valorile obţinute icircn cazul suporturile preparate au fost cuprinse icircntre 3841
MPa şi 22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul corespunzător modulului Young al
ţesutului osos spongios
Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor
Teste de citotoxicitate in vitro realizate icircn paralel pe două linii celulare diferite
fibroblaste și osteoblaste au indicat faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra celulelor
Caracterul non-citotoxic al suporturilor a fost evidențiat și in vivo după ce fragmente de
suporturi au fost implantate subcutanat la șoareci După 21 zile aceștia au fost sacrificați iar
fragmentele de țesut cu implant au fost analizate macroscopic și microscopic
119
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de
particule magnetice
Avacircnd icircn vedere proprietăţile biopolimerilor Cs Col şi Hya descrise icircn amănunt icircn
capitolele anterioare precum şi procedeul biomimetic de co-precipitarea de fosfați de calciu (CP)
din precursori CaCl2 şi NaH2PO4 un lot nou de suporturi a fost realizat conform metodei de
obţinere utilizate icircn capitolul 4 diferenţa dintre acest lot de suporturi şi lotul de suporturi
descrise icircn capitolul 4 fiind dată de modalitatea de incluziune a particulelor magnetice icircn etapa
de sinteză a suporturilor icircn cazul lotului din capitol 4 particulele au fost incorporate sub formă
uscată iar icircn cazul acestui lot particulele au fost icircncorporate sub formă de suspensie coloidală
51 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute prin acelaşi procedeu biomimetic utilizat icircn capitolul 4 Icircn
acest scop soluţii de precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri Cs (1) Col (1) Hya (1) şi 5 suspensie coloidală de
MNPs icircn apă (raportată la cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor)
pH-ul amestecului a fost apoi ajustat la 72-74 utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac iar după
spălare cu apă distilată pentru eliminarea compuşilor nereacţionaţi amestecurile au fost
liofilizate pentru 24h
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat şi de această dată
acelaşi program experimental cu două variabile (concentrația de Col - raportată la
concentrația de Cs respectiv raportul CaP) utilizat icircn capitolul 4 Icircn tabelul 51 este
prezentată codificarea varabilelor programului experimental iar icircn tabelul 52 sunt prezentate
domeniile de variaţie precum şi codificarea suporturilor (S1 - S13)
Utilizacircnd ecuației (3) din capitolul 2 s-au determinat valorile variabilelor investigate din
programul experimental icircmpreună cu răspunsurile obținute Coeficienţii de regresie au fost
determinaţi si sunt prezentaţi icircn tabelul 53 alături de coeficienți de corelație și de abatere
standard Variabila răspuns Y1 corespunde gradului de retenție PBS a suporturilor preparate ()
iar Y2 corespunde modului de elasticitate E (MPa) ndash tabel 54
120
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 51 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 52 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Codificare
Support X1 X2 Col Cs CaP
S1 -1 -1 35 65 16
S2 1 -1 65 35 16
S3 -1 1 35 65 17
S4 1 1 65 35 17
S5 -1141 0 2879 7121 165
S6 1141 0 7121 2879 165
S7 0 -1141 50 50 1579
S8 0 1141 50 50 1721
S9 0 0 50 50 165
S10 0 0 50 50 165
S11 0 0 50 50 165
S12 0 0 50 50 165
S13 0 0 50 50 165
Tabel 54 Eroarea asimetrică coeficienţii de corelare si de regresie determinați
a1 a2 a3 a4 a5 a6 COR ASE
Y1 0256534 0006965 0001565 -0033 -000592 -004559 0980261 0024421
Y2 894655 8300833 -204625 486659 -394375 9217909 0986554 7447254
121
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 54 Programul experimental icircmpreună cu valorile determinate pentru retenție PBS
() și E (MPa)
Codificare
suport X1 X2 Y1 ndash Retenție PBS () Y2 ndash E (MPa)
S1 -1 -1 121714plusmn21973 20925plusmn32
S2 1 -1 109649plusmn32378 27947plusmn22
S3 -1 1 239234plusmn17309 12001plusmn34
S4 1 1 163522plusmn10871 16201plusmn24
S5 -1141 0 138888plusmn24263 8668plusmn33
S6 1141 0 100628plusmn20724 12261plusmn29
S7 0 -1141 109091plusmn22104 9038plusmn21
S8 0 1141 121213plusmn5471 8372plusmn12
S9 0 0 138889plusmn18159 7628plusmn32
S10 0 0 138960plusmn18209 7873plusmn12
S11 0 0 146019plusmn1502 8089plusmn24
S12 0 0 141067plusmn10022 7942plusmn8
S13 0 0 141844plusmn9215 8034plusmn32
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei utilizacircnd
spectroscopia IR cu transformare Fourier (FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de
energie (EDS) şi difracţie cu raze X (XRD) Din punct de vedere al morfologiei au fost
caracterizate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM) și prin micro computer-tomografie
(microCT) De asemenea s-au analizat comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora proprietățile mecanice și proprietățile magnetice Citotoxicitatea
suporturilor a fost analizată printr-un test MTT in vitro (contact direct) şi in vivo pe şoareci din
linia CD1
Suporturile S7 S8 și S9 au fost sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru
4 ore şi au fost studiate morfologia și structura lor chimică cu scopul de a observa influenţa
porcesului de sterilizare asupra carcteristicilor menţionate
122
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
52 Rezultate și discuții
521 Structura chimică a suporturilor
Datele obţinute icircn urma analizei FTIR oferă informaţii despre structura suporturilor
Suporturile au fost analizate icircnainte şi după expunere la UV pentru 4 ore rezultatele fiind redate
icircn figura 51 S-au observat picuri pentru cei trei biopolimeri (Amide I C=O Amide II N-H
funcțiile OH grupari alifatice) fosfații de calciu (PO3-
4 la 563 cm-1
) și nanoparticule magnetice
[99 175]
Figura 51 Spectrele FTIR pentru suporturile S7 S8 S9
A icircnainte de expunere la UV B după expunere la UV
Benzile reprezentative pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 55 După cum se poate
observa benzile reprezentative pentru suporturile expuse la UV au valori foarte apropiate sau
chiar identice cu cele ale suporturilor care nu au fost expuse la UV ceea ce icircnseamnă că
123
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
radiațiile UV nu influențează structura chimică a acestora chiar și după o periadă mare de timp
(4 ore)
Tabel 52 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S1 și S3
IcircIcircnainte de expunere la UV DuDupă expunere la UV
Grupări
funcționale
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
OH 3421 3418 3409 3421 3419 3415
C-H 2937 2936 2934 2937 2942 2936
Amida I
C=O 1653 1659 1655 1655 1652 1655
Amida II
N-H 1556 1556 1552 1557 1556 1552
C-O 1030 1031 1030 1031 1030 1030
Fe-O 603 603 602 603 603 602
PO3_4
561 561 560 561 561 561
522 Compoziția suporturilor
Icircn figura 52 este redată difractograma XRD pentru suporturile S7 S8 și S9 Picurile
caracteristice specifice fosfaţilor de calciu ce pot fi associate planelor (002) (210) (112) (213)
și (004) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF No 65-3107) și unghiurile cu care
acestea sunt corelate sunt redate icircn tabelul 56 [176]
Figura 52 Spectrul XRD pentru suporturile S7 S8 și S9
124
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 56 Diferite forme de CP prezente icircn suporturile analizate conform JCPDS
Unghi 2ϴ (deg) Intensitate (ua) Index conform JCPDS Formula chimică
26 002 44-0778 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
28 210 44-0810 Ca3H2(P2O7)2 ∙ H2O
31 112 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
49 213 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
53 004 02-1350 CaHPO4
Icircn figura 53 este redat spectrul EDS pentru suportul S5 Numărul atomic pentru Ca a fost
292 iar pentru P a fost 148 ceea ce a indicat un raport CaP= 197 această valoare fiind
apropiată de valoare raportului CaP al fosfatului tertacalcic (TTCP) ndash Ca4(PO4)2O care este 200
[177]
Figura 53 Spectrul EDX pentru suportul S5
523 Morfologia suporturilor
Porozitatea caracterizată drept procentul de spaţiu gol dintr-un solideste una din cele mai
importante caracteristici ale unui suport realizat pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară şi
regenerarea ţesutului osos Porozitatea unui suport este influenţată de natura materialelor din
compoziţia sa precum şi de procesul de obţinere Un suport pentru regenerarea osoasă trebuie să
susţină migrarea şi proliferarea osteoblastelor şi a celulelor mezenchimale să permită
pătrunderea vaselor de sacircnge şi angiogeneza iar icircn final să contribuie la formarea de neoţesut
[178] Porozitatea unui suport influenţeză o serie de alte caracteristici esenţiale pentru un suport
125
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
realizat pentru aplicaţia menţionată anterior cele mai semnificative fiind biodegradabilitatea şi
proprietăţile mecanice
Rezultatele SEM sunt prezentate icircn figura 54 Figura 54A reprezintă suporturile S7 S8
S9 icircnainte de expunere la radiații UV iar figura 54B aceleași suporturi după expunere la
radiații UV La 500 microm se poate observa o structură poroasă a suporturilor şi icircncorporarea
particulelor magnetice și a cristalelor de calciu icircn matricea polimerică şi faptul că nu există
diferențe icircntre suporturile sterilizate și cele nesterilizate
Figura 54 Morfologia suporturilor S7 S8 S9 A Icircnainte de expunere la UV B După expunere
la UV
Pentru un studiu mai detaliat al morfologiei suporturilor fragmente din acestea au fost
scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi o
rotaţie de 05ordm Proiecţiile astfel obţinute au fost procesate şi reconstruite utilizacircnd programul
NRecon (Bruker Belgium) Trei regiuni de interes au fost selectate pentru fiecare proba iar
programul CTAn a fost utilizat pentru calcularea dimensiunii porilor precum şi dimaterului de
percolaţie Pentru calcularea porozităţii s-a utilizat metoda ldquosphere-fittingrdquo regasită icircn aplicaţia
BatMan a programului CTAn Pentru calcularea diametrului de percolaţie s-a utilizat metoda
126
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
descrisă de Ashworth şi colab [179] Pe scurt metoda ldquoshrink wraprdquo a fost aplicată pentru a
identifica volumul accesibil unui obiect virtual care poate penetra icircntreaga regiune de interes
utilizacircnd urmatoare ecuaţie
(16)
unde este o constantă de percolaţie egală cu 088 pentru sistemele 3D [180]
Vizualizarea distribuţiei porilor a fost efectuată utilizacircnd programul CTVox (Bruker
Belgium) Astfel o funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste
reconstrucţia 3D a probei de investigat iar un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare
Suportul care are cea mai mare dimensiune a porilor a fost suportul S7 iar suportul cu cea
mai mică dimensiune a porilor a fost suportul S8 Aceste două suporturi sunt practic suporturile
cu cel mai mic raport CaP ndash S7 (CaP = 1579) şi cel mai mare raport CaP ndash S8 (CaP = 1721)
ceea ce a indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra porozităţii
suporturilor Icircn ceea ce priveşte comparaţia porozităţii suporturilor din punct de vedere al
compoziţiei de biopolimeri s-a observat o dimensiune mai mare a porilor suportului S6
(conţinacircnd un raport mai mare de colagen)
Figura 55 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suporturile S6 S7 S8 S9
127
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn tabelul 57 sunt prezentate date despre dimensiunea şi distribuţia porilor (prezentate şi
icircn figura 55) volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
Tabel 57 Dimensiunea porilor suporturilor S5 S6 S7 S8
Denumirea
suportului
Dimensiunea
porilor (microm)
Volumul
regiunii de interes (mm3)
Aria regiunii de
interes (mm2)
S6 2121plusmn9091 222051 1027245
S7 27341plusmn10952 200577 955451
S8 13309plusmn6785 255724 1139832
S9 1388plusmn5284 316728 1343793
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost analizate icircn aceleaşi condiţii experimentale ca şi suporturile prezentate
icircn capitolul 4 Icircntr-o primă etapă suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ
egale s-au determinat dimensiunile şi au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii
specificaţi icircn capitolul 2 Pentru fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a
calculat modulul Young iar la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind redate icircn figura 56 și icircn
tabelul 53
Figura 56 Modulul Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu
cu incluziune suspensie coloidală de particule magnetice
0
50
100
150
200
250
300
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13
20925
27947
12001
16201
8668
12261
9038 8372 7628 7873 8089 7942 8034 E (
MP
a)
128
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young au fost cuprinse icircntre 7628 MPa şi 27947
MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător valorilor
Modulului Young al ţesutului osos spongios interval icircn care s-au icircncadrat şi valorile obţinute
pentru suporturile caracterizate icircn capitolul 4 Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru
suportul S2 avacircnd următoarea compoziţe 35 Cs 65 Col şi raportul CaP = 16 iar cea mai
mică valoare s-a obţinut pentru suportul S9 avacircnd următoarea compoziţe 50 Cs 50 Col şi
raportul CaP = 165 Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie S9 ndash S13 valorile obţinute
pentru E au fost apropiate ceea ce indică că metodă poate fi considerată reproductibilă din punct
de vedere al proprietăților mecanice Analizacircnd valoarea lui E din punct de vedere al influenţei
raportului CaP deci comparacircnd suporturile S7 (CaP = 1579 50 Cs 50 Col) cu S8 (CaP
= 1721 50 Cs 50 Col) s-au observat valori apropiate ale lui E de unde se poate
concluziona că raportul CaP nu influențează proprietățile mecanice ale suporturilor
525 Proprietăţi magnetice ale suporturilor
Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 58 S-a măsurat
susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime adimensională)
utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Tabel 58 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire suport
Susceptibilitate magnetică (volum)
Magnetizarea (emug)
S1 0295middot e-4
2431
S2 0382middot e-4
3148
S3 0414middot e-4
3412
S4 0304middot e-4
2505
S5 0272middot e-4
2241
S6 0439middot e-4
3618
S7 0476middot e-4
3923
S8 0399middot e-4
3288
S9 0539middot e-4
4442
S10 0749middot e-4
6173
S11 061middot e-4
5027
S12 0703middot e-4
5794
S13 0817middot e-4
6733
129
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13)
din capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 2241 şi 6733 emug indică faptul că suporturile
obținute sunt superparamagnetice
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Valorile gradului de retenție obținute pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 53 și
figura 57 Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a
suporturilor dovedită de datele SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei
biopolimeri utilizați la fabricarea suporturilor
Figura 57 Grad de retenţie PBS
Se poate afirma că o parte din PBS interacționează cu matricea polimerică iar o altă parte
este reținută fizic icircn porii suporturilor Inițial icircn PBS moleculele de H2O intră icircn suporturi prin
1579
165
1721
900
1200
1500
1800
2100
2400
287
9
37
27
45
75
542
3
627
1
712
1
CaP
GR
(
)
Colagen ()
2100-2400
1800-2100
1500-1800
1200-1500
900-1200
130
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
pori pentru a umple spațiile interne Pe de altă parte numărul de grupuri polar este de asemenea
un factor important care afectează hidrofilia materialului [181] Adăugarea de fosfați de calciu
icircn compoziția suporturilor duce la o scădere a gradului de retenție
527 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd un amesctec
de două enzime lizozim și colagenază Metoda de lucru utilizată a fost aceeaşi ca cea utilizată pentru
degradarea suporturilor obţinute şi caracterizate icircn capitolul 4 10 mg din fiecare probă s-a imersat icircn
5 ml soluţie de PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de
dializă introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS după care au fost incubate la 37degC La anumite
intervale de timp s-a extras şi analizat un volum din cei 10 ml PBS din punct de vedere al
concentraţiei de chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la 2 ore 48 ore 7 zile şi 14 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate icircn figura 58
Figura 58 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Comparacircnd valorile obținute nu s-a observat o dependență clară a vitezei de degradare a
concentrația de chitosan chiar dacă toate materialele sunt degradate treptat Comportamentul se
0
02
04
06
08
1
S5 S6 S7 S8 S9
(Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat)
middot100
m
moli
L
2 ore 48 ore 7 zile 14 zile
131
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
datorează interacțiunilor ionice ale chitosanului cu colagenul și fosfații de calciu care modifică
conformația situsului de legare pentru lizozim [182]
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat
Concentraţia de colagen degradat a fost analizată la 4 ore 48 ore 72 ore şi 7 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate sub formă de grafic
Figura 59 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Hidrolizarea colagenului din suporturi de către colagenază enzima implicată icircn procesul de
degradare al acestei proteine in vivo are două etape Icircntr-o primă etapă enzima se atașează la
suport și apoi rupe locurile specifice care corespund structurilor de aminoacizi pentru care
enzima are specificitate Condițiile de mediu (pH tărie ionică inhibitori de enzime) și
caracteristicile materialelor (compoziție structură supramoleculară și porozitate) sunt parametri
care dictează viteza de degradare și biointegrarea controlată a suportului Toate suporturile au
fost degradate icircn timp cu vitezediferite
0
005
01
015
02
025
S5 S6 S7 S8 S9
Con
centr
aţi
a d
e co
lagen
deg
rad
at
mm
oli
L
4 ore 48 ore 72 ore 7 zile
132
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
5281 Testul MTT
Citotoxicitatea in vitro a suporturile obținute a fost analizată utilizacircnd un test MTT test ce
a oferit informații despre viabilitatea a trei linii diferite de celule fibroblate celule STEM și
osteoblaste la contactul direct cu fragmente de suporturi
Rezultatele prezentate icircn figura 510 indică lipsa citotoxicităţii suporturilor asupra
fibroblastelor valorile viabilităţii celulare fiind mai mari de 80 pentru toate cele trei suporturi
S7 S8 S9 şi pentru toţi cei trei timpi de contact
Icircn urma contactului direct al suporturilor S1 S3 S13 pentru 24 ore 48 ore respectiv 72
ore cu celule stem rezultate redate icircn figura 511A s-au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce
cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de 97 (S1) 98 (S13) și 99 (S3) ceea ce indică a
foarte bună biocompatibilitate a probelor
Figura 510Viabilitatea fibroblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile S7 S8 S9
Suporturile S1 S3 şi S13 au fost puse icircn contact direct şi cu osteoblaste rezultate fiind
redate icircn figura 511B dar rezulatele obţinute icircn acest caz nu sunt la fel de bune ca icircn cazul
contactului direct cu celulele stem osteoblastele fiind celule cu o sensibilitate ridicată Teste
suplimentare sunt necesare icircn acest caz
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
()
Control S7 S8 S9
133
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Figura 511 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile S1 S3 S13
A Utilizacircnd celule stem B Utilizacircnd osteoblaste
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată lipsa de citotoxicitate suporturile la contactul direct cu
celulele stem s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-AM rezultatele obţinute
fiind prezentate icircn figura 512
Figura 512 Viabilitatea celulelor STEM icircn contact cu suporturile S1 şi S3
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
cel
ula
ră
Control S1 S3 S13 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
Control S1 S3 S13 B
134
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu
suporturile S1 şi S3 atacirct la 24 ore cacirct şi la 96 ore ce ce confirmă icircncă o dată faptul că suporturile
nu eliberează compuși citotoxici și totodată structura lor nu influențează negativ activitatea
celulelor stem
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor
La fel ca icircn capitolul 4 citotoxicitatea in vivo a suporturilor din acest lot a fost studiată pe
șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28 plusmn 30 grame
icircntr-o stare de icircntreţinere foarte bună găzduițiți icircn condițiile adecvate
Pentru implant materialele au fost secționate sub forma unor discuri cu diametrul de 15
mm (A=17671 mm2) apoi au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 10
minute Animalele au fost grupate icircn 3 loturi lotul 7 (corespunzător suportului S7) lotul 8
(corespunzător suportului S8) și lotul 9 (corespunzător suportului S9) fiecare lot cuprinzacircnd un
număr de 12 animale
Animalele au fost supuse la o intervenție chirurgicală de implantare subcutanată descrisă
icircn capitol 2 subcapitolul 248 Durata studiului a fost de 64 de zile La finalul primelor 48 ore de
experiment au fost sacrificați cacircte 3 șoareci din fiecare lot (7 8 9) apoi cacircte alți 3 din fiecare lot
la intervale de 12 34 respectiv 64 de zile
Inițial animalele au fost supuse zilnic unei observații clinice amănunțite pentru a depista
eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca urmare a respingerii implantului după care au
fost eutanasiate prin administrarea unei supradoze de izofluran Zona de implant a fost deschisă
chirurgical fără a leziona excesiv țesutul Țesuturile adiacente au fost examinate macroscopic
fiind apreciate modificările din zona de implant (porțiunea centrală a implantului) și din jurul
acesteia respectiv prezența hemoragiei necrozei infecției și modificarea culorii țesutului
Histologic fiecărui șoarece i s-au recoltat probe de țesut din zona de implant și adiacentă
acesteia pentru a evalua populația de celule din jurul implantului Aceste probe au fost fixate icircn
formol 10 apoi incluse la parafină colorate Tricromic Masson și examinate microscopic
Pentru suporturile din acest lot deoarece durata experimentului a fost mai mare s-a evaluat
gradul de icircncapsulare a materialelor (granulom de corp străin) măsuracircnd grosimea capsulei de la
periferia spațiului ocupat de implant pacircna la marginea exterioară a acesteia Scorul icircncapsulării a
fost realizat conform recomandărilor ISO Standard 10993 prezentate icircn tabelul 59
135
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 59 Scorul icircncapsulării
Capsulă Scor
Absentă 0
gt 05 mm 1
06 ndash 10 mm 2
11 ndash 20 mm 3
gt 20 mm 4
Cerințele testului sunt icircndeplinite dacă diferențele dintre scorul mediu al animalelor din lot
este lt 10 mm
Icircn urma observațiilor clinice nu se observă modificări ale țesuturilor adiacente implantului
integritatea pielii nu este modificată nu sunt prezente semne de turgescență icircnroșire erupție sau
piloerecție La racircndul lor datele histologice susțin ipoteza biocompatibilității compozitului pe
baza de polimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Figura 513 Suportul S7 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
Icircn cazul bioimplanturilor diferite tipuri de celule interacționează și conduc la răspunsuri
specifice iar icircnțelegerea acestor mecanisme ne conduc către realizare unor suprafețe de implant
136
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
cu o mult mai mare compatibilitate cu structurile biologice Fiecare implant ne-natural induce un
răspuns inflamator acutdin partea organismului dar nu răspunsul icircn sine este important ci
icircntinderea și intensitatea sa Prin urmare orice test de biocompatibilitate a unui anumit material
trebuie să se bazeze pe evaluarea populației de celule din jurul implantului
Markeri importanți pentru biocompatibilitate sunt tipurile de celule care apar după
implantarea materialului străin Icircn literatura de specialitate nu este clar dacă prezența celulelor
gigant de corp străin marchează o incompatibilitate a biomaterialului sau dacă acestea denotă un
comportament de degradare normală a materialelor biomaterialelor resorbabile [183] Orice
biomaterial implantat este recunoscut de către organism ca un rdquonon selfrdquo Icircn mod obișnuit toate
biomaterialele implantate icircn țesutul conjunctiv induc un răspuns din partea gazdei proces
inflamator acut a cărei formă de manifestare și intensitate diferă
Figura 514 Suportul S8 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
După Hench și Best dacă biomaterialul este (I) toxic țesuturile din jur mor (II) netoxic și
biologic inactiv (aproape inert) apare un țesut fibros de formă și grosime variabilă (III) netoxic
și biologic activ (bioactiv) se produce o legătură interfacială stracircnsă material-structură biologică
(IV) netoxic și se dizolvă țesuturile din jur icircl icircnlocuiesc [184] Amplitudinea și durata
137
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
procesului inflamator are o influență determinantă asupra stabilității și compatibilității
biomaterialului implantat [185]
Figura 515 Suportul S9 la 48 ore 12 zile și 64 zile post-implantare
Reacția organismului este evidentă icircn primele 48 de ore de la implantare manifestată
printr-un proces inflamator accentuat la materialele 7 și 8 și mai redus ca intensitate icircn cazul
suportului S9 Se constată un aflux celular semnificativ reprezentat de macrofage neutrofile
leucocite rare limfocite fibroblaste și fibre de colagen Infiltratul inflamator a fost mai redus
caracterizat prin prezența de rare leucocite neutrofile și macrofage la S9
La 10 zile de la prima evaluare (12 zile de la debutul experimentului) la suporturile S7 și
S8 reacția fibroasă periferică este mai intens exprimată prin fiboblaste și fibre de colagen cu
orientare concentrică Infiltratul inflamator este reprezentat de macrofage limfocite histiocite și
fibroblaste La suportul S9 se icircnregistrează o proliferare fibroasă cu tendință de icircnglobare a
materialului Reacție giganto-celulară cu celule gigante de corp străin icircn ale căror citoplasme se
pot observa particule fagocitate din biomaterial Primele celule care se atașează materialului de
implant sunt fibroblastele Ele produc un colagen imatur observabil pe suprafața implantului
[186]
Prezența fibrelor de colagen și a fibroblastelor este considerată o reacție tisulară normală
Icircn acest strat (fibrinos) prezența de macrofage și neutrofile joacă un rol important icircn
138
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
transformarea implantului icircntr-un material biologic recunoscut și acceptat de către organism
[187]
Prezența macrofagelor inclusiv dezvoltarea țesutului de granulație este un răspuns firesc din
partea organismului ca parte a comportamentului normal de degradare a materialelor cel puțin
icircn cazul biomaterialelor degradabile [188]
De asemenea macrofagele modulează reacția tisulară prin producerea de interleukine
factori de creștere și alți agenți bioactivi precursori ai celulelor gigant de corp străin [189]
Interacțiunea macrofage-limfocite este una complementară Probabil adeziunea macrofagelor la
o suprafață este semnalul pentru activarea limfocitelor iar prezența limfocitelor influențează la
racircndul lor activitatea macrofagelor [190] și fuziunea [191]
Următoarea etapă a răspunsului gazdei este marcată de atracția monocitelor și acțiunea
mastocitelor cu eliberarea de histamină [192] Această reacție este unică și nu pare să depindă de
tipul de implant Amploarea reacției și grosimea stratului inflamator (index pentru
biocompatibilitate) depinde de natura chimică și topografia implantului Anderson consideră că
prezența celulelor mononucleare inclusiv limfocite și celule plasmatice este considerată
inflamație cronică icircn timp ce reacția la corp străin cu dezvoltarea țesutului de granulație este
considerată un proces de videcare normal a unei răni ca răspuns la implantul de biomateriale La
34 de zile de la implant icircn cazul tuturor celor trei suporturi se observă o tendință de icircnglobare
tisulară a acestora prin invazie conjunctivă (scorul mediu al icircncapsulării a fost de 1 sub 05 mm)
și un infiltrat inflamator redus Este un proces normal de invazie a fibroblastelor și de sinteză a
matricei extracelulare prin acești fibroblaști activi Se termină icircntr-un strat interior de macrofage
șisau celule de corp străin cu o zonă secundară icircn afara fibroblaștilor și țesutului conjunctiv care
icircnconjoară materialul de implant [193]
După 64 de zile de la implantare se icircnregistrează o tendință evidentă de asimilare și
resorbție a celor trei tipuri de biomateriale și delimitarea acestora icircn insule mici izolate de țesut
fibros Răspunsul organismului icircn cazul celor trei tipuri de materiale a fost unul normal
caracterizat printr-o reacție inflamatorie acută a cărei intensitate s-a redus după primele 48 de
ore Grosimea capsulei fibroase este sub 05 mm (scor 1) aspect care influențează icircn mod pozitiv
degradarea și resorbția materialului icircn timp acestea făcacircdu-se ușor și fără o reacție celulară
semnificativă
139
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
53 Concluzii
Utilizacircnd același procedeu biomimetic de co-precipitare și același program
experimental folosite și icircn capitolul 4 s-au preparat 13 suporturi notate S1 ndash S13 Diferența icircntre
cele două loturi de suporturi preparate pentru potențiale aplicații icircn regenerarea osoasă a fost dată
de forma de prezentare a MNPs incluse icircn compoziție Icircn capitolul 4 MNPs au fost incluse icircn
sinteză sub formă uscată pe cacircnd icircn capitolul de față au fost introduse sub formă de suspensie
coloidală icircn apă urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura
suporturilor Pentru ambele loturi s-a folosit o concentrație de 5 MNPs față de cantitatea de
substanță uscată de biopolimeri și fosfați de calciu introduse icircn sinteză
Datele FTIR au evidențiat prezența de picuri caracteristice pentru toate
componentele suporturilor La fel ca icircn capitolul precedent o parte din suporturi au fost
sterilizate prin expunere la radiații UV timp de 4 ore Comparacircnd datele FTIR pentru suporturile
expuse la UV și cele ne-expuse nu s-au observat diferențe benzile reprezentative ale grupărilor
funcționale specifice componentelor suporturilor avacircnd valori foarte apropiate sau chiar egale
Datele XRD și EDS au analizat tipurile de fosfați de calciu formate pe matricea
polimerică cele mai reprezentative forme identificate fiind fosfat dicalcic ndash CaHPO4
hidroxiapatită ndash Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2 și fosfatul tetracalcic ndash Ca4(PO4)2O
Datele SEM au evidențiat o structură poroasă CP și MNPs fiind distribuite
uniform icircn matricea polimerică Ca și icircn cazul datelor FTIR s-a studiat icircn paralel și morfologia
suporturilor expuse la radiații UV demonstracircndu-se că acest tip de sterilizare nu influențează
morfologia acestora Un studiu mai detaliat al morfologiei a fost studiat cu ajutorul analizei
microCT Rezultatele au indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra
porozităţii suporturilor
Valorile obţinute pentru modulul lui Young se situează icircn intervalul 7628 MPa ndash
279 47 MPa Rezultatele sunt icircncurajatoare deoarece modului lui Young pentru osul spongios
se icircncadrează icircntre 20 MPa și 500 MPa
140
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn ceea ce privește proprietățile magnetice ale suporturilor s-a calculat
magnetizarea valorile obținute fiind cuprinse icircntre 2241 și 6733 emug Aceste valori indică
faptul cu suporturile sunt superparamagnetice
Gradul de retenție al suporturilor are valori foarte mari cuprinse icircntre 945 și
2248 valori corelate cu structura poroasă și proprietățile hidrofile ale biopolimerilor din
compoziție Degradarea enzimatică a suporturilor s-a realizat cu o viteză constantă icircn timp atacirct
pentru Cs cacirct și pentru Col
Citotoxicitatea in vitro a suporturilor a fost testată pe trei linii celulare diferite
fibroblaste osteoblaste și celule STEM Un test MTT standard a fost realizat la 24 ore 48 ore și
72 ore la fiecare timp calculacircndu-se viabilitatea celulară Suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor cele mai bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Pentru osteoblaste s-au
obținut valori mai reduse ale viabilității celulare comparativ cu celelate două linii celulare
explicate de sensibilitatea ridicată a acestui tip de celule
Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost studiată pe șoareci femele din linia
CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de la implantarea subcutanată a
fragmentelor sterilizate de suporturi O reacție inflamatorie acută a avut loc icircn primele ore de la
implantarea a cărei intensitate s-a redus dupăprimele 48 ore Analizacircnd icircn amănunt datele
histlogice obținute la diverse intervale de timp la sfacircrșitul testului s-a ajuns la concluzia că
suporturile nu au efect citotoxic in vivo totodată s-a observat asimilarea și resorbția suporturilor
141
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
Reproductibilitatea este una din ipotezele de bază icircn experimentele științifice Dacă un
experiment nu este reproductibil rezultatele lui nu poate fi dovedite deci prin urmare nu pot fi
acceptate
Acest aspect a creat dificultăți majore icircn majoritatea domeniilor științifice De exemplu icircn
domeniul biologic probele de microbiologie depind direct de tulpinile acestora ceea ce conduce
la o lipsă de consecvență a rezultatelor deoarece fiecare grup de cercetare poate folosi propriile
tulpini Dificultăți icircn reproductibilitatea experimentelor științifice sunt observate și icircn domeniul
ingineriei tisulare Icircn acest sens icircn timpul oricărui experiment științific trebuie avute icircn vedere
două aspecte importante repetabilitatea și reproductibilitatea metodei acestea fiind componente
ale preciziei icircntr-un sistem de măsurare Cei doi termini se referă la măsurarea unui set de
condiții care includ aceeași procedură aceeași operatori același sistem de măsurare și aceleași
condiții de funcționare Repetabilitatea are loc icircn aceași locație pe cacircnd reproductibilitatea are
loc icircn locații diferite [196 197]
Reproductibilitatea slabă pune la icircndoială rezultatele științelor biomedicale Problema
principală este dată de complexitatea procesul de cercetare științifice
Icircn capitolele 4 și 5 au fost prezentate prepararea și caracterizarea a două loturi de suporturi
ambele fiind realizate printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare Icircn acest scop soluţii de
precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost amestecate cu soluţii de
biopolimeri Cs (1) C (1) Hya (1) şi MNPs pH-ul amestecului a fost ajustat la 72-74
utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac ndash NH4OH iar după spălare amestecurile au fost liofilizate
pentru 24 h
Diferenţa dintre cele două loturi de material este data de modalitatea de incluziune a
particulelor magnetice icircn etapa de sinteză a suporturilor obţinacircndu-se icircn cele din urmă
142
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Lot numărul 1 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată
Lot numărul 2 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
Pentru ambele loturi a fost utilizat un program experimental cu două variabile (concentrația
de chitosancolagen și raportul CaP) cu scopul de a se determina compoziția optimă a
suporturilor Respectacircnd valorile teoretice din programul experimental s-au obţinut 13 probe
Concentraţia de Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză
iar pentru raportul CaP au fost alese valori apropiate de cele identificate icircn țesutul osos uman
611 Obținerea suporturilor
Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi lotul numărul 2 s-a
dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul numărul
9 ndash S9 s-a dovedit a fi cel mai aproape de un suport ideal
Astfel pentru a demonstra reproductibilitatea metodei obiectivele următoare au fost
obţinerea şi caracterizarea a 7 suporturi avacircnd compoziţia teoretică a suportului 9
Suporturile obţinute au fost notate S91 ndash S97 și au fost caracterizate din punct de vedere
al structurii chimice utilizacircnd spectroscopia IR cu transformată Fourier ndash FTIR iar din punct de
vedere al morfologiei prin microscopie electronică de baleiaj ndash SEM și micro computer-
tomografie (microCT)
De asemenea s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
143
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
612 Rezultate şi discuţii
6121 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată utilizacircnd spectroscopia icircn infraroşu cu transformată
Fourier ce determină interacțiunile dintre cei trei biopolimeri fosfați de calciu și particulele
magnetice Rezultatele redate icircn figura 61 indică prezenţa picurilor caracteristice tuturor
componentelor cei trei biopolimeri fosfații de calciu și nanoparticule magnetice iar icircn tabelul
61 sunt prezentate benzile lor representative [136]
Figura 61 Structura chimică a suporturilor
După cum se poate observa atacirct icircn figura 61 cacirct și icircn tabelul 61 suporturile analizate au
structură chimică asemănătoare componentele din structura lor avacircnd benzile reprezentative
apropiate sau chiar egale
144
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Tabel 61 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S92 şi S97
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
S92 S97
3422 OH 3420 OH
2927 C-H 2926 C-H
1655 Amida I C=O 1656 Amida I C=O
1554 Amida II N-H 1554 Amida II N-H
1074 C-O-C 1069 C-O-C
604 Fe-O 602 Fe-O
562 PO3_4
561 PO3-4
6122 Morofologia suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată pentru o imagine de ansamblu cu ajutorul
microscopiei electronice de baleiaj (figura 62) Nu se observă diferenţe de morfologie icircntre
suporturile analizate fiind observată icircn ambele cazuri și la ordine de mărire diferite o structură
tridimensională cu pori intercomunicabili structură ce include atacirct cristale de fosfaţi de calciu cacirct
şi nanoparticule magnetice distribuite icircn matricea polimerică
Pentru o imagine mai detaliată asupra morfologiei suporturilor fragmente din acestea au
fost scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi
o rotaţie de 05deg Tehnica utilizată a fost descrisă pe larg icircn capitolul 5 sub-capitolul 523
Programul CTVox (Bruker Belgium) a fost utilizat icircn vederea vizualizării distribuţiei
porozităţii O funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste reconstrucţia 3D
a probei de investigat iar apoi un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare după cum se
poate observa icircn figura 63 Icircn tabelul 62 sunt prezentate dimensiunea distribuţia porilor
volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
145
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 62 Morfologia suporturilor
Figura 63 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suportul S94
Tabel 62 Dimensiunea porilor suportului S94
Dimensiunea porilor Volumul regiunii de interes Aria regiunii de interes
121plusmn5613 microm
144912 mm
3 769888 mm
2
146
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn figurile 64 Valorile obţinute pentru rezistența
la compresiune se situează icircn jurul valorii de 58 MPa iar valorile modulului Young sunt
cuprinse icircntre 215 MPa şi 220 MPa valori
Figura 64 A Rezistenţa la compresiune a suporturilor B Modulul Young pentru suporturi
Aceste valori sunt icircn mare parte determinate de porozitatea ridicată a compozitelor obţinute
prin procedeul de liofilizare Se observă valori apropiate ale rezistenței la compresiune a
suporturilor precum și a modului Young calculat metoda este deci reproductibilă și din punct de
vedere al proprietăților mecanice ale suporturilor obținute
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Rezultatele obținute icircn urma studiului de determinare a retenției fluidelor de interes
biologic sunt redate icircn figura 65
Figura 65 Grad de retenţie maxim
0
200
400
600
800
1000
1200
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Gra
d d
e re
ten
ție
maxi
m
()
72 ore
147
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor
dovedită de datele de microscopie electronică de baleiaj (figura 62) Acestea sunt cuprinse icircntre
685 și 909 cu o medie a valorilor obținute de 781 Această diferență de 224 icircntre
valoarea maximă și valoarea minimă obținute poate fi explicată de faptul că dimensiunea porilor
nu este uniformă conform tabelului 62 această este de 121 plusmn 5613 pentru suportul S94
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea enzimatică este cea mai utilizată metodă de caracterizare a biodegradabilității
unui suport Suporturile S91 ndash S97 au fost supuse degradării enzimatice determinacircndu-se
concentraţia de chitosan respectiv de colagen degradat la intervalie stabilite
Concentraţia de chitosan degradat
Se observă o creştere graduală icircn timp a concentraţie de chitosan degradat (figura 66) ceea
ce indică o degradare controlată a suporturilor proprietate foarte importantă pentru aplicaţia
vizată deoarece o rată de degradare prea rapidă implică o refacere incompletă a ţesutului osos
iar o rată de degradare prea lentă poate duce la o fractură sau la o deformaţie a osului Se pot
observa valori apropiate ale concentraţie de chitosan degradat ceea ce indică reproductibilitatea
metodei de sinteză
Figura 66 Concentraţia de chitosan degradat
0
015
03
045
06
075
09
105
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
(Co
nce
ntr
aţi
e ch
ito
saln
deg
radat)
∙
10
0 m
mo
liL
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
148
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Concentraţia de colagen degradat
Analizacircnd figura 67 se observă valori constante icircn timp ale concentraţie de colagen
degradat Ca și icircn cazul chitosanului degradarea colagenului se realizeză gradual pe măsură ce
enzima icircn cazul de față colagenaza reușește să străbată matricea anorganică formată din fosfați
de calciu și să ajungă la matricea organică polimerică
Valorile obținute pentru cele 7 suporturi analizate sunt apropiate procesul de degragare
gradual fiind observată pentru toate cazurile
Figura 67 Concentraţia de colagen degradat
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
Fragmente de suporturi au fost puse icircn contact direct cu osteoblaste rezultatele fiind redate
icircn figura 68A Valorile obţinute pentru viabilitatea celulară sunt icircn jur de 80 pentru toate
intervalele de contact ceea ce indică faptul sunt lipsite de citotxicitate
Icircn urma contactului direct al suporturilor cu fibroblaste rezultate redate icircn figura 68B s-
au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de
aproximativ 100 pentru toate ambele suporturi ceea ce indică a foarte bună citompatibilitate a
probelor
0
05
1
15
2
25
3
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Co
nce
ntr
ţia
de
cola
gen
deg
rad
at
m
moli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
149
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 68 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile
A Utilizacircnd osteoblate B Utilizacircnd fibroblaste
Pentru a reconfirma citocompatibilitatea suporturile la contactul direct cu fibroblastele și
reproductibilitatea metodei de sinteză s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-
AM rezultatele obţinute fiind prezentate icircn figura 69
Figura 69 Viabilitatea fibroblastelor icircn contact direct cu suporturile
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu fragmente
de suporturi după 72 ore de contact direct
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 B
150
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
Corelate cu alte afecțiuni maligne tumorile primare sunt destul de rare și mai puțin
frecvente reprezentacircnd doar 02 din toate neoplasmele raportate icircn Marea Britanie și Statele
Unite [198] Icircn plus tumorile primare sunt depășite ca număr de metastaze date de carcinom
melanom sau afecțiunile maligne hematologice cum ar fi plasmacitomul De asemenea alte
condiții non-neoplazice cum ar fi unele procese inflamatorii chisturile osoase displazia fibroasă
sau boala Paget depășesc cazurile de tumori osoase primare [199] Cele mai frecvente tumori
osoase maligne sunt osteosarcomul (35) condrosarcomul (25) sarcomul Ewing (16)
chordomul (8) și histiocitomul fibros malign (5) [200]
Tratamentul tumorilor osoase maligne reprezintă o adevărată provocare clinică deoarece
rezecția chirurgicală a tumorii și radioterapia nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral
Chimioterapia care precede de regulă celelalte două tehnici are efecte adverse semnificative și
totodată icircn unele cazuri poate apărea o rezistență la aceste medicamente Există icircnsă și o serie de
tratamente alternative cum ar fi hipertermia terapia țintită imunoterapia fototerapia utilizarea
nanoparticulelor transplant de celule stem și altele unele din ele aflate icircncă icircn faza de studiu dar
care vor oferi cel mai probabil soluții foarte bune icircn viitor [201] Imunoterapia icircmbunătățește
capacitatea celulelor imune de a recunoaște și ținti celulele tumorale ceea ce duce la eliminarea
lor Avantajele imunoterapiei includ specificitate ridicată anti-tumorală și efecte secundare
minime prin folosirea propriului sistem imunitar al pacientului Hipertermia este un tratament
modern ce implică creșterea temperaturii la locul țintă pentru a induce astfel un stres termic
temperatura la care se ajunge fiind icircn medie 40degC (39ndash43degC icircn funcție de strategia terapeutică)
[202]
Icircn mod particular protocolul de tratament al osteosarcoamelor icircncepe cu rezecția
chirurgicală a tumorii osoase primare și a eventualelor metastaze Defectul osos obținut este
acoperit cu un material de substituție osoasă pentru a preveni fracturile sau deformațiile osoase
[203] Deoarce tumorile osoase sunt aproape imposibil de icircndepărtat icircn totalitate intervențiile
chirurgicale sunt urmate de radiochimioterapie [204]
Icircn cazul unor tumori osoase tratamentul implică două etape Icircntr-o primă etapă țesutul
tumoral este icircndepărtat chirurgical iar icircntr-o a doua etapă defectul osos obținut este acoperit cu
151
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
un material de substituție osoasă tot mai studiate fiind suporturile magentice biomimetice Icircn
prezența unui cacircmp magnetic aceste suporturi vor atrage alte particule magnetice introduse icircn
circulație Acestea din urmă vor fi funcționalizate cu medicamente chimioterapice precum și cu
factori de creștere care să susțină procesul de regenerare osoasă și formare de neo-țesut
Radioterapia se icircncadrează adesea icircn schemele de tratament a diferitelor tipuri de cancer
rezultatele obținute de-a lungul timpului icircn practica clinică fiind eficiente Utilizacircnd radiații
ionizate raze X radioterapia generează stres oxidativ excesiv și induce denaturarea ADN-ului
ce va conduce la moartea celulelor tumorale Radioterapia este o metodă neinvazivă de
tratament radiația fiind aplicată la locul țintă pe cacirct posibil Un dezavantaj al metodei este acelă
că unele celule sunt radiorezistente Icircn cazul icircn care este observat acest fenomen se impune
utilizarea unei doze excesive de radiații care icircnsă va distruge celulele adiacente sănătoase Din
acest motiv există scheme de tratament de radio-sensibilizare de exemplu se poate combina
chimioterapia de radio-sensibilizare cu radioterapia [205] Icircn ceea ce privește tumorile osoase
radioterapia are ca efect de scurtă durată o reducere a densității minerale osoase imediat după
expunerea la radiații dar ulterior induce re-calcifierea leziunii etapă a procesului complex de
remodelarea osoasă Se presupune că icircn cazul pacienților cu răspuns bun la acest tip de terapie
este nevoie de aproximativ 3 luni pentru ca osul să fie refăcut [206]
Medicamentele chimioterapeutice sau citostatice sunt fie substanțe naturale fie derivați
sintetici ai acestora extrase din plante specii marine sau unele microorganisme [207]
Dezavantajele acestei terapii sunt toxicitatea și biodistribuția nefavorabilă a compușilor Sisteme
pentru eliberarea țintită a acestor principii active sunt intens studiate [208]
Icircn acest context polimerii sunt materiale adecvate pentru a transporta medicamente
icircncapsulate sau legate chimic De-a lungul timpului polimerii și nanoparticulele polimerice au
jucat un rol cheie icircn dezvoltarea tehnologiei de eliberare a medicamentelor oferind eliberarea
controlată a agenților terapeutici icircn doze constante pe perioade lungi dozare ciclică și eficiență
mai bună a medicamentelor hidrofile sau hidrofobe [209 210]
Suporturile obținute icircn capitolele anterioare au potențial de a fi utilizate pentru umplerea
defectului osos rezultat după rejecția chirurgicală a tumorii și totodată pentru eliberarea țintită
de chimioterapice icircncorporate icircn nanoparticulele magnetice din structura lor Scopul strategiilor
experimentale descrise icircn cele ce urmează a fost testare potențialului suporturilor obținute de a fi
utilizate icircn radiochimioterapia tumorilor osoase maligne Inițial suporturile au fost expuse la
152
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
radiații X pentru a stabili influența asupra structurii și proprietăților acestora Icircn etapa următoare
s-a studiat icircncărcarea și eliberarea de chimioterapice (doxorubicină ndash DOX) din nanoparticulele
magnetice incluse icircn suporturi
621 Obținerea suporturilor
Șase suporturi au fost preparate după protocolul descris icircn capitolul 5 Pe scurt suporturile
au fost obținute prin co-precipitarea CaCl2 și a NaH2PO4 pe un suport de biopolimeri Cs Col
Hya și MNPs icircn prezența unei soluții apoase de amoniac NH4OH Icircn tabelul 63 sunt detaliate
codificările compoziția și caracteristicile distinctive ale suporturilor
Tabel 63 Codificarea și compoziția suporturile obținute și caracteristica lor distinctivă
Codificare
suport Compoziția biopolimerică CaP
Concentrația
de MNPs Caracteristica distinctivă
S5 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Control
S9 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Control
S5R 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S9R 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S5-DOX 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
S9-DOX 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor
Icircn vederea iradierii suporturilor cu raze X s-au urmat pași specificați icircn capitolul 2 sub-
capitolul 2491 și anume
a avut loc o simulare computer-tomograf (CT) icircn condiții similare radioterapiei
(poziționarea laserului plasarea markerilor radio-opaci externi scanarea volumului iradiat cu un
dispoziti de scanare CT special)
conturarea volumului țintă pe imagini complexe CT
stabilirea dozei de radiație
determinarea parametrilor fascicului de radiație (energia de lucru unghiul de incidență
dimensiuni și forme utilizarea accesoriilor optime)
analiza histogramei doză-volum pentru a verifica dacă cel puțin 95 din volumul țintă
a iradiat minim 95 de doza prescrisă
153
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn planul de iradiere denumit CILINDRU secțiunile obținute au fost conturate astfel
suprafața exterioară ca referință (S) materialul (V1) și volumul țintă (V2) V2 = V1 + 5mm
pentru a compensa posibilele eroari de poziție figura 610A
Doza de radiații utilizată a fost de 8 Gy fracțiune unică aceasta fiind doza unică
administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase [211 212 213]
Realizarea unui plan de tratament care să respecte atacirct distribuția omogenă icircn volumul țintă
a dozei prescrise cacirct și constracircngerile legate de doză cu privire la riscul de a afecta organele din
vecinătate impun alegerea cu atenție sporită a tehnicii de iradiere icircn unele cazuri fiind necesară
aplicarea unui bolus la suprafața volumului iradiat De exemplu iradierea peretelui toracic după
mastectomie radicală solicită utilizarea unui bolus icircn vederea obținerii parametrilor optimi ai
planului de tratament tipul și grosimea bolusului fiind incluse icircn algoritmul de calcul Bolusul
permite iradierea pielii cu 100 din doza prescrisă icircn timp ce icircn lipsa acestuia pielea (icircn care icircn
cancerul de sacircn apar aproape toate recidivele locale) este iradiată cu 70 din doza prescrisă iar
țesuturile nețintă (mușchi coaste) primesc 100 din doză Icircn mod similar bolusul este indicat
pentru iradierea tumorilor laringelui cu extensie la comisura anterioară sau a tumorilor vulvare
primare [214]
Planul de tratament a fost realizat utilizacircnd software-ul Eclipsetrade Planning Treatment
System Pentru o distribuție omogenă a dozei icircn volumul materialului a fost plasat un bolus de
10 mm grosime pe suprafața materialului rezultacircnd o includere suficientă icircn izodoza 95
(prezentată icircn verde icircn figura 610B) pentru V2 Termenul de izodoză se referă la suprafețele
care unesc toate punctele la nivelul cărora are loc absorbția unor doze egale de energie radiantă
[215]
Figura 610 A Conturarea volumului țintă pe imaginile CT ale eșantionului B Distribuția dozei
de radiații icircn volum de suport după aplicarea bolusului
154
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Parametrii stabiliți pentru planul de iradiere au fost două raze opuse izocentrice egale
una din poziția zero (AP) cu 6 MV și una posterioră poziționată la 180 de grade (PA) cu 15 MV
(figura 611)
Figura 611 Parametrii planului de iradiere
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină
Nanoparticulele magnetice au fost icircncărcate cu doxorubicină conform protocolului descris
anterior icircn subcaptiol 2492 Pe scurt icircntr-o suspensie coloidală de 1 MNPs icircn apă s-a
solubilizat 0125 doxorubicină nanoparticulele astfel obținute fiind notate cu MNPs-DOX
Suspensia finală a fost utilizată la prepararea suporturilor S5-DOX și S9-DOX conform datelor
experimentale din tabelul 63
Pentru caracterizarea suporturilor s-au analizat morfologia acestora eliberarea controlată
de medicamente antitumorale și citotoxicitatea in vitro la contactul direct cu celule tumorale
Structura chimică a suporturilor preparate a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR
iar morfologia lor cu ajutorul microscopiei electronice SEM
Pentru suporturile S5 S5R S9 S9R a fost analizată interacțiunea cu PBS (grad de retenție
maxim PBS) și s-au efectuat studii de degradare in vitro utilizacircnd un complex de enzime lizozim
(1200 μgml) și colagenază (100 μgml ) conform datelor experimentale din subcapitolul 246
155
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
De asemenea a fost studiată citotoxicitatea citotoxicitatea suporturilor sterilizate (expuse la o oră
la radiațiile UV) utilizacircnd celule osoase din linia MG-63 Un test MTT standard a fost efectuat la
24 48 și 72 de ore și a fost calculată viabilitatea celulară
Pentru suporturile S5-DOX și S9-DOX s-a analizat eliberarea de medicament in vitro
(subcapitol 2492) și interacțiunea cu celule MG-63 Suporturile au fost sterilizate tot prin
expunere la UV pentru o oră după care au fost puse icircn contact direct cu celulele Icircn paralel o
soluție stoc de doxorubincină a fost preparată icircn condiții sterile diferite concentrații fiind
analizate din punct de vedere al interacțiunii cu același tip de celulele Viabilitatea celulară a fost
calculată cu ajutorul unui test MTT standard
624 Rezultate și discuții
Suporturile preparate au fost testate icircn vederea unei potențiale utilizări icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne tehnică redată schematic icircn figura 612
Figura 612 Tratamentul tumorilor osoase maligne utilizacircnd tehnici de radioterapie și
chimioterapie
156
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor
Analiza FTIR a fost utilizată pentru studiul structurii chimice a suporturilor rezultatele
fiind redate icircn figura 613
Icircntre suporturile radiate și neradiate (figura 613A) nu se observă diferențe de structură
chimică benzile de absorbție caracteristice biopolimerilor nanopaticulelor magnetice și
fosfaților de calciu fiind observate icircn toate spectrele FTIR Icircn ceea ce privește biopolimerii se
pot observa următoarele picuri caracteristice 3439 cm-1
3434 cm-1
și 3489 cm-1
pentru gruparea
hidroxil 2925 cm-1
2924 cm-1
și 2927 cm-1
pentru -CH2 1652 cm-1
1654 cm-1
și 1649 cm-1
pentru amida I 1552 cm-1
și 1554 cm-1
pentru amida II [216] Pentru CaP au fost observate
picuri ale grupărilor fosfat la 601 cm-1
și 603 cm-1
iar pentru MNPs au fost observate picuri
caracteristice la 561 cm-1
și 563 cm-1
[99 160]
Figura 613 Spectrele FTIR ale suporturilor
Spectrele FTIR ale suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și al DOX sunt redate icircn figura
613B Spectrul DOX prezintă următoarele benzi caracteristice 2929 cm-1
pentru vibrația de
icircntindere a legăturii C-H 1730 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii C=O 1617 cm-1
și
157
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
1525 cm-1
pentru legătura NndashH 1411 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashC și 1286
cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashOndashC O parte din aceste benzi au fost observate și
pe spectrele corespunzătoare suporturilor S5-DOX și S9-DOX ceea ce sugerează interacțiunea
medicamentului cu celelalte componente ale suporturilor Alte picuri observate pe spectrele celor
două suporturi au fost 3446 cm-1
și 3440 cm-1
pentru gruparea ndashOH 2925 cmminus1
pentru ndashCH2
1654 cm-1
și 1656 cm-1
pentru amida I și altele cu valori apropiate de cele ale suporturilor fără
DOX (figure 613A)
Morfologia suporturilor realizate cu scopul de a fi utilizate icircn regenerarea osoasă este o
caracteristică foarte importantă de care trebuie să se țină cont icircn procesul de sinteză Aceste
suporturi trebuie să aibă porozitatea și dimensiunea porilor adecvate aplicației vizate Rețelele cu
pori interconectați influențează puternic procesul de nutriție a celulelor proliferarea și migrarea
acestora precum și vascularizare suportului [217] Rezultatele acestei analize au fost prezentate
icircn figura 614
Figura 614 Morfologia suporturilor
158
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
Influența radiaților asupra suporturilor a fost analizată și din punct de vedere al
interacțiunii cu fluidele de interes biologic și anume PBS pH = 72 001M S-a utilizat aceași
metodă volumetrică descrisă și icircn capitolele anterioare și s-a calculat gradul maxim de retenție
PBS utilizacircnd formula (14) redată icircn capitolul 2 Rezultatele obținute sunt prezentate icircn tabelul
64 și icircn figura 615
Tabel 64 Gradul de retenţie PBS al suporturilor
Nr crt Denumirea
suportului
Gradul
de retenţie PBS ()
1 S5 995 plusmn 30
2 S5R 1040 plusmn 35
3 S9 990 plusmn 50
4 S9R 987 plusmn 19
Figura 615 Gradul de retenție a suporturilor radiate și acelor neradiate
Diferența dintre valorile gradului de retenție pentru S5 și S5R este de aproximativ 45
iar icircntre S9 și S9R este nesemnificativă Icircn cazul suporturilor S5 și S5R diferență poate fi
explicată de dimensiunea neuniformă a porilor (figura 614) la fel ca și icircn cazul suporturilor
realizate pentru studiul reproductibilității ale cărui rezultate au fost prezentate mai sus Avacircnd
0
200
400
600
800
1000
1200
S5 S5R S9 S9R
Gra
dul m
axim
de
rete
nți
e P
BS
72 ore
159
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
această explicație pentru diferența dintre valorile obținute s-a putut afirma că radiațiile X nu
influențează interacțiunea suporturilor cu fluidele de inters biologic
Degradarea enzimatică a suporturilor a fost studiată utilizacircnd un amestec de două enzime
lizozim și colagenază metoda fiind descrisă icircn detaliu icircn capitolul 2
Potrivit lui Brouwer și colaboratorii [218] concentrația de lizozimă icircn serul uman este de
950-2450 μgL dar niveluri crescute pot fi observate icircn bolile benigne bolile inflamatorii
intestinale unele afecțiuni hematologice (policitemia vera mielomul multiplu) și procesele
maligne cum ar fi leucemiile [219] De exemplu Firkin [220] a raportat un nivel foarte ridicat al
lizozimului seric 30-120 μgml icircn leucemia mieloidă cronică și mielofibroza Icircn ceea ce privește
aceste date din literatură s-a ales o concentrație de 1200 μgml dat fiind că suporturile sunt
destinate tratamentului tumorilor osoase și probabil un nivel ridicat de lizozim va fi găsit icircn os
Deoarece colagenul este cea mai predominantă proteină din corpul uman nivelurile de
colagenază sunt greu de măsurat cu precizie această enzimă fiind găsită icircn toate țesuturile
organele icircn care există colagen Colagenaza interstițială are un rol-cheie icircn remodelarea normală
și patologică a matricelor extracelulare colagen inclusiv a țesutului osos și a țesutului conjunctiv
[221] De asemenea există diferite tipuri de colagenază de ex icircn pielea umană colagenază
secretată de fibroblastelor are două forme de proenzime (57 și 52 kDa) [222]
Rezultatele studiului au fost redate icircn figura 616A ndash reprezentacircnd concentrația de chitosan
degradat și 616B ndash reprezentacircnd concentrația de colagen degradat
Figura 616 A Concentraţia de chitosan degradat B Concentrația de colagen degradat
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
S5 S5R S9 S9R
(Conce
ntr
ația
de
Cs
deg
radat
) ∙
100
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
0
001
002
003
004
005
006
007
008
S5 S5R S9 S9R
Conce
ntr
ați
a de
cola
gen
deg
radat
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile A B
160
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Se observă icircn ambele cazuri o creștere graduală a concentrației de polimer degradat
chitosan respective colagen Valorile obținute sunt comparabile de unde s-a ajuns la concluzia
că radiațiile nu influențează nici interacțiunea suporturilor cu fluide biologice simulate icircn cazul
de față un complex de enzime icircn PBS pH=72 001M
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată prin contactul direct a suporturilor cu
osteoblastele liniei MG-63 figura 617
Valoarea viabilității calculată conform ecuației (15) din capitolul 2 scade icircn timp
fenomen observat și icircn celelalte studii de citoxicitate pe aceast tip de celule La 72 ore de la
contactul direct al celulelor cu fragmente de suport se observă o diferență de aproximativ 10
procente icircntre suporturile care nu au fost expuse radiațiilor și cele care au fost expuse Rezultatul
nu trebuie interpretat ca și negativ icircn condițiile icircn care rolul radiațiilor este de a distruge ceulele
tumorale osteoblastele Mg-63 fiind o linie de celule tumorale (osteosarcoame)
Radiațiile au fost absorbite de aceste suporturi cu o posibilă formare de radicali liberi fără
icircnsă a influența structura lor chimică morfologia și interacțiunea cu medii biologice simulate
Fenomenul este dificil de icircnțeles studii complexe fiind necesare icircn acest sens
Figura 617 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile
0
20
40
60
80
100
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itat
ea c
elula
ră
Control S5 S5R S9 S9R
161
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn concluzie rezultatele primei părți a studiului și anume studiul influenței radiațiilor X
asupra suporturilor au arătat rezultate icircncurajatoare structura chimică a suportului morfologia și
comportamentul de degradare enzimatică nu sunt influențate de razele X utilizate icircn radioterapie
ceea ce icircnseamnă că suporturile pot fi utilizate icircn continuare icircn chimioterapie
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale
Sistemele magnetice de eliberare controlată a medicamentelor au multiple avantaje față de
metodele normale cum ar fi abilitatea de a viza un anumit loc țintă icircn organism și reducerea
cantității de medicament necesară pentru a atinge o anumită concentrație la locul țintă ceea ce
implică o reducere a concentrației medicamentului icircn organele din vecinătate fiind minimizate
efectele secundare [223]
Doxorubicina - DOX este un potențial medicament pentru tratamentul metastazelor osoase
și a tumorilor osoase dar utilizarea sa este limitată de efectele secundare sistemice DOX este un
antibiotic antraciclinic care la nivel molecular interacționează cu ADN-ul și interferează cu
sinteza acidului nucleic rezultacircnd un efect remarcabil asupra transcripției AND [224 225]
Pentru aplicații icircn chimioterapia osoasă DOX este utilizat icircn sistemele de eliberare a
medicamentelor fabricate din diferite suporturi magneticecompozite apatită nanocristalină
[226] hidroxiapatită [227] chitosan și hidroxiapatită [228] acid poliglicic-co-glicolic -
polietilenglicol (PEG-PLGA) [87] microsfere magnetice
Icircn ceea ce privește eliberarea in vitro a DOX din suporturi o eliberare treptată poate fi
observată icircn figura 617
162
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 617 Curbele cinetice de eliberare a DOX din suporturi
Pentru suportul S5-DOX eliberarea a fost mai constantă icircn timp De remarcat este faptul că
aceast suport are o cantitate considerabilă de chitosan icircn compoziție comparativ cu S9-DOX
Trebuie reamintit fapul că toate MNPs utilizate icircn teza de față au fost acoperite cu chitosan
pentru o mai bună citocompatibiliate și pentru a putea lega principii active
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
Interacțiunea suporturilor preparate icircn sub-capitolul de față a fost studiată icircn paralel cu
interacțiunea suporturilor fără medicament icircncorporat pentru a putea realiza o analiză
comparativă S-a optat pentru contactul direct al fragmentelor de suport iar drept celule
tumorale s-au utilizat tot osteoblaste din linia MG-63 Rezultatele studiului sunt redate icircn figura
618
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 50 100 150 200 250 300 350
Conce
ntr
ați
a d
e D
OX
(μgm
L)
Timp ore
S5-DOX S9-DOX
163
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 618 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct A Cu soluții
de DOX de concentrații diferite B Cu suporturile avacircnd DOX icircn compoziție și a celor fără DOX
Viabilitatea celulară a suporturilor a fost aproape de 100 la primii 2 timpi de contact 24
și 48 ore atacirct pentru suporturile cu medicament cacirct și pentru cele fără medicament Icircnsă la 72 ore
de contact a suporturilor cu osteoblastele s-a observat o scădere semnificativă a viabilității
acestora valorile obținute fiind 64 pentru S5-DOX respectiv 75 pentru S9-DOX pentru
suporturile fără DOX valorile au scăzut nesemnificativ Această scădere bruscă de viabilitate ar
putea fi explicată de faptul cu DOX este eliberată treptat din suporturi la un raport relativ scăzut
proprietate de eliberare lentă a DOX poate fi utilizată și pentru că alte medicamente anti-
tumorale puternice sau combinații de medicamente ar putea fi transportate la desemnate zona și
eliberat la un raport optim pentru combaterea tumorilor [229]
164
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
63 Concluzii
Reproductibilitatea un experiment este foarte importantă icircn vederea transpunerii
rezultatelor obținute icircn practică Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi
preparate și caracterizate icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai
adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate
Pentru a demonstra reproductibilitatea metodei 7 suporturi avacircnd compoziţia
teoretică a lui S9 au fost preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a
compoziției din punct de vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn
fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate
celulară cu Calceină-AM
Toate analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă
este reproductibilă
Icircn a doua parte a studiului s-a testat potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircn primul racircnd s-a demonstrat că o doză de radiații X
similară cu cea utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile
suporturilor cum ar fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea
in vitro
Suporturile conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic
pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și
lentă a DOX sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn
terapia combinată a tumorilor osoase maligne
165
Concluzii generale
Concluzii generale
Osul este un țesut care are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn cazul unor
afecţiuni minore fiind supus de-a lungul vieții la procese biologice complexe de creştere
modelare şi remodelare Procesul de regenerare nu este suficient icircn cazul defecte osoase grave ce
au drept factori determinați principali rezecţiile de tumoră osoasă malformaţiile congenitale
unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita Toate acestea fac ca anual la
nivel mondial să fie utilizate peste 2 milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă
Materiale de substituţie osoasă pot fi clasificate icircn mai multe categorii grefe de origine naturală
(autogrefe alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria
tisulară precum şi diverse combinaţii ale acestora
Biomaterialele prelucrate sub divere forme (suporturi macroporase sisteme injectabile
capsule filme matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri și altele) sunt
elemente cheie icircn ingineria tisulară Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de
calciu s-au dovedit a fi o soluție promițătoare icircn ingineria tisulară și medicina regenrativă a
țesutului osos unele variante comerciale fiind folosite cu succes icircn practica clinică La
prepararea acestora trebuie să se țină cont și de nano-structura osului nu doar de compoziția sa
suporturile obținute prin procedee biomimetice fiind cele mai de succes
Nanoparticulele magnetice sunt folosite la o varietate de aplicații medicale clinice și
preclinice Eliberarea controlată de medicamente este un domeniu intens studiat icircn zilele noastre
iar utilizarea nanoparticulele magnetice icircn acest scop reprezintă un subiect de mare interes pentru
un număr considerabil de cercetători
Obiectivul central al lucrării de față a fost obținerea și caracterizarea de suporturi
compozite printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare a precursorilor de fosfați de calciu pe
un amestec de biopolimeri și nanoparticule magnetice pentru a fi testate icircn regenerarea osoasă
Biopolimeri utilizați au fost colagen chitosan acid hialuronic albumină serică bovină și
gelatină iar fosfații de calciu au fost obținuți din precursori pornindu-se de la un raport teoretic
CaP comparabil cu cel identificat icircn osul uman Nanoparticulele magnetice au fost incluse
pentru studii ce au vizat icircncorporarea și eliberarea controlată de principii biologice
166
Concluzii generale
Suporturile au fost caracterizate riguros din punct de vedere fizico-chimic și biologic S-a
icircnceput cu studiul structurii chimice a compoziției și morfologiei suporturilor după care s-a
studiat interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și cu soluții enzimatice
Proprietățile mecanice ale suporturilor au fost analizate din perspectiva modului de elasticitate
Young iar proprietățile magnetice din perspectiva susceptibilității magnetice a acestora Din
punct de vedere biologic suporturile au interacționat direct sau indirect cu diverse linii celulare
și s-au implantat sub-cutanat la șoareci icircn vederea determinării citotoxicității acestora Conceptul
de terapie combinată ce implică utilizarea radioterapii și chimioterapii a fost analizat icircntr-o
ultimă etapă pentru suporturile obținute
Pentru stabilirea compoziției optime s-au realizat icircn paralel suporturi pe bază de
biopolimer amestecuri diferite de biopolimeri (chitosan chitosan ndash acid hialuronic chitosan ndash
albumină serică bovină și chitosan ndash gelatină) și fosfați de calciu obținuți din precursori raportul
teoretic CaP fiind de 165 Trei concentrații diferite de nanoparticule (1 3 5 ) au fost
icircncorporate pe racircnd icircn sinteza celor patru tipuri de suporturi Structura chimică și compoziția
suporturilor au indicat prezența picurilor caracteristice componetelor incluse icircn sinteză Datele cu
privire la compoziția suporturilor au indicat prezența unor tipuri de fosfați de calciu identificați și
icircn literatură preponderenți fiind hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul monocalcic anhidru
Ca(H2PO4)2 fosfatul tricalcic (Ca3(PO4)2) S-a calculat magnetizarea suporturilor concentrația
de 5 fiind cea mai apropiată de datele regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective Studiile
privind interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic soluții enzimatice și celule au
indicat o corelație icircntre porozitatea materialelor și proprietațile de interacțiune cu fluide și medii
biologice
Avacircnd icircn vederea datele obținute anterior obiectivul următor a fost realizarea și
caraterizarea de suporturi pe bază de colagen ndash chitosan ndash acid hialuronic nanoparticule
magentice și fosfați de calciu S-a selectat concentrația de 5 MNPs pentru a fi inclusă icircn etapă
de sinteză particulele fiind introduse icircn formă uscată O parte din proprietățile suporturilor au
fost studiate icircn paralel cu cele ale suporturilor expuse la radiații UV timp de 4 ore cu scopul de a
observa eventuale modificări survenite după această procedură de iradiere folosită icircn practica
clinicăpreclinică pentru sterilizare Nu au fost observate diferențe icircn ceea ce privește structura
167
Concluzii generale
chimică și morfologia suporturilor Gradul de retenție PBS a fost influențat semnificativă de
raportul CaP Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul ambilor
biopolimeriValorile obţinute pentru modului lui Young sunt comparabile cu cele ale ţesutului
osos spongios uman Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor Interacțiunea in vitro cu
celule (fibroblaste și osteoblaste) a dovedit faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor caracterul non-citotoxic fiind evidențiat de un test sub-cutanat in vivo
Respectacircnd compoziția de biopolimeri și fosfați de calciu precum și concentrația de
MNPs un lot nou a fost realizat diferența față de cel descris anterior fiind dată de metoda de
includere a MNPs și anume au fost introduse sub formă de suspensie coloidală icircn apă
urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura suporturilor S-au
utilizat aceleași tehnici de caracterizare ca cele descrise la punctul anterior Icircn plus un studiu mai
detaliat al morfologiei a fost realizat cu ajutorul analizei microCT Rezultatele au indicat o
influenţă semnificativă a conţinutului de fază minerală asupra porozităţii suporturilor
Proprietățile mecanice ale suporturilor sunt comparabile cu cele ale țesutului osos spongios iar
din punct de vedere al proprietăților magnetice suporturile sunt superparamagnetice
Interacțiuneain vitro a suporturilor cu celule a fost testată pe fibroblaste osteoblaste și celule
STEM Un test MTT standard a evidențiat faptul că suporturle nuafectează celulele cele mai
bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost
studiată pe șoareci femele din linia CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de
la implantarea subcutanată a fragmentelor sterilizate de suporturi iar icircn final s-a ajuns la
concluzia că suporturile nu au efect toxic in vivo Totodată s-a observat asimilarea și resorbția
suporturilor
Icircn urma unor analize detaliate ale celor două loturi de suporturi preparate și caracterizate
icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia
vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate Pentru evaluarea
reproductibilității metodei de obținere șapte suporturi avacircnd compoziţia teoretică a lui S9 au fost
preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a compoziției din punct de
vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
168
Concluzii generale
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM Toate
analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă este reproductibilă
Potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne a fost
studiată icircmtr-o ultimă etapă Inițial s-a demonstrat că o doză de radiații X similară cu cea
utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile suporturilor cum ar
fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea in vitroSuporturile
conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic pentru tratamentul
metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și lentă a DOX
sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn terapia combinată
a tumorilor osoase maligne
Cuprins
PARTEA TEORETICĂ
Introducere 1
Capitolul 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru
regenerarea osoasă
4
11 Ţesutul osos Structură Fiziologie Patologie 4
111 Funcțiile țesutului osos 4
112 Structura ţesutului osos 6
1121 Matricea extracelulară 7
1222 Celulele țesutului osos 8
113 Fiziologia ţesutului osos 9
1131 Osteogeneza și osteoliza 10
1132 Creşterea osului 11
1133 Remodelarea osului 12
114 Patologia osoasă 13
1141 Tumori osoase 13
12 Metode de tratament a defectelor osoase 16
121 Metode actuale de tratament a defectelor osoase 16
1211 Grefe osoase biologice 16
1212 Grefe osoase și substituienți sintetici 18
122 Ingineria tisulară și regenerarea osoasă 20
1221 Biomateriale utilizate la realizarea de suporturi pentru regenerarea osoasă 21
12211 Biopolimeri 21
12212 Polimeri sintetici 28
12213 Biomateriale cermice 30
1222 Suporturi biomimetice pentru ingineria tisulară şi regenerarea osoasă 33
12221 Caracteristici ale suporturilor pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă
33
12222 Metode de obținere a suporturilor pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă
34
12223 Suporturi biomimetie pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
pentru regenerarea osoasă
37
13 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice pentru regenerarea osoasă
39
131 Suporturi magnetice cu biopolimeri 41
1311 Suporturi magnetice cu proteine 41
1312 Suporturi magnetice cu polizaharide 45
132 Suporturi magnetice cu polimeri sintetici 46
133 Suporturi magnetice pe bază de biomateriale ceramice 49
1331 Sticle ceramice bioactive 49
1332 Fosafați de calciu 51
14 Concluzii 51
PARTEA EXPERIMENTALĂ
Capitolul 2 Materiale şi metode experimentale 53
21 Strategie experimentală Obiective 53
22 Materiale utilizate 55
221 Materiale utilizate pentru prepararea suporturilor 55
222 Materiale utilizate pentru caracterizarea suporturilor 56
23 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
61
231 Obţinerea particulelor magnetice 61
232 Obținerea suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de
particule magnetice
61
233 Program experimental 62
24 Metode de caracterizare 65
241 Caracterizarea structurală a suporturilor 65
2411 Analiza prin Spectroscopia icircn infraroşu cu transformată Fourier (FTIR) 65
2412 Spectroscopia de raze x prin dispersie de energie (EDS) 65
2413 Difracţie cu raze X (XRD) 66
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor 67
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM) 67
2422 Micro computer-tomografia (microCT) 68
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor 68
244 Propritățile magnetice ale suporturilor 70
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic 71
246 Studii de degradare enzimatică in vitro 72
247 Teste de citotoxicitate in vitro 76
2471 Testul MTT 78
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 79
248 Teste de citotoxicitatea in vivo 80
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
81
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi 82
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază
de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și
fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
83
31 Obţinerea suporturilor 85
32 Rezultate și discuții 86
321 Structura chimică a suporturilor 86
322 Compoziția suporturilor 87
323 Morfologia suporturilor 90
324 Proprietăţi magnetice 91
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 92
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 94
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 96
3271 Testul MTT 96
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 97
33 Concluzii 99
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
100
41 Obținerea suporturilor 100
42 Rezultate și discuții 103
421 Structura chimică a suporturilor 103
422 Morfologia suporturilor 105
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 106
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 108
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat 108
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat 109
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 110
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor 112
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro 113
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor 114
43 Concluzii 117
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
119
51 Obţinerea suporturilor 119
52 Rezultate și discuții 122
521 Structura chimică a suporturilor 122
522 Compoziția suporturilor 123
523 Morfologia suporturilor 124
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor 127
525 Proprietăţilor magnetice ale suporturilor 128
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 129
527 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 130
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat 130
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat 131
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 132
5281 Testul MTT 133
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 133
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor 134
53 Concluzii 139
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
141
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
141
611 Obținerea suporturilor 142
612 Rezultate şi discuţii 143
6121 Structura chimică a suporturilor 143
6122 Morofologia suporturilor 144
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 146
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 146
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor 147
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 148
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
150
621 Obținerea suporturilor 152
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor 152
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină 154
624 Rezultate și discuții 155
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor 156
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
158
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 160
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale 161
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
162
63 Concluzii 164
Concluzii generale 165
1
Introducere
Introducere
Impactul clinic cacirct şi cel economic pentru tratamentul afecţiunilor osoase este uluitor osul
fiind al doilea cel mai transplantat ţesut după transfuziile de sacircnge Numeroase metode de
reconstrucţie a defectelor osoase sunt disponibile icircn practica clinică fiind utilizate autogrefe
alogrefe matrice osoasă demineralizată materiale metalice sau ceramice proteine osoase
morfogenetice factori de creştere și altele Succesul acestor materiale este icircnsă unul limitat
fiecare din ele prezentacircnd dezavantaje considerabile Icircn icircncercarea de a oferi o soluție pentru
rezolvarea problemei menționate tot mai mulți cercetători și-au icircndreptat atenția spre realizarea
de noi materiale pentru ingineria tisulară și regenerarea țesutului osos materiale cu proprietăți și
interacțiuni controlabile Aceste materiale se găsesc sub diverse forme de prezentare suporturi
poroase tridimensionale sisteme injectabile capsule filmemembrane și matrici fibroase și
nano-fibroase hidrogeluri
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă constă icircn rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea
unui material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și
regenerare osoasă ar putea fi un suport compozit poros cu incluziune de particule magnetice
Principalul motiv pentru care se optează pentru un suport compozit este acela că osul natural la
racircndul său este un compozit matricea extracelulară a țesutului osos fiind reprezentată de 60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă
Particulele magnetice care urmează a fi incluse icircn suporturi vor fi funcționalizate cu diferiți
bio-agenți factori de creștere medicamente cu efect chimioterapic icircn vederea unei eliberări
țintite ale principiilor active enumerate Unul din marele dezavantaje ale chimioterapiei efectele
adverse asupra stării generale a pacienților ar putea fi astfel icircnlăturat medicamentele acționacircnd
controlat doar la locul tumori osoase
Obiectivul central al tezei de față vizează obținerea unor astfel de suporturi pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice Cele mai importante
proprietățile impuse unor astfel de suporturi sunt biocompatibilitate lipsa toxicității proprietăți
de suprafață adecvate incluziuni și proliferării celulare osteoconductivitate osteoinductivitate
rata de degradare controlată proprietăți mecanice comparative cu cele ale osului natural etc De
2
Introducere
asemenea foarte important este ca suportul să fie biomimetic icircn vederea integrării adecvate icircn
osul gazdă
Teza de față este structurată icircn două secțiuni principale stadiul actual al cercetărilor icircn
domeniul vizat și rezultate originale
Prima secțiune sintetizează date de literatură și este reprezentată de primul capitol A doua
secțiune este formată din 5 capitole capitolul 2 prezintă materialele și metodele utilizate pentru
obținerea rezultatelor originale prezentate icircn capitolele 3 4 5 și 6
Capitolul 1 prezintă pe scurt date despre anatomia fiziologia și patologia țesutului osos
deoarece fără cunoșterea acestor noțiuni ar fi imposibil de realizat un suport care să permită
regenerarea adecvată a țesutului osos Capitolul cuprinde informații despre materialele deja
utilizate icircn practica clinică pentru regenerarea osoasă și variantele aflate icircn stadiul de cercetare
fiind prezentate pe scurt o parte din cele mai utilizate biomateriale icircn domeniul vizat O atenție
deosebită este acordată suporturilor biomimetice prin prezentarea caracteristicilor acestora
metodelor de obținere a acestora și a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
După un studiu amănunțit a suporturilor magnetice realizate și caracterizate pacircnă icircn prezent icircn
literatura de specialitate s-a realizat o clasificare a acestora icircn funcție de biomaterialele de bază
utilizate icircn sinteza acestora
Capitolul 2 redă inițial strategia experimentală și obiectivele lucrării de față după care sunt
enumerate caracteristicile principale ale materialelor utilizate pentru prepararea suporturilor și a
celor utilizate pentru caracterizarea acestora De asemenea sunt prezentate etapele procesului de
preparare a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule
magnetice precum și metodele de caracterizare a suporturilor obținute Sub capitolul Metode de
caracterizare evidențiază principiile de bază ale tehnicilor folosite condițiile de lucru parametrii
și dispozitivile utilizate
Capitolul 3 a avut drept scop principal realizare și caracterizarea unor suporturi compozite
folosind patru combinații diferite de biopolimeri și trei concentrații diferite de nanoparticule
magnetice Icircn urma analizei structurii chimice a suporturilor a compoziției și morfologiei
acestora a proprietăților magnetice precum și a interacțiunii suporturilor cu fluide de interes
biologic enzime și celule se vor stabili biopolimerii și concentrația de nanoparticule ce vor fi
utilizate icircn capitolele următoare
3
Introducere
Un program experimental s-a utilizat pentru a obține 13 suporturi pe bază de colagen
chitosan acid hialuronic și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată capitolul 4 prezentacircnd prepararea și caracterizarea acestora Pe lacircngă analizele realizate
pentru suporturile din capitolul 3 s-au analizat și proprietățile mecanice ale celor 13 suporturi
precum și citotoxicitate lor in vivo ultimul experiment menționat avacircnd o durată de 21 zile
Același program experimental și aceeași compoziție a suporturilor a fost utilizată și pentru
prepararea suporturilor descrise icircn capitolul 5 diferența fiind dată de faptul că particulele au fost
icircncorporate sub formă de suspensie coloidală Morfologia acestor suporturi a fost studiată icircn
detaliu cu ajutorul tehnicii microCT iar testele de toxicitate in vivo realizate pe aceași specie de
animale utilizate icircn capitolul anterior a avut o durată de mai mare de 64 zile
Capitolul 6 este structurat icircn două părți Prima parte prezintă reproductibilitatea metodei de
preparare a suporturilor iar a doua parte studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircntr-o primă etapă suporturile au fost iradiate cu o doza
unică de raze X administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase fiind analizată apoi
influența radiațiilor asupra proprietăților fizico-chimice și biologice a suporturilor A doua etapă
a studiului a constat icircn icircncărcarea nanoparticulelor incluse icircn suporturi cu doxorubicină
(medicament utilizat icircn practica clinică pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor
osoase) urmată de caracterizarea suporturilor obținute
Lucrarea se icircncheie cu un capitol de concluzii generale și bibliografia cosultată pentru
realizarea acesteia
4
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice pentru regenerarea osoasă
Osul este un țesut conjuctiv specializat dinamic care este suspus unui proces de
remodelare continuă pe parcursul vieții Are rolul atacirct de țesut cacirct și de organ funcțiile sale de
bază fiind de protecție a organelor vitale din cavitatea craniană toracică și a măduvei spinării de
suport a sistemului locomotor Matricea extracelulară a țesutului osos are o componentă organică
și o component anorganică iar celulele țesutului osos sunt osteoblastele osteocitele celulele de
suprafață și osteoclastele Din punct de vedere morfologic osul este fie spongios (trabecular) fie
compact (cortical) Țesutul osos spongios este asociat cu funcțiile metabolice iar țesutul osos
compact este asociat cu rezistența mecanică [1]
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta aceste
defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare Chiar dacă decenii icircntregi autogrefele
au fost utilizate cu precădere dezavantajele acestora au condus la cercetări riguroase pentru
fabricarea unor grefe osoase realizate din biomateriale (polimeri materiale ceramice materiale
metalice) Ingineria tisulară combină cu succes principiile biologiei țesutului osos și principiile
disciplinelor inginerești contribuind la consolidarea pierderilor osoase prin intermediul unor
matrici numite suporturi [2] Icircncorporarea unor sisteme de eliberarea controlată de principii
biologice icircn interiorul suporturilor vor conduce la rezultate remarcabile Nanoparticulele
magnetice funcționalizate pot fi un exemplu de astfel de sisteme
11 Ţesutul osos Structură Fiziologie Patologie
Țesutul osos este un organ foarte important pentru organismul viu Formarea sa este
moderată de mecanisme centrale și locale prin intermediul cărora este remodelat constant icircncă
din viața intrauterină și pe tot parcursul vieții pentru menținerea arhitecturii sale
microstructurale Procesul de remodelare este coordonat de activitățile osteoblastelor și
osteoclastelor care la racircndul lor sunt reglementate de procesele fiziologice de la nivel tisular și
de răspunsul la stimuli biomecanici
5
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
111 Funcțiile țesutului osos
Osul oferă protecție unor organe vitale și joacă de asemenea un rol important icircntr-o serie
de funcții fiziologice hematopoieză menținerea echilibrului acido-bazic funcția de rezervă
minerală funcția de suport a sistemului locomotor
Figura 11 Funcțiile țesutului osos [3]
Canalele medulare ale oaselor lungi găzduiesc celule stem mezenchimale capabile să se
diferențieze icircn precursorii hematopoietici care icircn cele din urmă dau naștere celulelor sanguine
mature
Icircn ceea ce privește menținere echilibrului acido-bazic oasele asigură organismului soluții
tampon carbonat și fosfat icircn timpul acidozei metabolice cronice proces observat icircn acidoza
renală tubulară și acidoza uremică Carbonatul de calciu este cel mai important dintre
componentele acestor soluții tampon asiguracircnd rezervorul de ioni de bicarbonat
6
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Din punct de vedere al rezervei de minerale țesutul osos este rezervorul a aproximativ
85 din fosforul din organism și 99 din calciu din organism
Osul are o rezistență mare la compresiune dar la forțe mari de tracțiune sau tensiune poate
fi fracturat Procentul mare de colagen din matricea organică (90 ) conferă un grad de
elasticitate considerabil țesutului osos dar cu toate acestea osul este un compozit casant [4]
112 Structura ţesutului osos
Țesutul osos este un material compozit format dintr-o matrice extracelulară şi din celule
proprii organizat pe cinci niveluri ierarhice (figura 12) macrostructura osului microstructura
osului sub-microstructura osului nanostructura osului și sub-nanostructura osului [5] [6]
Macrostructura osului este reprezentată de cele două tipuri de țesut osos compact icircntalnit
icircn literatură și sub denumirea de țesut osos cortical și spongios icircntalnit și sub denumirea de țesut
osos trabecular iar microstructura osului (10-500 microm) este reprezentată de componentele celor
două tipuri de țesuturi Țesutul osos cortical are o structură densă fiind format din sistemul
Haversian care la racircndul său este format dintr-un spațiu ce conține vase de sacircnge numit canal
haversian icircnconjurat de lamele osoase ce reprezintă sub-microstructura țesutului osos (1-10
microm) Țesutul osos spongios are o densitate mai mică decacirct a țesutului osos compact și este
format din spații areolare neregulate delimitate de trabecule osoase Spațiile areolare conțin
măduvă hematogenă bogată icircn sacircnge Icircn general țesutul osos compact reprezintă 80 din
sistemul osos dar distribuția celor două tipuri de țesut diferă icircn funcție de regiune
Figura 12 Organizarea structural ierarhică a osului [5]
7
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Nanostructura osului (cacircteva sute de nanometri ndash 1 microm) este reprezentată de fibrele de
colagen și de faza minerală iar sub-nanostructura osului (mai puțin de cacircteva sute de nanometri)
este reprezentată de structura moleculară a componentelor [7] [8]
1121 Matricea extracelulară
Matricea extracelulară este compusă dintr-o componenta organică ce reprezintă 33 din
masa uscată a matricei și o componenta anorganică ce reprezintă 67 din masa uscată a matricei
Componenta organică este formată icircn proporție de 90 din proteine colagenice
predominant colagen de tip I iar restul compoziției reprezintă proteine non-colagenice factori de
creștere și proteine morfogentice osoase Din proteinele non-colagenice regăsite icircn os fac parte
ostocalcina osteopontina fibronectina și sialoproteina osoasă II Osteocalcina cea mai
abundentă proteină non-colagenică din ţesutul osos reprezentacircnd 10-20 din cantitatea totală
are un rol important icircn procesul de mineralizare deoarece se leagă de cristalele de hidroxiapatită
[9] Osteopontina este o glicoproteină fosforilată icircntacirclnită icircn aproape toate ţesuturile
organismului uman piele creier fluidul sanguin cartilaj şi o varietate de tumori Osteonectina
este o glicoproteină bogată icircn cisteină care icircn procesul de mineralizare leagă colagenul de
hidroxiapatită avacircnd rolul unui nucleu de mineralizare reglacircnd formarea şi creşterea cristalelor
de hidroxiapatită [10] De asemenea icircn matricea organică au fost identificați glicozaminoglicanii
nesulfataţi (acid hialuronic) şi sulfataţi (condroitinsulfatul şi keratansulfatul)
Glicozaminoglicanii sulfataţi sunt legaţi covalent de molecule proteice formacircnd proteoglicani icircn
țesutul osos cei mai de icircntacirclniți fiind proteoglicani bogați icircn leucină cu masă moleculară mică
Componenta anorganică este reprezentată icircn cea mai mare parte din ioni de fosfat și ioni
de calciu Pe lacircngă acești ioni se găsesc icircntr-o cantitate considerabilă și bicarbonat sodiu
potasiu citrat magneziu carbonat fluor zinc bariu și stronțiu Ionii de calciu și fosfat formează
cristale de hidroxiapatită care se depun pe matricea colagenică proces icircn urma cărui rezultă
proprietățile de rezistență și rigiditate a țesutului osos [10] [11]
Matricea extracelulară osoasă constituie un cadru complex și organizat care oferă suport
mecanic și exercită un rol esențial homeostaza osoasă Matricea osoasă poate elibera mai multe
molecule care influențează activitatea celulelor osoase și prin urmare influențează procesul
complex de remodelarea osoasă Studiile icircn domeniu au indicat că doar pierderea masei osoase
8
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
este insuficientă pentru a provoca fracturi osoase alți factori inclusiv modificări ale proteinelor
matricei osoase au o contribuție colosală icircn producerea fracturilor osoase [12] [13]
1122 Celulele țesutului osos
Țesutul osos are icircn componență patru tipuri de celule osteoblaste osteoclaste osteocite și
celule de suprafaţă (figura 13)
Figura 13 Celulele țesutului osos
Osteoblastele celule localizate pe suprafața osului sunt derivate din celule stem
mezenchimale reprezentacircnd 4-6 din totalul de celule osoase Se găsesc icircn țesuturile tinere dar
apar și icircn condiții patologice Din punct de vedere morfologic sunt celule cu formă cubică de
dimensiuni mari (15-20 microm) ce prezintă caracteristici specifice celulelor implicate icircn sinteza
proteinelor reticulul endoplasmatic rugos și complexul Golgi ambele bine dezvoltate precum și
numeroase vezicule de secreție ce conțin precursori de matrice osoasă incluziuni lipidice și
mucopolizaharide Osteoblastele au un rol foarte important icircn procesul de formare al osului
Sinteza matricei osoase are loc icircn două etape depunerea matricei organice urmată de
mineralizarea acesteia Icircn etapa de depunere a matricei organice osteoblastele secretă proteine
colagenice non-colagenice și proteoglicani iar etapa a doua cea de mineralizarea a matricii
organice are o faza veziculară și o fază fibrilară [11]
Osteocitele sunt cele mai abundente celule osoase reprezentacircnd aproximativ 95 din
totalul acestora Sunt osteoblaste mature care ocupă spațiul lacunar fiind icircnconjurate de matrice
osoasă Ca și particularitate structurală osteocitele au prelungiri citoplasmatice asemănătoare
dendritelor neuronilor care formează o rețea de comunicare icircntre ele și suprafața osoasă Durata
9
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de viață a osteocitelor a fost estimată de Frost și colaboratorii [14] la 25 de ani dar acest lucru
nu poate fi apreciat cu exactitate deoarece procesul de remodelare osoasă presupune o reicircnnoire
a țesutului osos cu 4-10 pe an Icircn orice caz durata de viață a osteocitelor este cu mult mai
mare decacirct a osteoblastelor care au un ciclu de viață de aproximativ 3 luni Totodată nici rolul
osteocitelor nu este icircnțeles pe deplin numeroase studii concentracircndu-se pe asta [15]
Osteoclastele denumite și macrofagele ţesutului osos sunt celule multinucleate
diferențiate din celule stem hematopoetice sub influența a numeroși factori cum ar fi factorul de
stimulare a coloniilor de macrofage (M-CSF) și factorul de legătură nucleic kappa-B (RANKL)
M-CSF este secretat de celulele mezenchimale osteoprogenitoare și de osteoblaste iar RANKL
este secretat de osteoblaste osteocite și celule stromale Acești factori susțin activarea
transcripției expresiei genice icircn osteoclaste Osteoclastele conţin următoarele enzime fosfatază
acidă protează enzime oxidoreducătare ale glicolizei datorită cărora au o activitate enzimatică
intensă şi fagocitară Resorbţia osului nemineralizat (osteoidul) nu este realizată de osteoclaste
ci de elemente macrofagice histiocitare Osteoclastele intra icircn stare de repaus cacircnd formarea
osului definitiv este terminată Celulele redevin active icircn caz de fractura cacircnd are loc formarea
calusului [11] [8]
Celulele de suprafaţă sau bordantă sunt celule ce acoperă suprafeţele osoase icircn locurile
unde nu are loc nici resorbția nici formarea osoasă doua etape importante ale procesului de
remodelare osoasă Din punct de vedere structural sunt celule cu nucleu turtit o citoplasmă care
se extinde pe suprafața osoasă și doar cacircteva organite citoplasmatice cum ar fi aparatul Golgi
sau reticulul endoplasmatic rugos Funcțiile acestor tipuri de celule nu sunt pe deplin icircnțelese dar
studiile icircn domeniu susțin ideea că aceste celule au un rol important icircn prevenirea interacțiunii
directe dintre osteoblaste și matricea osoasă și totodată participă la procesul de diferențiere a
osteoclastelor
113 Fiziologia ţesutului osos
Pe parcursul icircntregii vieţii osul este supus proceselor biologice complexe procese de
creştere icircn lungime şi grosime modelare şi remodelare La racircndul lor la baza acestora stau
procesul de osteogenză ce constă icircn producerea de țesusut osos și osteoliză ce constă icircn
distrucția de țesut osos [8]
10
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1131 Osteogeneza și osteoliza
Osteogeneza este procesul de formare a osului osteoblastele fiind elementele esențiale icircn
acest proces Funcţionalitate osteoblastelor este controlată de molecule semnal hormoni factori
de creştere şi citokine [10] Pe scurt osteogeneza are trei pași de bază sinteza matricei
extracelulare organice (osteoid) mineralizarea matricei ce conduce la formarea osului și
remodelarea osului prin procesele de resorbție și reformar [16] Prin acţiunea concentrată a
moleculelor semnal osteoblastele produc icircntr-o primă etapă toate componentele matricei
organice a ţesutului osos ce va fi eliberată pe icircntreaga suprafaţă sub forma de osteoid
nemineralizat Pe seama precursorilor preluaţi din mediul extracelular se realizează după
modelul sintezei proteice sinteza matricei organice Concomitent cu producerea de matrice
organică are loc procesul de mineralizare a acestei ce reprezintă legarea substanţei anorganice de
matricea proteică o legatură particulară icircntre sărurile minerale şi proteină fiind realizată icircn urma
acestui proces La procesul mineralizării contribuie numeroşi factori locali şi generali un rol
cheie fiind jucat de factorii inhibitori naturali ioni de magneziu citrați pirofosfați și nucleotide
Icircn țesuturile conjuctive nemineralizate factorii anterior enumerați au o concentrație superioară
comparativ cu țesuturile conjuctive mineralizate Icircn cazul țesutului osos fosfataza alcalină
secretată de osteoblaste distruge parțial acești factori făcacircnd posibil procesul de mineralizare
Procesul de osteoliză ce corespunde distrucției osoase este atribuit osteoclastelor Procesul
icircncepe cu demineralizarea matricei osoase urmată de hidroliza enzimatică a componentelor
organice formacircndu-se zone de eroziune osoasă Pentru realizarea resorbţiei osteoclastul trebuie
să adere la o suprafaţă osoasă şi să formeze compartimentul subosteoclastic Icircnsă suprafeţele
osoase au o peliculă fină de matricea extracelulară nemineralizată acoperită de un strat de
osteoblaste icircntre care se stabilesc joncţiuni distanţate icircngreunacircnd fixarea osteoclastelor pe
suprafeţe osoase Osteoblastele au receptori pentru parathormon și 125-dihidroxicolecalciferol
prin stimularea cărora are loc restricția osteoblastelor urmată de eliberarea suprafeței osoase Prin
cuplarea substanțelor stimulante cu receptori specifici se declanșează sinteza de activator al
plasminogenului și sinteza de colagenază latentă urmate de activarea colagenazei latente de
către plasmină Activarea colagenazei va avea drept consecință icircndepărtarea peliculei de matrice
nemineralizată continuacircnd cu atașarea osteoclastelor [8]
11
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1132 Creşterea osului
Creşterea osului icircntacirclnită și sub denumirea de organogeneză osoasă este etapa care
urmează procesului de osteogeneză normală avacircnd drept rezultat formarea osului și a
articulaţiilor Mai precis constă icircn formarea şi creşterea oaselor icircn lungime icircn grosime şi
asigurarea formei epifizelor Pentru fiecare element osos există un punct de osificare specific icircn
care icircncepe formarea osoasă la o anumită vacircrstă [17] Se poate vorbi de două tipuri de osificare
osificarea endoconjunctivă sau intramembranară și osificarea endocondrală
Osificarea intramembranară este caracterizată de invazia capilarelor icircn zona mezenchimală
și de diferențierea celulelor mezenchimale icircn osteoblaste mature care vor depozita matrice
osoasă conducacircnd la formarea de corpusculi osoși Acești corpusculi vor crește și se vor
dezovolta iar apoi vor fuziona cu alți corpusculi și vor forma trabecule ososase Pe măsură ce
trabeculele osoase cresc icircn dimensiune și icircn număr devin interconectate formacircnd o formă de țesut
osos Această formă de țesut osos este o structură fără rezistență dezorganizată și are un număr
mare de osteocite Osificarea intramembranară are loc icircn timpul dezvoltării embrionare și este
implicată icircn formarea oaselor plate din structura cutiei craniene unele oase faciale o parte din
mandibulă și claviculă și adăugarea de țesut osos nou la diafiza majorității oaselor
Osificarea endocondrală utilizează proprietățile funcționale ale cartilajului și osului pentru
a asigura un mecanism de formare și creștere a scheletului Combinarea condrogenezei și a
osteogenezei icircn vederea osificării osoase este dependent de nivelul de vascularizare a cartilajului
de creștere Icircn figura 14 sunt prezentate la general etapele procesului de osificare endocondrală
[18] Osificarea endocondrală are 6 etape Celule mezenchimale se vor concentra (A) și se vor
diferenția icircn condrocite formacircnd un cartilaj nevascularizat (B) Icircn centrul cartilajului format
condrocitele se vor opri din proliferare și vor deveni hipertrofice (C) Condrocitele din
vecinătatea celor hipertrofice se vor diferenția icircn osteoblaste acestea din urmă formacircnd un colier
osos (D) Icircn continuare condrocitele hipertrofice vor regla formarea de matrice mineralizată Icircn
același timp icircn această etapă are loc eliberarea de factori angiogenetici care vor atrage vase de
sacircnge după care condrocitele hipertrofice vor intra icircn apoptoză (E) Coordonarea osteoblastelor
și invazia vaselor de sacircnge vor avea drept rezultat formarea țesutului spongios primar
Condrocitele se vor prolifera icircn continuare și icircn același timp va avea loc vascularizarea osului
aceste două etape contribuind la creșterea icircn lungime a osului Osteoblastele din colierul osos vor
12
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
contribui la formarea osului cortical pe cacircnd cele din țesutul spongios primar vor contribui la
formarea țesutului spongios final (F)
Figura 14 Osificarea endocondrală [18]
1133 Remodelarea osului
Osul este un organ activ remodelat pe tot parcursul vieții Procesul de remodelare osoasă
cuprinde patru faze distincte ce se desfăşoară permanent icircn anumite locuri faza de repaus faza
de resorbţie osoasă faza de inversie şi faza de formare reprezentate schematic icircn figura 15 Icircn
faza de repaus suprafaţa ţesutului osos este acoperită de celule de suprafaţă ancorate icircn matricea
mineralizată Icircn faza de resorbţie osoasă rolul principal revine osteoclastelor care vor forma o
cavitate numită lacună de resorbţie (lacuna Howship) Resorbţia are loc icircn două etape
demineralizarea fazei osoase și distrugerea fazei osoase Icircn faza de inversie are loc apariția
osteoblastelor icircn zona erodată ce vor acoperi lacuna de resorbţie printr-o depozitare activă de os
nemineralizat osteoid Osteoidul se depune pacircnă cănd grosimea acestuia ajunge la 20 microm
urmacircnd faza de mineralizare Pe măsură ce osteoidul este mineralizat locul unde a avut loc
remodelarea va fi icircnlocuit cu un os nou [19]
13
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 15 Remodelarea ţesutului osos
114 Patologia osoasă
Patologia osoasă poate fi de cauza traumatică ndash fractură sau netraumatică Icircn funcţie de
cauza fracturii putem vorbi de fracturi determinate de un accident traumtic fracturi de oboseală
şi fracturi de os patologic Cauzele netraumatice care pot cauza o anumită patolgie osoasă sunt
infecţiile osului tumorile osului și deformaţiile osului [17]
1141 Tumori osoase
Icircn literatura de specialitate tumorile sunt icircntalnite și sub denumirea de neoplasme și se
definesc ca proliferări tisulare anormale autonome persistente neconcordante cu ţesuturile din
jur care se dezvoltă continuu chiar și după icircncetarea stimului care a determinat proliferarea și nu
răspund la mecanisme normale de control ce guvernează creştere Icircn funcție de caracteristicile
morfo-funcționale și de evoluția acestora tumorile se clasifică icircn tumori begine şi tumori
maligne Cele benigne sunt caracterizate prin margini bine definite au o creştere lentă şi locală
sunt neinvazive şi compresive circumscrise şi icircncapsulate prezintă mitoze rare nu diseminează
icircn alte ţesuturi şi organe (non-metastazante) avacircnd un prognostic bun Tumorile maligne sunt
14
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
caracterizate prin margini nedefinite au o creştere rapidă fiind infiltrative şi icircncapsulante
invazive şi distructive sunt metastazante şi au un prognostic rezervat
Metastazarea reprezintă răspacircndirea celulelor maligne din tumora primară icircn organele
ţesuturile sau cavităţile organismului Comună majorităţii cancerelor umane metastazarea
transformă o tumoră de organ icircntr-o boală sistemică Este un proces complex multistadial şi
dinamic avacircnd la bază o serie de procese subtile interconectate ce rezultă din interacţiunile
gazdei cu tumora Fiecare etapă metastatică este subiectul unor influenţe multiple indispensabile
celulei maligne pentru a supravieţui variaţiilor de mediu (prin dobandirea de noi mutaţii) ce icirci
permit acesteia să invadeze ţesuturile vecine să patrundă icircn sistemul circulator (calea majoră de
răspacircndire prin vasele de sacircnge şisau limfatice) să extravazeze icircn ţesuturi noi să dezvolte un
sistem vascular propriu care să icircicirc suţină dezvoltarea şi chiar uneori să permită metastazei să dea
naştere la noi metastaze [20] [21]
Figura 16 Clasificarea tumorilor osoase
15
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Domeniul de patologie osteoarticulară icircn care se icircncadrează şi tumorile osoase este un
domeniu foarte vast şi delicat nu este constant fiind adesea descoperite noi metode de
diagnostic şi tratament ce ameliorează sau chiar schimbă radical prognosticul multor tumori
osoase Una din principalele probleme icircn ceea ce priveşte diagnosticul şi tratamentul tumorilor
osoase este aceea că nu există o separare netă icircntre tumora benignă şi tumora malignă
Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) propune o clasificare a tumorilor osoase bazată pe
capacitatea de diferenţiere a acestora ceea ce icircnseamnă că sunt grupate din punct de vedere
histologic şi citologic al ţesutului pe care acestea icircl reproduce clasificare redată icircn figura 16
[22]
Metastazele sunt cele mai icircntalnite tumori din os Acestea sunt considerate tumori
secundare osoase deoarece tumora primară nu icircşi are originea icircn os tipurile de cancer care dau
cel mai frecvent metastaze osoase fiind cancerul de prostată cancerul de sacircn şi cancerul
pulmonar Tumorile osoase primare cum sunt osteosarcoamele sau condrosarcoamele sunt
destul de rare statisticile sugeracircnd că doar icircn 1 din 20 cazuri de tumori osoase este vorbă de o
tumoră primară Cea mai frecvent intalnită tumoră osoasă primară este mielomul cu celule
plasmatice ce apare la pacienţi cu vacircrstă peste 40 ani urmată de diverse sarcoame Dintre
sarcoamele osoase primare ce reprezintă 02 din toate neoplasmele cele mai comune sunt
osteosarcoamele ndash 35 condrosarcoamele ndash 25 sarcomul Ewing ndash 16 condroamele ndash 8 şi
histiocitoamele maligne fibroase ndash 5
Incidenţa tumorilor primare benigne este mai dificil de determinat deoarece nu se
realizează biopsie pentru toate leziunile nou descoperite Atacircta timp cacirct leziunile pot fi complet
caracterizate ca şi bengine pe baza datelor clinice şi imagistice biopsia sau rezecţia sunt
nepotrivite şi neadecvate Cele mai comune tumori osoase benigne sunt următoarele
osteocondroamele ndash 35 encondroamele ndash 20 tumorile cu celule gigante ndash 15 osteomul
osteoid ndash 10 şi displazia fibroasă (maladia Jaffeacute) ndash 5 Icircn ciuda caracterului benign al
tumorilor tratamentul acestora trebuie să fie cacirct mai eficient posibil De exemplu o tumoră cu
celule gigante extinsă icircn suprafaţa articulară tibială poate duce la o fractura patologică dacă nu
este tratată adecvat
Tratamentul fiecărei tumori osoase depinde de mai mulţi factori caracterul benign sau
malign localizarea leziunii istoricul afecţiunii nivelul durerii Icircn cazul tumorilor benigne
icircndepărtarea leziunea urmată de grefarea sau biopsia excizională conduc icircn general la rezultate
16
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
bune Totuşi aceste două metode de tratament pot fi inadecvate icircn cazul tumorilor maligne atacircta
timp cacirct celule tumorale reziduale rămacircn la marginea leziunii Limfoamele osoase pot fi tratate
cu chimioterapie sau radioterapie fără a fi necesară o intrevenţie chirurgicală Alte tumori cum
ar fi de exemplu osteosarcoamele convenţionale sunt supuse icircntr-o primă etapă chimioterapiei
sau radioterapiei cu scopul de a micşora masa tumorală următoarea etapă fiind rezecţia
chirugicală Condrosarcoamele sunt tratate doar chirurgical chimioterapia dovedindu-se
ineficientă Multe procese maligne sau procese benigne agresive pot fi tratate prin rezecţie
chirurgicală atacirct a tumorii cacirct şi a unei margini de ţesut normal sau icircn cele mai grave cazuri prin
icircndepărtarea totală a osului muşchiului sau altor ţesuturi afectate de tumoră [23]
12 Metode de tratament a defectelor osoase
Spre deosebire de alte ţesuturi osul are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn
cazul unor afecţiuni minore fără formare de cicatrici Icircn schimb icircn cazul fracturilor patologice
sau a celor grave precum şi icircn pierderi mari de ţesut osos ce pot conduce la defecte osoase
grave procesele de regenerare şi reparare proprii vor avea nevoie de support [24] Principalii
factori ce conduc la defecte osoase grave sunt rezecţia de tumoră osoasă malformaţiile
congenitale unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita După sacircnge osul
este al doilea cel mai transplantat organ anual fiind efectuate la nivel mondial aproximativ 22
milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă [25] Materiale de substituţie osoasă
pot fi clasificate icircn mai multe categorii după cum urmează grefe de origine naturală (autogrefe
alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria tisulară
precum şi diverse combinaţii ale acestora [26]
121 Metode actuale de tratament a defectelor osoase
1211 Grefe osoase biologice
Icircn funcție de originea lor grefele biologice se clasifică icircn xenogrefe alogrefe și autogrefe
[27] Xenogrefe prelevate de la o specie diferită de a primitorului au fost utilizate o scurtă
perioada de timp deoarece după cacircteva decenii de studii icircndelungate s-au dovedit a fi cele mai
puţin adecvate grefe [28] Alogrefele sunt utilizate pentru reconstrucţia unor defecte osoase
grave Astfel alogrefele se utilizează icircn timpul intervenţiilor de revizie a artoplastiilor totale
17
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
pentru reconstrucţia pierderilor osoase Alogrefele sunt prelevate fie de la pacienţi vii fie de la
cadavre Icircn cazul icircn care donatorii sunt pacienţi vii o sursă foarte utilizată este capul femural
alogrefele fiind preluate icircn acest caz icircn timpul intervenţiilor primare de artoplastie totală de şold
Icircn cazul icircn care alogrefele sunt preluate de la cadavre oasele lungi şi pelvisul sunt sursele cele
mai utilizate [29] Icircn tabelul 11 sunt prezentate principalele avantaje și dezavantaje ale celor trei
tipuri de grefe osoase biologice
Tabel 11 Principalele avantaje și dezavantaje ale autogrefelor alogrefelor și xenogrefelor [24]
Grefă
osoasă
biologică
Avantaje Dezavantaje
Autogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
osteoconductivitate și osteogenice
histocompatibilie
nu există risc de imunogenicitate
sau transmitere de boli infecțioase
durere la locul prelevării și
moartea patului donator
sursă limitată de
disponibilitate și cantitate
timpi chirurgicali mai mari
ce implică pierderi de sacircnge
posibile infecții
Alogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
și osteoconductivitate
nu apare problema morbidității
patului donator
ușor de manevrat
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
osteoinductivitate variabilă
pierderea proprietăților
biologice și mecanice
respinse icircn anumite regiuni
geografice datorită unor aspecte
religioase
cost crescut
Xenogrefe
proprietăți osteoinductive și
osteoconductive
cost scăzut
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
risc imunogenic crescut
rezultate slabe
Un tip specializat de alogrefe este reprezentat de matricea osoasă demineralizată (DBM)
DBM se obține prin extracția acidă a alogrefelor și conține colagen de tip I proteine
18
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
noncolagenice și un număr variabil de factori de creștere osteoconductivi (de exemplu proteine
morfogenetice osoase - BMP) Concentrația de DBM este direct proporțională cu
osteoinductivitatea DBM se poate folosi fie singură fie icircn combinație cu alte alogrefe sau cu
grefe sintetice [27]
Autogrefele sunt utilizate pentru refacerea defectelor osoase primitorul și donatorul fiind
aceași persoană Sunt utilizate icircntr-un număr mare de intervenţii chirurgicale ortopedice
stomatologice şi maxilo-faciale cu scopul de a spori şi grăbi regenerarea osoasă sau de a restaura
defectele osoase Creasta iliacă este locul de unde se prelevă cel mai frecvent autogrefe datorită
accesului uşor şi a unei bune calităţi De asemenea autogrefele se mai pot preleva din tibia
proximală femurul distal coaste radiusul distal Şi canalul intramedular al oaselor lungi poate
reprezenta o potenţilă sursă de autogrefe precum şi o sursă bogată de celule şi factori de creştere
[30] [31]
1212 Grefe osoase și substituienți sintetici
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din biomateriale
sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea celulelor osoase icircn timpul
procesului de regenerarea osoasă [26] O gamă variată de materiale sintetice sunt utilizate ca și
substituenți osoși metale cum sunt tantalul titanul fierul sau magneziul polimeri sintetici cum
sunt poli acidul lactic poli acidul glicolic poliuretani sau poli ε-caprolactona și ceramice sum
sunt sticlele bioactive fosfații de calciu sau sulfați de calciu hidratați Icircn timp dintre toate aceste
materiale cele mai potrivite s-au dovedit a fi cele pe bază de fosfați de calciu datorită asemănării
cu compoziția osului natural (ce conține mai mult de 60 fosfați de calciu)
Substituenți sintetice sunt disponibili fie sub formă de granule (majoritatea au un diametru
cuprins icircntre 01 și 5 mm) fie sub formă suporturi cu porozitate variabilă icircn funcție de diverse
aspecte ce țin de locul unde vor fi implantate perioada necesară refaceriiregenerării complete
etc De asemenea icircn practica curentă se folosesc și substituienți injectabili denumiți adesea
cementuri un mare avantaj ala acestora fiind tehnica de implantare minim invazivă
Resorbabilitatea este o caracteristică esențială a substituienților osoși fiind intens studiată
Icircn tabelul 12 sunt prezentate principalele clase de substiutuenți osoși utilizați icircn prezent precum
și mecanismele de resorbție ale acestora
19
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Tabel 12 Principale tipuri de substituenți osoși și mecanismul de resorbție al acestora [32]
Clasa de
Material Tipul de material Mecanismul de resorbție
Materiale
Ceramice
Bioglas Resorbţie limitată
Sulfat de calciu hemihidrat (CSH)
Gips
Sulfat de calciu dehidrat (CSD)
Solubilizare
Solubilizare şisau conversie icircn
apatită
Fosfat dicalcic (DCP)
Fosfat octocalcic (OCP)
β-Fosfat tricalcic (β-TCP)
Fosfat de calciu bifazic (BCP)
Cristale de hidroxiapatită
precipitate
β-Pirofosfat de caciu (β-CPP)
Mediat cellular
Hidroxiapatită sinterizată Nu se resoarbe
Materiale
Metalice
Magneziu (aliaj) Coroziune
Fier (aliaj) Coroziune
Tantal titan Nu se resoarbe
Polimeri
Poli acid lactic poli acid glicolic
Poli ε-caprolactona Hidroliză
Celuloză
Hialuronan
Fibrină
Colagen
Chitosan
Transport la ganglioni limfatici
Hialuronidază
Plasmină
Colagenază
Lizozim
Icircn mod ideal un substituent osos ar trebui să fie icircnlocuit icircn timp de țesust osos nativ fără
pierderea suportului mecanic oferit de acesta Icircn unele cazuri defectele osoase sunt stabilizate
utilizacircnd fixarea metalică neresorbabilă defectul osos propriu-zis fiind completat cu un
substituent osos Rata de resorbție a substituienților osoși poate fi controlată prin optimizarea
geometriei materialului Prezența unei rețele cu pori interconectați sau a unor canale icircn structura
sa este o caracteristică cheie a unui substituent osos regăsindu-se inclusiv la cementurile
20
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
injectabile Icircn cazul substituenților pe bază de polimeri rata de resorbție poate fi controlată prin
unele modificări chimice [32]
122 Ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Dezavantajele substituenților osoși sintetici au condus la necesitatea unei metode
alternative şi efective avacircnd drept scop principal regenerarea osoasă S-au evidenţiat
următoarele alternative a substituenţilor osoşi utilizarea factorilor de creştere osteogenici (cum
ar fi proteienele morfogenetice osoase ndash BMPs) suporturi osteoinductive terapia genică
utilizarea celulelor stem toate acestea reprezentacircnd componentele inginerie tisulare (figura 17)
Figura 17 Triada ingineriei tisulare și aplicarea produsului rezultat icircn procesul de
regenerarea al țesutului osos afectat de tumoriinfecții
Componentele ingineriei tisulare o matrice sau un suport celule și molecule semnal au
fost stabilite plecacircnd de la structura țesuturilor biologice [33]
Matricea sau suportul este componenta cheie a ingineriei tisulare Acționează iniţial ca un
suport temporar pentru adeziunea și creșterea celulară apoi are rol definitoriu pentru sinteza de
matrice extracelulară iar icircn ultimă etapă contribuie la formarea de neo-țesut [34]
21
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau regenerarea
ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor artificiale și a suporturilor
Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase sisteme injectabile capsule
filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri etc [35]
1221 Biomateriale utilizate la realizarea de suporturi pentru regenerarea osoasă
La realizarea suporturilor pentru regenerarea osoasă sunt utilizate mai multe tipuri de
biomateriale biopolimeri polimeri sintetici și biomateriale ceramice
Polimeri atacirct de origine naturală cacirct și sintetică sunt utilizați pentru o varietate de aplicații
biomedicale Din clasa polimerilor naturali sau bioplomeri fac parte polizaharidele proteine și
poliesteri proveniți atacirct din regnul vegetal cacirct și din regnul animal Biopolimeri sunt utilizați
icircntr-o multitudine de domenii industria alimentară industria farmaceutică (foarte des ca și
excipienți) la realizare unor proteze icircn sisteme de eliberare controlată de medicamente etc
Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul biologic fiind dirijați spre degradarea metabolică
Datorită similarității dintre polimerii naturali și matricea extracelulară (ECM) aceste materiale
nu vor provoca o reacție imunologică cronică sau toxică reacții deseori icircntalnite icircn cazul
utilizării polimerilor sintetici [36]
12211 Biopolimeri
Printre cei mai utilizați biopolimeri se numără colagenulgelatina acidul hialuronic
chitosanulchitină albumina serică bovină fibroina din mătase [37]
Colagenul
Colagenul ndash Col proteina cea mai abundentă din organismul uman se remarcă ca
biopolimer printr-o serie de proprietăţi precum biocompatibilitatea excelentă
biodegradabilitatea rezistenţa mecanică ridicată toxicitatea scăzută reacţii imunologice slabe
fiind unul din cele mai utilizate biomateriale icircntr-o varietate de aplicaţii medicale
Din punct de vedere al structurii chimice colagenul are structură de triplu helix
macromolecula de colagen fiind formată din trei lanţuri α răsucite icircmpreună de la stacircnga la
dreapta icircn jurul unui ax comun [38] Există mai multe tipuri de colagen fiecare tip avacircnd
22
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
particularității proprii de structură precum și localizare icircn organe specific icircn organism Nu se ştie
cu exactitate cacircte tipuri de colagen există Cel mai intalnit colagen icircn racircndul vertebratelor este
colagenul de tip I de aceea este și cel mai utilizat și studiat icircn diverse domenii
Figura 18 Structura colagenului
Poate fi prelucrat sub o mare varietate de forme filme fibre structuri poroase
nanoparticule şi microparticule atacirct singur cacirct şi icircn combinaţie cu alte materiale Deoarece
structura sa chimică permite combinarea colagenului cu factori de creştere sau alţi agenţi
bioactivi una din cele mai importante aplicaţii ale colagenului este utilizarea lui icircn sisteme de
eliberarea controlată de medicamente membrane de colagen pentru aplicaţii oftalmice structuri
poroase pentru răni şi arsuri diferite geluri etc Remarcabilă este și utilizarea colagenului icircn
ingineria tisulară pentru realizarea unor substituenţi pentru piele a unor substituenţi osoşi sau a
unor valve artificiale [39]
Icircn domeniul ingineriei repararării şi regenerării ţesutului osos colagenul a fost unul dintre
primele biomateriale studiate fiind totodată şi unul din cele mai utilizate materiale de cele mai
multe ori utilizat icircn combinaţie cu alţi biopolimeri şi fosfaţi de calciu sub diverse forme de
prezentare hidrogeluri injectabile membranefilme suporturi poroase microsfere nanosfere
Un hidrogel pe bază de colagen reprezintă un candidat excelent pentru icircncapsularea de celule
datorită capacității sale de umflare icircn apă proprietăților fizice adecvate (de exemplu proprietăți
mecanice capacitatea de gelifiere) conținutului ridicat de apă ce facilitează transportul și
difuzia proprietăților biologice excelente și sensibilitații la degradarea enzimatică [40] De
23
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
exemplu hidrogeluri conținacircnd diferite rapoarte masice chitosancolagenul au fost fabricate icircn
următoarele condiții de sinteză gelifiere inițiată de utilizarea β-glicerofosfat utilizarea unui
mediu osteogenic suplimentar și a unei baze slabe și temperatură variată Prezența colagenului icircn
hidrogel a fost asociată cu creșterea proliferării celulare hidrogelul a fost mai compact rezultacircnd
o matrice rezistentă [41]
Membrane resorbabile pe bază de colagen au fost utilizate icircn ingineria tisulară și
regenerarea osoasă ghidată deoarece de-a lungul timpului numeroase studii au arătat că acestea
sunt biocompatibile și sporesc rata de regenerare Acestea sunt fabricate prin tehnici diverse
fiind adesea utilizate alături de polimeri sintetici de exemplu poli (tetrafluoroetilienă)
Variantele comerciale cele mai icircntalnite de membrane pe bază de colagen utilizate icircn practica
clinică sunt Bio-Gidereg (GeistlichPharma AG Wolhusen Elveția) DuraMatrix-Onlaytrade ndash
membrană pe bază de colagen pentru repararea țesutului dura mater (Collagen Matrix Inc NJ
SUA) TenoMendtrade (Collagen Matrix Inc) OssiPatchtrade ndash membrană protectoare pe bază de
colagen pentru regenerarea osoasă (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) și Collatenetrade
Fibrillar Collagen ndash pansament utilizat pentru afecțiuni maxilo-faciale (Ace Surgical Supply Co
Inc MA SUA)
Suporturile poroase pe bază de colagen au icircn componența lor și particule ceramice icircn acest
fel icircncercacircndu-se o imitare a structurii osului natural Din variantele comerciale cele mai des
utilizate se pot aminti Collagrafttrade (Collagen Corp SUA) ndash care combină hidroxiapatită fosfa
tricalcic cu măducă osoasă de la pacinet și colagen de origine bovină OssiMendtrade Bone Graft
Matrix (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) ndash combină minerale osoase sub formă poroasă
cu colagen și INFUSEreg Bone Graft (Medtronic Sofamor Danek Inc USA) ndash care pe langă un
suport poros pe bază de colagen conțin protein morfogenetice umane recombinate (rhBMP-2)
[40]
Gelatina
Gelatina este un derivat denaturat al colagenului Polielectrolit amfoteric gelatina este un
amestec de fragmente de proteine solubile icircn apă avacircnd aceleaşi secvenţe de aminoacizi ca şi
colagenul structura sa chimică fiind redată icircn figura 19 Colagenul diferă de gelatină prin aceea
că are mai multe structuri terţiare fiind mai puţin solubil icircn soluţii apoase decacirct gelatin [42]
Gelatina poate fi fabricată din diverse surse sursa de provenienţă a gelatinei influențacircnd
24
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţile acesteia Cel mai adesea se fabrică din piele porcină (46) piele bovină (294)
sau oase de origine porcină sau bovină (231) [43] Gelatina este un polimer biodegradabil
biocompatibil non-antigenic are cost scăzut susţine adeziunea celulară migrarea diferenţierea
şi proliferarea celulară Un dezavantaj al acestei proteine este acela că are proprietăţi mecanice
slabe De aceea pentru a fi utilizat la realizarea unor matrici suport pentru ingineria tisulară icircn
special a ţesuturilor dure gelatina se utilizează icircmpreună cu alţi polimeri de exemplu chitosan
unele ceramic (hidroxiapatită fosfat tricalcic) etc [44] [45]
Figura 19 Structura chimică a gelatinei
Albumina serică bovină
Albuminile serice sunt cele mai abundente proteine din sistemul circulator pentru o mare
varietate de organism fiind principalele molecule complexe care contribuie la presiunea arterială
osmotică Datorită potențialului său antioxidant albumina are un rol esențial icircn prepararea
mediilor pentru culturi de celule de mamifere atacirct icircn domeniul cercetării cacirct și icircn domenii
comerciale [46]
Icircn domeniul ingineriei tisulare și domeniul medicinei regenerative albumina serică bovină
ndash BSA este una dintre cele mai studiate proteine din punct de vedere al interacțiunii cu
polizaharidele datorită stabilității sale semnificative a faptului că este ușor accesibilă are o
solubilitate bună icircn apă și datorită asemănării structurale și funcționale cu albumina serică umană
[47]
Icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos albumina serică bovină este utilizată icircn
sisteme complexe pe bază de materiale ceramice Un studiu care evidențiază influența utilizării
albuminei alături de materiale ceramice a fost publicat de Chew și colaboratorii care au
25
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
demonstrat că adăugarea unei concentraţii scăzute de albumină serică bovină este utilă deoarece
susţine creşterea cristalelor de fosfaţi de calciu fiind astfel utilă procesului de mineralizare a
ţesutului osos Icircn comparaţie o concentraţie mare de albumină inhibă cristalizarea fosfaţilor de
calciu [48] Această proprietate a albuminei serice bovine precum și cele menționate anterior a
făcut ca aceasta să fie utilizată de unii autori la sinteza de cimenturi pe bază de fosfaţi de calciu
[49] [50]
De asemnea această proteină a fost utilizată ca adjuvant icircn studii vizacircnd regenerarea
osoasă cu ajutorul unor microsfere hibride alături de poliacrilatalginat de calciu [51]
Fibroină din mătase
Fibroina din mătase produsă de viermi de mătase Bombyx mori este o proteină naturală
cu o foarte bună biocompatibilitate non-toxică biodegradabilă De asemenea prezintă
proprietăţi intrinseci remarcabile şi o bună rezistenţă mecanică Datorită proprietăţilor
menţionate icircn ultimii ani a avut loc o creştere a interesului pentru utilizarea fibroinei din mătase
la obţinerea de suporturi poroase tridimensionale Studii recente au dovedit capacitatea unor
suporturi tridimensionale pe bază de fibroină de a susţine proliferarea celulară icircn aplicaţii vizacircnd
ingineria tisulară a osului a cartilajului şi a vaselor de sacircnge [52]
Figura 110 Structura chimică a fibroinei din mătase
Chitosan
Chitosanul ndash Cs descoperit icircntamplător de către Rouget la mijlocul secolului al XIX lea
este una din cele mai utilizate polizaharide icircn ingineria tisulară şi regenerare osului Acesta este
obţinut din chitină polizaharid structural ce are rol analog cu cel al colagenului icircn regnul animal
superior şi al celulozei icircn plantele Plantele produc celuloză icircn pereţii plantelor iar insectele şi
crustaceele produc chitină icircn aripi respectiv scoici Prin deacetilarea icircntre 40 şi 100 a
chitinei rezultă un polimer format din unităţi de β-(1-4)-2-acetamino-D-glucoză (N-acetil-D-
26
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
glucozamină) şi β-(1-4)-2-amino-D-glucoză (N-D-glucozamină) Icircn afara diferenţei de structură
dintre chitină şi chitosan o altă diferenţă este dată de solubilitatea celor doi biopolimeri chitina
este insolubilă icircn solvenţii uzuali chitosanul dizolvacircndu-se icircn aceştia Structura sa unică
biocompatibilitatea proprietăţi fizico-chimice (solubilitatea biodegradabilitate) versatilitate icircn
termeni de prelucrare proprietăţi multidimensionale şi funcţionalitate icircnaltă fac ca acest
biopolimer să aibă o multitudine de aplicaţii icircntr-o gamă variată de domenii domeniul
biomedical industria farmaceutică industria cosmetică biotehnologii industria alimentară
agricultură şi protecţia mediului [53] [54]
Figura 111 Structura chimică a chitosanului
Icircn ceea ce privește utilizarea chitosanului icircn domeniul regenerării osoase sunt elaborate
studii complexe icircncă de acum cacircteva deceni Borah şi colaboratorii fiind primii care au
demonstrate potenţialul osteogenic al acestuia [55] Au urmat apoi Muzarelli şi colaboratorii care
au realizat studii publicate icircn anii 1993 şi 1994 remarcante din punct de vedere al proprietăţilor
de regenerare osoasă ale chitosanului [56]
Acid hialuronic
Acidul hialuronic ndash Hya este un mucopolizaharid ce face parte din clasa
glicozaminoglicanilor ndash GAG avacircnd cea mai simplă structură chimică din această clasă de
compuși biologici și fiind singurul glicozaminoglican nesulfatat Icircn organismul uman acidul
hialuronic se găseşte icircn lichidul sinovial umoarea vitroasă matricea extracelulară a ţesutului viu
iar icircn cea mai mare cantitate se regăsește icircn piele Hya este componentul principal al matricei
extracelulare a cartilajului articular acţionacircnd ca o ancoră pentru GAG sulfataţi din cartilaj [57]
27
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Este neramificat și inert din punct de vedere imunologic iar spre deosebire de alți GAG
este sintetizat ca un polizaharid liber și nu substituit la o miezul unei proteine [58] Structura
acidului hialuronic este reprezentată de unităţile dizaharidice polianionice acid D-glucoronic şi
N-acetil-D-glucozamină unite alternant prin legături β ndash 14 și β ndash 1-3 glicozidice (figura 112)
Figura 112 Structura acidului hialuronic
Hya se extrage adesea din surse de origine animală creastă de cocoș și umoare vitroasă de
origine bovină icircnsă procesul de izolare din aceste surse este dificil deoarece acesta formează
complexe stabile din punct de vedere chimic cu proteoglicani prezenți icircn țesutul animal fiind
foarte greu de controlat masa moleculară a acesti biopolimer Extragerea acidului hialuronic din
surse microbiene reprezintă o alternativă la metoda de extragere menționată anterior bacteriile
din familia Streptococcilor grupurile A și C producacircnd icircn mod natural o capsulă mucoidă de
acid hialuronic [59]
Icircn ciuda faptului că acidul hialuronic se găsește icircntr-o cantitate mică icircn matricea
extracelulară a ţesutului osos acest polimer este implicat icircn procesele biologice importante ale
osului Poate fi produs de osteoblaste şi osteoclaste fiind găsit şi icircn citoplasma celulelor
osteoprogenitoare și poate lega hidroxiapatita fără să afecteze dezvoltarea minerală Are un rol
important icircn osificarea endocondrală şi a platoului de creştere epifizar fiind găsit icircntr-o
concentraţie mare icircn zona condrocitelor hipertrofice Important de menționat este că acidul
hialuronic se găsește icircn concentraţie mare icircn calusul fracturilor nou formate [57]
28
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Alginații
Alginatul este un polimer anionic natural obținut din diverse specii de alge brune
(Phaeophyceae Laminaria hyperborea Laminaria digitata Laminaria japonica Ascophyllum
nodosum Macrocystis pyrifera) prin tratament cu soluții alcaline apoase cel mai adesea
utilizacircndu-se NaOH De-a lungul timpului a fost intens studiat fiind utilizat icircn prezent icircn
multiple aplicații biomedicale datorită proprietăților care le deține biocompatilitate toxicitate
scăzută costuri de obținere și procesare relativ scăzute [60]
Icircn literatură sunt prezentate rezultatele unor studii prinvind utilizarea alginatului la
fabricarea de suporturi pentru igineria tisulară [61] Hye-Lee și colaboratorii prezintă un studiu
cu privire la prepararea și caracterizarea de suporturi compozite pe bază de nano-hidroxiapatită
alginat și chitosan cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos [62] Icircntr-un alt studiu
Sharma și colaboratorii prezintă fabricare de suporturi nano-biocompozite a căror componente
sunt același ca icircn studiul publicat de Hey-Lee la care se adaugă gelatină procedeul de fabricare
al nano-biocompozitelor fiind unul complex [63]
12212 Polimeri sintetici
Două din cele mai mari avantaje ale polimerilor sintetici sunt reproductibilitate mare şi
posibilitatea de a fi fabricaţi pe scară largă De asemnea pot fi fabricați sub o gamă foarte variată
de forme Icircn comparație cu polimerii naturali este foarte important de menționat faptul că
polimerilor sintetici li se pot controla proprietăţile mecanice şi biodegradabilitatea icircnsă ridică
probleme deoarece nu au activitate biologică şi sunt foarte hidrofobi [64]
Poli (acidul lactic)
Poli (acidul lactic) ndash PLA este unul din cei mai utilizați polimeri sintetici datorită
proprietăților sale mecanice foarte bune fiind utilizat cu succes icircn diverse implanturi medicale
Datorită faptului că PLA are o viteză de degradare in vivo scăzută este cel mai adesea utilizat
pentru fixarea ososă [65] Deoarece prezintă doi carboni asimetrici PLA are trei forme izomerice
D(-)- PDLA L(+)-PLLA şi (DL)- PDLLA Ușurința icircn procesare cristalinitatea precum și viteza
de degradare depind de structura și compoziția lanțurilor polimerice icircn mod particular de
raportul izomerilor PLLA este considerat un homoplimer izotactic semicristalin avacircnd cea mai
mare temperatură de topire dintre cei trei izomeri ai PLA [66]
29
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 113 Structura PLA
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA este un copolimer al poli (acidului lactic) ndash PLA şi
al poli (acidului glicolic) ndash PGA Este utilizat la realizarea de produse farmaceutice și diverse
suporturi pentru ingineria tisulară fiind un polimer biocompatibil și biodegradabil [67]
Suporturile pentru inginerie tisulară pe bază de PLGA au avantajul de a fi degradate icircn mediul de
cultură celular produșii de degradare rezultați fiind lipsiți de toxicitate [68]
Figura 114 Structura PLGA
unde n ndash numărul de unităţi structural de acid lactic şi m ndash numărul de unităţi structurale de acid
glycolic
Poli (caprolactona)
Poli (caprolactona) ndash PCL este un polimer termoplastic biocompatibil avacircnd temperaturile
de topire şi de vitrifiere scăzute Este cristalin şi hirofob caracteristici ce conduc la o viteză de
degradare scăzută De asemenea are proprietăţi mecanice constante icircn timp Proprietăţile
prezentate fac ca acest polimer să fie adesea utilizat icircn ingineria tisulară [69]
30
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 115 Structura PCL
Poli (3- hidroxibutiratul)
Poli (hidroxialcanoaţii) ndash PHA sunt o clasă de poliesteri naturali produși de o varietate de
microorganisme Primul polihidroxialcanoat descoperit și totodată cel mai studiat este poli-3-
hidroxibutiratul ndash P(3HB) a cărui structură chimică este redată icircn figura 116 [70]
Figura 116 Structura P(3HB)
12213 Biomateriale cermice
Din categoria suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă biomaterialele
ceramice reprezintă o categorie foarte importantă cele mai multe variante comerciale pentru
aplicația vizată icircncadracircndu-se icircn această categorie Compoziţia şi morfologia acestor
biomateriale au o influență esențială asupra răspunsului tisular Icircn majoritatea cazurilor sunt non-
imunogenice nu provoacă reacții inflamatoare și sunt non-citotoxice Icircn practica clinică
ceramicele sunt utilizate icircntr-o mare varietate de aplicații biomateriale pentru regenerarea
articulaţiei artificiale a şoldului biomaterialele de reconstrucţie osoasă implanturi pentru
icircnlocuirea celor trei oscioare de la nivelul urechii (ciocănş nicovală şi scăriţă) rădăcini dentare
artificiale şi ceramice pentru diverse tratamente medicale [71]
31
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Ceramicile utilizate la fabricarea de implanturi se clasifică icircn ceramice neresorbabile
(bioinerte) ceramice bioactive sau cu suprafaţa activă (semi-inerte) şi ceramice biodegradabile
sau resorbabile (non-inerte)
Ceramicele neresorbabile inerte sunt stabile la interacţiunea cu mediul fiziologic şi nu
prezintă bioactivitate sau efecte dăunătoare pentru organismul uman cele mai reprezentative
fiind alumina ndash Al2O3 zirconia ndash ZnO2 carbonul și nitrura de siliciu Ceramicele bioactive
semi-inerte sunt ceramice desemnate să inducă o activitate biologică specifică avacircnd
capacitatea de a se lega direct la os caracteristică deosebit de importantă şi unică icircn racircndul
tuturor tipurilor de biomateriale Din categoria ceramicelor bioactive semi-inerte fac parte
apatitele sticlele bioactive şi sticlele ceramice bioactive Fosfaţii de calciu chiar daca fac parte
din clasa apatitelor se icircncadrează icircn categoria ceramicelor resorbabile [72] [73]
Sticlele bioactive au fost inventate de către Hench Universitatea din Florida icircn 1971
Acestea au drept compoziţie de bază SiO2-CaO-Na2O-P2O5 și la fel ca ceramicile bioactive au
capacitatea de a se lega de os fară a exista conexiuni tisulare fibroase icircntre ele Bioglassreg
45S5
este prima şi cea mai studiată sticlă bioactivă Bioglassreg S53P4 este o altă sticlă bioactivă
utilizată icircn ortopedie ca şi substituent osos sub varianta comercială BonAlivereg (Vivoxid
Finlanda) [74]
Sticlele bioactive ceramice se obţin prin precipitarea icircn sticlele bioactive a unei faze
cristaline rolul acestei etape de sinteză fiind de a mări rezistenţa mecanică a acestora din urmă
Spre deosebire de sticlele bioactive obișnuite au o bioactivitate mai scăzută dar au o rezistenţă
mecanică superioară Sunt utilizate la realizare vertebrelor artificiale spaţiului intervertebral
artificial şi a unor materiale de umplere poroase sau granulare [75]
Fosfați de calciu
Fosfații de calciu reprezintă componenta majoră a țesutului dur al vertebratelor
componenta anorganică (minerală) a osului avacircnd icircn compoziție nanocristale non-
stoichiometrice de apatită avacircnd următoarea formulă chimică
Ca10-x(PO4)6-x(HPO4CO3)x(OHF)2-x
unde 0lexle2 O particularitate aparte a structurii apatitelor este capacitatea lor de a putea
icircncorpora multe tipuri de ioni organici sau anorganici Astfel s-a dovedit că fosfați de calciu
32
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanocristalini non-stoichiometrici atacirct biologici cacirct și sintetici icircncorporează icircn structura lor ioni
din mediu chimic care nu corespund apatitelor acești ioni fiind denumiți non-apatitici [76] Icircn
tabelul 13 sunt prezentați diferite tipuri de fosfați de calciu
Tabel 13 Diferite forme de fosfaţi de calciu abrevierea lor formula chimică raportul
CaP mineral (dacă există) [77] [78]
Denumire Abreviere Formulă chimică Raport
CaP Mineral
Fosfat monocalcic
monohidrat MCPM Ca(H2PO4)2 H2O 05 ndash
Fosfat monocalcic
anhidru MCPA Ca(H2PO4)2 05 ndash
Fosfat dicalcic
anhidru DCPA CaHPO4 100 Moneit
Fosfat dicalcic
dihidrat DCPD CaHPO4 2H2O 100 Bruțit
Fosfat octocalcic OCP Ca8H2(PO4)6 5H2O 133 ndash
α-Fosfat tricalcic α-TCP α-Ca3(PO4)2 15 ndash
β-Fosfat tricalcic β-TCP β-Ca3(PO4)2 15 ndash
Hidroxiapatită
deficită icircn calciu CDHap Ca9(HPO4)(PO4)5OH 15 ndash
Hidroxiapatită
precipitată Hap
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x
unde 0lexle2
xx(OH)2-x
133 ndash167 ndash
Hidroxiapatită
sinterizată SHA Ca10(PO4)6(OH)2 167 Hidroxiapatită
Oxiapatită OXA Ca10(PO4)6O 167 ndash
Fosfat tetracalcic TeTCP Ca4(PO4)2O 20 Hilgenstockite
Hidroxiapatita este utilizată destul de des icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos
datorită similarității dintre compoziția sa și cea a fazei minerale a osului uman Faza minerală a
osului uman are formula chimică asemănătoare ce cea a hidroxiapatitei deficitară icircn calciu avacircnd
grupările OH- parțial substituite cu grupări CO3
2- Structura cristalină a hidroxiapatitei poate fi
descrisă ca un aranjament hexagonal unde cationii sunt orientați pe planurile tetraedral și
octaedral Icircn ultimii ani diverse suporturi ceramice pe bază de hidroxiapaptită au fost realizate
Cu toate că acestea prezintă proprietăți foarte bune pentru aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului
osos porozitate ridicată osteointegrare bună totuși au diverse neajunsuri icircn ceea ce privește o
refacere completă a defectelor ososoase [79]
33
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1222 Suporturi biomimetice pentru ingineria tisulară şi regenerarea osoasă
12221 Caracteristici ale suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Suporturile realizate pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă trebuie să aibă o serie
de proprietăți foarte importante pentru a putea fi utilizate cu succes proprietăți prezentate
schematic icircn figura 117
Figura 117 Proprietățile unui suport ideal realizat pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Icircn primul racircnd suporturile trebuie să aibă o serie de proprietăți biologice care sunt
esențiale pentru obținerea unor rezultate promițătoare biocompatibilitatea și bioactivitatea fiind
două din cele mai importante Un suport este considerat biocompatibil dacă nu are răspuns
imunogenic și nu are componente toxice sau inflamatoare care vor conduce la o rejecție
imunologică Bioactivitatea se referă la interacțiunea suportului cu țesutul gazdă și integrarea
acestuia De asemenea din punct de vedere al bioactivității suporturile trebuie să fie
osteoconductive osteoinductive și osteogenice Biodegradabilitatea o altă proprietate biologică
foarte important constă icircntr-o degradare controlată a suportului pe măsură ce se formează țesut
34
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nou menținacircnd totodată suport suficient pentru regenerarea completă a țesutului afectat Lipsa
unor produși de degradare toxici este o altă caracteristică care definește biodegradabilitatea [80]
Proprietăţile de suprafaţa sunt și ele esențiale la fel și proprietăţile morfologice pori
interconectați structură tridimensională microporozitatea macroporozitatea dimensiunea
porilor adaptată fiecărui tip de țesutcelule Porii trebuie să fie interconectați pentru a permite
difuziunea și migrarea celulelor iar dimensiunea porilor trebuie să fie adaptată fiecărui tip de
țesutcelule Microporozitate oferă o suprafață care permite interacțiunile celule-matrice și
macroporozitate permite migrarea celulelor și invazia vaselor de sacircnge Porozitate adecvată
permite creșterea celulelor fără să afecteze proprietățile mecanice
Suporturile trebuie să aibă proprietăţi mecanice similare cu cele ale ţesutului lacircngă care
sunt implantate mai concret trebuie să aibă rezistență la diverse solicitări biomecanice
comparabile cu ale osului uman pentru a permite mecano-reglarea celulară și păstrarea
integrității in vivo [34] [35]
12222 Metode de obținere a suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Metodele convenționale de obținere a suporturilor includ prelucrarea prin turnare icircn
solvent și solubilizarea a particulelor liofilizarea separarea fazelor indusă termic metoda de
formare a spumelor din fază gazoasă formarea prin pulverizare formarea prin tehnica sol-gel
electrofilarea și altele
Icircn cazul metodei prin turnarea icircn solvent și solubilizare a particulelor o soluție de polimer
este introdusă icircntr-o solvent cu particule de săruri avacircnd dimensiuni specifice dispersate
uniform Solventul se va evapora rezultacircnd un suport cu particule icircncorporate Suportul este
imersat apoi icircn apă particulele fiind solubilizate uneori se folosește și icircncălzirea pentru o
solubilizare completă rezultacircnd icircn final o structură cu porozitate ridicată Rezprezentarea
schematică a metodei este redată icircn figura 118 Dezavantajele metodei de formare a suporturilor
sunt formarea unor suporturi cu formă prestabilită și citotoxicitatea suporturilor datoră
rezidurilor de solvent
35
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 118 Obținerea suporturilor prin turnare icircn solvent și solubilizarea particulelor
Liofilizarea are la bază procesul de sublimare care se referă la trecerea apei din fază solidă
icircn fază gazoasă Suporturile obținute prin liofilizarea prezintă o structură poroasă cu pori
interconectați avacircnd dimensiuni medii icircn jur de 300 nm (figura 119) dimensiuni ce depind de
natura componentelor suportului Dezavantajele acestei metode sunt timpul icircndelungat necesar
obținerii suportului și faptul că pori rezultați nu au dimensiuni regulate
Figura 119 Obținerea suporturilor prin liofilizare
36
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Metoda de formare a suporturilor din spume gazoase a fost dezvoltată pentru a icircnlătura
utilizarea solvenților organici citotoxici Polimeri biodegradabili dizolvați icircn apă sau fluoroform
sunt ținuți sub presiune cu diverși agenți gazoși inerți (azot dioxid de carbon) pacircnă cacircnd soluția
este saturată și plină de bule de gaz Tehnica are drept rezultat suporturi poroase cu dimensiuni
medii a porilor icircn intervalul 30-700 microm și o porozitate ridicată de pacircnă la 85
Tehnica sol-gel se bazeză pe polimerizarea anorganică a metalelor alcaloide O soluție (sol)
este format prin adăugarea unui surfactant după care vor urma reacțiile de condensare și
gelifiere [81]
Tehnica de electrofilare a fost inventată icircn 1934 de către Formhals și se bazează pe un
cacircmp electric ce impune o icircntindere uniaxală a unui jet vacircscoelastic provenit dintr-o soluție de
polimer ce icircși reduce continuu diametrul icircn final rezultacircnd nanofibre Este o tehnică simplă și
rentabilă pentru prepararea nanofibrelor polimerice cu diameter cuprinse icircntre 3 nm și 5 μm
(figura 120) Proprietățile nanofibrelor electrofilate sunt influențate de mulți factori cum ar fi
proprietățile polimerului proprietățile solventului aditivii concentrația polimerului proprietățile
soluției și așa mai departe [82]
Figura 120 Obținerea suporturilor prin liofilizare
Există și tehnici moderne de sinteză a suporturilor pentru regenerarea osoasă denumite
tehnici de prototipare rapide Dintre acestea cele mai utilizate și cele care oferă pacircnă icircn present
rezultatele cele mai promițătoare sunt sinterizarea selectivă cu laser stereolitografia imprimarea
tridimensională (3D) bio-imprimarea [81]
37
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
12223 Suporturi biomimetie pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu pentru
regenerarea osoasă
Suporturi biomimetice
Icircn general metodele de regenerare osoasă sunt de preferat metodelor de icircnlocuire osoasă
datorită neajunsurilor celor din urmă Un număr mare de studii icircn domeniul ingineriei tisulare și
regenerare a osului au evidenţiat importanţa critică a caracteristicilor arhitecturii suporturilor
utilizate icircn domeniu
Ţesuturile vii sunt caracterizate de o arhitectură ierarhică tridimensională şi un
micromediu unic ce uşurează intercaţiunea celulelor cu molecule semnal componentele matricei
extracelulare şi unele molecule mici Acest micromediu complex controlează procesele celulare
importante pentru morfogeneza ţesutului şi menţine proliferarea diferenţierea şi migrarea
celulară Ingineria tisulară convenţională a icircncercat să imite proprietăţile ţesutului osos nativ doar
la nivel micromolecular şi macromolecular fiind neglijate icircnsă structurile de la nivel
submicromolecular şi nanomolecular [83]
De asemenea numeroase studii icircn acest domeniu au arătat că nu este suficientă realizarea
unor suporturi pentru regenerarea osoasă luacircnd icircn considerarea doar compoziţia chimică a
osului deoarece acestea nu vor avea proprietăţi mecanice similare cu ale osului natural şi vor
afecta metabolismul acestuia cacircnd vor fi implantate in vivo
Pentru realizarea unui substituent osos care să poată fi aplicat cu succes pentru tratarea
unor defecte osose de diferite cauze trebuie să se ţină cont atacirct de compoziţia naturală a osului
dar cel mai important trebuie să se imite nanostrucutura lui deoarece arhitectura nanostructurală
a osului este esenţa lui atacirct icircn ceeea ce priveşte proprietăţile mecanice cacirct şi bioresorbabilitatea
Realizarea unor matrici de colagen icircn care s-a icircncercat reproducerea mineralizării intrafibrilare a
dus la obţinerea unor suporturi ce pot fi aplicate cu succes icircn ingineria tisulară și regenerarea
ţesutului osos [84]
Avacircnd icircn vedere aspectele mai sus menționate se poate spune că suporturilor preparate
plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important imitacircnd nanostructura sa sunt
suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg procesele substanţele dispozitivele
sistemele facute de om care imită natura [85]
38
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Suporturi compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
Compozitele sunt materiale solide ce au la bază o combinație de minim două materiale cu
propietăți diferite dezavantajele individuale ale acestora sunt diminuate fiind păstrate și puse icircn
valoare doar avantajele fiecărui componet al compozitului
Icircn ingineria tisulară și medicina regenerativă se utilizează mai multe varinte de
compozite co-polimeri polimer ndash polimer sau polimer ndash ceramice Unul din cei mai utilizați co-
polimeri icircn ingineria tisulară osoasă este poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA Compozitele
polimer sintetic ndash polimer sintetic sunt amestecuri de minim doi polimeri sintetice un exemplu
fiind compozitul pe bază de PLGA și polifosfazene asocierea acestora avacircnd drept obiectiv
principal obținerea unor produși de degardare neutri Se pot combina și polimeri sintetici cu
polimeri naturali pentru realizarea de compozite de exemplu PLGA și colagen
Compozitele polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje
care pleacă de la faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele
matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă) De-a lungul timpului au fost studiate și compozite
polimeri sintetici ndash ceramice de exemplu compozite pe bază de poli (acid lactic) poli (acidul
lactic-co-glicolic) hidroxiapatită dar studiile concentrate pe compozitele polimeri naturali ndash
ceramice au avut cele mai bune rezultate de-a lungul timpului [34]
Avantajele unui compozit pe bază de biopolimeri și ceramice ar fi pe de o parte
proprietățile mecanice variabile degradarea controlată și structura fizică a polimerilor iar pe de
altă parte rezistența și natura biomimetică a ceramicelor Combinarea de biopolimeri cu
ceramice elimină un mare dezavantaj al acestora din urmă și anume faptul că sunt casante dar
totodată crește bioactivitatea și capacitatea de transport și eliberare de agenți bioactivi [75]
Compozitele pe bază de colagen și hidroxiapatită au fost de-a lungul timpului cele mai
studiate compozite biopolimeri ndash ceramice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
13 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Icircn ultimii ani interesul pentru nanotehnologie a crescut semnificativ Particulele magnetice
fac parte din grupul materialelor utilizate icircn nanotehnologii cu un impact considerabil icircn diverse
domenii chimie biosenzori nanomedicină etc Cele mai importante aplicații ale lor sunt legate
39
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de obținerea particulelor de dimensiuni nanometrice denumite nanoparticule magnetice ndash MNPs
utilizate ca metode de diagnostic prin separarea magnetică a unor entități biologice utilizarea icircn
scop terapeutic și ultima aplicație aceasta fiind una din cele mai des folosite icircn medicină
utilizarea la rezonanța magnetică nucleară [86]
Utilizate icircn scop terapeutic nanoparticulele magnetice au fost evaluate pentru eliberarea
controlată de medicamente Prin utilizarea atracției magnetice sau a direcționării specifice a unor
biomarkeri tumorali nanoparticulele magnetice oferă o soluție atractivă pentru terapia directă cu
agenți chimioterapici care vor fi eliberați icircntr-un loc specific doză de medicament care ar fi fost
utilizată icircn mod curent fiind astfel redusă semnificativ și o dată cu ea efectele adverse asociate
cu absorbția de către țesuturi sănătoase a medicamentului [87]
MNPs folosite icircn aplicaţiile biomedicale trebuie să fie superparamgnetice adică să aibă
proprietatea de a putea fi magnetizate doar icircn prezenţa unui cacircmp magnetic extern De asemenea
trebuie să aibă dimensiuni mici pentru a nu fi eliminate din circulaţie de către ficat sau splină
după ce cacircmpul magnetic este icircnlăturat Icircn general cu cacirct particulele au dimensiuni mai mari cu
atacirct este mai mic timpul lor de icircnjumătăţire icircn plasma
Cele mai utilizate surse de materiale magnetice sunt oxizii de fier cu structură de miez ce
au mai multe forme cristaline polimorfe hematită α-Fe2O3 maghemită β-Fe2O3 γ- Fe2O3 şi
magnetită ε-Fe2O3 Fe3O4 precum şi alte forme amorfe Singurele utilizate icircn aplicaţiile medicale
sunt maghemita şi magnetita Pentru realizarea miezului magnetic a unor nanoparticule
magnetice se utilizează icircn unele aplicaţii şi fierul carbonil datorită dimensiunilor mici ale
particulelor sale [88] [89]
Pentru a icircmbunătăţi proprietăţile fizice şi chimice ale particulelor magnetice acestea sunt
adesea acoperite cu silica polimeri anumiţi surfactanţi sau diverşi compuşi organici Acoperirea
cu polimeri oferă o serie de avantaje nanoparticulelor magnetice numărul mare de grupări
funcţionale ale polimerilor permite alte funcţionalizări ale particulelor toxicitatea este complet
redusă are rol icircn stoparea procesului de oxidare etc Datorită atracţiei puternice dipol-dipol
dintre particule MNP tind să se aglomereze dar pentru a icircnlătura acest dezavantaj MNP sunt
acoperite cu polimeri hidrofilici cum sunt dextranul şi chitosanul Grupările funcționale ale
chitosanului permit funcționalizarea nanoparticulelor cu diverși agenți bioactivi prin stabilirea de
legături chimice icircntre grupările chitosanului și cele ale agentului
Reprezentarea unei nanoparticule magnetice acoperită cu polimer este redată icircn figura 121
40
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 121 Reprezentarea schematică a unei nanoparticule acoperite cu polimer cu funcții
aminice
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular cercetările
științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind cel de eliberarea
de principii active controlată și țintită
Nanoparticulele sunt integrate prin diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale
pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă
creștere deorece studii mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația
vizată
Icircn urma unui studiu de literatură amănunţit se poate realiza o clasificarea a suporturilor
magnetice pe bază de biomateriale cu aplicaţii icircn ingineria tisulară şi regenerarea osoasă icircn
funcţie de compoziție și icircn funcție de forma de prezentare
Icircn funcție de compoziție suporturile magnetice se pot clasifica icircn suporturi magnetice cu
biopolimeri care se clasifică la racircndul lor icircn suporturi magnetice pe bază de proteine şi suporturi
magnetice pe bază de polizaharide suporturi magnetice cu polimeri sintetici suporturi magnetice
cu materiale ceramice Icircn funcție de forma de prezentare suporturile magnetice se clasifică icircn
suporturi magnetice poroase hidrogeluri magnetice membrane magnetice nanofibroase și sticle
bioactive magnetice (figura 122)
41
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 122 Clasificarea suporturilor magnetice
131 Suporturi magnetice cu biopolimeri
1311 Suporturi magnetice cu proteine
Colagenul gelatina și fibroina din mătase sunt trei din proteinele cele mai utilizate icircn
sinteza de suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi magnetice cu colagen
Unul din primele studii ce prezintă conceptul de suporturi magnetice a fost publicat icircn
2010 de Bock şi colaboratorii [90] prezentacircnd realizarea şi caracterizarea a două tipuri de
suporturi magnetice Primul tip de suport a fost obţinut din hidroxiapatită şi colagen (7030 ww)
reticulat cu 14-butandiol diglicidil eter sub formă de structuri liofilizate microporoase şi
macroporoase avacircnd diametrul de 122plusmn08 mm şi icircnălţimea 47plusmn08 mm Al doilea tip de suport
a fost obţinut din 100 colagen liofilizat sub formă de structuri poroase omogene cu diametrul
42
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de 123plusmn1 mm şi icircnălţime 28plusmn09 mm Icircn vederea magnetizării ambele tipuri de suporturi au
fost imersate pentru 15 min icircn 1ml fero-fluid trei tipuri diferite de fero-fluide fiind utilizate
(figura 123) Fero-fluidele reprezentacircnd nanoparticule magnetice cu dimensiunea de 200 nm
dispersate icircn apă au fost notate FF-DXS (nanoparticule de magnetită acoperite cu sulfat de
dextran și funcționalizate cu grupări funcționale de sulfat de sodiu) FF-PAA (nanoparticule de
magnetită acoperite cu acid poli-DL-aspartic și funcționalizate cu carboxilat de sodiu) și FF-DP
(nanoparticule de magnetită acoperite cu amidon și funcționalizate cu grupări fosfat)
Figura 123 Reprezentarea schematică a procedeului de preparare a suporturilor magnetice [90]
Valorile obținute pentru magnetizarea suporturilor sunt considerate potrivite pentru
generarea de gradient magnetic icircn suport precum și icircn vecinătatea acestuia Studiile in vitro de
biocompatibilitate au dovedit că suporturile magnetice obținute susțin adeziunea și proliferarea
celulelor stem Icircn concluzie suporturile obținute au potențialul de a fi considerate substituenți
osoși avacircnd ca și noutate față de variantele standard proprietatea de a atrage particule magnetice
funcționalizate cu medicamente [91]
Icircn 2013 Panseri și colaboratorii [92] descriu icircntr-un studiu obținerea și caracterizarea de
suporturi magnetice obținute prin două metode diferite metoda A și metoda B Metoda A are la
bază magnetizarea in situ și constă icircn nucleația de apatită biomimetică și 7 nanoparticule
magnetice (cu dimensiunea mai mică de 50 nm achiziționate de la Sigma Aldrich) pe fibrile de
colagen autoasamblate Metoda B reproduce procedeul de obținere descris icircn studiul mai sus
43
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
menționat (Bock și colaboartorii) un suport poros pe bază de hidroxiapatită și colagen fiind
imersat icircn fero-fluidul FF-DP Din datele de microscopie electronică de baleiaj (SEM) autorii au
observat icircn cazul suporturilor obținute prin metoda A o distribuție omogenă a nanoparticulelor
magnetice pe fibrele de colagen iar icircn cazul suporturilor obținute prin metoda B o aglomerare a
nanoparticulelor Teste in vivo complexe au fost realizate utilizacircnd suporturile obținute
rezulatele indicacircnd potențialul acestora de a fi utilizate icircn aplicații ale ingineriei tisulare a
țeustului osos Icircntr-un studiu următor autorii funcționalizează hidroxiapatita cu ioni de fier (Fe2+
şi Fe3+
) conferindu-i astfel proprietăţi superparamagnetice şi totodată diminuacircnd potenţialul
citotoxic ce poate fi uneori dat de magnetită sau de unii oxizi de fier
Suporturi magnetice cu gelatină
Samal şi colaboratorii [93] evidenţiază obţinerea şi caracterizarea de suporturi magnetice
pe bază de gelatină Soluţii de gelatină amestecate cu concentraţii diferite de fero-fluid (particule
de magnetită acoperite cu acid poli-acrilic dispersate icircn apă) au fost transferate icircn plăci de
polistiren cu mai multe straturirezultacircnd membrane ce au fost apoi legate chimic cu ajutorul
carbodiimidelor icircn vederea obţinerii suporturilor
Gelatina a fost utilizată şi de Dashnyam şi colaboratorii [94] pentru obţinerea unor
suporturi magnetice hibride Suporturile au fost obţinute din gelatină şi siloxan printr-un
procedeu sol-gel icircn timpul căruia au fost icircncorporate 3 nanoparticule magnetice ultimul pas
pentru obţinerea unor suporturi foarte poroase a fost liofilizarea Icircn urma unor teste mecanice
efectuate autorii au observat o icircmbunătăţire semnificativă a proprietăţilor mecanice ale
suporturilor datorită icircncorporării de nanoparticule magnetice icircn strucura acestora Icircn cadrul
studiului au fost realizate teste de populare cu celule (stem mezenchimale izolate din şobolan) a
suporturilor avacircnd nanoparticule magnetice icircncorporate precum şi a suporturilor fară
nanoparticule magnetice icircncorporate rezultatele indicacircnd o proliferare celulară icircmbunătăţită icircn
cazul primelor suporturi menţionate
Suporturi magnetice cu fibroină din mătase
Icircntr-un studiu publicat recent fibroina a fost utilizată icircmpreună cu chitosan şi nanoparticule
magnetice pentru realizarea unor suporturi cu porozitate controlată cu aplicaţii icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos O soluţie de fibroină şi chitosan a fost preparată avacircnd raportul masic
44
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
31 şi reticulată cu o soluţie 08 glutaraldehidă Patru fero-fluide avacircnd concentraţiile
nanoparticulelor magnetice 0 05 1 şi 2 au fost adăugate icircn soluţia de polimeri iar
soluţiile astfel obţinute au fost transferate icircntr-o matriţă de politetrafluoretilină aşezată icircntr-o
placă de cupru rece a cărui temperatură a fost controlată cu azot lichid Cristale de gheaţă
unidirecţionale s-au format cu o viteză de solidificare de 1degCminut soluţia icircngheţată rezultată
fiind icircntr-o ultimă etapă liofilizată (figura 124)
Activitatea fizico-chimică a suporturilor obţinute a fost studiată icircn soluţii saline de tampon
fosfat pentru a determina retenţia de fluide şi biodegradarea Stabilitatea nanoparticulelor
magnetice din suporturile obţinute a fost analizată utilizacircnd Spectroscopie de absorbţie atomică
Toate cele patru suporturi realizate s-au dovedit a avea o bună biocompatibilitate icircn urma
testelor MTT [95]
Figura 124 a) Reprezentarea schematică a procesului de obținere asuporturilor b) Structurile
chimice al polimeriloragentului reticulant și interacțiunile dintre aceștia c) Dimensiunea
suporturilor și diferența de culoare dată de variația concentrației de nanoparticule magnetice
d) Suportul este atras de un magnet permanent [95]
Suporturi magnetice pe bază de fibroină din mătase au fost realizate şi caracterizate de
Samal şi colaboratorii Nanoparticulele magnetice au fost integrate icircn suporturi prin imersare
rezultacircnd diferite grade de magnetizare Suporturile obţinute s-au dovedit a avea foarte bune
45
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţi de hipertermie ajungacircnd la temperaturi ce au crescut cu 8degC icircn 100 secunde Testele
de biocompatibilitate au indicat lipsa citotoxicităţii suporturilor precum şi capacitatea acestora de
a susţine adeziune şi proliferarea celulară [96]
Hidrogeluri magnetice au fost obţinute printr-un proces de electro-gelifiere a unui soluţii
concentrate de fibroină din mătase (8 ) cu scopul de a fi utilizate ca şi suporturi icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos Patru feluri de suporturi au fost realizate suporturi avacircnd icircncorporate
nanoparticule magnetice (Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice acoperite
cu albumină serică umană (HSA-Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice
acoperite cu albumină serică umană şi conjugate fizic cu factori de creştere fibroblastici bazali
(HSA-Fe3O4-bFGF) şi suporturi fără niciun fel de nanoparticule magnetice Morfologia
suporturilor a fost studiată cu ajutorului microscopiei electronice de baleiaj Citotoxicitatea lor a
fost analizată printr-un test MTT realizat pe osteoblaste de linie iar activitatea osteogenică a fost
studiată din punct de vedere a fosfatazei alcaline a cantităţii de calciu mineralizat şi a
colagenului Analizacircnd rezultatele testelor menţionate autorii consideră că suporturile obţinute
pot fi utilizate pentru aplicaţia vizată [97]
1312 Suporturi magnetice cu polizaharide
Chitosanul este polizaharidul cel mai utilizat icircn studiile privind sinteza și caracterizarea de
suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi biocompozite magnetice pe bază de chitosan şi carboximetilceluloză au fost
obţinute şi caracterizate de către Grumăzescu şi colaboratorii [98] Carboximetilceluloza cel mai
utilizat eter de celuloză este o polizaharidă cu lanţ liniar solubilă icircn apă datorită grupărilor
carboximetil (CH3COONa) introduse icircn molecula de celuloză Deoarece are icircncărcătură electrică
opusă chitosanului reacţionează puternic cu acesta utilizacircndu-se ca agent de reticulare ionic la
anumite valori ale pH-ului Autorii au studiat morfologia suporturilor eficacitatea utilizării
acestora ca şi sisteme de eliberare controlată de antibiotice in vitro precum şi intercaţiunea lor cu
celule eucariotice Rezultate studiilor menţionate au demonstrat că suporturile magnetice
biocompozite propuse de autori pot fi utilizate cu succes icircn viitor icircn domeniul medical icircn
special icircn ingineria tisulară
Heidari şi colaboratorii [99] prezintă icircntr-un studiu recent prepararea in situ a unor
nanoparticule de oxid de fier icircn matrici de hidroxiapatităchitosan pentru aplicaţii icircn ingineria
46
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
ţesutului osos Atacirct hidroxiapatita cacirct şi chitosanul au fost extrase din surse naturale os cortical
bovin pentru hidroxiapatită respectiv creveţi pentru chitosan Două cloruri de fier (FeCl2 FeCl3)
au fost dizolvate icircn soluţie de acid acetic sub agitare magnetică pentru 30 min S-a adăugat apoi
pulbere de hidroxiapatită iar după dizolvarea pentru o oră a acesteia s-a adăugat chitosan şi s-a
lăsat la solubilizat pentru icircncă o oră Alte etape au urmat obţinacircndu-se o matrice gel ce a fost
uscată icircn etuvă la 60degC pentru 24 ore Compozitele tridimensionale obţinute au fost supuse unui
număr foarte mare de analize distribuţia particulelor magnetice icircn funcţie de mărime a fost
analizată cu ajutorul unui analizor de particule şi cu ajutorul microscopiei electronice de
transmisie (TEM) morfologia probelor a fost analizată utilizacircnd SEM proprietăţile magnetice au
fost studiate cu ajutorul unui magnetometru cu vibraţii simple (VSM) şi multe altele
Y Wei și colaboratorii [100] publică un studiu icircn care prezintă fabricarea și caracterizarea
de membrane nanofibroase pe bază de oxizi de fier (Fe3O4) chitosan și polialcool vinilic
Chitosanul (CS) și alcoolul polivinilic (PVA) au fost dizolvate separat icircntr-o soluție de acid
acetic iar apoi au fost amsetecate icircn raport de masă CSPVA= 23Nanoparticule pe bază de
Fe3O4 obținute printr-o metodă de co-precipitare au fost adăugate icircmpreună cu etanol icircn
amestecul polimeric Membranele magnetice nanofibroase Fe3O4CSPVA au fost obținute prin
electrofilarea soluției polimerice conținacircnd Fe3O4 Datorită procesului de electrofilare s-a obținut
o porozitate foarte bună a membranelor 839-851 Datele TEM au arătat o distribuiție uniform
a nanoparticulelor magnetice Datele de spectroscopiei icircn infraroșu cu transformată Fourier
(FTIR) și datela de difracției cu raze X (XRD) au demonstrat că structura chimică și
cristalinitatea probelor nu a fost afectată de procesul de electrofilare De asemenea proprietățile
mecanice proprietățile magnetice și interacțiunea cu osteoblaste aparținacircnd linie de celule
tumorale MG-63 au sugerat că membranele magentice obținute au un real potential pentru
viitoare aplicații privind regenerarea osoasă
132 Suporturi magnetice cu polimeri sintetici
Icircn ultimii 100 ani materialele sintetice sunt utilizate pentru repararea şi regenerarea unei
varietăţi de ţesuturi şi organe [101] Deoarece in vivo osul este adesea supus forţelor mecanice
rezultate icircn urma acţiunii muşchilor şi a mişcărilor corpului una din cerinţele de bază impuse
unui suport realizat cu scopul de a fi utilizat icircn ingineria tisulară a ţesutului osos este aceea de a
fi capabile să suporte stimulii mecanici Biomaterialele sintetice rezultate icircn urma polimerizării
47
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
acidului lactic a acidului glicolic sau a caprolactonei sunt studiate pentru realizarea de suporturi
compozite de obicei icircn combinaţie cu polimeri naturali [102]
Poli (acidul lactic)
Suporturile magnetice pe bază de PLA sunt icircn prezent puțin studiate unul din puținele
studii pe această temă fiind publicat icircn 2007 Lucrarea respectivă se concentrează pe analiza
influenței orientării fibrelor unui suport magnetic pe bază de poli (acid L-lactic) ndash PLLA obținut
prin procedeul de electrofilare asupra proprietăților sale mecanice Pentru realizarea suportului
o soluție de 3 PLLA icircn hexafluoro-2-propanol a fost amestecată cu nanoparticule de magnetită
(Fe3O4) icircn raport PLLAFe3O4 - 955 Amestecul a fost sonicat și apoi electrofilat S-a studiat
morfologia suporturilor obținute interacținuea cu celule precum și rezistența mechanică [102]
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Suporturi nano-compozite superparamagnetice pe bază de PLGA pentru ingineria tisulară
au fost realizate de Lai și colaboratorii Icircntr-o primă etapă PLGA și nanoparticule de magnetită
superparamagnetice hidrofobe (MNPs) au fost amestecate separat icircn diverse rapoarte masice (19
și 11) Icircn a doua etapă cele două amestecuri au fost transferate separat icircntr-o seringă de sticlă de
10 ml conectată la un ac cu dimensiunea de 6 gauge Un electrod a fost montat la ac iar
amestecul respectiv a fost electrofilat icircn timpul procesului tensiunea fiind păstrată constantă la
20 kV viteza de filare fiind de 1 mlH Icircn funcție de raportul PLGA MNPs s-au obținut două
suporturi diferite PLGA-10 MNPs și PLGA-50 MNPs Datele SEM și TEM au evidențiat o
dimensiune a fibrelor suporturilor de 400-600 nm cu MNPs distribuite uniform Suporturile
compozite s-au dovedit a avea o biocompatibilitate excelentă susținacircnd semnificativproliferarea
celulară [103]
Poli (caprolactona)
Unul dintre primele studii care prezintă suporturi magnetice pe bază de PCL a fost
prezentat de Kim și colaboratorii [104] Pentru realizarea suporturilor s-a preparat icircntr-o primă
etapă o soluție de 10 PCL (cu masa molară 80 kDa) icircn cloroform După solubilizare completă
icircn soluția de 10 PCL s-au adăugat două concentrații diferite de nanoparticule magnetice
(MNPs) 05 și 10 față de cantitatea de PCL solubilizată Icircn funcție de concetrația de
48
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanoparticule adăugate suporturile au fost notate PCL-MNP5 (5 MNP) PCL-MNP10 (10
MNP) și PCL (nu conține MNPs) După ultrasonicare soluțiile au fost icircnghețate la -70degC iar
apoi liofilizate pentru 3 zile Adăugarea de MNPs icircn suporturile pe bază de PCL a condus la o
icircmbunătățire a hidrofilicității precum și a proprietăților mecanice a acestora Autorii au
demonstrat că suporturile PCL-MNP au capacitatea de a susține adeziunea celulară precum și
mineralizarea avacircnd o bună biocompatibilitate Suporturi realizate după același protocol
prezentat icircn studiul menționat mai sus sunt riguros studiate in vitro și in vivo din punct de vedere
al biocompatibilității și al interacțiunii cu celule și țesuturi Rezultatele obținute icircn respectivul
studiu indică un potențial considerabil al acestor suporturi de a fi utilizat pentru repararea și
regenerarea osoasă [105]
Suporturi magnetice nanofibroase pe bază de PCL sunt prezentate și icircntr-un studiu publicat
icircn 2016 Icircntr-o soluție de 10 PCL icircn diclometan-etanol s-au icircncorporat două concentrații
diferite de nanoparticule magnetice conjugate cu COOH (10 și 20 COOH-MNPs)
amestecurile obținute fiind electrofilate la temperatura camerei obținuacircndu-se astfel suporturi
magnetice nanofibroase Microstructura și nanostructura suporturilor a fost analizată cu ajutorul
SEM și a microscopiei electronice de transmisie TEM Structura chimică a fost studiată prin
intermediul FTIR iar cristalinitatea prin intermediul XRD S-au studiat de asemenea
proprietățile hidrofile al suporturile proprietățile magnetice și foarte important
biocompatibilitatea acestora și interacțiunea cu celulele [106]
Gloria și colaboratorii [107] prezintă realizarea și caracterizarea de suporturi magnetice pe
bază de PCL cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos După solubilizarea PCL (masa
molară 65 kDa) icircn tetrahidrofuran s-au adăugat separat 3 concentrații diferite de nanoparticule
magnetice (hidroxiapatită dopată cu ioni de fier ndash FeHA) cu diametrul de 20 nm respectacircndu-se
următoarele rapoarte masice PCLFeHA 9010 8020 și 7030 Pentru o distribuție uniformă a
nanoparticulelor magnetice icircn soluția polimerică cele trei amestecuri polimer-nanoparticule au
fost ultrasonicate Următoarea etapă pentru obținerea suporturilor a fost turnarea amestecului icircn
matrițe speciale obținacircndu-se icircn final suporturi cu diametrul de 64 mm și o grosime de 05 mm
Icircn urma analizei datelor XRD autorii au observat că procesul de formare al suporturilor nu
afecteză structura și cristalinitatea acestora Analiza biologică a substraturilor a evidențiat
abilitatea acestora de a susține diferențierea osteogenică
49
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
De remarcat este studiul publicat de Santis și colaboratorii icircn care prezintă realizarea și
caracterizarea unui suport hibrid pe bază de PCL și polietilen glicol (PEG) și nanoparticule
magnetice cu potențiale aplicații icircn regenerarea țesutului osteocartilaginos Suportul hibrid
multistrat a fost obținut prin combinarea a două tehnici de formare a suporturilor imprimare 3D
și stereolitografie [108]
Poli (3- hidroxibutiratul) ndash P(3HB)
Akaraonye și colaboratorii [109] prezintă realizarea și caracterizarea de nanocompozite
magnetice pe bază de P(3HB) cu potențiale aplicații icircn ingineria țesutului osos Două tipuri de
nanocompozite magnetice au fost realizate nanocompozite pe bază de P(3HB) și nanoparticule
magnetice ndash P(3HB)MNP și nanocompozite pe bază de P(3HB) și ferofluid - P(3HB)FF S-a
observat o icircmbunătățire a cristalinității suporturilor compozite ca urmare a icircncorporării
nanoparticulelor magnetice și a ferofluidului icircn suportul polimeric un grad de cristalintate ridicat
al suporturilor fiind benefic regenerării ososoase Propritățile termomecanice favorabile precum
și biocompatibilitatea suporturilor realizate icircn lucrare indică o potențială utilizare a acestora icircn
aplicații ce vizează repararea și regenerarea țesutului osos
133 Suporturi magnetice pe bază de biomateriale ceramice
1331 Sticle ceramice bioactive
Datorită biocompatibilității lor ridicate sticlele bioactive pe bază de siliciu sunt utilizate
pentru refacerea unor defecte mici și chiar medii fiind adesea utilizate cu rolul de grefe icircn
intervenții chirurgicale parodontale și maxilofaciale De asemenea se utilizează pentru refacerea
unor defecte osoase ale urechii medii sau ale coloanei vertebrale Superioare sticlelor bioactive
non-mezoporoase icircn ceea ce privește volumul nanoporos bioactivitatea și degradarea sticlele
bioactive mezoporoase (MBG) au fost fabricate pentru prima dată icircn 2004 de Yan și
colaboratorii avacircnd formula chimică SiO2-CaO-P2O5 [110] Loacutepez-Noriega și colaboratorii au
demonstrat icircntr-un studiu capacitatea sticlelor MBG de a lega și elibera medicamente anti-
osteoporotice [111]
Wu și colaboratorii [112] publică un studiu ce are drept obiectiv principal realizarea unor
suporturi multifuncționale pe bază de MBG și fier (Fe) cu potențiale aplicații icircn terapia
hipertermică (hipertermie) și eliberarea controlată de medicamente pentru tratamentul unor
50
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
afecțiuni osoase maligne Suporturile poroase Fe-MBG (avacircnd icircncorporat 5 sau 10 Fe) au
fost pregătite utilizacircnd co-șabloanele copolimerului tribloc Pluronic P123 (utilizat pentru a
conferi o structură mezoporoasă avacircnd o dimensiune de cacircțiva nanometri) și bureți de
poliuretan(utilizați pentru a creea pori mari avacircnd dimensiuni de cacircteva sute de micrometri)
Prima etapă pentru obținerea celor două suporturi magentice 10 Fe-MBG (10Fe-MBG) și 5
Fe-MBG (5Fe-MBG) a fost solubilizarea icircn etanol de cantități diferite de P123
tetraetilortosilicat (TEOS) Ca(NO3)2∙4H2O FeCl3 trietilfosfat (TEP) și HCl sub agitare
magnetică pentru 24 ore Bureți de poliuretan au fost imersați pentru 10 min icircn soluția obținută icircn
prima etapă iar după icircndepărtarea soluției icircn exces au fost lasați la uscat la temperatura camerei
pentru 24 ore Această etapă a fost repetată de 5 ori după care bureții au fost calcinați la 700degC
pentru 5 ore Pe lacircngă cele două suporturi a fost realizat și un suport 0Fe-MBG care după cum
indică și numele nu conține fier Suporturilor obținute au fost caracterizate utilizacircnd diferite
tehnici SEM și EDS (figura 125) precum și XRD și TEM
Figura 125 a) c) e) Rezultatele SEM b) d) f) Rezultatele EDS [112]
De asemenea s-au realizat diverse teste pentru analiza proprietăților magnetice a
proprietăților mecanice a eliberării controlate de medicament din suport și a contactului cu
51
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
celule stem din măduvă osoasă umană Rezultatele obținute icircn urma studiilor menționate indică
faptul că suporturile sunt magentice degradabile bioactive și au capacitatea de eliberare
controlată de medicamente
1332 Fosafați de calciu
Panseri și colaboratorii [113] prezintă icircntr-un studiu realizarea și caracterizare in vitro a
unor suporturi compozite ceramice poroase Trei tipuri diferite de suporturi au fost fabricate din
hidroxiapatită (HA) ce icircncorporează magnetită (Mgn) avacircnd următoarele rapoarte HAMgn
955 HAMgn 9010 și HAMgn 5050 De asemenea s-a realizat un suport avacircnd raportul
HAMgn 1000 ce a fost utilizat drept control Diverse teste in vitro de biocompatibilitate au fost
realizate utilizacircnd linii celulare de osteoblaste umane Saos-2 teste de proliferare celulară teste
privind activitatea fosfatazei alcaline a celulelor teste de viabilitate celulară livedead etc
Rezultatele acestor teste au indicat o foarte bună biocompatibilitate a suporturilor ceea ce indică
faptul că adăugarea de magnetită icircn structura suporturilor nu a condus la efecte negative asupra
celulelor De asemenea suporturile au fost implantate in vivo la iepuri obținacircndu-se rezultate
bune
14 Concluzii
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta
aceste defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din
biomateriale sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea
celulelor osoase icircn timpul procesului de regenerarea osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau
regenerarea ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor
artificiale și a suporturilor Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase
52
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
sisteme injectabile capsule filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte
tuburi geluri etc
Suporturilor preparate plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important
imitacircnd nanostructura sa sunt suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg
procesele substanţele dispozitivele sistemele facute de om care imită natura Compozitele
polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje care pleacă de la
faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele matricei
extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă)
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular
cercetările științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind
cel de eliberarea de principii active controlată și țintită Nanoparticulele sunt integrate prin
diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă creștere deorece studii
mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația vizată
53
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Obținerea și caracterizarea de suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi
de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Capitolul 2 Materiale şi metode experimentale
21 Strategie experimentală Obiective
Regenerarea osoasă și inginerie tisulară a țesutului osos sunt două domenii intens studiate
datorită creșterii numărului de afecțiuni osoase infecții osoase pierderi de cauză traumatică ale
masei de țesut osos tumori osoase Autogrefele au fost o perioadă mare de timp cele mai
utilizate materiale pentru regenerarea și substituția osoasă icircnsă au multiple dezavantaje
ingineria tisulară atragacircnd tot mai mult atenția icircn special unele suporturi complexe pentru
ingineria tisulară a țesutului osos Icircn capitolul 1 au fost prezentate limitările metodelor actuale de
tratament şi necesitatea reală de găsire a unei metode alternative efective care să aibă drept scop
regenerarea osoasă
Ingineria tisulară domeniu interdisciplinar de mare actualitate oferă soluţii promiţătoare
pentru realizarea de materiale pentru regenerarea tisulară Plecacircnd de la structura țesuturilor
biologice componentele ingineriei tisulare sunt următoarele o matrice sau un suport celule și
molecule semnal suportul fiind componenta cheie
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă este rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea unui
material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și regenerare
osoasă ar putea fi un suport magnetic biomimetic
Icircn urma analizei rezultatelor stiinţifice din domeniul ingineriei tisulare și regenerării osoase
s-a ales pentru lucrarea de faţă o strategie de cercetare care a avut ca obiectiv central
Avacircnd icircn vedere componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă) au fost selectate biomaterialele
utilizate icircn studiile de față după cum urmează pentru componenta organică au fost selectați
biopolimeri adesea utilizaţi icircn studii ce vizează regenerarea țesutului osos şi fosfați de calciu
54
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
pentru componenta anorganică Noutatea tezei este dată de adăugarea de particule magnetice
(magnetită funcţionalizată cu chitosan) icircn amestecul supus procedeului de co-precipitare ce vor
fi funcționalizate cu diverși bioagenți (medicamente) și vor avea rolul de transportori ai acestora
Un suport magnetic biomimetic cu design adecvat este dispozitivul ideal pentru a ghida
formarea de neo-ţesut atacirct in vitro cacirct şi in vivo Suporturile pentru ingineria tisulară a osului
trebuie să fie biocompatibile să mimeze structura şi funcţia biologică a matricei extracelulare şi
să ofere suport mecanic pentru ţesutul icircn formare şi de asemenea să elibereze icircn locul unde are
loc repararea ţesutului diverse molecule celule factori de creştere Totodată suportul trebuie să
fie osteoconductiv şi osteoinductiv şi să aibă o rată de degradarea controlată
O mare parte din suporturile propuse de unele studii icircn domeniu nu mimează şi arhitectura
matricii extracelulare naturale acesta fiind motivul pentru care rezulatele unor astfel de studii nu
sunt satisfăcătoare Suportul trebuie să fie biomimetic adică să mimeze nu doar compoziția
osului ci cel mai important nano-structura sa Astfel pentru tema de cercetare abordată s-a ales
un procedeu biomimetic de co-precipitare in situ a fosfaţilor de calciu icircn soluţii de biopolimeri
inspirat din procesul natural de mineralizare unde mineralele sintetizate de către organism sunt
combinate cu componentele organice ale matrici extracelulare a ţesutului osos
Pentru partea organică a suporturilor s-au utilizat diverși polimeri naturali chitosan acid
hialuronic gelatină albumină şi colagen
Pentru partea anorganică a suporturilor s-au utilizat fosfaţi de calciu sintetici deoarece
prezintă o strucutură similară cu cea a mineralului primar din componenţa ţesutului osos avacircnd
rolul de stimuli osteoconductivi şi osteoinductivi Aceştia s-au obţinut prin precipitarea din
precursori azotat de calciu ndash Ca(NO3)2 CaCl2 şi fosfat monosodic ndash NaH2PO4
Utilizarea particulelor magnetice este un concept intens studiat icircn domeniul inginerie
tisulare Acesta implică utilizarea de nanoparticule magnetice care sunt funcționalizate cu factori
de creștere medicamente sau alți agenți bioactivi care vor fi preluate de către suportul magnetic
ca urmare a acțiunii unui camp magnetic icircn apropierea zonei unde este implantat suportul
Nanoparticulele magnetice funcţionalizate acţionează ca transportatori de agenţi bioactivi către şi
icircn interiorul suportului magnetic După ce patrund icircn suportul magnetic aceste particule
magnetice eliberează succesiv moleculele pe care le transportă Suporturile obţinute au fost
riguros analizate din punct de vedere fizico-chimic şi biologic
55
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
22 Materiale utilizate
221 Materiale utilizate pentru prepararea suporturilor
Analizacircnd icircn amănunt proprietăţile biopolimerilor utilizaţi icircn studii ce vizează obţinerea de
suporturi pentru regenerarea osoasă prezentate icircn capitolul 1 cinci biopolimeri au fost utilizaţi
pentru prepararea loturilor de suporturi două polizaharide şi trei proteine
Fosfaţi de calciu se vor obţine din precursori lor
Polizaharide
Chitosan ndash Cs CAS 9012-76-4 cu masă molară medie M = 309900 Da grad de
deacetilare 792 achiziţionat de la Vascon Co Canada
Hialuronat de sodiu din Streptococcus equindash Hya CAS 9067-32-7 M = 15-18 x
10E6
Da solubilitate = 5 mgml (H2O)Sigma Aldrich Germania
Proteine
Colagen ndash Col tip I+III acido-solubil extras din derm bovin 096 ρ= 097 gcm3
obţinut de la firma Lohmann amp Rauscher Newied Germania
Gelatină ndash G CAS 9000-70-8 pH 38 ndash 76 solubilitate = 10 gL (H₂O 25degC) Merck
Germania
Albumină serică bovină ndash Bsa CAS 9048-46-8 pulbere liofilizată ge 98
(electroforeză icircn gel de agaroză) Sigma-Aldrich Germania
Precursori de fosfaţi de calciu (CP)
Azotatul de calciu ndash Ca(NO3)2∙4H2O CAS 13477-34-4 M = 23615 gmol Sigma-
Aldrich Germania
Clorură de calciu ndash CaCl2middot2H2O CAS 10035-04-8 M = 14701 gmol solubilitatea =
1280 gL ρ = 185 gcm3 (20degC) Merck Germania
Fosfatul monosodic ndash NaH2PO4∙ 2H2O CAS 13472-35-0 pH=41-45 (25degC 5 icircn
soluţie) M = 13799 gmol Sigma-Aldrich Germania
Amoniac soluţie ndash NH4OH CAS 1336-21-6 soluţie 25 Sigma-Aldrich Germania
56
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Particule magnetice (MNPs)
Magnetită ndash Mag sintetizată printr-un procedeu de co-precipitare [114]
Chitosan ndash Cs low CAS 9012-76-4 chitosan cu masă moleculară mică M = 50000-
190000 Da (icircn funcţie de vacircscozitate) vacircscozitate 20-300 cP pentru o soluţie 1 icircn acetic acid
(1 25degC) Sigma-Aldrich Germania
Pluronicreg F-127 CAS 9003-11-6 pH= 6-7 Sigma-Aldrich Germania
Tripolifosfat de sodiu ndash TPP CAS 7758-29-4 Na5P3O10 85 M = 36786 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Doxorubicin hydrochloride ndash DOX CAS 25316-40-9 C27H29NO11 ∙HCl M = 57998
gmol utilizată la pentru studiul de eliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi Sigma-
Aldrich Germania
222 Materiale utilizate pentru caracterizarea suporturilor
Soluţie tampon fosfat pH=72 001 M
Pentru prepararea soluţie tampon fosfat (PBS) pH=72 001 M s-au utilizat
Fosfat monosodic ndashNaH2PO4middot2H2O CAS 13472-35-0 M = 15601 gmol Sigma
Aldrich Germania
Fosfat disodic ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 gmol Sigma Aldrich
Germania
S-au preparat soluţii de fosfat monosodic şi fosfat disodic ambele de concentraţie 001 M
după care cele două soluţii s-au amestecat conform tabel 21
Tabel 21 Proporţiilor de amestecare pentru obţinerea soluţiei PBS pH=72 001M
Fosfat monosodic (ml) Fosfat disodic (ml) pH
28 72 72
Soluţie tampon fosfat (PBS) cu pH 72 şi concentraţie 001 M s-a utilizat pentru
determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic şi la studiile in vitro de
degradare enzimatică
57
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Soluție fluid biologic simulat
Soluția de fluid biologic simulat (SBF) a fost preparată prin dizolvarea icircn apă deionizată a
reactivilor NaCl NaHCO3 KCl Na2HPO4∙2H2O MgCl2∙6H2O CaCl2∙2H2O and Na2SO4 [115]
Reactivii achiziționați de la Merck Germania și Sigma-Aldrich Germania s-au adăugat
unul cacircte unul după ce fiecare reactiv s-a dizolvat complet icircn 700 ml apă deionizată strict icircn
ordinea precizată icircn tabelul 22
Tabel 22 Compoziția chimica a fluidului biologic simulat (SBF)
Ordinea
componentului Reactivi
Cantitate
(gL)
1 NaCl CAS 7647-14-5
M = 5844 gmol 6547
2 NaHCO3 CAS 144-55-8
M = 8401 gmol 2268
3 KCl CAS 7447-40-7
M = 7455 gmol 0373
4 Na2HPO4∙2H2O CAS 10028-24-7
M = 17799 gmol 0178
5 MgCl2∙6H2O CAS 7791-18-6
M = 20330 gmol 0305
6 CaCl2∙2H2O CAS 10035-04-8
M = 14701 gmol 0368
7 Na2SO4 CAS 7757-82-6
M = 14204 gmol 0071
8 (CH2OH)3CNH2 CAS 77-86-1
M = 12114 gmol 6057
Soluția obținută după amestecarea reactivilor s-a ajustat la pH = 74 utilizacircnd o soluție 1M
HCl Din volumul total de acid o parte (aproximativ 20 ml) s-a introdus icircnainte de adaosul celui
de-al șaselea component (CaCl2∙2H2O) pentru a evita apariția fenomenului de precipitare După
adaosul celui de-al 8-lea component [tris (hidroximetil) amino metan] s-a ridicat temperatura
soluției la 37ordmC
58
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Această soluție s-a titrat ulterior cu 1M HCl pacircnă la pH=74 la 37ordmC Icircn timpul procesului
de titrare soluția a fost diluată continuu prin adaos consecutiv de apă deionizată pentru a rezulta
volumul final de 1 L
Concentrația ionilor icircn SBF-ul realizat sunt apropiate de cele care se găsesc icircn plasma
umană așa cum se poate observa icircn tabelul 23
Tabel 23 Concentrațiile ionilor icircn SBF și icircn plasma umană
Concentrație (mM)
Na+
K+
Ca2+
Mg2+
HPO42-
Cl-
HCO32-
SO42-
Plasma umană 1420 50 25 15 10 1030 270 05
SBF 1422 502 247 151 102 1250 272 052
Soluţie tampon fosfat-citrat pH=5
Pentru prepararea soluţiei tampon fosfatndashcitrat pH=5 (după metoda Perse 1980) s-au
utilizat
Fosfat disodic anhidru ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 Sigma-Aldrich
Germania
Acid citric ndash C6H8O7 CAS 77-92-9 M = 19212 gmol Honeywell Riedel-de Haeumln
Germania
S-au preparat o soluţie de Na2HPO4 de concentraţie 02M și o soluție C6H8O7 de
concentraţie 01M după care s-au amestecat volumele specificate icircn tabel 24
Tabel 24 Proporţiile de amestecare pentru obţinerea a 100 ml tampon fosfat-citrat pH=5
Fosfat disodic (ml) Acid citric (ml) Apă distilată (ml) pH
257 243 50 5
59
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Studii in vitro de degradare enzimatică
Tabel 25 Reactivi utilizați pentru studiile in vitro de degradare enzimatică
Determinarea concentrației de
chitosan degradat
Determinarea concentrației de
colagen degradat
Enzime
utilizate
Lizozim ndash 100000 unităţimg
CAS 12650-88-3
M = 143 kDa (a unui singur lanţ)
Sigma-Aldrich Germania
Colagenază clostridium histolyticum
CAS 9001-12-1
M = 68 ndash 125 kDa
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
determinarea
produșilor de
degradare
Fericianură de potasiundash
K3Fe(CN)6
CAS13746-66-2 ge990
M = 32924 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Ninhidrină ndash C9H6O4
CAS 485-47-2
M = 17814 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Clorură de staniu ndashSnCl2
CAS 7772-99-8
M = 1896 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
realizarea
curbei etalon
N-acetil-D-glucozamină ndash
C8H15NO6
CAS 7512-17-6
M = 22121 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Glicină ndash C2H5NO2
CAS 56-406-6
M = 7507 gmol
Fluka Elveţia
Solvenți
Carbonat de sodiu ndash Na2CO3
CAS497-19-8
M = 10599 gmol
Chemical Company Iaşi
2-metoxietanol ndash CH3OCH2CH2OH
CAS 109-86-4
M = 7609 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Teste de citotoxicitate in vitro
Cu excepția solvenților care au fost achiziționați de la Chemical Company Iaşi toate
celelalte materiale prezentate icircn tabelul 26 au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich
Germania
60
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Tabel 26 Reactivi utilizați pentru studiile de citotoxicitate in vitro
Medii de cultură și soluții
de completare
Reactivi pentru
determinare
citotoxicității in vitro
Soluţie salină
Hanksrsquo Balanced
(HBSS)
Solvenți
Mediu de cultură DMEM
(Dulbeccorsquos Modified
Eaglersquos Medium) cu
4500 mgl glucoză
L-glutamat şi bicaronat
de sodiu
Tripsină din pancreas
de porc
CAS 9002-07-7
M = 238 kDa HBSS cu roşu fenol
fără clorură de calciu
şi sulfat de magneziu
Alcool isopropilic
(CH3)2CHOH
CAS 67-63-0
M = 6001 gmol
Mediu de cultură DMEM
F-12 HAM
(amestec de nutrienţi)
cu L-glutamat piruvat de
sodiu 055 gl
glucoză 315 gl
Acid etilen-diamino-
tetraacetic ndash EDTA
CAS 60-00-4
M = 29224 gmol
PSN ndash amestec de
penicilină streptomicină
neomicină
5000 unităţi penicilină 5
mg streptomicină 10
mgml neomicină
MTT ndash C18H16BrN5S
[bromură de (3-[45-
dimetiltiazol-2-il]-25-
difenil) tetrazoliu
CAS 298-93-1
M = 41432 gmol
HBSS cu clorură de
calciu şi sulfat de
magneziu
fără roşu fenol
Alcool etilic
absolut C2H5OH
CAS 64-17-5
M = 4607 gmol
Ser fetal bovin ndash BFS
Calceină AM
CAS 148504-34-1
Teste de citotoxixictate in vivo
Șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28plusmn3
grame materialul biologic provenit din Biobaza INCDMI Cantacuzino București - filiala
Băneasa Reactivi utilizați au fost aleși conform standardului ISO 10993
Betadină ndash soluție cutanată 10
Isofluran 4 ndash soluție pentru inducția anesteziă
Aldehidă formică 10 parafină colorant Tricromic Masson ndash pentru examenul
histopatologic
61
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
23 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu
incluziune de particule magnetice
231 Obţinerea particulelor magnetice
Particulele magnetice au fost obţinute conform protocolului descris de Bălan şi
colaboratorii [116] proprietățile lor fiind prezentate icircn tabelul 27
Tabel 27 Proprietățile particulelor magnetice
Dimensiunea medie
(nm)
Indicile de
polidispersitate
Potențialul Zeta
icircn soluție apoasă de
surfactant (mV)
Magnetizarea
(emug)
178 027 -186 4365
Pe scurt un volum de soluţie de chitosan de masă moleculară mică ndash Cs low a fost
amestecat cu un volum de magnetită ndash Mag şi pluronic F-127
După omogenizare amestecului se va adăuga o soluţie TPP icircn picătură Amestecul final se
va dializă contra apei distilate pentru mai multe zile
232 Obținerea suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu
incluziune de particule magnetice
Suporturilor magnetice au fost obţinute utilizacircnd o metodă biomimetică de co-precipitare a
fosfaţilor de calciu din precursorii săi icircn soluţii de biopolimeri inspirată din procesul natural de
mineralizare etapele procesului de obţinere fiind prezentate icircn figura 21
Soluţiile apoase de precursori de fosfaţi de calciu au fost adăugate icircn amestecul de soluţii
de polimeri Icircnainte de adăugarea precursorilor de fosfaţi de calciu icircn amestecul de soluţii de
polimeri s-au adăugat particule magnetice fie sub formă uscată fie sub formă de suspensie
coloidală
Co-precipitarea s-a realizat icircn prezenţa unei soluţii de amoniac NH4OH (25 ) pacircnă la
obținerea unei valori a pH-ului de 72-74 Fiecare amestec a fost spălat de 3 ori cu apă distilată
prin centrifugare (5000 rpm timp de 10 minute) iar icircn final amestecurile au fost liofilizate 24h la
-55degC
62
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Figura 21 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
233 Program experimental
Specialiștii din foarte multe domenii de activitate se confruntă deseori cu provocarea de a
face compromisuri icircntre diferiți factori pentru a obține rezultatele dorite optimizare fiind
procesul de a alege aceste compromisuri icircn cel mai eficient mod posibil Noțiunea de diferiți
factori face referire la existența unor diferite soluții posibile iar noțiunea de realizare a
rezultatelor dorite se referă la obiectivul de a căuta icircmbunătățirea modului de identificare a
soluției optime Prin urmare icircntr-o problemă de optimizare diferitele soluții posibile sunt
comparate calitatea soluției fiind fundamentală deoarece aceste soluții sunt de multe ori icircn
contrast [117]
Programe experimentale factoriale sunt foarte eficiente pentru studierea a doi sau mai mulți
factori Efectul unui factor poate fi definit ca schimbarea răspunsului produs de o modificare a
nivelului factorului acesta fiind considerat efectul principal Icircn unele experimente se poate
63
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
constata că diferența de răspuns dintre nivelurile unui factor nu este aceeași la toate nivelurile
celorlalți factori numit efect de interacțiune icircntre factori Icircn mod colectiv efectele principale și
efectele de interacțiune sunt numite efectele factoriale Un design factorial complet poate estima
toate efectele principale și interacțiunile de ordin superior
Programe experimentale factoriale sunt folosite icircn ingineria tisulară și icircn domeniul
biomaterialelor [118] icircn domeniul farmaceutic [119] etc
Icircn teza de față s-a utilizat un program experimental multifactorial icircn vederea optimizării
compoziției suporturilor Programul menționat este caracterizat prin faptul că fenomenul
procesul este urmărit prin intermediul unui număr finit de variabile variabile ce pot avea fiecare
un număr discret de valori icircntr-un domeniu de variaţie prestabilit Compoziția suporturilor a fost
optimizată din punct de vedere al raportului biopolimerbiopolimer un program experimental
factorial central compus rotabil de ordinul 2 fiind utilizat [120] Ecuația următoare stabilește
numărul total de experiențe posibile
NE = 2k + 2k + n0 icircn cazul icircn care k lt 5 (1)
sau
NE = 2k-1
+ 2k + n0 icircn cazul icircn care k gt 5 (2)
unde k este numărul de variabile iar n0 numărul de experiențe dispuse icircn centrul domeniului
experimental valoare sa fiind cuprinsă icircn intervalul 3 ndash 7
Structura programului experimental reprezentată de dispunerea punctelor generate de
valorile diferite acordate factorilor are drept ipoteză posibilă ajustarea suprafeţei de răspuns ce
corespunde unui indicator icircn raport cu variabilele independente prin intermediul unor expresii
matematice de tip polinomial de ordinul 2 de forma
Y = a0 + ndash
+
ndash (3)
unde a0 este coeficientul de regresie iar xi si xj sunt variabilele independente care influenţează
variabila răspuns F Valorile discrete ce se atribuie variabilelor sunt alese astfel icircncat printr-o
codificare simetrică faţă de centrul planului experimental să fie posibilă ortogonalizarea matricii
experimentale corespunzătoare si inducerea unei erori minime cu ocazia calculelor aferente
coeficienţilor prin metoda celor mai mici pătrate [121]
64
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Icircn lucrarea de față s-a optat pentru o codificare a valorilor discrete aferente variabilelor
independente conform datelor din tabelul 28
Tabelul 28 Codificarea variabilelor independente icircn cazul exprimării multifactoriale libere
Valoare codificată -1414 -1 0 -1 14141
Valoare reală
Valorile discrete se estimează din valorile ce definesc intervalul de variaţie al variabilei
independente xi conform următoarelor relaţiilor de atribuire
= rarr ndash2 (4)
= rarr +2 (5)
= ( + ) 2 rarr 0 (6)
= ( + ) rarr ndash1 (7)
= ( + ) rarr 1 (8)
Icircn contextul obiectivelor de cercetare s-a folosit un program factorial cu două variabile
(X1 X2) a cărei matrice experimentală este prezentată in Tabelul 29 [122]
Tabel 29 Matrice experimentală a programului factorial cu 2 variabile
Nr Crt X1cod X2 cod
1 ndash1 ndash1
2 1 ndash1
3 ndash1 1
4 1 1
5 ndash1414 0
6 1414 0
7 0 ndash1414
8 0 1414
9 0 0
10 0 0
11 0 0
12 0 0
13 0 0
65
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
24 Metode de caracterizare
241 Caracterizarea structurală a suporturilor
2411 Analiza prin Spectroscopia icircn infraroşu cu transformată Fourier (FTIR)
Spectroscopia FTIR se utilizează icircn vederea determinării grupărilor funcţionale ale probei
analizate Metoda se bazează pe vibraţia legăturilor chimice rezultată icircn urma absorbţiei energiei
luminoase infraroşii la frecvenţe caracteristice FTIR este o metodă uzuală icircn stabilirea structurii
şi identificarea unui compus chimic [123]
Pentru caracterizarea probelor solide există trei metode de pregătire a probelor pastilarea
icircn prezenţa unei sări suspensia icircn nujol utilizarea unui solvent Metoda de pregătire a probelor
este aleasă icircn funcţie de natura probei de analizat de exemplu icircn cazul probelor dificil de mojarat
se va utiliza un solvent pentru pregătirea probelor Acest solvent trebuie să aibă cacirct mai puţine
benzi şi intensitatea mică (exemplu sulfura de carbon şi tetraclorura de carbon)
Icircn ceea ce priveşte suspensia icircn nujol (ulei de parafină) cacircteva miligrame de probă se
amestecă cu 1-3 picături de ulei de parafină pacircnă la obţinerea unei suspensii omogene Icircn cazul
pastilării cel mai adesea se utilizează bromura de potasiu (KBr) Aproximativ 2-3 mg probă se
mojarează şi se amestecă cu 200 mg bromură de potasiu mojararea probei fiind un aspect
important de care trebuie să se ţină cont Pulberea obţinută se va introduce icircntr-o matriţă şi se va
comprima cu ajutorul unei prese hidraulice obţinacircndu-se un disc a cărui grosime este un alt
aspect important de care trebuie să se ţine cont o grosime de aproximativ 1 mm fiind
recomandată pentru rezultate cacirct mai bune [124]
Suporturile obţinute au fost pregătite pentru analiza FTIR prin metoda pastilării cu KBr
2412 Spectroscopia de raze x prin dispersie de energie (EDS)
Icircn general dispozitivele pentru microscopia electronică de baleiaj (SEM) sunt echipate cu
un spectroscop de raze X cu dispersie de energie (EDS) șisau un Spectroscop cu raze X cu
dispersie pe lungime de undă (WDS) utile pentru analiza elementală sau caracterizarea chimică
Atacirct EDS cacirct și WDS se bazează pe detectarea și investigarea razelor X caracteristice produse de
electronii primari Icircn timpul iradierii un electron din stratul intern al atomul țintă poate fi scos
66
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
din icircnvelișul electronic rezultacircnd o gaură de electroni Ulterior un electron din straturile
exterioare va umple gaura iar diferența de energie dintre electronii din icircnvelișul intern și cei din
icircnvelișul extern va fi emisă sub formă de rază X Deoarece energia acestei razei X este
caracteristică structurii atomice a elementului din care este emisă prin măsurarea cantității și a
energiei razele X emise dintr-un eșantion se poate determina compoziția elementală a probei
EDS este o metodă utilizată cel mai adesea pentru analiza de suprafața a unui material [125]
Pentru analiza probelor s-a utilizat un microscop electronic cu scanare SEM model VEGA
II LSH produs de firma TESCAN Cehia cuplat cu un detector EDX tip QUANTAX QX2
produs de firma BRUKERROENTEC Germania
2413 Difracţie cu raze X (XRD)
Spectrul XRD a fost icircnregistrat utilizacircnd aparatul XRD-6000 SHIMADZU (figura 22)
Difracţia cu raze X este o metodă simplă şi uşor de realizat pentru analiza fazei cristaline a
probelor oferind totodată şi date despre dimensiune şi orientarea cristalelor acesteia
Figura 22 Difractometru de raze X [126]
Principiul de bază al acestei metode implică cuantificarea precisă a lărgimii picurilor de
difracţie Plecacircnd de la acest principiu s-au dezvoltat mai multe tehnici pentru estimarea fazei
67
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
anorganice formate şi a dimensiunii cristalelor cele mai icircntacirclnite icircn literatură fiind ecuaţia lui
Scherrer analiza lui Hall-Williamson şi metoda Fourier a lui Warren-Averbach [127]
Pentru identificarea fazelor anorganice din suporturile obţinute au fost utilizate standardele
Centrului Internaţional pentru Difracţie (JCPDS)
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM)
Microscopia electronică de baleiaj se utilizează pentru a studia icircn detaliu suprafaţa
probelor Datele SEM sunt foarte importante deoarece oferă informaţii despre morfologia
probelor ce are o influenţă remarcabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale acestora (gradul de
retenţie a fluidelor biologic simulate proprietăţile mecanice adeziunea şi proliferarea celulară
etc) Icircn vederea studiului morfologiei suporturilor obţinute s-a utilizat microscopul TESCAN
VEGA SBH II prezentat icircn figura 23 Tensiunea de lucru a fost de 30 kV
Figura 23 Microscopul TESCAN VEGA SBH II [128]
Analiza constă icircn scanarea suprafaţei probelor de către un fascicul de electroni de energie
icircnaltă fascicul ce porneşte dintr-un filament de tungsten aflat icircn structura microscopului Icircnainte
68
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
de a fi analizate probele trebuie să se acoperite cu un film subţire de aur sau platină pentru un
contrast icircmbunăţit Pe măsură ce fasciculul de electroni trece de-a lungul probei interacţiunea
dintre probă şi fascicul are drept rezultat diferite tipuri de semnale de electroni emise la suprafaţa
probei sau icircn apropierea acesteia Semnalele sunt culese procesate şi redate pe un monitor ca şi
pixeli ceea ce duce la formarea unei imagini a suprafeţei probei imagine ce apare
tridimensională [129]
2422 Micro computer-tomografia (microCT)
Micro-computer tomografia (microCT) este o analiză de icircnaltă precizie a morfologiei
suporturilor oferind date precise şi informații despre dimensiunea şi distribuţia porilor icircntr-un
suport Tehnica este asemănătoare cu cea utilizată icircn sistemele de tomografie cu raze X folosite
icircn medicină doar că are o rezoluţie mult mai bună Această tehnică studiază interiorul suportului
icircn mare detaliu fără a fi utilizate substanţe toxice sau fără a fi necesară o pregătire specială a
probei Astfel după scanare proba intactă poate fi analizată prin alte tehnici
Icircn timpul scanării micro CT proba este icircmpărțită icircntr-o serie de secţiuni transversale 2D
care sunt iradiate din margine cu raze X La trecerea prin secţiune razele X sunt atenuate iar
razele X emergente avacircnd intensități reduse sunt capturate de un detector din componenţa micro-
computer tomografului Traictoriile razelor X sunt calculate și coeficienții de atenuare sunt
derivați O hartă bidimensională cu pixeli este creată utilizacircnd datele obţinute și fiecare pixel este
notat cu o valoare de prag care corespunde atenuării coeficientul măsurat la un punct similar icircn
interiorul specimen Deoarece coeficientul de atenuare este corelat cu densitatea materialului
hărțile 2D rezultate oferă o imagine a fazelor materialului analizat Calitatea imaginilor obţinute
este dependentă de rezoluţia de scanare care este cuprinsă icircntre 1 şi 50 microm precum şi de
software-ul utilizat [130]
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor
Testul de compresiune a fost realizat cu ajutorul dispozitivului Texture Analyzer
TAXTplus Dispozitivul poate fi utilizat pentru teste fundamentale sau empirice cum ar fi cele
legate de analiza texturii ştiinţa materialelor şi reologia solidelor semi-solidelor lichidelor
vacircscoase pudrelor sau materialelor granulate Numeroase proprietăţi pot fi analizate cu ajutorul
69
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
acestui dispozitiv dintre care enumerăm duritate fragilitatea aderența rezistența la tracțiune
extensibilitate Icircn funcţie de proprietate testată şi tipul probei dispozitivul are o serie de
platforme şi accesorii Pentru testul de compresiune la dispozitiv se va ataşa platforma pentru
greutate mare (figura 24)
Figura 24 Ansamblu pentru testul de compresiune Texture Analyzer TAXTplus [131]
Datele sunt achiziționate de software-ul Exponent icircn timpul procedurii şi prezentate sub
formă de grafice ce oferă detalii despre comportamentul fiecărei probe la forţe specificate
Dispozitivul este utilizat icircn numeroase domenii alimentar farmaceutic cosmetic medical etc
Accesoriile ce se ataşează de partea de sus a dispozitivului printr-un adaptor special pot
avea forme diverse Majoritatea au formă cilindrică și suprafața de acțiune plată cu diametrul
cuprins icircntre 2 mm şi 50 mm şi sunt realizate din diverse materiale oţel inoxidabil aluminiu
polioximetilenă (cunoscut şi sub denumirea de poliacetal şi comercializat sub marca Delrin) şi
poli (metacrilat de metil) sub denumirea comercială Perspex Atacirct diametrul variabil cacirct şi faptul
că sunt realizate din patru tipuri diferite de material fac posibilă utilizarea pentru numeroase teste
a unor probe diferite [132]
Pentru realizarea testului de compresiune a suporturilor obţinute s-a utilizat accesoriul
cilindric fabricat din aluminiu cu diametrul de 1 inch (337 mm) Suporturile au fost tăiate icircn
70
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
fragmente aproximativ egale iar după ce s-au determinat dimensiunile au fost supuse testului de
compresiune folosind următorii parametrii
viteza de pre-test ndash 01 mmsec
viteza de testare ndash 05 mmsec
distanța de icircntoarcere ndash 6 mm
Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru fiecare
fragment s-au calculat
A = L times l ( ) (9)
unde A este aria probei L este lungimea probei iar l este lățimea probei
F =
(N) (10)
unde Fmax este valoarea forţei măsurată de dispozitiv iar F este forţa de greutate
(11)
unde σ este rezistenţa la compresiune iar icircn final s-a calculat modulul de elasticitate icircntacirclnit
adesea icircn literatură sub denumirea de modulul lui Young (Legea lui Hooke)
(12)
unde ε este deformarea
244 Propritățile magnetice ale suporturilor
Susceptibilitatea magnetică este o măsură a proprietăţilor magnetice a unui material
Această mărime este o constantă adimensională ce indică gradul de magnetizare a unui material
ca răspuns la aplicarea unui cacircmp magentic
Icircn literatură se mai icircntacirclneşte şi termenul de magnetizare şi reprezintă raportul dintre
momentul magnetic şi densitatea de flux magentic Există trei mărimi ale susceptibilităţii
magnetice susceptibilitatea magnetică de masă susceptibilitatea magnetică molară şi
71
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
susceptibilitatea magnetică de volum Susceptibilitatea magnetică de volum se mai numeşte şi
permeabilitatea [133]
Susceptibilitatea magnetică a suporturilor notată cu χm a fost determinată utilizacircnd balanţa
de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto prezentată icircn figura 25
Figura 25 Balanţa de susceptibilitate magnetic Sherwood Scientific MSB Auto [134]
Dacă valoarea obţinută este pozitivă atunci materialul se numeşte paramagnetic iar dacă
este negativă se numeşte diamagnetic [135] Măsurarea susceptibilităţii magnetice s-a făcut la o
intensitatea a campului magnetic H= 45 kGauss (1 Gauss = 1 Oestred) Cunoscacircnd valorile
susceptibilităţii magnetice a unui material se poate calcula magnetizarea acestuia notată cu M
utilizacircnd formula
χm∙H (emug) (13)
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic
Acestă analiză este foarte importantă pentru că oferă informaţii despre cantitatea de fluide
reţinute de suporturi in vitro Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes
biologic s-a realizat cu ajutorul metodei volumetrice prin contactul suporturilor cu soluție PBS
și cu o soluție SBF icircn paralel
72
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Un fragment din suportul analizat a fost pus icircn contact cu PBSSBF pH=72 001 M icircntr-o
microcoloană QIAquickregSpin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o seringă de 1 ml prin
intermediul unei membrane de silicon (figura 26)
Figura 26 Ansamblu de dispozitive utilizat pentru determinarea gradului de retenţie maxim
Dispozitivele au fost incubate la 37degC pentru un interval de timp determinat după care s-a
stabilit volumul de soluţie reţinut de fiecare probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim
notat GRmax utilizacircnd formula
GRmax =
times100 () (14)
unde mf=mi+mabs mabs reprezintă masa de solvent absorbită după intervalul de timp stabilit
iar mi este masa iniţială a probei Densitatea PBS-ului respectiv a SBF-ului se consideră avacircnd
valoarea 1
246 Studii de degradare enzimatică in vitro
Suporturile pe bază de biopolimeri pentru ingineria tisulară şi regenerarea ţesutului osos
sunt degradate in vivo de către enzime icircn mod particular cum ar fi de exemplu hialuronidaza
pentru acidul hialuronic lizozimul pentru chitosan şi colagenaza pentru colagen şi gelatină
Pentru a studia şi cuantifica procesul de biodegradarea al suporturilor pentru ingineria tisulară icircn
literatură există două metode
73
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- metoda directă prin care se cacircntăreşte suport analizat icircnainte şi după ce este supus
procesului de degradare pentru un anumit interval de timp şi se face raportul dintre
greutatea iniţială şi greutatea finală
- metoda indirectă prin care se analizează compuşii rezultaţi icircn urma procesului de
degradare [136]
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd fie lizozim
(enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al chitosanului icircn organismul uman) fie un
complex de lizozim și colagenază (enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al
colagenului icircn organismul uman) Primul pas a fost imersarea unui fragment din fiecare probă
icircntr-un volum de PBS cu lizozim (1200 μgml) sau lizozim cu colagenază (100 μgml) aflată
icircntr-o membrană de dializă introdusă apoi icircn soluţie PBS fără enzime Probele au fost apoi
incubate la 37degC iar la anumite intervale de timp un volum din soluţia de PBS icircn care este
imersată membrana de dializă cu proba de analizat a fost extras şi analizat
Determinarea concentrației de chitosan degradat
Cs este predominat degradat de enzime care hidrolizează legăturile glucozamină ndash
glucoazamină glucozamină ndash N-acetil-glucozamină şi N-acetil-glucozamină ndash N-acetil-
glucozamină Lizozimul şi enzimele bacteriene din colon sunt principalele enzime implicate icircn
procesul de degradare al Cs-ului Lizozimul poate hidroliza atacirct chitina cacirct şi Cs viteza de
degradare fiind invers proporţională cu cristalinitatea polimerilor şi cu gradul de deacetilare al
Cs-ului Icircn corpul uman lizozimul se găseşte icircn diferite concentraţii icircn ser lacrimi salivă şi
urină unde are activitate antibacteriană importantă
Figura 27 Ruperea legăturii β-(1-4) glicozidică din structura chitosanului de către lizozim
74
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Chiar dacă lizozimul din corpul uman este diferit din punct de vedere structural de cel
utilizat icircn testele in vitro studiile au demonstrat că are activitate similară icircn procesul de
biodegradare al chitosanului Activitatea lizozimului creşte o dată cu creşterea gradului de
acetilare al chitosanului sugeracircnd că la locul de acţiune al lizozimului trebuie să existe un minim
de unităţi acetilate pentru a se obţine o rată de degradare iniţială maximă Lizozimul este prezent
icircn mod natural icircn serul uman salivă și alte fluide hidrolizacircnd legătura β-(1-4) glicozidică dintre
N-acetilglucozamină (NAGA) și reziduri ale acidului N-acetil-muramic ce se depun pe pereții
celulei bacteriei [137]
Icircn ceea ce priveşte analiza concentraţiei de chitosan degradat s-a determinat cantitatea de
produşi de biodegradare enzimatică prin evaluarea complexului format cu o soluţie de
K3Fe(CN)6 Soluţia de fericanură de potasiu s-a obţinut prin solubilizarea a 05 g K3Fe(CN)6 icircn
1000 ml de 05 M Na2CO3
1 ml extras din probele de analizat s-a incubat cu 4 ml de K3Fe(CN)6 icircntr-o eprubetă icircn apă
adusă la fierbere timp de 15 minute Soluţia din eprubete s-a răcit la temperatura camerei s-a
transferat icircntr-un flacon de 25 ml s-a adus la semn cu soluţie carbonat de sodiu 05 M după care
s-a citit absorbanţa soluţiei la spectrofotometru UV-VIS la o lungime de undă de 420 nm
Concentraţia de chitosan degradat s-a calculat utilizacircnd o curbă etalon (figura 28)
Figura 28 Curba etalon pentru determinarea concentraţie de chitosan degradat
y = -92591x + 02402 Rsup2 = 09964
0
005
01
015
02
025
0 0004 0008 0012 0016 002 0024
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația N-acetil-D-glucozamină ()
75
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Pentru realizarea curbei etalon s-a preparat o soluţie de N-acetil-D-glucozamină de
concentraţie 002 după care s-au realizat 10 diluţii şi s-a determinat absorbanţa fiecărei soluţii
utilizacircnd aceaşi metodă spectofotometrică menţionată anterior
Determinarea concentrației de colagen degradat
Ninhidrina este o pulbere albă si cristalină solubilă icircn apă si alcool Reacţiile ninhidrinei
utilizacircnd tehnici manuale sau automate sunt folosite pentru analiza şi caracterizarea amino-
acizilor peptidelor proteinelor precum şi a unui număr mare de compuşi icircn numeroase domenii
biomedical clinic alimentar microbiologic histochimic şi altele Icircn ceea ce priveşte
caracterizarea proteinelor icircn urma reacţiei ninhidrinei cu grupările amino rezultă cromoforul
ninhidrinei icircntalnit icircn literatură sub denumirea de violet Ruhemann ndash RP (figura 29) după
numele cerecetătorului care a descoperit reacţia icircn 1910 ce absoarbe radiaţia luminoasă la o
lungime de undă de 570 nm Icircn unele cazuri cantitatea de cromofor formată nu e
stoechiometrică de aceea pentru obţinerea unor rezultate reproductibile icircn reacţie se introduce
un agent reducător cum este de exemplu SnCl2 ce are ca rezultat creșterea intensităţii culorii
[138]
Figura 29 Reacţia dintre ninhidrină şi aminoacizi
Reactivul de ninhdrină s-a preparat prin solubilizarea a 0283times10-3
moli de SnCl2∙2H2O icircn
500mL soluţie tampon citrat-fosfat pH = 5 urmat de adăugarea a 500 mL de 2-metoxietanol care
conţine 20 g de ninhidrină 1 mL extras din probele de analizat probă s-a incubat cu 5 ml reactiv
ninhidrinăicircntr-o eprubetă icircn apă adusă la fierbere timp de 20 minute Soluţia s-a răcit imediat
latemperatura camerei apoi s-au adăugat 20 ml de soluţie amestec apă distilată2 - propanol
(11) Absorbanţa a fost măsurată la 570 nm in celulă de cuarţ cu spectrofotometrul UV-VIS
76
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Curba de calibrare pentru determinarea concentraţiei de grupări NH2 terminale din colagen s-a
realizat utilizacircnd glicină (figura 210)
Figura 210 Curba etalon pentru determinarea concentraţiei de colagen degradat
247 Teste de citotoxicitate in vitro
Un material realizat cu scopul de a fi utilizat icircn contact direct cu un ţestut viu trebuie să fie
obligatoriu citocompatibil Primele teste ce trebuie realizate pentru a analiza această
caracteristică sunt testele in vitro de biocompatibilitate pe culturi de celule Doar după testări
riguroase a unui material pe diverse culturi de celule se poate merge mai departe la realizarea de
teste de citotoxicitate in vivo
Icircntr-un laborator de culturi de celule conservarea celulelor primare sau a liniilor celulare
este o condiţie esenţială deoarece permite atacirct păstrarea calităţii materialului biologic cacirct şi o
organizare eficientă a activităţilor De aceea celulele primare şi liniile celulare sunt criostocate
fie la -86degC fie la -196degC icircn prezenţa de soluţii crioprotectoare evitacircndu-se astfel formarea
cristalelor de gheaţă
Celule care au fost utilizate pentru a testa in vitro biocompatibilitatea suporturilor obţinute
au fost păstrate la -86degC utilizacircndu-se drept agent crioprotectant dimetilsulfoxid ndash DMSO
Suporturile au fost testate pe mai multe linii celulare
- fibroblaste primare NHDF LONZA
- celule stem isolate din ţesut adipos de iepure
y = 16194x + 00799 Rsup2 = 09968
0
01
02
03
04
05
0 00005 0001 00015 0002 00025
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația de glicină ()
77
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- pre-osteoblaste din linia celulară MC-3T3
- osteoblaste din linia celulară MG-63 (celule tumorale)
Prima etapă pentru realizarea unui test de biocompatibilitatea a fost dezgheţarea celulelor
Icircn funcţie de numărul de material testate şi de tipul plăcilor de cultură utilizate s-au folosit fie
flacoane de cultură medii cu suprafaţa de cultură de 75 cm2 fie flacoane de cultură mari cu
suprafaţa de cultură de 175 cm2 Flacoanele s-au incubat(la 37degC 55 CO2 şi umiditate relative
96) cu un anumit volum de mediu de cultură complet (mediu de cultură care se suplimentează
cu 10BFS şi 1 PSN) icircn funcţie de dimensiunea flaconului cu aproxiamtiv 2 ore icircnainte de
dezgheţarea celulelor Criotubul s-a scos de la -86degC s-a imersat rapid icircn apă avacircnd temperatura
37degC şi s-a agitat uşor pacircnă la dezgheţare completă Celule din criotub s-au centrifugat cu mediu
de cultură complet pentru icircndepărtarea agentului crioprotectant după care supernatantul s-a
icircnlocuit cu mediu de cultură complet După ce s-au numărat celulele s-a adăugat icircn flaconul de
cultură un volum potrivit de suspensie celulară Mediul de cultură din flacon a fost icircnlocuit zilnic
cu mediu proaspăt pacircnă la formarea unui monostrat confluent
După formarea monostratului următoare etapă a fost popularea cu celule a plăcilor de
cultură pe care au fost testate suporturile Pentru a desprinde celulele din flacon şi a realiza o
suspensie celulară s-a utilizat o soluţie de tripsină 025 EDTA 002 Icircnainte de adăugarea
soluţie tripsinăEDTA s-a icircndepărtat mediului de cultură din flacon iar apoi suprafaţa de cultură
a fost spălată de cateva ori cu HBSS cu roşu fenol fără calciu pentru a fi icircndepărtate urmele de
mediu care ar icircngreuna acţiunea tripsinei După centrifugare cu mediu de cultură complet icircn
vederea icircndepărtării resturilor de tripsină s-a icircnlocuit supernatantul cu mediu complet după care
s-au numărat celulele cu ajutorul unei camere de numărat celule Neubauer s-a realizat o
suspensie de celule icircn mediu complet după care s-a distribuit icircn fiecare godeu al plăcilor de
cultură un anumit volum de suspensie conţinacircnd numărul de celule calculat icircn funcţie de tipul de
celule şi numărul de godeuri al plăcilor de cultură
Icircn funcţie de tipul materialului analizat (pudre nanoparticule emulsii suporturi compacte
suporturi poroase etc) se pot realiza teste de biocompatibilitate prin contact direct prin metoda
eluţiei (contact indirect) sau prin metoda difuziei Contactul direct presupune adăugarea propriu-
zisă a fragmentelor din materialul testat icircn godeurile plăcilor de cultură cultivate cu celule
contactul indirect presupune adăugarea unui extract din materialul analizat analizacircndu-se de cele
mai multe ori diverse concentraţii ale extractului iar metoda difuziei constă icircn acţiunea
78
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
compusului analizat asupra celulelor printr-un strat de gel de agaroză ce acoperă cultura de
celule Suporturile obţinute icircn studiul de faţă au fost analizate prin contact direct şi prin contact
indirect [139]
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare după ce suporturile au fost sterilizate
fragmente de suportextract de suport au fost puse pe plăcile de cultură conţinacircnd celule ce au
fost incubate icircn placi cu 24 ore icircnainte
Testele realizate pentru studiul biocompatibilităţii suporuturilor au fost testul MTT la 24
48 și 72 ore de contact şi testul de viabilitate celulară cu Calceina-AM
2471 Testul MTT
Pentru realizarea testului MTT ndash [bromură de (3-[45-dimetiltiazol-2-il]-25-difenil)
tetrazoliu] fragmentele de material au fost extrase şi mediul de cultură icircnlocuit cu soluție de
lucru MTT (MTT 5 icircn mediu de cultură fără BFS şi amestec de antibiotice) Testul MTT se
bazează pe capacitatea celulelor viabile cu metabolism activ să reducă MTT-ul icircn cristale de
formazan de culoare albastru-violet (figura 211) [140]
Figura 211 Structura bromurii de tetrazolium MTT şi a produsului redus formazan
Celulele cu soluția MTT au fost incubate la 37degC pentru un anumit interval de timp icircn
funcţie de tipul de celule după care s-a extras soluţia MTT cristalele de formazan formate fiind
solubilizate cu alcool izopropilic Absorbanța soluției de formazan rezultată (culoare albastru-
violet) a fost măsurată spectrofotometric la λ=570nm cu ajutorul unui cititor de plăci (Tecan
Sun-rise Plate Reader) Rezultatele citirii spectrofotometrice din godeurile experimentale au fost
79
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
raportate la godeurile de control icircn care nu au fost prezente fragmente de materialextract
Raportul calculat a constituit viabilitatea celulară (V)
V =
(15)
unde abs suport este absorbanța din godeul conţinacircnd fragment de suportextract iar abs control
este absorbanța controlului
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Calceina AM este un colorant care are capacitatea de a colora icircn verde doar celule viabile
icircn mod particular citoplasma acestora După ce pătrunde icircn celulă calceina AM substanţă
incoloră este hidrolizată de esteraza din citoplasmă icircntr-un produs verde fluorescent (figura
212) [139] Pentru realizarea testului mediul de cultură din godeuri a fost extras iar apoi celule
au fost spălate de două ori cu HBSS cu calciu fără roşu fenol Icircn final s-a adăugat soluţie de
calceină (1-2 microL calceină la 1 mL HBSS cu calciu fără roşu fenol) iar placa de cultura a fost
introdusă icircn incubator pentru 20 min După cele 20 min celulele s-au vizualizat la microscop
confocal cu fluorescenţă (Leica Germania) şi s-au preluat imagini Testul s-a realizat la intervale
de timp diferite icircn funcţie de metoda de contact şi tipul celulelor
Figura 212 Schema de legare a Caleinei ndash AM la celulele viabile
80
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
248 Teste de citotoxicitatea in vivo
Pentru a demonstra siguranța unui material medical după o caracterizare riguroasă acesta
trebuie testat din punct de vedere al citotoxicității in vivo
Testele de citotoxicitate in vivo au fost realizate conform recomandărilor ISO Standard
10993 la Facultate de Medicină Veterinară din Iaşi sub coordonarea domnului Prof Dr Mareş
Mihai Studiile au fost realizate conform Directivei UE 632010 și cu acordul comitetului de
etică din cadrul instituției
S-au utilizat șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie
de 28 plusmn 3 grame materialul biologic provenind din Biobaza INCDMI Cantacuzino București
- filiala Băneasa Animalele au fost ţinute icircn condiții zooigienice corespunzătoare speciei și
vacircrstei temperatură și umiditate constante regim de iluminare 12 orezi acces liber la hrană
(furaj combinat complex) manipularea animalelor fiind făcută cu blacircndețe fără a le produce
stres sau durere Cu 3 zile icircnainte de icircnceperea experimentului animalele au fost mutate icircn
laborator pentru a se acomoda cu mediul ambiant
Pentru implant materialele au fost secționate sub diverse forme pătrate sau discuri apoi
au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 4 ore Animalele au fost grupate
icircn loturi icircn funcţie de numărul de suporturi analizate fiecare lot cuprinzacircnd un anumit număr de
animale
Icircnainte de intervenția chirurgicală zona de implant a fost tunsă și aseptizată cu betadină
soluție cutanată 10 Implantarea fragmentelor de suporturi s-a realizat subcutanat icircn condiții
aseptice prin incizia sterilă a pielii din regiunea dorsală a șoarecilor Inducția anestezică (15-30
de secunde) s-a realizat cu isofluran 4 iar pentru a se asigura liniștea intraoperatorie pe
parcursul a 15 minute (timp necesar inciziei depunerii fragmentului de suport și suturii pielii) a
fost utilizată concentrația de 15
Durata experimentului a fost diferită icircn funcție de lotul de suporturi testate După
sacrificarea animalelor s-au efectuat examene histopatologice Icircn vederea realizării preparatelor
microscopice fragmentele de țesut (cu sau fară material) au fost fixate icircn soluţie de formaldehidă
10 timp de 7 zile şi apoi incluse icircn blocuri de parafină prin metoda rapidă de includere
Blocurile de parafină au fost secţionate apoi icircn secţiuni de 5 microm cu ajutorul microtomului de
laborator Secţiunile rezultate au fost etalate pe lame histologice cu ajutorul albuminei Mayer
81
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
colorate Tricromic Masson și examinate microscopic Preparatele au fost examinate la microscop
şi interpretate
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
La nivel mondial cancerul rămacircne a doua cea mai comună cauză de deces icircn ciuda
icircncercărilor avansate de prevenție diagnosticării icircn stadiu incipient și a protocoalelor de
tratament riguroase [141] Icircn ceea ce privește tumorile osoase acestea sunt diagnosticate icircn
special la pacienți adulți sau vacircrstnici excepție făcacircnd osteosarcomul tumoră icircntacirclnită
preponderent la pacienți cu vacircrste cuprinse icircntre 10 și 20 și destul de rar la vacircrstnici
Icircn unele cazuri tratamentul tumorilor osoase maligne are drept primă etapă rezecția
chirurgicală a tumorii iar icircn a doua etapă pacientul urmează ședințe de radioterapie Cele două
tehnici nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral chimioterapia precedacircndu-le de regulă
Plecacircnd de la această schemă de tratament s-au realizat studii privind potențiala aplicație a
suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircntr-o primă fază suporturile au fost expuse la raze X după care au fost caracterizate din
punct de vedere fizico-chimic și biologic icircn vederea analizei influenței radiațiilor asupra
proprietăților suporturilor
Iradierea suporturilor cu raze X s-a realizat cu ajutorul dispozitivului CT-Sim Siemens
Somatom Definition figura 213 Deoarce grosimea materialului iradiat a fost de aproximativ 12
mm acesta a fost fixat pe un suport de 5 mm a cărui dimensiune a fost inclusă icircn calculul
parametrilor de iradiere
Figura 213 Dispozitivul CT-Sim Siemens Somatom Definition (stacircnga)Simularea CT
(dreapta)
82
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi
Sistemele de eliberare controlată de medicamente sunt studiate pentru tratamentul
alternativ a unor tipuri diferite de cancer Cele mai studiate sisteme sunt cele pe bază de polimeri
ceramice sau compozite ale acetora Polimerii cei mai utilizați la realizarea de sisteme de
eliberare sunt polietilen glicolul (PEG) polietilen oxidul poli (caprolactona) chitosanul
alginatul alcoolul polivinilic polimetil metacrilatul celuloza etc Și unele proteine
preponderant colagenul sunt utilizate pentru realizarea de sisteme de eliberare controlată dar
instabilitate lor chimică și fizică ridică anumite probleme tehnice [141]
Doxorubicina a fost medicamentul chimioterapic avut icircn vedere pentru studiul de față
Pentru prepararea de suporturilor cu potențial de utilizare ca sistem de eliberare de medicament
icircntr-o suspensie coloidală de nanoparticule magnetice (1 ) obținute conform protocolului
descris anterior (subcaptiol 231) s-a solubilizat 0125 doxorubicină Nanoparticulele
icircncărcate cu medicament au fost folosite la prepararea de suporturi după protocolul descris icircn
subcapitolul 23
Eliberarea in vitro a medicamentului a fost studiată cu atenție Primul pas a fost imersarea
a 20 mg din fiecare probă icircn PBS pH = 72 001M icircntr-o memebrană de dializă care a fost
complet imersată icircntr-un alt volum de PBS Studiul de eliberare a fost efectuat la 37ordmC pe o
perioadă de 14 zile La anumite intervale de timp un volum de PBS icircn care a fost imersată
membrana de dializă a fost extras pentru analiza UV-Vis și icircnlocuit cu același volum de PBS
proaspăt Absorbanța fiecărui volum de PBS extras a fost analizată utilizacircnd spectrofotometrul
NanoDrop ND 1000 (Thermo Fisher) la 480 nm Pentru trasarea curbei etalon s-au preparat
soluţii de diferite concentraţii de medicament (pe domeniul 1 microg ndash 10 microg) icircn PBS
83
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe
bază de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic
gelatină) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și apatite hidroxiapatite sau alți fosfați de
calciu cu aplicații icircn ingineria tisualră a țesutului osos sunt studiate icircn detaliu de aproape două
decenii Imitarea matricei extracelulare a țesuturilor umane a devenit o provocare pentru
ingineria tisulară datorită complexității sale fizice chimice și biologice prin urmare este
esențială alegerea biopolimerilor care să satisfacă criterii de compatibilitate chimică
biocompabibiltate biodegradabilitate controlată Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul
biologic și degradați metabolic Chitosanul colagenul gelatina alginatul condroitin sulfatul și
acidul hialuronic sunt printre cei mai studiați biopolimeri datorită argumentelor menționate
anterior și a similarității lor cu componentele matricei extracelulare [142-144]
Chitosanul ndash Cs un biopolimeri foarte versatil este unul din cei mai studiaţi pentru
ingineria tisulară a țesutului osos datorită proprietăţilor sale remarcabile biocompatibilitate
biodegradabilitate proprietăţi antibacteriene hemostatice şi antitumorale [55 56 145-148] De
asemenea susţine in vitro adeziunea şi proliferarea celulară a osteoblastelor precum şi formarea
de matrice osoasă mineralizat [149] Icircn ceea ce priveşte comportamentul in vivo un număr
semnificativ de studii au demonstrat faptul că suporturile pe bază de chitosan susţin
osteoconductivitatea icircn defecte osoase obţinute chirurgical [150]
Gelatina ndash G proteină derivată din colagen este un biopolimer degradabil cu
biocompatibilitate excelentă adesea utilizată icircn domeniile biomedical şi farmaceutic Icircn
combinaţie cu alţi biopolimeri adesea cu chitosanul gelatina contribuie la creşterea adeziunii
celulare [151] [152]
Acidul hialuronic ndash Hya susţine regenerarea tisulară la locul defectelor osoase prin
stimularea formării de calus [153] De asemenea rezultatele unor studii in vitro și in vivo au
sugerat o legătură icircntre creștere sintezei de acid hialuronic după tratatamentul cu parathormon și
resorbția osoasă ulterioară ceea ce ar putea indica o posibilă relație icircntre sinteza biopolimerului
și creșterea activității osteoclastelor [154]
Studiile icircn domeniu au evidenţiat faptul că o concentraţie scăzută de albumină serică
bovină ndash Bsa poate susţine mineralizarea ţesutului osos prin stimularea creşterii cristalelor de
84
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
fosfaţi de calciu [155] [156] icircn schimb o concentraţie mare de albumină poate chiar inhiba
creşterea lor [157]
Avacircnd icircn vedere proprietăţile menţionate mai sus ale celor patru biopolimeri (chitosan
acid hialuronic gelatină şi albumină) s-a emis ipoteza că prin realizarea unor combinații ale
acestora cu fosfați de calciu și particule magnetice se pot obține suporturi magnetice cu
performanțe crescute icircn regnerarea tisulară osoasă (Figura 31)
Figura 31 Suporturi pe bază de biopolimeri fosfați de calciu și nanoparticule magentice
Fosfații de calciu componenta fazei anorganice a țesutului osos uman stimulează
osteoconductivitatea și osteoinductivitatea Importanța utilizării nanoparticulelor magnetice icircn
suporturi compozite pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost detaliată icircn capitolul 1
Alegerea unei concentrații de nanoparticule adecvată este o provocare o concentrație prea mică
poate avea riscul de a nu conferi proprietăți magnetice suportului icircn care sunt incluse iar o
concentrație prea mare poate duce la un eventual caracter citotoxic al suportului Studiile icircn
85
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
domeniu prezintă prepararea de suporturi magnetice ce au icircncoporate concentrații diferite de
particule 05 1 2 3 7 5 sau 10 [9091 92] etc
Pentru a putea concluziona care ar fi concentrația optimă de particule introdusă icircn sinteză
s-au selectat trei concentraţii diferite de particule magentice 1 3 și 5 astfel icircncacirct să se
evite efectele toxice menținacircndu-le pe cele magnetice icircn domeniile terapeutice
31 Obţinerea suporturilor
Suporturile s-au obţinut printr-o metodă biomimetică de co-precipitare a fosfaţilor de
calciu din precursorii săi icircn prezențicirc de biopolimeri și particule magnetice Astfel soluții de
Ca(NO₃)₂∙4H2O(40 icircn apă distilată) şi NaH2PO4middotH2O (25 icircn apă distilată) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri (Cs (1 icircn soluție 15 HCl) Hya (2 in apă distilată)
Bsa (2 in apă distilată) G (2 in apă distilată)) Soluţia de Cs (1) a fost obţinută prin
dizolvare de Cs icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Separat s-au adăugat soluții de Hya (2)
Bsa (2) și G (2) (icircn apă distilată) astfel icircncacirct concentraţia să fie 10 faţă de cantitatea totală
de chitosan introdusă icircn sinteză Icircn fiecare amestec de biopolimercombinaţii de biopolimeri şi
precursori de fosfaţi de calciu s-au integrat concentraţii diferite de particule magnetice 1 3
şi 5 raportat faţă de cantitatea de substanţă uscată introdusă icircn procesul de sinteză pH-ul
amestecului final a fost ajustat la 72-74 prin adaos de soluţie de amoniac NH4OH (25 )
Raportul CaP a fost menținut la 165 icircn toate suporturile valoare comparabilă cu cea din ţesutul
osos uman [158]
Fiecare amestec compozit a fost spălat de 3 ori cu apă distilată separat prin centrifugare
(5000 rpm 10 minute) iar ultimul pas a constat icircn liofilizarea amestecurilor timp de 24 h
Cele patru tipuri diferite de suporturi au fost codificate icircn funcţie de compoziţia lor după
cum se observă icircn tabelul 31
Tabel 31 Compoziţia şi codificarea suporturilor
Denumirea
Suportului
ChitosanAlt biopolimer Concentraţia de
MNPs
Cs 1
Cs
1
Cs 3 3
Cs 5 5
Cs-Hya 1 Cs-Hya 1
86
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs-Hya 3 3
Cs-Hya 5 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa
1
Cs-Bsa 3 3
Cs-Bsa 5 5
Cs-G 1
Cs-G
1
Cs-G 3 3
Cs-G 5 5
Suporturile biomimetice pe bază de diferite amestecuri de chitosan și biopolimeri
(albumină acid hialuronic gelatină) cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei (spectroscopia IR cu
transformată Fourier ndash FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de energie ndash EDS) difracţie
cu raze X (XRD) și morfologic (microscopie electronică de baleiaj ndash SEM) De asemenea s-a
urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au
analizat proprietăţile magnetice Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi
printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
32 Rezultate și discuții
321 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR picuri caracteristice
biopolimerilor din compoziţie fosfaţilor de calciu şi particulelor magnetice fiind identificate pe
spectrele FTIR (figura 32)
Icircn ceea ce priveşte spectrul FTIR al suportului Cs 3 s-au observat benzile caracteristice
Cs-ului după cum urmează gruparea -OH la 3430 cm-1
gruparea ndashCH2 la 2923 cmminus1
amida I la
1655 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii CndashN la 1322 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării
CndashO la 1029 cm-1
[159] Pentru acelaşi suport s-au mai putut observa picuri specifice grupării
fosfat PO43-
icircn regiunea 600 cm-1
[99] şi grupării FendashO din particulele magnetice la 560 cm
-1
[160]
87
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Icircn cazul suportului Cs-Bsa 3 s-a observat o creştere semnificativă a intensităţii picului
1657 cmminus1
ce corespunde amidei I drept rezultat a vibraţiei de icircntindere a grupării C=O din
legătura peptidică Picul de la numărul de undă 1546 cm-1
corespunde amidei II iar picul de la
1240 cm-1
amidei III din componenta proteică [161]
Figura 32 Spectrele FTIR ale suporturilor
Pe spectrul FTIR pentru suportul Cs-Hya 3 s-au observat următoarele picuri picul pentru
vibraţia de icircntindere a grupăriindashOH la 3422 cm-1
picul pentru gruparea -CH2 la 2923 cm-1
picul
pentru amida primară I la 1654 cm-1
picul pentru COO- la 1420 cm
-1 şi picul pentru C-O la 1029
cm-1
[162]
322 Compoziția suporturilor
Icircn figura 33 este redată difractograma XRD pentru suporturile obţinute datele XRD
oferind informaţii despre faza anorganică şi despre cristalinitatea acestora
88
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
S-au observat următoarele picuri caracteristice 303ordm 356ordm 535ordm şi 574ordm ce pot fi
associate planelor (220) (311) (422) şi (511) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF
No 65-3107) Picuri specifice fosfaţilor de calciu de la unghiurile 23ordm 26ordm 28ordm 32ordm 335ordm 40ordm
48ordm şi 50ordm sunt corelate cu planurile (121) (002) (210) (112) (300) (310) (203) (213) şi
confirmă formarea următoarelor tipuri de fosfaţi de claciu Ca(H2PO4)22H2OmCaHPO4
Ca4(HPO4)3 25 H2O respectiv Ca3H2(P2O7)24H2O [47]
De asemenea un aspect foarte important care a fost observat a fost acela că principalul tip
de fosfat de calciu format icircn structura suporturilor compozite este hidroxiapatita
(Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul de calciu cu cele mai bune proprietăţi pentru formarea de ţesut osos
Figura 33 Spectrul XRD pentru suporturile obţinute
Compoziţia chimică a suporturilor a fost studiată cu ajutorul analizei EDX rezultatele fiind
redate icircn figura 34 Principalele tipuri de fosfați de calciu identificati pe spectrele XRD și EDX
sunt prezentați icircn tabelul 32
Tabel 32 Diferite forme de CP prezente icircn compozitele Cs-CP conform datelor XRD și EDX
Forme de fosfați de
calciu Formulă chimică Raport CaP
MCPM Ca(H2PO4)2middotH2O 05
Fosfat monocalcic
anhidru Ca(H2PO4)2 05
89
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Fosfat dicalcic
anhidru CaHPO4 100
Hidroxiapatită Ca10(PO4)6(OH)2 167
Fosfat tricalcic Ca3(PO4)2 15
Figura 34 Spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3
Pe spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3 s-au observat semnale intense icircn
regiunea elementelor Ca P O C Fe ceea ce confirmă compoziţia suporturilor fosfaţi de calciu
biopolimeri particule magnetice De asemenea din datele EDX obţinute s-a calculat raportul
molar al fazei minerale dintre calciu şi fosfor rezultatele indicacircnd formarea de diferite tipuri de
fosfaţi de calciu icircn structura suporturilor evidenţiindu-se fosfatul tricalcic (CaP = 152) icircn cazul
suportului Cs-Bsa 3 şi hidroxiapatita icircn cazul suportului Cs-G 3 [163]
90
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
323 Morfologia suporturilor
Icircn figura 35 sunt prezentate datele SEM obținute pentru suporturile Cs 3 Cs-Hya 3
Cs-Bsa 3 și Cs-G 3 la diferite grade de mărire Morfologia a fost studiată icircn secţiunea
suporturilor imaginile evidenţiind o porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea
fosfaţilor de calciu pe structura polimerică Particulele magnetice sunt complet integrate icircn
structura compozită
Figura 35 Morfologia suporturilor la două ordine diferite de mărire
Suporturile sintetizate pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară a ţesutului osos trebuie să aibă o
structură poroasă specifică şi o dimensiune a porilor adecvată aplicaţiei vizate Icircn primul racircnd
porii suportului trebuie să fie interconectaţi pentru a promova adeziunea şi creşterea
osteoblastelor migrarea nutrienţilor şi vascularizarea precum şi infiltrarea icircn matricea biologică
[164] [165] Icircn ceea ce priveşte dimensiune porilor icircn literatură există date contradictorii acest
aspect fiind explicat de complexitatea procesului de regenerare osoasă in vivo Astfel unele
studii recomandă utilizarea suporturilor cu dimensiunea a porilor cuprinsă icircntr-un interval foarte
larg de la 20 microm pacircnă la 1500 microm [166] [167] alte studii recomandă o dimensiune a porilor
icircntre 150 şi 600 microm sau icircntre 400 şi 1500 microm [168]
91
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Dimensiunile porilor suporturilor sintetizate (tabel 33) au fost calculate din imaginile
SEM prin analiza cantitativă a parametrilor imaginilor utilizacircnd funcția threshold a programului
ImageJ
Pentru fiecare imagine SEM măsurătorile au fost repetate de 10 ori la final fiind calculate
dimensiunea maximă a porilor dimensiunea medie a porilor dimensiunea minimă a porilor și
deviația standard S-a observat că dimensiunile maxime ale porilor au fost icircnregistrate pentru
suportul Cs-Hya 3 iar dimensiunile minime pentru suportul Cs-Bsa 3 Cel mai mic interval
dintre minimul și maximul dimensiunilor unui suport a fost calculat pentru suportul Cs-Bsa 3
ceea ce indică că acest suport are cea mai uniformă distribuție a porilor
Tabel 33 Dimensiunea porilor (microm)
Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
Deviația
standard 99458plusmn18938 111525plusmn16967 75084plusmn9075 92383plusmn13549
Dimensiunea
minimă 398541 451762 319411 456391
Dimensiunea
maximă 1946331 213656 1121936 154929
Dimensiunea
medie 952598 988953 672699 8149395
324 Proprietăţi magnetice
Deoarece obiectivul tezei de faţă implică utilizarea de particule magnetice ce vor fi
funcţionalizate cu medicamente rolul particulelor fiind de transportori a principiilor active ce
vor fi eliberate controlat studiul proprietăţilor magnetice ale suporturilor este esenţială Pentru a
stabili concentraţia optimă de particule introduse icircn sinteză icircn acest prim studiu s-au analizat trei
concentraţii diferite Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 34
Tabel 34 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Susceptibilitatea
magnetică de
masă
Magnetizarea
(emug)
Cs 1 1 0016middot e-4
132
Cs 3 3 009middot e-4
742
92
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs 5 5 0123middot e-4
1014
Cs-Hya 1 1 0003middot e-4
025
Cs-Hya 3 3 minus minus
Cs-Hya 5 5 0152middot e-4
1253
Cs-Bsa 1 1 0027middot e-4
226
Cs-Bsa 3 3 0074middot e-4
610
Cs-Bsa 5 5 0099middot e-4
816
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de masă a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 025 şi 1253 emug au fost mai mici decacirct cele ale
particulelor magnetice (4365 emug) [160] ce nu au fost icircncorporate icircn suport sau icircn oricare altă
structură compozită complexă
Icircntr-un studiu publicat de Heidari şi colaboratorii [99] s-au obţinut şi caracterizat nano-
suporturi magnetice pe bază de chitosan şi hidroxiapatită cu o valoare a magnetizării de 304
emug măsurată la o intensitate a cacircmpului magnetic H = 5189 kOe la temperatura camerei Un
alt studiu publicat de Bock şi colaboratorii [90] prezintă sinteza şi caracterizarea de suporturi pe
bază de hidroxiapatită şi colagen cu incluziune de tipuri diferite de fero-fluide magnetice La o
intensitate a cacircmpului magnetic de 10 kOe s-au obţinut valori ale magnetizării cuprinse icircntre 12
şi 15 emug pentru toate tipurile de suporturi sintetizate S-a observat că pentru o concentrație de
1 particule magnetice valorile obținute pentru magnetizare sunt prea mici comparabile cu cele
din literatură pentru concentrația de 5 fiind obținute valorile cele mai apropiate Comparacircnd
valorile obţinute cu datele de literatură s-a putut afirma că suporturile obţinute sunt
superparamagentice
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Interacţiunea suporturilor cu fluidele de interes biologic este un aspect important icircn ceea ce
priveşte potenţialele aplicaţii ale acestora icircn domeniul ingineriei tisulare a osului Pentru
suporturile obținute s-a studiat interacțiunea suporturilor cu două fluide soluție tampon fosfat-
PBS și fluid biologic simulat - SBF
93
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de aproximativ 5 mg din fiecare suport a fost pus icircn contact cu o soluţie PBSSBF pH = 72
001M icircntr-o microcoloană QIAquickreg
Spin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o
seringă de 1 ml prin intermediul unei membrane de silicon Dispozitivele au fost incubate la
37ordmC pentru un interval de 48 ore după care s-a stabilit volumul de PBSSBF reţinut de fiecare
probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din capitolul 2
Rezultatele obţinute cu privire la acest studiu sunt redate icircn tabelul 35
Tabel 35 Gradul de retenţie PBS și SBF () al suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Gradul de
retenţie PBS
()
Grad de retenție
SBF
()
Cs 1 1 704plusmn22 680plusmn35
Cs 3 3 645plusmn12 632plusmn14
Cs 5 5 676plusmn21 530plusmn25
Cs-Hya 1 1 784plusmn24 667plusmn31
Cs-Hya 3 3 714plusmn45 630plusmn29
Cs-Hya 5 5 490plusmn22 475plusmn17
Cs-Bsa 1 1 700plusmn39 654plusmn41
Cs-Bsa 3 3 454plusmn61 567plusmn16
Cs-Bsa 5 5 806plusmn78 515plusmn20
Cs-G 1 1 465plusmn35 421plusmn34
Cs-G 3 3 805plusmn42 625plusmn09
Cs-G 5 5 755plusmn27 722plusmn15
Pentru toate suporturile s-au obţinut valori mari ale gradului de retenţie PBS () acestea
fiind cuprinse icircntre 400 şi 800 Aceste valori au fost corelate pe de o parte cu structura
poroasă tridimensională a suporturilor iar pe de altă parte cu proprietăţile hidrofile ale
biopolimerilor atribuite grupărilor lor funcţionale
Icircn cazul suporturilor icircn care matricea polimerică este reprezentată doar de chitosan s-a
observat o variaţie foarte mică a valorile gradului de retenţie cea mai mare valoare fiind
măsurată la suporturile cu o concentraţie minimă de particule magnetice Icircn schimb icircn cazul
94
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
suporturilor Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G s-a observat o influenţă semnificativă a particule magnetice
asupra gradului de retenție Astfel icircn cazul suporturilor care au Hya icircn compoziţie s-a observat o
descreştere a gradului de retenţie pe măsură ce concentraţia de particule magnetice creşte pe
cacircnd pentru suporturile ce conţin albumină s-a observat o valoare maximă a gradului de retenţie
pentru suportul cu cea mai mare concentraţie de particule magnetice Suporturile Cs-G au
valorile gradului de retenţie apropiate pentru concentraţiile de particule magnetice de 3
respectiv 5 valoarea minimă fiind icircn cazul suportului Cs-G 1
Icircn ceea ce privește interacțiunea suporturilor cu soluția SBF prezența ionilor pozitivi (Na+
K+ Ca
2+ Mg
2+) și a ionilor negativi (HPO4
2- Cl
- HCO3
2- SO4
2- ) precum și abilitatea acestora
de a interacționa cu componentele suporturilor diminuează retenția de fază apoasă a suporturilor
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea suporturilor a fost studiată in vitro icircn prezenţa lizozimului pentru o perioadă
de 16 zile rezultatele studiului fiind prezentate icircn figura 36 A fost utilizată o concentraţie de
lizozim cu valoare apropiată de concentraţia lizozimului icircn serul uman [169]
Figura 36 Degradarea suporturilor
Analizacircnd rezultatele (tabel 36) s-a observat că procesul de degradare are practic două
etape Icircn prima etapă ce corespunde primelor 8 zile a avut loc o degradare mai accentuată a
suporturilor pe cacircnd icircn a doua etapă a urmat o icircncetinire a procesului de degradare Acest proces
de degradare icircn două etape a fost prezentat şi icircn alte studii şi poate fi explicat de faptul că
02
0
4
06
0
8
Cs 1 Cs 3 Cs 5 Cs-Hya 1
Cs-Hya 3
Cs-Hya 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa 3
Cs-Bsa 5
Cs-G 1
Cs-G 3
Cs-G 5
Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat
m
moli
L
2 zile 8 zile 16 zile
95
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
lizozimul conține un loc de legare hexameric iar secvențele hexazaharidice conținacircnd 3-4 sau
mai multe unități acetilate au o puternică influenţă asupra vitezei inițiale de degradare a
chitosanului După o pierdere mare de masă inițială viteza de degradare a suporturilor a scăzut
considerabil ca rezultat al pierderii secvențelor de hexazaharidă [170]
Tabel 36 Degradarea in vitro a suporturilor icircn prezenţă de lizozim
Denumirea
suportului
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
2 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
8 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
16 zile (mmoliL)
Cs 1 04045plusmn00014 06800plusmn00042 07452plusmn00028
Cs 3 04081plusmn00007 06292plusmn00028 06727plusmn00057
Cs 5 03791plusmn00064 06510plusmn00014 07343plusmn00021
Cs-Hya 1 03574plusmn00049 05132plusmn00028 06075plusmn00014
Cs-Hya 3 03827plusmn00028 07017plusmn00028 07379plusmn00071
Cs-Hya 5 03755plusmn00064 07742plusmn00028 07814plusmn00014
Cs-Bsa 1 03175plusmn00042 05640plusmn00085 07162plusmn00028
Cs-Bsa 3 03538plusmn00028 06510plusmn00035 06655plusmn00014
Cs-Bsa 5 03538plusmn00028 06582plusmn00028 06655plusmn00014
Cs-G 1 04226plusmn00049 07669plusmn00014 07814plusmn00014
Cs-G 3 04154plusmn00007 07887plusmn00042 08032plusmn00014
Cs-G 5 05024plusmn00035 07887plusmn00014 08249plusmn00042
După cum se poate observa icircn tabelul 36 pentru toate cele patru tipuri diferite de suporturi
Cs Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G concentraţia de particule magntice adăugate nu influenţează
semnificativ degradarea acestora Pentru toate cele trei intervale de timp la care s-a analizat
concentraţia de Cs degradat cele mai mari valori au fost obţinute pentru matricile Cs-G 5
96
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
3271 Testul MTT
Pentru evaluarea citotoxicității in vitro pe culturi de celule s-a utilizat metoda contactului
indirect realizacircndu-se un extract din suporturile obținute care icircn prealabil au fost sterilizate 10
mg din suporturile Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3 au fost introduse icircntr-o membrană
de dializă conținacircnd 4 ml alcool etilic 70 membrana de dializă fiind introdusă la racircndul ei icircntr-
un flacon steril conținacircnd 25 ml alcool etilic 70 După 30 minute alcool din flacon a fost
evacuat membrana de dializă fiind lasată icircn hotă pentru evaporarea alcoolui după care a fost
spălată icircn repetate racircnduri prin imersare icircn 25 ml PBS Fiecare probă din membrană de dializă a
fost imersată icircn 4 ml mediu de cultură complet și lasată la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului După cele 24 ore extractul a fost filtrat printr-un filtru de 70 microm
după care s-a măsurat volumul rezultat şi s-au adăugat 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost adus icircn contact cu două linii celulare diferite preosteoblaste MC3T3
(figura 37) și fibroblaste din derm uman (figura 38) icircn placi de 96 godeuri fiecare godeu
conținacircnd 3000 celule Cele două tipuri de celule au fost incubate pentru 24 ore icircn mediu de
cultură DMEM conținacircnd 10 BFS și 1 PSN Mediul complet a fost icircnlocuit complet după
cele 24 ore cu 150 μL extract Testul MTT s-a realizat la 24 48 și 72 ore calculacircndu-se
viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (15) din capitolul 2
Figura 37 Viabilitatea celulară a preosteoblatelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
97
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 38 Viabilitatea celulară a fibroblastelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
După 24 ore viabilitatea preosteoblastelor a fost cuprinsă icircntre 91 (Cs 3) şi 95 (Cs-
Bsa 3) pe cacircnd viabilitatea fibroblastelor a fost icircn jur de 96 pentru toate cele patru suporturi
analizate diferenţa foarte mică de procente fiind explicată de sensibilitatea crescută a
preosteobastelor Pentru ambele linii celulare s-a observat o uşoară scădere icircn timp a viabilităţii
celulare cea mai mică valoare calculată 88 fiind pentru suportul Cs-Hya 3 după 72 de ore
de contact a extractului cu fibroblastele
Datele obţinute icircn urma testului MTT au indicat faptul că suporturile nu au eliberat
compuşi citotoxici icircnglobaţi icircn structura suporturilor icircn momentul sintezei sau neicircndepărtaţi
care să influenţeze negativ ataşarea şi proliferarea celulară
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată biocompatibilitatea suporturilor şi lipsa unor efecte adverse a
acestora asupra celulelor s-a realizat un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM rezultatele
testului fiind redate icircn figura 39 Acelaşi extract utilizat la testul MTT a fost incubat cu
fibroblaste pentru 24 respectiv 96 ore
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
98
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 39 Viabilitatea celulară icircn urma testului cu Calceină-AM
Comparacircnd imaginile reprezentacircnd celulele incubate cu extractul suporturilor Cs-Bsa 3
respectiv Cs-G 3 cu imaginile reprezentacircnd celule care au fost incubate fără extract s-a
observat că nu există diferenţe de densitate celulară la niciunul din cei doi timpi de contact ceea
ce indică lipsa efectelor adverse a suporturilor asupra fibroblastelor
Atacirct rezultatele obţinute icircn urma testului MTT cacirct şi rezultatele obţinute icircn urma testului
cu Calceină-AM au evidenţiat un comportament bun al suporturilor la contactul cu cele două linii
celulare (fibroblaste şi preosteoblaste) ceea ce a condus la concluzia că suporturilor sunt
biocompatibile in vitro
99
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
33 Concluzii
Icircn capitolul de față s-au obținut și caracterizat suporturi compozite pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de concentrații diferite de particule magentice
Chitosanul unul din biopolimeri cei mai utilizați icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost
combinat cu acid hialuronic albumină serică bovină sau gelatină
Analizacircnd structura chimică a suporturilor s-a observat icircn spectrele FTIR
prezența picurilor caracteristice tuturor componentelor introduse icircn sinteza Diferite tipuri de
fosfați de calciu au fost identificate icircn faza cristalină a suporturilor cel mai impotant dintre
aceștia fiind hidroxiapatita identificată icircn suportul Cs-G 3
Morfologia a fost studiată icircn secţiunea suporturilor imaginile evidenţiind o
porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea fosfaţilor de calciu pe structura polimerică
Particulele magnetice sunt complet integrate icircn structura compozită Dimensiunea minimă a
porilor a fost icircn jur de 300 microm iar dimensiunea maximă icircn jur de 2000 microm
Comparacircnd valorile obţinute pentru magnetizarea suporturilor cu datele de
literatură concentrația de 5 particule magnetice s-a dovedit a fi cea mai apropiată de datele
regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective De asemenea se poate afirma că suporturile sunt
superparamagnetice
Retenția fluidelor biologice simulate este influențată de morfologia suporturilor și
proprietățile hidrofile ale suporturilor iar viteza de degradare enzimatică in vitro este corelată cu
conținutul de fază polimerică
Testele de citotoxicitate in vitro indică faptul că suporturile obținute nu eliberează
substanţe citotoxice care să influenţeze negativ proliferarea celulară
100
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub
formă uscată
Icircn ingineria tisulară a ţesutului osos polizaharidele (chitosan acid hialuronic) şi proteinele
(colagengelatină fibroină din mătase albumină) se numără printre cele mai utilizate
biomateriale pentru sinteza de suporturi [37]
Chitosanul ndash Cs este unul din cei mai utilizaţi biopolimeri icircn ingineria tisulară datorită
proprietăţilor sale remarcabile Numeroase studii prezintă rezultate foarte bune ale acestui
biopolimer icircn aplicaţii vizacircnd regenerarea şi repararea ososă [56 148 151 171] Colagenul ndash
Col este un alt biopolimer adesea utilizat icircn ingineria tisulară proprietăţile ce icircl recomandă
pentru ingineria tisulară a ţesutului osos icircn mod particular fiind osteoconductivitatea şi
biocompatibilitatea Asocierea cu fosfaţi de calciu ajută la o integrare foarte bună a unui suport
pe bază de colagen şi fosfaţi de calciu icircn ţesutul osos icircn studii in vivo [90] Acidul hialuronic ndash
Hya un alt biopolimer cu proprietăţi foarte bune ce susţine regenerarea tisulară la locul defectelor
osoase contribuind la formarea de calus Icircn aplicaţii pentru regenerarea osoasă acidul hialuronic
este combinat cu fosfaţi de calciu şi cu alţi biopolimeri [142 172]
Plecacircnd de la componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă
anorganică 20-30 componentă organică și apă) cei trei biopolimeri mai sus menţionaţi au fost
amestecaţi cu fosfaţi de calciu din precursori Icircn sinteză a fost integrată şi o concentraţie de 5
particule magneticendash MNPs concentraţie stabilită icircn urma rezultatelor obţinute icircn capitolul 3 icircn
care au fost studiate trei concentraţii diferite de MNPs
41 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute printr-un procedeu biomimetic prin precipitarea de fosfați de
calciu (CP) din precursorii CaCl2 şi NaH2PO4 icircntr-o amestec de biopolimeri CsndashColndashHya
(chitosan ndash colagen ndash acid hialuronic) icircn prezenţă de soluţie apoasă de amoniacSoluţia de Cs
(1) a fost obţinută prin dizolvare de Cs purificat icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Soluția
de Col (tip I + III) a fost obţinută de la LohmannampRauscher GmbH Germania Concentraţia de
Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză Icircnainte de
procesul de precipitare icircn soluția de polimeri CsndashColndashHya s-au adăugat 5 particule magnetice
101
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sub formă uscată (5 față de cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza
suporturilor) Soluţiile apoase de CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost adăugate peste
amestecul de soluţii de biopolimeri şi particule magnetice şi omogenizate prin agitarea mecanică
după care pH-ul soluţiei a fost adus la valoarea de 72-74 cu ajutorul soluţiei de NH4OH (25)
S-a urmărit menţinerea pH la valoare menţionată pentru 24 orePentru eliminarea compuşilor
nereacţionaţi amestecul final a fost spălat cu apă distilată prin centrifugare la 5000 rotații pe
minut timp de 10 minute etapă repetată de trei ori Ultima etapă icircn obţinerea suporturilor a fost
liofilizarea la temperatura de -55ordmC timp de 24 h Etapele procesului de obţinere sunt prezentate
icircn figura 41
Figura 41 Obţinerea suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat un program
experimental cu două variabile (concentrația de Col - raporată la concentrația de Cs
respectiv raportul CaP) Icircn tabelul 41 este prezentată codificarea variabilelor independente ale
programului experimental iar icircn tabelul 42 domeniile de variaţie precum şi codificarea
suporturilor (P1 - P13)
102
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Tabel 41 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 42 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Cod suport X1 X2 Col Cs CaP
P1 -1 -1 35 65 16
P2 1 -1 65 35 16
P3 -1 1 35 65 17
P4 1 1 65 35 17
P5 -1141 0 2879 7121 165
P6 1141 0 7121 2879 165
P7 0 -1141 50 50 1579
P8 0 1141 50 50 1721
P9 0 0 50 50 165
P10 0 0 50 50 165
P11 0 0 50 50 165
P12 0 0 50 50 165
P13 0 0 50 50 165
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii chimice utilizacircnd
analiza FTIR iar din punct de vedere al morfologiei prin SEM De asemenea s-au analizat
comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora proprietăţile
mecanice și proprietăţile magnetice al suporturilor Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată
printr-un test MTT in vitro (contact indirect) şi in vivo pe şobolani Wistar
Deoarece orice suport ce se dorește a fi implantat icircn organismul uman trebuie sterilizat
icircnainte de implantare se urmărește realizare de suporturi care să nu-și modifice morfologia și
structura fizică şi chimică după sterilzare Icircn acest scop suporturile P5 P6 P7 P8 și P9 au fost
103
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru 4 ore Pentru suporturile sterilizate au
fost studiate morfologia și structura chimică
42 Rezultate și discuții
421 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR La fel ca icircn cazul
morfologiei suporturilor au fost analizate prin FTIR suporturile icircnainte şi după expunere la UV
pentru 4 ore
Icircn figura 42A se pot observa spectrele suporturilor P5 P6 P7 P9 şi a particulelor
magnetice ndash MNPs sub formă uscată icircnainte de expunere la UV iar icircn figura 42B spectrele
suporturilor P5 P6 P7 P8 P9 după expunere la UV
Structura chimică a MNPs a fost confirmată de prezenţa benzilor de absorbţie caracteristice
chitosanului gruparea -OH la 3431 cm-1
amida I la 1637 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii
CndashN la 1384 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1072 cm-1
precum şi grupării FendashO
a magnetitei la 560 cm-1
[160]
Pe spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P9 (icircnainte de expunere la UV) au putut fi
identificate benzi de absorbţie caracteristice celor trei biopolimeri după cum urmează gruparea -
OH la 3429 cm-1
(P6) 3430 cm-1
(P7) 3431 cm-1
(P5 P9) gruparea ndashCH2 la 2924 cmminus1
(P5 P9)
şi la 2925 cm-1
(P6 P7) amida I la 1637 cmminus1
(P5) 1638 cm-1
(P9) 1653 cm-1
(P6) 1655 cm-1
(P7) amida II la 1555 cmminus1
(P7) 1563 cm-1
(P6) amida III la 1240 cmminus1
(P7 P9) 1242 cmminus1
(P5) 1246 cmminus1
(P6) şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1031 cmminus1
(P5 P7) 1032 cmminus1
(P9) 1035 cmminus1
(P6) Icircn cazul suportului P6 care conţine cea mai mare cantitate de colagen s-a
observat o intesitate mai mare a benzilor amidelor I II şi III după cum era de aşteptat Icircn plus icircn
toate spectrele s-a observat prezenţa picului asociat grupării COO- a hialuronatului de sodiu la
1405 cmminus1
(P7 P9) 1406 cmminus1
(P6) şi 1410 cmminus1
(P5) [173]
Benzile caracteristice magnetitei din particulele magnetice icircncorporate icircn suporturi au fost
observate la 561 cm-1
(P5 P7 P9) şi 562 cm-1
(P6) Icircn toate spectrele se pot observa picuri
specifice grupării fosfat PO43-
la 603 cm-1
(P5) şi 604 cm-1
(P6 P7 P9) Datorită faptului că
benzile caracteristice magnetitei sunt foarte aproape de cele caracteristice grupării fosfat
sugerează o suprapunere a acestora şi faptul că nu pot fi separate [99]
104
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 42 Spectrele FTIR ale suporturilor A icircnainte de expunere UV B după expunere UV
Icircn figura 42B sunt redate spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P8 şi P9 după
sterilizare prin expunere la radiaţii UV La fel ca icircn cazul suporturilor care nu au fost sterilizate
s-a observat prezenţa picurilor caracteristice celor trei biopolimeri a picurilor caracteristice
fosfaţilor de calciu şi a picurilor caracteristice particulelor magnetice la numere de undă
apropiate de cele ale picurilor caracteristice componentelor suporturilor nesterilizate ceea ce a
indicat faptul că procesul de sterilizare utilizat nu influenţează structura chimică a suporturilor
obţinute
105
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
422 Morfologia suporturilor
Datele SEM oferă informaţii importante despre suporturile realizate pentru ingineria
tisulară a ţesutului osos deoarece studiază morfologia lor aceasta avacircnd o influenţă
considerabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale suporturilor Morfologia a fost studiată icircn
secţiunea suporturilor Pentru o privire de ansamblu 5suporturi cu compoziţii diferite au fost
analizate la diverse ordine de mărire De asemnenea s-au analizat suporturi ce au fost expuse
pentru 4 ore la radiaţii UV pentru a vedea dacă acest proces de sterilizare influenţează
morfologia suporturilor
Icircn figura 43 sunt prezentate datele SEM ale suporturilor P5 P6 P7 şi P8 icircnainte de
expunere la UV iar icircn fugura 44 după expunere la UV la două ordine de mărire diferite Se
observă o structură poroasă tridimensională cu pori interconecaţi
Figura 43 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 icircnainte de expunere la UV
La ambele ordine de mărire s-a observat o distribuţie uniform a particulelor magnetice şi a
fosfaţilor de calciu icircn structura compozită polimerică Distribuţia uniformă a particulelor
magnetice se datorează procedeului de icircncorporarea directă a acestora icircn sinteză date
106
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
asemănătoare ce susţin acestă metodă de icircncorporarea fiind regăsite şi icircn alte studii din literatura
de specialitate
Figura 44 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 după expunere la UV
Comparacircnd imaginile din figura 43 cu cele din figura 44 nu s-au observat diferenţe de
morfologie a suporturilor aceaşi structură tridimensională poroasă fiind prezentă şi icircn acest caz
ceea ce indică faptul că procesul de sterilizare prin expunere la radiaţii UV pentru 4 ore nu
influenţează morfologia suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de 5 mg din fiecare probă a fost imersat icircn PBS pH= 72 icircntr-o microcoloană (QIAquickreg
Spin
Colummn 50 diametru 10 mm) ataşată la o microseringă de 1 ml icircntreg sistemul fiind incubat la
37ordmC pentru 72 ore după care s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din
capitolul 2 S-au analizat două fragmente din fiecare tip de suport şi s-a calculat deviaţia
standard Rezultatele obținute icircn urma acestui studiu sunt redate icircn figura 45
107
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Gradul de retenție al suporturilor preparate pentru aplicații icircn inginerie tisulară influențează
răspunsul suporturilor la difuziunea celulelor nutrienților și medicamentelor caracteristici foarte
importante pentru aplicația vizată [174]
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor ce
a fost observată pe imaginile SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei biopolimeri
utilizați icircn procesul de sinteză O parte din PBS este implicat icircn interacțiunea cu matricea
polimerică iar o altă parte este reținută fizic icircn porii suporturilor Cea mai mare valoare a
gradului de retenție a fost calculată pentru P7 suport ce are cel mai mic raport CaP = 1579 iar
una din cele mai mici valori ale gradului de retenţie a fost calculată pentru P8 suport ce are cel
mai mare raport CaP = 1721 ceea ce indică o influenţă semnificativă a raportului CaP asupra
retenţie de fluide biologice simulate Practic fosfaţi de calciu acoperă matricea polimerică
icircngreunacircnd pătrunderea soluţie PBS icircn interior
Figura 45 Gradul de retenție maxim PBS () pentru suporturile obținute
Se poate observa de asemenea că valorile gradului de retenție măsurate pentru suporturile
cu aceași compoziție teoretică sunt apropiate ceea ce indică reproductibilitatea metodei utilizate
pentru sinteza suporturilor
108
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat reacția cu enzime utilizacircnd lizozim și
colagenază Primul pas a fost imersarea a aproximativ 10 mg din fiecare probă icircn 5 mL soluţ ie de
PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de dializă
introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS Două mostre din fiecare probă au fost supuse degradării
Probele au fost apoi incubate la 37ordmC La intervale de 4 ore 48 ore 72 ore 7 zile și 14 zile de la
incubare un volum de 2 ml din fiecare probă a fost extras şi analizat din soluţia de PBS icircn care
este imersată membrana de dializă cu proba de analizat din punct de vedere al concentraţiei de
chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la intervalele de timp mai sus
menţionate datele obţinute icircn urma studiului fiind redate icircn figura 46 Icircn toate cazurile s-a
observat o creștere a ratei de degradare icircn timp avantajul suporturilor biodegradabile icircn
comparaţie cu cele care nu se degradadează este resorbţia materialului icircn timp fiind astfel exclus
riscul de rejecţie a suportului de către organism
Suporturile P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri (65 Cs 35 Col) şi raport
CaP diferit P1 are raportul CaP = 16 iar P3 are raportul CaP = 17 Icircn cazul suporturile P2 şi
P4 a fost aceeaşi situaţie ca icircn cazul suporturilor P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri
(35 Cs 65 Col) diferenţa dintre ele fiind dată de raportul CaP P2ndash CaP = 16 P4ndash CaP =
17 Nu au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute pentru cele patru suporturi fiind
observată o degradare ce creşte gradual icircn timp
Icircn cazul suporturilor P7 şi P8 suporturi ce au cel mai mic raport CaP (1579) ndash P7 și cel
mai mare raport CaP (1721) ndash P8 şi aceeaşi compoziţie polimerică nu au fost observate
diferențe semnificative icircn ceea ce priveşte cantitatea de chitosan degradat la niciunul din cele 5
intervalele de timp Icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 care au aceeaşi compoziţie nu au fost
observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute icircn toate cazurile fiind observată o degradare
constatantă icircn timp
109
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 46 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturi
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat
Rezultatele privind analiza concentraţia de colagen degradat au fost redate icircn figura 47 Icircn
cazul suporturilor P1ndash P4 s-a observat o legătură evidentă icircntre concentrația de colagen degradat
și compoziția polimerică a suporturilor
Icircn acest studiu pentru a determina viteza de degradare a suporturilor s-a utilizat colagenaza
bacteriană o enzimă specifică pentru degradarea in vivo a colagenului care hidrolizează
preferențial legăturile X-Gly icircn următoarele grupe de aminoacizi glicină-leucină (Gly-Leu)
glicină-izoleucină (Gly-Ile) alanin-prolină-glicină (Ala-Pro-Gly)
Icircn ceea ce privește concentraţia de colagen degradat pentru suporturile P5 ndash P9 s-a
observat şi icircn acest caz o legătură stracircnsă icircntre concentrația de colagen degradat și compoziția
polimerică a suporturilor cele mai mari valori fiind obţinute pentru suportul P6 ce conţine 7121
colagen şi doar 2879 chitosan şi cele mai mici valori pentu suportul P5 ce conţine 7121
chitosan şi 2879 colagen
La fel ca şi icircn studiul concentraţie de chitosan degradat icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 nu
au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute ceea ce confirmă reproductibilitatea
metodei
110
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 47 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturi
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ egale iar după ce s-au
determinat dimensiunile au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii specificaţi icircn
capitolul 2 Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru
fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a calculat modulul lui Young iar
la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind prezentate grafic icircn figura 48
Oasele sunt organe rigide formate din ţesut osos măduvă osoasă endost periost cartilaj
nervi şi canale vertebrale Icircn funcţie de structura sa ţesutul osos este de două tipuri ţesut osos
compact (cortical) şi ţesut osos spongios (trabecular) Ţesutul osos compact este localizat la
suprafaţa osului şi după cum sugerează şi denumirea sa are o macrostructură omogenă şi
compactă Se găseşte la diafiza oaselor iar grosimea sa variază icircn funcţie de localizarea
anatomică Ţesutul osos spongios este o reţea de pori interconectaţi volumul de spaţiu gol fiind
cuprins icircntre 50 şi 90 şi este localizat icircn epifiza oaselor lungi
Cele două tipuri de ţesuturi spongios şi compact au o influenţă semnificativă asupra
proprietăţilor mecanice ale osului Scheletul uman este supus zilnic la diferite forţe icircn funcţie de
activităţile icircntreprinse forţele de tensiune forţele de compresiune şi forţele de forfecare fiind
cele care acţionează cel mai adesea asupra ţesutului osos Solicitările mai complexe cum ar fi de
111
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
exemplu icircncovoierea osului pot fi descompuse la racircndul lor icircn cele trei forţe menţionate
anterior Pentru a studia solicitările la care este supus ţesutul osos proprietăţile mecanice ale
osului cum sunt modulul de elasticitate (Young) rezistenţa la compresiune şi tensiunea trebuie să
fie pe deplin icircnţelese Icircn ceea ce priveşte modului lui Young notat cu E acesta are valori diferite
pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut osos astfel E este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru
ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru ţesutul osos spongios [168]
Figura 48 Modulul lui Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de
calciu cu incluziune de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young icircn cazul suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi
fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice au fost cuprinse icircntre 3841 MPa şi
22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător
valorilor Modulului Young al ţesutului osos spongios Asemănarea suporturilor obţinute cu
ţesutul osos spongios poate fi susţinută şi de datele SEM care au evidenţiat o structură poroasă
tridimensională
Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru suportul P5 suport ce are cea mai mare
cantitate de chitosan icircn compoziţie (7121 Cs 2879 Col) iar cea mai mică valoare s-a
obţinut pentru P2 unul din suporturile cu cea mai mică cantitate de chitosan (35 ) ceea ce
indică o icircmbunătăţire a rezistenţei la compresiune a suporturilor prin adăugare de chitosan icircn
sinteza suporturilor Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie P9 ndash P13 valorile obţinute
112
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
pentru E sunt apropiate ceea ce indică faptul că metoda de sinteza a suporturilor este
reproductibilă
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 rezultatele obținute fiind prezentate icircn tabelul 43
Tabel 43 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire
suport
Susceptibilitate
magnetică (volum)
Magnetizarea
(emug)
P1 0160 middot e-4
1319
P2 0154 middot e-4
1269
P3 0135 middot e-4
1113
P4 0254 middot e-4
2093
P5 0160 middot e-4
1319
P6 0047 middot e-4
387
P7 0242 middot e-4
1995
P8 0112 middot e-4
923
P9 0257 middot e-4
2118
P10 0254 middot e-4
2093
P11 0432 middot e-4
3561
P12 0810 middot e-4
6676
P13 0514 middot e-4
4236
S-a observat că valorile obținute sunt cuprinse icircntre 387 şi 6676 emug amintind că s-a
introdus in sinteză o concentrație de 5 particule magnetice sub formă uscată (5 față de
cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor) ceea ce indică că
suporturile obţinute sunt superparamagentice
113
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare s-a utilizat metoda contactului indirect
realizacircndu-se un extract din suporturile P5 şi P6 care icircn prealabil au fost sterilizate după aceeaşi
metodă descrisă icircn capitolul 3 subpunctul 327 Fragmentele de suporturi sterilizate au fost
ulterior imersate icircn 4 ml mediu de cultură DMEM și lăsate la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului urmacircnd apoi filtrarea extractului printr-un filtru de 70 microm
măsurarea volumul final şi adăugarea a 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost pus icircn contact cu două linii celulare diferite fibroblaste din derm uman
(NHDF Lonza) și preosteoblaste MC3T3 icircn placi de 96 godeuri 3000 celule godeuCele două
tipuri de celule au fost incubate separat pentru 24 ore icircn mediu de cultură DMEM complet
icircnlocuit după cele 24 ore cu 150 μl extract Testul MTT a fost realizat la 24 48 și 72 ore
calculacircndu-se viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (7) din capitolul 2 rezultatele testului fiind
prezentate icircn figura 49 pentru contactul indirect al suporturilor cu fibroblaste şi icircn figura 410
pentru contactul indirect al suporturilor cu preosteoblaste
Figura 49 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu fibroblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea fibroblastelor s-a observat o uşoară creştere icircn timp a
acesteia pentru ambele suporturi analizate Icircn cazul suportului P5 valorile calculate pentru
viabilitate au fost cuprinse icircntre 964 şi 979 valori ce au sugerat lipsa unor efecte adverse
ale extractului asupra fibroblastelor deci suportul a fost considerat biocompatibil Pentru
114
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
suportul P6 s-au calculat valori uşor mai scăzute ale viabilităţii celulare icircntre 88 şi 924 dar
chiar şi aşa acestea s-au icircncadrat icircn limitele care au permis să se afirme că suportul este
biocompatibil
Figura 410 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu preosteoblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea preosteoblastelor s-au calculat valori mai mici decat icircn
cazul fibroblastelor S-a observat o tendinţă de scădere a viabilităţii icircn timp cea mai mică
valoare de 83 fiind calculată pentru suportul P6 Icircn cazul suportului P5 cea mai mică valoare
calculată a fost de 87 Rezulatele obţinute icircn urma contactului indirect cu preosteoblastele au
indicat faptul că suporturile nu au eliberat compuşi citotoxici acestea fiind biocompatibile
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor
Testele in vivo pentru determinarea citotoxicității s-au realizat pe femele icircn vacircrstă de 6
săptămacircni Animalele au fost grupate icircn 2 loturi lotul martor format din 9 șoareci a fost utilizat
ca bază de comparație pentru lotul cu implant (II) ndash suportul P9 compus din 18 șoareci Cu
excepţia celor de control tuturor celorlalţi li s-au implantat subcutanat fragmente de suporturi cu
dimensiunea 1 cm x 1 cm
Durata experimentului a fost de 21 de zile La finalul primelor 7 zile de experiment au fost
sacrificați 3 șoareci din lotul martor și 6 din lotul II Inițial animalele au fost supuse zilnic unei
observații clinice amănunțite pentru a depista eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca
115
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
urmare a intolerabilității implantului după care au fost sacrificate iar tesuturile adiacente
implantului au fost examinate histologic La fel s-a procedat si pentru ceilalți șoareci sacrificați
la 14 și respectiv 21 de zile
Preparatele au fost citite la microscop şi interpretate Macroscopic nu s-au remarcat
modificări locale evidente Microscopic pe probele de ţesut recoltat ce includeau implantul şi
ţesutul din jur imaginile au indicat o reacţie inflamatorie cronică uşoară infiltraţie limfoidă
difuză şi capsulă conjunctivă icircn jurul implantului La loturile testate suportul compozit a icircnfaţişat
aspecte de biodegradare superficială La lotul martor fals implantat unul din animale a dezvoltat
o reacţie inflamatorie uşoară cu infiltraţii limfocitare perivasculare restul secţiunilor au relevat
o vindecare normală a plăgii chirurgicale
După 7 zile de la implantare icircn jurul materialului implantat se remarcă un infiltrat
inflamator moderat reprezentat de leucocite neutrofile histiocite și macrofage (figura 411A)
Totodată icircn țesutul conjunctiv din jurul implantului se observă un infiltrat celular mononuclear
interfibrilar susținut de o congestie a capilarelor limitrofe ce se regăsește și icircn structura
materialului implantat (figura 411B) Structurile profunde ale pielii (dermul și hipodermul) nu
suferă modificări alterative Se remarcă o ușoară densificare a țesutului conjunctiv subcutanat
printr-o sporire a elementelor celulare (fibroblastele) și fibrilare (fibrele de colagen ) ale acestuia
(fugura 411C)
Figura 411 Examen histopatologic după 7 zile de la implantare Colorare tricromic Masson
După 14 zile de la implantare materialul implantat are o structură mai ldquoaerisitărdquo probabil
consecință a resorbției tisulare a unor constituienți Icircn jurul materialului implantat se observă o
veritabilă capsulă conjunctivă formată din țesut conjunctiv tacircnăr ce are tendința de sechestrare a
acestuia și care trimite scurte travei spre zona centrală a materialului implantat (figura 412A)
Se observă la periferia materialului implantat travei (septe) conjunctive pornite din capsula
116
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
conjunctivă periferică ce infiltrează materialul implantat remarcacircndu-se tendința de icircnglobare a
acestuia (figura 412B) icircntr-un țesut conjunctiv neoformat lax icircncă imatur reprezentat din
fibroblaste și fibre de colagen tinere (figura 412C)
Figura 412 Examen histopatologic după 14 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
După sacrificarea animalelor la 21 zile de la intervenția chirurgicală de implantare
subcutatantă macroscopic (figura 413A) nu există modificări locale evidente icircn structurile
cutanate din dreptul implantului la nici unul dintre animalele examinate histopatologic
Microscopic s-a observat un țesutul conjunctiv neoformat icircncă imatur dezorganizat
constituit din fibroblaste active și fibre de colagen cu un aranjament anarhic repezentat de
vacircrtejuri și cordoane (figura 414A) De asemenea au fost remarcate mici depozite de fosfat de
calciu sechestrate icircn masa conjunctivă neoformată (figura 414B) și septe conjunctive constituite
din țesut conjunctiv cu dispoziție diametrală și care străbat materialul implantat cu tendința de a-
l icircngloba
Figura 413 Analiza macroscopică a implantului
117
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 414 Examen histopatologic după 21 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
Drept concluzie a studiilor in vivo ce au urmărit interacțiunile dintre suporturi și țesuturile
vii s-a remarcat o lipsă de citotoxicitate a implantului subcutanat susținută de absența oricărei
reacții locale sau sistemice de respingere
43 Concluzii
Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu au fost obținute
prin precipitarea de fosfați de calciu din precursori CaCl2 și NaH2PO4 icircntr-un amestec de trei
biopolimeri cu proprietăți remarcabile pentru regenerarea osoasă Cs Col și Hya Un program
experimental a fost folosit pentru optimizarea metodei 13 suporturi fiind preparate P1 ndash P13 Icircn
sinteză a fost integrate o concentrație de 5 MNPs
Structura chimică a suporturilor precum și morfologia acestora au fost studiate și
pentru suporturi ce au fost expuse la radiații UV timp de 4 ore procedeu utilizat icircn unele aplicații
biomedicale pentru sterilizare
Benzi de frecvență caracteristice biopolimerilor CP și MNPs au fost observate icircn
toate spectrele FTIR Nu au fost observate diferențe icircntre spectrele suporturilor expuse la radiații
UV și cele normale ceea ce icircnseamnă că acest proces de sterilizare nu influențează structura
chimică a suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată icircn secțiune cu ajutorul SEM S-a remarcat
o structură poroasă a suporturilor cu CP și MNPs distribuite uniform pe scheletul polimeric
Distribuția uniform a MNPs este atribuită procedeului de icircncorporare direct a acestora icircn etapa de
118
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sinteză La fel ca icircn cazul structurii chimice radiațiile UV nu infleunțează morfologia
suporturilor astfel acest proces de sterilizare poate fi utilizat pentru testele in vitro și in vivo
Determinarea gradului de retenție PBS s-a realizat utilizacircnd o metodă
volumetrică valorile obținute după 72 ore de la interacțiunea suportului cu fluidul la 37degC
indicacircnd o influență semnificativă a raportului CaP asupra proprietății studiate
Pentru studiile de degradare in vitro s-a studiat interacțiunea cu un complex de
două enzime lizozim și colagenază enzime implicate in vivo icircn procesele de degradarea a
chitosanului respectiv colagenului Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul
ambilor biopolimeri
Modului lui Young are valori diferite pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut
osos este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru
ţesutul osos spongios Valorile obţinute icircn cazul suporturile preparate au fost cuprinse icircntre 3841
MPa şi 22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul corespunzător modulului Young al
ţesutului osos spongios
Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor
Teste de citotoxicitate in vitro realizate icircn paralel pe două linii celulare diferite
fibroblaste și osteoblaste au indicat faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra celulelor
Caracterul non-citotoxic al suporturilor a fost evidențiat și in vivo după ce fragmente de
suporturi au fost implantate subcutanat la șoareci După 21 zile aceștia au fost sacrificați iar
fragmentele de țesut cu implant au fost analizate macroscopic și microscopic
119
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de
particule magnetice
Avacircnd icircn vedere proprietăţile biopolimerilor Cs Col şi Hya descrise icircn amănunt icircn
capitolele anterioare precum şi procedeul biomimetic de co-precipitarea de fosfați de calciu (CP)
din precursori CaCl2 şi NaH2PO4 un lot nou de suporturi a fost realizat conform metodei de
obţinere utilizate icircn capitolul 4 diferenţa dintre acest lot de suporturi şi lotul de suporturi
descrise icircn capitolul 4 fiind dată de modalitatea de incluziune a particulelor magnetice icircn etapa
de sinteză a suporturilor icircn cazul lotului din capitol 4 particulele au fost incorporate sub formă
uscată iar icircn cazul acestui lot particulele au fost icircncorporate sub formă de suspensie coloidală
51 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute prin acelaşi procedeu biomimetic utilizat icircn capitolul 4 Icircn
acest scop soluţii de precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri Cs (1) Col (1) Hya (1) şi 5 suspensie coloidală de
MNPs icircn apă (raportată la cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor)
pH-ul amestecului a fost apoi ajustat la 72-74 utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac iar după
spălare cu apă distilată pentru eliminarea compuşilor nereacţionaţi amestecurile au fost
liofilizate pentru 24h
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat şi de această dată
acelaşi program experimental cu două variabile (concentrația de Col - raportată la
concentrația de Cs respectiv raportul CaP) utilizat icircn capitolul 4 Icircn tabelul 51 este
prezentată codificarea varabilelor programului experimental iar icircn tabelul 52 sunt prezentate
domeniile de variaţie precum şi codificarea suporturilor (S1 - S13)
Utilizacircnd ecuației (3) din capitolul 2 s-au determinat valorile variabilelor investigate din
programul experimental icircmpreună cu răspunsurile obținute Coeficienţii de regresie au fost
determinaţi si sunt prezentaţi icircn tabelul 53 alături de coeficienți de corelație și de abatere
standard Variabila răspuns Y1 corespunde gradului de retenție PBS a suporturilor preparate ()
iar Y2 corespunde modului de elasticitate E (MPa) ndash tabel 54
120
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 51 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 52 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Codificare
Support X1 X2 Col Cs CaP
S1 -1 -1 35 65 16
S2 1 -1 65 35 16
S3 -1 1 35 65 17
S4 1 1 65 35 17
S5 -1141 0 2879 7121 165
S6 1141 0 7121 2879 165
S7 0 -1141 50 50 1579
S8 0 1141 50 50 1721
S9 0 0 50 50 165
S10 0 0 50 50 165
S11 0 0 50 50 165
S12 0 0 50 50 165
S13 0 0 50 50 165
Tabel 54 Eroarea asimetrică coeficienţii de corelare si de regresie determinați
a1 a2 a3 a4 a5 a6 COR ASE
Y1 0256534 0006965 0001565 -0033 -000592 -004559 0980261 0024421
Y2 894655 8300833 -204625 486659 -394375 9217909 0986554 7447254
121
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 54 Programul experimental icircmpreună cu valorile determinate pentru retenție PBS
() și E (MPa)
Codificare
suport X1 X2 Y1 ndash Retenție PBS () Y2 ndash E (MPa)
S1 -1 -1 121714plusmn21973 20925plusmn32
S2 1 -1 109649plusmn32378 27947plusmn22
S3 -1 1 239234plusmn17309 12001plusmn34
S4 1 1 163522plusmn10871 16201plusmn24
S5 -1141 0 138888plusmn24263 8668plusmn33
S6 1141 0 100628plusmn20724 12261plusmn29
S7 0 -1141 109091plusmn22104 9038plusmn21
S8 0 1141 121213plusmn5471 8372plusmn12
S9 0 0 138889plusmn18159 7628plusmn32
S10 0 0 138960plusmn18209 7873plusmn12
S11 0 0 146019plusmn1502 8089plusmn24
S12 0 0 141067plusmn10022 7942plusmn8
S13 0 0 141844plusmn9215 8034plusmn32
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei utilizacircnd
spectroscopia IR cu transformare Fourier (FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de
energie (EDS) şi difracţie cu raze X (XRD) Din punct de vedere al morfologiei au fost
caracterizate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM) și prin micro computer-tomografie
(microCT) De asemenea s-au analizat comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora proprietățile mecanice și proprietățile magnetice Citotoxicitatea
suporturilor a fost analizată printr-un test MTT in vitro (contact direct) şi in vivo pe şoareci din
linia CD1
Suporturile S7 S8 și S9 au fost sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru
4 ore şi au fost studiate morfologia și structura lor chimică cu scopul de a observa influenţa
porcesului de sterilizare asupra carcteristicilor menţionate
122
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
52 Rezultate și discuții
521 Structura chimică a suporturilor
Datele obţinute icircn urma analizei FTIR oferă informaţii despre structura suporturilor
Suporturile au fost analizate icircnainte şi după expunere la UV pentru 4 ore rezultatele fiind redate
icircn figura 51 S-au observat picuri pentru cei trei biopolimeri (Amide I C=O Amide II N-H
funcțiile OH grupari alifatice) fosfații de calciu (PO3-
4 la 563 cm-1
) și nanoparticule magnetice
[99 175]
Figura 51 Spectrele FTIR pentru suporturile S7 S8 S9
A icircnainte de expunere la UV B după expunere la UV
Benzile reprezentative pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 55 După cum se poate
observa benzile reprezentative pentru suporturile expuse la UV au valori foarte apropiate sau
chiar identice cu cele ale suporturilor care nu au fost expuse la UV ceea ce icircnseamnă că
123
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
radiațiile UV nu influențează structura chimică a acestora chiar și după o periadă mare de timp
(4 ore)
Tabel 52 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S1 și S3
IcircIcircnainte de expunere la UV DuDupă expunere la UV
Grupări
funcționale
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
OH 3421 3418 3409 3421 3419 3415
C-H 2937 2936 2934 2937 2942 2936
Amida I
C=O 1653 1659 1655 1655 1652 1655
Amida II
N-H 1556 1556 1552 1557 1556 1552
C-O 1030 1031 1030 1031 1030 1030
Fe-O 603 603 602 603 603 602
PO3_4
561 561 560 561 561 561
522 Compoziția suporturilor
Icircn figura 52 este redată difractograma XRD pentru suporturile S7 S8 și S9 Picurile
caracteristice specifice fosfaţilor de calciu ce pot fi associate planelor (002) (210) (112) (213)
și (004) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF No 65-3107) și unghiurile cu care
acestea sunt corelate sunt redate icircn tabelul 56 [176]
Figura 52 Spectrul XRD pentru suporturile S7 S8 și S9
124
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 56 Diferite forme de CP prezente icircn suporturile analizate conform JCPDS
Unghi 2ϴ (deg) Intensitate (ua) Index conform JCPDS Formula chimică
26 002 44-0778 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
28 210 44-0810 Ca3H2(P2O7)2 ∙ H2O
31 112 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
49 213 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
53 004 02-1350 CaHPO4
Icircn figura 53 este redat spectrul EDS pentru suportul S5 Numărul atomic pentru Ca a fost
292 iar pentru P a fost 148 ceea ce a indicat un raport CaP= 197 această valoare fiind
apropiată de valoare raportului CaP al fosfatului tertacalcic (TTCP) ndash Ca4(PO4)2O care este 200
[177]
Figura 53 Spectrul EDX pentru suportul S5
523 Morfologia suporturilor
Porozitatea caracterizată drept procentul de spaţiu gol dintr-un solideste una din cele mai
importante caracteristici ale unui suport realizat pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară şi
regenerarea ţesutului osos Porozitatea unui suport este influenţată de natura materialelor din
compoziţia sa precum şi de procesul de obţinere Un suport pentru regenerarea osoasă trebuie să
susţină migrarea şi proliferarea osteoblastelor şi a celulelor mezenchimale să permită
pătrunderea vaselor de sacircnge şi angiogeneza iar icircn final să contribuie la formarea de neoţesut
[178] Porozitatea unui suport influenţeză o serie de alte caracteristici esenţiale pentru un suport
125
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
realizat pentru aplicaţia menţionată anterior cele mai semnificative fiind biodegradabilitatea şi
proprietăţile mecanice
Rezultatele SEM sunt prezentate icircn figura 54 Figura 54A reprezintă suporturile S7 S8
S9 icircnainte de expunere la radiații UV iar figura 54B aceleași suporturi după expunere la
radiații UV La 500 microm se poate observa o structură poroasă a suporturilor şi icircncorporarea
particulelor magnetice și a cristalelor de calciu icircn matricea polimerică şi faptul că nu există
diferențe icircntre suporturile sterilizate și cele nesterilizate
Figura 54 Morfologia suporturilor S7 S8 S9 A Icircnainte de expunere la UV B După expunere
la UV
Pentru un studiu mai detaliat al morfologiei suporturilor fragmente din acestea au fost
scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi o
rotaţie de 05ordm Proiecţiile astfel obţinute au fost procesate şi reconstruite utilizacircnd programul
NRecon (Bruker Belgium) Trei regiuni de interes au fost selectate pentru fiecare proba iar
programul CTAn a fost utilizat pentru calcularea dimensiunii porilor precum şi dimaterului de
percolaţie Pentru calcularea porozităţii s-a utilizat metoda ldquosphere-fittingrdquo regasită icircn aplicaţia
BatMan a programului CTAn Pentru calcularea diametrului de percolaţie s-a utilizat metoda
126
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
descrisă de Ashworth şi colab [179] Pe scurt metoda ldquoshrink wraprdquo a fost aplicată pentru a
identifica volumul accesibil unui obiect virtual care poate penetra icircntreaga regiune de interes
utilizacircnd urmatoare ecuaţie
(16)
unde este o constantă de percolaţie egală cu 088 pentru sistemele 3D [180]
Vizualizarea distribuţiei porilor a fost efectuată utilizacircnd programul CTVox (Bruker
Belgium) Astfel o funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste
reconstrucţia 3D a probei de investigat iar un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare
Suportul care are cea mai mare dimensiune a porilor a fost suportul S7 iar suportul cu cea
mai mică dimensiune a porilor a fost suportul S8 Aceste două suporturi sunt practic suporturile
cu cel mai mic raport CaP ndash S7 (CaP = 1579) şi cel mai mare raport CaP ndash S8 (CaP = 1721)
ceea ce a indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra porozităţii
suporturilor Icircn ceea ce priveşte comparaţia porozităţii suporturilor din punct de vedere al
compoziţiei de biopolimeri s-a observat o dimensiune mai mare a porilor suportului S6
(conţinacircnd un raport mai mare de colagen)
Figura 55 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suporturile S6 S7 S8 S9
127
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn tabelul 57 sunt prezentate date despre dimensiunea şi distribuţia porilor (prezentate şi
icircn figura 55) volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
Tabel 57 Dimensiunea porilor suporturilor S5 S6 S7 S8
Denumirea
suportului
Dimensiunea
porilor (microm)
Volumul
regiunii de interes (mm3)
Aria regiunii de
interes (mm2)
S6 2121plusmn9091 222051 1027245
S7 27341plusmn10952 200577 955451
S8 13309plusmn6785 255724 1139832
S9 1388plusmn5284 316728 1343793
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost analizate icircn aceleaşi condiţii experimentale ca şi suporturile prezentate
icircn capitolul 4 Icircntr-o primă etapă suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ
egale s-au determinat dimensiunile şi au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii
specificaţi icircn capitolul 2 Pentru fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a
calculat modulul Young iar la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind redate icircn figura 56 și icircn
tabelul 53
Figura 56 Modulul Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu
cu incluziune suspensie coloidală de particule magnetice
0
50
100
150
200
250
300
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13
20925
27947
12001
16201
8668
12261
9038 8372 7628 7873 8089 7942 8034 E (
MP
a)
128
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young au fost cuprinse icircntre 7628 MPa şi 27947
MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător valorilor
Modulului Young al ţesutului osos spongios interval icircn care s-au icircncadrat şi valorile obţinute
pentru suporturile caracterizate icircn capitolul 4 Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru
suportul S2 avacircnd următoarea compoziţe 35 Cs 65 Col şi raportul CaP = 16 iar cea mai
mică valoare s-a obţinut pentru suportul S9 avacircnd următoarea compoziţe 50 Cs 50 Col şi
raportul CaP = 165 Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie S9 ndash S13 valorile obţinute
pentru E au fost apropiate ceea ce indică că metodă poate fi considerată reproductibilă din punct
de vedere al proprietăților mecanice Analizacircnd valoarea lui E din punct de vedere al influenţei
raportului CaP deci comparacircnd suporturile S7 (CaP = 1579 50 Cs 50 Col) cu S8 (CaP
= 1721 50 Cs 50 Col) s-au observat valori apropiate ale lui E de unde se poate
concluziona că raportul CaP nu influențează proprietățile mecanice ale suporturilor
525 Proprietăţi magnetice ale suporturilor
Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 58 S-a măsurat
susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime adimensională)
utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Tabel 58 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire suport
Susceptibilitate magnetică (volum)
Magnetizarea (emug)
S1 0295middot e-4
2431
S2 0382middot e-4
3148
S3 0414middot e-4
3412
S4 0304middot e-4
2505
S5 0272middot e-4
2241
S6 0439middot e-4
3618
S7 0476middot e-4
3923
S8 0399middot e-4
3288
S9 0539middot e-4
4442
S10 0749middot e-4
6173
S11 061middot e-4
5027
S12 0703middot e-4
5794
S13 0817middot e-4
6733
129
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13)
din capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 2241 şi 6733 emug indică faptul că suporturile
obținute sunt superparamagnetice
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Valorile gradului de retenție obținute pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 53 și
figura 57 Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a
suporturilor dovedită de datele SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei
biopolimeri utilizați la fabricarea suporturilor
Figura 57 Grad de retenţie PBS
Se poate afirma că o parte din PBS interacționează cu matricea polimerică iar o altă parte
este reținută fizic icircn porii suporturilor Inițial icircn PBS moleculele de H2O intră icircn suporturi prin
1579
165
1721
900
1200
1500
1800
2100
2400
287
9
37
27
45
75
542
3
627
1
712
1
CaP
GR
(
)
Colagen ()
2100-2400
1800-2100
1500-1800
1200-1500
900-1200
130
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
pori pentru a umple spațiile interne Pe de altă parte numărul de grupuri polar este de asemenea
un factor important care afectează hidrofilia materialului [181] Adăugarea de fosfați de calciu
icircn compoziția suporturilor duce la o scădere a gradului de retenție
527 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd un amesctec
de două enzime lizozim și colagenază Metoda de lucru utilizată a fost aceeaşi ca cea utilizată pentru
degradarea suporturilor obţinute şi caracterizate icircn capitolul 4 10 mg din fiecare probă s-a imersat icircn
5 ml soluţie de PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de
dializă introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS după care au fost incubate la 37degC La anumite
intervale de timp s-a extras şi analizat un volum din cei 10 ml PBS din punct de vedere al
concentraţiei de chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la 2 ore 48 ore 7 zile şi 14 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate icircn figura 58
Figura 58 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Comparacircnd valorile obținute nu s-a observat o dependență clară a vitezei de degradare a
concentrația de chitosan chiar dacă toate materialele sunt degradate treptat Comportamentul se
0
02
04
06
08
1
S5 S6 S7 S8 S9
(Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat)
middot100
m
moli
L
2 ore 48 ore 7 zile 14 zile
131
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
datorează interacțiunilor ionice ale chitosanului cu colagenul și fosfații de calciu care modifică
conformația situsului de legare pentru lizozim [182]
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat
Concentraţia de colagen degradat a fost analizată la 4 ore 48 ore 72 ore şi 7 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate sub formă de grafic
Figura 59 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Hidrolizarea colagenului din suporturi de către colagenază enzima implicată icircn procesul de
degradare al acestei proteine in vivo are două etape Icircntr-o primă etapă enzima se atașează la
suport și apoi rupe locurile specifice care corespund structurilor de aminoacizi pentru care
enzima are specificitate Condițiile de mediu (pH tărie ionică inhibitori de enzime) și
caracteristicile materialelor (compoziție structură supramoleculară și porozitate) sunt parametri
care dictează viteza de degradare și biointegrarea controlată a suportului Toate suporturile au
fost degradate icircn timp cu vitezediferite
0
005
01
015
02
025
S5 S6 S7 S8 S9
Con
centr
aţi
a d
e co
lagen
deg
rad
at
mm
oli
L
4 ore 48 ore 72 ore 7 zile
132
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
5281 Testul MTT
Citotoxicitatea in vitro a suporturile obținute a fost analizată utilizacircnd un test MTT test ce
a oferit informații despre viabilitatea a trei linii diferite de celule fibroblate celule STEM și
osteoblaste la contactul direct cu fragmente de suporturi
Rezultatele prezentate icircn figura 510 indică lipsa citotoxicităţii suporturilor asupra
fibroblastelor valorile viabilităţii celulare fiind mai mari de 80 pentru toate cele trei suporturi
S7 S8 S9 şi pentru toţi cei trei timpi de contact
Icircn urma contactului direct al suporturilor S1 S3 S13 pentru 24 ore 48 ore respectiv 72
ore cu celule stem rezultate redate icircn figura 511A s-au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce
cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de 97 (S1) 98 (S13) și 99 (S3) ceea ce indică a
foarte bună biocompatibilitate a probelor
Figura 510Viabilitatea fibroblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile S7 S8 S9
Suporturile S1 S3 şi S13 au fost puse icircn contact direct şi cu osteoblaste rezultate fiind
redate icircn figura 511B dar rezulatele obţinute icircn acest caz nu sunt la fel de bune ca icircn cazul
contactului direct cu celulele stem osteoblastele fiind celule cu o sensibilitate ridicată Teste
suplimentare sunt necesare icircn acest caz
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
()
Control S7 S8 S9
133
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Figura 511 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile S1 S3 S13
A Utilizacircnd celule stem B Utilizacircnd osteoblaste
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată lipsa de citotoxicitate suporturile la contactul direct cu
celulele stem s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-AM rezultatele obţinute
fiind prezentate icircn figura 512
Figura 512 Viabilitatea celulelor STEM icircn contact cu suporturile S1 şi S3
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
cel
ula
ră
Control S1 S3 S13 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
Control S1 S3 S13 B
134
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu
suporturile S1 şi S3 atacirct la 24 ore cacirct şi la 96 ore ce ce confirmă icircncă o dată faptul că suporturile
nu eliberează compuși citotoxici și totodată structura lor nu influențează negativ activitatea
celulelor stem
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor
La fel ca icircn capitolul 4 citotoxicitatea in vivo a suporturilor din acest lot a fost studiată pe
șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28 plusmn 30 grame
icircntr-o stare de icircntreţinere foarte bună găzduițiți icircn condițiile adecvate
Pentru implant materialele au fost secționate sub forma unor discuri cu diametrul de 15
mm (A=17671 mm2) apoi au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 10
minute Animalele au fost grupate icircn 3 loturi lotul 7 (corespunzător suportului S7) lotul 8
(corespunzător suportului S8) și lotul 9 (corespunzător suportului S9) fiecare lot cuprinzacircnd un
număr de 12 animale
Animalele au fost supuse la o intervenție chirurgicală de implantare subcutanată descrisă
icircn capitol 2 subcapitolul 248 Durata studiului a fost de 64 de zile La finalul primelor 48 ore de
experiment au fost sacrificați cacircte 3 șoareci din fiecare lot (7 8 9) apoi cacircte alți 3 din fiecare lot
la intervale de 12 34 respectiv 64 de zile
Inițial animalele au fost supuse zilnic unei observații clinice amănunțite pentru a depista
eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca urmare a respingerii implantului după care au
fost eutanasiate prin administrarea unei supradoze de izofluran Zona de implant a fost deschisă
chirurgical fără a leziona excesiv țesutul Țesuturile adiacente au fost examinate macroscopic
fiind apreciate modificările din zona de implant (porțiunea centrală a implantului) și din jurul
acesteia respectiv prezența hemoragiei necrozei infecției și modificarea culorii țesutului
Histologic fiecărui șoarece i s-au recoltat probe de țesut din zona de implant și adiacentă
acesteia pentru a evalua populația de celule din jurul implantului Aceste probe au fost fixate icircn
formol 10 apoi incluse la parafină colorate Tricromic Masson și examinate microscopic
Pentru suporturile din acest lot deoarece durata experimentului a fost mai mare s-a evaluat
gradul de icircncapsulare a materialelor (granulom de corp străin) măsuracircnd grosimea capsulei de la
periferia spațiului ocupat de implant pacircna la marginea exterioară a acesteia Scorul icircncapsulării a
fost realizat conform recomandărilor ISO Standard 10993 prezentate icircn tabelul 59
135
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 59 Scorul icircncapsulării
Capsulă Scor
Absentă 0
gt 05 mm 1
06 ndash 10 mm 2
11 ndash 20 mm 3
gt 20 mm 4
Cerințele testului sunt icircndeplinite dacă diferențele dintre scorul mediu al animalelor din lot
este lt 10 mm
Icircn urma observațiilor clinice nu se observă modificări ale țesuturilor adiacente implantului
integritatea pielii nu este modificată nu sunt prezente semne de turgescență icircnroșire erupție sau
piloerecție La racircndul lor datele histologice susțin ipoteza biocompatibilității compozitului pe
baza de polimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Figura 513 Suportul S7 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
Icircn cazul bioimplanturilor diferite tipuri de celule interacționează și conduc la răspunsuri
specifice iar icircnțelegerea acestor mecanisme ne conduc către realizare unor suprafețe de implant
136
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
cu o mult mai mare compatibilitate cu structurile biologice Fiecare implant ne-natural induce un
răspuns inflamator acutdin partea organismului dar nu răspunsul icircn sine este important ci
icircntinderea și intensitatea sa Prin urmare orice test de biocompatibilitate a unui anumit material
trebuie să se bazeze pe evaluarea populației de celule din jurul implantului
Markeri importanți pentru biocompatibilitate sunt tipurile de celule care apar după
implantarea materialului străin Icircn literatura de specialitate nu este clar dacă prezența celulelor
gigant de corp străin marchează o incompatibilitate a biomaterialului sau dacă acestea denotă un
comportament de degradare normală a materialelor biomaterialelor resorbabile [183] Orice
biomaterial implantat este recunoscut de către organism ca un rdquonon selfrdquo Icircn mod obișnuit toate
biomaterialele implantate icircn țesutul conjunctiv induc un răspuns din partea gazdei proces
inflamator acut a cărei formă de manifestare și intensitate diferă
Figura 514 Suportul S8 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
După Hench și Best dacă biomaterialul este (I) toxic țesuturile din jur mor (II) netoxic și
biologic inactiv (aproape inert) apare un țesut fibros de formă și grosime variabilă (III) netoxic
și biologic activ (bioactiv) se produce o legătură interfacială stracircnsă material-structură biologică
(IV) netoxic și se dizolvă țesuturile din jur icircl icircnlocuiesc [184] Amplitudinea și durata
137
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
procesului inflamator are o influență determinantă asupra stabilității și compatibilității
biomaterialului implantat [185]
Figura 515 Suportul S9 la 48 ore 12 zile și 64 zile post-implantare
Reacția organismului este evidentă icircn primele 48 de ore de la implantare manifestată
printr-un proces inflamator accentuat la materialele 7 și 8 și mai redus ca intensitate icircn cazul
suportului S9 Se constată un aflux celular semnificativ reprezentat de macrofage neutrofile
leucocite rare limfocite fibroblaste și fibre de colagen Infiltratul inflamator a fost mai redus
caracterizat prin prezența de rare leucocite neutrofile și macrofage la S9
La 10 zile de la prima evaluare (12 zile de la debutul experimentului) la suporturile S7 și
S8 reacția fibroasă periferică este mai intens exprimată prin fiboblaste și fibre de colagen cu
orientare concentrică Infiltratul inflamator este reprezentat de macrofage limfocite histiocite și
fibroblaste La suportul S9 se icircnregistrează o proliferare fibroasă cu tendință de icircnglobare a
materialului Reacție giganto-celulară cu celule gigante de corp străin icircn ale căror citoplasme se
pot observa particule fagocitate din biomaterial Primele celule care se atașează materialului de
implant sunt fibroblastele Ele produc un colagen imatur observabil pe suprafața implantului
[186]
Prezența fibrelor de colagen și a fibroblastelor este considerată o reacție tisulară normală
Icircn acest strat (fibrinos) prezența de macrofage și neutrofile joacă un rol important icircn
138
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
transformarea implantului icircntr-un material biologic recunoscut și acceptat de către organism
[187]
Prezența macrofagelor inclusiv dezvoltarea țesutului de granulație este un răspuns firesc din
partea organismului ca parte a comportamentului normal de degradare a materialelor cel puțin
icircn cazul biomaterialelor degradabile [188]
De asemenea macrofagele modulează reacția tisulară prin producerea de interleukine
factori de creștere și alți agenți bioactivi precursori ai celulelor gigant de corp străin [189]
Interacțiunea macrofage-limfocite este una complementară Probabil adeziunea macrofagelor la
o suprafață este semnalul pentru activarea limfocitelor iar prezența limfocitelor influențează la
racircndul lor activitatea macrofagelor [190] și fuziunea [191]
Următoarea etapă a răspunsului gazdei este marcată de atracția monocitelor și acțiunea
mastocitelor cu eliberarea de histamină [192] Această reacție este unică și nu pare să depindă de
tipul de implant Amploarea reacției și grosimea stratului inflamator (index pentru
biocompatibilitate) depinde de natura chimică și topografia implantului Anderson consideră că
prezența celulelor mononucleare inclusiv limfocite și celule plasmatice este considerată
inflamație cronică icircn timp ce reacția la corp străin cu dezvoltarea țesutului de granulație este
considerată un proces de videcare normal a unei răni ca răspuns la implantul de biomateriale La
34 de zile de la implant icircn cazul tuturor celor trei suporturi se observă o tendință de icircnglobare
tisulară a acestora prin invazie conjunctivă (scorul mediu al icircncapsulării a fost de 1 sub 05 mm)
și un infiltrat inflamator redus Este un proces normal de invazie a fibroblastelor și de sinteză a
matricei extracelulare prin acești fibroblaști activi Se termină icircntr-un strat interior de macrofage
șisau celule de corp străin cu o zonă secundară icircn afara fibroblaștilor și țesutului conjunctiv care
icircnconjoară materialul de implant [193]
După 64 de zile de la implantare se icircnregistrează o tendință evidentă de asimilare și
resorbție a celor trei tipuri de biomateriale și delimitarea acestora icircn insule mici izolate de țesut
fibros Răspunsul organismului icircn cazul celor trei tipuri de materiale a fost unul normal
caracterizat printr-o reacție inflamatorie acută a cărei intensitate s-a redus după primele 48 de
ore Grosimea capsulei fibroase este sub 05 mm (scor 1) aspect care influențează icircn mod pozitiv
degradarea și resorbția materialului icircn timp acestea făcacircdu-se ușor și fără o reacție celulară
semnificativă
139
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
53 Concluzii
Utilizacircnd același procedeu biomimetic de co-precipitare și același program
experimental folosite și icircn capitolul 4 s-au preparat 13 suporturi notate S1 ndash S13 Diferența icircntre
cele două loturi de suporturi preparate pentru potențiale aplicații icircn regenerarea osoasă a fost dată
de forma de prezentare a MNPs incluse icircn compoziție Icircn capitolul 4 MNPs au fost incluse icircn
sinteză sub formă uscată pe cacircnd icircn capitolul de față au fost introduse sub formă de suspensie
coloidală icircn apă urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura
suporturilor Pentru ambele loturi s-a folosit o concentrație de 5 MNPs față de cantitatea de
substanță uscată de biopolimeri și fosfați de calciu introduse icircn sinteză
Datele FTIR au evidențiat prezența de picuri caracteristice pentru toate
componentele suporturilor La fel ca icircn capitolul precedent o parte din suporturi au fost
sterilizate prin expunere la radiații UV timp de 4 ore Comparacircnd datele FTIR pentru suporturile
expuse la UV și cele ne-expuse nu s-au observat diferențe benzile reprezentative ale grupărilor
funcționale specifice componentelor suporturilor avacircnd valori foarte apropiate sau chiar egale
Datele XRD și EDS au analizat tipurile de fosfați de calciu formate pe matricea
polimerică cele mai reprezentative forme identificate fiind fosfat dicalcic ndash CaHPO4
hidroxiapatită ndash Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2 și fosfatul tetracalcic ndash Ca4(PO4)2O
Datele SEM au evidențiat o structură poroasă CP și MNPs fiind distribuite
uniform icircn matricea polimerică Ca și icircn cazul datelor FTIR s-a studiat icircn paralel și morfologia
suporturilor expuse la radiații UV demonstracircndu-se că acest tip de sterilizare nu influențează
morfologia acestora Un studiu mai detaliat al morfologiei a fost studiat cu ajutorul analizei
microCT Rezultatele au indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra
porozităţii suporturilor
Valorile obţinute pentru modulul lui Young se situează icircn intervalul 7628 MPa ndash
279 47 MPa Rezultatele sunt icircncurajatoare deoarece modului lui Young pentru osul spongios
se icircncadrează icircntre 20 MPa și 500 MPa
140
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn ceea ce privește proprietățile magnetice ale suporturilor s-a calculat
magnetizarea valorile obținute fiind cuprinse icircntre 2241 și 6733 emug Aceste valori indică
faptul cu suporturile sunt superparamagnetice
Gradul de retenție al suporturilor are valori foarte mari cuprinse icircntre 945 și
2248 valori corelate cu structura poroasă și proprietățile hidrofile ale biopolimerilor din
compoziție Degradarea enzimatică a suporturilor s-a realizat cu o viteză constantă icircn timp atacirct
pentru Cs cacirct și pentru Col
Citotoxicitatea in vitro a suporturilor a fost testată pe trei linii celulare diferite
fibroblaste osteoblaste și celule STEM Un test MTT standard a fost realizat la 24 ore 48 ore și
72 ore la fiecare timp calculacircndu-se viabilitatea celulară Suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor cele mai bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Pentru osteoblaste s-au
obținut valori mai reduse ale viabilității celulare comparativ cu celelate două linii celulare
explicate de sensibilitatea ridicată a acestui tip de celule
Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost studiată pe șoareci femele din linia
CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de la implantarea subcutanată a
fragmentelor sterilizate de suporturi O reacție inflamatorie acută a avut loc icircn primele ore de la
implantarea a cărei intensitate s-a redus dupăprimele 48 ore Analizacircnd icircn amănunt datele
histlogice obținute la diverse intervale de timp la sfacircrșitul testului s-a ajuns la concluzia că
suporturile nu au efect citotoxic in vivo totodată s-a observat asimilarea și resorbția suporturilor
141
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
Reproductibilitatea este una din ipotezele de bază icircn experimentele științifice Dacă un
experiment nu este reproductibil rezultatele lui nu poate fi dovedite deci prin urmare nu pot fi
acceptate
Acest aspect a creat dificultăți majore icircn majoritatea domeniilor științifice De exemplu icircn
domeniul biologic probele de microbiologie depind direct de tulpinile acestora ceea ce conduce
la o lipsă de consecvență a rezultatelor deoarece fiecare grup de cercetare poate folosi propriile
tulpini Dificultăți icircn reproductibilitatea experimentelor științifice sunt observate și icircn domeniul
ingineriei tisulare Icircn acest sens icircn timpul oricărui experiment științific trebuie avute icircn vedere
două aspecte importante repetabilitatea și reproductibilitatea metodei acestea fiind componente
ale preciziei icircntr-un sistem de măsurare Cei doi termini se referă la măsurarea unui set de
condiții care includ aceeași procedură aceeași operatori același sistem de măsurare și aceleași
condiții de funcționare Repetabilitatea are loc icircn aceași locație pe cacircnd reproductibilitatea are
loc icircn locații diferite [196 197]
Reproductibilitatea slabă pune la icircndoială rezultatele științelor biomedicale Problema
principală este dată de complexitatea procesul de cercetare științifice
Icircn capitolele 4 și 5 au fost prezentate prepararea și caracterizarea a două loturi de suporturi
ambele fiind realizate printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare Icircn acest scop soluţii de
precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost amestecate cu soluţii de
biopolimeri Cs (1) C (1) Hya (1) şi MNPs pH-ul amestecului a fost ajustat la 72-74
utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac ndash NH4OH iar după spălare amestecurile au fost liofilizate
pentru 24 h
Diferenţa dintre cele două loturi de material este data de modalitatea de incluziune a
particulelor magnetice icircn etapa de sinteză a suporturilor obţinacircndu-se icircn cele din urmă
142
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Lot numărul 1 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată
Lot numărul 2 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
Pentru ambele loturi a fost utilizat un program experimental cu două variabile (concentrația
de chitosancolagen și raportul CaP) cu scopul de a se determina compoziția optimă a
suporturilor Respectacircnd valorile teoretice din programul experimental s-au obţinut 13 probe
Concentraţia de Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză
iar pentru raportul CaP au fost alese valori apropiate de cele identificate icircn țesutul osos uman
611 Obținerea suporturilor
Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi lotul numărul 2 s-a
dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul numărul
9 ndash S9 s-a dovedit a fi cel mai aproape de un suport ideal
Astfel pentru a demonstra reproductibilitatea metodei obiectivele următoare au fost
obţinerea şi caracterizarea a 7 suporturi avacircnd compoziţia teoretică a suportului 9
Suporturile obţinute au fost notate S91 ndash S97 și au fost caracterizate din punct de vedere
al structurii chimice utilizacircnd spectroscopia IR cu transformată Fourier ndash FTIR iar din punct de
vedere al morfologiei prin microscopie electronică de baleiaj ndash SEM și micro computer-
tomografie (microCT)
De asemenea s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
143
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
612 Rezultate şi discuţii
6121 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată utilizacircnd spectroscopia icircn infraroşu cu transformată
Fourier ce determină interacțiunile dintre cei trei biopolimeri fosfați de calciu și particulele
magnetice Rezultatele redate icircn figura 61 indică prezenţa picurilor caracteristice tuturor
componentelor cei trei biopolimeri fosfații de calciu și nanoparticule magnetice iar icircn tabelul
61 sunt prezentate benzile lor representative [136]
Figura 61 Structura chimică a suporturilor
După cum se poate observa atacirct icircn figura 61 cacirct și icircn tabelul 61 suporturile analizate au
structură chimică asemănătoare componentele din structura lor avacircnd benzile reprezentative
apropiate sau chiar egale
144
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Tabel 61 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S92 şi S97
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
S92 S97
3422 OH 3420 OH
2927 C-H 2926 C-H
1655 Amida I C=O 1656 Amida I C=O
1554 Amida II N-H 1554 Amida II N-H
1074 C-O-C 1069 C-O-C
604 Fe-O 602 Fe-O
562 PO3_4
561 PO3-4
6122 Morofologia suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată pentru o imagine de ansamblu cu ajutorul
microscopiei electronice de baleiaj (figura 62) Nu se observă diferenţe de morfologie icircntre
suporturile analizate fiind observată icircn ambele cazuri și la ordine de mărire diferite o structură
tridimensională cu pori intercomunicabili structură ce include atacirct cristale de fosfaţi de calciu cacirct
şi nanoparticule magnetice distribuite icircn matricea polimerică
Pentru o imagine mai detaliată asupra morfologiei suporturilor fragmente din acestea au
fost scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi
o rotaţie de 05deg Tehnica utilizată a fost descrisă pe larg icircn capitolul 5 sub-capitolul 523
Programul CTVox (Bruker Belgium) a fost utilizat icircn vederea vizualizării distribuţiei
porozităţii O funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste reconstrucţia 3D
a probei de investigat iar apoi un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare după cum se
poate observa icircn figura 63 Icircn tabelul 62 sunt prezentate dimensiunea distribuţia porilor
volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
145
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 62 Morfologia suporturilor
Figura 63 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suportul S94
Tabel 62 Dimensiunea porilor suportului S94
Dimensiunea porilor Volumul regiunii de interes Aria regiunii de interes
121plusmn5613 microm
144912 mm
3 769888 mm
2
146
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn figurile 64 Valorile obţinute pentru rezistența
la compresiune se situează icircn jurul valorii de 58 MPa iar valorile modulului Young sunt
cuprinse icircntre 215 MPa şi 220 MPa valori
Figura 64 A Rezistenţa la compresiune a suporturilor B Modulul Young pentru suporturi
Aceste valori sunt icircn mare parte determinate de porozitatea ridicată a compozitelor obţinute
prin procedeul de liofilizare Se observă valori apropiate ale rezistenței la compresiune a
suporturilor precum și a modului Young calculat metoda este deci reproductibilă și din punct de
vedere al proprietăților mecanice ale suporturilor obținute
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Rezultatele obținute icircn urma studiului de determinare a retenției fluidelor de interes
biologic sunt redate icircn figura 65
Figura 65 Grad de retenţie maxim
0
200
400
600
800
1000
1200
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Gra
d d
e re
ten
ție
maxi
m
()
72 ore
147
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor
dovedită de datele de microscopie electronică de baleiaj (figura 62) Acestea sunt cuprinse icircntre
685 și 909 cu o medie a valorilor obținute de 781 Această diferență de 224 icircntre
valoarea maximă și valoarea minimă obținute poate fi explicată de faptul că dimensiunea porilor
nu este uniformă conform tabelului 62 această este de 121 plusmn 5613 pentru suportul S94
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea enzimatică este cea mai utilizată metodă de caracterizare a biodegradabilității
unui suport Suporturile S91 ndash S97 au fost supuse degradării enzimatice determinacircndu-se
concentraţia de chitosan respectiv de colagen degradat la intervalie stabilite
Concentraţia de chitosan degradat
Se observă o creştere graduală icircn timp a concentraţie de chitosan degradat (figura 66) ceea
ce indică o degradare controlată a suporturilor proprietate foarte importantă pentru aplicaţia
vizată deoarece o rată de degradare prea rapidă implică o refacere incompletă a ţesutului osos
iar o rată de degradare prea lentă poate duce la o fractură sau la o deformaţie a osului Se pot
observa valori apropiate ale concentraţie de chitosan degradat ceea ce indică reproductibilitatea
metodei de sinteză
Figura 66 Concentraţia de chitosan degradat
0
015
03
045
06
075
09
105
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
(Co
nce
ntr
aţi
e ch
ito
saln
deg
radat)
∙
10
0 m
mo
liL
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
148
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Concentraţia de colagen degradat
Analizacircnd figura 67 se observă valori constante icircn timp ale concentraţie de colagen
degradat Ca și icircn cazul chitosanului degradarea colagenului se realizeză gradual pe măsură ce
enzima icircn cazul de față colagenaza reușește să străbată matricea anorganică formată din fosfați
de calciu și să ajungă la matricea organică polimerică
Valorile obținute pentru cele 7 suporturi analizate sunt apropiate procesul de degragare
gradual fiind observată pentru toate cazurile
Figura 67 Concentraţia de colagen degradat
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
Fragmente de suporturi au fost puse icircn contact direct cu osteoblaste rezultatele fiind redate
icircn figura 68A Valorile obţinute pentru viabilitatea celulară sunt icircn jur de 80 pentru toate
intervalele de contact ceea ce indică faptul sunt lipsite de citotxicitate
Icircn urma contactului direct al suporturilor cu fibroblaste rezultate redate icircn figura 68B s-
au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de
aproximativ 100 pentru toate ambele suporturi ceea ce indică a foarte bună citompatibilitate a
probelor
0
05
1
15
2
25
3
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Co
nce
ntr
ţia
de
cola
gen
deg
rad
at
m
moli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
149
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 68 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile
A Utilizacircnd osteoblate B Utilizacircnd fibroblaste
Pentru a reconfirma citocompatibilitatea suporturile la contactul direct cu fibroblastele și
reproductibilitatea metodei de sinteză s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-
AM rezultatele obţinute fiind prezentate icircn figura 69
Figura 69 Viabilitatea fibroblastelor icircn contact direct cu suporturile
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu fragmente
de suporturi după 72 ore de contact direct
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 B
150
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
Corelate cu alte afecțiuni maligne tumorile primare sunt destul de rare și mai puțin
frecvente reprezentacircnd doar 02 din toate neoplasmele raportate icircn Marea Britanie și Statele
Unite [198] Icircn plus tumorile primare sunt depășite ca număr de metastaze date de carcinom
melanom sau afecțiunile maligne hematologice cum ar fi plasmacitomul De asemenea alte
condiții non-neoplazice cum ar fi unele procese inflamatorii chisturile osoase displazia fibroasă
sau boala Paget depășesc cazurile de tumori osoase primare [199] Cele mai frecvente tumori
osoase maligne sunt osteosarcomul (35) condrosarcomul (25) sarcomul Ewing (16)
chordomul (8) și histiocitomul fibros malign (5) [200]
Tratamentul tumorilor osoase maligne reprezintă o adevărată provocare clinică deoarece
rezecția chirurgicală a tumorii și radioterapia nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral
Chimioterapia care precede de regulă celelalte două tehnici are efecte adverse semnificative și
totodată icircn unele cazuri poate apărea o rezistență la aceste medicamente Există icircnsă și o serie de
tratamente alternative cum ar fi hipertermia terapia țintită imunoterapia fototerapia utilizarea
nanoparticulelor transplant de celule stem și altele unele din ele aflate icircncă icircn faza de studiu dar
care vor oferi cel mai probabil soluții foarte bune icircn viitor [201] Imunoterapia icircmbunătățește
capacitatea celulelor imune de a recunoaște și ținti celulele tumorale ceea ce duce la eliminarea
lor Avantajele imunoterapiei includ specificitate ridicată anti-tumorală și efecte secundare
minime prin folosirea propriului sistem imunitar al pacientului Hipertermia este un tratament
modern ce implică creșterea temperaturii la locul țintă pentru a induce astfel un stres termic
temperatura la care se ajunge fiind icircn medie 40degC (39ndash43degC icircn funcție de strategia terapeutică)
[202]
Icircn mod particular protocolul de tratament al osteosarcoamelor icircncepe cu rezecția
chirurgicală a tumorii osoase primare și a eventualelor metastaze Defectul osos obținut este
acoperit cu un material de substituție osoasă pentru a preveni fracturile sau deformațiile osoase
[203] Deoarce tumorile osoase sunt aproape imposibil de icircndepărtat icircn totalitate intervențiile
chirurgicale sunt urmate de radiochimioterapie [204]
Icircn cazul unor tumori osoase tratamentul implică două etape Icircntr-o primă etapă țesutul
tumoral este icircndepărtat chirurgical iar icircntr-o a doua etapă defectul osos obținut este acoperit cu
151
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
un material de substituție osoasă tot mai studiate fiind suporturile magentice biomimetice Icircn
prezența unui cacircmp magnetic aceste suporturi vor atrage alte particule magnetice introduse icircn
circulație Acestea din urmă vor fi funcționalizate cu medicamente chimioterapice precum și cu
factori de creștere care să susțină procesul de regenerare osoasă și formare de neo-țesut
Radioterapia se icircncadrează adesea icircn schemele de tratament a diferitelor tipuri de cancer
rezultatele obținute de-a lungul timpului icircn practica clinică fiind eficiente Utilizacircnd radiații
ionizate raze X radioterapia generează stres oxidativ excesiv și induce denaturarea ADN-ului
ce va conduce la moartea celulelor tumorale Radioterapia este o metodă neinvazivă de
tratament radiația fiind aplicată la locul țintă pe cacirct posibil Un dezavantaj al metodei este acelă
că unele celule sunt radiorezistente Icircn cazul icircn care este observat acest fenomen se impune
utilizarea unei doze excesive de radiații care icircnsă va distruge celulele adiacente sănătoase Din
acest motiv există scheme de tratament de radio-sensibilizare de exemplu se poate combina
chimioterapia de radio-sensibilizare cu radioterapia [205] Icircn ceea ce privește tumorile osoase
radioterapia are ca efect de scurtă durată o reducere a densității minerale osoase imediat după
expunerea la radiații dar ulterior induce re-calcifierea leziunii etapă a procesului complex de
remodelarea osoasă Se presupune că icircn cazul pacienților cu răspuns bun la acest tip de terapie
este nevoie de aproximativ 3 luni pentru ca osul să fie refăcut [206]
Medicamentele chimioterapeutice sau citostatice sunt fie substanțe naturale fie derivați
sintetici ai acestora extrase din plante specii marine sau unele microorganisme [207]
Dezavantajele acestei terapii sunt toxicitatea și biodistribuția nefavorabilă a compușilor Sisteme
pentru eliberarea țintită a acestor principii active sunt intens studiate [208]
Icircn acest context polimerii sunt materiale adecvate pentru a transporta medicamente
icircncapsulate sau legate chimic De-a lungul timpului polimerii și nanoparticulele polimerice au
jucat un rol cheie icircn dezvoltarea tehnologiei de eliberare a medicamentelor oferind eliberarea
controlată a agenților terapeutici icircn doze constante pe perioade lungi dozare ciclică și eficiență
mai bună a medicamentelor hidrofile sau hidrofobe [209 210]
Suporturile obținute icircn capitolele anterioare au potențial de a fi utilizate pentru umplerea
defectului osos rezultat după rejecția chirurgicală a tumorii și totodată pentru eliberarea țintită
de chimioterapice icircncorporate icircn nanoparticulele magnetice din structura lor Scopul strategiilor
experimentale descrise icircn cele ce urmează a fost testare potențialului suporturilor obținute de a fi
utilizate icircn radiochimioterapia tumorilor osoase maligne Inițial suporturile au fost expuse la
152
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
radiații X pentru a stabili influența asupra structurii și proprietăților acestora Icircn etapa următoare
s-a studiat icircncărcarea și eliberarea de chimioterapice (doxorubicină ndash DOX) din nanoparticulele
magnetice incluse icircn suporturi
621 Obținerea suporturilor
Șase suporturi au fost preparate după protocolul descris icircn capitolul 5 Pe scurt suporturile
au fost obținute prin co-precipitarea CaCl2 și a NaH2PO4 pe un suport de biopolimeri Cs Col
Hya și MNPs icircn prezența unei soluții apoase de amoniac NH4OH Icircn tabelul 63 sunt detaliate
codificările compoziția și caracteristicile distinctive ale suporturilor
Tabel 63 Codificarea și compoziția suporturile obținute și caracteristica lor distinctivă
Codificare
suport Compoziția biopolimerică CaP
Concentrația
de MNPs Caracteristica distinctivă
S5 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Control
S9 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Control
S5R 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S9R 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S5-DOX 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
S9-DOX 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor
Icircn vederea iradierii suporturilor cu raze X s-au urmat pași specificați icircn capitolul 2 sub-
capitolul 2491 și anume
a avut loc o simulare computer-tomograf (CT) icircn condiții similare radioterapiei
(poziționarea laserului plasarea markerilor radio-opaci externi scanarea volumului iradiat cu un
dispoziti de scanare CT special)
conturarea volumului țintă pe imagini complexe CT
stabilirea dozei de radiație
determinarea parametrilor fascicului de radiație (energia de lucru unghiul de incidență
dimensiuni și forme utilizarea accesoriilor optime)
analiza histogramei doză-volum pentru a verifica dacă cel puțin 95 din volumul țintă
a iradiat minim 95 de doza prescrisă
153
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn planul de iradiere denumit CILINDRU secțiunile obținute au fost conturate astfel
suprafața exterioară ca referință (S) materialul (V1) și volumul țintă (V2) V2 = V1 + 5mm
pentru a compensa posibilele eroari de poziție figura 610A
Doza de radiații utilizată a fost de 8 Gy fracțiune unică aceasta fiind doza unică
administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase [211 212 213]
Realizarea unui plan de tratament care să respecte atacirct distribuția omogenă icircn volumul țintă
a dozei prescrise cacirct și constracircngerile legate de doză cu privire la riscul de a afecta organele din
vecinătate impun alegerea cu atenție sporită a tehnicii de iradiere icircn unele cazuri fiind necesară
aplicarea unui bolus la suprafața volumului iradiat De exemplu iradierea peretelui toracic după
mastectomie radicală solicită utilizarea unui bolus icircn vederea obținerii parametrilor optimi ai
planului de tratament tipul și grosimea bolusului fiind incluse icircn algoritmul de calcul Bolusul
permite iradierea pielii cu 100 din doza prescrisă icircn timp ce icircn lipsa acestuia pielea (icircn care icircn
cancerul de sacircn apar aproape toate recidivele locale) este iradiată cu 70 din doza prescrisă iar
țesuturile nețintă (mușchi coaste) primesc 100 din doză Icircn mod similar bolusul este indicat
pentru iradierea tumorilor laringelui cu extensie la comisura anterioară sau a tumorilor vulvare
primare [214]
Planul de tratament a fost realizat utilizacircnd software-ul Eclipsetrade Planning Treatment
System Pentru o distribuție omogenă a dozei icircn volumul materialului a fost plasat un bolus de
10 mm grosime pe suprafața materialului rezultacircnd o includere suficientă icircn izodoza 95
(prezentată icircn verde icircn figura 610B) pentru V2 Termenul de izodoză se referă la suprafețele
care unesc toate punctele la nivelul cărora are loc absorbția unor doze egale de energie radiantă
[215]
Figura 610 A Conturarea volumului țintă pe imaginile CT ale eșantionului B Distribuția dozei
de radiații icircn volum de suport după aplicarea bolusului
154
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Parametrii stabiliți pentru planul de iradiere au fost două raze opuse izocentrice egale
una din poziția zero (AP) cu 6 MV și una posterioră poziționată la 180 de grade (PA) cu 15 MV
(figura 611)
Figura 611 Parametrii planului de iradiere
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină
Nanoparticulele magnetice au fost icircncărcate cu doxorubicină conform protocolului descris
anterior icircn subcaptiol 2492 Pe scurt icircntr-o suspensie coloidală de 1 MNPs icircn apă s-a
solubilizat 0125 doxorubicină nanoparticulele astfel obținute fiind notate cu MNPs-DOX
Suspensia finală a fost utilizată la prepararea suporturilor S5-DOX și S9-DOX conform datelor
experimentale din tabelul 63
Pentru caracterizarea suporturilor s-au analizat morfologia acestora eliberarea controlată
de medicamente antitumorale și citotoxicitatea in vitro la contactul direct cu celule tumorale
Structura chimică a suporturilor preparate a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR
iar morfologia lor cu ajutorul microscopiei electronice SEM
Pentru suporturile S5 S5R S9 S9R a fost analizată interacțiunea cu PBS (grad de retenție
maxim PBS) și s-au efectuat studii de degradare in vitro utilizacircnd un complex de enzime lizozim
(1200 μgml) și colagenază (100 μgml ) conform datelor experimentale din subcapitolul 246
155
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
De asemenea a fost studiată citotoxicitatea citotoxicitatea suporturilor sterilizate (expuse la o oră
la radiațiile UV) utilizacircnd celule osoase din linia MG-63 Un test MTT standard a fost efectuat la
24 48 și 72 de ore și a fost calculată viabilitatea celulară
Pentru suporturile S5-DOX și S9-DOX s-a analizat eliberarea de medicament in vitro
(subcapitol 2492) și interacțiunea cu celule MG-63 Suporturile au fost sterilizate tot prin
expunere la UV pentru o oră după care au fost puse icircn contact direct cu celulele Icircn paralel o
soluție stoc de doxorubincină a fost preparată icircn condiții sterile diferite concentrații fiind
analizate din punct de vedere al interacțiunii cu același tip de celulele Viabilitatea celulară a fost
calculată cu ajutorul unui test MTT standard
624 Rezultate și discuții
Suporturile preparate au fost testate icircn vederea unei potențiale utilizări icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne tehnică redată schematic icircn figura 612
Figura 612 Tratamentul tumorilor osoase maligne utilizacircnd tehnici de radioterapie și
chimioterapie
156
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor
Analiza FTIR a fost utilizată pentru studiul structurii chimice a suporturilor rezultatele
fiind redate icircn figura 613
Icircntre suporturile radiate și neradiate (figura 613A) nu se observă diferențe de structură
chimică benzile de absorbție caracteristice biopolimerilor nanopaticulelor magnetice și
fosfaților de calciu fiind observate icircn toate spectrele FTIR Icircn ceea ce privește biopolimerii se
pot observa următoarele picuri caracteristice 3439 cm-1
3434 cm-1
și 3489 cm-1
pentru gruparea
hidroxil 2925 cm-1
2924 cm-1
și 2927 cm-1
pentru -CH2 1652 cm-1
1654 cm-1
și 1649 cm-1
pentru amida I 1552 cm-1
și 1554 cm-1
pentru amida II [216] Pentru CaP au fost observate
picuri ale grupărilor fosfat la 601 cm-1
și 603 cm-1
iar pentru MNPs au fost observate picuri
caracteristice la 561 cm-1
și 563 cm-1
[99 160]
Figura 613 Spectrele FTIR ale suporturilor
Spectrele FTIR ale suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și al DOX sunt redate icircn figura
613B Spectrul DOX prezintă următoarele benzi caracteristice 2929 cm-1
pentru vibrația de
icircntindere a legăturii C-H 1730 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii C=O 1617 cm-1
și
157
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
1525 cm-1
pentru legătura NndashH 1411 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashC și 1286
cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashOndashC O parte din aceste benzi au fost observate și
pe spectrele corespunzătoare suporturilor S5-DOX și S9-DOX ceea ce sugerează interacțiunea
medicamentului cu celelalte componente ale suporturilor Alte picuri observate pe spectrele celor
două suporturi au fost 3446 cm-1
și 3440 cm-1
pentru gruparea ndashOH 2925 cmminus1
pentru ndashCH2
1654 cm-1
și 1656 cm-1
pentru amida I și altele cu valori apropiate de cele ale suporturilor fără
DOX (figure 613A)
Morfologia suporturilor realizate cu scopul de a fi utilizate icircn regenerarea osoasă este o
caracteristică foarte importantă de care trebuie să se țină cont icircn procesul de sinteză Aceste
suporturi trebuie să aibă porozitatea și dimensiunea porilor adecvate aplicației vizate Rețelele cu
pori interconectați influențează puternic procesul de nutriție a celulelor proliferarea și migrarea
acestora precum și vascularizare suportului [217] Rezultatele acestei analize au fost prezentate
icircn figura 614
Figura 614 Morfologia suporturilor
158
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
Influența radiaților asupra suporturilor a fost analizată și din punct de vedere al
interacțiunii cu fluidele de interes biologic și anume PBS pH = 72 001M S-a utilizat aceași
metodă volumetrică descrisă și icircn capitolele anterioare și s-a calculat gradul maxim de retenție
PBS utilizacircnd formula (14) redată icircn capitolul 2 Rezultatele obținute sunt prezentate icircn tabelul
64 și icircn figura 615
Tabel 64 Gradul de retenţie PBS al suporturilor
Nr crt Denumirea
suportului
Gradul
de retenţie PBS ()
1 S5 995 plusmn 30
2 S5R 1040 plusmn 35
3 S9 990 plusmn 50
4 S9R 987 plusmn 19
Figura 615 Gradul de retenție a suporturilor radiate și acelor neradiate
Diferența dintre valorile gradului de retenție pentru S5 și S5R este de aproximativ 45
iar icircntre S9 și S9R este nesemnificativă Icircn cazul suporturilor S5 și S5R diferență poate fi
explicată de dimensiunea neuniformă a porilor (figura 614) la fel ca și icircn cazul suporturilor
realizate pentru studiul reproductibilității ale cărui rezultate au fost prezentate mai sus Avacircnd
0
200
400
600
800
1000
1200
S5 S5R S9 S9R
Gra
dul m
axim
de
rete
nți
e P
BS
72 ore
159
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
această explicație pentru diferența dintre valorile obținute s-a putut afirma că radiațiile X nu
influențează interacțiunea suporturilor cu fluidele de inters biologic
Degradarea enzimatică a suporturilor a fost studiată utilizacircnd un amestec de două enzime
lizozim și colagenază metoda fiind descrisă icircn detaliu icircn capitolul 2
Potrivit lui Brouwer și colaboratorii [218] concentrația de lizozimă icircn serul uman este de
950-2450 μgL dar niveluri crescute pot fi observate icircn bolile benigne bolile inflamatorii
intestinale unele afecțiuni hematologice (policitemia vera mielomul multiplu) și procesele
maligne cum ar fi leucemiile [219] De exemplu Firkin [220] a raportat un nivel foarte ridicat al
lizozimului seric 30-120 μgml icircn leucemia mieloidă cronică și mielofibroza Icircn ceea ce privește
aceste date din literatură s-a ales o concentrație de 1200 μgml dat fiind că suporturile sunt
destinate tratamentului tumorilor osoase și probabil un nivel ridicat de lizozim va fi găsit icircn os
Deoarece colagenul este cea mai predominantă proteină din corpul uman nivelurile de
colagenază sunt greu de măsurat cu precizie această enzimă fiind găsită icircn toate țesuturile
organele icircn care există colagen Colagenaza interstițială are un rol-cheie icircn remodelarea normală
și patologică a matricelor extracelulare colagen inclusiv a țesutului osos și a țesutului conjunctiv
[221] De asemenea există diferite tipuri de colagenază de ex icircn pielea umană colagenază
secretată de fibroblastelor are două forme de proenzime (57 și 52 kDa) [222]
Rezultatele studiului au fost redate icircn figura 616A ndash reprezentacircnd concentrația de chitosan
degradat și 616B ndash reprezentacircnd concentrația de colagen degradat
Figura 616 A Concentraţia de chitosan degradat B Concentrația de colagen degradat
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
S5 S5R S9 S9R
(Conce
ntr
ația
de
Cs
deg
radat
) ∙
100
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
0
001
002
003
004
005
006
007
008
S5 S5R S9 S9R
Conce
ntr
ați
a de
cola
gen
deg
radat
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile A B
160
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Se observă icircn ambele cazuri o creștere graduală a concentrației de polimer degradat
chitosan respective colagen Valorile obținute sunt comparabile de unde s-a ajuns la concluzia
că radiațiile nu influențează nici interacțiunea suporturilor cu fluide biologice simulate icircn cazul
de față un complex de enzime icircn PBS pH=72 001M
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată prin contactul direct a suporturilor cu
osteoblastele liniei MG-63 figura 617
Valoarea viabilității calculată conform ecuației (15) din capitolul 2 scade icircn timp
fenomen observat și icircn celelalte studii de citoxicitate pe aceast tip de celule La 72 ore de la
contactul direct al celulelor cu fragmente de suport se observă o diferență de aproximativ 10
procente icircntre suporturile care nu au fost expuse radiațiilor și cele care au fost expuse Rezultatul
nu trebuie interpretat ca și negativ icircn condițiile icircn care rolul radiațiilor este de a distruge ceulele
tumorale osteoblastele Mg-63 fiind o linie de celule tumorale (osteosarcoame)
Radiațiile au fost absorbite de aceste suporturi cu o posibilă formare de radicali liberi fără
icircnsă a influența structura lor chimică morfologia și interacțiunea cu medii biologice simulate
Fenomenul este dificil de icircnțeles studii complexe fiind necesare icircn acest sens
Figura 617 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile
0
20
40
60
80
100
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itat
ea c
elula
ră
Control S5 S5R S9 S9R
161
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn concluzie rezultatele primei părți a studiului și anume studiul influenței radiațiilor X
asupra suporturilor au arătat rezultate icircncurajatoare structura chimică a suportului morfologia și
comportamentul de degradare enzimatică nu sunt influențate de razele X utilizate icircn radioterapie
ceea ce icircnseamnă că suporturile pot fi utilizate icircn continuare icircn chimioterapie
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale
Sistemele magnetice de eliberare controlată a medicamentelor au multiple avantaje față de
metodele normale cum ar fi abilitatea de a viza un anumit loc țintă icircn organism și reducerea
cantității de medicament necesară pentru a atinge o anumită concentrație la locul țintă ceea ce
implică o reducere a concentrației medicamentului icircn organele din vecinătate fiind minimizate
efectele secundare [223]
Doxorubicina - DOX este un potențial medicament pentru tratamentul metastazelor osoase
și a tumorilor osoase dar utilizarea sa este limitată de efectele secundare sistemice DOX este un
antibiotic antraciclinic care la nivel molecular interacționează cu ADN-ul și interferează cu
sinteza acidului nucleic rezultacircnd un efect remarcabil asupra transcripției AND [224 225]
Pentru aplicații icircn chimioterapia osoasă DOX este utilizat icircn sistemele de eliberare a
medicamentelor fabricate din diferite suporturi magneticecompozite apatită nanocristalină
[226] hidroxiapatită [227] chitosan și hidroxiapatită [228] acid poliglicic-co-glicolic -
polietilenglicol (PEG-PLGA) [87] microsfere magnetice
Icircn ceea ce privește eliberarea in vitro a DOX din suporturi o eliberare treptată poate fi
observată icircn figura 617
162
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 617 Curbele cinetice de eliberare a DOX din suporturi
Pentru suportul S5-DOX eliberarea a fost mai constantă icircn timp De remarcat este faptul că
aceast suport are o cantitate considerabilă de chitosan icircn compoziție comparativ cu S9-DOX
Trebuie reamintit fapul că toate MNPs utilizate icircn teza de față au fost acoperite cu chitosan
pentru o mai bună citocompatibiliate și pentru a putea lega principii active
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
Interacțiunea suporturilor preparate icircn sub-capitolul de față a fost studiată icircn paralel cu
interacțiunea suporturilor fără medicament icircncorporat pentru a putea realiza o analiză
comparativă S-a optat pentru contactul direct al fragmentelor de suport iar drept celule
tumorale s-au utilizat tot osteoblaste din linia MG-63 Rezultatele studiului sunt redate icircn figura
618
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 50 100 150 200 250 300 350
Conce
ntr
ați
a d
e D
OX
(μgm
L)
Timp ore
S5-DOX S9-DOX
163
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 618 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct A Cu soluții
de DOX de concentrații diferite B Cu suporturile avacircnd DOX icircn compoziție și a celor fără DOX
Viabilitatea celulară a suporturilor a fost aproape de 100 la primii 2 timpi de contact 24
și 48 ore atacirct pentru suporturile cu medicament cacirct și pentru cele fără medicament Icircnsă la 72 ore
de contact a suporturilor cu osteoblastele s-a observat o scădere semnificativă a viabilității
acestora valorile obținute fiind 64 pentru S5-DOX respectiv 75 pentru S9-DOX pentru
suporturile fără DOX valorile au scăzut nesemnificativ Această scădere bruscă de viabilitate ar
putea fi explicată de faptul cu DOX este eliberată treptat din suporturi la un raport relativ scăzut
proprietate de eliberare lentă a DOX poate fi utilizată și pentru că alte medicamente anti-
tumorale puternice sau combinații de medicamente ar putea fi transportate la desemnate zona și
eliberat la un raport optim pentru combaterea tumorilor [229]
164
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
63 Concluzii
Reproductibilitatea un experiment este foarte importantă icircn vederea transpunerii
rezultatelor obținute icircn practică Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi
preparate și caracterizate icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai
adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate
Pentru a demonstra reproductibilitatea metodei 7 suporturi avacircnd compoziţia
teoretică a lui S9 au fost preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a
compoziției din punct de vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn
fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate
celulară cu Calceină-AM
Toate analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă
este reproductibilă
Icircn a doua parte a studiului s-a testat potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircn primul racircnd s-a demonstrat că o doză de radiații X
similară cu cea utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile
suporturilor cum ar fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea
in vitro
Suporturile conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic
pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și
lentă a DOX sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn
terapia combinată a tumorilor osoase maligne
165
Concluzii generale
Concluzii generale
Osul este un țesut care are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn cazul unor
afecţiuni minore fiind supus de-a lungul vieții la procese biologice complexe de creştere
modelare şi remodelare Procesul de regenerare nu este suficient icircn cazul defecte osoase grave ce
au drept factori determinați principali rezecţiile de tumoră osoasă malformaţiile congenitale
unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita Toate acestea fac ca anual la
nivel mondial să fie utilizate peste 2 milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă
Materiale de substituţie osoasă pot fi clasificate icircn mai multe categorii grefe de origine naturală
(autogrefe alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria
tisulară precum şi diverse combinaţii ale acestora
Biomaterialele prelucrate sub divere forme (suporturi macroporase sisteme injectabile
capsule filme matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri și altele) sunt
elemente cheie icircn ingineria tisulară Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de
calciu s-au dovedit a fi o soluție promițătoare icircn ingineria tisulară și medicina regenrativă a
țesutului osos unele variante comerciale fiind folosite cu succes icircn practica clinică La
prepararea acestora trebuie să se țină cont și de nano-structura osului nu doar de compoziția sa
suporturile obținute prin procedee biomimetice fiind cele mai de succes
Nanoparticulele magnetice sunt folosite la o varietate de aplicații medicale clinice și
preclinice Eliberarea controlată de medicamente este un domeniu intens studiat icircn zilele noastre
iar utilizarea nanoparticulele magnetice icircn acest scop reprezintă un subiect de mare interes pentru
un număr considerabil de cercetători
Obiectivul central al lucrării de față a fost obținerea și caracterizarea de suporturi
compozite printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare a precursorilor de fosfați de calciu pe
un amestec de biopolimeri și nanoparticule magnetice pentru a fi testate icircn regenerarea osoasă
Biopolimeri utilizați au fost colagen chitosan acid hialuronic albumină serică bovină și
gelatină iar fosfații de calciu au fost obținuți din precursori pornindu-se de la un raport teoretic
CaP comparabil cu cel identificat icircn osul uman Nanoparticulele magnetice au fost incluse
pentru studii ce au vizat icircncorporarea și eliberarea controlată de principii biologice
166
Concluzii generale
Suporturile au fost caracterizate riguros din punct de vedere fizico-chimic și biologic S-a
icircnceput cu studiul structurii chimice a compoziției și morfologiei suporturilor după care s-a
studiat interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și cu soluții enzimatice
Proprietățile mecanice ale suporturilor au fost analizate din perspectiva modului de elasticitate
Young iar proprietățile magnetice din perspectiva susceptibilității magnetice a acestora Din
punct de vedere biologic suporturile au interacționat direct sau indirect cu diverse linii celulare
și s-au implantat sub-cutanat la șoareci icircn vederea determinării citotoxicității acestora Conceptul
de terapie combinată ce implică utilizarea radioterapii și chimioterapii a fost analizat icircntr-o
ultimă etapă pentru suporturile obținute
Pentru stabilirea compoziției optime s-au realizat icircn paralel suporturi pe bază de
biopolimer amestecuri diferite de biopolimeri (chitosan chitosan ndash acid hialuronic chitosan ndash
albumină serică bovină și chitosan ndash gelatină) și fosfați de calciu obținuți din precursori raportul
teoretic CaP fiind de 165 Trei concentrații diferite de nanoparticule (1 3 5 ) au fost
icircncorporate pe racircnd icircn sinteza celor patru tipuri de suporturi Structura chimică și compoziția
suporturilor au indicat prezența picurilor caracteristice componetelor incluse icircn sinteză Datele cu
privire la compoziția suporturilor au indicat prezența unor tipuri de fosfați de calciu identificați și
icircn literatură preponderenți fiind hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul monocalcic anhidru
Ca(H2PO4)2 fosfatul tricalcic (Ca3(PO4)2) S-a calculat magnetizarea suporturilor concentrația
de 5 fiind cea mai apropiată de datele regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective Studiile
privind interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic soluții enzimatice și celule au
indicat o corelație icircntre porozitatea materialelor și proprietațile de interacțiune cu fluide și medii
biologice
Avacircnd icircn vederea datele obținute anterior obiectivul următor a fost realizarea și
caraterizarea de suporturi pe bază de colagen ndash chitosan ndash acid hialuronic nanoparticule
magentice și fosfați de calciu S-a selectat concentrația de 5 MNPs pentru a fi inclusă icircn etapă
de sinteză particulele fiind introduse icircn formă uscată O parte din proprietățile suporturilor au
fost studiate icircn paralel cu cele ale suporturilor expuse la radiații UV timp de 4 ore cu scopul de a
observa eventuale modificări survenite după această procedură de iradiere folosită icircn practica
clinicăpreclinică pentru sterilizare Nu au fost observate diferențe icircn ceea ce privește structura
167
Concluzii generale
chimică și morfologia suporturilor Gradul de retenție PBS a fost influențat semnificativă de
raportul CaP Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul ambilor
biopolimeriValorile obţinute pentru modului lui Young sunt comparabile cu cele ale ţesutului
osos spongios uman Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor Interacțiunea in vitro cu
celule (fibroblaste și osteoblaste) a dovedit faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor caracterul non-citotoxic fiind evidențiat de un test sub-cutanat in vivo
Respectacircnd compoziția de biopolimeri și fosfați de calciu precum și concentrația de
MNPs un lot nou a fost realizat diferența față de cel descris anterior fiind dată de metoda de
includere a MNPs și anume au fost introduse sub formă de suspensie coloidală icircn apă
urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura suporturilor S-au
utilizat aceleași tehnici de caracterizare ca cele descrise la punctul anterior Icircn plus un studiu mai
detaliat al morfologiei a fost realizat cu ajutorul analizei microCT Rezultatele au indicat o
influenţă semnificativă a conţinutului de fază minerală asupra porozităţii suporturilor
Proprietățile mecanice ale suporturilor sunt comparabile cu cele ale țesutului osos spongios iar
din punct de vedere al proprietăților magnetice suporturile sunt superparamagnetice
Interacțiuneain vitro a suporturilor cu celule a fost testată pe fibroblaste osteoblaste și celule
STEM Un test MTT standard a evidențiat faptul că suporturle nuafectează celulele cele mai
bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost
studiată pe șoareci femele din linia CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de
la implantarea subcutanată a fragmentelor sterilizate de suporturi iar icircn final s-a ajuns la
concluzia că suporturile nu au efect toxic in vivo Totodată s-a observat asimilarea și resorbția
suporturilor
Icircn urma unor analize detaliate ale celor două loturi de suporturi preparate și caracterizate
icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia
vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate Pentru evaluarea
reproductibilității metodei de obținere șapte suporturi avacircnd compoziţia teoretică a lui S9 au fost
preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a compoziției din punct de
vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
168
Concluzii generale
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM Toate
analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă este reproductibilă
Potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne a fost
studiată icircmtr-o ultimă etapă Inițial s-a demonstrat că o doză de radiații X similară cu cea
utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile suporturilor cum ar
fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea in vitroSuporturile
conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic pentru tratamentul
metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și lentă a DOX
sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn terapia combinată
a tumorilor osoase maligne
12222 Metode de obținere a suporturilor pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă
34
12223 Suporturi biomimetie pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
pentru regenerarea osoasă
37
13 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice pentru regenerarea osoasă
39
131 Suporturi magnetice cu biopolimeri 41
1311 Suporturi magnetice cu proteine 41
1312 Suporturi magnetice cu polizaharide 45
132 Suporturi magnetice cu polimeri sintetici 46
133 Suporturi magnetice pe bază de biomateriale ceramice 49
1331 Sticle ceramice bioactive 49
1332 Fosafați de calciu 51
14 Concluzii 51
PARTEA EXPERIMENTALĂ
Capitolul 2 Materiale şi metode experimentale 53
21 Strategie experimentală Obiective 53
22 Materiale utilizate 55
221 Materiale utilizate pentru prepararea suporturilor 55
222 Materiale utilizate pentru caracterizarea suporturilor 56
23 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
61
231 Obţinerea particulelor magnetice 61
232 Obținerea suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de
particule magnetice
61
233 Program experimental 62
24 Metode de caracterizare 65
241 Caracterizarea structurală a suporturilor 65
2411 Analiza prin Spectroscopia icircn infraroşu cu transformată Fourier (FTIR) 65
2412 Spectroscopia de raze x prin dispersie de energie (EDS) 65
2413 Difracţie cu raze X (XRD) 66
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor 67
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM) 67
2422 Micro computer-tomografia (microCT) 68
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor 68
244 Propritățile magnetice ale suporturilor 70
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic 71
246 Studii de degradare enzimatică in vitro 72
247 Teste de citotoxicitate in vitro 76
2471 Testul MTT 78
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 79
248 Teste de citotoxicitatea in vivo 80
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
81
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi 82
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază
de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și
fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
83
31 Obţinerea suporturilor 85
32 Rezultate și discuții 86
321 Structura chimică a suporturilor 86
322 Compoziția suporturilor 87
323 Morfologia suporturilor 90
324 Proprietăţi magnetice 91
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 92
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 94
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 96
3271 Testul MTT 96
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 97
33 Concluzii 99
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
100
41 Obținerea suporturilor 100
42 Rezultate și discuții 103
421 Structura chimică a suporturilor 103
422 Morfologia suporturilor 105
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 106
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 108
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat 108
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat 109
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 110
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor 112
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro 113
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor 114
43 Concluzii 117
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
119
51 Obţinerea suporturilor 119
52 Rezultate și discuții 122
521 Structura chimică a suporturilor 122
522 Compoziția suporturilor 123
523 Morfologia suporturilor 124
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor 127
525 Proprietăţilor magnetice ale suporturilor 128
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 129
527 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 130
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat 130
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat 131
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 132
5281 Testul MTT 133
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 133
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor 134
53 Concluzii 139
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
141
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
141
611 Obținerea suporturilor 142
612 Rezultate şi discuţii 143
6121 Structura chimică a suporturilor 143
6122 Morofologia suporturilor 144
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 146
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 146
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor 147
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 148
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
150
621 Obținerea suporturilor 152
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor 152
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină 154
624 Rezultate și discuții 155
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor 156
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
158
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 160
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale 161
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
162
63 Concluzii 164
Concluzii generale 165
1
Introducere
Introducere
Impactul clinic cacirct şi cel economic pentru tratamentul afecţiunilor osoase este uluitor osul
fiind al doilea cel mai transplantat ţesut după transfuziile de sacircnge Numeroase metode de
reconstrucţie a defectelor osoase sunt disponibile icircn practica clinică fiind utilizate autogrefe
alogrefe matrice osoasă demineralizată materiale metalice sau ceramice proteine osoase
morfogenetice factori de creştere și altele Succesul acestor materiale este icircnsă unul limitat
fiecare din ele prezentacircnd dezavantaje considerabile Icircn icircncercarea de a oferi o soluție pentru
rezolvarea problemei menționate tot mai mulți cercetători și-au icircndreptat atenția spre realizarea
de noi materiale pentru ingineria tisulară și regenerarea țesutului osos materiale cu proprietăți și
interacțiuni controlabile Aceste materiale se găsesc sub diverse forme de prezentare suporturi
poroase tridimensionale sisteme injectabile capsule filmemembrane și matrici fibroase și
nano-fibroase hidrogeluri
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă constă icircn rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea
unui material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și
regenerare osoasă ar putea fi un suport compozit poros cu incluziune de particule magnetice
Principalul motiv pentru care se optează pentru un suport compozit este acela că osul natural la
racircndul său este un compozit matricea extracelulară a țesutului osos fiind reprezentată de 60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă
Particulele magnetice care urmează a fi incluse icircn suporturi vor fi funcționalizate cu diferiți
bio-agenți factori de creștere medicamente cu efect chimioterapic icircn vederea unei eliberări
țintite ale principiilor active enumerate Unul din marele dezavantaje ale chimioterapiei efectele
adverse asupra stării generale a pacienților ar putea fi astfel icircnlăturat medicamentele acționacircnd
controlat doar la locul tumori osoase
Obiectivul central al tezei de față vizează obținerea unor astfel de suporturi pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice Cele mai importante
proprietățile impuse unor astfel de suporturi sunt biocompatibilitate lipsa toxicității proprietăți
de suprafață adecvate incluziuni și proliferării celulare osteoconductivitate osteoinductivitate
rata de degradare controlată proprietăți mecanice comparative cu cele ale osului natural etc De
2
Introducere
asemenea foarte important este ca suportul să fie biomimetic icircn vederea integrării adecvate icircn
osul gazdă
Teza de față este structurată icircn două secțiuni principale stadiul actual al cercetărilor icircn
domeniul vizat și rezultate originale
Prima secțiune sintetizează date de literatură și este reprezentată de primul capitol A doua
secțiune este formată din 5 capitole capitolul 2 prezintă materialele și metodele utilizate pentru
obținerea rezultatelor originale prezentate icircn capitolele 3 4 5 și 6
Capitolul 1 prezintă pe scurt date despre anatomia fiziologia și patologia țesutului osos
deoarece fără cunoșterea acestor noțiuni ar fi imposibil de realizat un suport care să permită
regenerarea adecvată a țesutului osos Capitolul cuprinde informații despre materialele deja
utilizate icircn practica clinică pentru regenerarea osoasă și variantele aflate icircn stadiul de cercetare
fiind prezentate pe scurt o parte din cele mai utilizate biomateriale icircn domeniul vizat O atenție
deosebită este acordată suporturilor biomimetice prin prezentarea caracteristicilor acestora
metodelor de obținere a acestora și a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
După un studiu amănunțit a suporturilor magnetice realizate și caracterizate pacircnă icircn prezent icircn
literatura de specialitate s-a realizat o clasificare a acestora icircn funcție de biomaterialele de bază
utilizate icircn sinteza acestora
Capitolul 2 redă inițial strategia experimentală și obiectivele lucrării de față după care sunt
enumerate caracteristicile principale ale materialelor utilizate pentru prepararea suporturilor și a
celor utilizate pentru caracterizarea acestora De asemenea sunt prezentate etapele procesului de
preparare a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule
magnetice precum și metodele de caracterizare a suporturilor obținute Sub capitolul Metode de
caracterizare evidențiază principiile de bază ale tehnicilor folosite condițiile de lucru parametrii
și dispozitivile utilizate
Capitolul 3 a avut drept scop principal realizare și caracterizarea unor suporturi compozite
folosind patru combinații diferite de biopolimeri și trei concentrații diferite de nanoparticule
magnetice Icircn urma analizei structurii chimice a suporturilor a compoziției și morfologiei
acestora a proprietăților magnetice precum și a interacțiunii suporturilor cu fluide de interes
biologic enzime și celule se vor stabili biopolimerii și concentrația de nanoparticule ce vor fi
utilizate icircn capitolele următoare
3
Introducere
Un program experimental s-a utilizat pentru a obține 13 suporturi pe bază de colagen
chitosan acid hialuronic și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată capitolul 4 prezentacircnd prepararea și caracterizarea acestora Pe lacircngă analizele realizate
pentru suporturile din capitolul 3 s-au analizat și proprietățile mecanice ale celor 13 suporturi
precum și citotoxicitate lor in vivo ultimul experiment menționat avacircnd o durată de 21 zile
Același program experimental și aceeași compoziție a suporturilor a fost utilizată și pentru
prepararea suporturilor descrise icircn capitolul 5 diferența fiind dată de faptul că particulele au fost
icircncorporate sub formă de suspensie coloidală Morfologia acestor suporturi a fost studiată icircn
detaliu cu ajutorul tehnicii microCT iar testele de toxicitate in vivo realizate pe aceași specie de
animale utilizate icircn capitolul anterior a avut o durată de mai mare de 64 zile
Capitolul 6 este structurat icircn două părți Prima parte prezintă reproductibilitatea metodei de
preparare a suporturilor iar a doua parte studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircntr-o primă etapă suporturile au fost iradiate cu o doza
unică de raze X administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase fiind analizată apoi
influența radiațiilor asupra proprietăților fizico-chimice și biologice a suporturilor A doua etapă
a studiului a constat icircn icircncărcarea nanoparticulelor incluse icircn suporturi cu doxorubicină
(medicament utilizat icircn practica clinică pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor
osoase) urmată de caracterizarea suporturilor obținute
Lucrarea se icircncheie cu un capitol de concluzii generale și bibliografia cosultată pentru
realizarea acesteia
4
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice pentru regenerarea osoasă
Osul este un țesut conjuctiv specializat dinamic care este suspus unui proces de
remodelare continuă pe parcursul vieții Are rolul atacirct de țesut cacirct și de organ funcțiile sale de
bază fiind de protecție a organelor vitale din cavitatea craniană toracică și a măduvei spinării de
suport a sistemului locomotor Matricea extracelulară a țesutului osos are o componentă organică
și o component anorganică iar celulele țesutului osos sunt osteoblastele osteocitele celulele de
suprafață și osteoclastele Din punct de vedere morfologic osul este fie spongios (trabecular) fie
compact (cortical) Țesutul osos spongios este asociat cu funcțiile metabolice iar țesutul osos
compact este asociat cu rezistența mecanică [1]
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta aceste
defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare Chiar dacă decenii icircntregi autogrefele
au fost utilizate cu precădere dezavantajele acestora au condus la cercetări riguroase pentru
fabricarea unor grefe osoase realizate din biomateriale (polimeri materiale ceramice materiale
metalice) Ingineria tisulară combină cu succes principiile biologiei țesutului osos și principiile
disciplinelor inginerești contribuind la consolidarea pierderilor osoase prin intermediul unor
matrici numite suporturi [2] Icircncorporarea unor sisteme de eliberarea controlată de principii
biologice icircn interiorul suporturilor vor conduce la rezultate remarcabile Nanoparticulele
magnetice funcționalizate pot fi un exemplu de astfel de sisteme
11 Ţesutul osos Structură Fiziologie Patologie
Țesutul osos este un organ foarte important pentru organismul viu Formarea sa este
moderată de mecanisme centrale și locale prin intermediul cărora este remodelat constant icircncă
din viața intrauterină și pe tot parcursul vieții pentru menținerea arhitecturii sale
microstructurale Procesul de remodelare este coordonat de activitățile osteoblastelor și
osteoclastelor care la racircndul lor sunt reglementate de procesele fiziologice de la nivel tisular și
de răspunsul la stimuli biomecanici
5
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
111 Funcțiile țesutului osos
Osul oferă protecție unor organe vitale și joacă de asemenea un rol important icircntr-o serie
de funcții fiziologice hematopoieză menținerea echilibrului acido-bazic funcția de rezervă
minerală funcția de suport a sistemului locomotor
Figura 11 Funcțiile țesutului osos [3]
Canalele medulare ale oaselor lungi găzduiesc celule stem mezenchimale capabile să se
diferențieze icircn precursorii hematopoietici care icircn cele din urmă dau naștere celulelor sanguine
mature
Icircn ceea ce privește menținere echilibrului acido-bazic oasele asigură organismului soluții
tampon carbonat și fosfat icircn timpul acidozei metabolice cronice proces observat icircn acidoza
renală tubulară și acidoza uremică Carbonatul de calciu este cel mai important dintre
componentele acestor soluții tampon asiguracircnd rezervorul de ioni de bicarbonat
6
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Din punct de vedere al rezervei de minerale țesutul osos este rezervorul a aproximativ
85 din fosforul din organism și 99 din calciu din organism
Osul are o rezistență mare la compresiune dar la forțe mari de tracțiune sau tensiune poate
fi fracturat Procentul mare de colagen din matricea organică (90 ) conferă un grad de
elasticitate considerabil țesutului osos dar cu toate acestea osul este un compozit casant [4]
112 Structura ţesutului osos
Țesutul osos este un material compozit format dintr-o matrice extracelulară şi din celule
proprii organizat pe cinci niveluri ierarhice (figura 12) macrostructura osului microstructura
osului sub-microstructura osului nanostructura osului și sub-nanostructura osului [5] [6]
Macrostructura osului este reprezentată de cele două tipuri de țesut osos compact icircntalnit
icircn literatură și sub denumirea de țesut osos cortical și spongios icircntalnit și sub denumirea de țesut
osos trabecular iar microstructura osului (10-500 microm) este reprezentată de componentele celor
două tipuri de țesuturi Țesutul osos cortical are o structură densă fiind format din sistemul
Haversian care la racircndul său este format dintr-un spațiu ce conține vase de sacircnge numit canal
haversian icircnconjurat de lamele osoase ce reprezintă sub-microstructura țesutului osos (1-10
microm) Țesutul osos spongios are o densitate mai mică decacirct a țesutului osos compact și este
format din spații areolare neregulate delimitate de trabecule osoase Spațiile areolare conțin
măduvă hematogenă bogată icircn sacircnge Icircn general țesutul osos compact reprezintă 80 din
sistemul osos dar distribuția celor două tipuri de țesut diferă icircn funcție de regiune
Figura 12 Organizarea structural ierarhică a osului [5]
7
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Nanostructura osului (cacircteva sute de nanometri ndash 1 microm) este reprezentată de fibrele de
colagen și de faza minerală iar sub-nanostructura osului (mai puțin de cacircteva sute de nanometri)
este reprezentată de structura moleculară a componentelor [7] [8]
1121 Matricea extracelulară
Matricea extracelulară este compusă dintr-o componenta organică ce reprezintă 33 din
masa uscată a matricei și o componenta anorganică ce reprezintă 67 din masa uscată a matricei
Componenta organică este formată icircn proporție de 90 din proteine colagenice
predominant colagen de tip I iar restul compoziției reprezintă proteine non-colagenice factori de
creștere și proteine morfogentice osoase Din proteinele non-colagenice regăsite icircn os fac parte
ostocalcina osteopontina fibronectina și sialoproteina osoasă II Osteocalcina cea mai
abundentă proteină non-colagenică din ţesutul osos reprezentacircnd 10-20 din cantitatea totală
are un rol important icircn procesul de mineralizare deoarece se leagă de cristalele de hidroxiapatită
[9] Osteopontina este o glicoproteină fosforilată icircntacirclnită icircn aproape toate ţesuturile
organismului uman piele creier fluidul sanguin cartilaj şi o varietate de tumori Osteonectina
este o glicoproteină bogată icircn cisteină care icircn procesul de mineralizare leagă colagenul de
hidroxiapatită avacircnd rolul unui nucleu de mineralizare reglacircnd formarea şi creşterea cristalelor
de hidroxiapatită [10] De asemenea icircn matricea organică au fost identificați glicozaminoglicanii
nesulfataţi (acid hialuronic) şi sulfataţi (condroitinsulfatul şi keratansulfatul)
Glicozaminoglicanii sulfataţi sunt legaţi covalent de molecule proteice formacircnd proteoglicani icircn
țesutul osos cei mai de icircntacirclniți fiind proteoglicani bogați icircn leucină cu masă moleculară mică
Componenta anorganică este reprezentată icircn cea mai mare parte din ioni de fosfat și ioni
de calciu Pe lacircngă acești ioni se găsesc icircntr-o cantitate considerabilă și bicarbonat sodiu
potasiu citrat magneziu carbonat fluor zinc bariu și stronțiu Ionii de calciu și fosfat formează
cristale de hidroxiapatită care se depun pe matricea colagenică proces icircn urma cărui rezultă
proprietățile de rezistență și rigiditate a țesutului osos [10] [11]
Matricea extracelulară osoasă constituie un cadru complex și organizat care oferă suport
mecanic și exercită un rol esențial homeostaza osoasă Matricea osoasă poate elibera mai multe
molecule care influențează activitatea celulelor osoase și prin urmare influențează procesul
complex de remodelarea osoasă Studiile icircn domeniu au indicat că doar pierderea masei osoase
8
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
este insuficientă pentru a provoca fracturi osoase alți factori inclusiv modificări ale proteinelor
matricei osoase au o contribuție colosală icircn producerea fracturilor osoase [12] [13]
1122 Celulele țesutului osos
Țesutul osos are icircn componență patru tipuri de celule osteoblaste osteoclaste osteocite și
celule de suprafaţă (figura 13)
Figura 13 Celulele țesutului osos
Osteoblastele celule localizate pe suprafața osului sunt derivate din celule stem
mezenchimale reprezentacircnd 4-6 din totalul de celule osoase Se găsesc icircn țesuturile tinere dar
apar și icircn condiții patologice Din punct de vedere morfologic sunt celule cu formă cubică de
dimensiuni mari (15-20 microm) ce prezintă caracteristici specifice celulelor implicate icircn sinteza
proteinelor reticulul endoplasmatic rugos și complexul Golgi ambele bine dezvoltate precum și
numeroase vezicule de secreție ce conțin precursori de matrice osoasă incluziuni lipidice și
mucopolizaharide Osteoblastele au un rol foarte important icircn procesul de formare al osului
Sinteza matricei osoase are loc icircn două etape depunerea matricei organice urmată de
mineralizarea acesteia Icircn etapa de depunere a matricei organice osteoblastele secretă proteine
colagenice non-colagenice și proteoglicani iar etapa a doua cea de mineralizarea a matricii
organice are o faza veziculară și o fază fibrilară [11]
Osteocitele sunt cele mai abundente celule osoase reprezentacircnd aproximativ 95 din
totalul acestora Sunt osteoblaste mature care ocupă spațiul lacunar fiind icircnconjurate de matrice
osoasă Ca și particularitate structurală osteocitele au prelungiri citoplasmatice asemănătoare
dendritelor neuronilor care formează o rețea de comunicare icircntre ele și suprafața osoasă Durata
9
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de viață a osteocitelor a fost estimată de Frost și colaboratorii [14] la 25 de ani dar acest lucru
nu poate fi apreciat cu exactitate deoarece procesul de remodelare osoasă presupune o reicircnnoire
a țesutului osos cu 4-10 pe an Icircn orice caz durata de viață a osteocitelor este cu mult mai
mare decacirct a osteoblastelor care au un ciclu de viață de aproximativ 3 luni Totodată nici rolul
osteocitelor nu este icircnțeles pe deplin numeroase studii concentracircndu-se pe asta [15]
Osteoclastele denumite și macrofagele ţesutului osos sunt celule multinucleate
diferențiate din celule stem hematopoetice sub influența a numeroși factori cum ar fi factorul de
stimulare a coloniilor de macrofage (M-CSF) și factorul de legătură nucleic kappa-B (RANKL)
M-CSF este secretat de celulele mezenchimale osteoprogenitoare și de osteoblaste iar RANKL
este secretat de osteoblaste osteocite și celule stromale Acești factori susțin activarea
transcripției expresiei genice icircn osteoclaste Osteoclastele conţin următoarele enzime fosfatază
acidă protează enzime oxidoreducătare ale glicolizei datorită cărora au o activitate enzimatică
intensă şi fagocitară Resorbţia osului nemineralizat (osteoidul) nu este realizată de osteoclaste
ci de elemente macrofagice histiocitare Osteoclastele intra icircn stare de repaus cacircnd formarea
osului definitiv este terminată Celulele redevin active icircn caz de fractura cacircnd are loc formarea
calusului [11] [8]
Celulele de suprafaţă sau bordantă sunt celule ce acoperă suprafeţele osoase icircn locurile
unde nu are loc nici resorbția nici formarea osoasă doua etape importante ale procesului de
remodelare osoasă Din punct de vedere structural sunt celule cu nucleu turtit o citoplasmă care
se extinde pe suprafața osoasă și doar cacircteva organite citoplasmatice cum ar fi aparatul Golgi
sau reticulul endoplasmatic rugos Funcțiile acestor tipuri de celule nu sunt pe deplin icircnțelese dar
studiile icircn domeniu susțin ideea că aceste celule au un rol important icircn prevenirea interacțiunii
directe dintre osteoblaste și matricea osoasă și totodată participă la procesul de diferențiere a
osteoclastelor
113 Fiziologia ţesutului osos
Pe parcursul icircntregii vieţii osul este supus proceselor biologice complexe procese de
creştere icircn lungime şi grosime modelare şi remodelare La racircndul lor la baza acestora stau
procesul de osteogenză ce constă icircn producerea de țesusut osos și osteoliză ce constă icircn
distrucția de țesut osos [8]
10
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1131 Osteogeneza și osteoliza
Osteogeneza este procesul de formare a osului osteoblastele fiind elementele esențiale icircn
acest proces Funcţionalitate osteoblastelor este controlată de molecule semnal hormoni factori
de creştere şi citokine [10] Pe scurt osteogeneza are trei pași de bază sinteza matricei
extracelulare organice (osteoid) mineralizarea matricei ce conduce la formarea osului și
remodelarea osului prin procesele de resorbție și reformar [16] Prin acţiunea concentrată a
moleculelor semnal osteoblastele produc icircntr-o primă etapă toate componentele matricei
organice a ţesutului osos ce va fi eliberată pe icircntreaga suprafaţă sub forma de osteoid
nemineralizat Pe seama precursorilor preluaţi din mediul extracelular se realizează după
modelul sintezei proteice sinteza matricei organice Concomitent cu producerea de matrice
organică are loc procesul de mineralizare a acestei ce reprezintă legarea substanţei anorganice de
matricea proteică o legatură particulară icircntre sărurile minerale şi proteină fiind realizată icircn urma
acestui proces La procesul mineralizării contribuie numeroşi factori locali şi generali un rol
cheie fiind jucat de factorii inhibitori naturali ioni de magneziu citrați pirofosfați și nucleotide
Icircn țesuturile conjuctive nemineralizate factorii anterior enumerați au o concentrație superioară
comparativ cu țesuturile conjuctive mineralizate Icircn cazul țesutului osos fosfataza alcalină
secretată de osteoblaste distruge parțial acești factori făcacircnd posibil procesul de mineralizare
Procesul de osteoliză ce corespunde distrucției osoase este atribuit osteoclastelor Procesul
icircncepe cu demineralizarea matricei osoase urmată de hidroliza enzimatică a componentelor
organice formacircndu-se zone de eroziune osoasă Pentru realizarea resorbţiei osteoclastul trebuie
să adere la o suprafaţă osoasă şi să formeze compartimentul subosteoclastic Icircnsă suprafeţele
osoase au o peliculă fină de matricea extracelulară nemineralizată acoperită de un strat de
osteoblaste icircntre care se stabilesc joncţiuni distanţate icircngreunacircnd fixarea osteoclastelor pe
suprafeţe osoase Osteoblastele au receptori pentru parathormon și 125-dihidroxicolecalciferol
prin stimularea cărora are loc restricția osteoblastelor urmată de eliberarea suprafeței osoase Prin
cuplarea substanțelor stimulante cu receptori specifici se declanșează sinteza de activator al
plasminogenului și sinteza de colagenază latentă urmate de activarea colagenazei latente de
către plasmină Activarea colagenazei va avea drept consecință icircndepărtarea peliculei de matrice
nemineralizată continuacircnd cu atașarea osteoclastelor [8]
11
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1132 Creşterea osului
Creşterea osului icircntacirclnită și sub denumirea de organogeneză osoasă este etapa care
urmează procesului de osteogeneză normală avacircnd drept rezultat formarea osului și a
articulaţiilor Mai precis constă icircn formarea şi creşterea oaselor icircn lungime icircn grosime şi
asigurarea formei epifizelor Pentru fiecare element osos există un punct de osificare specific icircn
care icircncepe formarea osoasă la o anumită vacircrstă [17] Se poate vorbi de două tipuri de osificare
osificarea endoconjunctivă sau intramembranară și osificarea endocondrală
Osificarea intramembranară este caracterizată de invazia capilarelor icircn zona mezenchimală
și de diferențierea celulelor mezenchimale icircn osteoblaste mature care vor depozita matrice
osoasă conducacircnd la formarea de corpusculi osoși Acești corpusculi vor crește și se vor
dezovolta iar apoi vor fuziona cu alți corpusculi și vor forma trabecule ososase Pe măsură ce
trabeculele osoase cresc icircn dimensiune și icircn număr devin interconectate formacircnd o formă de țesut
osos Această formă de țesut osos este o structură fără rezistență dezorganizată și are un număr
mare de osteocite Osificarea intramembranară are loc icircn timpul dezvoltării embrionare și este
implicată icircn formarea oaselor plate din structura cutiei craniene unele oase faciale o parte din
mandibulă și claviculă și adăugarea de țesut osos nou la diafiza majorității oaselor
Osificarea endocondrală utilizează proprietățile funcționale ale cartilajului și osului pentru
a asigura un mecanism de formare și creștere a scheletului Combinarea condrogenezei și a
osteogenezei icircn vederea osificării osoase este dependent de nivelul de vascularizare a cartilajului
de creștere Icircn figura 14 sunt prezentate la general etapele procesului de osificare endocondrală
[18] Osificarea endocondrală are 6 etape Celule mezenchimale se vor concentra (A) și se vor
diferenția icircn condrocite formacircnd un cartilaj nevascularizat (B) Icircn centrul cartilajului format
condrocitele se vor opri din proliferare și vor deveni hipertrofice (C) Condrocitele din
vecinătatea celor hipertrofice se vor diferenția icircn osteoblaste acestea din urmă formacircnd un colier
osos (D) Icircn continuare condrocitele hipertrofice vor regla formarea de matrice mineralizată Icircn
același timp icircn această etapă are loc eliberarea de factori angiogenetici care vor atrage vase de
sacircnge după care condrocitele hipertrofice vor intra icircn apoptoză (E) Coordonarea osteoblastelor
și invazia vaselor de sacircnge vor avea drept rezultat formarea țesutului spongios primar
Condrocitele se vor prolifera icircn continuare și icircn același timp va avea loc vascularizarea osului
aceste două etape contribuind la creșterea icircn lungime a osului Osteoblastele din colierul osos vor
12
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
contribui la formarea osului cortical pe cacircnd cele din țesutul spongios primar vor contribui la
formarea țesutului spongios final (F)
Figura 14 Osificarea endocondrală [18]
1133 Remodelarea osului
Osul este un organ activ remodelat pe tot parcursul vieții Procesul de remodelare osoasă
cuprinde patru faze distincte ce se desfăşoară permanent icircn anumite locuri faza de repaus faza
de resorbţie osoasă faza de inversie şi faza de formare reprezentate schematic icircn figura 15 Icircn
faza de repaus suprafaţa ţesutului osos este acoperită de celule de suprafaţă ancorate icircn matricea
mineralizată Icircn faza de resorbţie osoasă rolul principal revine osteoclastelor care vor forma o
cavitate numită lacună de resorbţie (lacuna Howship) Resorbţia are loc icircn două etape
demineralizarea fazei osoase și distrugerea fazei osoase Icircn faza de inversie are loc apariția
osteoblastelor icircn zona erodată ce vor acoperi lacuna de resorbţie printr-o depozitare activă de os
nemineralizat osteoid Osteoidul se depune pacircnă cănd grosimea acestuia ajunge la 20 microm
urmacircnd faza de mineralizare Pe măsură ce osteoidul este mineralizat locul unde a avut loc
remodelarea va fi icircnlocuit cu un os nou [19]
13
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 15 Remodelarea ţesutului osos
114 Patologia osoasă
Patologia osoasă poate fi de cauza traumatică ndash fractură sau netraumatică Icircn funcţie de
cauza fracturii putem vorbi de fracturi determinate de un accident traumtic fracturi de oboseală
şi fracturi de os patologic Cauzele netraumatice care pot cauza o anumită patolgie osoasă sunt
infecţiile osului tumorile osului și deformaţiile osului [17]
1141 Tumori osoase
Icircn literatura de specialitate tumorile sunt icircntalnite și sub denumirea de neoplasme și se
definesc ca proliferări tisulare anormale autonome persistente neconcordante cu ţesuturile din
jur care se dezvoltă continuu chiar și după icircncetarea stimului care a determinat proliferarea și nu
răspund la mecanisme normale de control ce guvernează creştere Icircn funcție de caracteristicile
morfo-funcționale și de evoluția acestora tumorile se clasifică icircn tumori begine şi tumori
maligne Cele benigne sunt caracterizate prin margini bine definite au o creştere lentă şi locală
sunt neinvazive şi compresive circumscrise şi icircncapsulate prezintă mitoze rare nu diseminează
icircn alte ţesuturi şi organe (non-metastazante) avacircnd un prognostic bun Tumorile maligne sunt
14
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
caracterizate prin margini nedefinite au o creştere rapidă fiind infiltrative şi icircncapsulante
invazive şi distructive sunt metastazante şi au un prognostic rezervat
Metastazarea reprezintă răspacircndirea celulelor maligne din tumora primară icircn organele
ţesuturile sau cavităţile organismului Comună majorităţii cancerelor umane metastazarea
transformă o tumoră de organ icircntr-o boală sistemică Este un proces complex multistadial şi
dinamic avacircnd la bază o serie de procese subtile interconectate ce rezultă din interacţiunile
gazdei cu tumora Fiecare etapă metastatică este subiectul unor influenţe multiple indispensabile
celulei maligne pentru a supravieţui variaţiilor de mediu (prin dobandirea de noi mutaţii) ce icirci
permit acesteia să invadeze ţesuturile vecine să patrundă icircn sistemul circulator (calea majoră de
răspacircndire prin vasele de sacircnge şisau limfatice) să extravazeze icircn ţesuturi noi să dezvolte un
sistem vascular propriu care să icircicirc suţină dezvoltarea şi chiar uneori să permită metastazei să dea
naştere la noi metastaze [20] [21]
Figura 16 Clasificarea tumorilor osoase
15
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Domeniul de patologie osteoarticulară icircn care se icircncadrează şi tumorile osoase este un
domeniu foarte vast şi delicat nu este constant fiind adesea descoperite noi metode de
diagnostic şi tratament ce ameliorează sau chiar schimbă radical prognosticul multor tumori
osoase Una din principalele probleme icircn ceea ce priveşte diagnosticul şi tratamentul tumorilor
osoase este aceea că nu există o separare netă icircntre tumora benignă şi tumora malignă
Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) propune o clasificare a tumorilor osoase bazată pe
capacitatea de diferenţiere a acestora ceea ce icircnseamnă că sunt grupate din punct de vedere
histologic şi citologic al ţesutului pe care acestea icircl reproduce clasificare redată icircn figura 16
[22]
Metastazele sunt cele mai icircntalnite tumori din os Acestea sunt considerate tumori
secundare osoase deoarece tumora primară nu icircşi are originea icircn os tipurile de cancer care dau
cel mai frecvent metastaze osoase fiind cancerul de prostată cancerul de sacircn şi cancerul
pulmonar Tumorile osoase primare cum sunt osteosarcoamele sau condrosarcoamele sunt
destul de rare statisticile sugeracircnd că doar icircn 1 din 20 cazuri de tumori osoase este vorbă de o
tumoră primară Cea mai frecvent intalnită tumoră osoasă primară este mielomul cu celule
plasmatice ce apare la pacienţi cu vacircrstă peste 40 ani urmată de diverse sarcoame Dintre
sarcoamele osoase primare ce reprezintă 02 din toate neoplasmele cele mai comune sunt
osteosarcoamele ndash 35 condrosarcoamele ndash 25 sarcomul Ewing ndash 16 condroamele ndash 8 şi
histiocitoamele maligne fibroase ndash 5
Incidenţa tumorilor primare benigne este mai dificil de determinat deoarece nu se
realizează biopsie pentru toate leziunile nou descoperite Atacircta timp cacirct leziunile pot fi complet
caracterizate ca şi bengine pe baza datelor clinice şi imagistice biopsia sau rezecţia sunt
nepotrivite şi neadecvate Cele mai comune tumori osoase benigne sunt următoarele
osteocondroamele ndash 35 encondroamele ndash 20 tumorile cu celule gigante ndash 15 osteomul
osteoid ndash 10 şi displazia fibroasă (maladia Jaffeacute) ndash 5 Icircn ciuda caracterului benign al
tumorilor tratamentul acestora trebuie să fie cacirct mai eficient posibil De exemplu o tumoră cu
celule gigante extinsă icircn suprafaţa articulară tibială poate duce la o fractura patologică dacă nu
este tratată adecvat
Tratamentul fiecărei tumori osoase depinde de mai mulţi factori caracterul benign sau
malign localizarea leziunii istoricul afecţiunii nivelul durerii Icircn cazul tumorilor benigne
icircndepărtarea leziunea urmată de grefarea sau biopsia excizională conduc icircn general la rezultate
16
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
bune Totuşi aceste două metode de tratament pot fi inadecvate icircn cazul tumorilor maligne atacircta
timp cacirct celule tumorale reziduale rămacircn la marginea leziunii Limfoamele osoase pot fi tratate
cu chimioterapie sau radioterapie fără a fi necesară o intrevenţie chirurgicală Alte tumori cum
ar fi de exemplu osteosarcoamele convenţionale sunt supuse icircntr-o primă etapă chimioterapiei
sau radioterapiei cu scopul de a micşora masa tumorală următoarea etapă fiind rezecţia
chirugicală Condrosarcoamele sunt tratate doar chirurgical chimioterapia dovedindu-se
ineficientă Multe procese maligne sau procese benigne agresive pot fi tratate prin rezecţie
chirurgicală atacirct a tumorii cacirct şi a unei margini de ţesut normal sau icircn cele mai grave cazuri prin
icircndepărtarea totală a osului muşchiului sau altor ţesuturi afectate de tumoră [23]
12 Metode de tratament a defectelor osoase
Spre deosebire de alte ţesuturi osul are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn
cazul unor afecţiuni minore fără formare de cicatrici Icircn schimb icircn cazul fracturilor patologice
sau a celor grave precum şi icircn pierderi mari de ţesut osos ce pot conduce la defecte osoase
grave procesele de regenerare şi reparare proprii vor avea nevoie de support [24] Principalii
factori ce conduc la defecte osoase grave sunt rezecţia de tumoră osoasă malformaţiile
congenitale unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita După sacircnge osul
este al doilea cel mai transplantat organ anual fiind efectuate la nivel mondial aproximativ 22
milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă [25] Materiale de substituţie osoasă
pot fi clasificate icircn mai multe categorii după cum urmează grefe de origine naturală (autogrefe
alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria tisulară
precum şi diverse combinaţii ale acestora [26]
121 Metode actuale de tratament a defectelor osoase
1211 Grefe osoase biologice
Icircn funcție de originea lor grefele biologice se clasifică icircn xenogrefe alogrefe și autogrefe
[27] Xenogrefe prelevate de la o specie diferită de a primitorului au fost utilizate o scurtă
perioada de timp deoarece după cacircteva decenii de studii icircndelungate s-au dovedit a fi cele mai
puţin adecvate grefe [28] Alogrefele sunt utilizate pentru reconstrucţia unor defecte osoase
grave Astfel alogrefele se utilizează icircn timpul intervenţiilor de revizie a artoplastiilor totale
17
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
pentru reconstrucţia pierderilor osoase Alogrefele sunt prelevate fie de la pacienţi vii fie de la
cadavre Icircn cazul icircn care donatorii sunt pacienţi vii o sursă foarte utilizată este capul femural
alogrefele fiind preluate icircn acest caz icircn timpul intervenţiilor primare de artoplastie totală de şold
Icircn cazul icircn care alogrefele sunt preluate de la cadavre oasele lungi şi pelvisul sunt sursele cele
mai utilizate [29] Icircn tabelul 11 sunt prezentate principalele avantaje și dezavantaje ale celor trei
tipuri de grefe osoase biologice
Tabel 11 Principalele avantaje și dezavantaje ale autogrefelor alogrefelor și xenogrefelor [24]
Grefă
osoasă
biologică
Avantaje Dezavantaje
Autogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
osteoconductivitate și osteogenice
histocompatibilie
nu există risc de imunogenicitate
sau transmitere de boli infecțioase
durere la locul prelevării și
moartea patului donator
sursă limitată de
disponibilitate și cantitate
timpi chirurgicali mai mari
ce implică pierderi de sacircnge
posibile infecții
Alogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
și osteoconductivitate
nu apare problema morbidității
patului donator
ușor de manevrat
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
osteoinductivitate variabilă
pierderea proprietăților
biologice și mecanice
respinse icircn anumite regiuni
geografice datorită unor aspecte
religioase
cost crescut
Xenogrefe
proprietăți osteoinductive și
osteoconductive
cost scăzut
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
risc imunogenic crescut
rezultate slabe
Un tip specializat de alogrefe este reprezentat de matricea osoasă demineralizată (DBM)
DBM se obține prin extracția acidă a alogrefelor și conține colagen de tip I proteine
18
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
noncolagenice și un număr variabil de factori de creștere osteoconductivi (de exemplu proteine
morfogenetice osoase - BMP) Concentrația de DBM este direct proporțională cu
osteoinductivitatea DBM se poate folosi fie singură fie icircn combinație cu alte alogrefe sau cu
grefe sintetice [27]
Autogrefele sunt utilizate pentru refacerea defectelor osoase primitorul și donatorul fiind
aceași persoană Sunt utilizate icircntr-un număr mare de intervenţii chirurgicale ortopedice
stomatologice şi maxilo-faciale cu scopul de a spori şi grăbi regenerarea osoasă sau de a restaura
defectele osoase Creasta iliacă este locul de unde se prelevă cel mai frecvent autogrefe datorită
accesului uşor şi a unei bune calităţi De asemenea autogrefele se mai pot preleva din tibia
proximală femurul distal coaste radiusul distal Şi canalul intramedular al oaselor lungi poate
reprezenta o potenţilă sursă de autogrefe precum şi o sursă bogată de celule şi factori de creştere
[30] [31]
1212 Grefe osoase și substituienți sintetici
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din biomateriale
sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea celulelor osoase icircn timpul
procesului de regenerarea osoasă [26] O gamă variată de materiale sintetice sunt utilizate ca și
substituenți osoși metale cum sunt tantalul titanul fierul sau magneziul polimeri sintetici cum
sunt poli acidul lactic poli acidul glicolic poliuretani sau poli ε-caprolactona și ceramice sum
sunt sticlele bioactive fosfații de calciu sau sulfați de calciu hidratați Icircn timp dintre toate aceste
materiale cele mai potrivite s-au dovedit a fi cele pe bază de fosfați de calciu datorită asemănării
cu compoziția osului natural (ce conține mai mult de 60 fosfați de calciu)
Substituenți sintetice sunt disponibili fie sub formă de granule (majoritatea au un diametru
cuprins icircntre 01 și 5 mm) fie sub formă suporturi cu porozitate variabilă icircn funcție de diverse
aspecte ce țin de locul unde vor fi implantate perioada necesară refaceriiregenerării complete
etc De asemenea icircn practica curentă se folosesc și substituienți injectabili denumiți adesea
cementuri un mare avantaj ala acestora fiind tehnica de implantare minim invazivă
Resorbabilitatea este o caracteristică esențială a substituienților osoși fiind intens studiată
Icircn tabelul 12 sunt prezentate principalele clase de substiutuenți osoși utilizați icircn prezent precum
și mecanismele de resorbție ale acestora
19
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Tabel 12 Principale tipuri de substituenți osoși și mecanismul de resorbție al acestora [32]
Clasa de
Material Tipul de material Mecanismul de resorbție
Materiale
Ceramice
Bioglas Resorbţie limitată
Sulfat de calciu hemihidrat (CSH)
Gips
Sulfat de calciu dehidrat (CSD)
Solubilizare
Solubilizare şisau conversie icircn
apatită
Fosfat dicalcic (DCP)
Fosfat octocalcic (OCP)
β-Fosfat tricalcic (β-TCP)
Fosfat de calciu bifazic (BCP)
Cristale de hidroxiapatită
precipitate
β-Pirofosfat de caciu (β-CPP)
Mediat cellular
Hidroxiapatită sinterizată Nu se resoarbe
Materiale
Metalice
Magneziu (aliaj) Coroziune
Fier (aliaj) Coroziune
Tantal titan Nu se resoarbe
Polimeri
Poli acid lactic poli acid glicolic
Poli ε-caprolactona Hidroliză
Celuloză
Hialuronan
Fibrină
Colagen
Chitosan
Transport la ganglioni limfatici
Hialuronidază
Plasmină
Colagenază
Lizozim
Icircn mod ideal un substituent osos ar trebui să fie icircnlocuit icircn timp de țesust osos nativ fără
pierderea suportului mecanic oferit de acesta Icircn unele cazuri defectele osoase sunt stabilizate
utilizacircnd fixarea metalică neresorbabilă defectul osos propriu-zis fiind completat cu un
substituent osos Rata de resorbție a substituienților osoși poate fi controlată prin optimizarea
geometriei materialului Prezența unei rețele cu pori interconectați sau a unor canale icircn structura
sa este o caracteristică cheie a unui substituent osos regăsindu-se inclusiv la cementurile
20
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
injectabile Icircn cazul substituenților pe bază de polimeri rata de resorbție poate fi controlată prin
unele modificări chimice [32]
122 Ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Dezavantajele substituenților osoși sintetici au condus la necesitatea unei metode
alternative şi efective avacircnd drept scop principal regenerarea osoasă S-au evidenţiat
următoarele alternative a substituenţilor osoşi utilizarea factorilor de creştere osteogenici (cum
ar fi proteienele morfogenetice osoase ndash BMPs) suporturi osteoinductive terapia genică
utilizarea celulelor stem toate acestea reprezentacircnd componentele inginerie tisulare (figura 17)
Figura 17 Triada ingineriei tisulare și aplicarea produsului rezultat icircn procesul de
regenerarea al țesutului osos afectat de tumoriinfecții
Componentele ingineriei tisulare o matrice sau un suport celule și molecule semnal au
fost stabilite plecacircnd de la structura țesuturilor biologice [33]
Matricea sau suportul este componenta cheie a ingineriei tisulare Acționează iniţial ca un
suport temporar pentru adeziunea și creșterea celulară apoi are rol definitoriu pentru sinteza de
matrice extracelulară iar icircn ultimă etapă contribuie la formarea de neo-țesut [34]
21
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau regenerarea
ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor artificiale și a suporturilor
Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase sisteme injectabile capsule
filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri etc [35]
1221 Biomateriale utilizate la realizarea de suporturi pentru regenerarea osoasă
La realizarea suporturilor pentru regenerarea osoasă sunt utilizate mai multe tipuri de
biomateriale biopolimeri polimeri sintetici și biomateriale ceramice
Polimeri atacirct de origine naturală cacirct și sintetică sunt utilizați pentru o varietate de aplicații
biomedicale Din clasa polimerilor naturali sau bioplomeri fac parte polizaharidele proteine și
poliesteri proveniți atacirct din regnul vegetal cacirct și din regnul animal Biopolimeri sunt utilizați
icircntr-o multitudine de domenii industria alimentară industria farmaceutică (foarte des ca și
excipienți) la realizare unor proteze icircn sisteme de eliberare controlată de medicamente etc
Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul biologic fiind dirijați spre degradarea metabolică
Datorită similarității dintre polimerii naturali și matricea extracelulară (ECM) aceste materiale
nu vor provoca o reacție imunologică cronică sau toxică reacții deseori icircntalnite icircn cazul
utilizării polimerilor sintetici [36]
12211 Biopolimeri
Printre cei mai utilizați biopolimeri se numără colagenulgelatina acidul hialuronic
chitosanulchitină albumina serică bovină fibroina din mătase [37]
Colagenul
Colagenul ndash Col proteina cea mai abundentă din organismul uman se remarcă ca
biopolimer printr-o serie de proprietăţi precum biocompatibilitatea excelentă
biodegradabilitatea rezistenţa mecanică ridicată toxicitatea scăzută reacţii imunologice slabe
fiind unul din cele mai utilizate biomateriale icircntr-o varietate de aplicaţii medicale
Din punct de vedere al structurii chimice colagenul are structură de triplu helix
macromolecula de colagen fiind formată din trei lanţuri α răsucite icircmpreună de la stacircnga la
dreapta icircn jurul unui ax comun [38] Există mai multe tipuri de colagen fiecare tip avacircnd
22
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
particularității proprii de structură precum și localizare icircn organe specific icircn organism Nu se ştie
cu exactitate cacircte tipuri de colagen există Cel mai intalnit colagen icircn racircndul vertebratelor este
colagenul de tip I de aceea este și cel mai utilizat și studiat icircn diverse domenii
Figura 18 Structura colagenului
Poate fi prelucrat sub o mare varietate de forme filme fibre structuri poroase
nanoparticule şi microparticule atacirct singur cacirct şi icircn combinaţie cu alte materiale Deoarece
structura sa chimică permite combinarea colagenului cu factori de creştere sau alţi agenţi
bioactivi una din cele mai importante aplicaţii ale colagenului este utilizarea lui icircn sisteme de
eliberarea controlată de medicamente membrane de colagen pentru aplicaţii oftalmice structuri
poroase pentru răni şi arsuri diferite geluri etc Remarcabilă este și utilizarea colagenului icircn
ingineria tisulară pentru realizarea unor substituenţi pentru piele a unor substituenţi osoşi sau a
unor valve artificiale [39]
Icircn domeniul ingineriei repararării şi regenerării ţesutului osos colagenul a fost unul dintre
primele biomateriale studiate fiind totodată şi unul din cele mai utilizate materiale de cele mai
multe ori utilizat icircn combinaţie cu alţi biopolimeri şi fosfaţi de calciu sub diverse forme de
prezentare hidrogeluri injectabile membranefilme suporturi poroase microsfere nanosfere
Un hidrogel pe bază de colagen reprezintă un candidat excelent pentru icircncapsularea de celule
datorită capacității sale de umflare icircn apă proprietăților fizice adecvate (de exemplu proprietăți
mecanice capacitatea de gelifiere) conținutului ridicat de apă ce facilitează transportul și
difuzia proprietăților biologice excelente și sensibilitații la degradarea enzimatică [40] De
23
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
exemplu hidrogeluri conținacircnd diferite rapoarte masice chitosancolagenul au fost fabricate icircn
următoarele condiții de sinteză gelifiere inițiată de utilizarea β-glicerofosfat utilizarea unui
mediu osteogenic suplimentar și a unei baze slabe și temperatură variată Prezența colagenului icircn
hidrogel a fost asociată cu creșterea proliferării celulare hidrogelul a fost mai compact rezultacircnd
o matrice rezistentă [41]
Membrane resorbabile pe bază de colagen au fost utilizate icircn ingineria tisulară și
regenerarea osoasă ghidată deoarece de-a lungul timpului numeroase studii au arătat că acestea
sunt biocompatibile și sporesc rata de regenerare Acestea sunt fabricate prin tehnici diverse
fiind adesea utilizate alături de polimeri sintetici de exemplu poli (tetrafluoroetilienă)
Variantele comerciale cele mai icircntalnite de membrane pe bază de colagen utilizate icircn practica
clinică sunt Bio-Gidereg (GeistlichPharma AG Wolhusen Elveția) DuraMatrix-Onlaytrade ndash
membrană pe bază de colagen pentru repararea țesutului dura mater (Collagen Matrix Inc NJ
SUA) TenoMendtrade (Collagen Matrix Inc) OssiPatchtrade ndash membrană protectoare pe bază de
colagen pentru regenerarea osoasă (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) și Collatenetrade
Fibrillar Collagen ndash pansament utilizat pentru afecțiuni maxilo-faciale (Ace Surgical Supply Co
Inc MA SUA)
Suporturile poroase pe bază de colagen au icircn componența lor și particule ceramice icircn acest
fel icircncercacircndu-se o imitare a structurii osului natural Din variantele comerciale cele mai des
utilizate se pot aminti Collagrafttrade (Collagen Corp SUA) ndash care combină hidroxiapatită fosfa
tricalcic cu măducă osoasă de la pacinet și colagen de origine bovină OssiMendtrade Bone Graft
Matrix (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) ndash combină minerale osoase sub formă poroasă
cu colagen și INFUSEreg Bone Graft (Medtronic Sofamor Danek Inc USA) ndash care pe langă un
suport poros pe bază de colagen conțin protein morfogenetice umane recombinate (rhBMP-2)
[40]
Gelatina
Gelatina este un derivat denaturat al colagenului Polielectrolit amfoteric gelatina este un
amestec de fragmente de proteine solubile icircn apă avacircnd aceleaşi secvenţe de aminoacizi ca şi
colagenul structura sa chimică fiind redată icircn figura 19 Colagenul diferă de gelatină prin aceea
că are mai multe structuri terţiare fiind mai puţin solubil icircn soluţii apoase decacirct gelatin [42]
Gelatina poate fi fabricată din diverse surse sursa de provenienţă a gelatinei influențacircnd
24
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţile acesteia Cel mai adesea se fabrică din piele porcină (46) piele bovină (294)
sau oase de origine porcină sau bovină (231) [43] Gelatina este un polimer biodegradabil
biocompatibil non-antigenic are cost scăzut susţine adeziunea celulară migrarea diferenţierea
şi proliferarea celulară Un dezavantaj al acestei proteine este acela că are proprietăţi mecanice
slabe De aceea pentru a fi utilizat la realizarea unor matrici suport pentru ingineria tisulară icircn
special a ţesuturilor dure gelatina se utilizează icircmpreună cu alţi polimeri de exemplu chitosan
unele ceramic (hidroxiapatită fosfat tricalcic) etc [44] [45]
Figura 19 Structura chimică a gelatinei
Albumina serică bovină
Albuminile serice sunt cele mai abundente proteine din sistemul circulator pentru o mare
varietate de organism fiind principalele molecule complexe care contribuie la presiunea arterială
osmotică Datorită potențialului său antioxidant albumina are un rol esențial icircn prepararea
mediilor pentru culturi de celule de mamifere atacirct icircn domeniul cercetării cacirct și icircn domenii
comerciale [46]
Icircn domeniul ingineriei tisulare și domeniul medicinei regenerative albumina serică bovină
ndash BSA este una dintre cele mai studiate proteine din punct de vedere al interacțiunii cu
polizaharidele datorită stabilității sale semnificative a faptului că este ușor accesibilă are o
solubilitate bună icircn apă și datorită asemănării structurale și funcționale cu albumina serică umană
[47]
Icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos albumina serică bovină este utilizată icircn
sisteme complexe pe bază de materiale ceramice Un studiu care evidențiază influența utilizării
albuminei alături de materiale ceramice a fost publicat de Chew și colaboratorii care au
25
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
demonstrat că adăugarea unei concentraţii scăzute de albumină serică bovină este utilă deoarece
susţine creşterea cristalelor de fosfaţi de calciu fiind astfel utilă procesului de mineralizare a
ţesutului osos Icircn comparaţie o concentraţie mare de albumină inhibă cristalizarea fosfaţilor de
calciu [48] Această proprietate a albuminei serice bovine precum și cele menționate anterior a
făcut ca aceasta să fie utilizată de unii autori la sinteza de cimenturi pe bază de fosfaţi de calciu
[49] [50]
De asemnea această proteină a fost utilizată ca adjuvant icircn studii vizacircnd regenerarea
osoasă cu ajutorul unor microsfere hibride alături de poliacrilatalginat de calciu [51]
Fibroină din mătase
Fibroina din mătase produsă de viermi de mătase Bombyx mori este o proteină naturală
cu o foarte bună biocompatibilitate non-toxică biodegradabilă De asemenea prezintă
proprietăţi intrinseci remarcabile şi o bună rezistenţă mecanică Datorită proprietăţilor
menţionate icircn ultimii ani a avut loc o creştere a interesului pentru utilizarea fibroinei din mătase
la obţinerea de suporturi poroase tridimensionale Studii recente au dovedit capacitatea unor
suporturi tridimensionale pe bază de fibroină de a susţine proliferarea celulară icircn aplicaţii vizacircnd
ingineria tisulară a osului a cartilajului şi a vaselor de sacircnge [52]
Figura 110 Structura chimică a fibroinei din mătase
Chitosan
Chitosanul ndash Cs descoperit icircntamplător de către Rouget la mijlocul secolului al XIX lea
este una din cele mai utilizate polizaharide icircn ingineria tisulară şi regenerare osului Acesta este
obţinut din chitină polizaharid structural ce are rol analog cu cel al colagenului icircn regnul animal
superior şi al celulozei icircn plantele Plantele produc celuloză icircn pereţii plantelor iar insectele şi
crustaceele produc chitină icircn aripi respectiv scoici Prin deacetilarea icircntre 40 şi 100 a
chitinei rezultă un polimer format din unităţi de β-(1-4)-2-acetamino-D-glucoză (N-acetil-D-
26
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
glucozamină) şi β-(1-4)-2-amino-D-glucoză (N-D-glucozamină) Icircn afara diferenţei de structură
dintre chitină şi chitosan o altă diferenţă este dată de solubilitatea celor doi biopolimeri chitina
este insolubilă icircn solvenţii uzuali chitosanul dizolvacircndu-se icircn aceştia Structura sa unică
biocompatibilitatea proprietăţi fizico-chimice (solubilitatea biodegradabilitate) versatilitate icircn
termeni de prelucrare proprietăţi multidimensionale şi funcţionalitate icircnaltă fac ca acest
biopolimer să aibă o multitudine de aplicaţii icircntr-o gamă variată de domenii domeniul
biomedical industria farmaceutică industria cosmetică biotehnologii industria alimentară
agricultură şi protecţia mediului [53] [54]
Figura 111 Structura chimică a chitosanului
Icircn ceea ce privește utilizarea chitosanului icircn domeniul regenerării osoase sunt elaborate
studii complexe icircncă de acum cacircteva deceni Borah şi colaboratorii fiind primii care au
demonstrate potenţialul osteogenic al acestuia [55] Au urmat apoi Muzarelli şi colaboratorii care
au realizat studii publicate icircn anii 1993 şi 1994 remarcante din punct de vedere al proprietăţilor
de regenerare osoasă ale chitosanului [56]
Acid hialuronic
Acidul hialuronic ndash Hya este un mucopolizaharid ce face parte din clasa
glicozaminoglicanilor ndash GAG avacircnd cea mai simplă structură chimică din această clasă de
compuși biologici și fiind singurul glicozaminoglican nesulfatat Icircn organismul uman acidul
hialuronic se găseşte icircn lichidul sinovial umoarea vitroasă matricea extracelulară a ţesutului viu
iar icircn cea mai mare cantitate se regăsește icircn piele Hya este componentul principal al matricei
extracelulare a cartilajului articular acţionacircnd ca o ancoră pentru GAG sulfataţi din cartilaj [57]
27
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Este neramificat și inert din punct de vedere imunologic iar spre deosebire de alți GAG
este sintetizat ca un polizaharid liber și nu substituit la o miezul unei proteine [58] Structura
acidului hialuronic este reprezentată de unităţile dizaharidice polianionice acid D-glucoronic şi
N-acetil-D-glucozamină unite alternant prin legături β ndash 14 și β ndash 1-3 glicozidice (figura 112)
Figura 112 Structura acidului hialuronic
Hya se extrage adesea din surse de origine animală creastă de cocoș și umoare vitroasă de
origine bovină icircnsă procesul de izolare din aceste surse este dificil deoarece acesta formează
complexe stabile din punct de vedere chimic cu proteoglicani prezenți icircn țesutul animal fiind
foarte greu de controlat masa moleculară a acesti biopolimer Extragerea acidului hialuronic din
surse microbiene reprezintă o alternativă la metoda de extragere menționată anterior bacteriile
din familia Streptococcilor grupurile A și C producacircnd icircn mod natural o capsulă mucoidă de
acid hialuronic [59]
Icircn ciuda faptului că acidul hialuronic se găsește icircntr-o cantitate mică icircn matricea
extracelulară a ţesutului osos acest polimer este implicat icircn procesele biologice importante ale
osului Poate fi produs de osteoblaste şi osteoclaste fiind găsit şi icircn citoplasma celulelor
osteoprogenitoare și poate lega hidroxiapatita fără să afecteze dezvoltarea minerală Are un rol
important icircn osificarea endocondrală şi a platoului de creştere epifizar fiind găsit icircntr-o
concentraţie mare icircn zona condrocitelor hipertrofice Important de menționat este că acidul
hialuronic se găsește icircn concentraţie mare icircn calusul fracturilor nou formate [57]
28
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Alginații
Alginatul este un polimer anionic natural obținut din diverse specii de alge brune
(Phaeophyceae Laminaria hyperborea Laminaria digitata Laminaria japonica Ascophyllum
nodosum Macrocystis pyrifera) prin tratament cu soluții alcaline apoase cel mai adesea
utilizacircndu-se NaOH De-a lungul timpului a fost intens studiat fiind utilizat icircn prezent icircn
multiple aplicații biomedicale datorită proprietăților care le deține biocompatilitate toxicitate
scăzută costuri de obținere și procesare relativ scăzute [60]
Icircn literatură sunt prezentate rezultatele unor studii prinvind utilizarea alginatului la
fabricarea de suporturi pentru igineria tisulară [61] Hye-Lee și colaboratorii prezintă un studiu
cu privire la prepararea și caracterizarea de suporturi compozite pe bază de nano-hidroxiapatită
alginat și chitosan cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos [62] Icircntr-un alt studiu
Sharma și colaboratorii prezintă fabricare de suporturi nano-biocompozite a căror componente
sunt același ca icircn studiul publicat de Hey-Lee la care se adaugă gelatină procedeul de fabricare
al nano-biocompozitelor fiind unul complex [63]
12212 Polimeri sintetici
Două din cele mai mari avantaje ale polimerilor sintetici sunt reproductibilitate mare şi
posibilitatea de a fi fabricaţi pe scară largă De asemnea pot fi fabricați sub o gamă foarte variată
de forme Icircn comparație cu polimerii naturali este foarte important de menționat faptul că
polimerilor sintetici li se pot controla proprietăţile mecanice şi biodegradabilitatea icircnsă ridică
probleme deoarece nu au activitate biologică şi sunt foarte hidrofobi [64]
Poli (acidul lactic)
Poli (acidul lactic) ndash PLA este unul din cei mai utilizați polimeri sintetici datorită
proprietăților sale mecanice foarte bune fiind utilizat cu succes icircn diverse implanturi medicale
Datorită faptului că PLA are o viteză de degradare in vivo scăzută este cel mai adesea utilizat
pentru fixarea ososă [65] Deoarece prezintă doi carboni asimetrici PLA are trei forme izomerice
D(-)- PDLA L(+)-PLLA şi (DL)- PDLLA Ușurința icircn procesare cristalinitatea precum și viteza
de degradare depind de structura și compoziția lanțurilor polimerice icircn mod particular de
raportul izomerilor PLLA este considerat un homoplimer izotactic semicristalin avacircnd cea mai
mare temperatură de topire dintre cei trei izomeri ai PLA [66]
29
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 113 Structura PLA
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA este un copolimer al poli (acidului lactic) ndash PLA şi
al poli (acidului glicolic) ndash PGA Este utilizat la realizarea de produse farmaceutice și diverse
suporturi pentru ingineria tisulară fiind un polimer biocompatibil și biodegradabil [67]
Suporturile pentru inginerie tisulară pe bază de PLGA au avantajul de a fi degradate icircn mediul de
cultură celular produșii de degradare rezultați fiind lipsiți de toxicitate [68]
Figura 114 Structura PLGA
unde n ndash numărul de unităţi structural de acid lactic şi m ndash numărul de unităţi structurale de acid
glycolic
Poli (caprolactona)
Poli (caprolactona) ndash PCL este un polimer termoplastic biocompatibil avacircnd temperaturile
de topire şi de vitrifiere scăzute Este cristalin şi hirofob caracteristici ce conduc la o viteză de
degradare scăzută De asemenea are proprietăţi mecanice constante icircn timp Proprietăţile
prezentate fac ca acest polimer să fie adesea utilizat icircn ingineria tisulară [69]
30
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 115 Structura PCL
Poli (3- hidroxibutiratul)
Poli (hidroxialcanoaţii) ndash PHA sunt o clasă de poliesteri naturali produși de o varietate de
microorganisme Primul polihidroxialcanoat descoperit și totodată cel mai studiat este poli-3-
hidroxibutiratul ndash P(3HB) a cărui structură chimică este redată icircn figura 116 [70]
Figura 116 Structura P(3HB)
12213 Biomateriale cermice
Din categoria suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă biomaterialele
ceramice reprezintă o categorie foarte importantă cele mai multe variante comerciale pentru
aplicația vizată icircncadracircndu-se icircn această categorie Compoziţia şi morfologia acestor
biomateriale au o influență esențială asupra răspunsului tisular Icircn majoritatea cazurilor sunt non-
imunogenice nu provoacă reacții inflamatoare și sunt non-citotoxice Icircn practica clinică
ceramicele sunt utilizate icircntr-o mare varietate de aplicații biomateriale pentru regenerarea
articulaţiei artificiale a şoldului biomaterialele de reconstrucţie osoasă implanturi pentru
icircnlocuirea celor trei oscioare de la nivelul urechii (ciocănş nicovală şi scăriţă) rădăcini dentare
artificiale şi ceramice pentru diverse tratamente medicale [71]
31
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Ceramicile utilizate la fabricarea de implanturi se clasifică icircn ceramice neresorbabile
(bioinerte) ceramice bioactive sau cu suprafaţa activă (semi-inerte) şi ceramice biodegradabile
sau resorbabile (non-inerte)
Ceramicele neresorbabile inerte sunt stabile la interacţiunea cu mediul fiziologic şi nu
prezintă bioactivitate sau efecte dăunătoare pentru organismul uman cele mai reprezentative
fiind alumina ndash Al2O3 zirconia ndash ZnO2 carbonul și nitrura de siliciu Ceramicele bioactive
semi-inerte sunt ceramice desemnate să inducă o activitate biologică specifică avacircnd
capacitatea de a se lega direct la os caracteristică deosebit de importantă şi unică icircn racircndul
tuturor tipurilor de biomateriale Din categoria ceramicelor bioactive semi-inerte fac parte
apatitele sticlele bioactive şi sticlele ceramice bioactive Fosfaţii de calciu chiar daca fac parte
din clasa apatitelor se icircncadrează icircn categoria ceramicelor resorbabile [72] [73]
Sticlele bioactive au fost inventate de către Hench Universitatea din Florida icircn 1971
Acestea au drept compoziţie de bază SiO2-CaO-Na2O-P2O5 și la fel ca ceramicile bioactive au
capacitatea de a se lega de os fară a exista conexiuni tisulare fibroase icircntre ele Bioglassreg
45S5
este prima şi cea mai studiată sticlă bioactivă Bioglassreg S53P4 este o altă sticlă bioactivă
utilizată icircn ortopedie ca şi substituent osos sub varianta comercială BonAlivereg (Vivoxid
Finlanda) [74]
Sticlele bioactive ceramice se obţin prin precipitarea icircn sticlele bioactive a unei faze
cristaline rolul acestei etape de sinteză fiind de a mări rezistenţa mecanică a acestora din urmă
Spre deosebire de sticlele bioactive obișnuite au o bioactivitate mai scăzută dar au o rezistenţă
mecanică superioară Sunt utilizate la realizare vertebrelor artificiale spaţiului intervertebral
artificial şi a unor materiale de umplere poroase sau granulare [75]
Fosfați de calciu
Fosfații de calciu reprezintă componenta majoră a țesutului dur al vertebratelor
componenta anorganică (minerală) a osului avacircnd icircn compoziție nanocristale non-
stoichiometrice de apatită avacircnd următoarea formulă chimică
Ca10-x(PO4)6-x(HPO4CO3)x(OHF)2-x
unde 0lexle2 O particularitate aparte a structurii apatitelor este capacitatea lor de a putea
icircncorpora multe tipuri de ioni organici sau anorganici Astfel s-a dovedit că fosfați de calciu
32
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanocristalini non-stoichiometrici atacirct biologici cacirct și sintetici icircncorporează icircn structura lor ioni
din mediu chimic care nu corespund apatitelor acești ioni fiind denumiți non-apatitici [76] Icircn
tabelul 13 sunt prezentați diferite tipuri de fosfați de calciu
Tabel 13 Diferite forme de fosfaţi de calciu abrevierea lor formula chimică raportul
CaP mineral (dacă există) [77] [78]
Denumire Abreviere Formulă chimică Raport
CaP Mineral
Fosfat monocalcic
monohidrat MCPM Ca(H2PO4)2 H2O 05 ndash
Fosfat monocalcic
anhidru MCPA Ca(H2PO4)2 05 ndash
Fosfat dicalcic
anhidru DCPA CaHPO4 100 Moneit
Fosfat dicalcic
dihidrat DCPD CaHPO4 2H2O 100 Bruțit
Fosfat octocalcic OCP Ca8H2(PO4)6 5H2O 133 ndash
α-Fosfat tricalcic α-TCP α-Ca3(PO4)2 15 ndash
β-Fosfat tricalcic β-TCP β-Ca3(PO4)2 15 ndash
Hidroxiapatită
deficită icircn calciu CDHap Ca9(HPO4)(PO4)5OH 15 ndash
Hidroxiapatită
precipitată Hap
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x
unde 0lexle2
xx(OH)2-x
133 ndash167 ndash
Hidroxiapatită
sinterizată SHA Ca10(PO4)6(OH)2 167 Hidroxiapatită
Oxiapatită OXA Ca10(PO4)6O 167 ndash
Fosfat tetracalcic TeTCP Ca4(PO4)2O 20 Hilgenstockite
Hidroxiapatita este utilizată destul de des icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos
datorită similarității dintre compoziția sa și cea a fazei minerale a osului uman Faza minerală a
osului uman are formula chimică asemănătoare ce cea a hidroxiapatitei deficitară icircn calciu avacircnd
grupările OH- parțial substituite cu grupări CO3
2- Structura cristalină a hidroxiapatitei poate fi
descrisă ca un aranjament hexagonal unde cationii sunt orientați pe planurile tetraedral și
octaedral Icircn ultimii ani diverse suporturi ceramice pe bază de hidroxiapaptită au fost realizate
Cu toate că acestea prezintă proprietăți foarte bune pentru aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului
osos porozitate ridicată osteointegrare bună totuși au diverse neajunsuri icircn ceea ce privește o
refacere completă a defectelor ososoase [79]
33
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1222 Suporturi biomimetice pentru ingineria tisulară şi regenerarea osoasă
12221 Caracteristici ale suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Suporturile realizate pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă trebuie să aibă o serie
de proprietăți foarte importante pentru a putea fi utilizate cu succes proprietăți prezentate
schematic icircn figura 117
Figura 117 Proprietățile unui suport ideal realizat pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Icircn primul racircnd suporturile trebuie să aibă o serie de proprietăți biologice care sunt
esențiale pentru obținerea unor rezultate promițătoare biocompatibilitatea și bioactivitatea fiind
două din cele mai importante Un suport este considerat biocompatibil dacă nu are răspuns
imunogenic și nu are componente toxice sau inflamatoare care vor conduce la o rejecție
imunologică Bioactivitatea se referă la interacțiunea suportului cu țesutul gazdă și integrarea
acestuia De asemenea din punct de vedere al bioactivității suporturile trebuie să fie
osteoconductive osteoinductive și osteogenice Biodegradabilitatea o altă proprietate biologică
foarte important constă icircntr-o degradare controlată a suportului pe măsură ce se formează țesut
34
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nou menținacircnd totodată suport suficient pentru regenerarea completă a țesutului afectat Lipsa
unor produși de degradare toxici este o altă caracteristică care definește biodegradabilitatea [80]
Proprietăţile de suprafaţa sunt și ele esențiale la fel și proprietăţile morfologice pori
interconectați structură tridimensională microporozitatea macroporozitatea dimensiunea
porilor adaptată fiecărui tip de țesutcelule Porii trebuie să fie interconectați pentru a permite
difuziunea și migrarea celulelor iar dimensiunea porilor trebuie să fie adaptată fiecărui tip de
țesutcelule Microporozitate oferă o suprafață care permite interacțiunile celule-matrice și
macroporozitate permite migrarea celulelor și invazia vaselor de sacircnge Porozitate adecvată
permite creșterea celulelor fără să afecteze proprietățile mecanice
Suporturile trebuie să aibă proprietăţi mecanice similare cu cele ale ţesutului lacircngă care
sunt implantate mai concret trebuie să aibă rezistență la diverse solicitări biomecanice
comparabile cu ale osului uman pentru a permite mecano-reglarea celulară și păstrarea
integrității in vivo [34] [35]
12222 Metode de obținere a suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Metodele convenționale de obținere a suporturilor includ prelucrarea prin turnare icircn
solvent și solubilizarea a particulelor liofilizarea separarea fazelor indusă termic metoda de
formare a spumelor din fază gazoasă formarea prin pulverizare formarea prin tehnica sol-gel
electrofilarea și altele
Icircn cazul metodei prin turnarea icircn solvent și solubilizare a particulelor o soluție de polimer
este introdusă icircntr-o solvent cu particule de săruri avacircnd dimensiuni specifice dispersate
uniform Solventul se va evapora rezultacircnd un suport cu particule icircncorporate Suportul este
imersat apoi icircn apă particulele fiind solubilizate uneori se folosește și icircncălzirea pentru o
solubilizare completă rezultacircnd icircn final o structură cu porozitate ridicată Rezprezentarea
schematică a metodei este redată icircn figura 118 Dezavantajele metodei de formare a suporturilor
sunt formarea unor suporturi cu formă prestabilită și citotoxicitatea suporturilor datoră
rezidurilor de solvent
35
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 118 Obținerea suporturilor prin turnare icircn solvent și solubilizarea particulelor
Liofilizarea are la bază procesul de sublimare care se referă la trecerea apei din fază solidă
icircn fază gazoasă Suporturile obținute prin liofilizarea prezintă o structură poroasă cu pori
interconectați avacircnd dimensiuni medii icircn jur de 300 nm (figura 119) dimensiuni ce depind de
natura componentelor suportului Dezavantajele acestei metode sunt timpul icircndelungat necesar
obținerii suportului și faptul că pori rezultați nu au dimensiuni regulate
Figura 119 Obținerea suporturilor prin liofilizare
36
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Metoda de formare a suporturilor din spume gazoase a fost dezvoltată pentru a icircnlătura
utilizarea solvenților organici citotoxici Polimeri biodegradabili dizolvați icircn apă sau fluoroform
sunt ținuți sub presiune cu diverși agenți gazoși inerți (azot dioxid de carbon) pacircnă cacircnd soluția
este saturată și plină de bule de gaz Tehnica are drept rezultat suporturi poroase cu dimensiuni
medii a porilor icircn intervalul 30-700 microm și o porozitate ridicată de pacircnă la 85
Tehnica sol-gel se bazeză pe polimerizarea anorganică a metalelor alcaloide O soluție (sol)
este format prin adăugarea unui surfactant după care vor urma reacțiile de condensare și
gelifiere [81]
Tehnica de electrofilare a fost inventată icircn 1934 de către Formhals și se bazează pe un
cacircmp electric ce impune o icircntindere uniaxală a unui jet vacircscoelastic provenit dintr-o soluție de
polimer ce icircși reduce continuu diametrul icircn final rezultacircnd nanofibre Este o tehnică simplă și
rentabilă pentru prepararea nanofibrelor polimerice cu diameter cuprinse icircntre 3 nm și 5 μm
(figura 120) Proprietățile nanofibrelor electrofilate sunt influențate de mulți factori cum ar fi
proprietățile polimerului proprietățile solventului aditivii concentrația polimerului proprietățile
soluției și așa mai departe [82]
Figura 120 Obținerea suporturilor prin liofilizare
Există și tehnici moderne de sinteză a suporturilor pentru regenerarea osoasă denumite
tehnici de prototipare rapide Dintre acestea cele mai utilizate și cele care oferă pacircnă icircn present
rezultatele cele mai promițătoare sunt sinterizarea selectivă cu laser stereolitografia imprimarea
tridimensională (3D) bio-imprimarea [81]
37
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
12223 Suporturi biomimetie pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu pentru
regenerarea osoasă
Suporturi biomimetice
Icircn general metodele de regenerare osoasă sunt de preferat metodelor de icircnlocuire osoasă
datorită neajunsurilor celor din urmă Un număr mare de studii icircn domeniul ingineriei tisulare și
regenerare a osului au evidenţiat importanţa critică a caracteristicilor arhitecturii suporturilor
utilizate icircn domeniu
Ţesuturile vii sunt caracterizate de o arhitectură ierarhică tridimensională şi un
micromediu unic ce uşurează intercaţiunea celulelor cu molecule semnal componentele matricei
extracelulare şi unele molecule mici Acest micromediu complex controlează procesele celulare
importante pentru morfogeneza ţesutului şi menţine proliferarea diferenţierea şi migrarea
celulară Ingineria tisulară convenţională a icircncercat să imite proprietăţile ţesutului osos nativ doar
la nivel micromolecular şi macromolecular fiind neglijate icircnsă structurile de la nivel
submicromolecular şi nanomolecular [83]
De asemenea numeroase studii icircn acest domeniu au arătat că nu este suficientă realizarea
unor suporturi pentru regenerarea osoasă luacircnd icircn considerarea doar compoziţia chimică a
osului deoarece acestea nu vor avea proprietăţi mecanice similare cu ale osului natural şi vor
afecta metabolismul acestuia cacircnd vor fi implantate in vivo
Pentru realizarea unui substituent osos care să poată fi aplicat cu succes pentru tratarea
unor defecte osose de diferite cauze trebuie să se ţină cont atacirct de compoziţia naturală a osului
dar cel mai important trebuie să se imite nanostrucutura lui deoarece arhitectura nanostructurală
a osului este esenţa lui atacirct icircn ceeea ce priveşte proprietăţile mecanice cacirct şi bioresorbabilitatea
Realizarea unor matrici de colagen icircn care s-a icircncercat reproducerea mineralizării intrafibrilare a
dus la obţinerea unor suporturi ce pot fi aplicate cu succes icircn ingineria tisulară și regenerarea
ţesutului osos [84]
Avacircnd icircn vedere aspectele mai sus menționate se poate spune că suporturilor preparate
plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important imitacircnd nanostructura sa sunt
suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg procesele substanţele dispozitivele
sistemele facute de om care imită natura [85]
38
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Suporturi compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
Compozitele sunt materiale solide ce au la bază o combinație de minim două materiale cu
propietăți diferite dezavantajele individuale ale acestora sunt diminuate fiind păstrate și puse icircn
valoare doar avantajele fiecărui componet al compozitului
Icircn ingineria tisulară și medicina regenerativă se utilizează mai multe varinte de
compozite co-polimeri polimer ndash polimer sau polimer ndash ceramice Unul din cei mai utilizați co-
polimeri icircn ingineria tisulară osoasă este poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA Compozitele
polimer sintetic ndash polimer sintetic sunt amestecuri de minim doi polimeri sintetice un exemplu
fiind compozitul pe bază de PLGA și polifosfazene asocierea acestora avacircnd drept obiectiv
principal obținerea unor produși de degardare neutri Se pot combina și polimeri sintetici cu
polimeri naturali pentru realizarea de compozite de exemplu PLGA și colagen
Compozitele polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje
care pleacă de la faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele
matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă) De-a lungul timpului au fost studiate și compozite
polimeri sintetici ndash ceramice de exemplu compozite pe bază de poli (acid lactic) poli (acidul
lactic-co-glicolic) hidroxiapatită dar studiile concentrate pe compozitele polimeri naturali ndash
ceramice au avut cele mai bune rezultate de-a lungul timpului [34]
Avantajele unui compozit pe bază de biopolimeri și ceramice ar fi pe de o parte
proprietățile mecanice variabile degradarea controlată și structura fizică a polimerilor iar pe de
altă parte rezistența și natura biomimetică a ceramicelor Combinarea de biopolimeri cu
ceramice elimină un mare dezavantaj al acestora din urmă și anume faptul că sunt casante dar
totodată crește bioactivitatea și capacitatea de transport și eliberare de agenți bioactivi [75]
Compozitele pe bază de colagen și hidroxiapatită au fost de-a lungul timpului cele mai
studiate compozite biopolimeri ndash ceramice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
13 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Icircn ultimii ani interesul pentru nanotehnologie a crescut semnificativ Particulele magnetice
fac parte din grupul materialelor utilizate icircn nanotehnologii cu un impact considerabil icircn diverse
domenii chimie biosenzori nanomedicină etc Cele mai importante aplicații ale lor sunt legate
39
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de obținerea particulelor de dimensiuni nanometrice denumite nanoparticule magnetice ndash MNPs
utilizate ca metode de diagnostic prin separarea magnetică a unor entități biologice utilizarea icircn
scop terapeutic și ultima aplicație aceasta fiind una din cele mai des folosite icircn medicină
utilizarea la rezonanța magnetică nucleară [86]
Utilizate icircn scop terapeutic nanoparticulele magnetice au fost evaluate pentru eliberarea
controlată de medicamente Prin utilizarea atracției magnetice sau a direcționării specifice a unor
biomarkeri tumorali nanoparticulele magnetice oferă o soluție atractivă pentru terapia directă cu
agenți chimioterapici care vor fi eliberați icircntr-un loc specific doză de medicament care ar fi fost
utilizată icircn mod curent fiind astfel redusă semnificativ și o dată cu ea efectele adverse asociate
cu absorbția de către țesuturi sănătoase a medicamentului [87]
MNPs folosite icircn aplicaţiile biomedicale trebuie să fie superparamgnetice adică să aibă
proprietatea de a putea fi magnetizate doar icircn prezenţa unui cacircmp magnetic extern De asemenea
trebuie să aibă dimensiuni mici pentru a nu fi eliminate din circulaţie de către ficat sau splină
după ce cacircmpul magnetic este icircnlăturat Icircn general cu cacirct particulele au dimensiuni mai mari cu
atacirct este mai mic timpul lor de icircnjumătăţire icircn plasma
Cele mai utilizate surse de materiale magnetice sunt oxizii de fier cu structură de miez ce
au mai multe forme cristaline polimorfe hematită α-Fe2O3 maghemită β-Fe2O3 γ- Fe2O3 şi
magnetită ε-Fe2O3 Fe3O4 precum şi alte forme amorfe Singurele utilizate icircn aplicaţiile medicale
sunt maghemita şi magnetita Pentru realizarea miezului magnetic a unor nanoparticule
magnetice se utilizează icircn unele aplicaţii şi fierul carbonil datorită dimensiunilor mici ale
particulelor sale [88] [89]
Pentru a icircmbunătăţi proprietăţile fizice şi chimice ale particulelor magnetice acestea sunt
adesea acoperite cu silica polimeri anumiţi surfactanţi sau diverşi compuşi organici Acoperirea
cu polimeri oferă o serie de avantaje nanoparticulelor magnetice numărul mare de grupări
funcţionale ale polimerilor permite alte funcţionalizări ale particulelor toxicitatea este complet
redusă are rol icircn stoparea procesului de oxidare etc Datorită atracţiei puternice dipol-dipol
dintre particule MNP tind să se aglomereze dar pentru a icircnlătura acest dezavantaj MNP sunt
acoperite cu polimeri hidrofilici cum sunt dextranul şi chitosanul Grupările funcționale ale
chitosanului permit funcționalizarea nanoparticulelor cu diverși agenți bioactivi prin stabilirea de
legături chimice icircntre grupările chitosanului și cele ale agentului
Reprezentarea unei nanoparticule magnetice acoperită cu polimer este redată icircn figura 121
40
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 121 Reprezentarea schematică a unei nanoparticule acoperite cu polimer cu funcții
aminice
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular cercetările
științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind cel de eliberarea
de principii active controlată și țintită
Nanoparticulele sunt integrate prin diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale
pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă
creștere deorece studii mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația
vizată
Icircn urma unui studiu de literatură amănunţit se poate realiza o clasificarea a suporturilor
magnetice pe bază de biomateriale cu aplicaţii icircn ingineria tisulară şi regenerarea osoasă icircn
funcţie de compoziție și icircn funcție de forma de prezentare
Icircn funcție de compoziție suporturile magnetice se pot clasifica icircn suporturi magnetice cu
biopolimeri care se clasifică la racircndul lor icircn suporturi magnetice pe bază de proteine şi suporturi
magnetice pe bază de polizaharide suporturi magnetice cu polimeri sintetici suporturi magnetice
cu materiale ceramice Icircn funcție de forma de prezentare suporturile magnetice se clasifică icircn
suporturi magnetice poroase hidrogeluri magnetice membrane magnetice nanofibroase și sticle
bioactive magnetice (figura 122)
41
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 122 Clasificarea suporturilor magnetice
131 Suporturi magnetice cu biopolimeri
1311 Suporturi magnetice cu proteine
Colagenul gelatina și fibroina din mătase sunt trei din proteinele cele mai utilizate icircn
sinteza de suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi magnetice cu colagen
Unul din primele studii ce prezintă conceptul de suporturi magnetice a fost publicat icircn
2010 de Bock şi colaboratorii [90] prezentacircnd realizarea şi caracterizarea a două tipuri de
suporturi magnetice Primul tip de suport a fost obţinut din hidroxiapatită şi colagen (7030 ww)
reticulat cu 14-butandiol diglicidil eter sub formă de structuri liofilizate microporoase şi
macroporoase avacircnd diametrul de 122plusmn08 mm şi icircnălţimea 47plusmn08 mm Al doilea tip de suport
a fost obţinut din 100 colagen liofilizat sub formă de structuri poroase omogene cu diametrul
42
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de 123plusmn1 mm şi icircnălţime 28plusmn09 mm Icircn vederea magnetizării ambele tipuri de suporturi au
fost imersate pentru 15 min icircn 1ml fero-fluid trei tipuri diferite de fero-fluide fiind utilizate
(figura 123) Fero-fluidele reprezentacircnd nanoparticule magnetice cu dimensiunea de 200 nm
dispersate icircn apă au fost notate FF-DXS (nanoparticule de magnetită acoperite cu sulfat de
dextran și funcționalizate cu grupări funcționale de sulfat de sodiu) FF-PAA (nanoparticule de
magnetită acoperite cu acid poli-DL-aspartic și funcționalizate cu carboxilat de sodiu) și FF-DP
(nanoparticule de magnetită acoperite cu amidon și funcționalizate cu grupări fosfat)
Figura 123 Reprezentarea schematică a procedeului de preparare a suporturilor magnetice [90]
Valorile obținute pentru magnetizarea suporturilor sunt considerate potrivite pentru
generarea de gradient magnetic icircn suport precum și icircn vecinătatea acestuia Studiile in vitro de
biocompatibilitate au dovedit că suporturile magnetice obținute susțin adeziunea și proliferarea
celulelor stem Icircn concluzie suporturile obținute au potențialul de a fi considerate substituenți
osoși avacircnd ca și noutate față de variantele standard proprietatea de a atrage particule magnetice
funcționalizate cu medicamente [91]
Icircn 2013 Panseri și colaboratorii [92] descriu icircntr-un studiu obținerea și caracterizarea de
suporturi magnetice obținute prin două metode diferite metoda A și metoda B Metoda A are la
bază magnetizarea in situ și constă icircn nucleația de apatită biomimetică și 7 nanoparticule
magnetice (cu dimensiunea mai mică de 50 nm achiziționate de la Sigma Aldrich) pe fibrile de
colagen autoasamblate Metoda B reproduce procedeul de obținere descris icircn studiul mai sus
43
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
menționat (Bock și colaboartorii) un suport poros pe bază de hidroxiapatită și colagen fiind
imersat icircn fero-fluidul FF-DP Din datele de microscopie electronică de baleiaj (SEM) autorii au
observat icircn cazul suporturilor obținute prin metoda A o distribuție omogenă a nanoparticulelor
magnetice pe fibrele de colagen iar icircn cazul suporturilor obținute prin metoda B o aglomerare a
nanoparticulelor Teste in vivo complexe au fost realizate utilizacircnd suporturile obținute
rezulatele indicacircnd potențialul acestora de a fi utilizate icircn aplicații ale ingineriei tisulare a
țeustului osos Icircntr-un studiu următor autorii funcționalizează hidroxiapatita cu ioni de fier (Fe2+
şi Fe3+
) conferindu-i astfel proprietăţi superparamagnetice şi totodată diminuacircnd potenţialul
citotoxic ce poate fi uneori dat de magnetită sau de unii oxizi de fier
Suporturi magnetice cu gelatină
Samal şi colaboratorii [93] evidenţiază obţinerea şi caracterizarea de suporturi magnetice
pe bază de gelatină Soluţii de gelatină amestecate cu concentraţii diferite de fero-fluid (particule
de magnetită acoperite cu acid poli-acrilic dispersate icircn apă) au fost transferate icircn plăci de
polistiren cu mai multe straturirezultacircnd membrane ce au fost apoi legate chimic cu ajutorul
carbodiimidelor icircn vederea obţinerii suporturilor
Gelatina a fost utilizată şi de Dashnyam şi colaboratorii [94] pentru obţinerea unor
suporturi magnetice hibride Suporturile au fost obţinute din gelatină şi siloxan printr-un
procedeu sol-gel icircn timpul căruia au fost icircncorporate 3 nanoparticule magnetice ultimul pas
pentru obţinerea unor suporturi foarte poroase a fost liofilizarea Icircn urma unor teste mecanice
efectuate autorii au observat o icircmbunătăţire semnificativă a proprietăţilor mecanice ale
suporturilor datorită icircncorporării de nanoparticule magnetice icircn strucura acestora Icircn cadrul
studiului au fost realizate teste de populare cu celule (stem mezenchimale izolate din şobolan) a
suporturilor avacircnd nanoparticule magnetice icircncorporate precum şi a suporturilor fară
nanoparticule magnetice icircncorporate rezultatele indicacircnd o proliferare celulară icircmbunătăţită icircn
cazul primelor suporturi menţionate
Suporturi magnetice cu fibroină din mătase
Icircntr-un studiu publicat recent fibroina a fost utilizată icircmpreună cu chitosan şi nanoparticule
magnetice pentru realizarea unor suporturi cu porozitate controlată cu aplicaţii icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos O soluţie de fibroină şi chitosan a fost preparată avacircnd raportul masic
44
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
31 şi reticulată cu o soluţie 08 glutaraldehidă Patru fero-fluide avacircnd concentraţiile
nanoparticulelor magnetice 0 05 1 şi 2 au fost adăugate icircn soluţia de polimeri iar
soluţiile astfel obţinute au fost transferate icircntr-o matriţă de politetrafluoretilină aşezată icircntr-o
placă de cupru rece a cărui temperatură a fost controlată cu azot lichid Cristale de gheaţă
unidirecţionale s-au format cu o viteză de solidificare de 1degCminut soluţia icircngheţată rezultată
fiind icircntr-o ultimă etapă liofilizată (figura 124)
Activitatea fizico-chimică a suporturilor obţinute a fost studiată icircn soluţii saline de tampon
fosfat pentru a determina retenţia de fluide şi biodegradarea Stabilitatea nanoparticulelor
magnetice din suporturile obţinute a fost analizată utilizacircnd Spectroscopie de absorbţie atomică
Toate cele patru suporturi realizate s-au dovedit a avea o bună biocompatibilitate icircn urma
testelor MTT [95]
Figura 124 a) Reprezentarea schematică a procesului de obținere asuporturilor b) Structurile
chimice al polimeriloragentului reticulant și interacțiunile dintre aceștia c) Dimensiunea
suporturilor și diferența de culoare dată de variația concentrației de nanoparticule magnetice
d) Suportul este atras de un magnet permanent [95]
Suporturi magnetice pe bază de fibroină din mătase au fost realizate şi caracterizate de
Samal şi colaboratorii Nanoparticulele magnetice au fost integrate icircn suporturi prin imersare
rezultacircnd diferite grade de magnetizare Suporturile obţinute s-au dovedit a avea foarte bune
45
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţi de hipertermie ajungacircnd la temperaturi ce au crescut cu 8degC icircn 100 secunde Testele
de biocompatibilitate au indicat lipsa citotoxicităţii suporturilor precum şi capacitatea acestora de
a susţine adeziune şi proliferarea celulară [96]
Hidrogeluri magnetice au fost obţinute printr-un proces de electro-gelifiere a unui soluţii
concentrate de fibroină din mătase (8 ) cu scopul de a fi utilizate ca şi suporturi icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos Patru feluri de suporturi au fost realizate suporturi avacircnd icircncorporate
nanoparticule magnetice (Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice acoperite
cu albumină serică umană (HSA-Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice
acoperite cu albumină serică umană şi conjugate fizic cu factori de creştere fibroblastici bazali
(HSA-Fe3O4-bFGF) şi suporturi fără niciun fel de nanoparticule magnetice Morfologia
suporturilor a fost studiată cu ajutorului microscopiei electronice de baleiaj Citotoxicitatea lor a
fost analizată printr-un test MTT realizat pe osteoblaste de linie iar activitatea osteogenică a fost
studiată din punct de vedere a fosfatazei alcaline a cantităţii de calciu mineralizat şi a
colagenului Analizacircnd rezultatele testelor menţionate autorii consideră că suporturile obţinute
pot fi utilizate pentru aplicaţia vizată [97]
1312 Suporturi magnetice cu polizaharide
Chitosanul este polizaharidul cel mai utilizat icircn studiile privind sinteza și caracterizarea de
suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi biocompozite magnetice pe bază de chitosan şi carboximetilceluloză au fost
obţinute şi caracterizate de către Grumăzescu şi colaboratorii [98] Carboximetilceluloza cel mai
utilizat eter de celuloză este o polizaharidă cu lanţ liniar solubilă icircn apă datorită grupărilor
carboximetil (CH3COONa) introduse icircn molecula de celuloză Deoarece are icircncărcătură electrică
opusă chitosanului reacţionează puternic cu acesta utilizacircndu-se ca agent de reticulare ionic la
anumite valori ale pH-ului Autorii au studiat morfologia suporturilor eficacitatea utilizării
acestora ca şi sisteme de eliberare controlată de antibiotice in vitro precum şi intercaţiunea lor cu
celule eucariotice Rezultate studiilor menţionate au demonstrat că suporturile magnetice
biocompozite propuse de autori pot fi utilizate cu succes icircn viitor icircn domeniul medical icircn
special icircn ingineria tisulară
Heidari şi colaboratorii [99] prezintă icircntr-un studiu recent prepararea in situ a unor
nanoparticule de oxid de fier icircn matrici de hidroxiapatităchitosan pentru aplicaţii icircn ingineria
46
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
ţesutului osos Atacirct hidroxiapatita cacirct şi chitosanul au fost extrase din surse naturale os cortical
bovin pentru hidroxiapatită respectiv creveţi pentru chitosan Două cloruri de fier (FeCl2 FeCl3)
au fost dizolvate icircn soluţie de acid acetic sub agitare magnetică pentru 30 min S-a adăugat apoi
pulbere de hidroxiapatită iar după dizolvarea pentru o oră a acesteia s-a adăugat chitosan şi s-a
lăsat la solubilizat pentru icircncă o oră Alte etape au urmat obţinacircndu-se o matrice gel ce a fost
uscată icircn etuvă la 60degC pentru 24 ore Compozitele tridimensionale obţinute au fost supuse unui
număr foarte mare de analize distribuţia particulelor magnetice icircn funcţie de mărime a fost
analizată cu ajutorul unui analizor de particule şi cu ajutorul microscopiei electronice de
transmisie (TEM) morfologia probelor a fost analizată utilizacircnd SEM proprietăţile magnetice au
fost studiate cu ajutorul unui magnetometru cu vibraţii simple (VSM) şi multe altele
Y Wei și colaboratorii [100] publică un studiu icircn care prezintă fabricarea și caracterizarea
de membrane nanofibroase pe bază de oxizi de fier (Fe3O4) chitosan și polialcool vinilic
Chitosanul (CS) și alcoolul polivinilic (PVA) au fost dizolvate separat icircntr-o soluție de acid
acetic iar apoi au fost amsetecate icircn raport de masă CSPVA= 23Nanoparticule pe bază de
Fe3O4 obținute printr-o metodă de co-precipitare au fost adăugate icircmpreună cu etanol icircn
amestecul polimeric Membranele magnetice nanofibroase Fe3O4CSPVA au fost obținute prin
electrofilarea soluției polimerice conținacircnd Fe3O4 Datorită procesului de electrofilare s-a obținut
o porozitate foarte bună a membranelor 839-851 Datele TEM au arătat o distribuiție uniform
a nanoparticulelor magnetice Datele de spectroscopiei icircn infraroșu cu transformată Fourier
(FTIR) și datela de difracției cu raze X (XRD) au demonstrat că structura chimică și
cristalinitatea probelor nu a fost afectată de procesul de electrofilare De asemenea proprietățile
mecanice proprietățile magnetice și interacțiunea cu osteoblaste aparținacircnd linie de celule
tumorale MG-63 au sugerat că membranele magentice obținute au un real potential pentru
viitoare aplicații privind regenerarea osoasă
132 Suporturi magnetice cu polimeri sintetici
Icircn ultimii 100 ani materialele sintetice sunt utilizate pentru repararea şi regenerarea unei
varietăţi de ţesuturi şi organe [101] Deoarece in vivo osul este adesea supus forţelor mecanice
rezultate icircn urma acţiunii muşchilor şi a mişcărilor corpului una din cerinţele de bază impuse
unui suport realizat cu scopul de a fi utilizat icircn ingineria tisulară a ţesutului osos este aceea de a
fi capabile să suporte stimulii mecanici Biomaterialele sintetice rezultate icircn urma polimerizării
47
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
acidului lactic a acidului glicolic sau a caprolactonei sunt studiate pentru realizarea de suporturi
compozite de obicei icircn combinaţie cu polimeri naturali [102]
Poli (acidul lactic)
Suporturile magnetice pe bază de PLA sunt icircn prezent puțin studiate unul din puținele
studii pe această temă fiind publicat icircn 2007 Lucrarea respectivă se concentrează pe analiza
influenței orientării fibrelor unui suport magnetic pe bază de poli (acid L-lactic) ndash PLLA obținut
prin procedeul de electrofilare asupra proprietăților sale mecanice Pentru realizarea suportului
o soluție de 3 PLLA icircn hexafluoro-2-propanol a fost amestecată cu nanoparticule de magnetită
(Fe3O4) icircn raport PLLAFe3O4 - 955 Amestecul a fost sonicat și apoi electrofilat S-a studiat
morfologia suporturilor obținute interacținuea cu celule precum și rezistența mechanică [102]
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Suporturi nano-compozite superparamagnetice pe bază de PLGA pentru ingineria tisulară
au fost realizate de Lai și colaboratorii Icircntr-o primă etapă PLGA și nanoparticule de magnetită
superparamagnetice hidrofobe (MNPs) au fost amestecate separat icircn diverse rapoarte masice (19
și 11) Icircn a doua etapă cele două amestecuri au fost transferate separat icircntr-o seringă de sticlă de
10 ml conectată la un ac cu dimensiunea de 6 gauge Un electrod a fost montat la ac iar
amestecul respectiv a fost electrofilat icircn timpul procesului tensiunea fiind păstrată constantă la
20 kV viteza de filare fiind de 1 mlH Icircn funcție de raportul PLGA MNPs s-au obținut două
suporturi diferite PLGA-10 MNPs și PLGA-50 MNPs Datele SEM și TEM au evidențiat o
dimensiune a fibrelor suporturilor de 400-600 nm cu MNPs distribuite uniform Suporturile
compozite s-au dovedit a avea o biocompatibilitate excelentă susținacircnd semnificativproliferarea
celulară [103]
Poli (caprolactona)
Unul dintre primele studii care prezintă suporturi magnetice pe bază de PCL a fost
prezentat de Kim și colaboratorii [104] Pentru realizarea suporturilor s-a preparat icircntr-o primă
etapă o soluție de 10 PCL (cu masa molară 80 kDa) icircn cloroform După solubilizare completă
icircn soluția de 10 PCL s-au adăugat două concentrații diferite de nanoparticule magnetice
(MNPs) 05 și 10 față de cantitatea de PCL solubilizată Icircn funcție de concetrația de
48
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanoparticule adăugate suporturile au fost notate PCL-MNP5 (5 MNP) PCL-MNP10 (10
MNP) și PCL (nu conține MNPs) După ultrasonicare soluțiile au fost icircnghețate la -70degC iar
apoi liofilizate pentru 3 zile Adăugarea de MNPs icircn suporturile pe bază de PCL a condus la o
icircmbunătățire a hidrofilicității precum și a proprietăților mecanice a acestora Autorii au
demonstrat că suporturile PCL-MNP au capacitatea de a susține adeziunea celulară precum și
mineralizarea avacircnd o bună biocompatibilitate Suporturi realizate după același protocol
prezentat icircn studiul menționat mai sus sunt riguros studiate in vitro și in vivo din punct de vedere
al biocompatibilității și al interacțiunii cu celule și țesuturi Rezultatele obținute icircn respectivul
studiu indică un potențial considerabil al acestor suporturi de a fi utilizat pentru repararea și
regenerarea osoasă [105]
Suporturi magnetice nanofibroase pe bază de PCL sunt prezentate și icircntr-un studiu publicat
icircn 2016 Icircntr-o soluție de 10 PCL icircn diclometan-etanol s-au icircncorporat două concentrații
diferite de nanoparticule magnetice conjugate cu COOH (10 și 20 COOH-MNPs)
amestecurile obținute fiind electrofilate la temperatura camerei obținuacircndu-se astfel suporturi
magnetice nanofibroase Microstructura și nanostructura suporturilor a fost analizată cu ajutorul
SEM și a microscopiei electronice de transmisie TEM Structura chimică a fost studiată prin
intermediul FTIR iar cristalinitatea prin intermediul XRD S-au studiat de asemenea
proprietățile hidrofile al suporturile proprietățile magnetice și foarte important
biocompatibilitatea acestora și interacțiunea cu celulele [106]
Gloria și colaboratorii [107] prezintă realizarea și caracterizarea de suporturi magnetice pe
bază de PCL cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos După solubilizarea PCL (masa
molară 65 kDa) icircn tetrahidrofuran s-au adăugat separat 3 concentrații diferite de nanoparticule
magnetice (hidroxiapatită dopată cu ioni de fier ndash FeHA) cu diametrul de 20 nm respectacircndu-se
următoarele rapoarte masice PCLFeHA 9010 8020 și 7030 Pentru o distribuție uniformă a
nanoparticulelor magnetice icircn soluția polimerică cele trei amestecuri polimer-nanoparticule au
fost ultrasonicate Următoarea etapă pentru obținerea suporturilor a fost turnarea amestecului icircn
matrițe speciale obținacircndu-se icircn final suporturi cu diametrul de 64 mm și o grosime de 05 mm
Icircn urma analizei datelor XRD autorii au observat că procesul de formare al suporturilor nu
afecteză structura și cristalinitatea acestora Analiza biologică a substraturilor a evidențiat
abilitatea acestora de a susține diferențierea osteogenică
49
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
De remarcat este studiul publicat de Santis și colaboratorii icircn care prezintă realizarea și
caracterizarea unui suport hibrid pe bază de PCL și polietilen glicol (PEG) și nanoparticule
magnetice cu potențiale aplicații icircn regenerarea țesutului osteocartilaginos Suportul hibrid
multistrat a fost obținut prin combinarea a două tehnici de formare a suporturilor imprimare 3D
și stereolitografie [108]
Poli (3- hidroxibutiratul) ndash P(3HB)
Akaraonye și colaboratorii [109] prezintă realizarea și caracterizarea de nanocompozite
magnetice pe bază de P(3HB) cu potențiale aplicații icircn ingineria țesutului osos Două tipuri de
nanocompozite magnetice au fost realizate nanocompozite pe bază de P(3HB) și nanoparticule
magnetice ndash P(3HB)MNP și nanocompozite pe bază de P(3HB) și ferofluid - P(3HB)FF S-a
observat o icircmbunătățire a cristalinității suporturilor compozite ca urmare a icircncorporării
nanoparticulelor magnetice și a ferofluidului icircn suportul polimeric un grad de cristalintate ridicat
al suporturilor fiind benefic regenerării ososoase Propritățile termomecanice favorabile precum
și biocompatibilitatea suporturilor realizate icircn lucrare indică o potențială utilizare a acestora icircn
aplicații ce vizează repararea și regenerarea țesutului osos
133 Suporturi magnetice pe bază de biomateriale ceramice
1331 Sticle ceramice bioactive
Datorită biocompatibilității lor ridicate sticlele bioactive pe bază de siliciu sunt utilizate
pentru refacerea unor defecte mici și chiar medii fiind adesea utilizate cu rolul de grefe icircn
intervenții chirurgicale parodontale și maxilofaciale De asemenea se utilizează pentru refacerea
unor defecte osoase ale urechii medii sau ale coloanei vertebrale Superioare sticlelor bioactive
non-mezoporoase icircn ceea ce privește volumul nanoporos bioactivitatea și degradarea sticlele
bioactive mezoporoase (MBG) au fost fabricate pentru prima dată icircn 2004 de Yan și
colaboratorii avacircnd formula chimică SiO2-CaO-P2O5 [110] Loacutepez-Noriega și colaboratorii au
demonstrat icircntr-un studiu capacitatea sticlelor MBG de a lega și elibera medicamente anti-
osteoporotice [111]
Wu și colaboratorii [112] publică un studiu ce are drept obiectiv principal realizarea unor
suporturi multifuncționale pe bază de MBG și fier (Fe) cu potențiale aplicații icircn terapia
hipertermică (hipertermie) și eliberarea controlată de medicamente pentru tratamentul unor
50
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
afecțiuni osoase maligne Suporturile poroase Fe-MBG (avacircnd icircncorporat 5 sau 10 Fe) au
fost pregătite utilizacircnd co-șabloanele copolimerului tribloc Pluronic P123 (utilizat pentru a
conferi o structură mezoporoasă avacircnd o dimensiune de cacircțiva nanometri) și bureți de
poliuretan(utilizați pentru a creea pori mari avacircnd dimensiuni de cacircteva sute de micrometri)
Prima etapă pentru obținerea celor două suporturi magentice 10 Fe-MBG (10Fe-MBG) și 5
Fe-MBG (5Fe-MBG) a fost solubilizarea icircn etanol de cantități diferite de P123
tetraetilortosilicat (TEOS) Ca(NO3)2∙4H2O FeCl3 trietilfosfat (TEP) și HCl sub agitare
magnetică pentru 24 ore Bureți de poliuretan au fost imersați pentru 10 min icircn soluția obținută icircn
prima etapă iar după icircndepărtarea soluției icircn exces au fost lasați la uscat la temperatura camerei
pentru 24 ore Această etapă a fost repetată de 5 ori după care bureții au fost calcinați la 700degC
pentru 5 ore Pe lacircngă cele două suporturi a fost realizat și un suport 0Fe-MBG care după cum
indică și numele nu conține fier Suporturilor obținute au fost caracterizate utilizacircnd diferite
tehnici SEM și EDS (figura 125) precum și XRD și TEM
Figura 125 a) c) e) Rezultatele SEM b) d) f) Rezultatele EDS [112]
De asemenea s-au realizat diverse teste pentru analiza proprietăților magnetice a
proprietăților mecanice a eliberării controlate de medicament din suport și a contactului cu
51
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
celule stem din măduvă osoasă umană Rezultatele obținute icircn urma studiilor menționate indică
faptul că suporturile sunt magentice degradabile bioactive și au capacitatea de eliberare
controlată de medicamente
1332 Fosafați de calciu
Panseri și colaboratorii [113] prezintă icircntr-un studiu realizarea și caracterizare in vitro a
unor suporturi compozite ceramice poroase Trei tipuri diferite de suporturi au fost fabricate din
hidroxiapatită (HA) ce icircncorporează magnetită (Mgn) avacircnd următoarele rapoarte HAMgn
955 HAMgn 9010 și HAMgn 5050 De asemenea s-a realizat un suport avacircnd raportul
HAMgn 1000 ce a fost utilizat drept control Diverse teste in vitro de biocompatibilitate au fost
realizate utilizacircnd linii celulare de osteoblaste umane Saos-2 teste de proliferare celulară teste
privind activitatea fosfatazei alcaline a celulelor teste de viabilitate celulară livedead etc
Rezultatele acestor teste au indicat o foarte bună biocompatibilitate a suporturilor ceea ce indică
faptul că adăugarea de magnetită icircn structura suporturilor nu a condus la efecte negative asupra
celulelor De asemenea suporturile au fost implantate in vivo la iepuri obținacircndu-se rezultate
bune
14 Concluzii
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta
aceste defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din
biomateriale sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea
celulelor osoase icircn timpul procesului de regenerarea osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau
regenerarea ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor
artificiale și a suporturilor Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase
52
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
sisteme injectabile capsule filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte
tuburi geluri etc
Suporturilor preparate plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important
imitacircnd nanostructura sa sunt suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg
procesele substanţele dispozitivele sistemele facute de om care imită natura Compozitele
polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje care pleacă de la
faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele matricei
extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă)
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular
cercetările științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind
cel de eliberarea de principii active controlată și țintită Nanoparticulele sunt integrate prin
diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă creștere deorece studii
mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația vizată
53
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Obținerea și caracterizarea de suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi
de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Capitolul 2 Materiale şi metode experimentale
21 Strategie experimentală Obiective
Regenerarea osoasă și inginerie tisulară a țesutului osos sunt două domenii intens studiate
datorită creșterii numărului de afecțiuni osoase infecții osoase pierderi de cauză traumatică ale
masei de țesut osos tumori osoase Autogrefele au fost o perioadă mare de timp cele mai
utilizate materiale pentru regenerarea și substituția osoasă icircnsă au multiple dezavantaje
ingineria tisulară atragacircnd tot mai mult atenția icircn special unele suporturi complexe pentru
ingineria tisulară a țesutului osos Icircn capitolul 1 au fost prezentate limitările metodelor actuale de
tratament şi necesitatea reală de găsire a unei metode alternative efective care să aibă drept scop
regenerarea osoasă
Ingineria tisulară domeniu interdisciplinar de mare actualitate oferă soluţii promiţătoare
pentru realizarea de materiale pentru regenerarea tisulară Plecacircnd de la structura țesuturilor
biologice componentele ingineriei tisulare sunt următoarele o matrice sau un suport celule și
molecule semnal suportul fiind componenta cheie
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă este rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea unui
material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și regenerare
osoasă ar putea fi un suport magnetic biomimetic
Icircn urma analizei rezultatelor stiinţifice din domeniul ingineriei tisulare și regenerării osoase
s-a ales pentru lucrarea de faţă o strategie de cercetare care a avut ca obiectiv central
Avacircnd icircn vedere componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă) au fost selectate biomaterialele
utilizate icircn studiile de față după cum urmează pentru componenta organică au fost selectați
biopolimeri adesea utilizaţi icircn studii ce vizează regenerarea țesutului osos şi fosfați de calciu
54
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
pentru componenta anorganică Noutatea tezei este dată de adăugarea de particule magnetice
(magnetită funcţionalizată cu chitosan) icircn amestecul supus procedeului de co-precipitare ce vor
fi funcționalizate cu diverși bioagenți (medicamente) și vor avea rolul de transportori ai acestora
Un suport magnetic biomimetic cu design adecvat este dispozitivul ideal pentru a ghida
formarea de neo-ţesut atacirct in vitro cacirct şi in vivo Suporturile pentru ingineria tisulară a osului
trebuie să fie biocompatibile să mimeze structura şi funcţia biologică a matricei extracelulare şi
să ofere suport mecanic pentru ţesutul icircn formare şi de asemenea să elibereze icircn locul unde are
loc repararea ţesutului diverse molecule celule factori de creştere Totodată suportul trebuie să
fie osteoconductiv şi osteoinductiv şi să aibă o rată de degradarea controlată
O mare parte din suporturile propuse de unele studii icircn domeniu nu mimează şi arhitectura
matricii extracelulare naturale acesta fiind motivul pentru care rezulatele unor astfel de studii nu
sunt satisfăcătoare Suportul trebuie să fie biomimetic adică să mimeze nu doar compoziția
osului ci cel mai important nano-structura sa Astfel pentru tema de cercetare abordată s-a ales
un procedeu biomimetic de co-precipitare in situ a fosfaţilor de calciu icircn soluţii de biopolimeri
inspirat din procesul natural de mineralizare unde mineralele sintetizate de către organism sunt
combinate cu componentele organice ale matrici extracelulare a ţesutului osos
Pentru partea organică a suporturilor s-au utilizat diverși polimeri naturali chitosan acid
hialuronic gelatină albumină şi colagen
Pentru partea anorganică a suporturilor s-au utilizat fosfaţi de calciu sintetici deoarece
prezintă o strucutură similară cu cea a mineralului primar din componenţa ţesutului osos avacircnd
rolul de stimuli osteoconductivi şi osteoinductivi Aceştia s-au obţinut prin precipitarea din
precursori azotat de calciu ndash Ca(NO3)2 CaCl2 şi fosfat monosodic ndash NaH2PO4
Utilizarea particulelor magnetice este un concept intens studiat icircn domeniul inginerie
tisulare Acesta implică utilizarea de nanoparticule magnetice care sunt funcționalizate cu factori
de creștere medicamente sau alți agenți bioactivi care vor fi preluate de către suportul magnetic
ca urmare a acțiunii unui camp magnetic icircn apropierea zonei unde este implantat suportul
Nanoparticulele magnetice funcţionalizate acţionează ca transportatori de agenţi bioactivi către şi
icircn interiorul suportului magnetic După ce patrund icircn suportul magnetic aceste particule
magnetice eliberează succesiv moleculele pe care le transportă Suporturile obţinute au fost
riguros analizate din punct de vedere fizico-chimic şi biologic
55
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
22 Materiale utilizate
221 Materiale utilizate pentru prepararea suporturilor
Analizacircnd icircn amănunt proprietăţile biopolimerilor utilizaţi icircn studii ce vizează obţinerea de
suporturi pentru regenerarea osoasă prezentate icircn capitolul 1 cinci biopolimeri au fost utilizaţi
pentru prepararea loturilor de suporturi două polizaharide şi trei proteine
Fosfaţi de calciu se vor obţine din precursori lor
Polizaharide
Chitosan ndash Cs CAS 9012-76-4 cu masă molară medie M = 309900 Da grad de
deacetilare 792 achiziţionat de la Vascon Co Canada
Hialuronat de sodiu din Streptococcus equindash Hya CAS 9067-32-7 M = 15-18 x
10E6
Da solubilitate = 5 mgml (H2O)Sigma Aldrich Germania
Proteine
Colagen ndash Col tip I+III acido-solubil extras din derm bovin 096 ρ= 097 gcm3
obţinut de la firma Lohmann amp Rauscher Newied Germania
Gelatină ndash G CAS 9000-70-8 pH 38 ndash 76 solubilitate = 10 gL (H₂O 25degC) Merck
Germania
Albumină serică bovină ndash Bsa CAS 9048-46-8 pulbere liofilizată ge 98
(electroforeză icircn gel de agaroză) Sigma-Aldrich Germania
Precursori de fosfaţi de calciu (CP)
Azotatul de calciu ndash Ca(NO3)2∙4H2O CAS 13477-34-4 M = 23615 gmol Sigma-
Aldrich Germania
Clorură de calciu ndash CaCl2middot2H2O CAS 10035-04-8 M = 14701 gmol solubilitatea =
1280 gL ρ = 185 gcm3 (20degC) Merck Germania
Fosfatul monosodic ndash NaH2PO4∙ 2H2O CAS 13472-35-0 pH=41-45 (25degC 5 icircn
soluţie) M = 13799 gmol Sigma-Aldrich Germania
Amoniac soluţie ndash NH4OH CAS 1336-21-6 soluţie 25 Sigma-Aldrich Germania
56
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Particule magnetice (MNPs)
Magnetită ndash Mag sintetizată printr-un procedeu de co-precipitare [114]
Chitosan ndash Cs low CAS 9012-76-4 chitosan cu masă moleculară mică M = 50000-
190000 Da (icircn funcţie de vacircscozitate) vacircscozitate 20-300 cP pentru o soluţie 1 icircn acetic acid
(1 25degC) Sigma-Aldrich Germania
Pluronicreg F-127 CAS 9003-11-6 pH= 6-7 Sigma-Aldrich Germania
Tripolifosfat de sodiu ndash TPP CAS 7758-29-4 Na5P3O10 85 M = 36786 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Doxorubicin hydrochloride ndash DOX CAS 25316-40-9 C27H29NO11 ∙HCl M = 57998
gmol utilizată la pentru studiul de eliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi Sigma-
Aldrich Germania
222 Materiale utilizate pentru caracterizarea suporturilor
Soluţie tampon fosfat pH=72 001 M
Pentru prepararea soluţie tampon fosfat (PBS) pH=72 001 M s-au utilizat
Fosfat monosodic ndashNaH2PO4middot2H2O CAS 13472-35-0 M = 15601 gmol Sigma
Aldrich Germania
Fosfat disodic ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 gmol Sigma Aldrich
Germania
S-au preparat soluţii de fosfat monosodic şi fosfat disodic ambele de concentraţie 001 M
după care cele două soluţii s-au amestecat conform tabel 21
Tabel 21 Proporţiilor de amestecare pentru obţinerea soluţiei PBS pH=72 001M
Fosfat monosodic (ml) Fosfat disodic (ml) pH
28 72 72
Soluţie tampon fosfat (PBS) cu pH 72 şi concentraţie 001 M s-a utilizat pentru
determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic şi la studiile in vitro de
degradare enzimatică
57
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Soluție fluid biologic simulat
Soluția de fluid biologic simulat (SBF) a fost preparată prin dizolvarea icircn apă deionizată a
reactivilor NaCl NaHCO3 KCl Na2HPO4∙2H2O MgCl2∙6H2O CaCl2∙2H2O and Na2SO4 [115]
Reactivii achiziționați de la Merck Germania și Sigma-Aldrich Germania s-au adăugat
unul cacircte unul după ce fiecare reactiv s-a dizolvat complet icircn 700 ml apă deionizată strict icircn
ordinea precizată icircn tabelul 22
Tabel 22 Compoziția chimica a fluidului biologic simulat (SBF)
Ordinea
componentului Reactivi
Cantitate
(gL)
1 NaCl CAS 7647-14-5
M = 5844 gmol 6547
2 NaHCO3 CAS 144-55-8
M = 8401 gmol 2268
3 KCl CAS 7447-40-7
M = 7455 gmol 0373
4 Na2HPO4∙2H2O CAS 10028-24-7
M = 17799 gmol 0178
5 MgCl2∙6H2O CAS 7791-18-6
M = 20330 gmol 0305
6 CaCl2∙2H2O CAS 10035-04-8
M = 14701 gmol 0368
7 Na2SO4 CAS 7757-82-6
M = 14204 gmol 0071
8 (CH2OH)3CNH2 CAS 77-86-1
M = 12114 gmol 6057
Soluția obținută după amestecarea reactivilor s-a ajustat la pH = 74 utilizacircnd o soluție 1M
HCl Din volumul total de acid o parte (aproximativ 20 ml) s-a introdus icircnainte de adaosul celui
de-al șaselea component (CaCl2∙2H2O) pentru a evita apariția fenomenului de precipitare După
adaosul celui de-al 8-lea component [tris (hidroximetil) amino metan] s-a ridicat temperatura
soluției la 37ordmC
58
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Această soluție s-a titrat ulterior cu 1M HCl pacircnă la pH=74 la 37ordmC Icircn timpul procesului
de titrare soluția a fost diluată continuu prin adaos consecutiv de apă deionizată pentru a rezulta
volumul final de 1 L
Concentrația ionilor icircn SBF-ul realizat sunt apropiate de cele care se găsesc icircn plasma
umană așa cum se poate observa icircn tabelul 23
Tabel 23 Concentrațiile ionilor icircn SBF și icircn plasma umană
Concentrație (mM)
Na+
K+
Ca2+
Mg2+
HPO42-
Cl-
HCO32-
SO42-
Plasma umană 1420 50 25 15 10 1030 270 05
SBF 1422 502 247 151 102 1250 272 052
Soluţie tampon fosfat-citrat pH=5
Pentru prepararea soluţiei tampon fosfatndashcitrat pH=5 (după metoda Perse 1980) s-au
utilizat
Fosfat disodic anhidru ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 Sigma-Aldrich
Germania
Acid citric ndash C6H8O7 CAS 77-92-9 M = 19212 gmol Honeywell Riedel-de Haeumln
Germania
S-au preparat o soluţie de Na2HPO4 de concentraţie 02M și o soluție C6H8O7 de
concentraţie 01M după care s-au amestecat volumele specificate icircn tabel 24
Tabel 24 Proporţiile de amestecare pentru obţinerea a 100 ml tampon fosfat-citrat pH=5
Fosfat disodic (ml) Acid citric (ml) Apă distilată (ml) pH
257 243 50 5
59
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Studii in vitro de degradare enzimatică
Tabel 25 Reactivi utilizați pentru studiile in vitro de degradare enzimatică
Determinarea concentrației de
chitosan degradat
Determinarea concentrației de
colagen degradat
Enzime
utilizate
Lizozim ndash 100000 unităţimg
CAS 12650-88-3
M = 143 kDa (a unui singur lanţ)
Sigma-Aldrich Germania
Colagenază clostridium histolyticum
CAS 9001-12-1
M = 68 ndash 125 kDa
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
determinarea
produșilor de
degradare
Fericianură de potasiundash
K3Fe(CN)6
CAS13746-66-2 ge990
M = 32924 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Ninhidrină ndash C9H6O4
CAS 485-47-2
M = 17814 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Clorură de staniu ndashSnCl2
CAS 7772-99-8
M = 1896 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
realizarea
curbei etalon
N-acetil-D-glucozamină ndash
C8H15NO6
CAS 7512-17-6
M = 22121 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Glicină ndash C2H5NO2
CAS 56-406-6
M = 7507 gmol
Fluka Elveţia
Solvenți
Carbonat de sodiu ndash Na2CO3
CAS497-19-8
M = 10599 gmol
Chemical Company Iaşi
2-metoxietanol ndash CH3OCH2CH2OH
CAS 109-86-4
M = 7609 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Teste de citotoxicitate in vitro
Cu excepția solvenților care au fost achiziționați de la Chemical Company Iaşi toate
celelalte materiale prezentate icircn tabelul 26 au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich
Germania
60
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Tabel 26 Reactivi utilizați pentru studiile de citotoxicitate in vitro
Medii de cultură și soluții
de completare
Reactivi pentru
determinare
citotoxicității in vitro
Soluţie salină
Hanksrsquo Balanced
(HBSS)
Solvenți
Mediu de cultură DMEM
(Dulbeccorsquos Modified
Eaglersquos Medium) cu
4500 mgl glucoză
L-glutamat şi bicaronat
de sodiu
Tripsină din pancreas
de porc
CAS 9002-07-7
M = 238 kDa HBSS cu roşu fenol
fără clorură de calciu
şi sulfat de magneziu
Alcool isopropilic
(CH3)2CHOH
CAS 67-63-0
M = 6001 gmol
Mediu de cultură DMEM
F-12 HAM
(amestec de nutrienţi)
cu L-glutamat piruvat de
sodiu 055 gl
glucoză 315 gl
Acid etilen-diamino-
tetraacetic ndash EDTA
CAS 60-00-4
M = 29224 gmol
PSN ndash amestec de
penicilină streptomicină
neomicină
5000 unităţi penicilină 5
mg streptomicină 10
mgml neomicină
MTT ndash C18H16BrN5S
[bromură de (3-[45-
dimetiltiazol-2-il]-25-
difenil) tetrazoliu
CAS 298-93-1
M = 41432 gmol
HBSS cu clorură de
calciu şi sulfat de
magneziu
fără roşu fenol
Alcool etilic
absolut C2H5OH
CAS 64-17-5
M = 4607 gmol
Ser fetal bovin ndash BFS
Calceină AM
CAS 148504-34-1
Teste de citotoxixictate in vivo
Șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28plusmn3
grame materialul biologic provenit din Biobaza INCDMI Cantacuzino București - filiala
Băneasa Reactivi utilizați au fost aleși conform standardului ISO 10993
Betadină ndash soluție cutanată 10
Isofluran 4 ndash soluție pentru inducția anesteziă
Aldehidă formică 10 parafină colorant Tricromic Masson ndash pentru examenul
histopatologic
61
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
23 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu
incluziune de particule magnetice
231 Obţinerea particulelor magnetice
Particulele magnetice au fost obţinute conform protocolului descris de Bălan şi
colaboratorii [116] proprietățile lor fiind prezentate icircn tabelul 27
Tabel 27 Proprietățile particulelor magnetice
Dimensiunea medie
(nm)
Indicile de
polidispersitate
Potențialul Zeta
icircn soluție apoasă de
surfactant (mV)
Magnetizarea
(emug)
178 027 -186 4365
Pe scurt un volum de soluţie de chitosan de masă moleculară mică ndash Cs low a fost
amestecat cu un volum de magnetită ndash Mag şi pluronic F-127
După omogenizare amestecului se va adăuga o soluţie TPP icircn picătură Amestecul final se
va dializă contra apei distilate pentru mai multe zile
232 Obținerea suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu
incluziune de particule magnetice
Suporturilor magnetice au fost obţinute utilizacircnd o metodă biomimetică de co-precipitare a
fosfaţilor de calciu din precursorii săi icircn soluţii de biopolimeri inspirată din procesul natural de
mineralizare etapele procesului de obţinere fiind prezentate icircn figura 21
Soluţiile apoase de precursori de fosfaţi de calciu au fost adăugate icircn amestecul de soluţii
de polimeri Icircnainte de adăugarea precursorilor de fosfaţi de calciu icircn amestecul de soluţii de
polimeri s-au adăugat particule magnetice fie sub formă uscată fie sub formă de suspensie
coloidală
Co-precipitarea s-a realizat icircn prezenţa unei soluţii de amoniac NH4OH (25 ) pacircnă la
obținerea unei valori a pH-ului de 72-74 Fiecare amestec a fost spălat de 3 ori cu apă distilată
prin centrifugare (5000 rpm timp de 10 minute) iar icircn final amestecurile au fost liofilizate 24h la
-55degC
62
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Figura 21 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
233 Program experimental
Specialiștii din foarte multe domenii de activitate se confruntă deseori cu provocarea de a
face compromisuri icircntre diferiți factori pentru a obține rezultatele dorite optimizare fiind
procesul de a alege aceste compromisuri icircn cel mai eficient mod posibil Noțiunea de diferiți
factori face referire la existența unor diferite soluții posibile iar noțiunea de realizare a
rezultatelor dorite se referă la obiectivul de a căuta icircmbunătățirea modului de identificare a
soluției optime Prin urmare icircntr-o problemă de optimizare diferitele soluții posibile sunt
comparate calitatea soluției fiind fundamentală deoarece aceste soluții sunt de multe ori icircn
contrast [117]
Programe experimentale factoriale sunt foarte eficiente pentru studierea a doi sau mai mulți
factori Efectul unui factor poate fi definit ca schimbarea răspunsului produs de o modificare a
nivelului factorului acesta fiind considerat efectul principal Icircn unele experimente se poate
63
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
constata că diferența de răspuns dintre nivelurile unui factor nu este aceeași la toate nivelurile
celorlalți factori numit efect de interacțiune icircntre factori Icircn mod colectiv efectele principale și
efectele de interacțiune sunt numite efectele factoriale Un design factorial complet poate estima
toate efectele principale și interacțiunile de ordin superior
Programe experimentale factoriale sunt folosite icircn ingineria tisulară și icircn domeniul
biomaterialelor [118] icircn domeniul farmaceutic [119] etc
Icircn teza de față s-a utilizat un program experimental multifactorial icircn vederea optimizării
compoziției suporturilor Programul menționat este caracterizat prin faptul că fenomenul
procesul este urmărit prin intermediul unui număr finit de variabile variabile ce pot avea fiecare
un număr discret de valori icircntr-un domeniu de variaţie prestabilit Compoziția suporturilor a fost
optimizată din punct de vedere al raportului biopolimerbiopolimer un program experimental
factorial central compus rotabil de ordinul 2 fiind utilizat [120] Ecuația următoare stabilește
numărul total de experiențe posibile
NE = 2k + 2k + n0 icircn cazul icircn care k lt 5 (1)
sau
NE = 2k-1
+ 2k + n0 icircn cazul icircn care k gt 5 (2)
unde k este numărul de variabile iar n0 numărul de experiențe dispuse icircn centrul domeniului
experimental valoare sa fiind cuprinsă icircn intervalul 3 ndash 7
Structura programului experimental reprezentată de dispunerea punctelor generate de
valorile diferite acordate factorilor are drept ipoteză posibilă ajustarea suprafeţei de răspuns ce
corespunde unui indicator icircn raport cu variabilele independente prin intermediul unor expresii
matematice de tip polinomial de ordinul 2 de forma
Y = a0 + ndash
+
ndash (3)
unde a0 este coeficientul de regresie iar xi si xj sunt variabilele independente care influenţează
variabila răspuns F Valorile discrete ce se atribuie variabilelor sunt alese astfel icircncat printr-o
codificare simetrică faţă de centrul planului experimental să fie posibilă ortogonalizarea matricii
experimentale corespunzătoare si inducerea unei erori minime cu ocazia calculelor aferente
coeficienţilor prin metoda celor mai mici pătrate [121]
64
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Icircn lucrarea de față s-a optat pentru o codificare a valorilor discrete aferente variabilelor
independente conform datelor din tabelul 28
Tabelul 28 Codificarea variabilelor independente icircn cazul exprimării multifactoriale libere
Valoare codificată -1414 -1 0 -1 14141
Valoare reală
Valorile discrete se estimează din valorile ce definesc intervalul de variaţie al variabilei
independente xi conform următoarelor relaţiilor de atribuire
= rarr ndash2 (4)
= rarr +2 (5)
= ( + ) 2 rarr 0 (6)
= ( + ) rarr ndash1 (7)
= ( + ) rarr 1 (8)
Icircn contextul obiectivelor de cercetare s-a folosit un program factorial cu două variabile
(X1 X2) a cărei matrice experimentală este prezentată in Tabelul 29 [122]
Tabel 29 Matrice experimentală a programului factorial cu 2 variabile
Nr Crt X1cod X2 cod
1 ndash1 ndash1
2 1 ndash1
3 ndash1 1
4 1 1
5 ndash1414 0
6 1414 0
7 0 ndash1414
8 0 1414
9 0 0
10 0 0
11 0 0
12 0 0
13 0 0
65
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
24 Metode de caracterizare
241 Caracterizarea structurală a suporturilor
2411 Analiza prin Spectroscopia icircn infraroşu cu transformată Fourier (FTIR)
Spectroscopia FTIR se utilizează icircn vederea determinării grupărilor funcţionale ale probei
analizate Metoda se bazează pe vibraţia legăturilor chimice rezultată icircn urma absorbţiei energiei
luminoase infraroşii la frecvenţe caracteristice FTIR este o metodă uzuală icircn stabilirea structurii
şi identificarea unui compus chimic [123]
Pentru caracterizarea probelor solide există trei metode de pregătire a probelor pastilarea
icircn prezenţa unei sări suspensia icircn nujol utilizarea unui solvent Metoda de pregătire a probelor
este aleasă icircn funcţie de natura probei de analizat de exemplu icircn cazul probelor dificil de mojarat
se va utiliza un solvent pentru pregătirea probelor Acest solvent trebuie să aibă cacirct mai puţine
benzi şi intensitatea mică (exemplu sulfura de carbon şi tetraclorura de carbon)
Icircn ceea ce priveşte suspensia icircn nujol (ulei de parafină) cacircteva miligrame de probă se
amestecă cu 1-3 picături de ulei de parafină pacircnă la obţinerea unei suspensii omogene Icircn cazul
pastilării cel mai adesea se utilizează bromura de potasiu (KBr) Aproximativ 2-3 mg probă se
mojarează şi se amestecă cu 200 mg bromură de potasiu mojararea probei fiind un aspect
important de care trebuie să se ţină cont Pulberea obţinută se va introduce icircntr-o matriţă şi se va
comprima cu ajutorul unei prese hidraulice obţinacircndu-se un disc a cărui grosime este un alt
aspect important de care trebuie să se ţine cont o grosime de aproximativ 1 mm fiind
recomandată pentru rezultate cacirct mai bune [124]
Suporturile obţinute au fost pregătite pentru analiza FTIR prin metoda pastilării cu KBr
2412 Spectroscopia de raze x prin dispersie de energie (EDS)
Icircn general dispozitivele pentru microscopia electronică de baleiaj (SEM) sunt echipate cu
un spectroscop de raze X cu dispersie de energie (EDS) șisau un Spectroscop cu raze X cu
dispersie pe lungime de undă (WDS) utile pentru analiza elementală sau caracterizarea chimică
Atacirct EDS cacirct și WDS se bazează pe detectarea și investigarea razelor X caracteristice produse de
electronii primari Icircn timpul iradierii un electron din stratul intern al atomul țintă poate fi scos
66
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
din icircnvelișul electronic rezultacircnd o gaură de electroni Ulterior un electron din straturile
exterioare va umple gaura iar diferența de energie dintre electronii din icircnvelișul intern și cei din
icircnvelișul extern va fi emisă sub formă de rază X Deoarece energia acestei razei X este
caracteristică structurii atomice a elementului din care este emisă prin măsurarea cantității și a
energiei razele X emise dintr-un eșantion se poate determina compoziția elementală a probei
EDS este o metodă utilizată cel mai adesea pentru analiza de suprafața a unui material [125]
Pentru analiza probelor s-a utilizat un microscop electronic cu scanare SEM model VEGA
II LSH produs de firma TESCAN Cehia cuplat cu un detector EDX tip QUANTAX QX2
produs de firma BRUKERROENTEC Germania
2413 Difracţie cu raze X (XRD)
Spectrul XRD a fost icircnregistrat utilizacircnd aparatul XRD-6000 SHIMADZU (figura 22)
Difracţia cu raze X este o metodă simplă şi uşor de realizat pentru analiza fazei cristaline a
probelor oferind totodată şi date despre dimensiune şi orientarea cristalelor acesteia
Figura 22 Difractometru de raze X [126]
Principiul de bază al acestei metode implică cuantificarea precisă a lărgimii picurilor de
difracţie Plecacircnd de la acest principiu s-au dezvoltat mai multe tehnici pentru estimarea fazei
67
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
anorganice formate şi a dimensiunii cristalelor cele mai icircntacirclnite icircn literatură fiind ecuaţia lui
Scherrer analiza lui Hall-Williamson şi metoda Fourier a lui Warren-Averbach [127]
Pentru identificarea fazelor anorganice din suporturile obţinute au fost utilizate standardele
Centrului Internaţional pentru Difracţie (JCPDS)
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM)
Microscopia electronică de baleiaj se utilizează pentru a studia icircn detaliu suprafaţa
probelor Datele SEM sunt foarte importante deoarece oferă informaţii despre morfologia
probelor ce are o influenţă remarcabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale acestora (gradul de
retenţie a fluidelor biologic simulate proprietăţile mecanice adeziunea şi proliferarea celulară
etc) Icircn vederea studiului morfologiei suporturilor obţinute s-a utilizat microscopul TESCAN
VEGA SBH II prezentat icircn figura 23 Tensiunea de lucru a fost de 30 kV
Figura 23 Microscopul TESCAN VEGA SBH II [128]
Analiza constă icircn scanarea suprafaţei probelor de către un fascicul de electroni de energie
icircnaltă fascicul ce porneşte dintr-un filament de tungsten aflat icircn structura microscopului Icircnainte
68
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
de a fi analizate probele trebuie să se acoperite cu un film subţire de aur sau platină pentru un
contrast icircmbunăţit Pe măsură ce fasciculul de electroni trece de-a lungul probei interacţiunea
dintre probă şi fascicul are drept rezultat diferite tipuri de semnale de electroni emise la suprafaţa
probei sau icircn apropierea acesteia Semnalele sunt culese procesate şi redate pe un monitor ca şi
pixeli ceea ce duce la formarea unei imagini a suprafeţei probei imagine ce apare
tridimensională [129]
2422 Micro computer-tomografia (microCT)
Micro-computer tomografia (microCT) este o analiză de icircnaltă precizie a morfologiei
suporturilor oferind date precise şi informații despre dimensiunea şi distribuţia porilor icircntr-un
suport Tehnica este asemănătoare cu cea utilizată icircn sistemele de tomografie cu raze X folosite
icircn medicină doar că are o rezoluţie mult mai bună Această tehnică studiază interiorul suportului
icircn mare detaliu fără a fi utilizate substanţe toxice sau fără a fi necesară o pregătire specială a
probei Astfel după scanare proba intactă poate fi analizată prin alte tehnici
Icircn timpul scanării micro CT proba este icircmpărțită icircntr-o serie de secţiuni transversale 2D
care sunt iradiate din margine cu raze X La trecerea prin secţiune razele X sunt atenuate iar
razele X emergente avacircnd intensități reduse sunt capturate de un detector din componenţa micro-
computer tomografului Traictoriile razelor X sunt calculate și coeficienții de atenuare sunt
derivați O hartă bidimensională cu pixeli este creată utilizacircnd datele obţinute și fiecare pixel este
notat cu o valoare de prag care corespunde atenuării coeficientul măsurat la un punct similar icircn
interiorul specimen Deoarece coeficientul de atenuare este corelat cu densitatea materialului
hărțile 2D rezultate oferă o imagine a fazelor materialului analizat Calitatea imaginilor obţinute
este dependentă de rezoluţia de scanare care este cuprinsă icircntre 1 şi 50 microm precum şi de
software-ul utilizat [130]
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor
Testul de compresiune a fost realizat cu ajutorul dispozitivului Texture Analyzer
TAXTplus Dispozitivul poate fi utilizat pentru teste fundamentale sau empirice cum ar fi cele
legate de analiza texturii ştiinţa materialelor şi reologia solidelor semi-solidelor lichidelor
vacircscoase pudrelor sau materialelor granulate Numeroase proprietăţi pot fi analizate cu ajutorul
69
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
acestui dispozitiv dintre care enumerăm duritate fragilitatea aderența rezistența la tracțiune
extensibilitate Icircn funcţie de proprietate testată şi tipul probei dispozitivul are o serie de
platforme şi accesorii Pentru testul de compresiune la dispozitiv se va ataşa platforma pentru
greutate mare (figura 24)
Figura 24 Ansamblu pentru testul de compresiune Texture Analyzer TAXTplus [131]
Datele sunt achiziționate de software-ul Exponent icircn timpul procedurii şi prezentate sub
formă de grafice ce oferă detalii despre comportamentul fiecărei probe la forţe specificate
Dispozitivul este utilizat icircn numeroase domenii alimentar farmaceutic cosmetic medical etc
Accesoriile ce se ataşează de partea de sus a dispozitivului printr-un adaptor special pot
avea forme diverse Majoritatea au formă cilindrică și suprafața de acțiune plată cu diametrul
cuprins icircntre 2 mm şi 50 mm şi sunt realizate din diverse materiale oţel inoxidabil aluminiu
polioximetilenă (cunoscut şi sub denumirea de poliacetal şi comercializat sub marca Delrin) şi
poli (metacrilat de metil) sub denumirea comercială Perspex Atacirct diametrul variabil cacirct şi faptul
că sunt realizate din patru tipuri diferite de material fac posibilă utilizarea pentru numeroase teste
a unor probe diferite [132]
Pentru realizarea testului de compresiune a suporturilor obţinute s-a utilizat accesoriul
cilindric fabricat din aluminiu cu diametrul de 1 inch (337 mm) Suporturile au fost tăiate icircn
70
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
fragmente aproximativ egale iar după ce s-au determinat dimensiunile au fost supuse testului de
compresiune folosind următorii parametrii
viteza de pre-test ndash 01 mmsec
viteza de testare ndash 05 mmsec
distanța de icircntoarcere ndash 6 mm
Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru fiecare
fragment s-au calculat
A = L times l ( ) (9)
unde A este aria probei L este lungimea probei iar l este lățimea probei
F =
(N) (10)
unde Fmax este valoarea forţei măsurată de dispozitiv iar F este forţa de greutate
(11)
unde σ este rezistenţa la compresiune iar icircn final s-a calculat modulul de elasticitate icircntacirclnit
adesea icircn literatură sub denumirea de modulul lui Young (Legea lui Hooke)
(12)
unde ε este deformarea
244 Propritățile magnetice ale suporturilor
Susceptibilitatea magnetică este o măsură a proprietăţilor magnetice a unui material
Această mărime este o constantă adimensională ce indică gradul de magnetizare a unui material
ca răspuns la aplicarea unui cacircmp magentic
Icircn literatură se mai icircntacirclneşte şi termenul de magnetizare şi reprezintă raportul dintre
momentul magnetic şi densitatea de flux magentic Există trei mărimi ale susceptibilităţii
magnetice susceptibilitatea magnetică de masă susceptibilitatea magnetică molară şi
71
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
susceptibilitatea magnetică de volum Susceptibilitatea magnetică de volum se mai numeşte şi
permeabilitatea [133]
Susceptibilitatea magnetică a suporturilor notată cu χm a fost determinată utilizacircnd balanţa
de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto prezentată icircn figura 25
Figura 25 Balanţa de susceptibilitate magnetic Sherwood Scientific MSB Auto [134]
Dacă valoarea obţinută este pozitivă atunci materialul se numeşte paramagnetic iar dacă
este negativă se numeşte diamagnetic [135] Măsurarea susceptibilităţii magnetice s-a făcut la o
intensitatea a campului magnetic H= 45 kGauss (1 Gauss = 1 Oestred) Cunoscacircnd valorile
susceptibilităţii magnetice a unui material se poate calcula magnetizarea acestuia notată cu M
utilizacircnd formula
χm∙H (emug) (13)
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic
Acestă analiză este foarte importantă pentru că oferă informaţii despre cantitatea de fluide
reţinute de suporturi in vitro Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes
biologic s-a realizat cu ajutorul metodei volumetrice prin contactul suporturilor cu soluție PBS
și cu o soluție SBF icircn paralel
72
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Un fragment din suportul analizat a fost pus icircn contact cu PBSSBF pH=72 001 M icircntr-o
microcoloană QIAquickregSpin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o seringă de 1 ml prin
intermediul unei membrane de silicon (figura 26)
Figura 26 Ansamblu de dispozitive utilizat pentru determinarea gradului de retenţie maxim
Dispozitivele au fost incubate la 37degC pentru un interval de timp determinat după care s-a
stabilit volumul de soluţie reţinut de fiecare probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim
notat GRmax utilizacircnd formula
GRmax =
times100 () (14)
unde mf=mi+mabs mabs reprezintă masa de solvent absorbită după intervalul de timp stabilit
iar mi este masa iniţială a probei Densitatea PBS-ului respectiv a SBF-ului se consideră avacircnd
valoarea 1
246 Studii de degradare enzimatică in vitro
Suporturile pe bază de biopolimeri pentru ingineria tisulară şi regenerarea ţesutului osos
sunt degradate in vivo de către enzime icircn mod particular cum ar fi de exemplu hialuronidaza
pentru acidul hialuronic lizozimul pentru chitosan şi colagenaza pentru colagen şi gelatină
Pentru a studia şi cuantifica procesul de biodegradarea al suporturilor pentru ingineria tisulară icircn
literatură există două metode
73
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- metoda directă prin care se cacircntăreşte suport analizat icircnainte şi după ce este supus
procesului de degradare pentru un anumit interval de timp şi se face raportul dintre
greutatea iniţială şi greutatea finală
- metoda indirectă prin care se analizează compuşii rezultaţi icircn urma procesului de
degradare [136]
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd fie lizozim
(enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al chitosanului icircn organismul uman) fie un
complex de lizozim și colagenază (enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al
colagenului icircn organismul uman) Primul pas a fost imersarea unui fragment din fiecare probă
icircntr-un volum de PBS cu lizozim (1200 μgml) sau lizozim cu colagenază (100 μgml) aflată
icircntr-o membrană de dializă introdusă apoi icircn soluţie PBS fără enzime Probele au fost apoi
incubate la 37degC iar la anumite intervale de timp un volum din soluţia de PBS icircn care este
imersată membrana de dializă cu proba de analizat a fost extras şi analizat
Determinarea concentrației de chitosan degradat
Cs este predominat degradat de enzime care hidrolizează legăturile glucozamină ndash
glucoazamină glucozamină ndash N-acetil-glucozamină şi N-acetil-glucozamină ndash N-acetil-
glucozamină Lizozimul şi enzimele bacteriene din colon sunt principalele enzime implicate icircn
procesul de degradare al Cs-ului Lizozimul poate hidroliza atacirct chitina cacirct şi Cs viteza de
degradare fiind invers proporţională cu cristalinitatea polimerilor şi cu gradul de deacetilare al
Cs-ului Icircn corpul uman lizozimul se găseşte icircn diferite concentraţii icircn ser lacrimi salivă şi
urină unde are activitate antibacteriană importantă
Figura 27 Ruperea legăturii β-(1-4) glicozidică din structura chitosanului de către lizozim
74
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Chiar dacă lizozimul din corpul uman este diferit din punct de vedere structural de cel
utilizat icircn testele in vitro studiile au demonstrat că are activitate similară icircn procesul de
biodegradare al chitosanului Activitatea lizozimului creşte o dată cu creşterea gradului de
acetilare al chitosanului sugeracircnd că la locul de acţiune al lizozimului trebuie să existe un minim
de unităţi acetilate pentru a se obţine o rată de degradare iniţială maximă Lizozimul este prezent
icircn mod natural icircn serul uman salivă și alte fluide hidrolizacircnd legătura β-(1-4) glicozidică dintre
N-acetilglucozamină (NAGA) și reziduri ale acidului N-acetil-muramic ce se depun pe pereții
celulei bacteriei [137]
Icircn ceea ce priveşte analiza concentraţiei de chitosan degradat s-a determinat cantitatea de
produşi de biodegradare enzimatică prin evaluarea complexului format cu o soluţie de
K3Fe(CN)6 Soluţia de fericanură de potasiu s-a obţinut prin solubilizarea a 05 g K3Fe(CN)6 icircn
1000 ml de 05 M Na2CO3
1 ml extras din probele de analizat s-a incubat cu 4 ml de K3Fe(CN)6 icircntr-o eprubetă icircn apă
adusă la fierbere timp de 15 minute Soluţia din eprubete s-a răcit la temperatura camerei s-a
transferat icircntr-un flacon de 25 ml s-a adus la semn cu soluţie carbonat de sodiu 05 M după care
s-a citit absorbanţa soluţiei la spectrofotometru UV-VIS la o lungime de undă de 420 nm
Concentraţia de chitosan degradat s-a calculat utilizacircnd o curbă etalon (figura 28)
Figura 28 Curba etalon pentru determinarea concentraţie de chitosan degradat
y = -92591x + 02402 Rsup2 = 09964
0
005
01
015
02
025
0 0004 0008 0012 0016 002 0024
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația N-acetil-D-glucozamină ()
75
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Pentru realizarea curbei etalon s-a preparat o soluţie de N-acetil-D-glucozamină de
concentraţie 002 după care s-au realizat 10 diluţii şi s-a determinat absorbanţa fiecărei soluţii
utilizacircnd aceaşi metodă spectofotometrică menţionată anterior
Determinarea concentrației de colagen degradat
Ninhidrina este o pulbere albă si cristalină solubilă icircn apă si alcool Reacţiile ninhidrinei
utilizacircnd tehnici manuale sau automate sunt folosite pentru analiza şi caracterizarea amino-
acizilor peptidelor proteinelor precum şi a unui număr mare de compuşi icircn numeroase domenii
biomedical clinic alimentar microbiologic histochimic şi altele Icircn ceea ce priveşte
caracterizarea proteinelor icircn urma reacţiei ninhidrinei cu grupările amino rezultă cromoforul
ninhidrinei icircntalnit icircn literatură sub denumirea de violet Ruhemann ndash RP (figura 29) după
numele cerecetătorului care a descoperit reacţia icircn 1910 ce absoarbe radiaţia luminoasă la o
lungime de undă de 570 nm Icircn unele cazuri cantitatea de cromofor formată nu e
stoechiometrică de aceea pentru obţinerea unor rezultate reproductibile icircn reacţie se introduce
un agent reducător cum este de exemplu SnCl2 ce are ca rezultat creșterea intensităţii culorii
[138]
Figura 29 Reacţia dintre ninhidrină şi aminoacizi
Reactivul de ninhdrină s-a preparat prin solubilizarea a 0283times10-3
moli de SnCl2∙2H2O icircn
500mL soluţie tampon citrat-fosfat pH = 5 urmat de adăugarea a 500 mL de 2-metoxietanol care
conţine 20 g de ninhidrină 1 mL extras din probele de analizat probă s-a incubat cu 5 ml reactiv
ninhidrinăicircntr-o eprubetă icircn apă adusă la fierbere timp de 20 minute Soluţia s-a răcit imediat
latemperatura camerei apoi s-au adăugat 20 ml de soluţie amestec apă distilată2 - propanol
(11) Absorbanţa a fost măsurată la 570 nm in celulă de cuarţ cu spectrofotometrul UV-VIS
76
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Curba de calibrare pentru determinarea concentraţiei de grupări NH2 terminale din colagen s-a
realizat utilizacircnd glicină (figura 210)
Figura 210 Curba etalon pentru determinarea concentraţiei de colagen degradat
247 Teste de citotoxicitate in vitro
Un material realizat cu scopul de a fi utilizat icircn contact direct cu un ţestut viu trebuie să fie
obligatoriu citocompatibil Primele teste ce trebuie realizate pentru a analiza această
caracteristică sunt testele in vitro de biocompatibilitate pe culturi de celule Doar după testări
riguroase a unui material pe diverse culturi de celule se poate merge mai departe la realizarea de
teste de citotoxicitate in vivo
Icircntr-un laborator de culturi de celule conservarea celulelor primare sau a liniilor celulare
este o condiţie esenţială deoarece permite atacirct păstrarea calităţii materialului biologic cacirct şi o
organizare eficientă a activităţilor De aceea celulele primare şi liniile celulare sunt criostocate
fie la -86degC fie la -196degC icircn prezenţa de soluţii crioprotectoare evitacircndu-se astfel formarea
cristalelor de gheaţă
Celule care au fost utilizate pentru a testa in vitro biocompatibilitatea suporturilor obţinute
au fost păstrate la -86degC utilizacircndu-se drept agent crioprotectant dimetilsulfoxid ndash DMSO
Suporturile au fost testate pe mai multe linii celulare
- fibroblaste primare NHDF LONZA
- celule stem isolate din ţesut adipos de iepure
y = 16194x + 00799 Rsup2 = 09968
0
01
02
03
04
05
0 00005 0001 00015 0002 00025
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația de glicină ()
77
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- pre-osteoblaste din linia celulară MC-3T3
- osteoblaste din linia celulară MG-63 (celule tumorale)
Prima etapă pentru realizarea unui test de biocompatibilitatea a fost dezgheţarea celulelor
Icircn funcţie de numărul de material testate şi de tipul plăcilor de cultură utilizate s-au folosit fie
flacoane de cultură medii cu suprafaţa de cultură de 75 cm2 fie flacoane de cultură mari cu
suprafaţa de cultură de 175 cm2 Flacoanele s-au incubat(la 37degC 55 CO2 şi umiditate relative
96) cu un anumit volum de mediu de cultură complet (mediu de cultură care se suplimentează
cu 10BFS şi 1 PSN) icircn funcţie de dimensiunea flaconului cu aproxiamtiv 2 ore icircnainte de
dezgheţarea celulelor Criotubul s-a scos de la -86degC s-a imersat rapid icircn apă avacircnd temperatura
37degC şi s-a agitat uşor pacircnă la dezgheţare completă Celule din criotub s-au centrifugat cu mediu
de cultură complet pentru icircndepărtarea agentului crioprotectant după care supernatantul s-a
icircnlocuit cu mediu de cultură complet După ce s-au numărat celulele s-a adăugat icircn flaconul de
cultură un volum potrivit de suspensie celulară Mediul de cultură din flacon a fost icircnlocuit zilnic
cu mediu proaspăt pacircnă la formarea unui monostrat confluent
După formarea monostratului următoare etapă a fost popularea cu celule a plăcilor de
cultură pe care au fost testate suporturile Pentru a desprinde celulele din flacon şi a realiza o
suspensie celulară s-a utilizat o soluţie de tripsină 025 EDTA 002 Icircnainte de adăugarea
soluţie tripsinăEDTA s-a icircndepărtat mediului de cultură din flacon iar apoi suprafaţa de cultură
a fost spălată de cateva ori cu HBSS cu roşu fenol fără calciu pentru a fi icircndepărtate urmele de
mediu care ar icircngreuna acţiunea tripsinei După centrifugare cu mediu de cultură complet icircn
vederea icircndepărtării resturilor de tripsină s-a icircnlocuit supernatantul cu mediu complet după care
s-au numărat celulele cu ajutorul unei camere de numărat celule Neubauer s-a realizat o
suspensie de celule icircn mediu complet după care s-a distribuit icircn fiecare godeu al plăcilor de
cultură un anumit volum de suspensie conţinacircnd numărul de celule calculat icircn funcţie de tipul de
celule şi numărul de godeuri al plăcilor de cultură
Icircn funcţie de tipul materialului analizat (pudre nanoparticule emulsii suporturi compacte
suporturi poroase etc) se pot realiza teste de biocompatibilitate prin contact direct prin metoda
eluţiei (contact indirect) sau prin metoda difuziei Contactul direct presupune adăugarea propriu-
zisă a fragmentelor din materialul testat icircn godeurile plăcilor de cultură cultivate cu celule
contactul indirect presupune adăugarea unui extract din materialul analizat analizacircndu-se de cele
mai multe ori diverse concentraţii ale extractului iar metoda difuziei constă icircn acţiunea
78
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
compusului analizat asupra celulelor printr-un strat de gel de agaroză ce acoperă cultura de
celule Suporturile obţinute icircn studiul de faţă au fost analizate prin contact direct şi prin contact
indirect [139]
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare după ce suporturile au fost sterilizate
fragmente de suportextract de suport au fost puse pe plăcile de cultură conţinacircnd celule ce au
fost incubate icircn placi cu 24 ore icircnainte
Testele realizate pentru studiul biocompatibilităţii suporuturilor au fost testul MTT la 24
48 și 72 ore de contact şi testul de viabilitate celulară cu Calceina-AM
2471 Testul MTT
Pentru realizarea testului MTT ndash [bromură de (3-[45-dimetiltiazol-2-il]-25-difenil)
tetrazoliu] fragmentele de material au fost extrase şi mediul de cultură icircnlocuit cu soluție de
lucru MTT (MTT 5 icircn mediu de cultură fără BFS şi amestec de antibiotice) Testul MTT se
bazează pe capacitatea celulelor viabile cu metabolism activ să reducă MTT-ul icircn cristale de
formazan de culoare albastru-violet (figura 211) [140]
Figura 211 Structura bromurii de tetrazolium MTT şi a produsului redus formazan
Celulele cu soluția MTT au fost incubate la 37degC pentru un anumit interval de timp icircn
funcţie de tipul de celule după care s-a extras soluţia MTT cristalele de formazan formate fiind
solubilizate cu alcool izopropilic Absorbanța soluției de formazan rezultată (culoare albastru-
violet) a fost măsurată spectrofotometric la λ=570nm cu ajutorul unui cititor de plăci (Tecan
Sun-rise Plate Reader) Rezultatele citirii spectrofotometrice din godeurile experimentale au fost
79
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
raportate la godeurile de control icircn care nu au fost prezente fragmente de materialextract
Raportul calculat a constituit viabilitatea celulară (V)
V =
(15)
unde abs suport este absorbanța din godeul conţinacircnd fragment de suportextract iar abs control
este absorbanța controlului
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Calceina AM este un colorant care are capacitatea de a colora icircn verde doar celule viabile
icircn mod particular citoplasma acestora După ce pătrunde icircn celulă calceina AM substanţă
incoloră este hidrolizată de esteraza din citoplasmă icircntr-un produs verde fluorescent (figura
212) [139] Pentru realizarea testului mediul de cultură din godeuri a fost extras iar apoi celule
au fost spălate de două ori cu HBSS cu calciu fără roşu fenol Icircn final s-a adăugat soluţie de
calceină (1-2 microL calceină la 1 mL HBSS cu calciu fără roşu fenol) iar placa de cultura a fost
introdusă icircn incubator pentru 20 min După cele 20 min celulele s-au vizualizat la microscop
confocal cu fluorescenţă (Leica Germania) şi s-au preluat imagini Testul s-a realizat la intervale
de timp diferite icircn funcţie de metoda de contact şi tipul celulelor
Figura 212 Schema de legare a Caleinei ndash AM la celulele viabile
80
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
248 Teste de citotoxicitatea in vivo
Pentru a demonstra siguranța unui material medical după o caracterizare riguroasă acesta
trebuie testat din punct de vedere al citotoxicității in vivo
Testele de citotoxicitate in vivo au fost realizate conform recomandărilor ISO Standard
10993 la Facultate de Medicină Veterinară din Iaşi sub coordonarea domnului Prof Dr Mareş
Mihai Studiile au fost realizate conform Directivei UE 632010 și cu acordul comitetului de
etică din cadrul instituției
S-au utilizat șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie
de 28 plusmn 3 grame materialul biologic provenind din Biobaza INCDMI Cantacuzino București
- filiala Băneasa Animalele au fost ţinute icircn condiții zooigienice corespunzătoare speciei și
vacircrstei temperatură și umiditate constante regim de iluminare 12 orezi acces liber la hrană
(furaj combinat complex) manipularea animalelor fiind făcută cu blacircndețe fără a le produce
stres sau durere Cu 3 zile icircnainte de icircnceperea experimentului animalele au fost mutate icircn
laborator pentru a se acomoda cu mediul ambiant
Pentru implant materialele au fost secționate sub diverse forme pătrate sau discuri apoi
au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 4 ore Animalele au fost grupate
icircn loturi icircn funcţie de numărul de suporturi analizate fiecare lot cuprinzacircnd un anumit număr de
animale
Icircnainte de intervenția chirurgicală zona de implant a fost tunsă și aseptizată cu betadină
soluție cutanată 10 Implantarea fragmentelor de suporturi s-a realizat subcutanat icircn condiții
aseptice prin incizia sterilă a pielii din regiunea dorsală a șoarecilor Inducția anestezică (15-30
de secunde) s-a realizat cu isofluran 4 iar pentru a se asigura liniștea intraoperatorie pe
parcursul a 15 minute (timp necesar inciziei depunerii fragmentului de suport și suturii pielii) a
fost utilizată concentrația de 15
Durata experimentului a fost diferită icircn funcție de lotul de suporturi testate După
sacrificarea animalelor s-au efectuat examene histopatologice Icircn vederea realizării preparatelor
microscopice fragmentele de țesut (cu sau fară material) au fost fixate icircn soluţie de formaldehidă
10 timp de 7 zile şi apoi incluse icircn blocuri de parafină prin metoda rapidă de includere
Blocurile de parafină au fost secţionate apoi icircn secţiuni de 5 microm cu ajutorul microtomului de
laborator Secţiunile rezultate au fost etalate pe lame histologice cu ajutorul albuminei Mayer
81
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
colorate Tricromic Masson și examinate microscopic Preparatele au fost examinate la microscop
şi interpretate
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
La nivel mondial cancerul rămacircne a doua cea mai comună cauză de deces icircn ciuda
icircncercărilor avansate de prevenție diagnosticării icircn stadiu incipient și a protocoalelor de
tratament riguroase [141] Icircn ceea ce privește tumorile osoase acestea sunt diagnosticate icircn
special la pacienți adulți sau vacircrstnici excepție făcacircnd osteosarcomul tumoră icircntacirclnită
preponderent la pacienți cu vacircrste cuprinse icircntre 10 și 20 și destul de rar la vacircrstnici
Icircn unele cazuri tratamentul tumorilor osoase maligne are drept primă etapă rezecția
chirurgicală a tumorii iar icircn a doua etapă pacientul urmează ședințe de radioterapie Cele două
tehnici nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral chimioterapia precedacircndu-le de regulă
Plecacircnd de la această schemă de tratament s-au realizat studii privind potențiala aplicație a
suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircntr-o primă fază suporturile au fost expuse la raze X după care au fost caracterizate din
punct de vedere fizico-chimic și biologic icircn vederea analizei influenței radiațiilor asupra
proprietăților suporturilor
Iradierea suporturilor cu raze X s-a realizat cu ajutorul dispozitivului CT-Sim Siemens
Somatom Definition figura 213 Deoarce grosimea materialului iradiat a fost de aproximativ 12
mm acesta a fost fixat pe un suport de 5 mm a cărui dimensiune a fost inclusă icircn calculul
parametrilor de iradiere
Figura 213 Dispozitivul CT-Sim Siemens Somatom Definition (stacircnga)Simularea CT
(dreapta)
82
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi
Sistemele de eliberare controlată de medicamente sunt studiate pentru tratamentul
alternativ a unor tipuri diferite de cancer Cele mai studiate sisteme sunt cele pe bază de polimeri
ceramice sau compozite ale acetora Polimerii cei mai utilizați la realizarea de sisteme de
eliberare sunt polietilen glicolul (PEG) polietilen oxidul poli (caprolactona) chitosanul
alginatul alcoolul polivinilic polimetil metacrilatul celuloza etc Și unele proteine
preponderant colagenul sunt utilizate pentru realizarea de sisteme de eliberare controlată dar
instabilitate lor chimică și fizică ridică anumite probleme tehnice [141]
Doxorubicina a fost medicamentul chimioterapic avut icircn vedere pentru studiul de față
Pentru prepararea de suporturilor cu potențial de utilizare ca sistem de eliberare de medicament
icircntr-o suspensie coloidală de nanoparticule magnetice (1 ) obținute conform protocolului
descris anterior (subcaptiol 231) s-a solubilizat 0125 doxorubicină Nanoparticulele
icircncărcate cu medicament au fost folosite la prepararea de suporturi după protocolul descris icircn
subcapitolul 23
Eliberarea in vitro a medicamentului a fost studiată cu atenție Primul pas a fost imersarea
a 20 mg din fiecare probă icircn PBS pH = 72 001M icircntr-o memebrană de dializă care a fost
complet imersată icircntr-un alt volum de PBS Studiul de eliberare a fost efectuat la 37ordmC pe o
perioadă de 14 zile La anumite intervale de timp un volum de PBS icircn care a fost imersată
membrana de dializă a fost extras pentru analiza UV-Vis și icircnlocuit cu același volum de PBS
proaspăt Absorbanța fiecărui volum de PBS extras a fost analizată utilizacircnd spectrofotometrul
NanoDrop ND 1000 (Thermo Fisher) la 480 nm Pentru trasarea curbei etalon s-au preparat
soluţii de diferite concentraţii de medicament (pe domeniul 1 microg ndash 10 microg) icircn PBS
83
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe
bază de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic
gelatină) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și apatite hidroxiapatite sau alți fosfați de
calciu cu aplicații icircn ingineria tisualră a țesutului osos sunt studiate icircn detaliu de aproape două
decenii Imitarea matricei extracelulare a țesuturilor umane a devenit o provocare pentru
ingineria tisulară datorită complexității sale fizice chimice și biologice prin urmare este
esențială alegerea biopolimerilor care să satisfacă criterii de compatibilitate chimică
biocompabibiltate biodegradabilitate controlată Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul
biologic și degradați metabolic Chitosanul colagenul gelatina alginatul condroitin sulfatul și
acidul hialuronic sunt printre cei mai studiați biopolimeri datorită argumentelor menționate
anterior și a similarității lor cu componentele matricei extracelulare [142-144]
Chitosanul ndash Cs un biopolimeri foarte versatil este unul din cei mai studiaţi pentru
ingineria tisulară a țesutului osos datorită proprietăţilor sale remarcabile biocompatibilitate
biodegradabilitate proprietăţi antibacteriene hemostatice şi antitumorale [55 56 145-148] De
asemenea susţine in vitro adeziunea şi proliferarea celulară a osteoblastelor precum şi formarea
de matrice osoasă mineralizat [149] Icircn ceea ce priveşte comportamentul in vivo un număr
semnificativ de studii au demonstrat faptul că suporturile pe bază de chitosan susţin
osteoconductivitatea icircn defecte osoase obţinute chirurgical [150]
Gelatina ndash G proteină derivată din colagen este un biopolimer degradabil cu
biocompatibilitate excelentă adesea utilizată icircn domeniile biomedical şi farmaceutic Icircn
combinaţie cu alţi biopolimeri adesea cu chitosanul gelatina contribuie la creşterea adeziunii
celulare [151] [152]
Acidul hialuronic ndash Hya susţine regenerarea tisulară la locul defectelor osoase prin
stimularea formării de calus [153] De asemenea rezultatele unor studii in vitro și in vivo au
sugerat o legătură icircntre creștere sintezei de acid hialuronic după tratatamentul cu parathormon și
resorbția osoasă ulterioară ceea ce ar putea indica o posibilă relație icircntre sinteza biopolimerului
și creșterea activității osteoclastelor [154]
Studiile icircn domeniu au evidenţiat faptul că o concentraţie scăzută de albumină serică
bovină ndash Bsa poate susţine mineralizarea ţesutului osos prin stimularea creşterii cristalelor de
84
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
fosfaţi de calciu [155] [156] icircn schimb o concentraţie mare de albumină poate chiar inhiba
creşterea lor [157]
Avacircnd icircn vedere proprietăţile menţionate mai sus ale celor patru biopolimeri (chitosan
acid hialuronic gelatină şi albumină) s-a emis ipoteza că prin realizarea unor combinații ale
acestora cu fosfați de calciu și particule magnetice se pot obține suporturi magnetice cu
performanțe crescute icircn regnerarea tisulară osoasă (Figura 31)
Figura 31 Suporturi pe bază de biopolimeri fosfați de calciu și nanoparticule magentice
Fosfații de calciu componenta fazei anorganice a țesutului osos uman stimulează
osteoconductivitatea și osteoinductivitatea Importanța utilizării nanoparticulelor magnetice icircn
suporturi compozite pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost detaliată icircn capitolul 1
Alegerea unei concentrații de nanoparticule adecvată este o provocare o concentrație prea mică
poate avea riscul de a nu conferi proprietăți magnetice suportului icircn care sunt incluse iar o
concentrație prea mare poate duce la un eventual caracter citotoxic al suportului Studiile icircn
85
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
domeniu prezintă prepararea de suporturi magnetice ce au icircncoporate concentrații diferite de
particule 05 1 2 3 7 5 sau 10 [9091 92] etc
Pentru a putea concluziona care ar fi concentrația optimă de particule introdusă icircn sinteză
s-au selectat trei concentraţii diferite de particule magentice 1 3 și 5 astfel icircncacirct să se
evite efectele toxice menținacircndu-le pe cele magnetice icircn domeniile terapeutice
31 Obţinerea suporturilor
Suporturile s-au obţinut printr-o metodă biomimetică de co-precipitare a fosfaţilor de
calciu din precursorii săi icircn prezențicirc de biopolimeri și particule magnetice Astfel soluții de
Ca(NO₃)₂∙4H2O(40 icircn apă distilată) şi NaH2PO4middotH2O (25 icircn apă distilată) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri (Cs (1 icircn soluție 15 HCl) Hya (2 in apă distilată)
Bsa (2 in apă distilată) G (2 in apă distilată)) Soluţia de Cs (1) a fost obţinută prin
dizolvare de Cs icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Separat s-au adăugat soluții de Hya (2)
Bsa (2) și G (2) (icircn apă distilată) astfel icircncacirct concentraţia să fie 10 faţă de cantitatea totală
de chitosan introdusă icircn sinteză Icircn fiecare amestec de biopolimercombinaţii de biopolimeri şi
precursori de fosfaţi de calciu s-au integrat concentraţii diferite de particule magnetice 1 3
şi 5 raportat faţă de cantitatea de substanţă uscată introdusă icircn procesul de sinteză pH-ul
amestecului final a fost ajustat la 72-74 prin adaos de soluţie de amoniac NH4OH (25 )
Raportul CaP a fost menținut la 165 icircn toate suporturile valoare comparabilă cu cea din ţesutul
osos uman [158]
Fiecare amestec compozit a fost spălat de 3 ori cu apă distilată separat prin centrifugare
(5000 rpm 10 minute) iar ultimul pas a constat icircn liofilizarea amestecurilor timp de 24 h
Cele patru tipuri diferite de suporturi au fost codificate icircn funcţie de compoziţia lor după
cum se observă icircn tabelul 31
Tabel 31 Compoziţia şi codificarea suporturilor
Denumirea
Suportului
ChitosanAlt biopolimer Concentraţia de
MNPs
Cs 1
Cs
1
Cs 3 3
Cs 5 5
Cs-Hya 1 Cs-Hya 1
86
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs-Hya 3 3
Cs-Hya 5 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa
1
Cs-Bsa 3 3
Cs-Bsa 5 5
Cs-G 1
Cs-G
1
Cs-G 3 3
Cs-G 5 5
Suporturile biomimetice pe bază de diferite amestecuri de chitosan și biopolimeri
(albumină acid hialuronic gelatină) cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei (spectroscopia IR cu
transformată Fourier ndash FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de energie ndash EDS) difracţie
cu raze X (XRD) și morfologic (microscopie electronică de baleiaj ndash SEM) De asemenea s-a
urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au
analizat proprietăţile magnetice Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi
printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
32 Rezultate și discuții
321 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR picuri caracteristice
biopolimerilor din compoziţie fosfaţilor de calciu şi particulelor magnetice fiind identificate pe
spectrele FTIR (figura 32)
Icircn ceea ce priveşte spectrul FTIR al suportului Cs 3 s-au observat benzile caracteristice
Cs-ului după cum urmează gruparea -OH la 3430 cm-1
gruparea ndashCH2 la 2923 cmminus1
amida I la
1655 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii CndashN la 1322 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării
CndashO la 1029 cm-1
[159] Pentru acelaşi suport s-au mai putut observa picuri specifice grupării
fosfat PO43-
icircn regiunea 600 cm-1
[99] şi grupării FendashO din particulele magnetice la 560 cm
-1
[160]
87
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Icircn cazul suportului Cs-Bsa 3 s-a observat o creştere semnificativă a intensităţii picului
1657 cmminus1
ce corespunde amidei I drept rezultat a vibraţiei de icircntindere a grupării C=O din
legătura peptidică Picul de la numărul de undă 1546 cm-1
corespunde amidei II iar picul de la
1240 cm-1
amidei III din componenta proteică [161]
Figura 32 Spectrele FTIR ale suporturilor
Pe spectrul FTIR pentru suportul Cs-Hya 3 s-au observat următoarele picuri picul pentru
vibraţia de icircntindere a grupăriindashOH la 3422 cm-1
picul pentru gruparea -CH2 la 2923 cm-1
picul
pentru amida primară I la 1654 cm-1
picul pentru COO- la 1420 cm
-1 şi picul pentru C-O la 1029
cm-1
[162]
322 Compoziția suporturilor
Icircn figura 33 este redată difractograma XRD pentru suporturile obţinute datele XRD
oferind informaţii despre faza anorganică şi despre cristalinitatea acestora
88
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
S-au observat următoarele picuri caracteristice 303ordm 356ordm 535ordm şi 574ordm ce pot fi
associate planelor (220) (311) (422) şi (511) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF
No 65-3107) Picuri specifice fosfaţilor de calciu de la unghiurile 23ordm 26ordm 28ordm 32ordm 335ordm 40ordm
48ordm şi 50ordm sunt corelate cu planurile (121) (002) (210) (112) (300) (310) (203) (213) şi
confirmă formarea următoarelor tipuri de fosfaţi de claciu Ca(H2PO4)22H2OmCaHPO4
Ca4(HPO4)3 25 H2O respectiv Ca3H2(P2O7)24H2O [47]
De asemenea un aspect foarte important care a fost observat a fost acela că principalul tip
de fosfat de calciu format icircn structura suporturilor compozite este hidroxiapatita
(Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul de calciu cu cele mai bune proprietăţi pentru formarea de ţesut osos
Figura 33 Spectrul XRD pentru suporturile obţinute
Compoziţia chimică a suporturilor a fost studiată cu ajutorul analizei EDX rezultatele fiind
redate icircn figura 34 Principalele tipuri de fosfați de calciu identificati pe spectrele XRD și EDX
sunt prezentați icircn tabelul 32
Tabel 32 Diferite forme de CP prezente icircn compozitele Cs-CP conform datelor XRD și EDX
Forme de fosfați de
calciu Formulă chimică Raport CaP
MCPM Ca(H2PO4)2middotH2O 05
Fosfat monocalcic
anhidru Ca(H2PO4)2 05
89
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Fosfat dicalcic
anhidru CaHPO4 100
Hidroxiapatită Ca10(PO4)6(OH)2 167
Fosfat tricalcic Ca3(PO4)2 15
Figura 34 Spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3
Pe spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3 s-au observat semnale intense icircn
regiunea elementelor Ca P O C Fe ceea ce confirmă compoziţia suporturilor fosfaţi de calciu
biopolimeri particule magnetice De asemenea din datele EDX obţinute s-a calculat raportul
molar al fazei minerale dintre calciu şi fosfor rezultatele indicacircnd formarea de diferite tipuri de
fosfaţi de calciu icircn structura suporturilor evidenţiindu-se fosfatul tricalcic (CaP = 152) icircn cazul
suportului Cs-Bsa 3 şi hidroxiapatita icircn cazul suportului Cs-G 3 [163]
90
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
323 Morfologia suporturilor
Icircn figura 35 sunt prezentate datele SEM obținute pentru suporturile Cs 3 Cs-Hya 3
Cs-Bsa 3 și Cs-G 3 la diferite grade de mărire Morfologia a fost studiată icircn secţiunea
suporturilor imaginile evidenţiind o porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea
fosfaţilor de calciu pe structura polimerică Particulele magnetice sunt complet integrate icircn
structura compozită
Figura 35 Morfologia suporturilor la două ordine diferite de mărire
Suporturile sintetizate pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară a ţesutului osos trebuie să aibă o
structură poroasă specifică şi o dimensiune a porilor adecvată aplicaţiei vizate Icircn primul racircnd
porii suportului trebuie să fie interconectaţi pentru a promova adeziunea şi creşterea
osteoblastelor migrarea nutrienţilor şi vascularizarea precum şi infiltrarea icircn matricea biologică
[164] [165] Icircn ceea ce priveşte dimensiune porilor icircn literatură există date contradictorii acest
aspect fiind explicat de complexitatea procesului de regenerare osoasă in vivo Astfel unele
studii recomandă utilizarea suporturilor cu dimensiunea a porilor cuprinsă icircntr-un interval foarte
larg de la 20 microm pacircnă la 1500 microm [166] [167] alte studii recomandă o dimensiune a porilor
icircntre 150 şi 600 microm sau icircntre 400 şi 1500 microm [168]
91
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Dimensiunile porilor suporturilor sintetizate (tabel 33) au fost calculate din imaginile
SEM prin analiza cantitativă a parametrilor imaginilor utilizacircnd funcția threshold a programului
ImageJ
Pentru fiecare imagine SEM măsurătorile au fost repetate de 10 ori la final fiind calculate
dimensiunea maximă a porilor dimensiunea medie a porilor dimensiunea minimă a porilor și
deviația standard S-a observat că dimensiunile maxime ale porilor au fost icircnregistrate pentru
suportul Cs-Hya 3 iar dimensiunile minime pentru suportul Cs-Bsa 3 Cel mai mic interval
dintre minimul și maximul dimensiunilor unui suport a fost calculat pentru suportul Cs-Bsa 3
ceea ce indică că acest suport are cea mai uniformă distribuție a porilor
Tabel 33 Dimensiunea porilor (microm)
Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
Deviația
standard 99458plusmn18938 111525plusmn16967 75084plusmn9075 92383plusmn13549
Dimensiunea
minimă 398541 451762 319411 456391
Dimensiunea
maximă 1946331 213656 1121936 154929
Dimensiunea
medie 952598 988953 672699 8149395
324 Proprietăţi magnetice
Deoarece obiectivul tezei de faţă implică utilizarea de particule magnetice ce vor fi
funcţionalizate cu medicamente rolul particulelor fiind de transportori a principiilor active ce
vor fi eliberate controlat studiul proprietăţilor magnetice ale suporturilor este esenţială Pentru a
stabili concentraţia optimă de particule introduse icircn sinteză icircn acest prim studiu s-au analizat trei
concentraţii diferite Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 34
Tabel 34 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Susceptibilitatea
magnetică de
masă
Magnetizarea
(emug)
Cs 1 1 0016middot e-4
132
Cs 3 3 009middot e-4
742
92
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs 5 5 0123middot e-4
1014
Cs-Hya 1 1 0003middot e-4
025
Cs-Hya 3 3 minus minus
Cs-Hya 5 5 0152middot e-4
1253
Cs-Bsa 1 1 0027middot e-4
226
Cs-Bsa 3 3 0074middot e-4
610
Cs-Bsa 5 5 0099middot e-4
816
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de masă a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 025 şi 1253 emug au fost mai mici decacirct cele ale
particulelor magnetice (4365 emug) [160] ce nu au fost icircncorporate icircn suport sau icircn oricare altă
structură compozită complexă
Icircntr-un studiu publicat de Heidari şi colaboratorii [99] s-au obţinut şi caracterizat nano-
suporturi magnetice pe bază de chitosan şi hidroxiapatită cu o valoare a magnetizării de 304
emug măsurată la o intensitate a cacircmpului magnetic H = 5189 kOe la temperatura camerei Un
alt studiu publicat de Bock şi colaboratorii [90] prezintă sinteza şi caracterizarea de suporturi pe
bază de hidroxiapatită şi colagen cu incluziune de tipuri diferite de fero-fluide magnetice La o
intensitate a cacircmpului magnetic de 10 kOe s-au obţinut valori ale magnetizării cuprinse icircntre 12
şi 15 emug pentru toate tipurile de suporturi sintetizate S-a observat că pentru o concentrație de
1 particule magnetice valorile obținute pentru magnetizare sunt prea mici comparabile cu cele
din literatură pentru concentrația de 5 fiind obținute valorile cele mai apropiate Comparacircnd
valorile obţinute cu datele de literatură s-a putut afirma că suporturile obţinute sunt
superparamagentice
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Interacţiunea suporturilor cu fluidele de interes biologic este un aspect important icircn ceea ce
priveşte potenţialele aplicaţii ale acestora icircn domeniul ingineriei tisulare a osului Pentru
suporturile obținute s-a studiat interacțiunea suporturilor cu două fluide soluție tampon fosfat-
PBS și fluid biologic simulat - SBF
93
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de aproximativ 5 mg din fiecare suport a fost pus icircn contact cu o soluţie PBSSBF pH = 72
001M icircntr-o microcoloană QIAquickreg
Spin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o
seringă de 1 ml prin intermediul unei membrane de silicon Dispozitivele au fost incubate la
37ordmC pentru un interval de 48 ore după care s-a stabilit volumul de PBSSBF reţinut de fiecare
probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din capitolul 2
Rezultatele obţinute cu privire la acest studiu sunt redate icircn tabelul 35
Tabel 35 Gradul de retenţie PBS și SBF () al suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Gradul de
retenţie PBS
()
Grad de retenție
SBF
()
Cs 1 1 704plusmn22 680plusmn35
Cs 3 3 645plusmn12 632plusmn14
Cs 5 5 676plusmn21 530plusmn25
Cs-Hya 1 1 784plusmn24 667plusmn31
Cs-Hya 3 3 714plusmn45 630plusmn29
Cs-Hya 5 5 490plusmn22 475plusmn17
Cs-Bsa 1 1 700plusmn39 654plusmn41
Cs-Bsa 3 3 454plusmn61 567plusmn16
Cs-Bsa 5 5 806plusmn78 515plusmn20
Cs-G 1 1 465plusmn35 421plusmn34
Cs-G 3 3 805plusmn42 625plusmn09
Cs-G 5 5 755plusmn27 722plusmn15
Pentru toate suporturile s-au obţinut valori mari ale gradului de retenţie PBS () acestea
fiind cuprinse icircntre 400 şi 800 Aceste valori au fost corelate pe de o parte cu structura
poroasă tridimensională a suporturilor iar pe de altă parte cu proprietăţile hidrofile ale
biopolimerilor atribuite grupărilor lor funcţionale
Icircn cazul suporturilor icircn care matricea polimerică este reprezentată doar de chitosan s-a
observat o variaţie foarte mică a valorile gradului de retenţie cea mai mare valoare fiind
măsurată la suporturile cu o concentraţie minimă de particule magnetice Icircn schimb icircn cazul
94
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
suporturilor Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G s-a observat o influenţă semnificativă a particule magnetice
asupra gradului de retenție Astfel icircn cazul suporturilor care au Hya icircn compoziţie s-a observat o
descreştere a gradului de retenţie pe măsură ce concentraţia de particule magnetice creşte pe
cacircnd pentru suporturile ce conţin albumină s-a observat o valoare maximă a gradului de retenţie
pentru suportul cu cea mai mare concentraţie de particule magnetice Suporturile Cs-G au
valorile gradului de retenţie apropiate pentru concentraţiile de particule magnetice de 3
respectiv 5 valoarea minimă fiind icircn cazul suportului Cs-G 1
Icircn ceea ce privește interacțiunea suporturilor cu soluția SBF prezența ionilor pozitivi (Na+
K+ Ca
2+ Mg
2+) și a ionilor negativi (HPO4
2- Cl
- HCO3
2- SO4
2- ) precum și abilitatea acestora
de a interacționa cu componentele suporturilor diminuează retenția de fază apoasă a suporturilor
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea suporturilor a fost studiată in vitro icircn prezenţa lizozimului pentru o perioadă
de 16 zile rezultatele studiului fiind prezentate icircn figura 36 A fost utilizată o concentraţie de
lizozim cu valoare apropiată de concentraţia lizozimului icircn serul uman [169]
Figura 36 Degradarea suporturilor
Analizacircnd rezultatele (tabel 36) s-a observat că procesul de degradare are practic două
etape Icircn prima etapă ce corespunde primelor 8 zile a avut loc o degradare mai accentuată a
suporturilor pe cacircnd icircn a doua etapă a urmat o icircncetinire a procesului de degradare Acest proces
de degradare icircn două etape a fost prezentat şi icircn alte studii şi poate fi explicat de faptul că
02
0
4
06
0
8
Cs 1 Cs 3 Cs 5 Cs-Hya 1
Cs-Hya 3
Cs-Hya 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa 3
Cs-Bsa 5
Cs-G 1
Cs-G 3
Cs-G 5
Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat
m
moli
L
2 zile 8 zile 16 zile
95
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
lizozimul conține un loc de legare hexameric iar secvențele hexazaharidice conținacircnd 3-4 sau
mai multe unități acetilate au o puternică influenţă asupra vitezei inițiale de degradare a
chitosanului După o pierdere mare de masă inițială viteza de degradare a suporturilor a scăzut
considerabil ca rezultat al pierderii secvențelor de hexazaharidă [170]
Tabel 36 Degradarea in vitro a suporturilor icircn prezenţă de lizozim
Denumirea
suportului
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
2 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
8 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
16 zile (mmoliL)
Cs 1 04045plusmn00014 06800plusmn00042 07452plusmn00028
Cs 3 04081plusmn00007 06292plusmn00028 06727plusmn00057
Cs 5 03791plusmn00064 06510plusmn00014 07343plusmn00021
Cs-Hya 1 03574plusmn00049 05132plusmn00028 06075plusmn00014
Cs-Hya 3 03827plusmn00028 07017plusmn00028 07379plusmn00071
Cs-Hya 5 03755plusmn00064 07742plusmn00028 07814plusmn00014
Cs-Bsa 1 03175plusmn00042 05640plusmn00085 07162plusmn00028
Cs-Bsa 3 03538plusmn00028 06510plusmn00035 06655plusmn00014
Cs-Bsa 5 03538plusmn00028 06582plusmn00028 06655plusmn00014
Cs-G 1 04226plusmn00049 07669plusmn00014 07814plusmn00014
Cs-G 3 04154plusmn00007 07887plusmn00042 08032plusmn00014
Cs-G 5 05024plusmn00035 07887plusmn00014 08249plusmn00042
După cum se poate observa icircn tabelul 36 pentru toate cele patru tipuri diferite de suporturi
Cs Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G concentraţia de particule magntice adăugate nu influenţează
semnificativ degradarea acestora Pentru toate cele trei intervale de timp la care s-a analizat
concentraţia de Cs degradat cele mai mari valori au fost obţinute pentru matricile Cs-G 5
96
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
3271 Testul MTT
Pentru evaluarea citotoxicității in vitro pe culturi de celule s-a utilizat metoda contactului
indirect realizacircndu-se un extract din suporturile obținute care icircn prealabil au fost sterilizate 10
mg din suporturile Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3 au fost introduse icircntr-o membrană
de dializă conținacircnd 4 ml alcool etilic 70 membrana de dializă fiind introdusă la racircndul ei icircntr-
un flacon steril conținacircnd 25 ml alcool etilic 70 După 30 minute alcool din flacon a fost
evacuat membrana de dializă fiind lasată icircn hotă pentru evaporarea alcoolui după care a fost
spălată icircn repetate racircnduri prin imersare icircn 25 ml PBS Fiecare probă din membrană de dializă a
fost imersată icircn 4 ml mediu de cultură complet și lasată la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului După cele 24 ore extractul a fost filtrat printr-un filtru de 70 microm
după care s-a măsurat volumul rezultat şi s-au adăugat 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost adus icircn contact cu două linii celulare diferite preosteoblaste MC3T3
(figura 37) și fibroblaste din derm uman (figura 38) icircn placi de 96 godeuri fiecare godeu
conținacircnd 3000 celule Cele două tipuri de celule au fost incubate pentru 24 ore icircn mediu de
cultură DMEM conținacircnd 10 BFS și 1 PSN Mediul complet a fost icircnlocuit complet după
cele 24 ore cu 150 μL extract Testul MTT s-a realizat la 24 48 și 72 ore calculacircndu-se
viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (15) din capitolul 2
Figura 37 Viabilitatea celulară a preosteoblatelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
97
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 38 Viabilitatea celulară a fibroblastelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
După 24 ore viabilitatea preosteoblastelor a fost cuprinsă icircntre 91 (Cs 3) şi 95 (Cs-
Bsa 3) pe cacircnd viabilitatea fibroblastelor a fost icircn jur de 96 pentru toate cele patru suporturi
analizate diferenţa foarte mică de procente fiind explicată de sensibilitatea crescută a
preosteobastelor Pentru ambele linii celulare s-a observat o uşoară scădere icircn timp a viabilităţii
celulare cea mai mică valoare calculată 88 fiind pentru suportul Cs-Hya 3 după 72 de ore
de contact a extractului cu fibroblastele
Datele obţinute icircn urma testului MTT au indicat faptul că suporturile nu au eliberat
compuşi citotoxici icircnglobaţi icircn structura suporturilor icircn momentul sintezei sau neicircndepărtaţi
care să influenţeze negativ ataşarea şi proliferarea celulară
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată biocompatibilitatea suporturilor şi lipsa unor efecte adverse a
acestora asupra celulelor s-a realizat un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM rezultatele
testului fiind redate icircn figura 39 Acelaşi extract utilizat la testul MTT a fost incubat cu
fibroblaste pentru 24 respectiv 96 ore
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
98
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 39 Viabilitatea celulară icircn urma testului cu Calceină-AM
Comparacircnd imaginile reprezentacircnd celulele incubate cu extractul suporturilor Cs-Bsa 3
respectiv Cs-G 3 cu imaginile reprezentacircnd celule care au fost incubate fără extract s-a
observat că nu există diferenţe de densitate celulară la niciunul din cei doi timpi de contact ceea
ce indică lipsa efectelor adverse a suporturilor asupra fibroblastelor
Atacirct rezultatele obţinute icircn urma testului MTT cacirct şi rezultatele obţinute icircn urma testului
cu Calceină-AM au evidenţiat un comportament bun al suporturilor la contactul cu cele două linii
celulare (fibroblaste şi preosteoblaste) ceea ce a condus la concluzia că suporturilor sunt
biocompatibile in vitro
99
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
33 Concluzii
Icircn capitolul de față s-au obținut și caracterizat suporturi compozite pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de concentrații diferite de particule magentice
Chitosanul unul din biopolimeri cei mai utilizați icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost
combinat cu acid hialuronic albumină serică bovină sau gelatină
Analizacircnd structura chimică a suporturilor s-a observat icircn spectrele FTIR
prezența picurilor caracteristice tuturor componentelor introduse icircn sinteza Diferite tipuri de
fosfați de calciu au fost identificate icircn faza cristalină a suporturilor cel mai impotant dintre
aceștia fiind hidroxiapatita identificată icircn suportul Cs-G 3
Morfologia a fost studiată icircn secţiunea suporturilor imaginile evidenţiind o
porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea fosfaţilor de calciu pe structura polimerică
Particulele magnetice sunt complet integrate icircn structura compozită Dimensiunea minimă a
porilor a fost icircn jur de 300 microm iar dimensiunea maximă icircn jur de 2000 microm
Comparacircnd valorile obţinute pentru magnetizarea suporturilor cu datele de
literatură concentrația de 5 particule magnetice s-a dovedit a fi cea mai apropiată de datele
regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective De asemenea se poate afirma că suporturile sunt
superparamagnetice
Retenția fluidelor biologice simulate este influențată de morfologia suporturilor și
proprietățile hidrofile ale suporturilor iar viteza de degradare enzimatică in vitro este corelată cu
conținutul de fază polimerică
Testele de citotoxicitate in vitro indică faptul că suporturile obținute nu eliberează
substanţe citotoxice care să influenţeze negativ proliferarea celulară
100
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub
formă uscată
Icircn ingineria tisulară a ţesutului osos polizaharidele (chitosan acid hialuronic) şi proteinele
(colagengelatină fibroină din mătase albumină) se numără printre cele mai utilizate
biomateriale pentru sinteza de suporturi [37]
Chitosanul ndash Cs este unul din cei mai utilizaţi biopolimeri icircn ingineria tisulară datorită
proprietăţilor sale remarcabile Numeroase studii prezintă rezultate foarte bune ale acestui
biopolimer icircn aplicaţii vizacircnd regenerarea şi repararea ososă [56 148 151 171] Colagenul ndash
Col este un alt biopolimer adesea utilizat icircn ingineria tisulară proprietăţile ce icircl recomandă
pentru ingineria tisulară a ţesutului osos icircn mod particular fiind osteoconductivitatea şi
biocompatibilitatea Asocierea cu fosfaţi de calciu ajută la o integrare foarte bună a unui suport
pe bază de colagen şi fosfaţi de calciu icircn ţesutul osos icircn studii in vivo [90] Acidul hialuronic ndash
Hya un alt biopolimer cu proprietăţi foarte bune ce susţine regenerarea tisulară la locul defectelor
osoase contribuind la formarea de calus Icircn aplicaţii pentru regenerarea osoasă acidul hialuronic
este combinat cu fosfaţi de calciu şi cu alţi biopolimeri [142 172]
Plecacircnd de la componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă
anorganică 20-30 componentă organică și apă) cei trei biopolimeri mai sus menţionaţi au fost
amestecaţi cu fosfaţi de calciu din precursori Icircn sinteză a fost integrată şi o concentraţie de 5
particule magneticendash MNPs concentraţie stabilită icircn urma rezultatelor obţinute icircn capitolul 3 icircn
care au fost studiate trei concentraţii diferite de MNPs
41 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute printr-un procedeu biomimetic prin precipitarea de fosfați de
calciu (CP) din precursorii CaCl2 şi NaH2PO4 icircntr-o amestec de biopolimeri CsndashColndashHya
(chitosan ndash colagen ndash acid hialuronic) icircn prezenţă de soluţie apoasă de amoniacSoluţia de Cs
(1) a fost obţinută prin dizolvare de Cs purificat icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Soluția
de Col (tip I + III) a fost obţinută de la LohmannampRauscher GmbH Germania Concentraţia de
Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză Icircnainte de
procesul de precipitare icircn soluția de polimeri CsndashColndashHya s-au adăugat 5 particule magnetice
101
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sub formă uscată (5 față de cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza
suporturilor) Soluţiile apoase de CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost adăugate peste
amestecul de soluţii de biopolimeri şi particule magnetice şi omogenizate prin agitarea mecanică
după care pH-ul soluţiei a fost adus la valoarea de 72-74 cu ajutorul soluţiei de NH4OH (25)
S-a urmărit menţinerea pH la valoare menţionată pentru 24 orePentru eliminarea compuşilor
nereacţionaţi amestecul final a fost spălat cu apă distilată prin centrifugare la 5000 rotații pe
minut timp de 10 minute etapă repetată de trei ori Ultima etapă icircn obţinerea suporturilor a fost
liofilizarea la temperatura de -55ordmC timp de 24 h Etapele procesului de obţinere sunt prezentate
icircn figura 41
Figura 41 Obţinerea suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat un program
experimental cu două variabile (concentrația de Col - raporată la concentrația de Cs
respectiv raportul CaP) Icircn tabelul 41 este prezentată codificarea variabilelor independente ale
programului experimental iar icircn tabelul 42 domeniile de variaţie precum şi codificarea
suporturilor (P1 - P13)
102
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Tabel 41 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 42 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Cod suport X1 X2 Col Cs CaP
P1 -1 -1 35 65 16
P2 1 -1 65 35 16
P3 -1 1 35 65 17
P4 1 1 65 35 17
P5 -1141 0 2879 7121 165
P6 1141 0 7121 2879 165
P7 0 -1141 50 50 1579
P8 0 1141 50 50 1721
P9 0 0 50 50 165
P10 0 0 50 50 165
P11 0 0 50 50 165
P12 0 0 50 50 165
P13 0 0 50 50 165
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii chimice utilizacircnd
analiza FTIR iar din punct de vedere al morfologiei prin SEM De asemenea s-au analizat
comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora proprietăţile
mecanice și proprietăţile magnetice al suporturilor Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată
printr-un test MTT in vitro (contact indirect) şi in vivo pe şobolani Wistar
Deoarece orice suport ce se dorește a fi implantat icircn organismul uman trebuie sterilizat
icircnainte de implantare se urmărește realizare de suporturi care să nu-și modifice morfologia și
structura fizică şi chimică după sterilzare Icircn acest scop suporturile P5 P6 P7 P8 și P9 au fost
103
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru 4 ore Pentru suporturile sterilizate au
fost studiate morfologia și structura chimică
42 Rezultate și discuții
421 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR La fel ca icircn cazul
morfologiei suporturilor au fost analizate prin FTIR suporturile icircnainte şi după expunere la UV
pentru 4 ore
Icircn figura 42A se pot observa spectrele suporturilor P5 P6 P7 P9 şi a particulelor
magnetice ndash MNPs sub formă uscată icircnainte de expunere la UV iar icircn figura 42B spectrele
suporturilor P5 P6 P7 P8 P9 după expunere la UV
Structura chimică a MNPs a fost confirmată de prezenţa benzilor de absorbţie caracteristice
chitosanului gruparea -OH la 3431 cm-1
amida I la 1637 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii
CndashN la 1384 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1072 cm-1
precum şi grupării FendashO
a magnetitei la 560 cm-1
[160]
Pe spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P9 (icircnainte de expunere la UV) au putut fi
identificate benzi de absorbţie caracteristice celor trei biopolimeri după cum urmează gruparea -
OH la 3429 cm-1
(P6) 3430 cm-1
(P7) 3431 cm-1
(P5 P9) gruparea ndashCH2 la 2924 cmminus1
(P5 P9)
şi la 2925 cm-1
(P6 P7) amida I la 1637 cmminus1
(P5) 1638 cm-1
(P9) 1653 cm-1
(P6) 1655 cm-1
(P7) amida II la 1555 cmminus1
(P7) 1563 cm-1
(P6) amida III la 1240 cmminus1
(P7 P9) 1242 cmminus1
(P5) 1246 cmminus1
(P6) şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1031 cmminus1
(P5 P7) 1032 cmminus1
(P9) 1035 cmminus1
(P6) Icircn cazul suportului P6 care conţine cea mai mare cantitate de colagen s-a
observat o intesitate mai mare a benzilor amidelor I II şi III după cum era de aşteptat Icircn plus icircn
toate spectrele s-a observat prezenţa picului asociat grupării COO- a hialuronatului de sodiu la
1405 cmminus1
(P7 P9) 1406 cmminus1
(P6) şi 1410 cmminus1
(P5) [173]
Benzile caracteristice magnetitei din particulele magnetice icircncorporate icircn suporturi au fost
observate la 561 cm-1
(P5 P7 P9) şi 562 cm-1
(P6) Icircn toate spectrele se pot observa picuri
specifice grupării fosfat PO43-
la 603 cm-1
(P5) şi 604 cm-1
(P6 P7 P9) Datorită faptului că
benzile caracteristice magnetitei sunt foarte aproape de cele caracteristice grupării fosfat
sugerează o suprapunere a acestora şi faptul că nu pot fi separate [99]
104
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 42 Spectrele FTIR ale suporturilor A icircnainte de expunere UV B după expunere UV
Icircn figura 42B sunt redate spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P8 şi P9 după
sterilizare prin expunere la radiaţii UV La fel ca icircn cazul suporturilor care nu au fost sterilizate
s-a observat prezenţa picurilor caracteristice celor trei biopolimeri a picurilor caracteristice
fosfaţilor de calciu şi a picurilor caracteristice particulelor magnetice la numere de undă
apropiate de cele ale picurilor caracteristice componentelor suporturilor nesterilizate ceea ce a
indicat faptul că procesul de sterilizare utilizat nu influenţează structura chimică a suporturilor
obţinute
105
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
422 Morfologia suporturilor
Datele SEM oferă informaţii importante despre suporturile realizate pentru ingineria
tisulară a ţesutului osos deoarece studiază morfologia lor aceasta avacircnd o influenţă
considerabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale suporturilor Morfologia a fost studiată icircn
secţiunea suporturilor Pentru o privire de ansamblu 5suporturi cu compoziţii diferite au fost
analizate la diverse ordine de mărire De asemnenea s-au analizat suporturi ce au fost expuse
pentru 4 ore la radiaţii UV pentru a vedea dacă acest proces de sterilizare influenţează
morfologia suporturilor
Icircn figura 43 sunt prezentate datele SEM ale suporturilor P5 P6 P7 şi P8 icircnainte de
expunere la UV iar icircn fugura 44 după expunere la UV la două ordine de mărire diferite Se
observă o structură poroasă tridimensională cu pori interconecaţi
Figura 43 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 icircnainte de expunere la UV
La ambele ordine de mărire s-a observat o distribuţie uniform a particulelor magnetice şi a
fosfaţilor de calciu icircn structura compozită polimerică Distribuţia uniformă a particulelor
magnetice se datorează procedeului de icircncorporarea directă a acestora icircn sinteză date
106
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
asemănătoare ce susţin acestă metodă de icircncorporarea fiind regăsite şi icircn alte studii din literatura
de specialitate
Figura 44 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 după expunere la UV
Comparacircnd imaginile din figura 43 cu cele din figura 44 nu s-au observat diferenţe de
morfologie a suporturilor aceaşi structură tridimensională poroasă fiind prezentă şi icircn acest caz
ceea ce indică faptul că procesul de sterilizare prin expunere la radiaţii UV pentru 4 ore nu
influenţează morfologia suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de 5 mg din fiecare probă a fost imersat icircn PBS pH= 72 icircntr-o microcoloană (QIAquickreg
Spin
Colummn 50 diametru 10 mm) ataşată la o microseringă de 1 ml icircntreg sistemul fiind incubat la
37ordmC pentru 72 ore după care s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din
capitolul 2 S-au analizat două fragmente din fiecare tip de suport şi s-a calculat deviaţia
standard Rezultatele obținute icircn urma acestui studiu sunt redate icircn figura 45
107
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Gradul de retenție al suporturilor preparate pentru aplicații icircn inginerie tisulară influențează
răspunsul suporturilor la difuziunea celulelor nutrienților și medicamentelor caracteristici foarte
importante pentru aplicația vizată [174]
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor ce
a fost observată pe imaginile SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei biopolimeri
utilizați icircn procesul de sinteză O parte din PBS este implicat icircn interacțiunea cu matricea
polimerică iar o altă parte este reținută fizic icircn porii suporturilor Cea mai mare valoare a
gradului de retenție a fost calculată pentru P7 suport ce are cel mai mic raport CaP = 1579 iar
una din cele mai mici valori ale gradului de retenţie a fost calculată pentru P8 suport ce are cel
mai mare raport CaP = 1721 ceea ce indică o influenţă semnificativă a raportului CaP asupra
retenţie de fluide biologice simulate Practic fosfaţi de calciu acoperă matricea polimerică
icircngreunacircnd pătrunderea soluţie PBS icircn interior
Figura 45 Gradul de retenție maxim PBS () pentru suporturile obținute
Se poate observa de asemenea că valorile gradului de retenție măsurate pentru suporturile
cu aceași compoziție teoretică sunt apropiate ceea ce indică reproductibilitatea metodei utilizate
pentru sinteza suporturilor
108
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat reacția cu enzime utilizacircnd lizozim și
colagenază Primul pas a fost imersarea a aproximativ 10 mg din fiecare probă icircn 5 mL soluţ ie de
PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de dializă
introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS Două mostre din fiecare probă au fost supuse degradării
Probele au fost apoi incubate la 37ordmC La intervale de 4 ore 48 ore 72 ore 7 zile și 14 zile de la
incubare un volum de 2 ml din fiecare probă a fost extras şi analizat din soluţia de PBS icircn care
este imersată membrana de dializă cu proba de analizat din punct de vedere al concentraţiei de
chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la intervalele de timp mai sus
menţionate datele obţinute icircn urma studiului fiind redate icircn figura 46 Icircn toate cazurile s-a
observat o creștere a ratei de degradare icircn timp avantajul suporturilor biodegradabile icircn
comparaţie cu cele care nu se degradadează este resorbţia materialului icircn timp fiind astfel exclus
riscul de rejecţie a suportului de către organism
Suporturile P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri (65 Cs 35 Col) şi raport
CaP diferit P1 are raportul CaP = 16 iar P3 are raportul CaP = 17 Icircn cazul suporturile P2 şi
P4 a fost aceeaşi situaţie ca icircn cazul suporturilor P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri
(35 Cs 65 Col) diferenţa dintre ele fiind dată de raportul CaP P2ndash CaP = 16 P4ndash CaP =
17 Nu au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute pentru cele patru suporturi fiind
observată o degradare ce creşte gradual icircn timp
Icircn cazul suporturilor P7 şi P8 suporturi ce au cel mai mic raport CaP (1579) ndash P7 și cel
mai mare raport CaP (1721) ndash P8 şi aceeaşi compoziţie polimerică nu au fost observate
diferențe semnificative icircn ceea ce priveşte cantitatea de chitosan degradat la niciunul din cele 5
intervalele de timp Icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 care au aceeaşi compoziţie nu au fost
observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute icircn toate cazurile fiind observată o degradare
constatantă icircn timp
109
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 46 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturi
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat
Rezultatele privind analiza concentraţia de colagen degradat au fost redate icircn figura 47 Icircn
cazul suporturilor P1ndash P4 s-a observat o legătură evidentă icircntre concentrația de colagen degradat
și compoziția polimerică a suporturilor
Icircn acest studiu pentru a determina viteza de degradare a suporturilor s-a utilizat colagenaza
bacteriană o enzimă specifică pentru degradarea in vivo a colagenului care hidrolizează
preferențial legăturile X-Gly icircn următoarele grupe de aminoacizi glicină-leucină (Gly-Leu)
glicină-izoleucină (Gly-Ile) alanin-prolină-glicină (Ala-Pro-Gly)
Icircn ceea ce privește concentraţia de colagen degradat pentru suporturile P5 ndash P9 s-a
observat şi icircn acest caz o legătură stracircnsă icircntre concentrația de colagen degradat și compoziția
polimerică a suporturilor cele mai mari valori fiind obţinute pentru suportul P6 ce conţine 7121
colagen şi doar 2879 chitosan şi cele mai mici valori pentu suportul P5 ce conţine 7121
chitosan şi 2879 colagen
La fel ca şi icircn studiul concentraţie de chitosan degradat icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 nu
au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute ceea ce confirmă reproductibilitatea
metodei
110
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 47 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturi
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ egale iar după ce s-au
determinat dimensiunile au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii specificaţi icircn
capitolul 2 Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru
fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a calculat modulul lui Young iar
la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind prezentate grafic icircn figura 48
Oasele sunt organe rigide formate din ţesut osos măduvă osoasă endost periost cartilaj
nervi şi canale vertebrale Icircn funcţie de structura sa ţesutul osos este de două tipuri ţesut osos
compact (cortical) şi ţesut osos spongios (trabecular) Ţesutul osos compact este localizat la
suprafaţa osului şi după cum sugerează şi denumirea sa are o macrostructură omogenă şi
compactă Se găseşte la diafiza oaselor iar grosimea sa variază icircn funcţie de localizarea
anatomică Ţesutul osos spongios este o reţea de pori interconectaţi volumul de spaţiu gol fiind
cuprins icircntre 50 şi 90 şi este localizat icircn epifiza oaselor lungi
Cele două tipuri de ţesuturi spongios şi compact au o influenţă semnificativă asupra
proprietăţilor mecanice ale osului Scheletul uman este supus zilnic la diferite forţe icircn funcţie de
activităţile icircntreprinse forţele de tensiune forţele de compresiune şi forţele de forfecare fiind
cele care acţionează cel mai adesea asupra ţesutului osos Solicitările mai complexe cum ar fi de
111
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
exemplu icircncovoierea osului pot fi descompuse la racircndul lor icircn cele trei forţe menţionate
anterior Pentru a studia solicitările la care este supus ţesutul osos proprietăţile mecanice ale
osului cum sunt modulul de elasticitate (Young) rezistenţa la compresiune şi tensiunea trebuie să
fie pe deplin icircnţelese Icircn ceea ce priveşte modului lui Young notat cu E acesta are valori diferite
pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut osos astfel E este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru
ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru ţesutul osos spongios [168]
Figura 48 Modulul lui Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de
calciu cu incluziune de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young icircn cazul suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi
fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice au fost cuprinse icircntre 3841 MPa şi
22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător
valorilor Modulului Young al ţesutului osos spongios Asemănarea suporturilor obţinute cu
ţesutul osos spongios poate fi susţinută şi de datele SEM care au evidenţiat o structură poroasă
tridimensională
Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru suportul P5 suport ce are cea mai mare
cantitate de chitosan icircn compoziţie (7121 Cs 2879 Col) iar cea mai mică valoare s-a
obţinut pentru P2 unul din suporturile cu cea mai mică cantitate de chitosan (35 ) ceea ce
indică o icircmbunătăţire a rezistenţei la compresiune a suporturilor prin adăugare de chitosan icircn
sinteza suporturilor Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie P9 ndash P13 valorile obţinute
112
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
pentru E sunt apropiate ceea ce indică faptul că metoda de sinteza a suporturilor este
reproductibilă
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 rezultatele obținute fiind prezentate icircn tabelul 43
Tabel 43 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire
suport
Susceptibilitate
magnetică (volum)
Magnetizarea
(emug)
P1 0160 middot e-4
1319
P2 0154 middot e-4
1269
P3 0135 middot e-4
1113
P4 0254 middot e-4
2093
P5 0160 middot e-4
1319
P6 0047 middot e-4
387
P7 0242 middot e-4
1995
P8 0112 middot e-4
923
P9 0257 middot e-4
2118
P10 0254 middot e-4
2093
P11 0432 middot e-4
3561
P12 0810 middot e-4
6676
P13 0514 middot e-4
4236
S-a observat că valorile obținute sunt cuprinse icircntre 387 şi 6676 emug amintind că s-a
introdus in sinteză o concentrație de 5 particule magnetice sub formă uscată (5 față de
cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor) ceea ce indică că
suporturile obţinute sunt superparamagentice
113
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare s-a utilizat metoda contactului indirect
realizacircndu-se un extract din suporturile P5 şi P6 care icircn prealabil au fost sterilizate după aceeaşi
metodă descrisă icircn capitolul 3 subpunctul 327 Fragmentele de suporturi sterilizate au fost
ulterior imersate icircn 4 ml mediu de cultură DMEM și lăsate la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului urmacircnd apoi filtrarea extractului printr-un filtru de 70 microm
măsurarea volumul final şi adăugarea a 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost pus icircn contact cu două linii celulare diferite fibroblaste din derm uman
(NHDF Lonza) și preosteoblaste MC3T3 icircn placi de 96 godeuri 3000 celule godeuCele două
tipuri de celule au fost incubate separat pentru 24 ore icircn mediu de cultură DMEM complet
icircnlocuit după cele 24 ore cu 150 μl extract Testul MTT a fost realizat la 24 48 și 72 ore
calculacircndu-se viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (7) din capitolul 2 rezultatele testului fiind
prezentate icircn figura 49 pentru contactul indirect al suporturilor cu fibroblaste şi icircn figura 410
pentru contactul indirect al suporturilor cu preosteoblaste
Figura 49 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu fibroblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea fibroblastelor s-a observat o uşoară creştere icircn timp a
acesteia pentru ambele suporturi analizate Icircn cazul suportului P5 valorile calculate pentru
viabilitate au fost cuprinse icircntre 964 şi 979 valori ce au sugerat lipsa unor efecte adverse
ale extractului asupra fibroblastelor deci suportul a fost considerat biocompatibil Pentru
114
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
suportul P6 s-au calculat valori uşor mai scăzute ale viabilităţii celulare icircntre 88 şi 924 dar
chiar şi aşa acestea s-au icircncadrat icircn limitele care au permis să se afirme că suportul este
biocompatibil
Figura 410 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu preosteoblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea preosteoblastelor s-au calculat valori mai mici decat icircn
cazul fibroblastelor S-a observat o tendinţă de scădere a viabilităţii icircn timp cea mai mică
valoare de 83 fiind calculată pentru suportul P6 Icircn cazul suportului P5 cea mai mică valoare
calculată a fost de 87 Rezulatele obţinute icircn urma contactului indirect cu preosteoblastele au
indicat faptul că suporturile nu au eliberat compuşi citotoxici acestea fiind biocompatibile
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor
Testele in vivo pentru determinarea citotoxicității s-au realizat pe femele icircn vacircrstă de 6
săptămacircni Animalele au fost grupate icircn 2 loturi lotul martor format din 9 șoareci a fost utilizat
ca bază de comparație pentru lotul cu implant (II) ndash suportul P9 compus din 18 șoareci Cu
excepţia celor de control tuturor celorlalţi li s-au implantat subcutanat fragmente de suporturi cu
dimensiunea 1 cm x 1 cm
Durata experimentului a fost de 21 de zile La finalul primelor 7 zile de experiment au fost
sacrificați 3 șoareci din lotul martor și 6 din lotul II Inițial animalele au fost supuse zilnic unei
observații clinice amănunțite pentru a depista eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca
115
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
urmare a intolerabilității implantului după care au fost sacrificate iar tesuturile adiacente
implantului au fost examinate histologic La fel s-a procedat si pentru ceilalți șoareci sacrificați
la 14 și respectiv 21 de zile
Preparatele au fost citite la microscop şi interpretate Macroscopic nu s-au remarcat
modificări locale evidente Microscopic pe probele de ţesut recoltat ce includeau implantul şi
ţesutul din jur imaginile au indicat o reacţie inflamatorie cronică uşoară infiltraţie limfoidă
difuză şi capsulă conjunctivă icircn jurul implantului La loturile testate suportul compozit a icircnfaţişat
aspecte de biodegradare superficială La lotul martor fals implantat unul din animale a dezvoltat
o reacţie inflamatorie uşoară cu infiltraţii limfocitare perivasculare restul secţiunilor au relevat
o vindecare normală a plăgii chirurgicale
După 7 zile de la implantare icircn jurul materialului implantat se remarcă un infiltrat
inflamator moderat reprezentat de leucocite neutrofile histiocite și macrofage (figura 411A)
Totodată icircn țesutul conjunctiv din jurul implantului se observă un infiltrat celular mononuclear
interfibrilar susținut de o congestie a capilarelor limitrofe ce se regăsește și icircn structura
materialului implantat (figura 411B) Structurile profunde ale pielii (dermul și hipodermul) nu
suferă modificări alterative Se remarcă o ușoară densificare a țesutului conjunctiv subcutanat
printr-o sporire a elementelor celulare (fibroblastele) și fibrilare (fibrele de colagen ) ale acestuia
(fugura 411C)
Figura 411 Examen histopatologic după 7 zile de la implantare Colorare tricromic Masson
După 14 zile de la implantare materialul implantat are o structură mai ldquoaerisitărdquo probabil
consecință a resorbției tisulare a unor constituienți Icircn jurul materialului implantat se observă o
veritabilă capsulă conjunctivă formată din țesut conjunctiv tacircnăr ce are tendința de sechestrare a
acestuia și care trimite scurte travei spre zona centrală a materialului implantat (figura 412A)
Se observă la periferia materialului implantat travei (septe) conjunctive pornite din capsula
116
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
conjunctivă periferică ce infiltrează materialul implantat remarcacircndu-se tendința de icircnglobare a
acestuia (figura 412B) icircntr-un țesut conjunctiv neoformat lax icircncă imatur reprezentat din
fibroblaste și fibre de colagen tinere (figura 412C)
Figura 412 Examen histopatologic după 14 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
După sacrificarea animalelor la 21 zile de la intervenția chirurgicală de implantare
subcutatantă macroscopic (figura 413A) nu există modificări locale evidente icircn structurile
cutanate din dreptul implantului la nici unul dintre animalele examinate histopatologic
Microscopic s-a observat un țesutul conjunctiv neoformat icircncă imatur dezorganizat
constituit din fibroblaste active și fibre de colagen cu un aranjament anarhic repezentat de
vacircrtejuri și cordoane (figura 414A) De asemenea au fost remarcate mici depozite de fosfat de
calciu sechestrate icircn masa conjunctivă neoformată (figura 414B) și septe conjunctive constituite
din țesut conjunctiv cu dispoziție diametrală și care străbat materialul implantat cu tendința de a-
l icircngloba
Figura 413 Analiza macroscopică a implantului
117
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 414 Examen histopatologic după 21 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
Drept concluzie a studiilor in vivo ce au urmărit interacțiunile dintre suporturi și țesuturile
vii s-a remarcat o lipsă de citotoxicitate a implantului subcutanat susținută de absența oricărei
reacții locale sau sistemice de respingere
43 Concluzii
Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu au fost obținute
prin precipitarea de fosfați de calciu din precursori CaCl2 și NaH2PO4 icircntr-un amestec de trei
biopolimeri cu proprietăți remarcabile pentru regenerarea osoasă Cs Col și Hya Un program
experimental a fost folosit pentru optimizarea metodei 13 suporturi fiind preparate P1 ndash P13 Icircn
sinteză a fost integrate o concentrație de 5 MNPs
Structura chimică a suporturilor precum și morfologia acestora au fost studiate și
pentru suporturi ce au fost expuse la radiații UV timp de 4 ore procedeu utilizat icircn unele aplicații
biomedicale pentru sterilizare
Benzi de frecvență caracteristice biopolimerilor CP și MNPs au fost observate icircn
toate spectrele FTIR Nu au fost observate diferențe icircntre spectrele suporturilor expuse la radiații
UV și cele normale ceea ce icircnseamnă că acest proces de sterilizare nu influențează structura
chimică a suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată icircn secțiune cu ajutorul SEM S-a remarcat
o structură poroasă a suporturilor cu CP și MNPs distribuite uniform pe scheletul polimeric
Distribuția uniform a MNPs este atribuită procedeului de icircncorporare direct a acestora icircn etapa de
118
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sinteză La fel ca icircn cazul structurii chimice radiațiile UV nu infleunțează morfologia
suporturilor astfel acest proces de sterilizare poate fi utilizat pentru testele in vitro și in vivo
Determinarea gradului de retenție PBS s-a realizat utilizacircnd o metodă
volumetrică valorile obținute după 72 ore de la interacțiunea suportului cu fluidul la 37degC
indicacircnd o influență semnificativă a raportului CaP asupra proprietății studiate
Pentru studiile de degradare in vitro s-a studiat interacțiunea cu un complex de
două enzime lizozim și colagenază enzime implicate in vivo icircn procesele de degradarea a
chitosanului respectiv colagenului Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul
ambilor biopolimeri
Modului lui Young are valori diferite pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut
osos este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru
ţesutul osos spongios Valorile obţinute icircn cazul suporturile preparate au fost cuprinse icircntre 3841
MPa şi 22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul corespunzător modulului Young al
ţesutului osos spongios
Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor
Teste de citotoxicitate in vitro realizate icircn paralel pe două linii celulare diferite
fibroblaste și osteoblaste au indicat faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra celulelor
Caracterul non-citotoxic al suporturilor a fost evidențiat și in vivo după ce fragmente de
suporturi au fost implantate subcutanat la șoareci După 21 zile aceștia au fost sacrificați iar
fragmentele de țesut cu implant au fost analizate macroscopic și microscopic
119
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de
particule magnetice
Avacircnd icircn vedere proprietăţile biopolimerilor Cs Col şi Hya descrise icircn amănunt icircn
capitolele anterioare precum şi procedeul biomimetic de co-precipitarea de fosfați de calciu (CP)
din precursori CaCl2 şi NaH2PO4 un lot nou de suporturi a fost realizat conform metodei de
obţinere utilizate icircn capitolul 4 diferenţa dintre acest lot de suporturi şi lotul de suporturi
descrise icircn capitolul 4 fiind dată de modalitatea de incluziune a particulelor magnetice icircn etapa
de sinteză a suporturilor icircn cazul lotului din capitol 4 particulele au fost incorporate sub formă
uscată iar icircn cazul acestui lot particulele au fost icircncorporate sub formă de suspensie coloidală
51 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute prin acelaşi procedeu biomimetic utilizat icircn capitolul 4 Icircn
acest scop soluţii de precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri Cs (1) Col (1) Hya (1) şi 5 suspensie coloidală de
MNPs icircn apă (raportată la cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor)
pH-ul amestecului a fost apoi ajustat la 72-74 utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac iar după
spălare cu apă distilată pentru eliminarea compuşilor nereacţionaţi amestecurile au fost
liofilizate pentru 24h
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat şi de această dată
acelaşi program experimental cu două variabile (concentrația de Col - raportată la
concentrația de Cs respectiv raportul CaP) utilizat icircn capitolul 4 Icircn tabelul 51 este
prezentată codificarea varabilelor programului experimental iar icircn tabelul 52 sunt prezentate
domeniile de variaţie precum şi codificarea suporturilor (S1 - S13)
Utilizacircnd ecuației (3) din capitolul 2 s-au determinat valorile variabilelor investigate din
programul experimental icircmpreună cu răspunsurile obținute Coeficienţii de regresie au fost
determinaţi si sunt prezentaţi icircn tabelul 53 alături de coeficienți de corelație și de abatere
standard Variabila răspuns Y1 corespunde gradului de retenție PBS a suporturilor preparate ()
iar Y2 corespunde modului de elasticitate E (MPa) ndash tabel 54
120
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 51 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 52 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Codificare
Support X1 X2 Col Cs CaP
S1 -1 -1 35 65 16
S2 1 -1 65 35 16
S3 -1 1 35 65 17
S4 1 1 65 35 17
S5 -1141 0 2879 7121 165
S6 1141 0 7121 2879 165
S7 0 -1141 50 50 1579
S8 0 1141 50 50 1721
S9 0 0 50 50 165
S10 0 0 50 50 165
S11 0 0 50 50 165
S12 0 0 50 50 165
S13 0 0 50 50 165
Tabel 54 Eroarea asimetrică coeficienţii de corelare si de regresie determinați
a1 a2 a3 a4 a5 a6 COR ASE
Y1 0256534 0006965 0001565 -0033 -000592 -004559 0980261 0024421
Y2 894655 8300833 -204625 486659 -394375 9217909 0986554 7447254
121
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 54 Programul experimental icircmpreună cu valorile determinate pentru retenție PBS
() și E (MPa)
Codificare
suport X1 X2 Y1 ndash Retenție PBS () Y2 ndash E (MPa)
S1 -1 -1 121714plusmn21973 20925plusmn32
S2 1 -1 109649plusmn32378 27947plusmn22
S3 -1 1 239234plusmn17309 12001plusmn34
S4 1 1 163522plusmn10871 16201plusmn24
S5 -1141 0 138888plusmn24263 8668plusmn33
S6 1141 0 100628plusmn20724 12261plusmn29
S7 0 -1141 109091plusmn22104 9038plusmn21
S8 0 1141 121213plusmn5471 8372plusmn12
S9 0 0 138889plusmn18159 7628plusmn32
S10 0 0 138960plusmn18209 7873plusmn12
S11 0 0 146019plusmn1502 8089plusmn24
S12 0 0 141067plusmn10022 7942plusmn8
S13 0 0 141844plusmn9215 8034plusmn32
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei utilizacircnd
spectroscopia IR cu transformare Fourier (FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de
energie (EDS) şi difracţie cu raze X (XRD) Din punct de vedere al morfologiei au fost
caracterizate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM) și prin micro computer-tomografie
(microCT) De asemenea s-au analizat comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora proprietățile mecanice și proprietățile magnetice Citotoxicitatea
suporturilor a fost analizată printr-un test MTT in vitro (contact direct) şi in vivo pe şoareci din
linia CD1
Suporturile S7 S8 și S9 au fost sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru
4 ore şi au fost studiate morfologia și structura lor chimică cu scopul de a observa influenţa
porcesului de sterilizare asupra carcteristicilor menţionate
122
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
52 Rezultate și discuții
521 Structura chimică a suporturilor
Datele obţinute icircn urma analizei FTIR oferă informaţii despre structura suporturilor
Suporturile au fost analizate icircnainte şi după expunere la UV pentru 4 ore rezultatele fiind redate
icircn figura 51 S-au observat picuri pentru cei trei biopolimeri (Amide I C=O Amide II N-H
funcțiile OH grupari alifatice) fosfații de calciu (PO3-
4 la 563 cm-1
) și nanoparticule magnetice
[99 175]
Figura 51 Spectrele FTIR pentru suporturile S7 S8 S9
A icircnainte de expunere la UV B după expunere la UV
Benzile reprezentative pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 55 După cum se poate
observa benzile reprezentative pentru suporturile expuse la UV au valori foarte apropiate sau
chiar identice cu cele ale suporturilor care nu au fost expuse la UV ceea ce icircnseamnă că
123
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
radiațiile UV nu influențează structura chimică a acestora chiar și după o periadă mare de timp
(4 ore)
Tabel 52 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S1 și S3
IcircIcircnainte de expunere la UV DuDupă expunere la UV
Grupări
funcționale
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
OH 3421 3418 3409 3421 3419 3415
C-H 2937 2936 2934 2937 2942 2936
Amida I
C=O 1653 1659 1655 1655 1652 1655
Amida II
N-H 1556 1556 1552 1557 1556 1552
C-O 1030 1031 1030 1031 1030 1030
Fe-O 603 603 602 603 603 602
PO3_4
561 561 560 561 561 561
522 Compoziția suporturilor
Icircn figura 52 este redată difractograma XRD pentru suporturile S7 S8 și S9 Picurile
caracteristice specifice fosfaţilor de calciu ce pot fi associate planelor (002) (210) (112) (213)
și (004) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF No 65-3107) și unghiurile cu care
acestea sunt corelate sunt redate icircn tabelul 56 [176]
Figura 52 Spectrul XRD pentru suporturile S7 S8 și S9
124
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 56 Diferite forme de CP prezente icircn suporturile analizate conform JCPDS
Unghi 2ϴ (deg) Intensitate (ua) Index conform JCPDS Formula chimică
26 002 44-0778 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
28 210 44-0810 Ca3H2(P2O7)2 ∙ H2O
31 112 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
49 213 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
53 004 02-1350 CaHPO4
Icircn figura 53 este redat spectrul EDS pentru suportul S5 Numărul atomic pentru Ca a fost
292 iar pentru P a fost 148 ceea ce a indicat un raport CaP= 197 această valoare fiind
apropiată de valoare raportului CaP al fosfatului tertacalcic (TTCP) ndash Ca4(PO4)2O care este 200
[177]
Figura 53 Spectrul EDX pentru suportul S5
523 Morfologia suporturilor
Porozitatea caracterizată drept procentul de spaţiu gol dintr-un solideste una din cele mai
importante caracteristici ale unui suport realizat pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară şi
regenerarea ţesutului osos Porozitatea unui suport este influenţată de natura materialelor din
compoziţia sa precum şi de procesul de obţinere Un suport pentru regenerarea osoasă trebuie să
susţină migrarea şi proliferarea osteoblastelor şi a celulelor mezenchimale să permită
pătrunderea vaselor de sacircnge şi angiogeneza iar icircn final să contribuie la formarea de neoţesut
[178] Porozitatea unui suport influenţeză o serie de alte caracteristici esenţiale pentru un suport
125
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
realizat pentru aplicaţia menţionată anterior cele mai semnificative fiind biodegradabilitatea şi
proprietăţile mecanice
Rezultatele SEM sunt prezentate icircn figura 54 Figura 54A reprezintă suporturile S7 S8
S9 icircnainte de expunere la radiații UV iar figura 54B aceleași suporturi după expunere la
radiații UV La 500 microm se poate observa o structură poroasă a suporturilor şi icircncorporarea
particulelor magnetice și a cristalelor de calciu icircn matricea polimerică şi faptul că nu există
diferențe icircntre suporturile sterilizate și cele nesterilizate
Figura 54 Morfologia suporturilor S7 S8 S9 A Icircnainte de expunere la UV B După expunere
la UV
Pentru un studiu mai detaliat al morfologiei suporturilor fragmente din acestea au fost
scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi o
rotaţie de 05ordm Proiecţiile astfel obţinute au fost procesate şi reconstruite utilizacircnd programul
NRecon (Bruker Belgium) Trei regiuni de interes au fost selectate pentru fiecare proba iar
programul CTAn a fost utilizat pentru calcularea dimensiunii porilor precum şi dimaterului de
percolaţie Pentru calcularea porozităţii s-a utilizat metoda ldquosphere-fittingrdquo regasită icircn aplicaţia
BatMan a programului CTAn Pentru calcularea diametrului de percolaţie s-a utilizat metoda
126
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
descrisă de Ashworth şi colab [179] Pe scurt metoda ldquoshrink wraprdquo a fost aplicată pentru a
identifica volumul accesibil unui obiect virtual care poate penetra icircntreaga regiune de interes
utilizacircnd urmatoare ecuaţie
(16)
unde este o constantă de percolaţie egală cu 088 pentru sistemele 3D [180]
Vizualizarea distribuţiei porilor a fost efectuată utilizacircnd programul CTVox (Bruker
Belgium) Astfel o funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste
reconstrucţia 3D a probei de investigat iar un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare
Suportul care are cea mai mare dimensiune a porilor a fost suportul S7 iar suportul cu cea
mai mică dimensiune a porilor a fost suportul S8 Aceste două suporturi sunt practic suporturile
cu cel mai mic raport CaP ndash S7 (CaP = 1579) şi cel mai mare raport CaP ndash S8 (CaP = 1721)
ceea ce a indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra porozităţii
suporturilor Icircn ceea ce priveşte comparaţia porozităţii suporturilor din punct de vedere al
compoziţiei de biopolimeri s-a observat o dimensiune mai mare a porilor suportului S6
(conţinacircnd un raport mai mare de colagen)
Figura 55 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suporturile S6 S7 S8 S9
127
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn tabelul 57 sunt prezentate date despre dimensiunea şi distribuţia porilor (prezentate şi
icircn figura 55) volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
Tabel 57 Dimensiunea porilor suporturilor S5 S6 S7 S8
Denumirea
suportului
Dimensiunea
porilor (microm)
Volumul
regiunii de interes (mm3)
Aria regiunii de
interes (mm2)
S6 2121plusmn9091 222051 1027245
S7 27341plusmn10952 200577 955451
S8 13309plusmn6785 255724 1139832
S9 1388plusmn5284 316728 1343793
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost analizate icircn aceleaşi condiţii experimentale ca şi suporturile prezentate
icircn capitolul 4 Icircntr-o primă etapă suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ
egale s-au determinat dimensiunile şi au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii
specificaţi icircn capitolul 2 Pentru fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a
calculat modulul Young iar la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind redate icircn figura 56 și icircn
tabelul 53
Figura 56 Modulul Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu
cu incluziune suspensie coloidală de particule magnetice
0
50
100
150
200
250
300
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13
20925
27947
12001
16201
8668
12261
9038 8372 7628 7873 8089 7942 8034 E (
MP
a)
128
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young au fost cuprinse icircntre 7628 MPa şi 27947
MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător valorilor
Modulului Young al ţesutului osos spongios interval icircn care s-au icircncadrat şi valorile obţinute
pentru suporturile caracterizate icircn capitolul 4 Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru
suportul S2 avacircnd următoarea compoziţe 35 Cs 65 Col şi raportul CaP = 16 iar cea mai
mică valoare s-a obţinut pentru suportul S9 avacircnd următoarea compoziţe 50 Cs 50 Col şi
raportul CaP = 165 Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie S9 ndash S13 valorile obţinute
pentru E au fost apropiate ceea ce indică că metodă poate fi considerată reproductibilă din punct
de vedere al proprietăților mecanice Analizacircnd valoarea lui E din punct de vedere al influenţei
raportului CaP deci comparacircnd suporturile S7 (CaP = 1579 50 Cs 50 Col) cu S8 (CaP
= 1721 50 Cs 50 Col) s-au observat valori apropiate ale lui E de unde se poate
concluziona că raportul CaP nu influențează proprietățile mecanice ale suporturilor
525 Proprietăţi magnetice ale suporturilor
Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 58 S-a măsurat
susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime adimensională)
utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Tabel 58 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire suport
Susceptibilitate magnetică (volum)
Magnetizarea (emug)
S1 0295middot e-4
2431
S2 0382middot e-4
3148
S3 0414middot e-4
3412
S4 0304middot e-4
2505
S5 0272middot e-4
2241
S6 0439middot e-4
3618
S7 0476middot e-4
3923
S8 0399middot e-4
3288
S9 0539middot e-4
4442
S10 0749middot e-4
6173
S11 061middot e-4
5027
S12 0703middot e-4
5794
S13 0817middot e-4
6733
129
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13)
din capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 2241 şi 6733 emug indică faptul că suporturile
obținute sunt superparamagnetice
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Valorile gradului de retenție obținute pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 53 și
figura 57 Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a
suporturilor dovedită de datele SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei
biopolimeri utilizați la fabricarea suporturilor
Figura 57 Grad de retenţie PBS
Se poate afirma că o parte din PBS interacționează cu matricea polimerică iar o altă parte
este reținută fizic icircn porii suporturilor Inițial icircn PBS moleculele de H2O intră icircn suporturi prin
1579
165
1721
900
1200
1500
1800
2100
2400
287
9
37
27
45
75
542
3
627
1
712
1
CaP
GR
(
)
Colagen ()
2100-2400
1800-2100
1500-1800
1200-1500
900-1200
130
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
pori pentru a umple spațiile interne Pe de altă parte numărul de grupuri polar este de asemenea
un factor important care afectează hidrofilia materialului [181] Adăugarea de fosfați de calciu
icircn compoziția suporturilor duce la o scădere a gradului de retenție
527 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd un amesctec
de două enzime lizozim și colagenază Metoda de lucru utilizată a fost aceeaşi ca cea utilizată pentru
degradarea suporturilor obţinute şi caracterizate icircn capitolul 4 10 mg din fiecare probă s-a imersat icircn
5 ml soluţie de PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de
dializă introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS după care au fost incubate la 37degC La anumite
intervale de timp s-a extras şi analizat un volum din cei 10 ml PBS din punct de vedere al
concentraţiei de chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la 2 ore 48 ore 7 zile şi 14 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate icircn figura 58
Figura 58 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Comparacircnd valorile obținute nu s-a observat o dependență clară a vitezei de degradare a
concentrația de chitosan chiar dacă toate materialele sunt degradate treptat Comportamentul se
0
02
04
06
08
1
S5 S6 S7 S8 S9
(Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat)
middot100
m
moli
L
2 ore 48 ore 7 zile 14 zile
131
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
datorează interacțiunilor ionice ale chitosanului cu colagenul și fosfații de calciu care modifică
conformația situsului de legare pentru lizozim [182]
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat
Concentraţia de colagen degradat a fost analizată la 4 ore 48 ore 72 ore şi 7 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate sub formă de grafic
Figura 59 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Hidrolizarea colagenului din suporturi de către colagenază enzima implicată icircn procesul de
degradare al acestei proteine in vivo are două etape Icircntr-o primă etapă enzima se atașează la
suport și apoi rupe locurile specifice care corespund structurilor de aminoacizi pentru care
enzima are specificitate Condițiile de mediu (pH tărie ionică inhibitori de enzime) și
caracteristicile materialelor (compoziție structură supramoleculară și porozitate) sunt parametri
care dictează viteza de degradare și biointegrarea controlată a suportului Toate suporturile au
fost degradate icircn timp cu vitezediferite
0
005
01
015
02
025
S5 S6 S7 S8 S9
Con
centr
aţi
a d
e co
lagen
deg
rad
at
mm
oli
L
4 ore 48 ore 72 ore 7 zile
132
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
5281 Testul MTT
Citotoxicitatea in vitro a suporturile obținute a fost analizată utilizacircnd un test MTT test ce
a oferit informații despre viabilitatea a trei linii diferite de celule fibroblate celule STEM și
osteoblaste la contactul direct cu fragmente de suporturi
Rezultatele prezentate icircn figura 510 indică lipsa citotoxicităţii suporturilor asupra
fibroblastelor valorile viabilităţii celulare fiind mai mari de 80 pentru toate cele trei suporturi
S7 S8 S9 şi pentru toţi cei trei timpi de contact
Icircn urma contactului direct al suporturilor S1 S3 S13 pentru 24 ore 48 ore respectiv 72
ore cu celule stem rezultate redate icircn figura 511A s-au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce
cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de 97 (S1) 98 (S13) și 99 (S3) ceea ce indică a
foarte bună biocompatibilitate a probelor
Figura 510Viabilitatea fibroblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile S7 S8 S9
Suporturile S1 S3 şi S13 au fost puse icircn contact direct şi cu osteoblaste rezultate fiind
redate icircn figura 511B dar rezulatele obţinute icircn acest caz nu sunt la fel de bune ca icircn cazul
contactului direct cu celulele stem osteoblastele fiind celule cu o sensibilitate ridicată Teste
suplimentare sunt necesare icircn acest caz
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
()
Control S7 S8 S9
133
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Figura 511 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile S1 S3 S13
A Utilizacircnd celule stem B Utilizacircnd osteoblaste
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată lipsa de citotoxicitate suporturile la contactul direct cu
celulele stem s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-AM rezultatele obţinute
fiind prezentate icircn figura 512
Figura 512 Viabilitatea celulelor STEM icircn contact cu suporturile S1 şi S3
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
cel
ula
ră
Control S1 S3 S13 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
Control S1 S3 S13 B
134
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu
suporturile S1 şi S3 atacirct la 24 ore cacirct şi la 96 ore ce ce confirmă icircncă o dată faptul că suporturile
nu eliberează compuși citotoxici și totodată structura lor nu influențează negativ activitatea
celulelor stem
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor
La fel ca icircn capitolul 4 citotoxicitatea in vivo a suporturilor din acest lot a fost studiată pe
șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28 plusmn 30 grame
icircntr-o stare de icircntreţinere foarte bună găzduițiți icircn condițiile adecvate
Pentru implant materialele au fost secționate sub forma unor discuri cu diametrul de 15
mm (A=17671 mm2) apoi au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 10
minute Animalele au fost grupate icircn 3 loturi lotul 7 (corespunzător suportului S7) lotul 8
(corespunzător suportului S8) și lotul 9 (corespunzător suportului S9) fiecare lot cuprinzacircnd un
număr de 12 animale
Animalele au fost supuse la o intervenție chirurgicală de implantare subcutanată descrisă
icircn capitol 2 subcapitolul 248 Durata studiului a fost de 64 de zile La finalul primelor 48 ore de
experiment au fost sacrificați cacircte 3 șoareci din fiecare lot (7 8 9) apoi cacircte alți 3 din fiecare lot
la intervale de 12 34 respectiv 64 de zile
Inițial animalele au fost supuse zilnic unei observații clinice amănunțite pentru a depista
eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca urmare a respingerii implantului după care au
fost eutanasiate prin administrarea unei supradoze de izofluran Zona de implant a fost deschisă
chirurgical fără a leziona excesiv țesutul Țesuturile adiacente au fost examinate macroscopic
fiind apreciate modificările din zona de implant (porțiunea centrală a implantului) și din jurul
acesteia respectiv prezența hemoragiei necrozei infecției și modificarea culorii țesutului
Histologic fiecărui șoarece i s-au recoltat probe de țesut din zona de implant și adiacentă
acesteia pentru a evalua populația de celule din jurul implantului Aceste probe au fost fixate icircn
formol 10 apoi incluse la parafină colorate Tricromic Masson și examinate microscopic
Pentru suporturile din acest lot deoarece durata experimentului a fost mai mare s-a evaluat
gradul de icircncapsulare a materialelor (granulom de corp străin) măsuracircnd grosimea capsulei de la
periferia spațiului ocupat de implant pacircna la marginea exterioară a acesteia Scorul icircncapsulării a
fost realizat conform recomandărilor ISO Standard 10993 prezentate icircn tabelul 59
135
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 59 Scorul icircncapsulării
Capsulă Scor
Absentă 0
gt 05 mm 1
06 ndash 10 mm 2
11 ndash 20 mm 3
gt 20 mm 4
Cerințele testului sunt icircndeplinite dacă diferențele dintre scorul mediu al animalelor din lot
este lt 10 mm
Icircn urma observațiilor clinice nu se observă modificări ale țesuturilor adiacente implantului
integritatea pielii nu este modificată nu sunt prezente semne de turgescență icircnroșire erupție sau
piloerecție La racircndul lor datele histologice susțin ipoteza biocompatibilității compozitului pe
baza de polimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Figura 513 Suportul S7 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
Icircn cazul bioimplanturilor diferite tipuri de celule interacționează și conduc la răspunsuri
specifice iar icircnțelegerea acestor mecanisme ne conduc către realizare unor suprafețe de implant
136
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
cu o mult mai mare compatibilitate cu structurile biologice Fiecare implant ne-natural induce un
răspuns inflamator acutdin partea organismului dar nu răspunsul icircn sine este important ci
icircntinderea și intensitatea sa Prin urmare orice test de biocompatibilitate a unui anumit material
trebuie să se bazeze pe evaluarea populației de celule din jurul implantului
Markeri importanți pentru biocompatibilitate sunt tipurile de celule care apar după
implantarea materialului străin Icircn literatura de specialitate nu este clar dacă prezența celulelor
gigant de corp străin marchează o incompatibilitate a biomaterialului sau dacă acestea denotă un
comportament de degradare normală a materialelor biomaterialelor resorbabile [183] Orice
biomaterial implantat este recunoscut de către organism ca un rdquonon selfrdquo Icircn mod obișnuit toate
biomaterialele implantate icircn țesutul conjunctiv induc un răspuns din partea gazdei proces
inflamator acut a cărei formă de manifestare și intensitate diferă
Figura 514 Suportul S8 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
După Hench și Best dacă biomaterialul este (I) toxic țesuturile din jur mor (II) netoxic și
biologic inactiv (aproape inert) apare un țesut fibros de formă și grosime variabilă (III) netoxic
și biologic activ (bioactiv) se produce o legătură interfacială stracircnsă material-structură biologică
(IV) netoxic și se dizolvă țesuturile din jur icircl icircnlocuiesc [184] Amplitudinea și durata
137
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
procesului inflamator are o influență determinantă asupra stabilității și compatibilității
biomaterialului implantat [185]
Figura 515 Suportul S9 la 48 ore 12 zile și 64 zile post-implantare
Reacția organismului este evidentă icircn primele 48 de ore de la implantare manifestată
printr-un proces inflamator accentuat la materialele 7 și 8 și mai redus ca intensitate icircn cazul
suportului S9 Se constată un aflux celular semnificativ reprezentat de macrofage neutrofile
leucocite rare limfocite fibroblaste și fibre de colagen Infiltratul inflamator a fost mai redus
caracterizat prin prezența de rare leucocite neutrofile și macrofage la S9
La 10 zile de la prima evaluare (12 zile de la debutul experimentului) la suporturile S7 și
S8 reacția fibroasă periferică este mai intens exprimată prin fiboblaste și fibre de colagen cu
orientare concentrică Infiltratul inflamator este reprezentat de macrofage limfocite histiocite și
fibroblaste La suportul S9 se icircnregistrează o proliferare fibroasă cu tendință de icircnglobare a
materialului Reacție giganto-celulară cu celule gigante de corp străin icircn ale căror citoplasme se
pot observa particule fagocitate din biomaterial Primele celule care se atașează materialului de
implant sunt fibroblastele Ele produc un colagen imatur observabil pe suprafața implantului
[186]
Prezența fibrelor de colagen și a fibroblastelor este considerată o reacție tisulară normală
Icircn acest strat (fibrinos) prezența de macrofage și neutrofile joacă un rol important icircn
138
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
transformarea implantului icircntr-un material biologic recunoscut și acceptat de către organism
[187]
Prezența macrofagelor inclusiv dezvoltarea țesutului de granulație este un răspuns firesc din
partea organismului ca parte a comportamentului normal de degradare a materialelor cel puțin
icircn cazul biomaterialelor degradabile [188]
De asemenea macrofagele modulează reacția tisulară prin producerea de interleukine
factori de creștere și alți agenți bioactivi precursori ai celulelor gigant de corp străin [189]
Interacțiunea macrofage-limfocite este una complementară Probabil adeziunea macrofagelor la
o suprafață este semnalul pentru activarea limfocitelor iar prezența limfocitelor influențează la
racircndul lor activitatea macrofagelor [190] și fuziunea [191]
Următoarea etapă a răspunsului gazdei este marcată de atracția monocitelor și acțiunea
mastocitelor cu eliberarea de histamină [192] Această reacție este unică și nu pare să depindă de
tipul de implant Amploarea reacției și grosimea stratului inflamator (index pentru
biocompatibilitate) depinde de natura chimică și topografia implantului Anderson consideră că
prezența celulelor mononucleare inclusiv limfocite și celule plasmatice este considerată
inflamație cronică icircn timp ce reacția la corp străin cu dezvoltarea țesutului de granulație este
considerată un proces de videcare normal a unei răni ca răspuns la implantul de biomateriale La
34 de zile de la implant icircn cazul tuturor celor trei suporturi se observă o tendință de icircnglobare
tisulară a acestora prin invazie conjunctivă (scorul mediu al icircncapsulării a fost de 1 sub 05 mm)
și un infiltrat inflamator redus Este un proces normal de invazie a fibroblastelor și de sinteză a
matricei extracelulare prin acești fibroblaști activi Se termină icircntr-un strat interior de macrofage
șisau celule de corp străin cu o zonă secundară icircn afara fibroblaștilor și țesutului conjunctiv care
icircnconjoară materialul de implant [193]
După 64 de zile de la implantare se icircnregistrează o tendință evidentă de asimilare și
resorbție a celor trei tipuri de biomateriale și delimitarea acestora icircn insule mici izolate de țesut
fibros Răspunsul organismului icircn cazul celor trei tipuri de materiale a fost unul normal
caracterizat printr-o reacție inflamatorie acută a cărei intensitate s-a redus după primele 48 de
ore Grosimea capsulei fibroase este sub 05 mm (scor 1) aspect care influențează icircn mod pozitiv
degradarea și resorbția materialului icircn timp acestea făcacircdu-se ușor și fără o reacție celulară
semnificativă
139
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
53 Concluzii
Utilizacircnd același procedeu biomimetic de co-precipitare și același program
experimental folosite și icircn capitolul 4 s-au preparat 13 suporturi notate S1 ndash S13 Diferența icircntre
cele două loturi de suporturi preparate pentru potențiale aplicații icircn regenerarea osoasă a fost dată
de forma de prezentare a MNPs incluse icircn compoziție Icircn capitolul 4 MNPs au fost incluse icircn
sinteză sub formă uscată pe cacircnd icircn capitolul de față au fost introduse sub formă de suspensie
coloidală icircn apă urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura
suporturilor Pentru ambele loturi s-a folosit o concentrație de 5 MNPs față de cantitatea de
substanță uscată de biopolimeri și fosfați de calciu introduse icircn sinteză
Datele FTIR au evidențiat prezența de picuri caracteristice pentru toate
componentele suporturilor La fel ca icircn capitolul precedent o parte din suporturi au fost
sterilizate prin expunere la radiații UV timp de 4 ore Comparacircnd datele FTIR pentru suporturile
expuse la UV și cele ne-expuse nu s-au observat diferențe benzile reprezentative ale grupărilor
funcționale specifice componentelor suporturilor avacircnd valori foarte apropiate sau chiar egale
Datele XRD și EDS au analizat tipurile de fosfați de calciu formate pe matricea
polimerică cele mai reprezentative forme identificate fiind fosfat dicalcic ndash CaHPO4
hidroxiapatită ndash Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2 și fosfatul tetracalcic ndash Ca4(PO4)2O
Datele SEM au evidențiat o structură poroasă CP și MNPs fiind distribuite
uniform icircn matricea polimerică Ca și icircn cazul datelor FTIR s-a studiat icircn paralel și morfologia
suporturilor expuse la radiații UV demonstracircndu-se că acest tip de sterilizare nu influențează
morfologia acestora Un studiu mai detaliat al morfologiei a fost studiat cu ajutorul analizei
microCT Rezultatele au indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra
porozităţii suporturilor
Valorile obţinute pentru modulul lui Young se situează icircn intervalul 7628 MPa ndash
279 47 MPa Rezultatele sunt icircncurajatoare deoarece modului lui Young pentru osul spongios
se icircncadrează icircntre 20 MPa și 500 MPa
140
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn ceea ce privește proprietățile magnetice ale suporturilor s-a calculat
magnetizarea valorile obținute fiind cuprinse icircntre 2241 și 6733 emug Aceste valori indică
faptul cu suporturile sunt superparamagnetice
Gradul de retenție al suporturilor are valori foarte mari cuprinse icircntre 945 și
2248 valori corelate cu structura poroasă și proprietățile hidrofile ale biopolimerilor din
compoziție Degradarea enzimatică a suporturilor s-a realizat cu o viteză constantă icircn timp atacirct
pentru Cs cacirct și pentru Col
Citotoxicitatea in vitro a suporturilor a fost testată pe trei linii celulare diferite
fibroblaste osteoblaste și celule STEM Un test MTT standard a fost realizat la 24 ore 48 ore și
72 ore la fiecare timp calculacircndu-se viabilitatea celulară Suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor cele mai bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Pentru osteoblaste s-au
obținut valori mai reduse ale viabilității celulare comparativ cu celelate două linii celulare
explicate de sensibilitatea ridicată a acestui tip de celule
Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost studiată pe șoareci femele din linia
CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de la implantarea subcutanată a
fragmentelor sterilizate de suporturi O reacție inflamatorie acută a avut loc icircn primele ore de la
implantarea a cărei intensitate s-a redus dupăprimele 48 ore Analizacircnd icircn amănunt datele
histlogice obținute la diverse intervale de timp la sfacircrșitul testului s-a ajuns la concluzia că
suporturile nu au efect citotoxic in vivo totodată s-a observat asimilarea și resorbția suporturilor
141
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
Reproductibilitatea este una din ipotezele de bază icircn experimentele științifice Dacă un
experiment nu este reproductibil rezultatele lui nu poate fi dovedite deci prin urmare nu pot fi
acceptate
Acest aspect a creat dificultăți majore icircn majoritatea domeniilor științifice De exemplu icircn
domeniul biologic probele de microbiologie depind direct de tulpinile acestora ceea ce conduce
la o lipsă de consecvență a rezultatelor deoarece fiecare grup de cercetare poate folosi propriile
tulpini Dificultăți icircn reproductibilitatea experimentelor științifice sunt observate și icircn domeniul
ingineriei tisulare Icircn acest sens icircn timpul oricărui experiment științific trebuie avute icircn vedere
două aspecte importante repetabilitatea și reproductibilitatea metodei acestea fiind componente
ale preciziei icircntr-un sistem de măsurare Cei doi termini se referă la măsurarea unui set de
condiții care includ aceeași procedură aceeași operatori același sistem de măsurare și aceleași
condiții de funcționare Repetabilitatea are loc icircn aceași locație pe cacircnd reproductibilitatea are
loc icircn locații diferite [196 197]
Reproductibilitatea slabă pune la icircndoială rezultatele științelor biomedicale Problema
principală este dată de complexitatea procesul de cercetare științifice
Icircn capitolele 4 și 5 au fost prezentate prepararea și caracterizarea a două loturi de suporturi
ambele fiind realizate printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare Icircn acest scop soluţii de
precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost amestecate cu soluţii de
biopolimeri Cs (1) C (1) Hya (1) şi MNPs pH-ul amestecului a fost ajustat la 72-74
utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac ndash NH4OH iar după spălare amestecurile au fost liofilizate
pentru 24 h
Diferenţa dintre cele două loturi de material este data de modalitatea de incluziune a
particulelor magnetice icircn etapa de sinteză a suporturilor obţinacircndu-se icircn cele din urmă
142
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Lot numărul 1 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată
Lot numărul 2 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
Pentru ambele loturi a fost utilizat un program experimental cu două variabile (concentrația
de chitosancolagen și raportul CaP) cu scopul de a se determina compoziția optimă a
suporturilor Respectacircnd valorile teoretice din programul experimental s-au obţinut 13 probe
Concentraţia de Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză
iar pentru raportul CaP au fost alese valori apropiate de cele identificate icircn țesutul osos uman
611 Obținerea suporturilor
Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi lotul numărul 2 s-a
dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul numărul
9 ndash S9 s-a dovedit a fi cel mai aproape de un suport ideal
Astfel pentru a demonstra reproductibilitatea metodei obiectivele următoare au fost
obţinerea şi caracterizarea a 7 suporturi avacircnd compoziţia teoretică a suportului 9
Suporturile obţinute au fost notate S91 ndash S97 și au fost caracterizate din punct de vedere
al structurii chimice utilizacircnd spectroscopia IR cu transformată Fourier ndash FTIR iar din punct de
vedere al morfologiei prin microscopie electronică de baleiaj ndash SEM și micro computer-
tomografie (microCT)
De asemenea s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
143
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
612 Rezultate şi discuţii
6121 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată utilizacircnd spectroscopia icircn infraroşu cu transformată
Fourier ce determină interacțiunile dintre cei trei biopolimeri fosfați de calciu și particulele
magnetice Rezultatele redate icircn figura 61 indică prezenţa picurilor caracteristice tuturor
componentelor cei trei biopolimeri fosfații de calciu și nanoparticule magnetice iar icircn tabelul
61 sunt prezentate benzile lor representative [136]
Figura 61 Structura chimică a suporturilor
După cum se poate observa atacirct icircn figura 61 cacirct și icircn tabelul 61 suporturile analizate au
structură chimică asemănătoare componentele din structura lor avacircnd benzile reprezentative
apropiate sau chiar egale
144
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Tabel 61 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S92 şi S97
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
S92 S97
3422 OH 3420 OH
2927 C-H 2926 C-H
1655 Amida I C=O 1656 Amida I C=O
1554 Amida II N-H 1554 Amida II N-H
1074 C-O-C 1069 C-O-C
604 Fe-O 602 Fe-O
562 PO3_4
561 PO3-4
6122 Morofologia suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată pentru o imagine de ansamblu cu ajutorul
microscopiei electronice de baleiaj (figura 62) Nu se observă diferenţe de morfologie icircntre
suporturile analizate fiind observată icircn ambele cazuri și la ordine de mărire diferite o structură
tridimensională cu pori intercomunicabili structură ce include atacirct cristale de fosfaţi de calciu cacirct
şi nanoparticule magnetice distribuite icircn matricea polimerică
Pentru o imagine mai detaliată asupra morfologiei suporturilor fragmente din acestea au
fost scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi
o rotaţie de 05deg Tehnica utilizată a fost descrisă pe larg icircn capitolul 5 sub-capitolul 523
Programul CTVox (Bruker Belgium) a fost utilizat icircn vederea vizualizării distribuţiei
porozităţii O funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste reconstrucţia 3D
a probei de investigat iar apoi un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare după cum se
poate observa icircn figura 63 Icircn tabelul 62 sunt prezentate dimensiunea distribuţia porilor
volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
145
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 62 Morfologia suporturilor
Figura 63 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suportul S94
Tabel 62 Dimensiunea porilor suportului S94
Dimensiunea porilor Volumul regiunii de interes Aria regiunii de interes
121plusmn5613 microm
144912 mm
3 769888 mm
2
146
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn figurile 64 Valorile obţinute pentru rezistența
la compresiune se situează icircn jurul valorii de 58 MPa iar valorile modulului Young sunt
cuprinse icircntre 215 MPa şi 220 MPa valori
Figura 64 A Rezistenţa la compresiune a suporturilor B Modulul Young pentru suporturi
Aceste valori sunt icircn mare parte determinate de porozitatea ridicată a compozitelor obţinute
prin procedeul de liofilizare Se observă valori apropiate ale rezistenței la compresiune a
suporturilor precum și a modului Young calculat metoda este deci reproductibilă și din punct de
vedere al proprietăților mecanice ale suporturilor obținute
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Rezultatele obținute icircn urma studiului de determinare a retenției fluidelor de interes
biologic sunt redate icircn figura 65
Figura 65 Grad de retenţie maxim
0
200
400
600
800
1000
1200
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Gra
d d
e re
ten
ție
maxi
m
()
72 ore
147
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor
dovedită de datele de microscopie electronică de baleiaj (figura 62) Acestea sunt cuprinse icircntre
685 și 909 cu o medie a valorilor obținute de 781 Această diferență de 224 icircntre
valoarea maximă și valoarea minimă obținute poate fi explicată de faptul că dimensiunea porilor
nu este uniformă conform tabelului 62 această este de 121 plusmn 5613 pentru suportul S94
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea enzimatică este cea mai utilizată metodă de caracterizare a biodegradabilității
unui suport Suporturile S91 ndash S97 au fost supuse degradării enzimatice determinacircndu-se
concentraţia de chitosan respectiv de colagen degradat la intervalie stabilite
Concentraţia de chitosan degradat
Se observă o creştere graduală icircn timp a concentraţie de chitosan degradat (figura 66) ceea
ce indică o degradare controlată a suporturilor proprietate foarte importantă pentru aplicaţia
vizată deoarece o rată de degradare prea rapidă implică o refacere incompletă a ţesutului osos
iar o rată de degradare prea lentă poate duce la o fractură sau la o deformaţie a osului Se pot
observa valori apropiate ale concentraţie de chitosan degradat ceea ce indică reproductibilitatea
metodei de sinteză
Figura 66 Concentraţia de chitosan degradat
0
015
03
045
06
075
09
105
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
(Co
nce
ntr
aţi
e ch
ito
saln
deg
radat)
∙
10
0 m
mo
liL
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
148
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Concentraţia de colagen degradat
Analizacircnd figura 67 se observă valori constante icircn timp ale concentraţie de colagen
degradat Ca și icircn cazul chitosanului degradarea colagenului se realizeză gradual pe măsură ce
enzima icircn cazul de față colagenaza reușește să străbată matricea anorganică formată din fosfați
de calciu și să ajungă la matricea organică polimerică
Valorile obținute pentru cele 7 suporturi analizate sunt apropiate procesul de degragare
gradual fiind observată pentru toate cazurile
Figura 67 Concentraţia de colagen degradat
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
Fragmente de suporturi au fost puse icircn contact direct cu osteoblaste rezultatele fiind redate
icircn figura 68A Valorile obţinute pentru viabilitatea celulară sunt icircn jur de 80 pentru toate
intervalele de contact ceea ce indică faptul sunt lipsite de citotxicitate
Icircn urma contactului direct al suporturilor cu fibroblaste rezultate redate icircn figura 68B s-
au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de
aproximativ 100 pentru toate ambele suporturi ceea ce indică a foarte bună citompatibilitate a
probelor
0
05
1
15
2
25
3
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Co
nce
ntr
ţia
de
cola
gen
deg
rad
at
m
moli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
149
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 68 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile
A Utilizacircnd osteoblate B Utilizacircnd fibroblaste
Pentru a reconfirma citocompatibilitatea suporturile la contactul direct cu fibroblastele și
reproductibilitatea metodei de sinteză s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-
AM rezultatele obţinute fiind prezentate icircn figura 69
Figura 69 Viabilitatea fibroblastelor icircn contact direct cu suporturile
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu fragmente
de suporturi după 72 ore de contact direct
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 B
150
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
Corelate cu alte afecțiuni maligne tumorile primare sunt destul de rare și mai puțin
frecvente reprezentacircnd doar 02 din toate neoplasmele raportate icircn Marea Britanie și Statele
Unite [198] Icircn plus tumorile primare sunt depășite ca număr de metastaze date de carcinom
melanom sau afecțiunile maligne hematologice cum ar fi plasmacitomul De asemenea alte
condiții non-neoplazice cum ar fi unele procese inflamatorii chisturile osoase displazia fibroasă
sau boala Paget depășesc cazurile de tumori osoase primare [199] Cele mai frecvente tumori
osoase maligne sunt osteosarcomul (35) condrosarcomul (25) sarcomul Ewing (16)
chordomul (8) și histiocitomul fibros malign (5) [200]
Tratamentul tumorilor osoase maligne reprezintă o adevărată provocare clinică deoarece
rezecția chirurgicală a tumorii și radioterapia nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral
Chimioterapia care precede de regulă celelalte două tehnici are efecte adverse semnificative și
totodată icircn unele cazuri poate apărea o rezistență la aceste medicamente Există icircnsă și o serie de
tratamente alternative cum ar fi hipertermia terapia țintită imunoterapia fototerapia utilizarea
nanoparticulelor transplant de celule stem și altele unele din ele aflate icircncă icircn faza de studiu dar
care vor oferi cel mai probabil soluții foarte bune icircn viitor [201] Imunoterapia icircmbunătățește
capacitatea celulelor imune de a recunoaște și ținti celulele tumorale ceea ce duce la eliminarea
lor Avantajele imunoterapiei includ specificitate ridicată anti-tumorală și efecte secundare
minime prin folosirea propriului sistem imunitar al pacientului Hipertermia este un tratament
modern ce implică creșterea temperaturii la locul țintă pentru a induce astfel un stres termic
temperatura la care se ajunge fiind icircn medie 40degC (39ndash43degC icircn funcție de strategia terapeutică)
[202]
Icircn mod particular protocolul de tratament al osteosarcoamelor icircncepe cu rezecția
chirurgicală a tumorii osoase primare și a eventualelor metastaze Defectul osos obținut este
acoperit cu un material de substituție osoasă pentru a preveni fracturile sau deformațiile osoase
[203] Deoarce tumorile osoase sunt aproape imposibil de icircndepărtat icircn totalitate intervențiile
chirurgicale sunt urmate de radiochimioterapie [204]
Icircn cazul unor tumori osoase tratamentul implică două etape Icircntr-o primă etapă țesutul
tumoral este icircndepărtat chirurgical iar icircntr-o a doua etapă defectul osos obținut este acoperit cu
151
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
un material de substituție osoasă tot mai studiate fiind suporturile magentice biomimetice Icircn
prezența unui cacircmp magnetic aceste suporturi vor atrage alte particule magnetice introduse icircn
circulație Acestea din urmă vor fi funcționalizate cu medicamente chimioterapice precum și cu
factori de creștere care să susțină procesul de regenerare osoasă și formare de neo-țesut
Radioterapia se icircncadrează adesea icircn schemele de tratament a diferitelor tipuri de cancer
rezultatele obținute de-a lungul timpului icircn practica clinică fiind eficiente Utilizacircnd radiații
ionizate raze X radioterapia generează stres oxidativ excesiv și induce denaturarea ADN-ului
ce va conduce la moartea celulelor tumorale Radioterapia este o metodă neinvazivă de
tratament radiația fiind aplicată la locul țintă pe cacirct posibil Un dezavantaj al metodei este acelă
că unele celule sunt radiorezistente Icircn cazul icircn care este observat acest fenomen se impune
utilizarea unei doze excesive de radiații care icircnsă va distruge celulele adiacente sănătoase Din
acest motiv există scheme de tratament de radio-sensibilizare de exemplu se poate combina
chimioterapia de radio-sensibilizare cu radioterapia [205] Icircn ceea ce privește tumorile osoase
radioterapia are ca efect de scurtă durată o reducere a densității minerale osoase imediat după
expunerea la radiații dar ulterior induce re-calcifierea leziunii etapă a procesului complex de
remodelarea osoasă Se presupune că icircn cazul pacienților cu răspuns bun la acest tip de terapie
este nevoie de aproximativ 3 luni pentru ca osul să fie refăcut [206]
Medicamentele chimioterapeutice sau citostatice sunt fie substanțe naturale fie derivați
sintetici ai acestora extrase din plante specii marine sau unele microorganisme [207]
Dezavantajele acestei terapii sunt toxicitatea și biodistribuția nefavorabilă a compușilor Sisteme
pentru eliberarea țintită a acestor principii active sunt intens studiate [208]
Icircn acest context polimerii sunt materiale adecvate pentru a transporta medicamente
icircncapsulate sau legate chimic De-a lungul timpului polimerii și nanoparticulele polimerice au
jucat un rol cheie icircn dezvoltarea tehnologiei de eliberare a medicamentelor oferind eliberarea
controlată a agenților terapeutici icircn doze constante pe perioade lungi dozare ciclică și eficiență
mai bună a medicamentelor hidrofile sau hidrofobe [209 210]
Suporturile obținute icircn capitolele anterioare au potențial de a fi utilizate pentru umplerea
defectului osos rezultat după rejecția chirurgicală a tumorii și totodată pentru eliberarea țintită
de chimioterapice icircncorporate icircn nanoparticulele magnetice din structura lor Scopul strategiilor
experimentale descrise icircn cele ce urmează a fost testare potențialului suporturilor obținute de a fi
utilizate icircn radiochimioterapia tumorilor osoase maligne Inițial suporturile au fost expuse la
152
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
radiații X pentru a stabili influența asupra structurii și proprietăților acestora Icircn etapa următoare
s-a studiat icircncărcarea și eliberarea de chimioterapice (doxorubicină ndash DOX) din nanoparticulele
magnetice incluse icircn suporturi
621 Obținerea suporturilor
Șase suporturi au fost preparate după protocolul descris icircn capitolul 5 Pe scurt suporturile
au fost obținute prin co-precipitarea CaCl2 și a NaH2PO4 pe un suport de biopolimeri Cs Col
Hya și MNPs icircn prezența unei soluții apoase de amoniac NH4OH Icircn tabelul 63 sunt detaliate
codificările compoziția și caracteristicile distinctive ale suporturilor
Tabel 63 Codificarea și compoziția suporturile obținute și caracteristica lor distinctivă
Codificare
suport Compoziția biopolimerică CaP
Concentrația
de MNPs Caracteristica distinctivă
S5 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Control
S9 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Control
S5R 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S9R 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S5-DOX 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
S9-DOX 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor
Icircn vederea iradierii suporturilor cu raze X s-au urmat pași specificați icircn capitolul 2 sub-
capitolul 2491 și anume
a avut loc o simulare computer-tomograf (CT) icircn condiții similare radioterapiei
(poziționarea laserului plasarea markerilor radio-opaci externi scanarea volumului iradiat cu un
dispoziti de scanare CT special)
conturarea volumului țintă pe imagini complexe CT
stabilirea dozei de radiație
determinarea parametrilor fascicului de radiație (energia de lucru unghiul de incidență
dimensiuni și forme utilizarea accesoriilor optime)
analiza histogramei doză-volum pentru a verifica dacă cel puțin 95 din volumul țintă
a iradiat minim 95 de doza prescrisă
153
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn planul de iradiere denumit CILINDRU secțiunile obținute au fost conturate astfel
suprafața exterioară ca referință (S) materialul (V1) și volumul țintă (V2) V2 = V1 + 5mm
pentru a compensa posibilele eroari de poziție figura 610A
Doza de radiații utilizată a fost de 8 Gy fracțiune unică aceasta fiind doza unică
administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase [211 212 213]
Realizarea unui plan de tratament care să respecte atacirct distribuția omogenă icircn volumul țintă
a dozei prescrise cacirct și constracircngerile legate de doză cu privire la riscul de a afecta organele din
vecinătate impun alegerea cu atenție sporită a tehnicii de iradiere icircn unele cazuri fiind necesară
aplicarea unui bolus la suprafața volumului iradiat De exemplu iradierea peretelui toracic după
mastectomie radicală solicită utilizarea unui bolus icircn vederea obținerii parametrilor optimi ai
planului de tratament tipul și grosimea bolusului fiind incluse icircn algoritmul de calcul Bolusul
permite iradierea pielii cu 100 din doza prescrisă icircn timp ce icircn lipsa acestuia pielea (icircn care icircn
cancerul de sacircn apar aproape toate recidivele locale) este iradiată cu 70 din doza prescrisă iar
țesuturile nețintă (mușchi coaste) primesc 100 din doză Icircn mod similar bolusul este indicat
pentru iradierea tumorilor laringelui cu extensie la comisura anterioară sau a tumorilor vulvare
primare [214]
Planul de tratament a fost realizat utilizacircnd software-ul Eclipsetrade Planning Treatment
System Pentru o distribuție omogenă a dozei icircn volumul materialului a fost plasat un bolus de
10 mm grosime pe suprafața materialului rezultacircnd o includere suficientă icircn izodoza 95
(prezentată icircn verde icircn figura 610B) pentru V2 Termenul de izodoză se referă la suprafețele
care unesc toate punctele la nivelul cărora are loc absorbția unor doze egale de energie radiantă
[215]
Figura 610 A Conturarea volumului țintă pe imaginile CT ale eșantionului B Distribuția dozei
de radiații icircn volum de suport după aplicarea bolusului
154
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Parametrii stabiliți pentru planul de iradiere au fost două raze opuse izocentrice egale
una din poziția zero (AP) cu 6 MV și una posterioră poziționată la 180 de grade (PA) cu 15 MV
(figura 611)
Figura 611 Parametrii planului de iradiere
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină
Nanoparticulele magnetice au fost icircncărcate cu doxorubicină conform protocolului descris
anterior icircn subcaptiol 2492 Pe scurt icircntr-o suspensie coloidală de 1 MNPs icircn apă s-a
solubilizat 0125 doxorubicină nanoparticulele astfel obținute fiind notate cu MNPs-DOX
Suspensia finală a fost utilizată la prepararea suporturilor S5-DOX și S9-DOX conform datelor
experimentale din tabelul 63
Pentru caracterizarea suporturilor s-au analizat morfologia acestora eliberarea controlată
de medicamente antitumorale și citotoxicitatea in vitro la contactul direct cu celule tumorale
Structura chimică a suporturilor preparate a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR
iar morfologia lor cu ajutorul microscopiei electronice SEM
Pentru suporturile S5 S5R S9 S9R a fost analizată interacțiunea cu PBS (grad de retenție
maxim PBS) și s-au efectuat studii de degradare in vitro utilizacircnd un complex de enzime lizozim
(1200 μgml) și colagenază (100 μgml ) conform datelor experimentale din subcapitolul 246
155
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
De asemenea a fost studiată citotoxicitatea citotoxicitatea suporturilor sterilizate (expuse la o oră
la radiațiile UV) utilizacircnd celule osoase din linia MG-63 Un test MTT standard a fost efectuat la
24 48 și 72 de ore și a fost calculată viabilitatea celulară
Pentru suporturile S5-DOX și S9-DOX s-a analizat eliberarea de medicament in vitro
(subcapitol 2492) și interacțiunea cu celule MG-63 Suporturile au fost sterilizate tot prin
expunere la UV pentru o oră după care au fost puse icircn contact direct cu celulele Icircn paralel o
soluție stoc de doxorubincină a fost preparată icircn condiții sterile diferite concentrații fiind
analizate din punct de vedere al interacțiunii cu același tip de celulele Viabilitatea celulară a fost
calculată cu ajutorul unui test MTT standard
624 Rezultate și discuții
Suporturile preparate au fost testate icircn vederea unei potențiale utilizări icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne tehnică redată schematic icircn figura 612
Figura 612 Tratamentul tumorilor osoase maligne utilizacircnd tehnici de radioterapie și
chimioterapie
156
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor
Analiza FTIR a fost utilizată pentru studiul structurii chimice a suporturilor rezultatele
fiind redate icircn figura 613
Icircntre suporturile radiate și neradiate (figura 613A) nu se observă diferențe de structură
chimică benzile de absorbție caracteristice biopolimerilor nanopaticulelor magnetice și
fosfaților de calciu fiind observate icircn toate spectrele FTIR Icircn ceea ce privește biopolimerii se
pot observa următoarele picuri caracteristice 3439 cm-1
3434 cm-1
și 3489 cm-1
pentru gruparea
hidroxil 2925 cm-1
2924 cm-1
și 2927 cm-1
pentru -CH2 1652 cm-1
1654 cm-1
și 1649 cm-1
pentru amida I 1552 cm-1
și 1554 cm-1
pentru amida II [216] Pentru CaP au fost observate
picuri ale grupărilor fosfat la 601 cm-1
și 603 cm-1
iar pentru MNPs au fost observate picuri
caracteristice la 561 cm-1
și 563 cm-1
[99 160]
Figura 613 Spectrele FTIR ale suporturilor
Spectrele FTIR ale suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și al DOX sunt redate icircn figura
613B Spectrul DOX prezintă următoarele benzi caracteristice 2929 cm-1
pentru vibrația de
icircntindere a legăturii C-H 1730 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii C=O 1617 cm-1
și
157
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
1525 cm-1
pentru legătura NndashH 1411 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashC și 1286
cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashOndashC O parte din aceste benzi au fost observate și
pe spectrele corespunzătoare suporturilor S5-DOX și S9-DOX ceea ce sugerează interacțiunea
medicamentului cu celelalte componente ale suporturilor Alte picuri observate pe spectrele celor
două suporturi au fost 3446 cm-1
și 3440 cm-1
pentru gruparea ndashOH 2925 cmminus1
pentru ndashCH2
1654 cm-1
și 1656 cm-1
pentru amida I și altele cu valori apropiate de cele ale suporturilor fără
DOX (figure 613A)
Morfologia suporturilor realizate cu scopul de a fi utilizate icircn regenerarea osoasă este o
caracteristică foarte importantă de care trebuie să se țină cont icircn procesul de sinteză Aceste
suporturi trebuie să aibă porozitatea și dimensiunea porilor adecvate aplicației vizate Rețelele cu
pori interconectați influențează puternic procesul de nutriție a celulelor proliferarea și migrarea
acestora precum și vascularizare suportului [217] Rezultatele acestei analize au fost prezentate
icircn figura 614
Figura 614 Morfologia suporturilor
158
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
Influența radiaților asupra suporturilor a fost analizată și din punct de vedere al
interacțiunii cu fluidele de interes biologic și anume PBS pH = 72 001M S-a utilizat aceași
metodă volumetrică descrisă și icircn capitolele anterioare și s-a calculat gradul maxim de retenție
PBS utilizacircnd formula (14) redată icircn capitolul 2 Rezultatele obținute sunt prezentate icircn tabelul
64 și icircn figura 615
Tabel 64 Gradul de retenţie PBS al suporturilor
Nr crt Denumirea
suportului
Gradul
de retenţie PBS ()
1 S5 995 plusmn 30
2 S5R 1040 plusmn 35
3 S9 990 plusmn 50
4 S9R 987 plusmn 19
Figura 615 Gradul de retenție a suporturilor radiate și acelor neradiate
Diferența dintre valorile gradului de retenție pentru S5 și S5R este de aproximativ 45
iar icircntre S9 și S9R este nesemnificativă Icircn cazul suporturilor S5 și S5R diferență poate fi
explicată de dimensiunea neuniformă a porilor (figura 614) la fel ca și icircn cazul suporturilor
realizate pentru studiul reproductibilității ale cărui rezultate au fost prezentate mai sus Avacircnd
0
200
400
600
800
1000
1200
S5 S5R S9 S9R
Gra
dul m
axim
de
rete
nți
e P
BS
72 ore
159
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
această explicație pentru diferența dintre valorile obținute s-a putut afirma că radiațiile X nu
influențează interacțiunea suporturilor cu fluidele de inters biologic
Degradarea enzimatică a suporturilor a fost studiată utilizacircnd un amestec de două enzime
lizozim și colagenază metoda fiind descrisă icircn detaliu icircn capitolul 2
Potrivit lui Brouwer și colaboratorii [218] concentrația de lizozimă icircn serul uman este de
950-2450 μgL dar niveluri crescute pot fi observate icircn bolile benigne bolile inflamatorii
intestinale unele afecțiuni hematologice (policitemia vera mielomul multiplu) și procesele
maligne cum ar fi leucemiile [219] De exemplu Firkin [220] a raportat un nivel foarte ridicat al
lizozimului seric 30-120 μgml icircn leucemia mieloidă cronică și mielofibroza Icircn ceea ce privește
aceste date din literatură s-a ales o concentrație de 1200 μgml dat fiind că suporturile sunt
destinate tratamentului tumorilor osoase și probabil un nivel ridicat de lizozim va fi găsit icircn os
Deoarece colagenul este cea mai predominantă proteină din corpul uman nivelurile de
colagenază sunt greu de măsurat cu precizie această enzimă fiind găsită icircn toate țesuturile
organele icircn care există colagen Colagenaza interstițială are un rol-cheie icircn remodelarea normală
și patologică a matricelor extracelulare colagen inclusiv a țesutului osos și a țesutului conjunctiv
[221] De asemenea există diferite tipuri de colagenază de ex icircn pielea umană colagenază
secretată de fibroblastelor are două forme de proenzime (57 și 52 kDa) [222]
Rezultatele studiului au fost redate icircn figura 616A ndash reprezentacircnd concentrația de chitosan
degradat și 616B ndash reprezentacircnd concentrația de colagen degradat
Figura 616 A Concentraţia de chitosan degradat B Concentrația de colagen degradat
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
S5 S5R S9 S9R
(Conce
ntr
ația
de
Cs
deg
radat
) ∙
100
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
0
001
002
003
004
005
006
007
008
S5 S5R S9 S9R
Conce
ntr
ați
a de
cola
gen
deg
radat
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile A B
160
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Se observă icircn ambele cazuri o creștere graduală a concentrației de polimer degradat
chitosan respective colagen Valorile obținute sunt comparabile de unde s-a ajuns la concluzia
că radiațiile nu influențează nici interacțiunea suporturilor cu fluide biologice simulate icircn cazul
de față un complex de enzime icircn PBS pH=72 001M
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată prin contactul direct a suporturilor cu
osteoblastele liniei MG-63 figura 617
Valoarea viabilității calculată conform ecuației (15) din capitolul 2 scade icircn timp
fenomen observat și icircn celelalte studii de citoxicitate pe aceast tip de celule La 72 ore de la
contactul direct al celulelor cu fragmente de suport se observă o diferență de aproximativ 10
procente icircntre suporturile care nu au fost expuse radiațiilor și cele care au fost expuse Rezultatul
nu trebuie interpretat ca și negativ icircn condițiile icircn care rolul radiațiilor este de a distruge ceulele
tumorale osteoblastele Mg-63 fiind o linie de celule tumorale (osteosarcoame)
Radiațiile au fost absorbite de aceste suporturi cu o posibilă formare de radicali liberi fără
icircnsă a influența structura lor chimică morfologia și interacțiunea cu medii biologice simulate
Fenomenul este dificil de icircnțeles studii complexe fiind necesare icircn acest sens
Figura 617 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile
0
20
40
60
80
100
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itat
ea c
elula
ră
Control S5 S5R S9 S9R
161
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn concluzie rezultatele primei părți a studiului și anume studiul influenței radiațiilor X
asupra suporturilor au arătat rezultate icircncurajatoare structura chimică a suportului morfologia și
comportamentul de degradare enzimatică nu sunt influențate de razele X utilizate icircn radioterapie
ceea ce icircnseamnă că suporturile pot fi utilizate icircn continuare icircn chimioterapie
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale
Sistemele magnetice de eliberare controlată a medicamentelor au multiple avantaje față de
metodele normale cum ar fi abilitatea de a viza un anumit loc țintă icircn organism și reducerea
cantității de medicament necesară pentru a atinge o anumită concentrație la locul țintă ceea ce
implică o reducere a concentrației medicamentului icircn organele din vecinătate fiind minimizate
efectele secundare [223]
Doxorubicina - DOX este un potențial medicament pentru tratamentul metastazelor osoase
și a tumorilor osoase dar utilizarea sa este limitată de efectele secundare sistemice DOX este un
antibiotic antraciclinic care la nivel molecular interacționează cu ADN-ul și interferează cu
sinteza acidului nucleic rezultacircnd un efect remarcabil asupra transcripției AND [224 225]
Pentru aplicații icircn chimioterapia osoasă DOX este utilizat icircn sistemele de eliberare a
medicamentelor fabricate din diferite suporturi magneticecompozite apatită nanocristalină
[226] hidroxiapatită [227] chitosan și hidroxiapatită [228] acid poliglicic-co-glicolic -
polietilenglicol (PEG-PLGA) [87] microsfere magnetice
Icircn ceea ce privește eliberarea in vitro a DOX din suporturi o eliberare treptată poate fi
observată icircn figura 617
162
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 617 Curbele cinetice de eliberare a DOX din suporturi
Pentru suportul S5-DOX eliberarea a fost mai constantă icircn timp De remarcat este faptul că
aceast suport are o cantitate considerabilă de chitosan icircn compoziție comparativ cu S9-DOX
Trebuie reamintit fapul că toate MNPs utilizate icircn teza de față au fost acoperite cu chitosan
pentru o mai bună citocompatibiliate și pentru a putea lega principii active
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
Interacțiunea suporturilor preparate icircn sub-capitolul de față a fost studiată icircn paralel cu
interacțiunea suporturilor fără medicament icircncorporat pentru a putea realiza o analiză
comparativă S-a optat pentru contactul direct al fragmentelor de suport iar drept celule
tumorale s-au utilizat tot osteoblaste din linia MG-63 Rezultatele studiului sunt redate icircn figura
618
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 50 100 150 200 250 300 350
Conce
ntr
ați
a d
e D
OX
(μgm
L)
Timp ore
S5-DOX S9-DOX
163
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 618 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct A Cu soluții
de DOX de concentrații diferite B Cu suporturile avacircnd DOX icircn compoziție și a celor fără DOX
Viabilitatea celulară a suporturilor a fost aproape de 100 la primii 2 timpi de contact 24
și 48 ore atacirct pentru suporturile cu medicament cacirct și pentru cele fără medicament Icircnsă la 72 ore
de contact a suporturilor cu osteoblastele s-a observat o scădere semnificativă a viabilității
acestora valorile obținute fiind 64 pentru S5-DOX respectiv 75 pentru S9-DOX pentru
suporturile fără DOX valorile au scăzut nesemnificativ Această scădere bruscă de viabilitate ar
putea fi explicată de faptul cu DOX este eliberată treptat din suporturi la un raport relativ scăzut
proprietate de eliberare lentă a DOX poate fi utilizată și pentru că alte medicamente anti-
tumorale puternice sau combinații de medicamente ar putea fi transportate la desemnate zona și
eliberat la un raport optim pentru combaterea tumorilor [229]
164
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
63 Concluzii
Reproductibilitatea un experiment este foarte importantă icircn vederea transpunerii
rezultatelor obținute icircn practică Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi
preparate și caracterizate icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai
adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate
Pentru a demonstra reproductibilitatea metodei 7 suporturi avacircnd compoziţia
teoretică a lui S9 au fost preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a
compoziției din punct de vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn
fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate
celulară cu Calceină-AM
Toate analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă
este reproductibilă
Icircn a doua parte a studiului s-a testat potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircn primul racircnd s-a demonstrat că o doză de radiații X
similară cu cea utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile
suporturilor cum ar fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea
in vitro
Suporturile conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic
pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și
lentă a DOX sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn
terapia combinată a tumorilor osoase maligne
165
Concluzii generale
Concluzii generale
Osul este un țesut care are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn cazul unor
afecţiuni minore fiind supus de-a lungul vieții la procese biologice complexe de creştere
modelare şi remodelare Procesul de regenerare nu este suficient icircn cazul defecte osoase grave ce
au drept factori determinați principali rezecţiile de tumoră osoasă malformaţiile congenitale
unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita Toate acestea fac ca anual la
nivel mondial să fie utilizate peste 2 milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă
Materiale de substituţie osoasă pot fi clasificate icircn mai multe categorii grefe de origine naturală
(autogrefe alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria
tisulară precum şi diverse combinaţii ale acestora
Biomaterialele prelucrate sub divere forme (suporturi macroporase sisteme injectabile
capsule filme matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri și altele) sunt
elemente cheie icircn ingineria tisulară Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de
calciu s-au dovedit a fi o soluție promițătoare icircn ingineria tisulară și medicina regenrativă a
țesutului osos unele variante comerciale fiind folosite cu succes icircn practica clinică La
prepararea acestora trebuie să se țină cont și de nano-structura osului nu doar de compoziția sa
suporturile obținute prin procedee biomimetice fiind cele mai de succes
Nanoparticulele magnetice sunt folosite la o varietate de aplicații medicale clinice și
preclinice Eliberarea controlată de medicamente este un domeniu intens studiat icircn zilele noastre
iar utilizarea nanoparticulele magnetice icircn acest scop reprezintă un subiect de mare interes pentru
un număr considerabil de cercetători
Obiectivul central al lucrării de față a fost obținerea și caracterizarea de suporturi
compozite printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare a precursorilor de fosfați de calciu pe
un amestec de biopolimeri și nanoparticule magnetice pentru a fi testate icircn regenerarea osoasă
Biopolimeri utilizați au fost colagen chitosan acid hialuronic albumină serică bovină și
gelatină iar fosfații de calciu au fost obținuți din precursori pornindu-se de la un raport teoretic
CaP comparabil cu cel identificat icircn osul uman Nanoparticulele magnetice au fost incluse
pentru studii ce au vizat icircncorporarea și eliberarea controlată de principii biologice
166
Concluzii generale
Suporturile au fost caracterizate riguros din punct de vedere fizico-chimic și biologic S-a
icircnceput cu studiul structurii chimice a compoziției și morfologiei suporturilor după care s-a
studiat interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și cu soluții enzimatice
Proprietățile mecanice ale suporturilor au fost analizate din perspectiva modului de elasticitate
Young iar proprietățile magnetice din perspectiva susceptibilității magnetice a acestora Din
punct de vedere biologic suporturile au interacționat direct sau indirect cu diverse linii celulare
și s-au implantat sub-cutanat la șoareci icircn vederea determinării citotoxicității acestora Conceptul
de terapie combinată ce implică utilizarea radioterapii și chimioterapii a fost analizat icircntr-o
ultimă etapă pentru suporturile obținute
Pentru stabilirea compoziției optime s-au realizat icircn paralel suporturi pe bază de
biopolimer amestecuri diferite de biopolimeri (chitosan chitosan ndash acid hialuronic chitosan ndash
albumină serică bovină și chitosan ndash gelatină) și fosfați de calciu obținuți din precursori raportul
teoretic CaP fiind de 165 Trei concentrații diferite de nanoparticule (1 3 5 ) au fost
icircncorporate pe racircnd icircn sinteza celor patru tipuri de suporturi Structura chimică și compoziția
suporturilor au indicat prezența picurilor caracteristice componetelor incluse icircn sinteză Datele cu
privire la compoziția suporturilor au indicat prezența unor tipuri de fosfați de calciu identificați și
icircn literatură preponderenți fiind hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul monocalcic anhidru
Ca(H2PO4)2 fosfatul tricalcic (Ca3(PO4)2) S-a calculat magnetizarea suporturilor concentrația
de 5 fiind cea mai apropiată de datele regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective Studiile
privind interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic soluții enzimatice și celule au
indicat o corelație icircntre porozitatea materialelor și proprietațile de interacțiune cu fluide și medii
biologice
Avacircnd icircn vederea datele obținute anterior obiectivul următor a fost realizarea și
caraterizarea de suporturi pe bază de colagen ndash chitosan ndash acid hialuronic nanoparticule
magentice și fosfați de calciu S-a selectat concentrația de 5 MNPs pentru a fi inclusă icircn etapă
de sinteză particulele fiind introduse icircn formă uscată O parte din proprietățile suporturilor au
fost studiate icircn paralel cu cele ale suporturilor expuse la radiații UV timp de 4 ore cu scopul de a
observa eventuale modificări survenite după această procedură de iradiere folosită icircn practica
clinicăpreclinică pentru sterilizare Nu au fost observate diferențe icircn ceea ce privește structura
167
Concluzii generale
chimică și morfologia suporturilor Gradul de retenție PBS a fost influențat semnificativă de
raportul CaP Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul ambilor
biopolimeriValorile obţinute pentru modului lui Young sunt comparabile cu cele ale ţesutului
osos spongios uman Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor Interacțiunea in vitro cu
celule (fibroblaste și osteoblaste) a dovedit faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor caracterul non-citotoxic fiind evidențiat de un test sub-cutanat in vivo
Respectacircnd compoziția de biopolimeri și fosfați de calciu precum și concentrația de
MNPs un lot nou a fost realizat diferența față de cel descris anterior fiind dată de metoda de
includere a MNPs și anume au fost introduse sub formă de suspensie coloidală icircn apă
urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura suporturilor S-au
utilizat aceleași tehnici de caracterizare ca cele descrise la punctul anterior Icircn plus un studiu mai
detaliat al morfologiei a fost realizat cu ajutorul analizei microCT Rezultatele au indicat o
influenţă semnificativă a conţinutului de fază minerală asupra porozităţii suporturilor
Proprietățile mecanice ale suporturilor sunt comparabile cu cele ale țesutului osos spongios iar
din punct de vedere al proprietăților magnetice suporturile sunt superparamagnetice
Interacțiuneain vitro a suporturilor cu celule a fost testată pe fibroblaste osteoblaste și celule
STEM Un test MTT standard a evidențiat faptul că suporturle nuafectează celulele cele mai
bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost
studiată pe șoareci femele din linia CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de
la implantarea subcutanată a fragmentelor sterilizate de suporturi iar icircn final s-a ajuns la
concluzia că suporturile nu au efect toxic in vivo Totodată s-a observat asimilarea și resorbția
suporturilor
Icircn urma unor analize detaliate ale celor două loturi de suporturi preparate și caracterizate
icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia
vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate Pentru evaluarea
reproductibilității metodei de obținere șapte suporturi avacircnd compoziţia teoretică a lui S9 au fost
preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a compoziției din punct de
vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
168
Concluzii generale
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM Toate
analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă este reproductibilă
Potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne a fost
studiată icircmtr-o ultimă etapă Inițial s-a demonstrat că o doză de radiații X similară cu cea
utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile suporturilor cum ar
fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea in vitroSuporturile
conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic pentru tratamentul
metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și lentă a DOX
sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn terapia combinată
a tumorilor osoase maligne
2413 Difracţie cu raze X (XRD) 66
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor 67
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM) 67
2422 Micro computer-tomografia (microCT) 68
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor 68
244 Propritățile magnetice ale suporturilor 70
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic 71
246 Studii de degradare enzimatică in vitro 72
247 Teste de citotoxicitate in vitro 76
2471 Testul MTT 78
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 79
248 Teste de citotoxicitatea in vivo 80
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
81
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi 82
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază
de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și
fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
83
31 Obţinerea suporturilor 85
32 Rezultate și discuții 86
321 Structura chimică a suporturilor 86
322 Compoziția suporturilor 87
323 Morfologia suporturilor 90
324 Proprietăţi magnetice 91
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 92
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 94
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 96
3271 Testul MTT 96
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 97
33 Concluzii 99
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
100
41 Obținerea suporturilor 100
42 Rezultate și discuții 103
421 Structura chimică a suporturilor 103
422 Morfologia suporturilor 105
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 106
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 108
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat 108
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat 109
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 110
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor 112
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro 113
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor 114
43 Concluzii 117
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
119
51 Obţinerea suporturilor 119
52 Rezultate și discuții 122
521 Structura chimică a suporturilor 122
522 Compoziția suporturilor 123
523 Morfologia suporturilor 124
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor 127
525 Proprietăţilor magnetice ale suporturilor 128
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 129
527 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 130
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat 130
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat 131
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 132
5281 Testul MTT 133
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 133
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor 134
53 Concluzii 139
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
141
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
141
611 Obținerea suporturilor 142
612 Rezultate şi discuţii 143
6121 Structura chimică a suporturilor 143
6122 Morofologia suporturilor 144
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 146
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 146
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor 147
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 148
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
150
621 Obținerea suporturilor 152
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor 152
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină 154
624 Rezultate și discuții 155
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor 156
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
158
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 160
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale 161
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
162
63 Concluzii 164
Concluzii generale 165
1
Introducere
Introducere
Impactul clinic cacirct şi cel economic pentru tratamentul afecţiunilor osoase este uluitor osul
fiind al doilea cel mai transplantat ţesut după transfuziile de sacircnge Numeroase metode de
reconstrucţie a defectelor osoase sunt disponibile icircn practica clinică fiind utilizate autogrefe
alogrefe matrice osoasă demineralizată materiale metalice sau ceramice proteine osoase
morfogenetice factori de creştere și altele Succesul acestor materiale este icircnsă unul limitat
fiecare din ele prezentacircnd dezavantaje considerabile Icircn icircncercarea de a oferi o soluție pentru
rezolvarea problemei menționate tot mai mulți cercetători și-au icircndreptat atenția spre realizarea
de noi materiale pentru ingineria tisulară și regenerarea țesutului osos materiale cu proprietăți și
interacțiuni controlabile Aceste materiale se găsesc sub diverse forme de prezentare suporturi
poroase tridimensionale sisteme injectabile capsule filmemembrane și matrici fibroase și
nano-fibroase hidrogeluri
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă constă icircn rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea
unui material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și
regenerare osoasă ar putea fi un suport compozit poros cu incluziune de particule magnetice
Principalul motiv pentru care se optează pentru un suport compozit este acela că osul natural la
racircndul său este un compozit matricea extracelulară a țesutului osos fiind reprezentată de 60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă
Particulele magnetice care urmează a fi incluse icircn suporturi vor fi funcționalizate cu diferiți
bio-agenți factori de creștere medicamente cu efect chimioterapic icircn vederea unei eliberări
țintite ale principiilor active enumerate Unul din marele dezavantaje ale chimioterapiei efectele
adverse asupra stării generale a pacienților ar putea fi astfel icircnlăturat medicamentele acționacircnd
controlat doar la locul tumori osoase
Obiectivul central al tezei de față vizează obținerea unor astfel de suporturi pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice Cele mai importante
proprietățile impuse unor astfel de suporturi sunt biocompatibilitate lipsa toxicității proprietăți
de suprafață adecvate incluziuni și proliferării celulare osteoconductivitate osteoinductivitate
rata de degradare controlată proprietăți mecanice comparative cu cele ale osului natural etc De
2
Introducere
asemenea foarte important este ca suportul să fie biomimetic icircn vederea integrării adecvate icircn
osul gazdă
Teza de față este structurată icircn două secțiuni principale stadiul actual al cercetărilor icircn
domeniul vizat și rezultate originale
Prima secțiune sintetizează date de literatură și este reprezentată de primul capitol A doua
secțiune este formată din 5 capitole capitolul 2 prezintă materialele și metodele utilizate pentru
obținerea rezultatelor originale prezentate icircn capitolele 3 4 5 și 6
Capitolul 1 prezintă pe scurt date despre anatomia fiziologia și patologia țesutului osos
deoarece fără cunoșterea acestor noțiuni ar fi imposibil de realizat un suport care să permită
regenerarea adecvată a țesutului osos Capitolul cuprinde informații despre materialele deja
utilizate icircn practica clinică pentru regenerarea osoasă și variantele aflate icircn stadiul de cercetare
fiind prezentate pe scurt o parte din cele mai utilizate biomateriale icircn domeniul vizat O atenție
deosebită este acordată suporturilor biomimetice prin prezentarea caracteristicilor acestora
metodelor de obținere a acestora și a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
După un studiu amănunțit a suporturilor magnetice realizate și caracterizate pacircnă icircn prezent icircn
literatura de specialitate s-a realizat o clasificare a acestora icircn funcție de biomaterialele de bază
utilizate icircn sinteza acestora
Capitolul 2 redă inițial strategia experimentală și obiectivele lucrării de față după care sunt
enumerate caracteristicile principale ale materialelor utilizate pentru prepararea suporturilor și a
celor utilizate pentru caracterizarea acestora De asemenea sunt prezentate etapele procesului de
preparare a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule
magnetice precum și metodele de caracterizare a suporturilor obținute Sub capitolul Metode de
caracterizare evidențiază principiile de bază ale tehnicilor folosite condițiile de lucru parametrii
și dispozitivile utilizate
Capitolul 3 a avut drept scop principal realizare și caracterizarea unor suporturi compozite
folosind patru combinații diferite de biopolimeri și trei concentrații diferite de nanoparticule
magnetice Icircn urma analizei structurii chimice a suporturilor a compoziției și morfologiei
acestora a proprietăților magnetice precum și a interacțiunii suporturilor cu fluide de interes
biologic enzime și celule se vor stabili biopolimerii și concentrația de nanoparticule ce vor fi
utilizate icircn capitolele următoare
3
Introducere
Un program experimental s-a utilizat pentru a obține 13 suporturi pe bază de colagen
chitosan acid hialuronic și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată capitolul 4 prezentacircnd prepararea și caracterizarea acestora Pe lacircngă analizele realizate
pentru suporturile din capitolul 3 s-au analizat și proprietățile mecanice ale celor 13 suporturi
precum și citotoxicitate lor in vivo ultimul experiment menționat avacircnd o durată de 21 zile
Același program experimental și aceeași compoziție a suporturilor a fost utilizată și pentru
prepararea suporturilor descrise icircn capitolul 5 diferența fiind dată de faptul că particulele au fost
icircncorporate sub formă de suspensie coloidală Morfologia acestor suporturi a fost studiată icircn
detaliu cu ajutorul tehnicii microCT iar testele de toxicitate in vivo realizate pe aceași specie de
animale utilizate icircn capitolul anterior a avut o durată de mai mare de 64 zile
Capitolul 6 este structurat icircn două părți Prima parte prezintă reproductibilitatea metodei de
preparare a suporturilor iar a doua parte studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircntr-o primă etapă suporturile au fost iradiate cu o doza
unică de raze X administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase fiind analizată apoi
influența radiațiilor asupra proprietăților fizico-chimice și biologice a suporturilor A doua etapă
a studiului a constat icircn icircncărcarea nanoparticulelor incluse icircn suporturi cu doxorubicină
(medicament utilizat icircn practica clinică pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor
osoase) urmată de caracterizarea suporturilor obținute
Lucrarea se icircncheie cu un capitol de concluzii generale și bibliografia cosultată pentru
realizarea acesteia
4
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice pentru regenerarea osoasă
Osul este un țesut conjuctiv specializat dinamic care este suspus unui proces de
remodelare continuă pe parcursul vieții Are rolul atacirct de țesut cacirct și de organ funcțiile sale de
bază fiind de protecție a organelor vitale din cavitatea craniană toracică și a măduvei spinării de
suport a sistemului locomotor Matricea extracelulară a țesutului osos are o componentă organică
și o component anorganică iar celulele țesutului osos sunt osteoblastele osteocitele celulele de
suprafață și osteoclastele Din punct de vedere morfologic osul este fie spongios (trabecular) fie
compact (cortical) Țesutul osos spongios este asociat cu funcțiile metabolice iar țesutul osos
compact este asociat cu rezistența mecanică [1]
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta aceste
defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare Chiar dacă decenii icircntregi autogrefele
au fost utilizate cu precădere dezavantajele acestora au condus la cercetări riguroase pentru
fabricarea unor grefe osoase realizate din biomateriale (polimeri materiale ceramice materiale
metalice) Ingineria tisulară combină cu succes principiile biologiei țesutului osos și principiile
disciplinelor inginerești contribuind la consolidarea pierderilor osoase prin intermediul unor
matrici numite suporturi [2] Icircncorporarea unor sisteme de eliberarea controlată de principii
biologice icircn interiorul suporturilor vor conduce la rezultate remarcabile Nanoparticulele
magnetice funcționalizate pot fi un exemplu de astfel de sisteme
11 Ţesutul osos Structură Fiziologie Patologie
Țesutul osos este un organ foarte important pentru organismul viu Formarea sa este
moderată de mecanisme centrale și locale prin intermediul cărora este remodelat constant icircncă
din viața intrauterină și pe tot parcursul vieții pentru menținerea arhitecturii sale
microstructurale Procesul de remodelare este coordonat de activitățile osteoblastelor și
osteoclastelor care la racircndul lor sunt reglementate de procesele fiziologice de la nivel tisular și
de răspunsul la stimuli biomecanici
5
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
111 Funcțiile țesutului osos
Osul oferă protecție unor organe vitale și joacă de asemenea un rol important icircntr-o serie
de funcții fiziologice hematopoieză menținerea echilibrului acido-bazic funcția de rezervă
minerală funcția de suport a sistemului locomotor
Figura 11 Funcțiile țesutului osos [3]
Canalele medulare ale oaselor lungi găzduiesc celule stem mezenchimale capabile să se
diferențieze icircn precursorii hematopoietici care icircn cele din urmă dau naștere celulelor sanguine
mature
Icircn ceea ce privește menținere echilibrului acido-bazic oasele asigură organismului soluții
tampon carbonat și fosfat icircn timpul acidozei metabolice cronice proces observat icircn acidoza
renală tubulară și acidoza uremică Carbonatul de calciu este cel mai important dintre
componentele acestor soluții tampon asiguracircnd rezervorul de ioni de bicarbonat
6
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Din punct de vedere al rezervei de minerale țesutul osos este rezervorul a aproximativ
85 din fosforul din organism și 99 din calciu din organism
Osul are o rezistență mare la compresiune dar la forțe mari de tracțiune sau tensiune poate
fi fracturat Procentul mare de colagen din matricea organică (90 ) conferă un grad de
elasticitate considerabil țesutului osos dar cu toate acestea osul este un compozit casant [4]
112 Structura ţesutului osos
Țesutul osos este un material compozit format dintr-o matrice extracelulară şi din celule
proprii organizat pe cinci niveluri ierarhice (figura 12) macrostructura osului microstructura
osului sub-microstructura osului nanostructura osului și sub-nanostructura osului [5] [6]
Macrostructura osului este reprezentată de cele două tipuri de țesut osos compact icircntalnit
icircn literatură și sub denumirea de țesut osos cortical și spongios icircntalnit și sub denumirea de țesut
osos trabecular iar microstructura osului (10-500 microm) este reprezentată de componentele celor
două tipuri de țesuturi Țesutul osos cortical are o structură densă fiind format din sistemul
Haversian care la racircndul său este format dintr-un spațiu ce conține vase de sacircnge numit canal
haversian icircnconjurat de lamele osoase ce reprezintă sub-microstructura țesutului osos (1-10
microm) Țesutul osos spongios are o densitate mai mică decacirct a țesutului osos compact și este
format din spații areolare neregulate delimitate de trabecule osoase Spațiile areolare conțin
măduvă hematogenă bogată icircn sacircnge Icircn general țesutul osos compact reprezintă 80 din
sistemul osos dar distribuția celor două tipuri de țesut diferă icircn funcție de regiune
Figura 12 Organizarea structural ierarhică a osului [5]
7
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Nanostructura osului (cacircteva sute de nanometri ndash 1 microm) este reprezentată de fibrele de
colagen și de faza minerală iar sub-nanostructura osului (mai puțin de cacircteva sute de nanometri)
este reprezentată de structura moleculară a componentelor [7] [8]
1121 Matricea extracelulară
Matricea extracelulară este compusă dintr-o componenta organică ce reprezintă 33 din
masa uscată a matricei și o componenta anorganică ce reprezintă 67 din masa uscată a matricei
Componenta organică este formată icircn proporție de 90 din proteine colagenice
predominant colagen de tip I iar restul compoziției reprezintă proteine non-colagenice factori de
creștere și proteine morfogentice osoase Din proteinele non-colagenice regăsite icircn os fac parte
ostocalcina osteopontina fibronectina și sialoproteina osoasă II Osteocalcina cea mai
abundentă proteină non-colagenică din ţesutul osos reprezentacircnd 10-20 din cantitatea totală
are un rol important icircn procesul de mineralizare deoarece se leagă de cristalele de hidroxiapatită
[9] Osteopontina este o glicoproteină fosforilată icircntacirclnită icircn aproape toate ţesuturile
organismului uman piele creier fluidul sanguin cartilaj şi o varietate de tumori Osteonectina
este o glicoproteină bogată icircn cisteină care icircn procesul de mineralizare leagă colagenul de
hidroxiapatită avacircnd rolul unui nucleu de mineralizare reglacircnd formarea şi creşterea cristalelor
de hidroxiapatită [10] De asemenea icircn matricea organică au fost identificați glicozaminoglicanii
nesulfataţi (acid hialuronic) şi sulfataţi (condroitinsulfatul şi keratansulfatul)
Glicozaminoglicanii sulfataţi sunt legaţi covalent de molecule proteice formacircnd proteoglicani icircn
țesutul osos cei mai de icircntacirclniți fiind proteoglicani bogați icircn leucină cu masă moleculară mică
Componenta anorganică este reprezentată icircn cea mai mare parte din ioni de fosfat și ioni
de calciu Pe lacircngă acești ioni se găsesc icircntr-o cantitate considerabilă și bicarbonat sodiu
potasiu citrat magneziu carbonat fluor zinc bariu și stronțiu Ionii de calciu și fosfat formează
cristale de hidroxiapatită care se depun pe matricea colagenică proces icircn urma cărui rezultă
proprietățile de rezistență și rigiditate a țesutului osos [10] [11]
Matricea extracelulară osoasă constituie un cadru complex și organizat care oferă suport
mecanic și exercită un rol esențial homeostaza osoasă Matricea osoasă poate elibera mai multe
molecule care influențează activitatea celulelor osoase și prin urmare influențează procesul
complex de remodelarea osoasă Studiile icircn domeniu au indicat că doar pierderea masei osoase
8
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
este insuficientă pentru a provoca fracturi osoase alți factori inclusiv modificări ale proteinelor
matricei osoase au o contribuție colosală icircn producerea fracturilor osoase [12] [13]
1122 Celulele țesutului osos
Țesutul osos are icircn componență patru tipuri de celule osteoblaste osteoclaste osteocite și
celule de suprafaţă (figura 13)
Figura 13 Celulele țesutului osos
Osteoblastele celule localizate pe suprafața osului sunt derivate din celule stem
mezenchimale reprezentacircnd 4-6 din totalul de celule osoase Se găsesc icircn țesuturile tinere dar
apar și icircn condiții patologice Din punct de vedere morfologic sunt celule cu formă cubică de
dimensiuni mari (15-20 microm) ce prezintă caracteristici specifice celulelor implicate icircn sinteza
proteinelor reticulul endoplasmatic rugos și complexul Golgi ambele bine dezvoltate precum și
numeroase vezicule de secreție ce conțin precursori de matrice osoasă incluziuni lipidice și
mucopolizaharide Osteoblastele au un rol foarte important icircn procesul de formare al osului
Sinteza matricei osoase are loc icircn două etape depunerea matricei organice urmată de
mineralizarea acesteia Icircn etapa de depunere a matricei organice osteoblastele secretă proteine
colagenice non-colagenice și proteoglicani iar etapa a doua cea de mineralizarea a matricii
organice are o faza veziculară și o fază fibrilară [11]
Osteocitele sunt cele mai abundente celule osoase reprezentacircnd aproximativ 95 din
totalul acestora Sunt osteoblaste mature care ocupă spațiul lacunar fiind icircnconjurate de matrice
osoasă Ca și particularitate structurală osteocitele au prelungiri citoplasmatice asemănătoare
dendritelor neuronilor care formează o rețea de comunicare icircntre ele și suprafața osoasă Durata
9
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de viață a osteocitelor a fost estimată de Frost și colaboratorii [14] la 25 de ani dar acest lucru
nu poate fi apreciat cu exactitate deoarece procesul de remodelare osoasă presupune o reicircnnoire
a țesutului osos cu 4-10 pe an Icircn orice caz durata de viață a osteocitelor este cu mult mai
mare decacirct a osteoblastelor care au un ciclu de viață de aproximativ 3 luni Totodată nici rolul
osteocitelor nu este icircnțeles pe deplin numeroase studii concentracircndu-se pe asta [15]
Osteoclastele denumite și macrofagele ţesutului osos sunt celule multinucleate
diferențiate din celule stem hematopoetice sub influența a numeroși factori cum ar fi factorul de
stimulare a coloniilor de macrofage (M-CSF) și factorul de legătură nucleic kappa-B (RANKL)
M-CSF este secretat de celulele mezenchimale osteoprogenitoare și de osteoblaste iar RANKL
este secretat de osteoblaste osteocite și celule stromale Acești factori susțin activarea
transcripției expresiei genice icircn osteoclaste Osteoclastele conţin următoarele enzime fosfatază
acidă protează enzime oxidoreducătare ale glicolizei datorită cărora au o activitate enzimatică
intensă şi fagocitară Resorbţia osului nemineralizat (osteoidul) nu este realizată de osteoclaste
ci de elemente macrofagice histiocitare Osteoclastele intra icircn stare de repaus cacircnd formarea
osului definitiv este terminată Celulele redevin active icircn caz de fractura cacircnd are loc formarea
calusului [11] [8]
Celulele de suprafaţă sau bordantă sunt celule ce acoperă suprafeţele osoase icircn locurile
unde nu are loc nici resorbția nici formarea osoasă doua etape importante ale procesului de
remodelare osoasă Din punct de vedere structural sunt celule cu nucleu turtit o citoplasmă care
se extinde pe suprafața osoasă și doar cacircteva organite citoplasmatice cum ar fi aparatul Golgi
sau reticulul endoplasmatic rugos Funcțiile acestor tipuri de celule nu sunt pe deplin icircnțelese dar
studiile icircn domeniu susțin ideea că aceste celule au un rol important icircn prevenirea interacțiunii
directe dintre osteoblaste și matricea osoasă și totodată participă la procesul de diferențiere a
osteoclastelor
113 Fiziologia ţesutului osos
Pe parcursul icircntregii vieţii osul este supus proceselor biologice complexe procese de
creştere icircn lungime şi grosime modelare şi remodelare La racircndul lor la baza acestora stau
procesul de osteogenză ce constă icircn producerea de țesusut osos și osteoliză ce constă icircn
distrucția de țesut osos [8]
10
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1131 Osteogeneza și osteoliza
Osteogeneza este procesul de formare a osului osteoblastele fiind elementele esențiale icircn
acest proces Funcţionalitate osteoblastelor este controlată de molecule semnal hormoni factori
de creştere şi citokine [10] Pe scurt osteogeneza are trei pași de bază sinteza matricei
extracelulare organice (osteoid) mineralizarea matricei ce conduce la formarea osului și
remodelarea osului prin procesele de resorbție și reformar [16] Prin acţiunea concentrată a
moleculelor semnal osteoblastele produc icircntr-o primă etapă toate componentele matricei
organice a ţesutului osos ce va fi eliberată pe icircntreaga suprafaţă sub forma de osteoid
nemineralizat Pe seama precursorilor preluaţi din mediul extracelular se realizează după
modelul sintezei proteice sinteza matricei organice Concomitent cu producerea de matrice
organică are loc procesul de mineralizare a acestei ce reprezintă legarea substanţei anorganice de
matricea proteică o legatură particulară icircntre sărurile minerale şi proteină fiind realizată icircn urma
acestui proces La procesul mineralizării contribuie numeroşi factori locali şi generali un rol
cheie fiind jucat de factorii inhibitori naturali ioni de magneziu citrați pirofosfați și nucleotide
Icircn țesuturile conjuctive nemineralizate factorii anterior enumerați au o concentrație superioară
comparativ cu țesuturile conjuctive mineralizate Icircn cazul țesutului osos fosfataza alcalină
secretată de osteoblaste distruge parțial acești factori făcacircnd posibil procesul de mineralizare
Procesul de osteoliză ce corespunde distrucției osoase este atribuit osteoclastelor Procesul
icircncepe cu demineralizarea matricei osoase urmată de hidroliza enzimatică a componentelor
organice formacircndu-se zone de eroziune osoasă Pentru realizarea resorbţiei osteoclastul trebuie
să adere la o suprafaţă osoasă şi să formeze compartimentul subosteoclastic Icircnsă suprafeţele
osoase au o peliculă fină de matricea extracelulară nemineralizată acoperită de un strat de
osteoblaste icircntre care se stabilesc joncţiuni distanţate icircngreunacircnd fixarea osteoclastelor pe
suprafeţe osoase Osteoblastele au receptori pentru parathormon și 125-dihidroxicolecalciferol
prin stimularea cărora are loc restricția osteoblastelor urmată de eliberarea suprafeței osoase Prin
cuplarea substanțelor stimulante cu receptori specifici se declanșează sinteza de activator al
plasminogenului și sinteza de colagenază latentă urmate de activarea colagenazei latente de
către plasmină Activarea colagenazei va avea drept consecință icircndepărtarea peliculei de matrice
nemineralizată continuacircnd cu atașarea osteoclastelor [8]
11
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1132 Creşterea osului
Creşterea osului icircntacirclnită și sub denumirea de organogeneză osoasă este etapa care
urmează procesului de osteogeneză normală avacircnd drept rezultat formarea osului și a
articulaţiilor Mai precis constă icircn formarea şi creşterea oaselor icircn lungime icircn grosime şi
asigurarea formei epifizelor Pentru fiecare element osos există un punct de osificare specific icircn
care icircncepe formarea osoasă la o anumită vacircrstă [17] Se poate vorbi de două tipuri de osificare
osificarea endoconjunctivă sau intramembranară și osificarea endocondrală
Osificarea intramembranară este caracterizată de invazia capilarelor icircn zona mezenchimală
și de diferențierea celulelor mezenchimale icircn osteoblaste mature care vor depozita matrice
osoasă conducacircnd la formarea de corpusculi osoși Acești corpusculi vor crește și se vor
dezovolta iar apoi vor fuziona cu alți corpusculi și vor forma trabecule ososase Pe măsură ce
trabeculele osoase cresc icircn dimensiune și icircn număr devin interconectate formacircnd o formă de țesut
osos Această formă de țesut osos este o structură fără rezistență dezorganizată și are un număr
mare de osteocite Osificarea intramembranară are loc icircn timpul dezvoltării embrionare și este
implicată icircn formarea oaselor plate din structura cutiei craniene unele oase faciale o parte din
mandibulă și claviculă și adăugarea de țesut osos nou la diafiza majorității oaselor
Osificarea endocondrală utilizează proprietățile funcționale ale cartilajului și osului pentru
a asigura un mecanism de formare și creștere a scheletului Combinarea condrogenezei și a
osteogenezei icircn vederea osificării osoase este dependent de nivelul de vascularizare a cartilajului
de creștere Icircn figura 14 sunt prezentate la general etapele procesului de osificare endocondrală
[18] Osificarea endocondrală are 6 etape Celule mezenchimale se vor concentra (A) și se vor
diferenția icircn condrocite formacircnd un cartilaj nevascularizat (B) Icircn centrul cartilajului format
condrocitele se vor opri din proliferare și vor deveni hipertrofice (C) Condrocitele din
vecinătatea celor hipertrofice se vor diferenția icircn osteoblaste acestea din urmă formacircnd un colier
osos (D) Icircn continuare condrocitele hipertrofice vor regla formarea de matrice mineralizată Icircn
același timp icircn această etapă are loc eliberarea de factori angiogenetici care vor atrage vase de
sacircnge după care condrocitele hipertrofice vor intra icircn apoptoză (E) Coordonarea osteoblastelor
și invazia vaselor de sacircnge vor avea drept rezultat formarea țesutului spongios primar
Condrocitele se vor prolifera icircn continuare și icircn același timp va avea loc vascularizarea osului
aceste două etape contribuind la creșterea icircn lungime a osului Osteoblastele din colierul osos vor
12
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
contribui la formarea osului cortical pe cacircnd cele din țesutul spongios primar vor contribui la
formarea țesutului spongios final (F)
Figura 14 Osificarea endocondrală [18]
1133 Remodelarea osului
Osul este un organ activ remodelat pe tot parcursul vieții Procesul de remodelare osoasă
cuprinde patru faze distincte ce se desfăşoară permanent icircn anumite locuri faza de repaus faza
de resorbţie osoasă faza de inversie şi faza de formare reprezentate schematic icircn figura 15 Icircn
faza de repaus suprafaţa ţesutului osos este acoperită de celule de suprafaţă ancorate icircn matricea
mineralizată Icircn faza de resorbţie osoasă rolul principal revine osteoclastelor care vor forma o
cavitate numită lacună de resorbţie (lacuna Howship) Resorbţia are loc icircn două etape
demineralizarea fazei osoase și distrugerea fazei osoase Icircn faza de inversie are loc apariția
osteoblastelor icircn zona erodată ce vor acoperi lacuna de resorbţie printr-o depozitare activă de os
nemineralizat osteoid Osteoidul se depune pacircnă cănd grosimea acestuia ajunge la 20 microm
urmacircnd faza de mineralizare Pe măsură ce osteoidul este mineralizat locul unde a avut loc
remodelarea va fi icircnlocuit cu un os nou [19]
13
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 15 Remodelarea ţesutului osos
114 Patologia osoasă
Patologia osoasă poate fi de cauza traumatică ndash fractură sau netraumatică Icircn funcţie de
cauza fracturii putem vorbi de fracturi determinate de un accident traumtic fracturi de oboseală
şi fracturi de os patologic Cauzele netraumatice care pot cauza o anumită patolgie osoasă sunt
infecţiile osului tumorile osului și deformaţiile osului [17]
1141 Tumori osoase
Icircn literatura de specialitate tumorile sunt icircntalnite și sub denumirea de neoplasme și se
definesc ca proliferări tisulare anormale autonome persistente neconcordante cu ţesuturile din
jur care se dezvoltă continuu chiar și după icircncetarea stimului care a determinat proliferarea și nu
răspund la mecanisme normale de control ce guvernează creştere Icircn funcție de caracteristicile
morfo-funcționale și de evoluția acestora tumorile se clasifică icircn tumori begine şi tumori
maligne Cele benigne sunt caracterizate prin margini bine definite au o creştere lentă şi locală
sunt neinvazive şi compresive circumscrise şi icircncapsulate prezintă mitoze rare nu diseminează
icircn alte ţesuturi şi organe (non-metastazante) avacircnd un prognostic bun Tumorile maligne sunt
14
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
caracterizate prin margini nedefinite au o creştere rapidă fiind infiltrative şi icircncapsulante
invazive şi distructive sunt metastazante şi au un prognostic rezervat
Metastazarea reprezintă răspacircndirea celulelor maligne din tumora primară icircn organele
ţesuturile sau cavităţile organismului Comună majorităţii cancerelor umane metastazarea
transformă o tumoră de organ icircntr-o boală sistemică Este un proces complex multistadial şi
dinamic avacircnd la bază o serie de procese subtile interconectate ce rezultă din interacţiunile
gazdei cu tumora Fiecare etapă metastatică este subiectul unor influenţe multiple indispensabile
celulei maligne pentru a supravieţui variaţiilor de mediu (prin dobandirea de noi mutaţii) ce icirci
permit acesteia să invadeze ţesuturile vecine să patrundă icircn sistemul circulator (calea majoră de
răspacircndire prin vasele de sacircnge şisau limfatice) să extravazeze icircn ţesuturi noi să dezvolte un
sistem vascular propriu care să icircicirc suţină dezvoltarea şi chiar uneori să permită metastazei să dea
naştere la noi metastaze [20] [21]
Figura 16 Clasificarea tumorilor osoase
15
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Domeniul de patologie osteoarticulară icircn care se icircncadrează şi tumorile osoase este un
domeniu foarte vast şi delicat nu este constant fiind adesea descoperite noi metode de
diagnostic şi tratament ce ameliorează sau chiar schimbă radical prognosticul multor tumori
osoase Una din principalele probleme icircn ceea ce priveşte diagnosticul şi tratamentul tumorilor
osoase este aceea că nu există o separare netă icircntre tumora benignă şi tumora malignă
Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) propune o clasificare a tumorilor osoase bazată pe
capacitatea de diferenţiere a acestora ceea ce icircnseamnă că sunt grupate din punct de vedere
histologic şi citologic al ţesutului pe care acestea icircl reproduce clasificare redată icircn figura 16
[22]
Metastazele sunt cele mai icircntalnite tumori din os Acestea sunt considerate tumori
secundare osoase deoarece tumora primară nu icircşi are originea icircn os tipurile de cancer care dau
cel mai frecvent metastaze osoase fiind cancerul de prostată cancerul de sacircn şi cancerul
pulmonar Tumorile osoase primare cum sunt osteosarcoamele sau condrosarcoamele sunt
destul de rare statisticile sugeracircnd că doar icircn 1 din 20 cazuri de tumori osoase este vorbă de o
tumoră primară Cea mai frecvent intalnită tumoră osoasă primară este mielomul cu celule
plasmatice ce apare la pacienţi cu vacircrstă peste 40 ani urmată de diverse sarcoame Dintre
sarcoamele osoase primare ce reprezintă 02 din toate neoplasmele cele mai comune sunt
osteosarcoamele ndash 35 condrosarcoamele ndash 25 sarcomul Ewing ndash 16 condroamele ndash 8 şi
histiocitoamele maligne fibroase ndash 5
Incidenţa tumorilor primare benigne este mai dificil de determinat deoarece nu se
realizează biopsie pentru toate leziunile nou descoperite Atacircta timp cacirct leziunile pot fi complet
caracterizate ca şi bengine pe baza datelor clinice şi imagistice biopsia sau rezecţia sunt
nepotrivite şi neadecvate Cele mai comune tumori osoase benigne sunt următoarele
osteocondroamele ndash 35 encondroamele ndash 20 tumorile cu celule gigante ndash 15 osteomul
osteoid ndash 10 şi displazia fibroasă (maladia Jaffeacute) ndash 5 Icircn ciuda caracterului benign al
tumorilor tratamentul acestora trebuie să fie cacirct mai eficient posibil De exemplu o tumoră cu
celule gigante extinsă icircn suprafaţa articulară tibială poate duce la o fractura patologică dacă nu
este tratată adecvat
Tratamentul fiecărei tumori osoase depinde de mai mulţi factori caracterul benign sau
malign localizarea leziunii istoricul afecţiunii nivelul durerii Icircn cazul tumorilor benigne
icircndepărtarea leziunea urmată de grefarea sau biopsia excizională conduc icircn general la rezultate
16
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
bune Totuşi aceste două metode de tratament pot fi inadecvate icircn cazul tumorilor maligne atacircta
timp cacirct celule tumorale reziduale rămacircn la marginea leziunii Limfoamele osoase pot fi tratate
cu chimioterapie sau radioterapie fără a fi necesară o intrevenţie chirurgicală Alte tumori cum
ar fi de exemplu osteosarcoamele convenţionale sunt supuse icircntr-o primă etapă chimioterapiei
sau radioterapiei cu scopul de a micşora masa tumorală următoarea etapă fiind rezecţia
chirugicală Condrosarcoamele sunt tratate doar chirurgical chimioterapia dovedindu-se
ineficientă Multe procese maligne sau procese benigne agresive pot fi tratate prin rezecţie
chirurgicală atacirct a tumorii cacirct şi a unei margini de ţesut normal sau icircn cele mai grave cazuri prin
icircndepărtarea totală a osului muşchiului sau altor ţesuturi afectate de tumoră [23]
12 Metode de tratament a defectelor osoase
Spre deosebire de alte ţesuturi osul are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn
cazul unor afecţiuni minore fără formare de cicatrici Icircn schimb icircn cazul fracturilor patologice
sau a celor grave precum şi icircn pierderi mari de ţesut osos ce pot conduce la defecte osoase
grave procesele de regenerare şi reparare proprii vor avea nevoie de support [24] Principalii
factori ce conduc la defecte osoase grave sunt rezecţia de tumoră osoasă malformaţiile
congenitale unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita După sacircnge osul
este al doilea cel mai transplantat organ anual fiind efectuate la nivel mondial aproximativ 22
milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă [25] Materiale de substituţie osoasă
pot fi clasificate icircn mai multe categorii după cum urmează grefe de origine naturală (autogrefe
alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria tisulară
precum şi diverse combinaţii ale acestora [26]
121 Metode actuale de tratament a defectelor osoase
1211 Grefe osoase biologice
Icircn funcție de originea lor grefele biologice se clasifică icircn xenogrefe alogrefe și autogrefe
[27] Xenogrefe prelevate de la o specie diferită de a primitorului au fost utilizate o scurtă
perioada de timp deoarece după cacircteva decenii de studii icircndelungate s-au dovedit a fi cele mai
puţin adecvate grefe [28] Alogrefele sunt utilizate pentru reconstrucţia unor defecte osoase
grave Astfel alogrefele se utilizează icircn timpul intervenţiilor de revizie a artoplastiilor totale
17
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
pentru reconstrucţia pierderilor osoase Alogrefele sunt prelevate fie de la pacienţi vii fie de la
cadavre Icircn cazul icircn care donatorii sunt pacienţi vii o sursă foarte utilizată este capul femural
alogrefele fiind preluate icircn acest caz icircn timpul intervenţiilor primare de artoplastie totală de şold
Icircn cazul icircn care alogrefele sunt preluate de la cadavre oasele lungi şi pelvisul sunt sursele cele
mai utilizate [29] Icircn tabelul 11 sunt prezentate principalele avantaje și dezavantaje ale celor trei
tipuri de grefe osoase biologice
Tabel 11 Principalele avantaje și dezavantaje ale autogrefelor alogrefelor și xenogrefelor [24]
Grefă
osoasă
biologică
Avantaje Dezavantaje
Autogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
osteoconductivitate și osteogenice
histocompatibilie
nu există risc de imunogenicitate
sau transmitere de boli infecțioase
durere la locul prelevării și
moartea patului donator
sursă limitată de
disponibilitate și cantitate
timpi chirurgicali mai mari
ce implică pierderi de sacircnge
posibile infecții
Alogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
și osteoconductivitate
nu apare problema morbidității
patului donator
ușor de manevrat
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
osteoinductivitate variabilă
pierderea proprietăților
biologice și mecanice
respinse icircn anumite regiuni
geografice datorită unor aspecte
religioase
cost crescut
Xenogrefe
proprietăți osteoinductive și
osteoconductive
cost scăzut
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
risc imunogenic crescut
rezultate slabe
Un tip specializat de alogrefe este reprezentat de matricea osoasă demineralizată (DBM)
DBM se obține prin extracția acidă a alogrefelor și conține colagen de tip I proteine
18
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
noncolagenice și un număr variabil de factori de creștere osteoconductivi (de exemplu proteine
morfogenetice osoase - BMP) Concentrația de DBM este direct proporțională cu
osteoinductivitatea DBM se poate folosi fie singură fie icircn combinație cu alte alogrefe sau cu
grefe sintetice [27]
Autogrefele sunt utilizate pentru refacerea defectelor osoase primitorul și donatorul fiind
aceași persoană Sunt utilizate icircntr-un număr mare de intervenţii chirurgicale ortopedice
stomatologice şi maxilo-faciale cu scopul de a spori şi grăbi regenerarea osoasă sau de a restaura
defectele osoase Creasta iliacă este locul de unde se prelevă cel mai frecvent autogrefe datorită
accesului uşor şi a unei bune calităţi De asemenea autogrefele se mai pot preleva din tibia
proximală femurul distal coaste radiusul distal Şi canalul intramedular al oaselor lungi poate
reprezenta o potenţilă sursă de autogrefe precum şi o sursă bogată de celule şi factori de creştere
[30] [31]
1212 Grefe osoase și substituienți sintetici
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din biomateriale
sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea celulelor osoase icircn timpul
procesului de regenerarea osoasă [26] O gamă variată de materiale sintetice sunt utilizate ca și
substituenți osoși metale cum sunt tantalul titanul fierul sau magneziul polimeri sintetici cum
sunt poli acidul lactic poli acidul glicolic poliuretani sau poli ε-caprolactona și ceramice sum
sunt sticlele bioactive fosfații de calciu sau sulfați de calciu hidratați Icircn timp dintre toate aceste
materiale cele mai potrivite s-au dovedit a fi cele pe bază de fosfați de calciu datorită asemănării
cu compoziția osului natural (ce conține mai mult de 60 fosfați de calciu)
Substituenți sintetice sunt disponibili fie sub formă de granule (majoritatea au un diametru
cuprins icircntre 01 și 5 mm) fie sub formă suporturi cu porozitate variabilă icircn funcție de diverse
aspecte ce țin de locul unde vor fi implantate perioada necesară refaceriiregenerării complete
etc De asemenea icircn practica curentă se folosesc și substituienți injectabili denumiți adesea
cementuri un mare avantaj ala acestora fiind tehnica de implantare minim invazivă
Resorbabilitatea este o caracteristică esențială a substituienților osoși fiind intens studiată
Icircn tabelul 12 sunt prezentate principalele clase de substiutuenți osoși utilizați icircn prezent precum
și mecanismele de resorbție ale acestora
19
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Tabel 12 Principale tipuri de substituenți osoși și mecanismul de resorbție al acestora [32]
Clasa de
Material Tipul de material Mecanismul de resorbție
Materiale
Ceramice
Bioglas Resorbţie limitată
Sulfat de calciu hemihidrat (CSH)
Gips
Sulfat de calciu dehidrat (CSD)
Solubilizare
Solubilizare şisau conversie icircn
apatită
Fosfat dicalcic (DCP)
Fosfat octocalcic (OCP)
β-Fosfat tricalcic (β-TCP)
Fosfat de calciu bifazic (BCP)
Cristale de hidroxiapatită
precipitate
β-Pirofosfat de caciu (β-CPP)
Mediat cellular
Hidroxiapatită sinterizată Nu se resoarbe
Materiale
Metalice
Magneziu (aliaj) Coroziune
Fier (aliaj) Coroziune
Tantal titan Nu se resoarbe
Polimeri
Poli acid lactic poli acid glicolic
Poli ε-caprolactona Hidroliză
Celuloză
Hialuronan
Fibrină
Colagen
Chitosan
Transport la ganglioni limfatici
Hialuronidază
Plasmină
Colagenază
Lizozim
Icircn mod ideal un substituent osos ar trebui să fie icircnlocuit icircn timp de țesust osos nativ fără
pierderea suportului mecanic oferit de acesta Icircn unele cazuri defectele osoase sunt stabilizate
utilizacircnd fixarea metalică neresorbabilă defectul osos propriu-zis fiind completat cu un
substituent osos Rata de resorbție a substituienților osoși poate fi controlată prin optimizarea
geometriei materialului Prezența unei rețele cu pori interconectați sau a unor canale icircn structura
sa este o caracteristică cheie a unui substituent osos regăsindu-se inclusiv la cementurile
20
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
injectabile Icircn cazul substituenților pe bază de polimeri rata de resorbție poate fi controlată prin
unele modificări chimice [32]
122 Ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Dezavantajele substituenților osoși sintetici au condus la necesitatea unei metode
alternative şi efective avacircnd drept scop principal regenerarea osoasă S-au evidenţiat
următoarele alternative a substituenţilor osoşi utilizarea factorilor de creştere osteogenici (cum
ar fi proteienele morfogenetice osoase ndash BMPs) suporturi osteoinductive terapia genică
utilizarea celulelor stem toate acestea reprezentacircnd componentele inginerie tisulare (figura 17)
Figura 17 Triada ingineriei tisulare și aplicarea produsului rezultat icircn procesul de
regenerarea al țesutului osos afectat de tumoriinfecții
Componentele ingineriei tisulare o matrice sau un suport celule și molecule semnal au
fost stabilite plecacircnd de la structura țesuturilor biologice [33]
Matricea sau suportul este componenta cheie a ingineriei tisulare Acționează iniţial ca un
suport temporar pentru adeziunea și creșterea celulară apoi are rol definitoriu pentru sinteza de
matrice extracelulară iar icircn ultimă etapă contribuie la formarea de neo-țesut [34]
21
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau regenerarea
ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor artificiale și a suporturilor
Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase sisteme injectabile capsule
filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri etc [35]
1221 Biomateriale utilizate la realizarea de suporturi pentru regenerarea osoasă
La realizarea suporturilor pentru regenerarea osoasă sunt utilizate mai multe tipuri de
biomateriale biopolimeri polimeri sintetici și biomateriale ceramice
Polimeri atacirct de origine naturală cacirct și sintetică sunt utilizați pentru o varietate de aplicații
biomedicale Din clasa polimerilor naturali sau bioplomeri fac parte polizaharidele proteine și
poliesteri proveniți atacirct din regnul vegetal cacirct și din regnul animal Biopolimeri sunt utilizați
icircntr-o multitudine de domenii industria alimentară industria farmaceutică (foarte des ca și
excipienți) la realizare unor proteze icircn sisteme de eliberare controlată de medicamente etc
Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul biologic fiind dirijați spre degradarea metabolică
Datorită similarității dintre polimerii naturali și matricea extracelulară (ECM) aceste materiale
nu vor provoca o reacție imunologică cronică sau toxică reacții deseori icircntalnite icircn cazul
utilizării polimerilor sintetici [36]
12211 Biopolimeri
Printre cei mai utilizați biopolimeri se numără colagenulgelatina acidul hialuronic
chitosanulchitină albumina serică bovină fibroina din mătase [37]
Colagenul
Colagenul ndash Col proteina cea mai abundentă din organismul uman se remarcă ca
biopolimer printr-o serie de proprietăţi precum biocompatibilitatea excelentă
biodegradabilitatea rezistenţa mecanică ridicată toxicitatea scăzută reacţii imunologice slabe
fiind unul din cele mai utilizate biomateriale icircntr-o varietate de aplicaţii medicale
Din punct de vedere al structurii chimice colagenul are structură de triplu helix
macromolecula de colagen fiind formată din trei lanţuri α răsucite icircmpreună de la stacircnga la
dreapta icircn jurul unui ax comun [38] Există mai multe tipuri de colagen fiecare tip avacircnd
22
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
particularității proprii de structură precum și localizare icircn organe specific icircn organism Nu se ştie
cu exactitate cacircte tipuri de colagen există Cel mai intalnit colagen icircn racircndul vertebratelor este
colagenul de tip I de aceea este și cel mai utilizat și studiat icircn diverse domenii
Figura 18 Structura colagenului
Poate fi prelucrat sub o mare varietate de forme filme fibre structuri poroase
nanoparticule şi microparticule atacirct singur cacirct şi icircn combinaţie cu alte materiale Deoarece
structura sa chimică permite combinarea colagenului cu factori de creştere sau alţi agenţi
bioactivi una din cele mai importante aplicaţii ale colagenului este utilizarea lui icircn sisteme de
eliberarea controlată de medicamente membrane de colagen pentru aplicaţii oftalmice structuri
poroase pentru răni şi arsuri diferite geluri etc Remarcabilă este și utilizarea colagenului icircn
ingineria tisulară pentru realizarea unor substituenţi pentru piele a unor substituenţi osoşi sau a
unor valve artificiale [39]
Icircn domeniul ingineriei repararării şi regenerării ţesutului osos colagenul a fost unul dintre
primele biomateriale studiate fiind totodată şi unul din cele mai utilizate materiale de cele mai
multe ori utilizat icircn combinaţie cu alţi biopolimeri şi fosfaţi de calciu sub diverse forme de
prezentare hidrogeluri injectabile membranefilme suporturi poroase microsfere nanosfere
Un hidrogel pe bază de colagen reprezintă un candidat excelent pentru icircncapsularea de celule
datorită capacității sale de umflare icircn apă proprietăților fizice adecvate (de exemplu proprietăți
mecanice capacitatea de gelifiere) conținutului ridicat de apă ce facilitează transportul și
difuzia proprietăților biologice excelente și sensibilitații la degradarea enzimatică [40] De
23
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
exemplu hidrogeluri conținacircnd diferite rapoarte masice chitosancolagenul au fost fabricate icircn
următoarele condiții de sinteză gelifiere inițiată de utilizarea β-glicerofosfat utilizarea unui
mediu osteogenic suplimentar și a unei baze slabe și temperatură variată Prezența colagenului icircn
hidrogel a fost asociată cu creșterea proliferării celulare hidrogelul a fost mai compact rezultacircnd
o matrice rezistentă [41]
Membrane resorbabile pe bază de colagen au fost utilizate icircn ingineria tisulară și
regenerarea osoasă ghidată deoarece de-a lungul timpului numeroase studii au arătat că acestea
sunt biocompatibile și sporesc rata de regenerare Acestea sunt fabricate prin tehnici diverse
fiind adesea utilizate alături de polimeri sintetici de exemplu poli (tetrafluoroetilienă)
Variantele comerciale cele mai icircntalnite de membrane pe bază de colagen utilizate icircn practica
clinică sunt Bio-Gidereg (GeistlichPharma AG Wolhusen Elveția) DuraMatrix-Onlaytrade ndash
membrană pe bază de colagen pentru repararea țesutului dura mater (Collagen Matrix Inc NJ
SUA) TenoMendtrade (Collagen Matrix Inc) OssiPatchtrade ndash membrană protectoare pe bază de
colagen pentru regenerarea osoasă (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) și Collatenetrade
Fibrillar Collagen ndash pansament utilizat pentru afecțiuni maxilo-faciale (Ace Surgical Supply Co
Inc MA SUA)
Suporturile poroase pe bază de colagen au icircn componența lor și particule ceramice icircn acest
fel icircncercacircndu-se o imitare a structurii osului natural Din variantele comerciale cele mai des
utilizate se pot aminti Collagrafttrade (Collagen Corp SUA) ndash care combină hidroxiapatită fosfa
tricalcic cu măducă osoasă de la pacinet și colagen de origine bovină OssiMendtrade Bone Graft
Matrix (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) ndash combină minerale osoase sub formă poroasă
cu colagen și INFUSEreg Bone Graft (Medtronic Sofamor Danek Inc USA) ndash care pe langă un
suport poros pe bază de colagen conțin protein morfogenetice umane recombinate (rhBMP-2)
[40]
Gelatina
Gelatina este un derivat denaturat al colagenului Polielectrolit amfoteric gelatina este un
amestec de fragmente de proteine solubile icircn apă avacircnd aceleaşi secvenţe de aminoacizi ca şi
colagenul structura sa chimică fiind redată icircn figura 19 Colagenul diferă de gelatină prin aceea
că are mai multe structuri terţiare fiind mai puţin solubil icircn soluţii apoase decacirct gelatin [42]
Gelatina poate fi fabricată din diverse surse sursa de provenienţă a gelatinei influențacircnd
24
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţile acesteia Cel mai adesea se fabrică din piele porcină (46) piele bovină (294)
sau oase de origine porcină sau bovină (231) [43] Gelatina este un polimer biodegradabil
biocompatibil non-antigenic are cost scăzut susţine adeziunea celulară migrarea diferenţierea
şi proliferarea celulară Un dezavantaj al acestei proteine este acela că are proprietăţi mecanice
slabe De aceea pentru a fi utilizat la realizarea unor matrici suport pentru ingineria tisulară icircn
special a ţesuturilor dure gelatina se utilizează icircmpreună cu alţi polimeri de exemplu chitosan
unele ceramic (hidroxiapatită fosfat tricalcic) etc [44] [45]
Figura 19 Structura chimică a gelatinei
Albumina serică bovină
Albuminile serice sunt cele mai abundente proteine din sistemul circulator pentru o mare
varietate de organism fiind principalele molecule complexe care contribuie la presiunea arterială
osmotică Datorită potențialului său antioxidant albumina are un rol esențial icircn prepararea
mediilor pentru culturi de celule de mamifere atacirct icircn domeniul cercetării cacirct și icircn domenii
comerciale [46]
Icircn domeniul ingineriei tisulare și domeniul medicinei regenerative albumina serică bovină
ndash BSA este una dintre cele mai studiate proteine din punct de vedere al interacțiunii cu
polizaharidele datorită stabilității sale semnificative a faptului că este ușor accesibilă are o
solubilitate bună icircn apă și datorită asemănării structurale și funcționale cu albumina serică umană
[47]
Icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos albumina serică bovină este utilizată icircn
sisteme complexe pe bază de materiale ceramice Un studiu care evidențiază influența utilizării
albuminei alături de materiale ceramice a fost publicat de Chew și colaboratorii care au
25
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
demonstrat că adăugarea unei concentraţii scăzute de albumină serică bovină este utilă deoarece
susţine creşterea cristalelor de fosfaţi de calciu fiind astfel utilă procesului de mineralizare a
ţesutului osos Icircn comparaţie o concentraţie mare de albumină inhibă cristalizarea fosfaţilor de
calciu [48] Această proprietate a albuminei serice bovine precum și cele menționate anterior a
făcut ca aceasta să fie utilizată de unii autori la sinteza de cimenturi pe bază de fosfaţi de calciu
[49] [50]
De asemnea această proteină a fost utilizată ca adjuvant icircn studii vizacircnd regenerarea
osoasă cu ajutorul unor microsfere hibride alături de poliacrilatalginat de calciu [51]
Fibroină din mătase
Fibroina din mătase produsă de viermi de mătase Bombyx mori este o proteină naturală
cu o foarte bună biocompatibilitate non-toxică biodegradabilă De asemenea prezintă
proprietăţi intrinseci remarcabile şi o bună rezistenţă mecanică Datorită proprietăţilor
menţionate icircn ultimii ani a avut loc o creştere a interesului pentru utilizarea fibroinei din mătase
la obţinerea de suporturi poroase tridimensionale Studii recente au dovedit capacitatea unor
suporturi tridimensionale pe bază de fibroină de a susţine proliferarea celulară icircn aplicaţii vizacircnd
ingineria tisulară a osului a cartilajului şi a vaselor de sacircnge [52]
Figura 110 Structura chimică a fibroinei din mătase
Chitosan
Chitosanul ndash Cs descoperit icircntamplător de către Rouget la mijlocul secolului al XIX lea
este una din cele mai utilizate polizaharide icircn ingineria tisulară şi regenerare osului Acesta este
obţinut din chitină polizaharid structural ce are rol analog cu cel al colagenului icircn regnul animal
superior şi al celulozei icircn plantele Plantele produc celuloză icircn pereţii plantelor iar insectele şi
crustaceele produc chitină icircn aripi respectiv scoici Prin deacetilarea icircntre 40 şi 100 a
chitinei rezultă un polimer format din unităţi de β-(1-4)-2-acetamino-D-glucoză (N-acetil-D-
26
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
glucozamină) şi β-(1-4)-2-amino-D-glucoză (N-D-glucozamină) Icircn afara diferenţei de structură
dintre chitină şi chitosan o altă diferenţă este dată de solubilitatea celor doi biopolimeri chitina
este insolubilă icircn solvenţii uzuali chitosanul dizolvacircndu-se icircn aceştia Structura sa unică
biocompatibilitatea proprietăţi fizico-chimice (solubilitatea biodegradabilitate) versatilitate icircn
termeni de prelucrare proprietăţi multidimensionale şi funcţionalitate icircnaltă fac ca acest
biopolimer să aibă o multitudine de aplicaţii icircntr-o gamă variată de domenii domeniul
biomedical industria farmaceutică industria cosmetică biotehnologii industria alimentară
agricultură şi protecţia mediului [53] [54]
Figura 111 Structura chimică a chitosanului
Icircn ceea ce privește utilizarea chitosanului icircn domeniul regenerării osoase sunt elaborate
studii complexe icircncă de acum cacircteva deceni Borah şi colaboratorii fiind primii care au
demonstrate potenţialul osteogenic al acestuia [55] Au urmat apoi Muzarelli şi colaboratorii care
au realizat studii publicate icircn anii 1993 şi 1994 remarcante din punct de vedere al proprietăţilor
de regenerare osoasă ale chitosanului [56]
Acid hialuronic
Acidul hialuronic ndash Hya este un mucopolizaharid ce face parte din clasa
glicozaminoglicanilor ndash GAG avacircnd cea mai simplă structură chimică din această clasă de
compuși biologici și fiind singurul glicozaminoglican nesulfatat Icircn organismul uman acidul
hialuronic se găseşte icircn lichidul sinovial umoarea vitroasă matricea extracelulară a ţesutului viu
iar icircn cea mai mare cantitate se regăsește icircn piele Hya este componentul principal al matricei
extracelulare a cartilajului articular acţionacircnd ca o ancoră pentru GAG sulfataţi din cartilaj [57]
27
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Este neramificat și inert din punct de vedere imunologic iar spre deosebire de alți GAG
este sintetizat ca un polizaharid liber și nu substituit la o miezul unei proteine [58] Structura
acidului hialuronic este reprezentată de unităţile dizaharidice polianionice acid D-glucoronic şi
N-acetil-D-glucozamină unite alternant prin legături β ndash 14 și β ndash 1-3 glicozidice (figura 112)
Figura 112 Structura acidului hialuronic
Hya se extrage adesea din surse de origine animală creastă de cocoș și umoare vitroasă de
origine bovină icircnsă procesul de izolare din aceste surse este dificil deoarece acesta formează
complexe stabile din punct de vedere chimic cu proteoglicani prezenți icircn țesutul animal fiind
foarte greu de controlat masa moleculară a acesti biopolimer Extragerea acidului hialuronic din
surse microbiene reprezintă o alternativă la metoda de extragere menționată anterior bacteriile
din familia Streptococcilor grupurile A și C producacircnd icircn mod natural o capsulă mucoidă de
acid hialuronic [59]
Icircn ciuda faptului că acidul hialuronic se găsește icircntr-o cantitate mică icircn matricea
extracelulară a ţesutului osos acest polimer este implicat icircn procesele biologice importante ale
osului Poate fi produs de osteoblaste şi osteoclaste fiind găsit şi icircn citoplasma celulelor
osteoprogenitoare și poate lega hidroxiapatita fără să afecteze dezvoltarea minerală Are un rol
important icircn osificarea endocondrală şi a platoului de creştere epifizar fiind găsit icircntr-o
concentraţie mare icircn zona condrocitelor hipertrofice Important de menționat este că acidul
hialuronic se găsește icircn concentraţie mare icircn calusul fracturilor nou formate [57]
28
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Alginații
Alginatul este un polimer anionic natural obținut din diverse specii de alge brune
(Phaeophyceae Laminaria hyperborea Laminaria digitata Laminaria japonica Ascophyllum
nodosum Macrocystis pyrifera) prin tratament cu soluții alcaline apoase cel mai adesea
utilizacircndu-se NaOH De-a lungul timpului a fost intens studiat fiind utilizat icircn prezent icircn
multiple aplicații biomedicale datorită proprietăților care le deține biocompatilitate toxicitate
scăzută costuri de obținere și procesare relativ scăzute [60]
Icircn literatură sunt prezentate rezultatele unor studii prinvind utilizarea alginatului la
fabricarea de suporturi pentru igineria tisulară [61] Hye-Lee și colaboratorii prezintă un studiu
cu privire la prepararea și caracterizarea de suporturi compozite pe bază de nano-hidroxiapatită
alginat și chitosan cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos [62] Icircntr-un alt studiu
Sharma și colaboratorii prezintă fabricare de suporturi nano-biocompozite a căror componente
sunt același ca icircn studiul publicat de Hey-Lee la care se adaugă gelatină procedeul de fabricare
al nano-biocompozitelor fiind unul complex [63]
12212 Polimeri sintetici
Două din cele mai mari avantaje ale polimerilor sintetici sunt reproductibilitate mare şi
posibilitatea de a fi fabricaţi pe scară largă De asemnea pot fi fabricați sub o gamă foarte variată
de forme Icircn comparație cu polimerii naturali este foarte important de menționat faptul că
polimerilor sintetici li se pot controla proprietăţile mecanice şi biodegradabilitatea icircnsă ridică
probleme deoarece nu au activitate biologică şi sunt foarte hidrofobi [64]
Poli (acidul lactic)
Poli (acidul lactic) ndash PLA este unul din cei mai utilizați polimeri sintetici datorită
proprietăților sale mecanice foarte bune fiind utilizat cu succes icircn diverse implanturi medicale
Datorită faptului că PLA are o viteză de degradare in vivo scăzută este cel mai adesea utilizat
pentru fixarea ososă [65] Deoarece prezintă doi carboni asimetrici PLA are trei forme izomerice
D(-)- PDLA L(+)-PLLA şi (DL)- PDLLA Ușurința icircn procesare cristalinitatea precum și viteza
de degradare depind de structura și compoziția lanțurilor polimerice icircn mod particular de
raportul izomerilor PLLA este considerat un homoplimer izotactic semicristalin avacircnd cea mai
mare temperatură de topire dintre cei trei izomeri ai PLA [66]
29
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 113 Structura PLA
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA este un copolimer al poli (acidului lactic) ndash PLA şi
al poli (acidului glicolic) ndash PGA Este utilizat la realizarea de produse farmaceutice și diverse
suporturi pentru ingineria tisulară fiind un polimer biocompatibil și biodegradabil [67]
Suporturile pentru inginerie tisulară pe bază de PLGA au avantajul de a fi degradate icircn mediul de
cultură celular produșii de degradare rezultați fiind lipsiți de toxicitate [68]
Figura 114 Structura PLGA
unde n ndash numărul de unităţi structural de acid lactic şi m ndash numărul de unităţi structurale de acid
glycolic
Poli (caprolactona)
Poli (caprolactona) ndash PCL este un polimer termoplastic biocompatibil avacircnd temperaturile
de topire şi de vitrifiere scăzute Este cristalin şi hirofob caracteristici ce conduc la o viteză de
degradare scăzută De asemenea are proprietăţi mecanice constante icircn timp Proprietăţile
prezentate fac ca acest polimer să fie adesea utilizat icircn ingineria tisulară [69]
30
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 115 Structura PCL
Poli (3- hidroxibutiratul)
Poli (hidroxialcanoaţii) ndash PHA sunt o clasă de poliesteri naturali produși de o varietate de
microorganisme Primul polihidroxialcanoat descoperit și totodată cel mai studiat este poli-3-
hidroxibutiratul ndash P(3HB) a cărui structură chimică este redată icircn figura 116 [70]
Figura 116 Structura P(3HB)
12213 Biomateriale cermice
Din categoria suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă biomaterialele
ceramice reprezintă o categorie foarte importantă cele mai multe variante comerciale pentru
aplicația vizată icircncadracircndu-se icircn această categorie Compoziţia şi morfologia acestor
biomateriale au o influență esențială asupra răspunsului tisular Icircn majoritatea cazurilor sunt non-
imunogenice nu provoacă reacții inflamatoare și sunt non-citotoxice Icircn practica clinică
ceramicele sunt utilizate icircntr-o mare varietate de aplicații biomateriale pentru regenerarea
articulaţiei artificiale a şoldului biomaterialele de reconstrucţie osoasă implanturi pentru
icircnlocuirea celor trei oscioare de la nivelul urechii (ciocănş nicovală şi scăriţă) rădăcini dentare
artificiale şi ceramice pentru diverse tratamente medicale [71]
31
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Ceramicile utilizate la fabricarea de implanturi se clasifică icircn ceramice neresorbabile
(bioinerte) ceramice bioactive sau cu suprafaţa activă (semi-inerte) şi ceramice biodegradabile
sau resorbabile (non-inerte)
Ceramicele neresorbabile inerte sunt stabile la interacţiunea cu mediul fiziologic şi nu
prezintă bioactivitate sau efecte dăunătoare pentru organismul uman cele mai reprezentative
fiind alumina ndash Al2O3 zirconia ndash ZnO2 carbonul și nitrura de siliciu Ceramicele bioactive
semi-inerte sunt ceramice desemnate să inducă o activitate biologică specifică avacircnd
capacitatea de a se lega direct la os caracteristică deosebit de importantă şi unică icircn racircndul
tuturor tipurilor de biomateriale Din categoria ceramicelor bioactive semi-inerte fac parte
apatitele sticlele bioactive şi sticlele ceramice bioactive Fosfaţii de calciu chiar daca fac parte
din clasa apatitelor se icircncadrează icircn categoria ceramicelor resorbabile [72] [73]
Sticlele bioactive au fost inventate de către Hench Universitatea din Florida icircn 1971
Acestea au drept compoziţie de bază SiO2-CaO-Na2O-P2O5 și la fel ca ceramicile bioactive au
capacitatea de a se lega de os fară a exista conexiuni tisulare fibroase icircntre ele Bioglassreg
45S5
este prima şi cea mai studiată sticlă bioactivă Bioglassreg S53P4 este o altă sticlă bioactivă
utilizată icircn ortopedie ca şi substituent osos sub varianta comercială BonAlivereg (Vivoxid
Finlanda) [74]
Sticlele bioactive ceramice se obţin prin precipitarea icircn sticlele bioactive a unei faze
cristaline rolul acestei etape de sinteză fiind de a mări rezistenţa mecanică a acestora din urmă
Spre deosebire de sticlele bioactive obișnuite au o bioactivitate mai scăzută dar au o rezistenţă
mecanică superioară Sunt utilizate la realizare vertebrelor artificiale spaţiului intervertebral
artificial şi a unor materiale de umplere poroase sau granulare [75]
Fosfați de calciu
Fosfații de calciu reprezintă componenta majoră a țesutului dur al vertebratelor
componenta anorganică (minerală) a osului avacircnd icircn compoziție nanocristale non-
stoichiometrice de apatită avacircnd următoarea formulă chimică
Ca10-x(PO4)6-x(HPO4CO3)x(OHF)2-x
unde 0lexle2 O particularitate aparte a structurii apatitelor este capacitatea lor de a putea
icircncorpora multe tipuri de ioni organici sau anorganici Astfel s-a dovedit că fosfați de calciu
32
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanocristalini non-stoichiometrici atacirct biologici cacirct și sintetici icircncorporează icircn structura lor ioni
din mediu chimic care nu corespund apatitelor acești ioni fiind denumiți non-apatitici [76] Icircn
tabelul 13 sunt prezentați diferite tipuri de fosfați de calciu
Tabel 13 Diferite forme de fosfaţi de calciu abrevierea lor formula chimică raportul
CaP mineral (dacă există) [77] [78]
Denumire Abreviere Formulă chimică Raport
CaP Mineral
Fosfat monocalcic
monohidrat MCPM Ca(H2PO4)2 H2O 05 ndash
Fosfat monocalcic
anhidru MCPA Ca(H2PO4)2 05 ndash
Fosfat dicalcic
anhidru DCPA CaHPO4 100 Moneit
Fosfat dicalcic
dihidrat DCPD CaHPO4 2H2O 100 Bruțit
Fosfat octocalcic OCP Ca8H2(PO4)6 5H2O 133 ndash
α-Fosfat tricalcic α-TCP α-Ca3(PO4)2 15 ndash
β-Fosfat tricalcic β-TCP β-Ca3(PO4)2 15 ndash
Hidroxiapatită
deficită icircn calciu CDHap Ca9(HPO4)(PO4)5OH 15 ndash
Hidroxiapatită
precipitată Hap
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x
unde 0lexle2
xx(OH)2-x
133 ndash167 ndash
Hidroxiapatită
sinterizată SHA Ca10(PO4)6(OH)2 167 Hidroxiapatită
Oxiapatită OXA Ca10(PO4)6O 167 ndash
Fosfat tetracalcic TeTCP Ca4(PO4)2O 20 Hilgenstockite
Hidroxiapatita este utilizată destul de des icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos
datorită similarității dintre compoziția sa și cea a fazei minerale a osului uman Faza minerală a
osului uman are formula chimică asemănătoare ce cea a hidroxiapatitei deficitară icircn calciu avacircnd
grupările OH- parțial substituite cu grupări CO3
2- Structura cristalină a hidroxiapatitei poate fi
descrisă ca un aranjament hexagonal unde cationii sunt orientați pe planurile tetraedral și
octaedral Icircn ultimii ani diverse suporturi ceramice pe bază de hidroxiapaptită au fost realizate
Cu toate că acestea prezintă proprietăți foarte bune pentru aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului
osos porozitate ridicată osteointegrare bună totuși au diverse neajunsuri icircn ceea ce privește o
refacere completă a defectelor ososoase [79]
33
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1222 Suporturi biomimetice pentru ingineria tisulară şi regenerarea osoasă
12221 Caracteristici ale suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Suporturile realizate pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă trebuie să aibă o serie
de proprietăți foarte importante pentru a putea fi utilizate cu succes proprietăți prezentate
schematic icircn figura 117
Figura 117 Proprietățile unui suport ideal realizat pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Icircn primul racircnd suporturile trebuie să aibă o serie de proprietăți biologice care sunt
esențiale pentru obținerea unor rezultate promițătoare biocompatibilitatea și bioactivitatea fiind
două din cele mai importante Un suport este considerat biocompatibil dacă nu are răspuns
imunogenic și nu are componente toxice sau inflamatoare care vor conduce la o rejecție
imunologică Bioactivitatea se referă la interacțiunea suportului cu țesutul gazdă și integrarea
acestuia De asemenea din punct de vedere al bioactivității suporturile trebuie să fie
osteoconductive osteoinductive și osteogenice Biodegradabilitatea o altă proprietate biologică
foarte important constă icircntr-o degradare controlată a suportului pe măsură ce se formează țesut
34
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nou menținacircnd totodată suport suficient pentru regenerarea completă a țesutului afectat Lipsa
unor produși de degradare toxici este o altă caracteristică care definește biodegradabilitatea [80]
Proprietăţile de suprafaţa sunt și ele esențiale la fel și proprietăţile morfologice pori
interconectați structură tridimensională microporozitatea macroporozitatea dimensiunea
porilor adaptată fiecărui tip de țesutcelule Porii trebuie să fie interconectați pentru a permite
difuziunea și migrarea celulelor iar dimensiunea porilor trebuie să fie adaptată fiecărui tip de
țesutcelule Microporozitate oferă o suprafață care permite interacțiunile celule-matrice și
macroporozitate permite migrarea celulelor și invazia vaselor de sacircnge Porozitate adecvată
permite creșterea celulelor fără să afecteze proprietățile mecanice
Suporturile trebuie să aibă proprietăţi mecanice similare cu cele ale ţesutului lacircngă care
sunt implantate mai concret trebuie să aibă rezistență la diverse solicitări biomecanice
comparabile cu ale osului uman pentru a permite mecano-reglarea celulară și păstrarea
integrității in vivo [34] [35]
12222 Metode de obținere a suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Metodele convenționale de obținere a suporturilor includ prelucrarea prin turnare icircn
solvent și solubilizarea a particulelor liofilizarea separarea fazelor indusă termic metoda de
formare a spumelor din fază gazoasă formarea prin pulverizare formarea prin tehnica sol-gel
electrofilarea și altele
Icircn cazul metodei prin turnarea icircn solvent și solubilizare a particulelor o soluție de polimer
este introdusă icircntr-o solvent cu particule de săruri avacircnd dimensiuni specifice dispersate
uniform Solventul se va evapora rezultacircnd un suport cu particule icircncorporate Suportul este
imersat apoi icircn apă particulele fiind solubilizate uneori se folosește și icircncălzirea pentru o
solubilizare completă rezultacircnd icircn final o structură cu porozitate ridicată Rezprezentarea
schematică a metodei este redată icircn figura 118 Dezavantajele metodei de formare a suporturilor
sunt formarea unor suporturi cu formă prestabilită și citotoxicitatea suporturilor datoră
rezidurilor de solvent
35
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 118 Obținerea suporturilor prin turnare icircn solvent și solubilizarea particulelor
Liofilizarea are la bază procesul de sublimare care se referă la trecerea apei din fază solidă
icircn fază gazoasă Suporturile obținute prin liofilizarea prezintă o structură poroasă cu pori
interconectați avacircnd dimensiuni medii icircn jur de 300 nm (figura 119) dimensiuni ce depind de
natura componentelor suportului Dezavantajele acestei metode sunt timpul icircndelungat necesar
obținerii suportului și faptul că pori rezultați nu au dimensiuni regulate
Figura 119 Obținerea suporturilor prin liofilizare
36
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Metoda de formare a suporturilor din spume gazoase a fost dezvoltată pentru a icircnlătura
utilizarea solvenților organici citotoxici Polimeri biodegradabili dizolvați icircn apă sau fluoroform
sunt ținuți sub presiune cu diverși agenți gazoși inerți (azot dioxid de carbon) pacircnă cacircnd soluția
este saturată și plină de bule de gaz Tehnica are drept rezultat suporturi poroase cu dimensiuni
medii a porilor icircn intervalul 30-700 microm și o porozitate ridicată de pacircnă la 85
Tehnica sol-gel se bazeză pe polimerizarea anorganică a metalelor alcaloide O soluție (sol)
este format prin adăugarea unui surfactant după care vor urma reacțiile de condensare și
gelifiere [81]
Tehnica de electrofilare a fost inventată icircn 1934 de către Formhals și se bazează pe un
cacircmp electric ce impune o icircntindere uniaxală a unui jet vacircscoelastic provenit dintr-o soluție de
polimer ce icircși reduce continuu diametrul icircn final rezultacircnd nanofibre Este o tehnică simplă și
rentabilă pentru prepararea nanofibrelor polimerice cu diameter cuprinse icircntre 3 nm și 5 μm
(figura 120) Proprietățile nanofibrelor electrofilate sunt influențate de mulți factori cum ar fi
proprietățile polimerului proprietățile solventului aditivii concentrația polimerului proprietățile
soluției și așa mai departe [82]
Figura 120 Obținerea suporturilor prin liofilizare
Există și tehnici moderne de sinteză a suporturilor pentru regenerarea osoasă denumite
tehnici de prototipare rapide Dintre acestea cele mai utilizate și cele care oferă pacircnă icircn present
rezultatele cele mai promițătoare sunt sinterizarea selectivă cu laser stereolitografia imprimarea
tridimensională (3D) bio-imprimarea [81]
37
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
12223 Suporturi biomimetie pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu pentru
regenerarea osoasă
Suporturi biomimetice
Icircn general metodele de regenerare osoasă sunt de preferat metodelor de icircnlocuire osoasă
datorită neajunsurilor celor din urmă Un număr mare de studii icircn domeniul ingineriei tisulare și
regenerare a osului au evidenţiat importanţa critică a caracteristicilor arhitecturii suporturilor
utilizate icircn domeniu
Ţesuturile vii sunt caracterizate de o arhitectură ierarhică tridimensională şi un
micromediu unic ce uşurează intercaţiunea celulelor cu molecule semnal componentele matricei
extracelulare şi unele molecule mici Acest micromediu complex controlează procesele celulare
importante pentru morfogeneza ţesutului şi menţine proliferarea diferenţierea şi migrarea
celulară Ingineria tisulară convenţională a icircncercat să imite proprietăţile ţesutului osos nativ doar
la nivel micromolecular şi macromolecular fiind neglijate icircnsă structurile de la nivel
submicromolecular şi nanomolecular [83]
De asemenea numeroase studii icircn acest domeniu au arătat că nu este suficientă realizarea
unor suporturi pentru regenerarea osoasă luacircnd icircn considerarea doar compoziţia chimică a
osului deoarece acestea nu vor avea proprietăţi mecanice similare cu ale osului natural şi vor
afecta metabolismul acestuia cacircnd vor fi implantate in vivo
Pentru realizarea unui substituent osos care să poată fi aplicat cu succes pentru tratarea
unor defecte osose de diferite cauze trebuie să se ţină cont atacirct de compoziţia naturală a osului
dar cel mai important trebuie să se imite nanostrucutura lui deoarece arhitectura nanostructurală
a osului este esenţa lui atacirct icircn ceeea ce priveşte proprietăţile mecanice cacirct şi bioresorbabilitatea
Realizarea unor matrici de colagen icircn care s-a icircncercat reproducerea mineralizării intrafibrilare a
dus la obţinerea unor suporturi ce pot fi aplicate cu succes icircn ingineria tisulară și regenerarea
ţesutului osos [84]
Avacircnd icircn vedere aspectele mai sus menționate se poate spune că suporturilor preparate
plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important imitacircnd nanostructura sa sunt
suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg procesele substanţele dispozitivele
sistemele facute de om care imită natura [85]
38
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Suporturi compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
Compozitele sunt materiale solide ce au la bază o combinație de minim două materiale cu
propietăți diferite dezavantajele individuale ale acestora sunt diminuate fiind păstrate și puse icircn
valoare doar avantajele fiecărui componet al compozitului
Icircn ingineria tisulară și medicina regenerativă se utilizează mai multe varinte de
compozite co-polimeri polimer ndash polimer sau polimer ndash ceramice Unul din cei mai utilizați co-
polimeri icircn ingineria tisulară osoasă este poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA Compozitele
polimer sintetic ndash polimer sintetic sunt amestecuri de minim doi polimeri sintetice un exemplu
fiind compozitul pe bază de PLGA și polifosfazene asocierea acestora avacircnd drept obiectiv
principal obținerea unor produși de degardare neutri Se pot combina și polimeri sintetici cu
polimeri naturali pentru realizarea de compozite de exemplu PLGA și colagen
Compozitele polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje
care pleacă de la faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele
matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă) De-a lungul timpului au fost studiate și compozite
polimeri sintetici ndash ceramice de exemplu compozite pe bază de poli (acid lactic) poli (acidul
lactic-co-glicolic) hidroxiapatită dar studiile concentrate pe compozitele polimeri naturali ndash
ceramice au avut cele mai bune rezultate de-a lungul timpului [34]
Avantajele unui compozit pe bază de biopolimeri și ceramice ar fi pe de o parte
proprietățile mecanice variabile degradarea controlată și structura fizică a polimerilor iar pe de
altă parte rezistența și natura biomimetică a ceramicelor Combinarea de biopolimeri cu
ceramice elimină un mare dezavantaj al acestora din urmă și anume faptul că sunt casante dar
totodată crește bioactivitatea și capacitatea de transport și eliberare de agenți bioactivi [75]
Compozitele pe bază de colagen și hidroxiapatită au fost de-a lungul timpului cele mai
studiate compozite biopolimeri ndash ceramice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
13 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Icircn ultimii ani interesul pentru nanotehnologie a crescut semnificativ Particulele magnetice
fac parte din grupul materialelor utilizate icircn nanotehnologii cu un impact considerabil icircn diverse
domenii chimie biosenzori nanomedicină etc Cele mai importante aplicații ale lor sunt legate
39
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de obținerea particulelor de dimensiuni nanometrice denumite nanoparticule magnetice ndash MNPs
utilizate ca metode de diagnostic prin separarea magnetică a unor entități biologice utilizarea icircn
scop terapeutic și ultima aplicație aceasta fiind una din cele mai des folosite icircn medicină
utilizarea la rezonanța magnetică nucleară [86]
Utilizate icircn scop terapeutic nanoparticulele magnetice au fost evaluate pentru eliberarea
controlată de medicamente Prin utilizarea atracției magnetice sau a direcționării specifice a unor
biomarkeri tumorali nanoparticulele magnetice oferă o soluție atractivă pentru terapia directă cu
agenți chimioterapici care vor fi eliberați icircntr-un loc specific doză de medicament care ar fi fost
utilizată icircn mod curent fiind astfel redusă semnificativ și o dată cu ea efectele adverse asociate
cu absorbția de către țesuturi sănătoase a medicamentului [87]
MNPs folosite icircn aplicaţiile biomedicale trebuie să fie superparamgnetice adică să aibă
proprietatea de a putea fi magnetizate doar icircn prezenţa unui cacircmp magnetic extern De asemenea
trebuie să aibă dimensiuni mici pentru a nu fi eliminate din circulaţie de către ficat sau splină
după ce cacircmpul magnetic este icircnlăturat Icircn general cu cacirct particulele au dimensiuni mai mari cu
atacirct este mai mic timpul lor de icircnjumătăţire icircn plasma
Cele mai utilizate surse de materiale magnetice sunt oxizii de fier cu structură de miez ce
au mai multe forme cristaline polimorfe hematită α-Fe2O3 maghemită β-Fe2O3 γ- Fe2O3 şi
magnetită ε-Fe2O3 Fe3O4 precum şi alte forme amorfe Singurele utilizate icircn aplicaţiile medicale
sunt maghemita şi magnetita Pentru realizarea miezului magnetic a unor nanoparticule
magnetice se utilizează icircn unele aplicaţii şi fierul carbonil datorită dimensiunilor mici ale
particulelor sale [88] [89]
Pentru a icircmbunătăţi proprietăţile fizice şi chimice ale particulelor magnetice acestea sunt
adesea acoperite cu silica polimeri anumiţi surfactanţi sau diverşi compuşi organici Acoperirea
cu polimeri oferă o serie de avantaje nanoparticulelor magnetice numărul mare de grupări
funcţionale ale polimerilor permite alte funcţionalizări ale particulelor toxicitatea este complet
redusă are rol icircn stoparea procesului de oxidare etc Datorită atracţiei puternice dipol-dipol
dintre particule MNP tind să se aglomereze dar pentru a icircnlătura acest dezavantaj MNP sunt
acoperite cu polimeri hidrofilici cum sunt dextranul şi chitosanul Grupările funcționale ale
chitosanului permit funcționalizarea nanoparticulelor cu diverși agenți bioactivi prin stabilirea de
legături chimice icircntre grupările chitosanului și cele ale agentului
Reprezentarea unei nanoparticule magnetice acoperită cu polimer este redată icircn figura 121
40
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 121 Reprezentarea schematică a unei nanoparticule acoperite cu polimer cu funcții
aminice
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular cercetările
științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind cel de eliberarea
de principii active controlată și țintită
Nanoparticulele sunt integrate prin diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale
pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă
creștere deorece studii mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația
vizată
Icircn urma unui studiu de literatură amănunţit se poate realiza o clasificarea a suporturilor
magnetice pe bază de biomateriale cu aplicaţii icircn ingineria tisulară şi regenerarea osoasă icircn
funcţie de compoziție și icircn funcție de forma de prezentare
Icircn funcție de compoziție suporturile magnetice se pot clasifica icircn suporturi magnetice cu
biopolimeri care se clasifică la racircndul lor icircn suporturi magnetice pe bază de proteine şi suporturi
magnetice pe bază de polizaharide suporturi magnetice cu polimeri sintetici suporturi magnetice
cu materiale ceramice Icircn funcție de forma de prezentare suporturile magnetice se clasifică icircn
suporturi magnetice poroase hidrogeluri magnetice membrane magnetice nanofibroase și sticle
bioactive magnetice (figura 122)
41
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 122 Clasificarea suporturilor magnetice
131 Suporturi magnetice cu biopolimeri
1311 Suporturi magnetice cu proteine
Colagenul gelatina și fibroina din mătase sunt trei din proteinele cele mai utilizate icircn
sinteza de suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi magnetice cu colagen
Unul din primele studii ce prezintă conceptul de suporturi magnetice a fost publicat icircn
2010 de Bock şi colaboratorii [90] prezentacircnd realizarea şi caracterizarea a două tipuri de
suporturi magnetice Primul tip de suport a fost obţinut din hidroxiapatită şi colagen (7030 ww)
reticulat cu 14-butandiol diglicidil eter sub formă de structuri liofilizate microporoase şi
macroporoase avacircnd diametrul de 122plusmn08 mm şi icircnălţimea 47plusmn08 mm Al doilea tip de suport
a fost obţinut din 100 colagen liofilizat sub formă de structuri poroase omogene cu diametrul
42
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de 123plusmn1 mm şi icircnălţime 28plusmn09 mm Icircn vederea magnetizării ambele tipuri de suporturi au
fost imersate pentru 15 min icircn 1ml fero-fluid trei tipuri diferite de fero-fluide fiind utilizate
(figura 123) Fero-fluidele reprezentacircnd nanoparticule magnetice cu dimensiunea de 200 nm
dispersate icircn apă au fost notate FF-DXS (nanoparticule de magnetită acoperite cu sulfat de
dextran și funcționalizate cu grupări funcționale de sulfat de sodiu) FF-PAA (nanoparticule de
magnetită acoperite cu acid poli-DL-aspartic și funcționalizate cu carboxilat de sodiu) și FF-DP
(nanoparticule de magnetită acoperite cu amidon și funcționalizate cu grupări fosfat)
Figura 123 Reprezentarea schematică a procedeului de preparare a suporturilor magnetice [90]
Valorile obținute pentru magnetizarea suporturilor sunt considerate potrivite pentru
generarea de gradient magnetic icircn suport precum și icircn vecinătatea acestuia Studiile in vitro de
biocompatibilitate au dovedit că suporturile magnetice obținute susțin adeziunea și proliferarea
celulelor stem Icircn concluzie suporturile obținute au potențialul de a fi considerate substituenți
osoși avacircnd ca și noutate față de variantele standard proprietatea de a atrage particule magnetice
funcționalizate cu medicamente [91]
Icircn 2013 Panseri și colaboratorii [92] descriu icircntr-un studiu obținerea și caracterizarea de
suporturi magnetice obținute prin două metode diferite metoda A și metoda B Metoda A are la
bază magnetizarea in situ și constă icircn nucleația de apatită biomimetică și 7 nanoparticule
magnetice (cu dimensiunea mai mică de 50 nm achiziționate de la Sigma Aldrich) pe fibrile de
colagen autoasamblate Metoda B reproduce procedeul de obținere descris icircn studiul mai sus
43
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
menționat (Bock și colaboartorii) un suport poros pe bază de hidroxiapatită și colagen fiind
imersat icircn fero-fluidul FF-DP Din datele de microscopie electronică de baleiaj (SEM) autorii au
observat icircn cazul suporturilor obținute prin metoda A o distribuție omogenă a nanoparticulelor
magnetice pe fibrele de colagen iar icircn cazul suporturilor obținute prin metoda B o aglomerare a
nanoparticulelor Teste in vivo complexe au fost realizate utilizacircnd suporturile obținute
rezulatele indicacircnd potențialul acestora de a fi utilizate icircn aplicații ale ingineriei tisulare a
țeustului osos Icircntr-un studiu următor autorii funcționalizează hidroxiapatita cu ioni de fier (Fe2+
şi Fe3+
) conferindu-i astfel proprietăţi superparamagnetice şi totodată diminuacircnd potenţialul
citotoxic ce poate fi uneori dat de magnetită sau de unii oxizi de fier
Suporturi magnetice cu gelatină
Samal şi colaboratorii [93] evidenţiază obţinerea şi caracterizarea de suporturi magnetice
pe bază de gelatină Soluţii de gelatină amestecate cu concentraţii diferite de fero-fluid (particule
de magnetită acoperite cu acid poli-acrilic dispersate icircn apă) au fost transferate icircn plăci de
polistiren cu mai multe straturirezultacircnd membrane ce au fost apoi legate chimic cu ajutorul
carbodiimidelor icircn vederea obţinerii suporturilor
Gelatina a fost utilizată şi de Dashnyam şi colaboratorii [94] pentru obţinerea unor
suporturi magnetice hibride Suporturile au fost obţinute din gelatină şi siloxan printr-un
procedeu sol-gel icircn timpul căruia au fost icircncorporate 3 nanoparticule magnetice ultimul pas
pentru obţinerea unor suporturi foarte poroase a fost liofilizarea Icircn urma unor teste mecanice
efectuate autorii au observat o icircmbunătăţire semnificativă a proprietăţilor mecanice ale
suporturilor datorită icircncorporării de nanoparticule magnetice icircn strucura acestora Icircn cadrul
studiului au fost realizate teste de populare cu celule (stem mezenchimale izolate din şobolan) a
suporturilor avacircnd nanoparticule magnetice icircncorporate precum şi a suporturilor fară
nanoparticule magnetice icircncorporate rezultatele indicacircnd o proliferare celulară icircmbunătăţită icircn
cazul primelor suporturi menţionate
Suporturi magnetice cu fibroină din mătase
Icircntr-un studiu publicat recent fibroina a fost utilizată icircmpreună cu chitosan şi nanoparticule
magnetice pentru realizarea unor suporturi cu porozitate controlată cu aplicaţii icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos O soluţie de fibroină şi chitosan a fost preparată avacircnd raportul masic
44
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
31 şi reticulată cu o soluţie 08 glutaraldehidă Patru fero-fluide avacircnd concentraţiile
nanoparticulelor magnetice 0 05 1 şi 2 au fost adăugate icircn soluţia de polimeri iar
soluţiile astfel obţinute au fost transferate icircntr-o matriţă de politetrafluoretilină aşezată icircntr-o
placă de cupru rece a cărui temperatură a fost controlată cu azot lichid Cristale de gheaţă
unidirecţionale s-au format cu o viteză de solidificare de 1degCminut soluţia icircngheţată rezultată
fiind icircntr-o ultimă etapă liofilizată (figura 124)
Activitatea fizico-chimică a suporturilor obţinute a fost studiată icircn soluţii saline de tampon
fosfat pentru a determina retenţia de fluide şi biodegradarea Stabilitatea nanoparticulelor
magnetice din suporturile obţinute a fost analizată utilizacircnd Spectroscopie de absorbţie atomică
Toate cele patru suporturi realizate s-au dovedit a avea o bună biocompatibilitate icircn urma
testelor MTT [95]
Figura 124 a) Reprezentarea schematică a procesului de obținere asuporturilor b) Structurile
chimice al polimeriloragentului reticulant și interacțiunile dintre aceștia c) Dimensiunea
suporturilor și diferența de culoare dată de variația concentrației de nanoparticule magnetice
d) Suportul este atras de un magnet permanent [95]
Suporturi magnetice pe bază de fibroină din mătase au fost realizate şi caracterizate de
Samal şi colaboratorii Nanoparticulele magnetice au fost integrate icircn suporturi prin imersare
rezultacircnd diferite grade de magnetizare Suporturile obţinute s-au dovedit a avea foarte bune
45
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţi de hipertermie ajungacircnd la temperaturi ce au crescut cu 8degC icircn 100 secunde Testele
de biocompatibilitate au indicat lipsa citotoxicităţii suporturilor precum şi capacitatea acestora de
a susţine adeziune şi proliferarea celulară [96]
Hidrogeluri magnetice au fost obţinute printr-un proces de electro-gelifiere a unui soluţii
concentrate de fibroină din mătase (8 ) cu scopul de a fi utilizate ca şi suporturi icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos Patru feluri de suporturi au fost realizate suporturi avacircnd icircncorporate
nanoparticule magnetice (Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice acoperite
cu albumină serică umană (HSA-Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice
acoperite cu albumină serică umană şi conjugate fizic cu factori de creştere fibroblastici bazali
(HSA-Fe3O4-bFGF) şi suporturi fără niciun fel de nanoparticule magnetice Morfologia
suporturilor a fost studiată cu ajutorului microscopiei electronice de baleiaj Citotoxicitatea lor a
fost analizată printr-un test MTT realizat pe osteoblaste de linie iar activitatea osteogenică a fost
studiată din punct de vedere a fosfatazei alcaline a cantităţii de calciu mineralizat şi a
colagenului Analizacircnd rezultatele testelor menţionate autorii consideră că suporturile obţinute
pot fi utilizate pentru aplicaţia vizată [97]
1312 Suporturi magnetice cu polizaharide
Chitosanul este polizaharidul cel mai utilizat icircn studiile privind sinteza și caracterizarea de
suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi biocompozite magnetice pe bază de chitosan şi carboximetilceluloză au fost
obţinute şi caracterizate de către Grumăzescu şi colaboratorii [98] Carboximetilceluloza cel mai
utilizat eter de celuloză este o polizaharidă cu lanţ liniar solubilă icircn apă datorită grupărilor
carboximetil (CH3COONa) introduse icircn molecula de celuloză Deoarece are icircncărcătură electrică
opusă chitosanului reacţionează puternic cu acesta utilizacircndu-se ca agent de reticulare ionic la
anumite valori ale pH-ului Autorii au studiat morfologia suporturilor eficacitatea utilizării
acestora ca şi sisteme de eliberare controlată de antibiotice in vitro precum şi intercaţiunea lor cu
celule eucariotice Rezultate studiilor menţionate au demonstrat că suporturile magnetice
biocompozite propuse de autori pot fi utilizate cu succes icircn viitor icircn domeniul medical icircn
special icircn ingineria tisulară
Heidari şi colaboratorii [99] prezintă icircntr-un studiu recent prepararea in situ a unor
nanoparticule de oxid de fier icircn matrici de hidroxiapatităchitosan pentru aplicaţii icircn ingineria
46
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
ţesutului osos Atacirct hidroxiapatita cacirct şi chitosanul au fost extrase din surse naturale os cortical
bovin pentru hidroxiapatită respectiv creveţi pentru chitosan Două cloruri de fier (FeCl2 FeCl3)
au fost dizolvate icircn soluţie de acid acetic sub agitare magnetică pentru 30 min S-a adăugat apoi
pulbere de hidroxiapatită iar după dizolvarea pentru o oră a acesteia s-a adăugat chitosan şi s-a
lăsat la solubilizat pentru icircncă o oră Alte etape au urmat obţinacircndu-se o matrice gel ce a fost
uscată icircn etuvă la 60degC pentru 24 ore Compozitele tridimensionale obţinute au fost supuse unui
număr foarte mare de analize distribuţia particulelor magnetice icircn funcţie de mărime a fost
analizată cu ajutorul unui analizor de particule şi cu ajutorul microscopiei electronice de
transmisie (TEM) morfologia probelor a fost analizată utilizacircnd SEM proprietăţile magnetice au
fost studiate cu ajutorul unui magnetometru cu vibraţii simple (VSM) şi multe altele
Y Wei și colaboratorii [100] publică un studiu icircn care prezintă fabricarea și caracterizarea
de membrane nanofibroase pe bază de oxizi de fier (Fe3O4) chitosan și polialcool vinilic
Chitosanul (CS) și alcoolul polivinilic (PVA) au fost dizolvate separat icircntr-o soluție de acid
acetic iar apoi au fost amsetecate icircn raport de masă CSPVA= 23Nanoparticule pe bază de
Fe3O4 obținute printr-o metodă de co-precipitare au fost adăugate icircmpreună cu etanol icircn
amestecul polimeric Membranele magnetice nanofibroase Fe3O4CSPVA au fost obținute prin
electrofilarea soluției polimerice conținacircnd Fe3O4 Datorită procesului de electrofilare s-a obținut
o porozitate foarte bună a membranelor 839-851 Datele TEM au arătat o distribuiție uniform
a nanoparticulelor magnetice Datele de spectroscopiei icircn infraroșu cu transformată Fourier
(FTIR) și datela de difracției cu raze X (XRD) au demonstrat că structura chimică și
cristalinitatea probelor nu a fost afectată de procesul de electrofilare De asemenea proprietățile
mecanice proprietățile magnetice și interacțiunea cu osteoblaste aparținacircnd linie de celule
tumorale MG-63 au sugerat că membranele magentice obținute au un real potential pentru
viitoare aplicații privind regenerarea osoasă
132 Suporturi magnetice cu polimeri sintetici
Icircn ultimii 100 ani materialele sintetice sunt utilizate pentru repararea şi regenerarea unei
varietăţi de ţesuturi şi organe [101] Deoarece in vivo osul este adesea supus forţelor mecanice
rezultate icircn urma acţiunii muşchilor şi a mişcărilor corpului una din cerinţele de bază impuse
unui suport realizat cu scopul de a fi utilizat icircn ingineria tisulară a ţesutului osos este aceea de a
fi capabile să suporte stimulii mecanici Biomaterialele sintetice rezultate icircn urma polimerizării
47
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
acidului lactic a acidului glicolic sau a caprolactonei sunt studiate pentru realizarea de suporturi
compozite de obicei icircn combinaţie cu polimeri naturali [102]
Poli (acidul lactic)
Suporturile magnetice pe bază de PLA sunt icircn prezent puțin studiate unul din puținele
studii pe această temă fiind publicat icircn 2007 Lucrarea respectivă se concentrează pe analiza
influenței orientării fibrelor unui suport magnetic pe bază de poli (acid L-lactic) ndash PLLA obținut
prin procedeul de electrofilare asupra proprietăților sale mecanice Pentru realizarea suportului
o soluție de 3 PLLA icircn hexafluoro-2-propanol a fost amestecată cu nanoparticule de magnetită
(Fe3O4) icircn raport PLLAFe3O4 - 955 Amestecul a fost sonicat și apoi electrofilat S-a studiat
morfologia suporturilor obținute interacținuea cu celule precum și rezistența mechanică [102]
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Suporturi nano-compozite superparamagnetice pe bază de PLGA pentru ingineria tisulară
au fost realizate de Lai și colaboratorii Icircntr-o primă etapă PLGA și nanoparticule de magnetită
superparamagnetice hidrofobe (MNPs) au fost amestecate separat icircn diverse rapoarte masice (19
și 11) Icircn a doua etapă cele două amestecuri au fost transferate separat icircntr-o seringă de sticlă de
10 ml conectată la un ac cu dimensiunea de 6 gauge Un electrod a fost montat la ac iar
amestecul respectiv a fost electrofilat icircn timpul procesului tensiunea fiind păstrată constantă la
20 kV viteza de filare fiind de 1 mlH Icircn funcție de raportul PLGA MNPs s-au obținut două
suporturi diferite PLGA-10 MNPs și PLGA-50 MNPs Datele SEM și TEM au evidențiat o
dimensiune a fibrelor suporturilor de 400-600 nm cu MNPs distribuite uniform Suporturile
compozite s-au dovedit a avea o biocompatibilitate excelentă susținacircnd semnificativproliferarea
celulară [103]
Poli (caprolactona)
Unul dintre primele studii care prezintă suporturi magnetice pe bază de PCL a fost
prezentat de Kim și colaboratorii [104] Pentru realizarea suporturilor s-a preparat icircntr-o primă
etapă o soluție de 10 PCL (cu masa molară 80 kDa) icircn cloroform După solubilizare completă
icircn soluția de 10 PCL s-au adăugat două concentrații diferite de nanoparticule magnetice
(MNPs) 05 și 10 față de cantitatea de PCL solubilizată Icircn funcție de concetrația de
48
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanoparticule adăugate suporturile au fost notate PCL-MNP5 (5 MNP) PCL-MNP10 (10
MNP) și PCL (nu conține MNPs) După ultrasonicare soluțiile au fost icircnghețate la -70degC iar
apoi liofilizate pentru 3 zile Adăugarea de MNPs icircn suporturile pe bază de PCL a condus la o
icircmbunătățire a hidrofilicității precum și a proprietăților mecanice a acestora Autorii au
demonstrat că suporturile PCL-MNP au capacitatea de a susține adeziunea celulară precum și
mineralizarea avacircnd o bună biocompatibilitate Suporturi realizate după același protocol
prezentat icircn studiul menționat mai sus sunt riguros studiate in vitro și in vivo din punct de vedere
al biocompatibilității și al interacțiunii cu celule și țesuturi Rezultatele obținute icircn respectivul
studiu indică un potențial considerabil al acestor suporturi de a fi utilizat pentru repararea și
regenerarea osoasă [105]
Suporturi magnetice nanofibroase pe bază de PCL sunt prezentate și icircntr-un studiu publicat
icircn 2016 Icircntr-o soluție de 10 PCL icircn diclometan-etanol s-au icircncorporat două concentrații
diferite de nanoparticule magnetice conjugate cu COOH (10 și 20 COOH-MNPs)
amestecurile obținute fiind electrofilate la temperatura camerei obținuacircndu-se astfel suporturi
magnetice nanofibroase Microstructura și nanostructura suporturilor a fost analizată cu ajutorul
SEM și a microscopiei electronice de transmisie TEM Structura chimică a fost studiată prin
intermediul FTIR iar cristalinitatea prin intermediul XRD S-au studiat de asemenea
proprietățile hidrofile al suporturile proprietățile magnetice și foarte important
biocompatibilitatea acestora și interacțiunea cu celulele [106]
Gloria și colaboratorii [107] prezintă realizarea și caracterizarea de suporturi magnetice pe
bază de PCL cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos După solubilizarea PCL (masa
molară 65 kDa) icircn tetrahidrofuran s-au adăugat separat 3 concentrații diferite de nanoparticule
magnetice (hidroxiapatită dopată cu ioni de fier ndash FeHA) cu diametrul de 20 nm respectacircndu-se
următoarele rapoarte masice PCLFeHA 9010 8020 și 7030 Pentru o distribuție uniformă a
nanoparticulelor magnetice icircn soluția polimerică cele trei amestecuri polimer-nanoparticule au
fost ultrasonicate Următoarea etapă pentru obținerea suporturilor a fost turnarea amestecului icircn
matrițe speciale obținacircndu-se icircn final suporturi cu diametrul de 64 mm și o grosime de 05 mm
Icircn urma analizei datelor XRD autorii au observat că procesul de formare al suporturilor nu
afecteză structura și cristalinitatea acestora Analiza biologică a substraturilor a evidențiat
abilitatea acestora de a susține diferențierea osteogenică
49
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
De remarcat este studiul publicat de Santis și colaboratorii icircn care prezintă realizarea și
caracterizarea unui suport hibrid pe bază de PCL și polietilen glicol (PEG) și nanoparticule
magnetice cu potențiale aplicații icircn regenerarea țesutului osteocartilaginos Suportul hibrid
multistrat a fost obținut prin combinarea a două tehnici de formare a suporturilor imprimare 3D
și stereolitografie [108]
Poli (3- hidroxibutiratul) ndash P(3HB)
Akaraonye și colaboratorii [109] prezintă realizarea și caracterizarea de nanocompozite
magnetice pe bază de P(3HB) cu potențiale aplicații icircn ingineria țesutului osos Două tipuri de
nanocompozite magnetice au fost realizate nanocompozite pe bază de P(3HB) și nanoparticule
magnetice ndash P(3HB)MNP și nanocompozite pe bază de P(3HB) și ferofluid - P(3HB)FF S-a
observat o icircmbunătățire a cristalinității suporturilor compozite ca urmare a icircncorporării
nanoparticulelor magnetice și a ferofluidului icircn suportul polimeric un grad de cristalintate ridicat
al suporturilor fiind benefic regenerării ososoase Propritățile termomecanice favorabile precum
și biocompatibilitatea suporturilor realizate icircn lucrare indică o potențială utilizare a acestora icircn
aplicații ce vizează repararea și regenerarea țesutului osos
133 Suporturi magnetice pe bază de biomateriale ceramice
1331 Sticle ceramice bioactive
Datorită biocompatibilității lor ridicate sticlele bioactive pe bază de siliciu sunt utilizate
pentru refacerea unor defecte mici și chiar medii fiind adesea utilizate cu rolul de grefe icircn
intervenții chirurgicale parodontale și maxilofaciale De asemenea se utilizează pentru refacerea
unor defecte osoase ale urechii medii sau ale coloanei vertebrale Superioare sticlelor bioactive
non-mezoporoase icircn ceea ce privește volumul nanoporos bioactivitatea și degradarea sticlele
bioactive mezoporoase (MBG) au fost fabricate pentru prima dată icircn 2004 de Yan și
colaboratorii avacircnd formula chimică SiO2-CaO-P2O5 [110] Loacutepez-Noriega și colaboratorii au
demonstrat icircntr-un studiu capacitatea sticlelor MBG de a lega și elibera medicamente anti-
osteoporotice [111]
Wu și colaboratorii [112] publică un studiu ce are drept obiectiv principal realizarea unor
suporturi multifuncționale pe bază de MBG și fier (Fe) cu potențiale aplicații icircn terapia
hipertermică (hipertermie) și eliberarea controlată de medicamente pentru tratamentul unor
50
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
afecțiuni osoase maligne Suporturile poroase Fe-MBG (avacircnd icircncorporat 5 sau 10 Fe) au
fost pregătite utilizacircnd co-șabloanele copolimerului tribloc Pluronic P123 (utilizat pentru a
conferi o structură mezoporoasă avacircnd o dimensiune de cacircțiva nanometri) și bureți de
poliuretan(utilizați pentru a creea pori mari avacircnd dimensiuni de cacircteva sute de micrometri)
Prima etapă pentru obținerea celor două suporturi magentice 10 Fe-MBG (10Fe-MBG) și 5
Fe-MBG (5Fe-MBG) a fost solubilizarea icircn etanol de cantități diferite de P123
tetraetilortosilicat (TEOS) Ca(NO3)2∙4H2O FeCl3 trietilfosfat (TEP) și HCl sub agitare
magnetică pentru 24 ore Bureți de poliuretan au fost imersați pentru 10 min icircn soluția obținută icircn
prima etapă iar după icircndepărtarea soluției icircn exces au fost lasați la uscat la temperatura camerei
pentru 24 ore Această etapă a fost repetată de 5 ori după care bureții au fost calcinați la 700degC
pentru 5 ore Pe lacircngă cele două suporturi a fost realizat și un suport 0Fe-MBG care după cum
indică și numele nu conține fier Suporturilor obținute au fost caracterizate utilizacircnd diferite
tehnici SEM și EDS (figura 125) precum și XRD și TEM
Figura 125 a) c) e) Rezultatele SEM b) d) f) Rezultatele EDS [112]
De asemenea s-au realizat diverse teste pentru analiza proprietăților magnetice a
proprietăților mecanice a eliberării controlate de medicament din suport și a contactului cu
51
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
celule stem din măduvă osoasă umană Rezultatele obținute icircn urma studiilor menționate indică
faptul că suporturile sunt magentice degradabile bioactive și au capacitatea de eliberare
controlată de medicamente
1332 Fosafați de calciu
Panseri și colaboratorii [113] prezintă icircntr-un studiu realizarea și caracterizare in vitro a
unor suporturi compozite ceramice poroase Trei tipuri diferite de suporturi au fost fabricate din
hidroxiapatită (HA) ce icircncorporează magnetită (Mgn) avacircnd următoarele rapoarte HAMgn
955 HAMgn 9010 și HAMgn 5050 De asemenea s-a realizat un suport avacircnd raportul
HAMgn 1000 ce a fost utilizat drept control Diverse teste in vitro de biocompatibilitate au fost
realizate utilizacircnd linii celulare de osteoblaste umane Saos-2 teste de proliferare celulară teste
privind activitatea fosfatazei alcaline a celulelor teste de viabilitate celulară livedead etc
Rezultatele acestor teste au indicat o foarte bună biocompatibilitate a suporturilor ceea ce indică
faptul că adăugarea de magnetită icircn structura suporturilor nu a condus la efecte negative asupra
celulelor De asemenea suporturile au fost implantate in vivo la iepuri obținacircndu-se rezultate
bune
14 Concluzii
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta
aceste defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din
biomateriale sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea
celulelor osoase icircn timpul procesului de regenerarea osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau
regenerarea ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor
artificiale și a suporturilor Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase
52
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
sisteme injectabile capsule filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte
tuburi geluri etc
Suporturilor preparate plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important
imitacircnd nanostructura sa sunt suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg
procesele substanţele dispozitivele sistemele facute de om care imită natura Compozitele
polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje care pleacă de la
faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele matricei
extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă)
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular
cercetările științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind
cel de eliberarea de principii active controlată și țintită Nanoparticulele sunt integrate prin
diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă creștere deorece studii
mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația vizată
53
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Obținerea și caracterizarea de suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi
de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Capitolul 2 Materiale şi metode experimentale
21 Strategie experimentală Obiective
Regenerarea osoasă și inginerie tisulară a țesutului osos sunt două domenii intens studiate
datorită creșterii numărului de afecțiuni osoase infecții osoase pierderi de cauză traumatică ale
masei de țesut osos tumori osoase Autogrefele au fost o perioadă mare de timp cele mai
utilizate materiale pentru regenerarea și substituția osoasă icircnsă au multiple dezavantaje
ingineria tisulară atragacircnd tot mai mult atenția icircn special unele suporturi complexe pentru
ingineria tisulară a țesutului osos Icircn capitolul 1 au fost prezentate limitările metodelor actuale de
tratament şi necesitatea reală de găsire a unei metode alternative efective care să aibă drept scop
regenerarea osoasă
Ingineria tisulară domeniu interdisciplinar de mare actualitate oferă soluţii promiţătoare
pentru realizarea de materiale pentru regenerarea tisulară Plecacircnd de la structura țesuturilor
biologice componentele ingineriei tisulare sunt următoarele o matrice sau un suport celule și
molecule semnal suportul fiind componenta cheie
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă este rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea unui
material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și regenerare
osoasă ar putea fi un suport magnetic biomimetic
Icircn urma analizei rezultatelor stiinţifice din domeniul ingineriei tisulare și regenerării osoase
s-a ales pentru lucrarea de faţă o strategie de cercetare care a avut ca obiectiv central
Avacircnd icircn vedere componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă) au fost selectate biomaterialele
utilizate icircn studiile de față după cum urmează pentru componenta organică au fost selectați
biopolimeri adesea utilizaţi icircn studii ce vizează regenerarea țesutului osos şi fosfați de calciu
54
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
pentru componenta anorganică Noutatea tezei este dată de adăugarea de particule magnetice
(magnetită funcţionalizată cu chitosan) icircn amestecul supus procedeului de co-precipitare ce vor
fi funcționalizate cu diverși bioagenți (medicamente) și vor avea rolul de transportori ai acestora
Un suport magnetic biomimetic cu design adecvat este dispozitivul ideal pentru a ghida
formarea de neo-ţesut atacirct in vitro cacirct şi in vivo Suporturile pentru ingineria tisulară a osului
trebuie să fie biocompatibile să mimeze structura şi funcţia biologică a matricei extracelulare şi
să ofere suport mecanic pentru ţesutul icircn formare şi de asemenea să elibereze icircn locul unde are
loc repararea ţesutului diverse molecule celule factori de creştere Totodată suportul trebuie să
fie osteoconductiv şi osteoinductiv şi să aibă o rată de degradarea controlată
O mare parte din suporturile propuse de unele studii icircn domeniu nu mimează şi arhitectura
matricii extracelulare naturale acesta fiind motivul pentru care rezulatele unor astfel de studii nu
sunt satisfăcătoare Suportul trebuie să fie biomimetic adică să mimeze nu doar compoziția
osului ci cel mai important nano-structura sa Astfel pentru tema de cercetare abordată s-a ales
un procedeu biomimetic de co-precipitare in situ a fosfaţilor de calciu icircn soluţii de biopolimeri
inspirat din procesul natural de mineralizare unde mineralele sintetizate de către organism sunt
combinate cu componentele organice ale matrici extracelulare a ţesutului osos
Pentru partea organică a suporturilor s-au utilizat diverși polimeri naturali chitosan acid
hialuronic gelatină albumină şi colagen
Pentru partea anorganică a suporturilor s-au utilizat fosfaţi de calciu sintetici deoarece
prezintă o strucutură similară cu cea a mineralului primar din componenţa ţesutului osos avacircnd
rolul de stimuli osteoconductivi şi osteoinductivi Aceştia s-au obţinut prin precipitarea din
precursori azotat de calciu ndash Ca(NO3)2 CaCl2 şi fosfat monosodic ndash NaH2PO4
Utilizarea particulelor magnetice este un concept intens studiat icircn domeniul inginerie
tisulare Acesta implică utilizarea de nanoparticule magnetice care sunt funcționalizate cu factori
de creștere medicamente sau alți agenți bioactivi care vor fi preluate de către suportul magnetic
ca urmare a acțiunii unui camp magnetic icircn apropierea zonei unde este implantat suportul
Nanoparticulele magnetice funcţionalizate acţionează ca transportatori de agenţi bioactivi către şi
icircn interiorul suportului magnetic După ce patrund icircn suportul magnetic aceste particule
magnetice eliberează succesiv moleculele pe care le transportă Suporturile obţinute au fost
riguros analizate din punct de vedere fizico-chimic şi biologic
55
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
22 Materiale utilizate
221 Materiale utilizate pentru prepararea suporturilor
Analizacircnd icircn amănunt proprietăţile biopolimerilor utilizaţi icircn studii ce vizează obţinerea de
suporturi pentru regenerarea osoasă prezentate icircn capitolul 1 cinci biopolimeri au fost utilizaţi
pentru prepararea loturilor de suporturi două polizaharide şi trei proteine
Fosfaţi de calciu se vor obţine din precursori lor
Polizaharide
Chitosan ndash Cs CAS 9012-76-4 cu masă molară medie M = 309900 Da grad de
deacetilare 792 achiziţionat de la Vascon Co Canada
Hialuronat de sodiu din Streptococcus equindash Hya CAS 9067-32-7 M = 15-18 x
10E6
Da solubilitate = 5 mgml (H2O)Sigma Aldrich Germania
Proteine
Colagen ndash Col tip I+III acido-solubil extras din derm bovin 096 ρ= 097 gcm3
obţinut de la firma Lohmann amp Rauscher Newied Germania
Gelatină ndash G CAS 9000-70-8 pH 38 ndash 76 solubilitate = 10 gL (H₂O 25degC) Merck
Germania
Albumină serică bovină ndash Bsa CAS 9048-46-8 pulbere liofilizată ge 98
(electroforeză icircn gel de agaroză) Sigma-Aldrich Germania
Precursori de fosfaţi de calciu (CP)
Azotatul de calciu ndash Ca(NO3)2∙4H2O CAS 13477-34-4 M = 23615 gmol Sigma-
Aldrich Germania
Clorură de calciu ndash CaCl2middot2H2O CAS 10035-04-8 M = 14701 gmol solubilitatea =
1280 gL ρ = 185 gcm3 (20degC) Merck Germania
Fosfatul monosodic ndash NaH2PO4∙ 2H2O CAS 13472-35-0 pH=41-45 (25degC 5 icircn
soluţie) M = 13799 gmol Sigma-Aldrich Germania
Amoniac soluţie ndash NH4OH CAS 1336-21-6 soluţie 25 Sigma-Aldrich Germania
56
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Particule magnetice (MNPs)
Magnetită ndash Mag sintetizată printr-un procedeu de co-precipitare [114]
Chitosan ndash Cs low CAS 9012-76-4 chitosan cu masă moleculară mică M = 50000-
190000 Da (icircn funcţie de vacircscozitate) vacircscozitate 20-300 cP pentru o soluţie 1 icircn acetic acid
(1 25degC) Sigma-Aldrich Germania
Pluronicreg F-127 CAS 9003-11-6 pH= 6-7 Sigma-Aldrich Germania
Tripolifosfat de sodiu ndash TPP CAS 7758-29-4 Na5P3O10 85 M = 36786 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Doxorubicin hydrochloride ndash DOX CAS 25316-40-9 C27H29NO11 ∙HCl M = 57998
gmol utilizată la pentru studiul de eliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi Sigma-
Aldrich Germania
222 Materiale utilizate pentru caracterizarea suporturilor
Soluţie tampon fosfat pH=72 001 M
Pentru prepararea soluţie tampon fosfat (PBS) pH=72 001 M s-au utilizat
Fosfat monosodic ndashNaH2PO4middot2H2O CAS 13472-35-0 M = 15601 gmol Sigma
Aldrich Germania
Fosfat disodic ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 gmol Sigma Aldrich
Germania
S-au preparat soluţii de fosfat monosodic şi fosfat disodic ambele de concentraţie 001 M
după care cele două soluţii s-au amestecat conform tabel 21
Tabel 21 Proporţiilor de amestecare pentru obţinerea soluţiei PBS pH=72 001M
Fosfat monosodic (ml) Fosfat disodic (ml) pH
28 72 72
Soluţie tampon fosfat (PBS) cu pH 72 şi concentraţie 001 M s-a utilizat pentru
determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic şi la studiile in vitro de
degradare enzimatică
57
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Soluție fluid biologic simulat
Soluția de fluid biologic simulat (SBF) a fost preparată prin dizolvarea icircn apă deionizată a
reactivilor NaCl NaHCO3 KCl Na2HPO4∙2H2O MgCl2∙6H2O CaCl2∙2H2O and Na2SO4 [115]
Reactivii achiziționați de la Merck Germania și Sigma-Aldrich Germania s-au adăugat
unul cacircte unul după ce fiecare reactiv s-a dizolvat complet icircn 700 ml apă deionizată strict icircn
ordinea precizată icircn tabelul 22
Tabel 22 Compoziția chimica a fluidului biologic simulat (SBF)
Ordinea
componentului Reactivi
Cantitate
(gL)
1 NaCl CAS 7647-14-5
M = 5844 gmol 6547
2 NaHCO3 CAS 144-55-8
M = 8401 gmol 2268
3 KCl CAS 7447-40-7
M = 7455 gmol 0373
4 Na2HPO4∙2H2O CAS 10028-24-7
M = 17799 gmol 0178
5 MgCl2∙6H2O CAS 7791-18-6
M = 20330 gmol 0305
6 CaCl2∙2H2O CAS 10035-04-8
M = 14701 gmol 0368
7 Na2SO4 CAS 7757-82-6
M = 14204 gmol 0071
8 (CH2OH)3CNH2 CAS 77-86-1
M = 12114 gmol 6057
Soluția obținută după amestecarea reactivilor s-a ajustat la pH = 74 utilizacircnd o soluție 1M
HCl Din volumul total de acid o parte (aproximativ 20 ml) s-a introdus icircnainte de adaosul celui
de-al șaselea component (CaCl2∙2H2O) pentru a evita apariția fenomenului de precipitare După
adaosul celui de-al 8-lea component [tris (hidroximetil) amino metan] s-a ridicat temperatura
soluției la 37ordmC
58
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Această soluție s-a titrat ulterior cu 1M HCl pacircnă la pH=74 la 37ordmC Icircn timpul procesului
de titrare soluția a fost diluată continuu prin adaos consecutiv de apă deionizată pentru a rezulta
volumul final de 1 L
Concentrația ionilor icircn SBF-ul realizat sunt apropiate de cele care se găsesc icircn plasma
umană așa cum se poate observa icircn tabelul 23
Tabel 23 Concentrațiile ionilor icircn SBF și icircn plasma umană
Concentrație (mM)
Na+
K+
Ca2+
Mg2+
HPO42-
Cl-
HCO32-
SO42-
Plasma umană 1420 50 25 15 10 1030 270 05
SBF 1422 502 247 151 102 1250 272 052
Soluţie tampon fosfat-citrat pH=5
Pentru prepararea soluţiei tampon fosfatndashcitrat pH=5 (după metoda Perse 1980) s-au
utilizat
Fosfat disodic anhidru ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 Sigma-Aldrich
Germania
Acid citric ndash C6H8O7 CAS 77-92-9 M = 19212 gmol Honeywell Riedel-de Haeumln
Germania
S-au preparat o soluţie de Na2HPO4 de concentraţie 02M și o soluție C6H8O7 de
concentraţie 01M după care s-au amestecat volumele specificate icircn tabel 24
Tabel 24 Proporţiile de amestecare pentru obţinerea a 100 ml tampon fosfat-citrat pH=5
Fosfat disodic (ml) Acid citric (ml) Apă distilată (ml) pH
257 243 50 5
59
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Studii in vitro de degradare enzimatică
Tabel 25 Reactivi utilizați pentru studiile in vitro de degradare enzimatică
Determinarea concentrației de
chitosan degradat
Determinarea concentrației de
colagen degradat
Enzime
utilizate
Lizozim ndash 100000 unităţimg
CAS 12650-88-3
M = 143 kDa (a unui singur lanţ)
Sigma-Aldrich Germania
Colagenază clostridium histolyticum
CAS 9001-12-1
M = 68 ndash 125 kDa
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
determinarea
produșilor de
degradare
Fericianură de potasiundash
K3Fe(CN)6
CAS13746-66-2 ge990
M = 32924 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Ninhidrină ndash C9H6O4
CAS 485-47-2
M = 17814 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Clorură de staniu ndashSnCl2
CAS 7772-99-8
M = 1896 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
realizarea
curbei etalon
N-acetil-D-glucozamină ndash
C8H15NO6
CAS 7512-17-6
M = 22121 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Glicină ndash C2H5NO2
CAS 56-406-6
M = 7507 gmol
Fluka Elveţia
Solvenți
Carbonat de sodiu ndash Na2CO3
CAS497-19-8
M = 10599 gmol
Chemical Company Iaşi
2-metoxietanol ndash CH3OCH2CH2OH
CAS 109-86-4
M = 7609 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Teste de citotoxicitate in vitro
Cu excepția solvenților care au fost achiziționați de la Chemical Company Iaşi toate
celelalte materiale prezentate icircn tabelul 26 au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich
Germania
60
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Tabel 26 Reactivi utilizați pentru studiile de citotoxicitate in vitro
Medii de cultură și soluții
de completare
Reactivi pentru
determinare
citotoxicității in vitro
Soluţie salină
Hanksrsquo Balanced
(HBSS)
Solvenți
Mediu de cultură DMEM
(Dulbeccorsquos Modified
Eaglersquos Medium) cu
4500 mgl glucoză
L-glutamat şi bicaronat
de sodiu
Tripsină din pancreas
de porc
CAS 9002-07-7
M = 238 kDa HBSS cu roşu fenol
fără clorură de calciu
şi sulfat de magneziu
Alcool isopropilic
(CH3)2CHOH
CAS 67-63-0
M = 6001 gmol
Mediu de cultură DMEM
F-12 HAM
(amestec de nutrienţi)
cu L-glutamat piruvat de
sodiu 055 gl
glucoză 315 gl
Acid etilen-diamino-
tetraacetic ndash EDTA
CAS 60-00-4
M = 29224 gmol
PSN ndash amestec de
penicilină streptomicină
neomicină
5000 unităţi penicilină 5
mg streptomicină 10
mgml neomicină
MTT ndash C18H16BrN5S
[bromură de (3-[45-
dimetiltiazol-2-il]-25-
difenil) tetrazoliu
CAS 298-93-1
M = 41432 gmol
HBSS cu clorură de
calciu şi sulfat de
magneziu
fără roşu fenol
Alcool etilic
absolut C2H5OH
CAS 64-17-5
M = 4607 gmol
Ser fetal bovin ndash BFS
Calceină AM
CAS 148504-34-1
Teste de citotoxixictate in vivo
Șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28plusmn3
grame materialul biologic provenit din Biobaza INCDMI Cantacuzino București - filiala
Băneasa Reactivi utilizați au fost aleși conform standardului ISO 10993
Betadină ndash soluție cutanată 10
Isofluran 4 ndash soluție pentru inducția anesteziă
Aldehidă formică 10 parafină colorant Tricromic Masson ndash pentru examenul
histopatologic
61
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
23 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu
incluziune de particule magnetice
231 Obţinerea particulelor magnetice
Particulele magnetice au fost obţinute conform protocolului descris de Bălan şi
colaboratorii [116] proprietățile lor fiind prezentate icircn tabelul 27
Tabel 27 Proprietățile particulelor magnetice
Dimensiunea medie
(nm)
Indicile de
polidispersitate
Potențialul Zeta
icircn soluție apoasă de
surfactant (mV)
Magnetizarea
(emug)
178 027 -186 4365
Pe scurt un volum de soluţie de chitosan de masă moleculară mică ndash Cs low a fost
amestecat cu un volum de magnetită ndash Mag şi pluronic F-127
După omogenizare amestecului se va adăuga o soluţie TPP icircn picătură Amestecul final se
va dializă contra apei distilate pentru mai multe zile
232 Obținerea suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu
incluziune de particule magnetice
Suporturilor magnetice au fost obţinute utilizacircnd o metodă biomimetică de co-precipitare a
fosfaţilor de calciu din precursorii săi icircn soluţii de biopolimeri inspirată din procesul natural de
mineralizare etapele procesului de obţinere fiind prezentate icircn figura 21
Soluţiile apoase de precursori de fosfaţi de calciu au fost adăugate icircn amestecul de soluţii
de polimeri Icircnainte de adăugarea precursorilor de fosfaţi de calciu icircn amestecul de soluţii de
polimeri s-au adăugat particule magnetice fie sub formă uscată fie sub formă de suspensie
coloidală
Co-precipitarea s-a realizat icircn prezenţa unei soluţii de amoniac NH4OH (25 ) pacircnă la
obținerea unei valori a pH-ului de 72-74 Fiecare amestec a fost spălat de 3 ori cu apă distilată
prin centrifugare (5000 rpm timp de 10 minute) iar icircn final amestecurile au fost liofilizate 24h la
-55degC
62
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Figura 21 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
233 Program experimental
Specialiștii din foarte multe domenii de activitate se confruntă deseori cu provocarea de a
face compromisuri icircntre diferiți factori pentru a obține rezultatele dorite optimizare fiind
procesul de a alege aceste compromisuri icircn cel mai eficient mod posibil Noțiunea de diferiți
factori face referire la existența unor diferite soluții posibile iar noțiunea de realizare a
rezultatelor dorite se referă la obiectivul de a căuta icircmbunătățirea modului de identificare a
soluției optime Prin urmare icircntr-o problemă de optimizare diferitele soluții posibile sunt
comparate calitatea soluției fiind fundamentală deoarece aceste soluții sunt de multe ori icircn
contrast [117]
Programe experimentale factoriale sunt foarte eficiente pentru studierea a doi sau mai mulți
factori Efectul unui factor poate fi definit ca schimbarea răspunsului produs de o modificare a
nivelului factorului acesta fiind considerat efectul principal Icircn unele experimente se poate
63
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
constata că diferența de răspuns dintre nivelurile unui factor nu este aceeași la toate nivelurile
celorlalți factori numit efect de interacțiune icircntre factori Icircn mod colectiv efectele principale și
efectele de interacțiune sunt numite efectele factoriale Un design factorial complet poate estima
toate efectele principale și interacțiunile de ordin superior
Programe experimentale factoriale sunt folosite icircn ingineria tisulară și icircn domeniul
biomaterialelor [118] icircn domeniul farmaceutic [119] etc
Icircn teza de față s-a utilizat un program experimental multifactorial icircn vederea optimizării
compoziției suporturilor Programul menționat este caracterizat prin faptul că fenomenul
procesul este urmărit prin intermediul unui număr finit de variabile variabile ce pot avea fiecare
un număr discret de valori icircntr-un domeniu de variaţie prestabilit Compoziția suporturilor a fost
optimizată din punct de vedere al raportului biopolimerbiopolimer un program experimental
factorial central compus rotabil de ordinul 2 fiind utilizat [120] Ecuația următoare stabilește
numărul total de experiențe posibile
NE = 2k + 2k + n0 icircn cazul icircn care k lt 5 (1)
sau
NE = 2k-1
+ 2k + n0 icircn cazul icircn care k gt 5 (2)
unde k este numărul de variabile iar n0 numărul de experiențe dispuse icircn centrul domeniului
experimental valoare sa fiind cuprinsă icircn intervalul 3 ndash 7
Structura programului experimental reprezentată de dispunerea punctelor generate de
valorile diferite acordate factorilor are drept ipoteză posibilă ajustarea suprafeţei de răspuns ce
corespunde unui indicator icircn raport cu variabilele independente prin intermediul unor expresii
matematice de tip polinomial de ordinul 2 de forma
Y = a0 + ndash
+
ndash (3)
unde a0 este coeficientul de regresie iar xi si xj sunt variabilele independente care influenţează
variabila răspuns F Valorile discrete ce se atribuie variabilelor sunt alese astfel icircncat printr-o
codificare simetrică faţă de centrul planului experimental să fie posibilă ortogonalizarea matricii
experimentale corespunzătoare si inducerea unei erori minime cu ocazia calculelor aferente
coeficienţilor prin metoda celor mai mici pătrate [121]
64
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Icircn lucrarea de față s-a optat pentru o codificare a valorilor discrete aferente variabilelor
independente conform datelor din tabelul 28
Tabelul 28 Codificarea variabilelor independente icircn cazul exprimării multifactoriale libere
Valoare codificată -1414 -1 0 -1 14141
Valoare reală
Valorile discrete se estimează din valorile ce definesc intervalul de variaţie al variabilei
independente xi conform următoarelor relaţiilor de atribuire
= rarr ndash2 (4)
= rarr +2 (5)
= ( + ) 2 rarr 0 (6)
= ( + ) rarr ndash1 (7)
= ( + ) rarr 1 (8)
Icircn contextul obiectivelor de cercetare s-a folosit un program factorial cu două variabile
(X1 X2) a cărei matrice experimentală este prezentată in Tabelul 29 [122]
Tabel 29 Matrice experimentală a programului factorial cu 2 variabile
Nr Crt X1cod X2 cod
1 ndash1 ndash1
2 1 ndash1
3 ndash1 1
4 1 1
5 ndash1414 0
6 1414 0
7 0 ndash1414
8 0 1414
9 0 0
10 0 0
11 0 0
12 0 0
13 0 0
65
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
24 Metode de caracterizare
241 Caracterizarea structurală a suporturilor
2411 Analiza prin Spectroscopia icircn infraroşu cu transformată Fourier (FTIR)
Spectroscopia FTIR se utilizează icircn vederea determinării grupărilor funcţionale ale probei
analizate Metoda se bazează pe vibraţia legăturilor chimice rezultată icircn urma absorbţiei energiei
luminoase infraroşii la frecvenţe caracteristice FTIR este o metodă uzuală icircn stabilirea structurii
şi identificarea unui compus chimic [123]
Pentru caracterizarea probelor solide există trei metode de pregătire a probelor pastilarea
icircn prezenţa unei sări suspensia icircn nujol utilizarea unui solvent Metoda de pregătire a probelor
este aleasă icircn funcţie de natura probei de analizat de exemplu icircn cazul probelor dificil de mojarat
se va utiliza un solvent pentru pregătirea probelor Acest solvent trebuie să aibă cacirct mai puţine
benzi şi intensitatea mică (exemplu sulfura de carbon şi tetraclorura de carbon)
Icircn ceea ce priveşte suspensia icircn nujol (ulei de parafină) cacircteva miligrame de probă se
amestecă cu 1-3 picături de ulei de parafină pacircnă la obţinerea unei suspensii omogene Icircn cazul
pastilării cel mai adesea se utilizează bromura de potasiu (KBr) Aproximativ 2-3 mg probă se
mojarează şi se amestecă cu 200 mg bromură de potasiu mojararea probei fiind un aspect
important de care trebuie să se ţină cont Pulberea obţinută se va introduce icircntr-o matriţă şi se va
comprima cu ajutorul unei prese hidraulice obţinacircndu-se un disc a cărui grosime este un alt
aspect important de care trebuie să se ţine cont o grosime de aproximativ 1 mm fiind
recomandată pentru rezultate cacirct mai bune [124]
Suporturile obţinute au fost pregătite pentru analiza FTIR prin metoda pastilării cu KBr
2412 Spectroscopia de raze x prin dispersie de energie (EDS)
Icircn general dispozitivele pentru microscopia electronică de baleiaj (SEM) sunt echipate cu
un spectroscop de raze X cu dispersie de energie (EDS) șisau un Spectroscop cu raze X cu
dispersie pe lungime de undă (WDS) utile pentru analiza elementală sau caracterizarea chimică
Atacirct EDS cacirct și WDS se bazează pe detectarea și investigarea razelor X caracteristice produse de
electronii primari Icircn timpul iradierii un electron din stratul intern al atomul țintă poate fi scos
66
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
din icircnvelișul electronic rezultacircnd o gaură de electroni Ulterior un electron din straturile
exterioare va umple gaura iar diferența de energie dintre electronii din icircnvelișul intern și cei din
icircnvelișul extern va fi emisă sub formă de rază X Deoarece energia acestei razei X este
caracteristică structurii atomice a elementului din care este emisă prin măsurarea cantității și a
energiei razele X emise dintr-un eșantion se poate determina compoziția elementală a probei
EDS este o metodă utilizată cel mai adesea pentru analiza de suprafața a unui material [125]
Pentru analiza probelor s-a utilizat un microscop electronic cu scanare SEM model VEGA
II LSH produs de firma TESCAN Cehia cuplat cu un detector EDX tip QUANTAX QX2
produs de firma BRUKERROENTEC Germania
2413 Difracţie cu raze X (XRD)
Spectrul XRD a fost icircnregistrat utilizacircnd aparatul XRD-6000 SHIMADZU (figura 22)
Difracţia cu raze X este o metodă simplă şi uşor de realizat pentru analiza fazei cristaline a
probelor oferind totodată şi date despre dimensiune şi orientarea cristalelor acesteia
Figura 22 Difractometru de raze X [126]
Principiul de bază al acestei metode implică cuantificarea precisă a lărgimii picurilor de
difracţie Plecacircnd de la acest principiu s-au dezvoltat mai multe tehnici pentru estimarea fazei
67
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
anorganice formate şi a dimensiunii cristalelor cele mai icircntacirclnite icircn literatură fiind ecuaţia lui
Scherrer analiza lui Hall-Williamson şi metoda Fourier a lui Warren-Averbach [127]
Pentru identificarea fazelor anorganice din suporturile obţinute au fost utilizate standardele
Centrului Internaţional pentru Difracţie (JCPDS)
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM)
Microscopia electronică de baleiaj se utilizează pentru a studia icircn detaliu suprafaţa
probelor Datele SEM sunt foarte importante deoarece oferă informaţii despre morfologia
probelor ce are o influenţă remarcabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale acestora (gradul de
retenţie a fluidelor biologic simulate proprietăţile mecanice adeziunea şi proliferarea celulară
etc) Icircn vederea studiului morfologiei suporturilor obţinute s-a utilizat microscopul TESCAN
VEGA SBH II prezentat icircn figura 23 Tensiunea de lucru a fost de 30 kV
Figura 23 Microscopul TESCAN VEGA SBH II [128]
Analiza constă icircn scanarea suprafaţei probelor de către un fascicul de electroni de energie
icircnaltă fascicul ce porneşte dintr-un filament de tungsten aflat icircn structura microscopului Icircnainte
68
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
de a fi analizate probele trebuie să se acoperite cu un film subţire de aur sau platină pentru un
contrast icircmbunăţit Pe măsură ce fasciculul de electroni trece de-a lungul probei interacţiunea
dintre probă şi fascicul are drept rezultat diferite tipuri de semnale de electroni emise la suprafaţa
probei sau icircn apropierea acesteia Semnalele sunt culese procesate şi redate pe un monitor ca şi
pixeli ceea ce duce la formarea unei imagini a suprafeţei probei imagine ce apare
tridimensională [129]
2422 Micro computer-tomografia (microCT)
Micro-computer tomografia (microCT) este o analiză de icircnaltă precizie a morfologiei
suporturilor oferind date precise şi informații despre dimensiunea şi distribuţia porilor icircntr-un
suport Tehnica este asemănătoare cu cea utilizată icircn sistemele de tomografie cu raze X folosite
icircn medicină doar că are o rezoluţie mult mai bună Această tehnică studiază interiorul suportului
icircn mare detaliu fără a fi utilizate substanţe toxice sau fără a fi necesară o pregătire specială a
probei Astfel după scanare proba intactă poate fi analizată prin alte tehnici
Icircn timpul scanării micro CT proba este icircmpărțită icircntr-o serie de secţiuni transversale 2D
care sunt iradiate din margine cu raze X La trecerea prin secţiune razele X sunt atenuate iar
razele X emergente avacircnd intensități reduse sunt capturate de un detector din componenţa micro-
computer tomografului Traictoriile razelor X sunt calculate și coeficienții de atenuare sunt
derivați O hartă bidimensională cu pixeli este creată utilizacircnd datele obţinute și fiecare pixel este
notat cu o valoare de prag care corespunde atenuării coeficientul măsurat la un punct similar icircn
interiorul specimen Deoarece coeficientul de atenuare este corelat cu densitatea materialului
hărțile 2D rezultate oferă o imagine a fazelor materialului analizat Calitatea imaginilor obţinute
este dependentă de rezoluţia de scanare care este cuprinsă icircntre 1 şi 50 microm precum şi de
software-ul utilizat [130]
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor
Testul de compresiune a fost realizat cu ajutorul dispozitivului Texture Analyzer
TAXTplus Dispozitivul poate fi utilizat pentru teste fundamentale sau empirice cum ar fi cele
legate de analiza texturii ştiinţa materialelor şi reologia solidelor semi-solidelor lichidelor
vacircscoase pudrelor sau materialelor granulate Numeroase proprietăţi pot fi analizate cu ajutorul
69
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
acestui dispozitiv dintre care enumerăm duritate fragilitatea aderența rezistența la tracțiune
extensibilitate Icircn funcţie de proprietate testată şi tipul probei dispozitivul are o serie de
platforme şi accesorii Pentru testul de compresiune la dispozitiv se va ataşa platforma pentru
greutate mare (figura 24)
Figura 24 Ansamblu pentru testul de compresiune Texture Analyzer TAXTplus [131]
Datele sunt achiziționate de software-ul Exponent icircn timpul procedurii şi prezentate sub
formă de grafice ce oferă detalii despre comportamentul fiecărei probe la forţe specificate
Dispozitivul este utilizat icircn numeroase domenii alimentar farmaceutic cosmetic medical etc
Accesoriile ce se ataşează de partea de sus a dispozitivului printr-un adaptor special pot
avea forme diverse Majoritatea au formă cilindrică și suprafața de acțiune plată cu diametrul
cuprins icircntre 2 mm şi 50 mm şi sunt realizate din diverse materiale oţel inoxidabil aluminiu
polioximetilenă (cunoscut şi sub denumirea de poliacetal şi comercializat sub marca Delrin) şi
poli (metacrilat de metil) sub denumirea comercială Perspex Atacirct diametrul variabil cacirct şi faptul
că sunt realizate din patru tipuri diferite de material fac posibilă utilizarea pentru numeroase teste
a unor probe diferite [132]
Pentru realizarea testului de compresiune a suporturilor obţinute s-a utilizat accesoriul
cilindric fabricat din aluminiu cu diametrul de 1 inch (337 mm) Suporturile au fost tăiate icircn
70
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
fragmente aproximativ egale iar după ce s-au determinat dimensiunile au fost supuse testului de
compresiune folosind următorii parametrii
viteza de pre-test ndash 01 mmsec
viteza de testare ndash 05 mmsec
distanța de icircntoarcere ndash 6 mm
Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru fiecare
fragment s-au calculat
A = L times l ( ) (9)
unde A este aria probei L este lungimea probei iar l este lățimea probei
F =
(N) (10)
unde Fmax este valoarea forţei măsurată de dispozitiv iar F este forţa de greutate
(11)
unde σ este rezistenţa la compresiune iar icircn final s-a calculat modulul de elasticitate icircntacirclnit
adesea icircn literatură sub denumirea de modulul lui Young (Legea lui Hooke)
(12)
unde ε este deformarea
244 Propritățile magnetice ale suporturilor
Susceptibilitatea magnetică este o măsură a proprietăţilor magnetice a unui material
Această mărime este o constantă adimensională ce indică gradul de magnetizare a unui material
ca răspuns la aplicarea unui cacircmp magentic
Icircn literatură se mai icircntacirclneşte şi termenul de magnetizare şi reprezintă raportul dintre
momentul magnetic şi densitatea de flux magentic Există trei mărimi ale susceptibilităţii
magnetice susceptibilitatea magnetică de masă susceptibilitatea magnetică molară şi
71
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
susceptibilitatea magnetică de volum Susceptibilitatea magnetică de volum se mai numeşte şi
permeabilitatea [133]
Susceptibilitatea magnetică a suporturilor notată cu χm a fost determinată utilizacircnd balanţa
de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto prezentată icircn figura 25
Figura 25 Balanţa de susceptibilitate magnetic Sherwood Scientific MSB Auto [134]
Dacă valoarea obţinută este pozitivă atunci materialul se numeşte paramagnetic iar dacă
este negativă se numeşte diamagnetic [135] Măsurarea susceptibilităţii magnetice s-a făcut la o
intensitatea a campului magnetic H= 45 kGauss (1 Gauss = 1 Oestred) Cunoscacircnd valorile
susceptibilităţii magnetice a unui material se poate calcula magnetizarea acestuia notată cu M
utilizacircnd formula
χm∙H (emug) (13)
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic
Acestă analiză este foarte importantă pentru că oferă informaţii despre cantitatea de fluide
reţinute de suporturi in vitro Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes
biologic s-a realizat cu ajutorul metodei volumetrice prin contactul suporturilor cu soluție PBS
și cu o soluție SBF icircn paralel
72
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Un fragment din suportul analizat a fost pus icircn contact cu PBSSBF pH=72 001 M icircntr-o
microcoloană QIAquickregSpin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o seringă de 1 ml prin
intermediul unei membrane de silicon (figura 26)
Figura 26 Ansamblu de dispozitive utilizat pentru determinarea gradului de retenţie maxim
Dispozitivele au fost incubate la 37degC pentru un interval de timp determinat după care s-a
stabilit volumul de soluţie reţinut de fiecare probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim
notat GRmax utilizacircnd formula
GRmax =
times100 () (14)
unde mf=mi+mabs mabs reprezintă masa de solvent absorbită după intervalul de timp stabilit
iar mi este masa iniţială a probei Densitatea PBS-ului respectiv a SBF-ului se consideră avacircnd
valoarea 1
246 Studii de degradare enzimatică in vitro
Suporturile pe bază de biopolimeri pentru ingineria tisulară şi regenerarea ţesutului osos
sunt degradate in vivo de către enzime icircn mod particular cum ar fi de exemplu hialuronidaza
pentru acidul hialuronic lizozimul pentru chitosan şi colagenaza pentru colagen şi gelatină
Pentru a studia şi cuantifica procesul de biodegradarea al suporturilor pentru ingineria tisulară icircn
literatură există două metode
73
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- metoda directă prin care se cacircntăreşte suport analizat icircnainte şi după ce este supus
procesului de degradare pentru un anumit interval de timp şi se face raportul dintre
greutatea iniţială şi greutatea finală
- metoda indirectă prin care se analizează compuşii rezultaţi icircn urma procesului de
degradare [136]
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd fie lizozim
(enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al chitosanului icircn organismul uman) fie un
complex de lizozim și colagenază (enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al
colagenului icircn organismul uman) Primul pas a fost imersarea unui fragment din fiecare probă
icircntr-un volum de PBS cu lizozim (1200 μgml) sau lizozim cu colagenază (100 μgml) aflată
icircntr-o membrană de dializă introdusă apoi icircn soluţie PBS fără enzime Probele au fost apoi
incubate la 37degC iar la anumite intervale de timp un volum din soluţia de PBS icircn care este
imersată membrana de dializă cu proba de analizat a fost extras şi analizat
Determinarea concentrației de chitosan degradat
Cs este predominat degradat de enzime care hidrolizează legăturile glucozamină ndash
glucoazamină glucozamină ndash N-acetil-glucozamină şi N-acetil-glucozamină ndash N-acetil-
glucozamină Lizozimul şi enzimele bacteriene din colon sunt principalele enzime implicate icircn
procesul de degradare al Cs-ului Lizozimul poate hidroliza atacirct chitina cacirct şi Cs viteza de
degradare fiind invers proporţională cu cristalinitatea polimerilor şi cu gradul de deacetilare al
Cs-ului Icircn corpul uman lizozimul se găseşte icircn diferite concentraţii icircn ser lacrimi salivă şi
urină unde are activitate antibacteriană importantă
Figura 27 Ruperea legăturii β-(1-4) glicozidică din structura chitosanului de către lizozim
74
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Chiar dacă lizozimul din corpul uman este diferit din punct de vedere structural de cel
utilizat icircn testele in vitro studiile au demonstrat că are activitate similară icircn procesul de
biodegradare al chitosanului Activitatea lizozimului creşte o dată cu creşterea gradului de
acetilare al chitosanului sugeracircnd că la locul de acţiune al lizozimului trebuie să existe un minim
de unităţi acetilate pentru a se obţine o rată de degradare iniţială maximă Lizozimul este prezent
icircn mod natural icircn serul uman salivă și alte fluide hidrolizacircnd legătura β-(1-4) glicozidică dintre
N-acetilglucozamină (NAGA) și reziduri ale acidului N-acetil-muramic ce se depun pe pereții
celulei bacteriei [137]
Icircn ceea ce priveşte analiza concentraţiei de chitosan degradat s-a determinat cantitatea de
produşi de biodegradare enzimatică prin evaluarea complexului format cu o soluţie de
K3Fe(CN)6 Soluţia de fericanură de potasiu s-a obţinut prin solubilizarea a 05 g K3Fe(CN)6 icircn
1000 ml de 05 M Na2CO3
1 ml extras din probele de analizat s-a incubat cu 4 ml de K3Fe(CN)6 icircntr-o eprubetă icircn apă
adusă la fierbere timp de 15 minute Soluţia din eprubete s-a răcit la temperatura camerei s-a
transferat icircntr-un flacon de 25 ml s-a adus la semn cu soluţie carbonat de sodiu 05 M după care
s-a citit absorbanţa soluţiei la spectrofotometru UV-VIS la o lungime de undă de 420 nm
Concentraţia de chitosan degradat s-a calculat utilizacircnd o curbă etalon (figura 28)
Figura 28 Curba etalon pentru determinarea concentraţie de chitosan degradat
y = -92591x + 02402 Rsup2 = 09964
0
005
01
015
02
025
0 0004 0008 0012 0016 002 0024
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația N-acetil-D-glucozamină ()
75
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Pentru realizarea curbei etalon s-a preparat o soluţie de N-acetil-D-glucozamină de
concentraţie 002 după care s-au realizat 10 diluţii şi s-a determinat absorbanţa fiecărei soluţii
utilizacircnd aceaşi metodă spectofotometrică menţionată anterior
Determinarea concentrației de colagen degradat
Ninhidrina este o pulbere albă si cristalină solubilă icircn apă si alcool Reacţiile ninhidrinei
utilizacircnd tehnici manuale sau automate sunt folosite pentru analiza şi caracterizarea amino-
acizilor peptidelor proteinelor precum şi a unui număr mare de compuşi icircn numeroase domenii
biomedical clinic alimentar microbiologic histochimic şi altele Icircn ceea ce priveşte
caracterizarea proteinelor icircn urma reacţiei ninhidrinei cu grupările amino rezultă cromoforul
ninhidrinei icircntalnit icircn literatură sub denumirea de violet Ruhemann ndash RP (figura 29) după
numele cerecetătorului care a descoperit reacţia icircn 1910 ce absoarbe radiaţia luminoasă la o
lungime de undă de 570 nm Icircn unele cazuri cantitatea de cromofor formată nu e
stoechiometrică de aceea pentru obţinerea unor rezultate reproductibile icircn reacţie se introduce
un agent reducător cum este de exemplu SnCl2 ce are ca rezultat creșterea intensităţii culorii
[138]
Figura 29 Reacţia dintre ninhidrină şi aminoacizi
Reactivul de ninhdrină s-a preparat prin solubilizarea a 0283times10-3
moli de SnCl2∙2H2O icircn
500mL soluţie tampon citrat-fosfat pH = 5 urmat de adăugarea a 500 mL de 2-metoxietanol care
conţine 20 g de ninhidrină 1 mL extras din probele de analizat probă s-a incubat cu 5 ml reactiv
ninhidrinăicircntr-o eprubetă icircn apă adusă la fierbere timp de 20 minute Soluţia s-a răcit imediat
latemperatura camerei apoi s-au adăugat 20 ml de soluţie amestec apă distilată2 - propanol
(11) Absorbanţa a fost măsurată la 570 nm in celulă de cuarţ cu spectrofotometrul UV-VIS
76
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Curba de calibrare pentru determinarea concentraţiei de grupări NH2 terminale din colagen s-a
realizat utilizacircnd glicină (figura 210)
Figura 210 Curba etalon pentru determinarea concentraţiei de colagen degradat
247 Teste de citotoxicitate in vitro
Un material realizat cu scopul de a fi utilizat icircn contact direct cu un ţestut viu trebuie să fie
obligatoriu citocompatibil Primele teste ce trebuie realizate pentru a analiza această
caracteristică sunt testele in vitro de biocompatibilitate pe culturi de celule Doar după testări
riguroase a unui material pe diverse culturi de celule se poate merge mai departe la realizarea de
teste de citotoxicitate in vivo
Icircntr-un laborator de culturi de celule conservarea celulelor primare sau a liniilor celulare
este o condiţie esenţială deoarece permite atacirct păstrarea calităţii materialului biologic cacirct şi o
organizare eficientă a activităţilor De aceea celulele primare şi liniile celulare sunt criostocate
fie la -86degC fie la -196degC icircn prezenţa de soluţii crioprotectoare evitacircndu-se astfel formarea
cristalelor de gheaţă
Celule care au fost utilizate pentru a testa in vitro biocompatibilitatea suporturilor obţinute
au fost păstrate la -86degC utilizacircndu-se drept agent crioprotectant dimetilsulfoxid ndash DMSO
Suporturile au fost testate pe mai multe linii celulare
- fibroblaste primare NHDF LONZA
- celule stem isolate din ţesut adipos de iepure
y = 16194x + 00799 Rsup2 = 09968
0
01
02
03
04
05
0 00005 0001 00015 0002 00025
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația de glicină ()
77
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- pre-osteoblaste din linia celulară MC-3T3
- osteoblaste din linia celulară MG-63 (celule tumorale)
Prima etapă pentru realizarea unui test de biocompatibilitatea a fost dezgheţarea celulelor
Icircn funcţie de numărul de material testate şi de tipul plăcilor de cultură utilizate s-au folosit fie
flacoane de cultură medii cu suprafaţa de cultură de 75 cm2 fie flacoane de cultură mari cu
suprafaţa de cultură de 175 cm2 Flacoanele s-au incubat(la 37degC 55 CO2 şi umiditate relative
96) cu un anumit volum de mediu de cultură complet (mediu de cultură care se suplimentează
cu 10BFS şi 1 PSN) icircn funcţie de dimensiunea flaconului cu aproxiamtiv 2 ore icircnainte de
dezgheţarea celulelor Criotubul s-a scos de la -86degC s-a imersat rapid icircn apă avacircnd temperatura
37degC şi s-a agitat uşor pacircnă la dezgheţare completă Celule din criotub s-au centrifugat cu mediu
de cultură complet pentru icircndepărtarea agentului crioprotectant după care supernatantul s-a
icircnlocuit cu mediu de cultură complet După ce s-au numărat celulele s-a adăugat icircn flaconul de
cultură un volum potrivit de suspensie celulară Mediul de cultură din flacon a fost icircnlocuit zilnic
cu mediu proaspăt pacircnă la formarea unui monostrat confluent
După formarea monostratului următoare etapă a fost popularea cu celule a plăcilor de
cultură pe care au fost testate suporturile Pentru a desprinde celulele din flacon şi a realiza o
suspensie celulară s-a utilizat o soluţie de tripsină 025 EDTA 002 Icircnainte de adăugarea
soluţie tripsinăEDTA s-a icircndepărtat mediului de cultură din flacon iar apoi suprafaţa de cultură
a fost spălată de cateva ori cu HBSS cu roşu fenol fără calciu pentru a fi icircndepărtate urmele de
mediu care ar icircngreuna acţiunea tripsinei După centrifugare cu mediu de cultură complet icircn
vederea icircndepărtării resturilor de tripsină s-a icircnlocuit supernatantul cu mediu complet după care
s-au numărat celulele cu ajutorul unei camere de numărat celule Neubauer s-a realizat o
suspensie de celule icircn mediu complet după care s-a distribuit icircn fiecare godeu al plăcilor de
cultură un anumit volum de suspensie conţinacircnd numărul de celule calculat icircn funcţie de tipul de
celule şi numărul de godeuri al plăcilor de cultură
Icircn funcţie de tipul materialului analizat (pudre nanoparticule emulsii suporturi compacte
suporturi poroase etc) se pot realiza teste de biocompatibilitate prin contact direct prin metoda
eluţiei (contact indirect) sau prin metoda difuziei Contactul direct presupune adăugarea propriu-
zisă a fragmentelor din materialul testat icircn godeurile plăcilor de cultură cultivate cu celule
contactul indirect presupune adăugarea unui extract din materialul analizat analizacircndu-se de cele
mai multe ori diverse concentraţii ale extractului iar metoda difuziei constă icircn acţiunea
78
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
compusului analizat asupra celulelor printr-un strat de gel de agaroză ce acoperă cultura de
celule Suporturile obţinute icircn studiul de faţă au fost analizate prin contact direct şi prin contact
indirect [139]
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare după ce suporturile au fost sterilizate
fragmente de suportextract de suport au fost puse pe plăcile de cultură conţinacircnd celule ce au
fost incubate icircn placi cu 24 ore icircnainte
Testele realizate pentru studiul biocompatibilităţii suporuturilor au fost testul MTT la 24
48 și 72 ore de contact şi testul de viabilitate celulară cu Calceina-AM
2471 Testul MTT
Pentru realizarea testului MTT ndash [bromură de (3-[45-dimetiltiazol-2-il]-25-difenil)
tetrazoliu] fragmentele de material au fost extrase şi mediul de cultură icircnlocuit cu soluție de
lucru MTT (MTT 5 icircn mediu de cultură fără BFS şi amestec de antibiotice) Testul MTT se
bazează pe capacitatea celulelor viabile cu metabolism activ să reducă MTT-ul icircn cristale de
formazan de culoare albastru-violet (figura 211) [140]
Figura 211 Structura bromurii de tetrazolium MTT şi a produsului redus formazan
Celulele cu soluția MTT au fost incubate la 37degC pentru un anumit interval de timp icircn
funcţie de tipul de celule după care s-a extras soluţia MTT cristalele de formazan formate fiind
solubilizate cu alcool izopropilic Absorbanța soluției de formazan rezultată (culoare albastru-
violet) a fost măsurată spectrofotometric la λ=570nm cu ajutorul unui cititor de plăci (Tecan
Sun-rise Plate Reader) Rezultatele citirii spectrofotometrice din godeurile experimentale au fost
79
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
raportate la godeurile de control icircn care nu au fost prezente fragmente de materialextract
Raportul calculat a constituit viabilitatea celulară (V)
V =
(15)
unde abs suport este absorbanța din godeul conţinacircnd fragment de suportextract iar abs control
este absorbanța controlului
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Calceina AM este un colorant care are capacitatea de a colora icircn verde doar celule viabile
icircn mod particular citoplasma acestora După ce pătrunde icircn celulă calceina AM substanţă
incoloră este hidrolizată de esteraza din citoplasmă icircntr-un produs verde fluorescent (figura
212) [139] Pentru realizarea testului mediul de cultură din godeuri a fost extras iar apoi celule
au fost spălate de două ori cu HBSS cu calciu fără roşu fenol Icircn final s-a adăugat soluţie de
calceină (1-2 microL calceină la 1 mL HBSS cu calciu fără roşu fenol) iar placa de cultura a fost
introdusă icircn incubator pentru 20 min După cele 20 min celulele s-au vizualizat la microscop
confocal cu fluorescenţă (Leica Germania) şi s-au preluat imagini Testul s-a realizat la intervale
de timp diferite icircn funcţie de metoda de contact şi tipul celulelor
Figura 212 Schema de legare a Caleinei ndash AM la celulele viabile
80
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
248 Teste de citotoxicitatea in vivo
Pentru a demonstra siguranța unui material medical după o caracterizare riguroasă acesta
trebuie testat din punct de vedere al citotoxicității in vivo
Testele de citotoxicitate in vivo au fost realizate conform recomandărilor ISO Standard
10993 la Facultate de Medicină Veterinară din Iaşi sub coordonarea domnului Prof Dr Mareş
Mihai Studiile au fost realizate conform Directivei UE 632010 și cu acordul comitetului de
etică din cadrul instituției
S-au utilizat șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie
de 28 plusmn 3 grame materialul biologic provenind din Biobaza INCDMI Cantacuzino București
- filiala Băneasa Animalele au fost ţinute icircn condiții zooigienice corespunzătoare speciei și
vacircrstei temperatură și umiditate constante regim de iluminare 12 orezi acces liber la hrană
(furaj combinat complex) manipularea animalelor fiind făcută cu blacircndețe fără a le produce
stres sau durere Cu 3 zile icircnainte de icircnceperea experimentului animalele au fost mutate icircn
laborator pentru a se acomoda cu mediul ambiant
Pentru implant materialele au fost secționate sub diverse forme pătrate sau discuri apoi
au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 4 ore Animalele au fost grupate
icircn loturi icircn funcţie de numărul de suporturi analizate fiecare lot cuprinzacircnd un anumit număr de
animale
Icircnainte de intervenția chirurgicală zona de implant a fost tunsă și aseptizată cu betadină
soluție cutanată 10 Implantarea fragmentelor de suporturi s-a realizat subcutanat icircn condiții
aseptice prin incizia sterilă a pielii din regiunea dorsală a șoarecilor Inducția anestezică (15-30
de secunde) s-a realizat cu isofluran 4 iar pentru a se asigura liniștea intraoperatorie pe
parcursul a 15 minute (timp necesar inciziei depunerii fragmentului de suport și suturii pielii) a
fost utilizată concentrația de 15
Durata experimentului a fost diferită icircn funcție de lotul de suporturi testate După
sacrificarea animalelor s-au efectuat examene histopatologice Icircn vederea realizării preparatelor
microscopice fragmentele de țesut (cu sau fară material) au fost fixate icircn soluţie de formaldehidă
10 timp de 7 zile şi apoi incluse icircn blocuri de parafină prin metoda rapidă de includere
Blocurile de parafină au fost secţionate apoi icircn secţiuni de 5 microm cu ajutorul microtomului de
laborator Secţiunile rezultate au fost etalate pe lame histologice cu ajutorul albuminei Mayer
81
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
colorate Tricromic Masson și examinate microscopic Preparatele au fost examinate la microscop
şi interpretate
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
La nivel mondial cancerul rămacircne a doua cea mai comună cauză de deces icircn ciuda
icircncercărilor avansate de prevenție diagnosticării icircn stadiu incipient și a protocoalelor de
tratament riguroase [141] Icircn ceea ce privește tumorile osoase acestea sunt diagnosticate icircn
special la pacienți adulți sau vacircrstnici excepție făcacircnd osteosarcomul tumoră icircntacirclnită
preponderent la pacienți cu vacircrste cuprinse icircntre 10 și 20 și destul de rar la vacircrstnici
Icircn unele cazuri tratamentul tumorilor osoase maligne are drept primă etapă rezecția
chirurgicală a tumorii iar icircn a doua etapă pacientul urmează ședințe de radioterapie Cele două
tehnici nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral chimioterapia precedacircndu-le de regulă
Plecacircnd de la această schemă de tratament s-au realizat studii privind potențiala aplicație a
suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircntr-o primă fază suporturile au fost expuse la raze X după care au fost caracterizate din
punct de vedere fizico-chimic și biologic icircn vederea analizei influenței radiațiilor asupra
proprietăților suporturilor
Iradierea suporturilor cu raze X s-a realizat cu ajutorul dispozitivului CT-Sim Siemens
Somatom Definition figura 213 Deoarce grosimea materialului iradiat a fost de aproximativ 12
mm acesta a fost fixat pe un suport de 5 mm a cărui dimensiune a fost inclusă icircn calculul
parametrilor de iradiere
Figura 213 Dispozitivul CT-Sim Siemens Somatom Definition (stacircnga)Simularea CT
(dreapta)
82
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi
Sistemele de eliberare controlată de medicamente sunt studiate pentru tratamentul
alternativ a unor tipuri diferite de cancer Cele mai studiate sisteme sunt cele pe bază de polimeri
ceramice sau compozite ale acetora Polimerii cei mai utilizați la realizarea de sisteme de
eliberare sunt polietilen glicolul (PEG) polietilen oxidul poli (caprolactona) chitosanul
alginatul alcoolul polivinilic polimetil metacrilatul celuloza etc Și unele proteine
preponderant colagenul sunt utilizate pentru realizarea de sisteme de eliberare controlată dar
instabilitate lor chimică și fizică ridică anumite probleme tehnice [141]
Doxorubicina a fost medicamentul chimioterapic avut icircn vedere pentru studiul de față
Pentru prepararea de suporturilor cu potențial de utilizare ca sistem de eliberare de medicament
icircntr-o suspensie coloidală de nanoparticule magnetice (1 ) obținute conform protocolului
descris anterior (subcaptiol 231) s-a solubilizat 0125 doxorubicină Nanoparticulele
icircncărcate cu medicament au fost folosite la prepararea de suporturi după protocolul descris icircn
subcapitolul 23
Eliberarea in vitro a medicamentului a fost studiată cu atenție Primul pas a fost imersarea
a 20 mg din fiecare probă icircn PBS pH = 72 001M icircntr-o memebrană de dializă care a fost
complet imersată icircntr-un alt volum de PBS Studiul de eliberare a fost efectuat la 37ordmC pe o
perioadă de 14 zile La anumite intervale de timp un volum de PBS icircn care a fost imersată
membrana de dializă a fost extras pentru analiza UV-Vis și icircnlocuit cu același volum de PBS
proaspăt Absorbanța fiecărui volum de PBS extras a fost analizată utilizacircnd spectrofotometrul
NanoDrop ND 1000 (Thermo Fisher) la 480 nm Pentru trasarea curbei etalon s-au preparat
soluţii de diferite concentraţii de medicament (pe domeniul 1 microg ndash 10 microg) icircn PBS
83
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe
bază de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic
gelatină) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și apatite hidroxiapatite sau alți fosfați de
calciu cu aplicații icircn ingineria tisualră a țesutului osos sunt studiate icircn detaliu de aproape două
decenii Imitarea matricei extracelulare a țesuturilor umane a devenit o provocare pentru
ingineria tisulară datorită complexității sale fizice chimice și biologice prin urmare este
esențială alegerea biopolimerilor care să satisfacă criterii de compatibilitate chimică
biocompabibiltate biodegradabilitate controlată Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul
biologic și degradați metabolic Chitosanul colagenul gelatina alginatul condroitin sulfatul și
acidul hialuronic sunt printre cei mai studiați biopolimeri datorită argumentelor menționate
anterior și a similarității lor cu componentele matricei extracelulare [142-144]
Chitosanul ndash Cs un biopolimeri foarte versatil este unul din cei mai studiaţi pentru
ingineria tisulară a țesutului osos datorită proprietăţilor sale remarcabile biocompatibilitate
biodegradabilitate proprietăţi antibacteriene hemostatice şi antitumorale [55 56 145-148] De
asemenea susţine in vitro adeziunea şi proliferarea celulară a osteoblastelor precum şi formarea
de matrice osoasă mineralizat [149] Icircn ceea ce priveşte comportamentul in vivo un număr
semnificativ de studii au demonstrat faptul că suporturile pe bază de chitosan susţin
osteoconductivitatea icircn defecte osoase obţinute chirurgical [150]
Gelatina ndash G proteină derivată din colagen este un biopolimer degradabil cu
biocompatibilitate excelentă adesea utilizată icircn domeniile biomedical şi farmaceutic Icircn
combinaţie cu alţi biopolimeri adesea cu chitosanul gelatina contribuie la creşterea adeziunii
celulare [151] [152]
Acidul hialuronic ndash Hya susţine regenerarea tisulară la locul defectelor osoase prin
stimularea formării de calus [153] De asemenea rezultatele unor studii in vitro și in vivo au
sugerat o legătură icircntre creștere sintezei de acid hialuronic după tratatamentul cu parathormon și
resorbția osoasă ulterioară ceea ce ar putea indica o posibilă relație icircntre sinteza biopolimerului
și creșterea activității osteoclastelor [154]
Studiile icircn domeniu au evidenţiat faptul că o concentraţie scăzută de albumină serică
bovină ndash Bsa poate susţine mineralizarea ţesutului osos prin stimularea creşterii cristalelor de
84
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
fosfaţi de calciu [155] [156] icircn schimb o concentraţie mare de albumină poate chiar inhiba
creşterea lor [157]
Avacircnd icircn vedere proprietăţile menţionate mai sus ale celor patru biopolimeri (chitosan
acid hialuronic gelatină şi albumină) s-a emis ipoteza că prin realizarea unor combinații ale
acestora cu fosfați de calciu și particule magnetice se pot obține suporturi magnetice cu
performanțe crescute icircn regnerarea tisulară osoasă (Figura 31)
Figura 31 Suporturi pe bază de biopolimeri fosfați de calciu și nanoparticule magentice
Fosfații de calciu componenta fazei anorganice a țesutului osos uman stimulează
osteoconductivitatea și osteoinductivitatea Importanța utilizării nanoparticulelor magnetice icircn
suporturi compozite pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost detaliată icircn capitolul 1
Alegerea unei concentrații de nanoparticule adecvată este o provocare o concentrație prea mică
poate avea riscul de a nu conferi proprietăți magnetice suportului icircn care sunt incluse iar o
concentrație prea mare poate duce la un eventual caracter citotoxic al suportului Studiile icircn
85
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
domeniu prezintă prepararea de suporturi magnetice ce au icircncoporate concentrații diferite de
particule 05 1 2 3 7 5 sau 10 [9091 92] etc
Pentru a putea concluziona care ar fi concentrația optimă de particule introdusă icircn sinteză
s-au selectat trei concentraţii diferite de particule magentice 1 3 și 5 astfel icircncacirct să se
evite efectele toxice menținacircndu-le pe cele magnetice icircn domeniile terapeutice
31 Obţinerea suporturilor
Suporturile s-au obţinut printr-o metodă biomimetică de co-precipitare a fosfaţilor de
calciu din precursorii săi icircn prezențicirc de biopolimeri și particule magnetice Astfel soluții de
Ca(NO₃)₂∙4H2O(40 icircn apă distilată) şi NaH2PO4middotH2O (25 icircn apă distilată) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri (Cs (1 icircn soluție 15 HCl) Hya (2 in apă distilată)
Bsa (2 in apă distilată) G (2 in apă distilată)) Soluţia de Cs (1) a fost obţinută prin
dizolvare de Cs icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Separat s-au adăugat soluții de Hya (2)
Bsa (2) și G (2) (icircn apă distilată) astfel icircncacirct concentraţia să fie 10 faţă de cantitatea totală
de chitosan introdusă icircn sinteză Icircn fiecare amestec de biopolimercombinaţii de biopolimeri şi
precursori de fosfaţi de calciu s-au integrat concentraţii diferite de particule magnetice 1 3
şi 5 raportat faţă de cantitatea de substanţă uscată introdusă icircn procesul de sinteză pH-ul
amestecului final a fost ajustat la 72-74 prin adaos de soluţie de amoniac NH4OH (25 )
Raportul CaP a fost menținut la 165 icircn toate suporturile valoare comparabilă cu cea din ţesutul
osos uman [158]
Fiecare amestec compozit a fost spălat de 3 ori cu apă distilată separat prin centrifugare
(5000 rpm 10 minute) iar ultimul pas a constat icircn liofilizarea amestecurilor timp de 24 h
Cele patru tipuri diferite de suporturi au fost codificate icircn funcţie de compoziţia lor după
cum se observă icircn tabelul 31
Tabel 31 Compoziţia şi codificarea suporturilor
Denumirea
Suportului
ChitosanAlt biopolimer Concentraţia de
MNPs
Cs 1
Cs
1
Cs 3 3
Cs 5 5
Cs-Hya 1 Cs-Hya 1
86
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs-Hya 3 3
Cs-Hya 5 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa
1
Cs-Bsa 3 3
Cs-Bsa 5 5
Cs-G 1
Cs-G
1
Cs-G 3 3
Cs-G 5 5
Suporturile biomimetice pe bază de diferite amestecuri de chitosan și biopolimeri
(albumină acid hialuronic gelatină) cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei (spectroscopia IR cu
transformată Fourier ndash FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de energie ndash EDS) difracţie
cu raze X (XRD) și morfologic (microscopie electronică de baleiaj ndash SEM) De asemenea s-a
urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au
analizat proprietăţile magnetice Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi
printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
32 Rezultate și discuții
321 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR picuri caracteristice
biopolimerilor din compoziţie fosfaţilor de calciu şi particulelor magnetice fiind identificate pe
spectrele FTIR (figura 32)
Icircn ceea ce priveşte spectrul FTIR al suportului Cs 3 s-au observat benzile caracteristice
Cs-ului după cum urmează gruparea -OH la 3430 cm-1
gruparea ndashCH2 la 2923 cmminus1
amida I la
1655 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii CndashN la 1322 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării
CndashO la 1029 cm-1
[159] Pentru acelaşi suport s-au mai putut observa picuri specifice grupării
fosfat PO43-
icircn regiunea 600 cm-1
[99] şi grupării FendashO din particulele magnetice la 560 cm
-1
[160]
87
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Icircn cazul suportului Cs-Bsa 3 s-a observat o creştere semnificativă a intensităţii picului
1657 cmminus1
ce corespunde amidei I drept rezultat a vibraţiei de icircntindere a grupării C=O din
legătura peptidică Picul de la numărul de undă 1546 cm-1
corespunde amidei II iar picul de la
1240 cm-1
amidei III din componenta proteică [161]
Figura 32 Spectrele FTIR ale suporturilor
Pe spectrul FTIR pentru suportul Cs-Hya 3 s-au observat următoarele picuri picul pentru
vibraţia de icircntindere a grupăriindashOH la 3422 cm-1
picul pentru gruparea -CH2 la 2923 cm-1
picul
pentru amida primară I la 1654 cm-1
picul pentru COO- la 1420 cm
-1 şi picul pentru C-O la 1029
cm-1
[162]
322 Compoziția suporturilor
Icircn figura 33 este redată difractograma XRD pentru suporturile obţinute datele XRD
oferind informaţii despre faza anorganică şi despre cristalinitatea acestora
88
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
S-au observat următoarele picuri caracteristice 303ordm 356ordm 535ordm şi 574ordm ce pot fi
associate planelor (220) (311) (422) şi (511) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF
No 65-3107) Picuri specifice fosfaţilor de calciu de la unghiurile 23ordm 26ordm 28ordm 32ordm 335ordm 40ordm
48ordm şi 50ordm sunt corelate cu planurile (121) (002) (210) (112) (300) (310) (203) (213) şi
confirmă formarea următoarelor tipuri de fosfaţi de claciu Ca(H2PO4)22H2OmCaHPO4
Ca4(HPO4)3 25 H2O respectiv Ca3H2(P2O7)24H2O [47]
De asemenea un aspect foarte important care a fost observat a fost acela că principalul tip
de fosfat de calciu format icircn structura suporturilor compozite este hidroxiapatita
(Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul de calciu cu cele mai bune proprietăţi pentru formarea de ţesut osos
Figura 33 Spectrul XRD pentru suporturile obţinute
Compoziţia chimică a suporturilor a fost studiată cu ajutorul analizei EDX rezultatele fiind
redate icircn figura 34 Principalele tipuri de fosfați de calciu identificati pe spectrele XRD și EDX
sunt prezentați icircn tabelul 32
Tabel 32 Diferite forme de CP prezente icircn compozitele Cs-CP conform datelor XRD și EDX
Forme de fosfați de
calciu Formulă chimică Raport CaP
MCPM Ca(H2PO4)2middotH2O 05
Fosfat monocalcic
anhidru Ca(H2PO4)2 05
89
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Fosfat dicalcic
anhidru CaHPO4 100
Hidroxiapatită Ca10(PO4)6(OH)2 167
Fosfat tricalcic Ca3(PO4)2 15
Figura 34 Spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3
Pe spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3 s-au observat semnale intense icircn
regiunea elementelor Ca P O C Fe ceea ce confirmă compoziţia suporturilor fosfaţi de calciu
biopolimeri particule magnetice De asemenea din datele EDX obţinute s-a calculat raportul
molar al fazei minerale dintre calciu şi fosfor rezultatele indicacircnd formarea de diferite tipuri de
fosfaţi de calciu icircn structura suporturilor evidenţiindu-se fosfatul tricalcic (CaP = 152) icircn cazul
suportului Cs-Bsa 3 şi hidroxiapatita icircn cazul suportului Cs-G 3 [163]
90
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
323 Morfologia suporturilor
Icircn figura 35 sunt prezentate datele SEM obținute pentru suporturile Cs 3 Cs-Hya 3
Cs-Bsa 3 și Cs-G 3 la diferite grade de mărire Morfologia a fost studiată icircn secţiunea
suporturilor imaginile evidenţiind o porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea
fosfaţilor de calciu pe structura polimerică Particulele magnetice sunt complet integrate icircn
structura compozită
Figura 35 Morfologia suporturilor la două ordine diferite de mărire
Suporturile sintetizate pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară a ţesutului osos trebuie să aibă o
structură poroasă specifică şi o dimensiune a porilor adecvată aplicaţiei vizate Icircn primul racircnd
porii suportului trebuie să fie interconectaţi pentru a promova adeziunea şi creşterea
osteoblastelor migrarea nutrienţilor şi vascularizarea precum şi infiltrarea icircn matricea biologică
[164] [165] Icircn ceea ce priveşte dimensiune porilor icircn literatură există date contradictorii acest
aspect fiind explicat de complexitatea procesului de regenerare osoasă in vivo Astfel unele
studii recomandă utilizarea suporturilor cu dimensiunea a porilor cuprinsă icircntr-un interval foarte
larg de la 20 microm pacircnă la 1500 microm [166] [167] alte studii recomandă o dimensiune a porilor
icircntre 150 şi 600 microm sau icircntre 400 şi 1500 microm [168]
91
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Dimensiunile porilor suporturilor sintetizate (tabel 33) au fost calculate din imaginile
SEM prin analiza cantitativă a parametrilor imaginilor utilizacircnd funcția threshold a programului
ImageJ
Pentru fiecare imagine SEM măsurătorile au fost repetate de 10 ori la final fiind calculate
dimensiunea maximă a porilor dimensiunea medie a porilor dimensiunea minimă a porilor și
deviația standard S-a observat că dimensiunile maxime ale porilor au fost icircnregistrate pentru
suportul Cs-Hya 3 iar dimensiunile minime pentru suportul Cs-Bsa 3 Cel mai mic interval
dintre minimul și maximul dimensiunilor unui suport a fost calculat pentru suportul Cs-Bsa 3
ceea ce indică că acest suport are cea mai uniformă distribuție a porilor
Tabel 33 Dimensiunea porilor (microm)
Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
Deviația
standard 99458plusmn18938 111525plusmn16967 75084plusmn9075 92383plusmn13549
Dimensiunea
minimă 398541 451762 319411 456391
Dimensiunea
maximă 1946331 213656 1121936 154929
Dimensiunea
medie 952598 988953 672699 8149395
324 Proprietăţi magnetice
Deoarece obiectivul tezei de faţă implică utilizarea de particule magnetice ce vor fi
funcţionalizate cu medicamente rolul particulelor fiind de transportori a principiilor active ce
vor fi eliberate controlat studiul proprietăţilor magnetice ale suporturilor este esenţială Pentru a
stabili concentraţia optimă de particule introduse icircn sinteză icircn acest prim studiu s-au analizat trei
concentraţii diferite Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 34
Tabel 34 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Susceptibilitatea
magnetică de
masă
Magnetizarea
(emug)
Cs 1 1 0016middot e-4
132
Cs 3 3 009middot e-4
742
92
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs 5 5 0123middot e-4
1014
Cs-Hya 1 1 0003middot e-4
025
Cs-Hya 3 3 minus minus
Cs-Hya 5 5 0152middot e-4
1253
Cs-Bsa 1 1 0027middot e-4
226
Cs-Bsa 3 3 0074middot e-4
610
Cs-Bsa 5 5 0099middot e-4
816
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de masă a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 025 şi 1253 emug au fost mai mici decacirct cele ale
particulelor magnetice (4365 emug) [160] ce nu au fost icircncorporate icircn suport sau icircn oricare altă
structură compozită complexă
Icircntr-un studiu publicat de Heidari şi colaboratorii [99] s-au obţinut şi caracterizat nano-
suporturi magnetice pe bază de chitosan şi hidroxiapatită cu o valoare a magnetizării de 304
emug măsurată la o intensitate a cacircmpului magnetic H = 5189 kOe la temperatura camerei Un
alt studiu publicat de Bock şi colaboratorii [90] prezintă sinteza şi caracterizarea de suporturi pe
bază de hidroxiapatită şi colagen cu incluziune de tipuri diferite de fero-fluide magnetice La o
intensitate a cacircmpului magnetic de 10 kOe s-au obţinut valori ale magnetizării cuprinse icircntre 12
şi 15 emug pentru toate tipurile de suporturi sintetizate S-a observat că pentru o concentrație de
1 particule magnetice valorile obținute pentru magnetizare sunt prea mici comparabile cu cele
din literatură pentru concentrația de 5 fiind obținute valorile cele mai apropiate Comparacircnd
valorile obţinute cu datele de literatură s-a putut afirma că suporturile obţinute sunt
superparamagentice
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Interacţiunea suporturilor cu fluidele de interes biologic este un aspect important icircn ceea ce
priveşte potenţialele aplicaţii ale acestora icircn domeniul ingineriei tisulare a osului Pentru
suporturile obținute s-a studiat interacțiunea suporturilor cu două fluide soluție tampon fosfat-
PBS și fluid biologic simulat - SBF
93
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de aproximativ 5 mg din fiecare suport a fost pus icircn contact cu o soluţie PBSSBF pH = 72
001M icircntr-o microcoloană QIAquickreg
Spin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o
seringă de 1 ml prin intermediul unei membrane de silicon Dispozitivele au fost incubate la
37ordmC pentru un interval de 48 ore după care s-a stabilit volumul de PBSSBF reţinut de fiecare
probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din capitolul 2
Rezultatele obţinute cu privire la acest studiu sunt redate icircn tabelul 35
Tabel 35 Gradul de retenţie PBS și SBF () al suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Gradul de
retenţie PBS
()
Grad de retenție
SBF
()
Cs 1 1 704plusmn22 680plusmn35
Cs 3 3 645plusmn12 632plusmn14
Cs 5 5 676plusmn21 530plusmn25
Cs-Hya 1 1 784plusmn24 667plusmn31
Cs-Hya 3 3 714plusmn45 630plusmn29
Cs-Hya 5 5 490plusmn22 475plusmn17
Cs-Bsa 1 1 700plusmn39 654plusmn41
Cs-Bsa 3 3 454plusmn61 567plusmn16
Cs-Bsa 5 5 806plusmn78 515plusmn20
Cs-G 1 1 465plusmn35 421plusmn34
Cs-G 3 3 805plusmn42 625plusmn09
Cs-G 5 5 755plusmn27 722plusmn15
Pentru toate suporturile s-au obţinut valori mari ale gradului de retenţie PBS () acestea
fiind cuprinse icircntre 400 şi 800 Aceste valori au fost corelate pe de o parte cu structura
poroasă tridimensională a suporturilor iar pe de altă parte cu proprietăţile hidrofile ale
biopolimerilor atribuite grupărilor lor funcţionale
Icircn cazul suporturilor icircn care matricea polimerică este reprezentată doar de chitosan s-a
observat o variaţie foarte mică a valorile gradului de retenţie cea mai mare valoare fiind
măsurată la suporturile cu o concentraţie minimă de particule magnetice Icircn schimb icircn cazul
94
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
suporturilor Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G s-a observat o influenţă semnificativă a particule magnetice
asupra gradului de retenție Astfel icircn cazul suporturilor care au Hya icircn compoziţie s-a observat o
descreştere a gradului de retenţie pe măsură ce concentraţia de particule magnetice creşte pe
cacircnd pentru suporturile ce conţin albumină s-a observat o valoare maximă a gradului de retenţie
pentru suportul cu cea mai mare concentraţie de particule magnetice Suporturile Cs-G au
valorile gradului de retenţie apropiate pentru concentraţiile de particule magnetice de 3
respectiv 5 valoarea minimă fiind icircn cazul suportului Cs-G 1
Icircn ceea ce privește interacțiunea suporturilor cu soluția SBF prezența ionilor pozitivi (Na+
K+ Ca
2+ Mg
2+) și a ionilor negativi (HPO4
2- Cl
- HCO3
2- SO4
2- ) precum și abilitatea acestora
de a interacționa cu componentele suporturilor diminuează retenția de fază apoasă a suporturilor
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea suporturilor a fost studiată in vitro icircn prezenţa lizozimului pentru o perioadă
de 16 zile rezultatele studiului fiind prezentate icircn figura 36 A fost utilizată o concentraţie de
lizozim cu valoare apropiată de concentraţia lizozimului icircn serul uman [169]
Figura 36 Degradarea suporturilor
Analizacircnd rezultatele (tabel 36) s-a observat că procesul de degradare are practic două
etape Icircn prima etapă ce corespunde primelor 8 zile a avut loc o degradare mai accentuată a
suporturilor pe cacircnd icircn a doua etapă a urmat o icircncetinire a procesului de degradare Acest proces
de degradare icircn două etape a fost prezentat şi icircn alte studii şi poate fi explicat de faptul că
02
0
4
06
0
8
Cs 1 Cs 3 Cs 5 Cs-Hya 1
Cs-Hya 3
Cs-Hya 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa 3
Cs-Bsa 5
Cs-G 1
Cs-G 3
Cs-G 5
Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat
m
moli
L
2 zile 8 zile 16 zile
95
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
lizozimul conține un loc de legare hexameric iar secvențele hexazaharidice conținacircnd 3-4 sau
mai multe unități acetilate au o puternică influenţă asupra vitezei inițiale de degradare a
chitosanului După o pierdere mare de masă inițială viteza de degradare a suporturilor a scăzut
considerabil ca rezultat al pierderii secvențelor de hexazaharidă [170]
Tabel 36 Degradarea in vitro a suporturilor icircn prezenţă de lizozim
Denumirea
suportului
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
2 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
8 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
16 zile (mmoliL)
Cs 1 04045plusmn00014 06800plusmn00042 07452plusmn00028
Cs 3 04081plusmn00007 06292plusmn00028 06727plusmn00057
Cs 5 03791plusmn00064 06510plusmn00014 07343plusmn00021
Cs-Hya 1 03574plusmn00049 05132plusmn00028 06075plusmn00014
Cs-Hya 3 03827plusmn00028 07017plusmn00028 07379plusmn00071
Cs-Hya 5 03755plusmn00064 07742plusmn00028 07814plusmn00014
Cs-Bsa 1 03175plusmn00042 05640plusmn00085 07162plusmn00028
Cs-Bsa 3 03538plusmn00028 06510plusmn00035 06655plusmn00014
Cs-Bsa 5 03538plusmn00028 06582plusmn00028 06655plusmn00014
Cs-G 1 04226plusmn00049 07669plusmn00014 07814plusmn00014
Cs-G 3 04154plusmn00007 07887plusmn00042 08032plusmn00014
Cs-G 5 05024plusmn00035 07887plusmn00014 08249plusmn00042
După cum se poate observa icircn tabelul 36 pentru toate cele patru tipuri diferite de suporturi
Cs Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G concentraţia de particule magntice adăugate nu influenţează
semnificativ degradarea acestora Pentru toate cele trei intervale de timp la care s-a analizat
concentraţia de Cs degradat cele mai mari valori au fost obţinute pentru matricile Cs-G 5
96
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
3271 Testul MTT
Pentru evaluarea citotoxicității in vitro pe culturi de celule s-a utilizat metoda contactului
indirect realizacircndu-se un extract din suporturile obținute care icircn prealabil au fost sterilizate 10
mg din suporturile Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3 au fost introduse icircntr-o membrană
de dializă conținacircnd 4 ml alcool etilic 70 membrana de dializă fiind introdusă la racircndul ei icircntr-
un flacon steril conținacircnd 25 ml alcool etilic 70 După 30 minute alcool din flacon a fost
evacuat membrana de dializă fiind lasată icircn hotă pentru evaporarea alcoolui după care a fost
spălată icircn repetate racircnduri prin imersare icircn 25 ml PBS Fiecare probă din membrană de dializă a
fost imersată icircn 4 ml mediu de cultură complet și lasată la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului După cele 24 ore extractul a fost filtrat printr-un filtru de 70 microm
după care s-a măsurat volumul rezultat şi s-au adăugat 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost adus icircn contact cu două linii celulare diferite preosteoblaste MC3T3
(figura 37) și fibroblaste din derm uman (figura 38) icircn placi de 96 godeuri fiecare godeu
conținacircnd 3000 celule Cele două tipuri de celule au fost incubate pentru 24 ore icircn mediu de
cultură DMEM conținacircnd 10 BFS și 1 PSN Mediul complet a fost icircnlocuit complet după
cele 24 ore cu 150 μL extract Testul MTT s-a realizat la 24 48 și 72 ore calculacircndu-se
viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (15) din capitolul 2
Figura 37 Viabilitatea celulară a preosteoblatelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
97
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 38 Viabilitatea celulară a fibroblastelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
După 24 ore viabilitatea preosteoblastelor a fost cuprinsă icircntre 91 (Cs 3) şi 95 (Cs-
Bsa 3) pe cacircnd viabilitatea fibroblastelor a fost icircn jur de 96 pentru toate cele patru suporturi
analizate diferenţa foarte mică de procente fiind explicată de sensibilitatea crescută a
preosteobastelor Pentru ambele linii celulare s-a observat o uşoară scădere icircn timp a viabilităţii
celulare cea mai mică valoare calculată 88 fiind pentru suportul Cs-Hya 3 după 72 de ore
de contact a extractului cu fibroblastele
Datele obţinute icircn urma testului MTT au indicat faptul că suporturile nu au eliberat
compuşi citotoxici icircnglobaţi icircn structura suporturilor icircn momentul sintezei sau neicircndepărtaţi
care să influenţeze negativ ataşarea şi proliferarea celulară
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată biocompatibilitatea suporturilor şi lipsa unor efecte adverse a
acestora asupra celulelor s-a realizat un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM rezultatele
testului fiind redate icircn figura 39 Acelaşi extract utilizat la testul MTT a fost incubat cu
fibroblaste pentru 24 respectiv 96 ore
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
98
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 39 Viabilitatea celulară icircn urma testului cu Calceină-AM
Comparacircnd imaginile reprezentacircnd celulele incubate cu extractul suporturilor Cs-Bsa 3
respectiv Cs-G 3 cu imaginile reprezentacircnd celule care au fost incubate fără extract s-a
observat că nu există diferenţe de densitate celulară la niciunul din cei doi timpi de contact ceea
ce indică lipsa efectelor adverse a suporturilor asupra fibroblastelor
Atacirct rezultatele obţinute icircn urma testului MTT cacirct şi rezultatele obţinute icircn urma testului
cu Calceină-AM au evidenţiat un comportament bun al suporturilor la contactul cu cele două linii
celulare (fibroblaste şi preosteoblaste) ceea ce a condus la concluzia că suporturilor sunt
biocompatibile in vitro
99
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
33 Concluzii
Icircn capitolul de față s-au obținut și caracterizat suporturi compozite pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de concentrații diferite de particule magentice
Chitosanul unul din biopolimeri cei mai utilizați icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost
combinat cu acid hialuronic albumină serică bovină sau gelatină
Analizacircnd structura chimică a suporturilor s-a observat icircn spectrele FTIR
prezența picurilor caracteristice tuturor componentelor introduse icircn sinteza Diferite tipuri de
fosfați de calciu au fost identificate icircn faza cristalină a suporturilor cel mai impotant dintre
aceștia fiind hidroxiapatita identificată icircn suportul Cs-G 3
Morfologia a fost studiată icircn secţiunea suporturilor imaginile evidenţiind o
porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea fosfaţilor de calciu pe structura polimerică
Particulele magnetice sunt complet integrate icircn structura compozită Dimensiunea minimă a
porilor a fost icircn jur de 300 microm iar dimensiunea maximă icircn jur de 2000 microm
Comparacircnd valorile obţinute pentru magnetizarea suporturilor cu datele de
literatură concentrația de 5 particule magnetice s-a dovedit a fi cea mai apropiată de datele
regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective De asemenea se poate afirma că suporturile sunt
superparamagnetice
Retenția fluidelor biologice simulate este influențată de morfologia suporturilor și
proprietățile hidrofile ale suporturilor iar viteza de degradare enzimatică in vitro este corelată cu
conținutul de fază polimerică
Testele de citotoxicitate in vitro indică faptul că suporturile obținute nu eliberează
substanţe citotoxice care să influenţeze negativ proliferarea celulară
100
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub
formă uscată
Icircn ingineria tisulară a ţesutului osos polizaharidele (chitosan acid hialuronic) şi proteinele
(colagengelatină fibroină din mătase albumină) se numără printre cele mai utilizate
biomateriale pentru sinteza de suporturi [37]
Chitosanul ndash Cs este unul din cei mai utilizaţi biopolimeri icircn ingineria tisulară datorită
proprietăţilor sale remarcabile Numeroase studii prezintă rezultate foarte bune ale acestui
biopolimer icircn aplicaţii vizacircnd regenerarea şi repararea ososă [56 148 151 171] Colagenul ndash
Col este un alt biopolimer adesea utilizat icircn ingineria tisulară proprietăţile ce icircl recomandă
pentru ingineria tisulară a ţesutului osos icircn mod particular fiind osteoconductivitatea şi
biocompatibilitatea Asocierea cu fosfaţi de calciu ajută la o integrare foarte bună a unui suport
pe bază de colagen şi fosfaţi de calciu icircn ţesutul osos icircn studii in vivo [90] Acidul hialuronic ndash
Hya un alt biopolimer cu proprietăţi foarte bune ce susţine regenerarea tisulară la locul defectelor
osoase contribuind la formarea de calus Icircn aplicaţii pentru regenerarea osoasă acidul hialuronic
este combinat cu fosfaţi de calciu şi cu alţi biopolimeri [142 172]
Plecacircnd de la componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă
anorganică 20-30 componentă organică și apă) cei trei biopolimeri mai sus menţionaţi au fost
amestecaţi cu fosfaţi de calciu din precursori Icircn sinteză a fost integrată şi o concentraţie de 5
particule magneticendash MNPs concentraţie stabilită icircn urma rezultatelor obţinute icircn capitolul 3 icircn
care au fost studiate trei concentraţii diferite de MNPs
41 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute printr-un procedeu biomimetic prin precipitarea de fosfați de
calciu (CP) din precursorii CaCl2 şi NaH2PO4 icircntr-o amestec de biopolimeri CsndashColndashHya
(chitosan ndash colagen ndash acid hialuronic) icircn prezenţă de soluţie apoasă de amoniacSoluţia de Cs
(1) a fost obţinută prin dizolvare de Cs purificat icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Soluția
de Col (tip I + III) a fost obţinută de la LohmannampRauscher GmbH Germania Concentraţia de
Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză Icircnainte de
procesul de precipitare icircn soluția de polimeri CsndashColndashHya s-au adăugat 5 particule magnetice
101
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sub formă uscată (5 față de cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza
suporturilor) Soluţiile apoase de CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost adăugate peste
amestecul de soluţii de biopolimeri şi particule magnetice şi omogenizate prin agitarea mecanică
după care pH-ul soluţiei a fost adus la valoarea de 72-74 cu ajutorul soluţiei de NH4OH (25)
S-a urmărit menţinerea pH la valoare menţionată pentru 24 orePentru eliminarea compuşilor
nereacţionaţi amestecul final a fost spălat cu apă distilată prin centrifugare la 5000 rotații pe
minut timp de 10 minute etapă repetată de trei ori Ultima etapă icircn obţinerea suporturilor a fost
liofilizarea la temperatura de -55ordmC timp de 24 h Etapele procesului de obţinere sunt prezentate
icircn figura 41
Figura 41 Obţinerea suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat un program
experimental cu două variabile (concentrația de Col - raporată la concentrația de Cs
respectiv raportul CaP) Icircn tabelul 41 este prezentată codificarea variabilelor independente ale
programului experimental iar icircn tabelul 42 domeniile de variaţie precum şi codificarea
suporturilor (P1 - P13)
102
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Tabel 41 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 42 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Cod suport X1 X2 Col Cs CaP
P1 -1 -1 35 65 16
P2 1 -1 65 35 16
P3 -1 1 35 65 17
P4 1 1 65 35 17
P5 -1141 0 2879 7121 165
P6 1141 0 7121 2879 165
P7 0 -1141 50 50 1579
P8 0 1141 50 50 1721
P9 0 0 50 50 165
P10 0 0 50 50 165
P11 0 0 50 50 165
P12 0 0 50 50 165
P13 0 0 50 50 165
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii chimice utilizacircnd
analiza FTIR iar din punct de vedere al morfologiei prin SEM De asemenea s-au analizat
comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora proprietăţile
mecanice și proprietăţile magnetice al suporturilor Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată
printr-un test MTT in vitro (contact indirect) şi in vivo pe şobolani Wistar
Deoarece orice suport ce se dorește a fi implantat icircn organismul uman trebuie sterilizat
icircnainte de implantare se urmărește realizare de suporturi care să nu-și modifice morfologia și
structura fizică şi chimică după sterilzare Icircn acest scop suporturile P5 P6 P7 P8 și P9 au fost
103
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru 4 ore Pentru suporturile sterilizate au
fost studiate morfologia și structura chimică
42 Rezultate și discuții
421 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR La fel ca icircn cazul
morfologiei suporturilor au fost analizate prin FTIR suporturile icircnainte şi după expunere la UV
pentru 4 ore
Icircn figura 42A se pot observa spectrele suporturilor P5 P6 P7 P9 şi a particulelor
magnetice ndash MNPs sub formă uscată icircnainte de expunere la UV iar icircn figura 42B spectrele
suporturilor P5 P6 P7 P8 P9 după expunere la UV
Structura chimică a MNPs a fost confirmată de prezenţa benzilor de absorbţie caracteristice
chitosanului gruparea -OH la 3431 cm-1
amida I la 1637 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii
CndashN la 1384 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1072 cm-1
precum şi grupării FendashO
a magnetitei la 560 cm-1
[160]
Pe spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P9 (icircnainte de expunere la UV) au putut fi
identificate benzi de absorbţie caracteristice celor trei biopolimeri după cum urmează gruparea -
OH la 3429 cm-1
(P6) 3430 cm-1
(P7) 3431 cm-1
(P5 P9) gruparea ndashCH2 la 2924 cmminus1
(P5 P9)
şi la 2925 cm-1
(P6 P7) amida I la 1637 cmminus1
(P5) 1638 cm-1
(P9) 1653 cm-1
(P6) 1655 cm-1
(P7) amida II la 1555 cmminus1
(P7) 1563 cm-1
(P6) amida III la 1240 cmminus1
(P7 P9) 1242 cmminus1
(P5) 1246 cmminus1
(P6) şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1031 cmminus1
(P5 P7) 1032 cmminus1
(P9) 1035 cmminus1
(P6) Icircn cazul suportului P6 care conţine cea mai mare cantitate de colagen s-a
observat o intesitate mai mare a benzilor amidelor I II şi III după cum era de aşteptat Icircn plus icircn
toate spectrele s-a observat prezenţa picului asociat grupării COO- a hialuronatului de sodiu la
1405 cmminus1
(P7 P9) 1406 cmminus1
(P6) şi 1410 cmminus1
(P5) [173]
Benzile caracteristice magnetitei din particulele magnetice icircncorporate icircn suporturi au fost
observate la 561 cm-1
(P5 P7 P9) şi 562 cm-1
(P6) Icircn toate spectrele se pot observa picuri
specifice grupării fosfat PO43-
la 603 cm-1
(P5) şi 604 cm-1
(P6 P7 P9) Datorită faptului că
benzile caracteristice magnetitei sunt foarte aproape de cele caracteristice grupării fosfat
sugerează o suprapunere a acestora şi faptul că nu pot fi separate [99]
104
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 42 Spectrele FTIR ale suporturilor A icircnainte de expunere UV B după expunere UV
Icircn figura 42B sunt redate spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P8 şi P9 după
sterilizare prin expunere la radiaţii UV La fel ca icircn cazul suporturilor care nu au fost sterilizate
s-a observat prezenţa picurilor caracteristice celor trei biopolimeri a picurilor caracteristice
fosfaţilor de calciu şi a picurilor caracteristice particulelor magnetice la numere de undă
apropiate de cele ale picurilor caracteristice componentelor suporturilor nesterilizate ceea ce a
indicat faptul că procesul de sterilizare utilizat nu influenţează structura chimică a suporturilor
obţinute
105
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
422 Morfologia suporturilor
Datele SEM oferă informaţii importante despre suporturile realizate pentru ingineria
tisulară a ţesutului osos deoarece studiază morfologia lor aceasta avacircnd o influenţă
considerabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale suporturilor Morfologia a fost studiată icircn
secţiunea suporturilor Pentru o privire de ansamblu 5suporturi cu compoziţii diferite au fost
analizate la diverse ordine de mărire De asemnenea s-au analizat suporturi ce au fost expuse
pentru 4 ore la radiaţii UV pentru a vedea dacă acest proces de sterilizare influenţează
morfologia suporturilor
Icircn figura 43 sunt prezentate datele SEM ale suporturilor P5 P6 P7 şi P8 icircnainte de
expunere la UV iar icircn fugura 44 după expunere la UV la două ordine de mărire diferite Se
observă o structură poroasă tridimensională cu pori interconecaţi
Figura 43 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 icircnainte de expunere la UV
La ambele ordine de mărire s-a observat o distribuţie uniform a particulelor magnetice şi a
fosfaţilor de calciu icircn structura compozită polimerică Distribuţia uniformă a particulelor
magnetice se datorează procedeului de icircncorporarea directă a acestora icircn sinteză date
106
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
asemănătoare ce susţin acestă metodă de icircncorporarea fiind regăsite şi icircn alte studii din literatura
de specialitate
Figura 44 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 după expunere la UV
Comparacircnd imaginile din figura 43 cu cele din figura 44 nu s-au observat diferenţe de
morfologie a suporturilor aceaşi structură tridimensională poroasă fiind prezentă şi icircn acest caz
ceea ce indică faptul că procesul de sterilizare prin expunere la radiaţii UV pentru 4 ore nu
influenţează morfologia suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de 5 mg din fiecare probă a fost imersat icircn PBS pH= 72 icircntr-o microcoloană (QIAquickreg
Spin
Colummn 50 diametru 10 mm) ataşată la o microseringă de 1 ml icircntreg sistemul fiind incubat la
37ordmC pentru 72 ore după care s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din
capitolul 2 S-au analizat două fragmente din fiecare tip de suport şi s-a calculat deviaţia
standard Rezultatele obținute icircn urma acestui studiu sunt redate icircn figura 45
107
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Gradul de retenție al suporturilor preparate pentru aplicații icircn inginerie tisulară influențează
răspunsul suporturilor la difuziunea celulelor nutrienților și medicamentelor caracteristici foarte
importante pentru aplicația vizată [174]
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor ce
a fost observată pe imaginile SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei biopolimeri
utilizați icircn procesul de sinteză O parte din PBS este implicat icircn interacțiunea cu matricea
polimerică iar o altă parte este reținută fizic icircn porii suporturilor Cea mai mare valoare a
gradului de retenție a fost calculată pentru P7 suport ce are cel mai mic raport CaP = 1579 iar
una din cele mai mici valori ale gradului de retenţie a fost calculată pentru P8 suport ce are cel
mai mare raport CaP = 1721 ceea ce indică o influenţă semnificativă a raportului CaP asupra
retenţie de fluide biologice simulate Practic fosfaţi de calciu acoperă matricea polimerică
icircngreunacircnd pătrunderea soluţie PBS icircn interior
Figura 45 Gradul de retenție maxim PBS () pentru suporturile obținute
Se poate observa de asemenea că valorile gradului de retenție măsurate pentru suporturile
cu aceași compoziție teoretică sunt apropiate ceea ce indică reproductibilitatea metodei utilizate
pentru sinteza suporturilor
108
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat reacția cu enzime utilizacircnd lizozim și
colagenază Primul pas a fost imersarea a aproximativ 10 mg din fiecare probă icircn 5 mL soluţ ie de
PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de dializă
introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS Două mostre din fiecare probă au fost supuse degradării
Probele au fost apoi incubate la 37ordmC La intervale de 4 ore 48 ore 72 ore 7 zile și 14 zile de la
incubare un volum de 2 ml din fiecare probă a fost extras şi analizat din soluţia de PBS icircn care
este imersată membrana de dializă cu proba de analizat din punct de vedere al concentraţiei de
chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la intervalele de timp mai sus
menţionate datele obţinute icircn urma studiului fiind redate icircn figura 46 Icircn toate cazurile s-a
observat o creștere a ratei de degradare icircn timp avantajul suporturilor biodegradabile icircn
comparaţie cu cele care nu se degradadează este resorbţia materialului icircn timp fiind astfel exclus
riscul de rejecţie a suportului de către organism
Suporturile P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri (65 Cs 35 Col) şi raport
CaP diferit P1 are raportul CaP = 16 iar P3 are raportul CaP = 17 Icircn cazul suporturile P2 şi
P4 a fost aceeaşi situaţie ca icircn cazul suporturilor P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri
(35 Cs 65 Col) diferenţa dintre ele fiind dată de raportul CaP P2ndash CaP = 16 P4ndash CaP =
17 Nu au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute pentru cele patru suporturi fiind
observată o degradare ce creşte gradual icircn timp
Icircn cazul suporturilor P7 şi P8 suporturi ce au cel mai mic raport CaP (1579) ndash P7 și cel
mai mare raport CaP (1721) ndash P8 şi aceeaşi compoziţie polimerică nu au fost observate
diferențe semnificative icircn ceea ce priveşte cantitatea de chitosan degradat la niciunul din cele 5
intervalele de timp Icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 care au aceeaşi compoziţie nu au fost
observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute icircn toate cazurile fiind observată o degradare
constatantă icircn timp
109
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 46 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturi
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat
Rezultatele privind analiza concentraţia de colagen degradat au fost redate icircn figura 47 Icircn
cazul suporturilor P1ndash P4 s-a observat o legătură evidentă icircntre concentrația de colagen degradat
și compoziția polimerică a suporturilor
Icircn acest studiu pentru a determina viteza de degradare a suporturilor s-a utilizat colagenaza
bacteriană o enzimă specifică pentru degradarea in vivo a colagenului care hidrolizează
preferențial legăturile X-Gly icircn următoarele grupe de aminoacizi glicină-leucină (Gly-Leu)
glicină-izoleucină (Gly-Ile) alanin-prolină-glicină (Ala-Pro-Gly)
Icircn ceea ce privește concentraţia de colagen degradat pentru suporturile P5 ndash P9 s-a
observat şi icircn acest caz o legătură stracircnsă icircntre concentrația de colagen degradat și compoziția
polimerică a suporturilor cele mai mari valori fiind obţinute pentru suportul P6 ce conţine 7121
colagen şi doar 2879 chitosan şi cele mai mici valori pentu suportul P5 ce conţine 7121
chitosan şi 2879 colagen
La fel ca şi icircn studiul concentraţie de chitosan degradat icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 nu
au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute ceea ce confirmă reproductibilitatea
metodei
110
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 47 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturi
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ egale iar după ce s-au
determinat dimensiunile au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii specificaţi icircn
capitolul 2 Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru
fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a calculat modulul lui Young iar
la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind prezentate grafic icircn figura 48
Oasele sunt organe rigide formate din ţesut osos măduvă osoasă endost periost cartilaj
nervi şi canale vertebrale Icircn funcţie de structura sa ţesutul osos este de două tipuri ţesut osos
compact (cortical) şi ţesut osos spongios (trabecular) Ţesutul osos compact este localizat la
suprafaţa osului şi după cum sugerează şi denumirea sa are o macrostructură omogenă şi
compactă Se găseşte la diafiza oaselor iar grosimea sa variază icircn funcţie de localizarea
anatomică Ţesutul osos spongios este o reţea de pori interconectaţi volumul de spaţiu gol fiind
cuprins icircntre 50 şi 90 şi este localizat icircn epifiza oaselor lungi
Cele două tipuri de ţesuturi spongios şi compact au o influenţă semnificativă asupra
proprietăţilor mecanice ale osului Scheletul uman este supus zilnic la diferite forţe icircn funcţie de
activităţile icircntreprinse forţele de tensiune forţele de compresiune şi forţele de forfecare fiind
cele care acţionează cel mai adesea asupra ţesutului osos Solicitările mai complexe cum ar fi de
111
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
exemplu icircncovoierea osului pot fi descompuse la racircndul lor icircn cele trei forţe menţionate
anterior Pentru a studia solicitările la care este supus ţesutul osos proprietăţile mecanice ale
osului cum sunt modulul de elasticitate (Young) rezistenţa la compresiune şi tensiunea trebuie să
fie pe deplin icircnţelese Icircn ceea ce priveşte modului lui Young notat cu E acesta are valori diferite
pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut osos astfel E este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru
ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru ţesutul osos spongios [168]
Figura 48 Modulul lui Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de
calciu cu incluziune de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young icircn cazul suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi
fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice au fost cuprinse icircntre 3841 MPa şi
22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător
valorilor Modulului Young al ţesutului osos spongios Asemănarea suporturilor obţinute cu
ţesutul osos spongios poate fi susţinută şi de datele SEM care au evidenţiat o structură poroasă
tridimensională
Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru suportul P5 suport ce are cea mai mare
cantitate de chitosan icircn compoziţie (7121 Cs 2879 Col) iar cea mai mică valoare s-a
obţinut pentru P2 unul din suporturile cu cea mai mică cantitate de chitosan (35 ) ceea ce
indică o icircmbunătăţire a rezistenţei la compresiune a suporturilor prin adăugare de chitosan icircn
sinteza suporturilor Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie P9 ndash P13 valorile obţinute
112
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
pentru E sunt apropiate ceea ce indică faptul că metoda de sinteza a suporturilor este
reproductibilă
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 rezultatele obținute fiind prezentate icircn tabelul 43
Tabel 43 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire
suport
Susceptibilitate
magnetică (volum)
Magnetizarea
(emug)
P1 0160 middot e-4
1319
P2 0154 middot e-4
1269
P3 0135 middot e-4
1113
P4 0254 middot e-4
2093
P5 0160 middot e-4
1319
P6 0047 middot e-4
387
P7 0242 middot e-4
1995
P8 0112 middot e-4
923
P9 0257 middot e-4
2118
P10 0254 middot e-4
2093
P11 0432 middot e-4
3561
P12 0810 middot e-4
6676
P13 0514 middot e-4
4236
S-a observat că valorile obținute sunt cuprinse icircntre 387 şi 6676 emug amintind că s-a
introdus in sinteză o concentrație de 5 particule magnetice sub formă uscată (5 față de
cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor) ceea ce indică că
suporturile obţinute sunt superparamagentice
113
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare s-a utilizat metoda contactului indirect
realizacircndu-se un extract din suporturile P5 şi P6 care icircn prealabil au fost sterilizate după aceeaşi
metodă descrisă icircn capitolul 3 subpunctul 327 Fragmentele de suporturi sterilizate au fost
ulterior imersate icircn 4 ml mediu de cultură DMEM și lăsate la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului urmacircnd apoi filtrarea extractului printr-un filtru de 70 microm
măsurarea volumul final şi adăugarea a 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost pus icircn contact cu două linii celulare diferite fibroblaste din derm uman
(NHDF Lonza) și preosteoblaste MC3T3 icircn placi de 96 godeuri 3000 celule godeuCele două
tipuri de celule au fost incubate separat pentru 24 ore icircn mediu de cultură DMEM complet
icircnlocuit după cele 24 ore cu 150 μl extract Testul MTT a fost realizat la 24 48 și 72 ore
calculacircndu-se viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (7) din capitolul 2 rezultatele testului fiind
prezentate icircn figura 49 pentru contactul indirect al suporturilor cu fibroblaste şi icircn figura 410
pentru contactul indirect al suporturilor cu preosteoblaste
Figura 49 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu fibroblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea fibroblastelor s-a observat o uşoară creştere icircn timp a
acesteia pentru ambele suporturi analizate Icircn cazul suportului P5 valorile calculate pentru
viabilitate au fost cuprinse icircntre 964 şi 979 valori ce au sugerat lipsa unor efecte adverse
ale extractului asupra fibroblastelor deci suportul a fost considerat biocompatibil Pentru
114
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
suportul P6 s-au calculat valori uşor mai scăzute ale viabilităţii celulare icircntre 88 şi 924 dar
chiar şi aşa acestea s-au icircncadrat icircn limitele care au permis să se afirme că suportul este
biocompatibil
Figura 410 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu preosteoblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea preosteoblastelor s-au calculat valori mai mici decat icircn
cazul fibroblastelor S-a observat o tendinţă de scădere a viabilităţii icircn timp cea mai mică
valoare de 83 fiind calculată pentru suportul P6 Icircn cazul suportului P5 cea mai mică valoare
calculată a fost de 87 Rezulatele obţinute icircn urma contactului indirect cu preosteoblastele au
indicat faptul că suporturile nu au eliberat compuşi citotoxici acestea fiind biocompatibile
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor
Testele in vivo pentru determinarea citotoxicității s-au realizat pe femele icircn vacircrstă de 6
săptămacircni Animalele au fost grupate icircn 2 loturi lotul martor format din 9 șoareci a fost utilizat
ca bază de comparație pentru lotul cu implant (II) ndash suportul P9 compus din 18 șoareci Cu
excepţia celor de control tuturor celorlalţi li s-au implantat subcutanat fragmente de suporturi cu
dimensiunea 1 cm x 1 cm
Durata experimentului a fost de 21 de zile La finalul primelor 7 zile de experiment au fost
sacrificați 3 șoareci din lotul martor și 6 din lotul II Inițial animalele au fost supuse zilnic unei
observații clinice amănunțite pentru a depista eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca
115
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
urmare a intolerabilității implantului după care au fost sacrificate iar tesuturile adiacente
implantului au fost examinate histologic La fel s-a procedat si pentru ceilalți șoareci sacrificați
la 14 și respectiv 21 de zile
Preparatele au fost citite la microscop şi interpretate Macroscopic nu s-au remarcat
modificări locale evidente Microscopic pe probele de ţesut recoltat ce includeau implantul şi
ţesutul din jur imaginile au indicat o reacţie inflamatorie cronică uşoară infiltraţie limfoidă
difuză şi capsulă conjunctivă icircn jurul implantului La loturile testate suportul compozit a icircnfaţişat
aspecte de biodegradare superficială La lotul martor fals implantat unul din animale a dezvoltat
o reacţie inflamatorie uşoară cu infiltraţii limfocitare perivasculare restul secţiunilor au relevat
o vindecare normală a plăgii chirurgicale
După 7 zile de la implantare icircn jurul materialului implantat se remarcă un infiltrat
inflamator moderat reprezentat de leucocite neutrofile histiocite și macrofage (figura 411A)
Totodată icircn țesutul conjunctiv din jurul implantului se observă un infiltrat celular mononuclear
interfibrilar susținut de o congestie a capilarelor limitrofe ce se regăsește și icircn structura
materialului implantat (figura 411B) Structurile profunde ale pielii (dermul și hipodermul) nu
suferă modificări alterative Se remarcă o ușoară densificare a țesutului conjunctiv subcutanat
printr-o sporire a elementelor celulare (fibroblastele) și fibrilare (fibrele de colagen ) ale acestuia
(fugura 411C)
Figura 411 Examen histopatologic după 7 zile de la implantare Colorare tricromic Masson
După 14 zile de la implantare materialul implantat are o structură mai ldquoaerisitărdquo probabil
consecință a resorbției tisulare a unor constituienți Icircn jurul materialului implantat se observă o
veritabilă capsulă conjunctivă formată din țesut conjunctiv tacircnăr ce are tendința de sechestrare a
acestuia și care trimite scurte travei spre zona centrală a materialului implantat (figura 412A)
Se observă la periferia materialului implantat travei (septe) conjunctive pornite din capsula
116
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
conjunctivă periferică ce infiltrează materialul implantat remarcacircndu-se tendința de icircnglobare a
acestuia (figura 412B) icircntr-un țesut conjunctiv neoformat lax icircncă imatur reprezentat din
fibroblaste și fibre de colagen tinere (figura 412C)
Figura 412 Examen histopatologic după 14 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
După sacrificarea animalelor la 21 zile de la intervenția chirurgicală de implantare
subcutatantă macroscopic (figura 413A) nu există modificări locale evidente icircn structurile
cutanate din dreptul implantului la nici unul dintre animalele examinate histopatologic
Microscopic s-a observat un țesutul conjunctiv neoformat icircncă imatur dezorganizat
constituit din fibroblaste active și fibre de colagen cu un aranjament anarhic repezentat de
vacircrtejuri și cordoane (figura 414A) De asemenea au fost remarcate mici depozite de fosfat de
calciu sechestrate icircn masa conjunctivă neoformată (figura 414B) și septe conjunctive constituite
din țesut conjunctiv cu dispoziție diametrală și care străbat materialul implantat cu tendința de a-
l icircngloba
Figura 413 Analiza macroscopică a implantului
117
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 414 Examen histopatologic după 21 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
Drept concluzie a studiilor in vivo ce au urmărit interacțiunile dintre suporturi și țesuturile
vii s-a remarcat o lipsă de citotoxicitate a implantului subcutanat susținută de absența oricărei
reacții locale sau sistemice de respingere
43 Concluzii
Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu au fost obținute
prin precipitarea de fosfați de calciu din precursori CaCl2 și NaH2PO4 icircntr-un amestec de trei
biopolimeri cu proprietăți remarcabile pentru regenerarea osoasă Cs Col și Hya Un program
experimental a fost folosit pentru optimizarea metodei 13 suporturi fiind preparate P1 ndash P13 Icircn
sinteză a fost integrate o concentrație de 5 MNPs
Structura chimică a suporturilor precum și morfologia acestora au fost studiate și
pentru suporturi ce au fost expuse la radiații UV timp de 4 ore procedeu utilizat icircn unele aplicații
biomedicale pentru sterilizare
Benzi de frecvență caracteristice biopolimerilor CP și MNPs au fost observate icircn
toate spectrele FTIR Nu au fost observate diferențe icircntre spectrele suporturilor expuse la radiații
UV și cele normale ceea ce icircnseamnă că acest proces de sterilizare nu influențează structura
chimică a suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată icircn secțiune cu ajutorul SEM S-a remarcat
o structură poroasă a suporturilor cu CP și MNPs distribuite uniform pe scheletul polimeric
Distribuția uniform a MNPs este atribuită procedeului de icircncorporare direct a acestora icircn etapa de
118
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sinteză La fel ca icircn cazul structurii chimice radiațiile UV nu infleunțează morfologia
suporturilor astfel acest proces de sterilizare poate fi utilizat pentru testele in vitro și in vivo
Determinarea gradului de retenție PBS s-a realizat utilizacircnd o metodă
volumetrică valorile obținute după 72 ore de la interacțiunea suportului cu fluidul la 37degC
indicacircnd o influență semnificativă a raportului CaP asupra proprietății studiate
Pentru studiile de degradare in vitro s-a studiat interacțiunea cu un complex de
două enzime lizozim și colagenază enzime implicate in vivo icircn procesele de degradarea a
chitosanului respectiv colagenului Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul
ambilor biopolimeri
Modului lui Young are valori diferite pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut
osos este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru
ţesutul osos spongios Valorile obţinute icircn cazul suporturile preparate au fost cuprinse icircntre 3841
MPa şi 22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul corespunzător modulului Young al
ţesutului osos spongios
Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor
Teste de citotoxicitate in vitro realizate icircn paralel pe două linii celulare diferite
fibroblaste și osteoblaste au indicat faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra celulelor
Caracterul non-citotoxic al suporturilor a fost evidențiat și in vivo după ce fragmente de
suporturi au fost implantate subcutanat la șoareci După 21 zile aceștia au fost sacrificați iar
fragmentele de țesut cu implant au fost analizate macroscopic și microscopic
119
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de
particule magnetice
Avacircnd icircn vedere proprietăţile biopolimerilor Cs Col şi Hya descrise icircn amănunt icircn
capitolele anterioare precum şi procedeul biomimetic de co-precipitarea de fosfați de calciu (CP)
din precursori CaCl2 şi NaH2PO4 un lot nou de suporturi a fost realizat conform metodei de
obţinere utilizate icircn capitolul 4 diferenţa dintre acest lot de suporturi şi lotul de suporturi
descrise icircn capitolul 4 fiind dată de modalitatea de incluziune a particulelor magnetice icircn etapa
de sinteză a suporturilor icircn cazul lotului din capitol 4 particulele au fost incorporate sub formă
uscată iar icircn cazul acestui lot particulele au fost icircncorporate sub formă de suspensie coloidală
51 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute prin acelaşi procedeu biomimetic utilizat icircn capitolul 4 Icircn
acest scop soluţii de precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri Cs (1) Col (1) Hya (1) şi 5 suspensie coloidală de
MNPs icircn apă (raportată la cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor)
pH-ul amestecului a fost apoi ajustat la 72-74 utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac iar după
spălare cu apă distilată pentru eliminarea compuşilor nereacţionaţi amestecurile au fost
liofilizate pentru 24h
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat şi de această dată
acelaşi program experimental cu două variabile (concentrația de Col - raportată la
concentrația de Cs respectiv raportul CaP) utilizat icircn capitolul 4 Icircn tabelul 51 este
prezentată codificarea varabilelor programului experimental iar icircn tabelul 52 sunt prezentate
domeniile de variaţie precum şi codificarea suporturilor (S1 - S13)
Utilizacircnd ecuației (3) din capitolul 2 s-au determinat valorile variabilelor investigate din
programul experimental icircmpreună cu răspunsurile obținute Coeficienţii de regresie au fost
determinaţi si sunt prezentaţi icircn tabelul 53 alături de coeficienți de corelație și de abatere
standard Variabila răspuns Y1 corespunde gradului de retenție PBS a suporturilor preparate ()
iar Y2 corespunde modului de elasticitate E (MPa) ndash tabel 54
120
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 51 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 52 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Codificare
Support X1 X2 Col Cs CaP
S1 -1 -1 35 65 16
S2 1 -1 65 35 16
S3 -1 1 35 65 17
S4 1 1 65 35 17
S5 -1141 0 2879 7121 165
S6 1141 0 7121 2879 165
S7 0 -1141 50 50 1579
S8 0 1141 50 50 1721
S9 0 0 50 50 165
S10 0 0 50 50 165
S11 0 0 50 50 165
S12 0 0 50 50 165
S13 0 0 50 50 165
Tabel 54 Eroarea asimetrică coeficienţii de corelare si de regresie determinați
a1 a2 a3 a4 a5 a6 COR ASE
Y1 0256534 0006965 0001565 -0033 -000592 -004559 0980261 0024421
Y2 894655 8300833 -204625 486659 -394375 9217909 0986554 7447254
121
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 54 Programul experimental icircmpreună cu valorile determinate pentru retenție PBS
() și E (MPa)
Codificare
suport X1 X2 Y1 ndash Retenție PBS () Y2 ndash E (MPa)
S1 -1 -1 121714plusmn21973 20925plusmn32
S2 1 -1 109649plusmn32378 27947plusmn22
S3 -1 1 239234plusmn17309 12001plusmn34
S4 1 1 163522plusmn10871 16201plusmn24
S5 -1141 0 138888plusmn24263 8668plusmn33
S6 1141 0 100628plusmn20724 12261plusmn29
S7 0 -1141 109091plusmn22104 9038plusmn21
S8 0 1141 121213plusmn5471 8372plusmn12
S9 0 0 138889plusmn18159 7628plusmn32
S10 0 0 138960plusmn18209 7873plusmn12
S11 0 0 146019plusmn1502 8089plusmn24
S12 0 0 141067plusmn10022 7942plusmn8
S13 0 0 141844plusmn9215 8034plusmn32
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei utilizacircnd
spectroscopia IR cu transformare Fourier (FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de
energie (EDS) şi difracţie cu raze X (XRD) Din punct de vedere al morfologiei au fost
caracterizate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM) și prin micro computer-tomografie
(microCT) De asemenea s-au analizat comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora proprietățile mecanice și proprietățile magnetice Citotoxicitatea
suporturilor a fost analizată printr-un test MTT in vitro (contact direct) şi in vivo pe şoareci din
linia CD1
Suporturile S7 S8 și S9 au fost sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru
4 ore şi au fost studiate morfologia și structura lor chimică cu scopul de a observa influenţa
porcesului de sterilizare asupra carcteristicilor menţionate
122
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
52 Rezultate și discuții
521 Structura chimică a suporturilor
Datele obţinute icircn urma analizei FTIR oferă informaţii despre structura suporturilor
Suporturile au fost analizate icircnainte şi după expunere la UV pentru 4 ore rezultatele fiind redate
icircn figura 51 S-au observat picuri pentru cei trei biopolimeri (Amide I C=O Amide II N-H
funcțiile OH grupari alifatice) fosfații de calciu (PO3-
4 la 563 cm-1
) și nanoparticule magnetice
[99 175]
Figura 51 Spectrele FTIR pentru suporturile S7 S8 S9
A icircnainte de expunere la UV B după expunere la UV
Benzile reprezentative pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 55 După cum se poate
observa benzile reprezentative pentru suporturile expuse la UV au valori foarte apropiate sau
chiar identice cu cele ale suporturilor care nu au fost expuse la UV ceea ce icircnseamnă că
123
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
radiațiile UV nu influențează structura chimică a acestora chiar și după o periadă mare de timp
(4 ore)
Tabel 52 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S1 și S3
IcircIcircnainte de expunere la UV DuDupă expunere la UV
Grupări
funcționale
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
OH 3421 3418 3409 3421 3419 3415
C-H 2937 2936 2934 2937 2942 2936
Amida I
C=O 1653 1659 1655 1655 1652 1655
Amida II
N-H 1556 1556 1552 1557 1556 1552
C-O 1030 1031 1030 1031 1030 1030
Fe-O 603 603 602 603 603 602
PO3_4
561 561 560 561 561 561
522 Compoziția suporturilor
Icircn figura 52 este redată difractograma XRD pentru suporturile S7 S8 și S9 Picurile
caracteristice specifice fosfaţilor de calciu ce pot fi associate planelor (002) (210) (112) (213)
și (004) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF No 65-3107) și unghiurile cu care
acestea sunt corelate sunt redate icircn tabelul 56 [176]
Figura 52 Spectrul XRD pentru suporturile S7 S8 și S9
124
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 56 Diferite forme de CP prezente icircn suporturile analizate conform JCPDS
Unghi 2ϴ (deg) Intensitate (ua) Index conform JCPDS Formula chimică
26 002 44-0778 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
28 210 44-0810 Ca3H2(P2O7)2 ∙ H2O
31 112 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
49 213 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
53 004 02-1350 CaHPO4
Icircn figura 53 este redat spectrul EDS pentru suportul S5 Numărul atomic pentru Ca a fost
292 iar pentru P a fost 148 ceea ce a indicat un raport CaP= 197 această valoare fiind
apropiată de valoare raportului CaP al fosfatului tertacalcic (TTCP) ndash Ca4(PO4)2O care este 200
[177]
Figura 53 Spectrul EDX pentru suportul S5
523 Morfologia suporturilor
Porozitatea caracterizată drept procentul de spaţiu gol dintr-un solideste una din cele mai
importante caracteristici ale unui suport realizat pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară şi
regenerarea ţesutului osos Porozitatea unui suport este influenţată de natura materialelor din
compoziţia sa precum şi de procesul de obţinere Un suport pentru regenerarea osoasă trebuie să
susţină migrarea şi proliferarea osteoblastelor şi a celulelor mezenchimale să permită
pătrunderea vaselor de sacircnge şi angiogeneza iar icircn final să contribuie la formarea de neoţesut
[178] Porozitatea unui suport influenţeză o serie de alte caracteristici esenţiale pentru un suport
125
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
realizat pentru aplicaţia menţionată anterior cele mai semnificative fiind biodegradabilitatea şi
proprietăţile mecanice
Rezultatele SEM sunt prezentate icircn figura 54 Figura 54A reprezintă suporturile S7 S8
S9 icircnainte de expunere la radiații UV iar figura 54B aceleași suporturi după expunere la
radiații UV La 500 microm se poate observa o structură poroasă a suporturilor şi icircncorporarea
particulelor magnetice și a cristalelor de calciu icircn matricea polimerică şi faptul că nu există
diferențe icircntre suporturile sterilizate și cele nesterilizate
Figura 54 Morfologia suporturilor S7 S8 S9 A Icircnainte de expunere la UV B După expunere
la UV
Pentru un studiu mai detaliat al morfologiei suporturilor fragmente din acestea au fost
scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi o
rotaţie de 05ordm Proiecţiile astfel obţinute au fost procesate şi reconstruite utilizacircnd programul
NRecon (Bruker Belgium) Trei regiuni de interes au fost selectate pentru fiecare proba iar
programul CTAn a fost utilizat pentru calcularea dimensiunii porilor precum şi dimaterului de
percolaţie Pentru calcularea porozităţii s-a utilizat metoda ldquosphere-fittingrdquo regasită icircn aplicaţia
BatMan a programului CTAn Pentru calcularea diametrului de percolaţie s-a utilizat metoda
126
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
descrisă de Ashworth şi colab [179] Pe scurt metoda ldquoshrink wraprdquo a fost aplicată pentru a
identifica volumul accesibil unui obiect virtual care poate penetra icircntreaga regiune de interes
utilizacircnd urmatoare ecuaţie
(16)
unde este o constantă de percolaţie egală cu 088 pentru sistemele 3D [180]
Vizualizarea distribuţiei porilor a fost efectuată utilizacircnd programul CTVox (Bruker
Belgium) Astfel o funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste
reconstrucţia 3D a probei de investigat iar un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare
Suportul care are cea mai mare dimensiune a porilor a fost suportul S7 iar suportul cu cea
mai mică dimensiune a porilor a fost suportul S8 Aceste două suporturi sunt practic suporturile
cu cel mai mic raport CaP ndash S7 (CaP = 1579) şi cel mai mare raport CaP ndash S8 (CaP = 1721)
ceea ce a indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra porozităţii
suporturilor Icircn ceea ce priveşte comparaţia porozităţii suporturilor din punct de vedere al
compoziţiei de biopolimeri s-a observat o dimensiune mai mare a porilor suportului S6
(conţinacircnd un raport mai mare de colagen)
Figura 55 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suporturile S6 S7 S8 S9
127
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn tabelul 57 sunt prezentate date despre dimensiunea şi distribuţia porilor (prezentate şi
icircn figura 55) volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
Tabel 57 Dimensiunea porilor suporturilor S5 S6 S7 S8
Denumirea
suportului
Dimensiunea
porilor (microm)
Volumul
regiunii de interes (mm3)
Aria regiunii de
interes (mm2)
S6 2121plusmn9091 222051 1027245
S7 27341plusmn10952 200577 955451
S8 13309plusmn6785 255724 1139832
S9 1388plusmn5284 316728 1343793
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost analizate icircn aceleaşi condiţii experimentale ca şi suporturile prezentate
icircn capitolul 4 Icircntr-o primă etapă suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ
egale s-au determinat dimensiunile şi au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii
specificaţi icircn capitolul 2 Pentru fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a
calculat modulul Young iar la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind redate icircn figura 56 și icircn
tabelul 53
Figura 56 Modulul Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu
cu incluziune suspensie coloidală de particule magnetice
0
50
100
150
200
250
300
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13
20925
27947
12001
16201
8668
12261
9038 8372 7628 7873 8089 7942 8034 E (
MP
a)
128
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young au fost cuprinse icircntre 7628 MPa şi 27947
MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător valorilor
Modulului Young al ţesutului osos spongios interval icircn care s-au icircncadrat şi valorile obţinute
pentru suporturile caracterizate icircn capitolul 4 Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru
suportul S2 avacircnd următoarea compoziţe 35 Cs 65 Col şi raportul CaP = 16 iar cea mai
mică valoare s-a obţinut pentru suportul S9 avacircnd următoarea compoziţe 50 Cs 50 Col şi
raportul CaP = 165 Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie S9 ndash S13 valorile obţinute
pentru E au fost apropiate ceea ce indică că metodă poate fi considerată reproductibilă din punct
de vedere al proprietăților mecanice Analizacircnd valoarea lui E din punct de vedere al influenţei
raportului CaP deci comparacircnd suporturile S7 (CaP = 1579 50 Cs 50 Col) cu S8 (CaP
= 1721 50 Cs 50 Col) s-au observat valori apropiate ale lui E de unde se poate
concluziona că raportul CaP nu influențează proprietățile mecanice ale suporturilor
525 Proprietăţi magnetice ale suporturilor
Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 58 S-a măsurat
susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime adimensională)
utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Tabel 58 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire suport
Susceptibilitate magnetică (volum)
Magnetizarea (emug)
S1 0295middot e-4
2431
S2 0382middot e-4
3148
S3 0414middot e-4
3412
S4 0304middot e-4
2505
S5 0272middot e-4
2241
S6 0439middot e-4
3618
S7 0476middot e-4
3923
S8 0399middot e-4
3288
S9 0539middot e-4
4442
S10 0749middot e-4
6173
S11 061middot e-4
5027
S12 0703middot e-4
5794
S13 0817middot e-4
6733
129
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13)
din capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 2241 şi 6733 emug indică faptul că suporturile
obținute sunt superparamagnetice
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Valorile gradului de retenție obținute pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 53 și
figura 57 Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a
suporturilor dovedită de datele SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei
biopolimeri utilizați la fabricarea suporturilor
Figura 57 Grad de retenţie PBS
Se poate afirma că o parte din PBS interacționează cu matricea polimerică iar o altă parte
este reținută fizic icircn porii suporturilor Inițial icircn PBS moleculele de H2O intră icircn suporturi prin
1579
165
1721
900
1200
1500
1800
2100
2400
287
9
37
27
45
75
542
3
627
1
712
1
CaP
GR
(
)
Colagen ()
2100-2400
1800-2100
1500-1800
1200-1500
900-1200
130
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
pori pentru a umple spațiile interne Pe de altă parte numărul de grupuri polar este de asemenea
un factor important care afectează hidrofilia materialului [181] Adăugarea de fosfați de calciu
icircn compoziția suporturilor duce la o scădere a gradului de retenție
527 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd un amesctec
de două enzime lizozim și colagenază Metoda de lucru utilizată a fost aceeaşi ca cea utilizată pentru
degradarea suporturilor obţinute şi caracterizate icircn capitolul 4 10 mg din fiecare probă s-a imersat icircn
5 ml soluţie de PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de
dializă introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS după care au fost incubate la 37degC La anumite
intervale de timp s-a extras şi analizat un volum din cei 10 ml PBS din punct de vedere al
concentraţiei de chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la 2 ore 48 ore 7 zile şi 14 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate icircn figura 58
Figura 58 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Comparacircnd valorile obținute nu s-a observat o dependență clară a vitezei de degradare a
concentrația de chitosan chiar dacă toate materialele sunt degradate treptat Comportamentul se
0
02
04
06
08
1
S5 S6 S7 S8 S9
(Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat)
middot100
m
moli
L
2 ore 48 ore 7 zile 14 zile
131
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
datorează interacțiunilor ionice ale chitosanului cu colagenul și fosfații de calciu care modifică
conformația situsului de legare pentru lizozim [182]
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat
Concentraţia de colagen degradat a fost analizată la 4 ore 48 ore 72 ore şi 7 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate sub formă de grafic
Figura 59 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Hidrolizarea colagenului din suporturi de către colagenază enzima implicată icircn procesul de
degradare al acestei proteine in vivo are două etape Icircntr-o primă etapă enzima se atașează la
suport și apoi rupe locurile specifice care corespund structurilor de aminoacizi pentru care
enzima are specificitate Condițiile de mediu (pH tărie ionică inhibitori de enzime) și
caracteristicile materialelor (compoziție structură supramoleculară și porozitate) sunt parametri
care dictează viteza de degradare și biointegrarea controlată a suportului Toate suporturile au
fost degradate icircn timp cu vitezediferite
0
005
01
015
02
025
S5 S6 S7 S8 S9
Con
centr
aţi
a d
e co
lagen
deg
rad
at
mm
oli
L
4 ore 48 ore 72 ore 7 zile
132
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
5281 Testul MTT
Citotoxicitatea in vitro a suporturile obținute a fost analizată utilizacircnd un test MTT test ce
a oferit informații despre viabilitatea a trei linii diferite de celule fibroblate celule STEM și
osteoblaste la contactul direct cu fragmente de suporturi
Rezultatele prezentate icircn figura 510 indică lipsa citotoxicităţii suporturilor asupra
fibroblastelor valorile viabilităţii celulare fiind mai mari de 80 pentru toate cele trei suporturi
S7 S8 S9 şi pentru toţi cei trei timpi de contact
Icircn urma contactului direct al suporturilor S1 S3 S13 pentru 24 ore 48 ore respectiv 72
ore cu celule stem rezultate redate icircn figura 511A s-au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce
cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de 97 (S1) 98 (S13) și 99 (S3) ceea ce indică a
foarte bună biocompatibilitate a probelor
Figura 510Viabilitatea fibroblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile S7 S8 S9
Suporturile S1 S3 şi S13 au fost puse icircn contact direct şi cu osteoblaste rezultate fiind
redate icircn figura 511B dar rezulatele obţinute icircn acest caz nu sunt la fel de bune ca icircn cazul
contactului direct cu celulele stem osteoblastele fiind celule cu o sensibilitate ridicată Teste
suplimentare sunt necesare icircn acest caz
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
()
Control S7 S8 S9
133
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Figura 511 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile S1 S3 S13
A Utilizacircnd celule stem B Utilizacircnd osteoblaste
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată lipsa de citotoxicitate suporturile la contactul direct cu
celulele stem s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-AM rezultatele obţinute
fiind prezentate icircn figura 512
Figura 512 Viabilitatea celulelor STEM icircn contact cu suporturile S1 şi S3
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
cel
ula
ră
Control S1 S3 S13 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
Control S1 S3 S13 B
134
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu
suporturile S1 şi S3 atacirct la 24 ore cacirct şi la 96 ore ce ce confirmă icircncă o dată faptul că suporturile
nu eliberează compuși citotoxici și totodată structura lor nu influențează negativ activitatea
celulelor stem
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor
La fel ca icircn capitolul 4 citotoxicitatea in vivo a suporturilor din acest lot a fost studiată pe
șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28 plusmn 30 grame
icircntr-o stare de icircntreţinere foarte bună găzduițiți icircn condițiile adecvate
Pentru implant materialele au fost secționate sub forma unor discuri cu diametrul de 15
mm (A=17671 mm2) apoi au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 10
minute Animalele au fost grupate icircn 3 loturi lotul 7 (corespunzător suportului S7) lotul 8
(corespunzător suportului S8) și lotul 9 (corespunzător suportului S9) fiecare lot cuprinzacircnd un
număr de 12 animale
Animalele au fost supuse la o intervenție chirurgicală de implantare subcutanată descrisă
icircn capitol 2 subcapitolul 248 Durata studiului a fost de 64 de zile La finalul primelor 48 ore de
experiment au fost sacrificați cacircte 3 șoareci din fiecare lot (7 8 9) apoi cacircte alți 3 din fiecare lot
la intervale de 12 34 respectiv 64 de zile
Inițial animalele au fost supuse zilnic unei observații clinice amănunțite pentru a depista
eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca urmare a respingerii implantului după care au
fost eutanasiate prin administrarea unei supradoze de izofluran Zona de implant a fost deschisă
chirurgical fără a leziona excesiv țesutul Țesuturile adiacente au fost examinate macroscopic
fiind apreciate modificările din zona de implant (porțiunea centrală a implantului) și din jurul
acesteia respectiv prezența hemoragiei necrozei infecției și modificarea culorii țesutului
Histologic fiecărui șoarece i s-au recoltat probe de țesut din zona de implant și adiacentă
acesteia pentru a evalua populația de celule din jurul implantului Aceste probe au fost fixate icircn
formol 10 apoi incluse la parafină colorate Tricromic Masson și examinate microscopic
Pentru suporturile din acest lot deoarece durata experimentului a fost mai mare s-a evaluat
gradul de icircncapsulare a materialelor (granulom de corp străin) măsuracircnd grosimea capsulei de la
periferia spațiului ocupat de implant pacircna la marginea exterioară a acesteia Scorul icircncapsulării a
fost realizat conform recomandărilor ISO Standard 10993 prezentate icircn tabelul 59
135
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 59 Scorul icircncapsulării
Capsulă Scor
Absentă 0
gt 05 mm 1
06 ndash 10 mm 2
11 ndash 20 mm 3
gt 20 mm 4
Cerințele testului sunt icircndeplinite dacă diferențele dintre scorul mediu al animalelor din lot
este lt 10 mm
Icircn urma observațiilor clinice nu se observă modificări ale țesuturilor adiacente implantului
integritatea pielii nu este modificată nu sunt prezente semne de turgescență icircnroșire erupție sau
piloerecție La racircndul lor datele histologice susțin ipoteza biocompatibilității compozitului pe
baza de polimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Figura 513 Suportul S7 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
Icircn cazul bioimplanturilor diferite tipuri de celule interacționează și conduc la răspunsuri
specifice iar icircnțelegerea acestor mecanisme ne conduc către realizare unor suprafețe de implant
136
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
cu o mult mai mare compatibilitate cu structurile biologice Fiecare implant ne-natural induce un
răspuns inflamator acutdin partea organismului dar nu răspunsul icircn sine este important ci
icircntinderea și intensitatea sa Prin urmare orice test de biocompatibilitate a unui anumit material
trebuie să se bazeze pe evaluarea populației de celule din jurul implantului
Markeri importanți pentru biocompatibilitate sunt tipurile de celule care apar după
implantarea materialului străin Icircn literatura de specialitate nu este clar dacă prezența celulelor
gigant de corp străin marchează o incompatibilitate a biomaterialului sau dacă acestea denotă un
comportament de degradare normală a materialelor biomaterialelor resorbabile [183] Orice
biomaterial implantat este recunoscut de către organism ca un rdquonon selfrdquo Icircn mod obișnuit toate
biomaterialele implantate icircn țesutul conjunctiv induc un răspuns din partea gazdei proces
inflamator acut a cărei formă de manifestare și intensitate diferă
Figura 514 Suportul S8 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
După Hench și Best dacă biomaterialul este (I) toxic țesuturile din jur mor (II) netoxic și
biologic inactiv (aproape inert) apare un țesut fibros de formă și grosime variabilă (III) netoxic
și biologic activ (bioactiv) se produce o legătură interfacială stracircnsă material-structură biologică
(IV) netoxic și se dizolvă țesuturile din jur icircl icircnlocuiesc [184] Amplitudinea și durata
137
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
procesului inflamator are o influență determinantă asupra stabilității și compatibilității
biomaterialului implantat [185]
Figura 515 Suportul S9 la 48 ore 12 zile și 64 zile post-implantare
Reacția organismului este evidentă icircn primele 48 de ore de la implantare manifestată
printr-un proces inflamator accentuat la materialele 7 și 8 și mai redus ca intensitate icircn cazul
suportului S9 Se constată un aflux celular semnificativ reprezentat de macrofage neutrofile
leucocite rare limfocite fibroblaste și fibre de colagen Infiltratul inflamator a fost mai redus
caracterizat prin prezența de rare leucocite neutrofile și macrofage la S9
La 10 zile de la prima evaluare (12 zile de la debutul experimentului) la suporturile S7 și
S8 reacția fibroasă periferică este mai intens exprimată prin fiboblaste și fibre de colagen cu
orientare concentrică Infiltratul inflamator este reprezentat de macrofage limfocite histiocite și
fibroblaste La suportul S9 se icircnregistrează o proliferare fibroasă cu tendință de icircnglobare a
materialului Reacție giganto-celulară cu celule gigante de corp străin icircn ale căror citoplasme se
pot observa particule fagocitate din biomaterial Primele celule care se atașează materialului de
implant sunt fibroblastele Ele produc un colagen imatur observabil pe suprafața implantului
[186]
Prezența fibrelor de colagen și a fibroblastelor este considerată o reacție tisulară normală
Icircn acest strat (fibrinos) prezența de macrofage și neutrofile joacă un rol important icircn
138
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
transformarea implantului icircntr-un material biologic recunoscut și acceptat de către organism
[187]
Prezența macrofagelor inclusiv dezvoltarea țesutului de granulație este un răspuns firesc din
partea organismului ca parte a comportamentului normal de degradare a materialelor cel puțin
icircn cazul biomaterialelor degradabile [188]
De asemenea macrofagele modulează reacția tisulară prin producerea de interleukine
factori de creștere și alți agenți bioactivi precursori ai celulelor gigant de corp străin [189]
Interacțiunea macrofage-limfocite este una complementară Probabil adeziunea macrofagelor la
o suprafață este semnalul pentru activarea limfocitelor iar prezența limfocitelor influențează la
racircndul lor activitatea macrofagelor [190] și fuziunea [191]
Următoarea etapă a răspunsului gazdei este marcată de atracția monocitelor și acțiunea
mastocitelor cu eliberarea de histamină [192] Această reacție este unică și nu pare să depindă de
tipul de implant Amploarea reacției și grosimea stratului inflamator (index pentru
biocompatibilitate) depinde de natura chimică și topografia implantului Anderson consideră că
prezența celulelor mononucleare inclusiv limfocite și celule plasmatice este considerată
inflamație cronică icircn timp ce reacția la corp străin cu dezvoltarea țesutului de granulație este
considerată un proces de videcare normal a unei răni ca răspuns la implantul de biomateriale La
34 de zile de la implant icircn cazul tuturor celor trei suporturi se observă o tendință de icircnglobare
tisulară a acestora prin invazie conjunctivă (scorul mediu al icircncapsulării a fost de 1 sub 05 mm)
și un infiltrat inflamator redus Este un proces normal de invazie a fibroblastelor și de sinteză a
matricei extracelulare prin acești fibroblaști activi Se termină icircntr-un strat interior de macrofage
șisau celule de corp străin cu o zonă secundară icircn afara fibroblaștilor și țesutului conjunctiv care
icircnconjoară materialul de implant [193]
După 64 de zile de la implantare se icircnregistrează o tendință evidentă de asimilare și
resorbție a celor trei tipuri de biomateriale și delimitarea acestora icircn insule mici izolate de țesut
fibros Răspunsul organismului icircn cazul celor trei tipuri de materiale a fost unul normal
caracterizat printr-o reacție inflamatorie acută a cărei intensitate s-a redus după primele 48 de
ore Grosimea capsulei fibroase este sub 05 mm (scor 1) aspect care influențează icircn mod pozitiv
degradarea și resorbția materialului icircn timp acestea făcacircdu-se ușor și fără o reacție celulară
semnificativă
139
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
53 Concluzii
Utilizacircnd același procedeu biomimetic de co-precipitare și același program
experimental folosite și icircn capitolul 4 s-au preparat 13 suporturi notate S1 ndash S13 Diferența icircntre
cele două loturi de suporturi preparate pentru potențiale aplicații icircn regenerarea osoasă a fost dată
de forma de prezentare a MNPs incluse icircn compoziție Icircn capitolul 4 MNPs au fost incluse icircn
sinteză sub formă uscată pe cacircnd icircn capitolul de față au fost introduse sub formă de suspensie
coloidală icircn apă urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura
suporturilor Pentru ambele loturi s-a folosit o concentrație de 5 MNPs față de cantitatea de
substanță uscată de biopolimeri și fosfați de calciu introduse icircn sinteză
Datele FTIR au evidențiat prezența de picuri caracteristice pentru toate
componentele suporturilor La fel ca icircn capitolul precedent o parte din suporturi au fost
sterilizate prin expunere la radiații UV timp de 4 ore Comparacircnd datele FTIR pentru suporturile
expuse la UV și cele ne-expuse nu s-au observat diferențe benzile reprezentative ale grupărilor
funcționale specifice componentelor suporturilor avacircnd valori foarte apropiate sau chiar egale
Datele XRD și EDS au analizat tipurile de fosfați de calciu formate pe matricea
polimerică cele mai reprezentative forme identificate fiind fosfat dicalcic ndash CaHPO4
hidroxiapatită ndash Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2 și fosfatul tetracalcic ndash Ca4(PO4)2O
Datele SEM au evidențiat o structură poroasă CP și MNPs fiind distribuite
uniform icircn matricea polimerică Ca și icircn cazul datelor FTIR s-a studiat icircn paralel și morfologia
suporturilor expuse la radiații UV demonstracircndu-se că acest tip de sterilizare nu influențează
morfologia acestora Un studiu mai detaliat al morfologiei a fost studiat cu ajutorul analizei
microCT Rezultatele au indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra
porozităţii suporturilor
Valorile obţinute pentru modulul lui Young se situează icircn intervalul 7628 MPa ndash
279 47 MPa Rezultatele sunt icircncurajatoare deoarece modului lui Young pentru osul spongios
se icircncadrează icircntre 20 MPa și 500 MPa
140
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn ceea ce privește proprietățile magnetice ale suporturilor s-a calculat
magnetizarea valorile obținute fiind cuprinse icircntre 2241 și 6733 emug Aceste valori indică
faptul cu suporturile sunt superparamagnetice
Gradul de retenție al suporturilor are valori foarte mari cuprinse icircntre 945 și
2248 valori corelate cu structura poroasă și proprietățile hidrofile ale biopolimerilor din
compoziție Degradarea enzimatică a suporturilor s-a realizat cu o viteză constantă icircn timp atacirct
pentru Cs cacirct și pentru Col
Citotoxicitatea in vitro a suporturilor a fost testată pe trei linii celulare diferite
fibroblaste osteoblaste și celule STEM Un test MTT standard a fost realizat la 24 ore 48 ore și
72 ore la fiecare timp calculacircndu-se viabilitatea celulară Suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor cele mai bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Pentru osteoblaste s-au
obținut valori mai reduse ale viabilității celulare comparativ cu celelate două linii celulare
explicate de sensibilitatea ridicată a acestui tip de celule
Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost studiată pe șoareci femele din linia
CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de la implantarea subcutanată a
fragmentelor sterilizate de suporturi O reacție inflamatorie acută a avut loc icircn primele ore de la
implantarea a cărei intensitate s-a redus dupăprimele 48 ore Analizacircnd icircn amănunt datele
histlogice obținute la diverse intervale de timp la sfacircrșitul testului s-a ajuns la concluzia că
suporturile nu au efect citotoxic in vivo totodată s-a observat asimilarea și resorbția suporturilor
141
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
Reproductibilitatea este una din ipotezele de bază icircn experimentele științifice Dacă un
experiment nu este reproductibil rezultatele lui nu poate fi dovedite deci prin urmare nu pot fi
acceptate
Acest aspect a creat dificultăți majore icircn majoritatea domeniilor științifice De exemplu icircn
domeniul biologic probele de microbiologie depind direct de tulpinile acestora ceea ce conduce
la o lipsă de consecvență a rezultatelor deoarece fiecare grup de cercetare poate folosi propriile
tulpini Dificultăți icircn reproductibilitatea experimentelor științifice sunt observate și icircn domeniul
ingineriei tisulare Icircn acest sens icircn timpul oricărui experiment științific trebuie avute icircn vedere
două aspecte importante repetabilitatea și reproductibilitatea metodei acestea fiind componente
ale preciziei icircntr-un sistem de măsurare Cei doi termini se referă la măsurarea unui set de
condiții care includ aceeași procedură aceeași operatori același sistem de măsurare și aceleași
condiții de funcționare Repetabilitatea are loc icircn aceași locație pe cacircnd reproductibilitatea are
loc icircn locații diferite [196 197]
Reproductibilitatea slabă pune la icircndoială rezultatele științelor biomedicale Problema
principală este dată de complexitatea procesul de cercetare științifice
Icircn capitolele 4 și 5 au fost prezentate prepararea și caracterizarea a două loturi de suporturi
ambele fiind realizate printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare Icircn acest scop soluţii de
precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost amestecate cu soluţii de
biopolimeri Cs (1) C (1) Hya (1) şi MNPs pH-ul amestecului a fost ajustat la 72-74
utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac ndash NH4OH iar după spălare amestecurile au fost liofilizate
pentru 24 h
Diferenţa dintre cele două loturi de material este data de modalitatea de incluziune a
particulelor magnetice icircn etapa de sinteză a suporturilor obţinacircndu-se icircn cele din urmă
142
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Lot numărul 1 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată
Lot numărul 2 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
Pentru ambele loturi a fost utilizat un program experimental cu două variabile (concentrația
de chitosancolagen și raportul CaP) cu scopul de a se determina compoziția optimă a
suporturilor Respectacircnd valorile teoretice din programul experimental s-au obţinut 13 probe
Concentraţia de Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză
iar pentru raportul CaP au fost alese valori apropiate de cele identificate icircn țesutul osos uman
611 Obținerea suporturilor
Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi lotul numărul 2 s-a
dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul numărul
9 ndash S9 s-a dovedit a fi cel mai aproape de un suport ideal
Astfel pentru a demonstra reproductibilitatea metodei obiectivele următoare au fost
obţinerea şi caracterizarea a 7 suporturi avacircnd compoziţia teoretică a suportului 9
Suporturile obţinute au fost notate S91 ndash S97 și au fost caracterizate din punct de vedere
al structurii chimice utilizacircnd spectroscopia IR cu transformată Fourier ndash FTIR iar din punct de
vedere al morfologiei prin microscopie electronică de baleiaj ndash SEM și micro computer-
tomografie (microCT)
De asemenea s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
143
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
612 Rezultate şi discuţii
6121 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată utilizacircnd spectroscopia icircn infraroşu cu transformată
Fourier ce determină interacțiunile dintre cei trei biopolimeri fosfați de calciu și particulele
magnetice Rezultatele redate icircn figura 61 indică prezenţa picurilor caracteristice tuturor
componentelor cei trei biopolimeri fosfații de calciu și nanoparticule magnetice iar icircn tabelul
61 sunt prezentate benzile lor representative [136]
Figura 61 Structura chimică a suporturilor
După cum se poate observa atacirct icircn figura 61 cacirct și icircn tabelul 61 suporturile analizate au
structură chimică asemănătoare componentele din structura lor avacircnd benzile reprezentative
apropiate sau chiar egale
144
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Tabel 61 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S92 şi S97
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
S92 S97
3422 OH 3420 OH
2927 C-H 2926 C-H
1655 Amida I C=O 1656 Amida I C=O
1554 Amida II N-H 1554 Amida II N-H
1074 C-O-C 1069 C-O-C
604 Fe-O 602 Fe-O
562 PO3_4
561 PO3-4
6122 Morofologia suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată pentru o imagine de ansamblu cu ajutorul
microscopiei electronice de baleiaj (figura 62) Nu se observă diferenţe de morfologie icircntre
suporturile analizate fiind observată icircn ambele cazuri și la ordine de mărire diferite o structură
tridimensională cu pori intercomunicabili structură ce include atacirct cristale de fosfaţi de calciu cacirct
şi nanoparticule magnetice distribuite icircn matricea polimerică
Pentru o imagine mai detaliată asupra morfologiei suporturilor fragmente din acestea au
fost scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi
o rotaţie de 05deg Tehnica utilizată a fost descrisă pe larg icircn capitolul 5 sub-capitolul 523
Programul CTVox (Bruker Belgium) a fost utilizat icircn vederea vizualizării distribuţiei
porozităţii O funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste reconstrucţia 3D
a probei de investigat iar apoi un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare după cum se
poate observa icircn figura 63 Icircn tabelul 62 sunt prezentate dimensiunea distribuţia porilor
volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
145
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 62 Morfologia suporturilor
Figura 63 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suportul S94
Tabel 62 Dimensiunea porilor suportului S94
Dimensiunea porilor Volumul regiunii de interes Aria regiunii de interes
121plusmn5613 microm
144912 mm
3 769888 mm
2
146
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn figurile 64 Valorile obţinute pentru rezistența
la compresiune se situează icircn jurul valorii de 58 MPa iar valorile modulului Young sunt
cuprinse icircntre 215 MPa şi 220 MPa valori
Figura 64 A Rezistenţa la compresiune a suporturilor B Modulul Young pentru suporturi
Aceste valori sunt icircn mare parte determinate de porozitatea ridicată a compozitelor obţinute
prin procedeul de liofilizare Se observă valori apropiate ale rezistenței la compresiune a
suporturilor precum și a modului Young calculat metoda este deci reproductibilă și din punct de
vedere al proprietăților mecanice ale suporturilor obținute
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Rezultatele obținute icircn urma studiului de determinare a retenției fluidelor de interes
biologic sunt redate icircn figura 65
Figura 65 Grad de retenţie maxim
0
200
400
600
800
1000
1200
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Gra
d d
e re
ten
ție
maxi
m
()
72 ore
147
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor
dovedită de datele de microscopie electronică de baleiaj (figura 62) Acestea sunt cuprinse icircntre
685 și 909 cu o medie a valorilor obținute de 781 Această diferență de 224 icircntre
valoarea maximă și valoarea minimă obținute poate fi explicată de faptul că dimensiunea porilor
nu este uniformă conform tabelului 62 această este de 121 plusmn 5613 pentru suportul S94
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea enzimatică este cea mai utilizată metodă de caracterizare a biodegradabilității
unui suport Suporturile S91 ndash S97 au fost supuse degradării enzimatice determinacircndu-se
concentraţia de chitosan respectiv de colagen degradat la intervalie stabilite
Concentraţia de chitosan degradat
Se observă o creştere graduală icircn timp a concentraţie de chitosan degradat (figura 66) ceea
ce indică o degradare controlată a suporturilor proprietate foarte importantă pentru aplicaţia
vizată deoarece o rată de degradare prea rapidă implică o refacere incompletă a ţesutului osos
iar o rată de degradare prea lentă poate duce la o fractură sau la o deformaţie a osului Se pot
observa valori apropiate ale concentraţie de chitosan degradat ceea ce indică reproductibilitatea
metodei de sinteză
Figura 66 Concentraţia de chitosan degradat
0
015
03
045
06
075
09
105
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
(Co
nce
ntr
aţi
e ch
ito
saln
deg
radat)
∙
10
0 m
mo
liL
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
148
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Concentraţia de colagen degradat
Analizacircnd figura 67 se observă valori constante icircn timp ale concentraţie de colagen
degradat Ca și icircn cazul chitosanului degradarea colagenului se realizeză gradual pe măsură ce
enzima icircn cazul de față colagenaza reușește să străbată matricea anorganică formată din fosfați
de calciu și să ajungă la matricea organică polimerică
Valorile obținute pentru cele 7 suporturi analizate sunt apropiate procesul de degragare
gradual fiind observată pentru toate cazurile
Figura 67 Concentraţia de colagen degradat
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
Fragmente de suporturi au fost puse icircn contact direct cu osteoblaste rezultatele fiind redate
icircn figura 68A Valorile obţinute pentru viabilitatea celulară sunt icircn jur de 80 pentru toate
intervalele de contact ceea ce indică faptul sunt lipsite de citotxicitate
Icircn urma contactului direct al suporturilor cu fibroblaste rezultate redate icircn figura 68B s-
au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de
aproximativ 100 pentru toate ambele suporturi ceea ce indică a foarte bună citompatibilitate a
probelor
0
05
1
15
2
25
3
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Co
nce
ntr
ţia
de
cola
gen
deg
rad
at
m
moli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
149
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 68 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile
A Utilizacircnd osteoblate B Utilizacircnd fibroblaste
Pentru a reconfirma citocompatibilitatea suporturile la contactul direct cu fibroblastele și
reproductibilitatea metodei de sinteză s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-
AM rezultatele obţinute fiind prezentate icircn figura 69
Figura 69 Viabilitatea fibroblastelor icircn contact direct cu suporturile
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu fragmente
de suporturi după 72 ore de contact direct
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 B
150
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
Corelate cu alte afecțiuni maligne tumorile primare sunt destul de rare și mai puțin
frecvente reprezentacircnd doar 02 din toate neoplasmele raportate icircn Marea Britanie și Statele
Unite [198] Icircn plus tumorile primare sunt depășite ca număr de metastaze date de carcinom
melanom sau afecțiunile maligne hematologice cum ar fi plasmacitomul De asemenea alte
condiții non-neoplazice cum ar fi unele procese inflamatorii chisturile osoase displazia fibroasă
sau boala Paget depășesc cazurile de tumori osoase primare [199] Cele mai frecvente tumori
osoase maligne sunt osteosarcomul (35) condrosarcomul (25) sarcomul Ewing (16)
chordomul (8) și histiocitomul fibros malign (5) [200]
Tratamentul tumorilor osoase maligne reprezintă o adevărată provocare clinică deoarece
rezecția chirurgicală a tumorii și radioterapia nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral
Chimioterapia care precede de regulă celelalte două tehnici are efecte adverse semnificative și
totodată icircn unele cazuri poate apărea o rezistență la aceste medicamente Există icircnsă și o serie de
tratamente alternative cum ar fi hipertermia terapia țintită imunoterapia fototerapia utilizarea
nanoparticulelor transplant de celule stem și altele unele din ele aflate icircncă icircn faza de studiu dar
care vor oferi cel mai probabil soluții foarte bune icircn viitor [201] Imunoterapia icircmbunătățește
capacitatea celulelor imune de a recunoaște și ținti celulele tumorale ceea ce duce la eliminarea
lor Avantajele imunoterapiei includ specificitate ridicată anti-tumorală și efecte secundare
minime prin folosirea propriului sistem imunitar al pacientului Hipertermia este un tratament
modern ce implică creșterea temperaturii la locul țintă pentru a induce astfel un stres termic
temperatura la care se ajunge fiind icircn medie 40degC (39ndash43degC icircn funcție de strategia terapeutică)
[202]
Icircn mod particular protocolul de tratament al osteosarcoamelor icircncepe cu rezecția
chirurgicală a tumorii osoase primare și a eventualelor metastaze Defectul osos obținut este
acoperit cu un material de substituție osoasă pentru a preveni fracturile sau deformațiile osoase
[203] Deoarce tumorile osoase sunt aproape imposibil de icircndepărtat icircn totalitate intervențiile
chirurgicale sunt urmate de radiochimioterapie [204]
Icircn cazul unor tumori osoase tratamentul implică două etape Icircntr-o primă etapă țesutul
tumoral este icircndepărtat chirurgical iar icircntr-o a doua etapă defectul osos obținut este acoperit cu
151
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
un material de substituție osoasă tot mai studiate fiind suporturile magentice biomimetice Icircn
prezența unui cacircmp magnetic aceste suporturi vor atrage alte particule magnetice introduse icircn
circulație Acestea din urmă vor fi funcționalizate cu medicamente chimioterapice precum și cu
factori de creștere care să susțină procesul de regenerare osoasă și formare de neo-țesut
Radioterapia se icircncadrează adesea icircn schemele de tratament a diferitelor tipuri de cancer
rezultatele obținute de-a lungul timpului icircn practica clinică fiind eficiente Utilizacircnd radiații
ionizate raze X radioterapia generează stres oxidativ excesiv și induce denaturarea ADN-ului
ce va conduce la moartea celulelor tumorale Radioterapia este o metodă neinvazivă de
tratament radiația fiind aplicată la locul țintă pe cacirct posibil Un dezavantaj al metodei este acelă
că unele celule sunt radiorezistente Icircn cazul icircn care este observat acest fenomen se impune
utilizarea unei doze excesive de radiații care icircnsă va distruge celulele adiacente sănătoase Din
acest motiv există scheme de tratament de radio-sensibilizare de exemplu se poate combina
chimioterapia de radio-sensibilizare cu radioterapia [205] Icircn ceea ce privește tumorile osoase
radioterapia are ca efect de scurtă durată o reducere a densității minerale osoase imediat după
expunerea la radiații dar ulterior induce re-calcifierea leziunii etapă a procesului complex de
remodelarea osoasă Se presupune că icircn cazul pacienților cu răspuns bun la acest tip de terapie
este nevoie de aproximativ 3 luni pentru ca osul să fie refăcut [206]
Medicamentele chimioterapeutice sau citostatice sunt fie substanțe naturale fie derivați
sintetici ai acestora extrase din plante specii marine sau unele microorganisme [207]
Dezavantajele acestei terapii sunt toxicitatea și biodistribuția nefavorabilă a compușilor Sisteme
pentru eliberarea țintită a acestor principii active sunt intens studiate [208]
Icircn acest context polimerii sunt materiale adecvate pentru a transporta medicamente
icircncapsulate sau legate chimic De-a lungul timpului polimerii și nanoparticulele polimerice au
jucat un rol cheie icircn dezvoltarea tehnologiei de eliberare a medicamentelor oferind eliberarea
controlată a agenților terapeutici icircn doze constante pe perioade lungi dozare ciclică și eficiență
mai bună a medicamentelor hidrofile sau hidrofobe [209 210]
Suporturile obținute icircn capitolele anterioare au potențial de a fi utilizate pentru umplerea
defectului osos rezultat după rejecția chirurgicală a tumorii și totodată pentru eliberarea țintită
de chimioterapice icircncorporate icircn nanoparticulele magnetice din structura lor Scopul strategiilor
experimentale descrise icircn cele ce urmează a fost testare potențialului suporturilor obținute de a fi
utilizate icircn radiochimioterapia tumorilor osoase maligne Inițial suporturile au fost expuse la
152
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
radiații X pentru a stabili influența asupra structurii și proprietăților acestora Icircn etapa următoare
s-a studiat icircncărcarea și eliberarea de chimioterapice (doxorubicină ndash DOX) din nanoparticulele
magnetice incluse icircn suporturi
621 Obținerea suporturilor
Șase suporturi au fost preparate după protocolul descris icircn capitolul 5 Pe scurt suporturile
au fost obținute prin co-precipitarea CaCl2 și a NaH2PO4 pe un suport de biopolimeri Cs Col
Hya și MNPs icircn prezența unei soluții apoase de amoniac NH4OH Icircn tabelul 63 sunt detaliate
codificările compoziția și caracteristicile distinctive ale suporturilor
Tabel 63 Codificarea și compoziția suporturile obținute și caracteristica lor distinctivă
Codificare
suport Compoziția biopolimerică CaP
Concentrația
de MNPs Caracteristica distinctivă
S5 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Control
S9 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Control
S5R 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S9R 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S5-DOX 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
S9-DOX 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor
Icircn vederea iradierii suporturilor cu raze X s-au urmat pași specificați icircn capitolul 2 sub-
capitolul 2491 și anume
a avut loc o simulare computer-tomograf (CT) icircn condiții similare radioterapiei
(poziționarea laserului plasarea markerilor radio-opaci externi scanarea volumului iradiat cu un
dispoziti de scanare CT special)
conturarea volumului țintă pe imagini complexe CT
stabilirea dozei de radiație
determinarea parametrilor fascicului de radiație (energia de lucru unghiul de incidență
dimensiuni și forme utilizarea accesoriilor optime)
analiza histogramei doză-volum pentru a verifica dacă cel puțin 95 din volumul țintă
a iradiat minim 95 de doza prescrisă
153
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn planul de iradiere denumit CILINDRU secțiunile obținute au fost conturate astfel
suprafața exterioară ca referință (S) materialul (V1) și volumul țintă (V2) V2 = V1 + 5mm
pentru a compensa posibilele eroari de poziție figura 610A
Doza de radiații utilizată a fost de 8 Gy fracțiune unică aceasta fiind doza unică
administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase [211 212 213]
Realizarea unui plan de tratament care să respecte atacirct distribuția omogenă icircn volumul țintă
a dozei prescrise cacirct și constracircngerile legate de doză cu privire la riscul de a afecta organele din
vecinătate impun alegerea cu atenție sporită a tehnicii de iradiere icircn unele cazuri fiind necesară
aplicarea unui bolus la suprafața volumului iradiat De exemplu iradierea peretelui toracic după
mastectomie radicală solicită utilizarea unui bolus icircn vederea obținerii parametrilor optimi ai
planului de tratament tipul și grosimea bolusului fiind incluse icircn algoritmul de calcul Bolusul
permite iradierea pielii cu 100 din doza prescrisă icircn timp ce icircn lipsa acestuia pielea (icircn care icircn
cancerul de sacircn apar aproape toate recidivele locale) este iradiată cu 70 din doza prescrisă iar
țesuturile nețintă (mușchi coaste) primesc 100 din doză Icircn mod similar bolusul este indicat
pentru iradierea tumorilor laringelui cu extensie la comisura anterioară sau a tumorilor vulvare
primare [214]
Planul de tratament a fost realizat utilizacircnd software-ul Eclipsetrade Planning Treatment
System Pentru o distribuție omogenă a dozei icircn volumul materialului a fost plasat un bolus de
10 mm grosime pe suprafața materialului rezultacircnd o includere suficientă icircn izodoza 95
(prezentată icircn verde icircn figura 610B) pentru V2 Termenul de izodoză se referă la suprafețele
care unesc toate punctele la nivelul cărora are loc absorbția unor doze egale de energie radiantă
[215]
Figura 610 A Conturarea volumului țintă pe imaginile CT ale eșantionului B Distribuția dozei
de radiații icircn volum de suport după aplicarea bolusului
154
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Parametrii stabiliți pentru planul de iradiere au fost două raze opuse izocentrice egale
una din poziția zero (AP) cu 6 MV și una posterioră poziționată la 180 de grade (PA) cu 15 MV
(figura 611)
Figura 611 Parametrii planului de iradiere
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină
Nanoparticulele magnetice au fost icircncărcate cu doxorubicină conform protocolului descris
anterior icircn subcaptiol 2492 Pe scurt icircntr-o suspensie coloidală de 1 MNPs icircn apă s-a
solubilizat 0125 doxorubicină nanoparticulele astfel obținute fiind notate cu MNPs-DOX
Suspensia finală a fost utilizată la prepararea suporturilor S5-DOX și S9-DOX conform datelor
experimentale din tabelul 63
Pentru caracterizarea suporturilor s-au analizat morfologia acestora eliberarea controlată
de medicamente antitumorale și citotoxicitatea in vitro la contactul direct cu celule tumorale
Structura chimică a suporturilor preparate a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR
iar morfologia lor cu ajutorul microscopiei electronice SEM
Pentru suporturile S5 S5R S9 S9R a fost analizată interacțiunea cu PBS (grad de retenție
maxim PBS) și s-au efectuat studii de degradare in vitro utilizacircnd un complex de enzime lizozim
(1200 μgml) și colagenază (100 μgml ) conform datelor experimentale din subcapitolul 246
155
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
De asemenea a fost studiată citotoxicitatea citotoxicitatea suporturilor sterilizate (expuse la o oră
la radiațiile UV) utilizacircnd celule osoase din linia MG-63 Un test MTT standard a fost efectuat la
24 48 și 72 de ore și a fost calculată viabilitatea celulară
Pentru suporturile S5-DOX și S9-DOX s-a analizat eliberarea de medicament in vitro
(subcapitol 2492) și interacțiunea cu celule MG-63 Suporturile au fost sterilizate tot prin
expunere la UV pentru o oră după care au fost puse icircn contact direct cu celulele Icircn paralel o
soluție stoc de doxorubincină a fost preparată icircn condiții sterile diferite concentrații fiind
analizate din punct de vedere al interacțiunii cu același tip de celulele Viabilitatea celulară a fost
calculată cu ajutorul unui test MTT standard
624 Rezultate și discuții
Suporturile preparate au fost testate icircn vederea unei potențiale utilizări icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne tehnică redată schematic icircn figura 612
Figura 612 Tratamentul tumorilor osoase maligne utilizacircnd tehnici de radioterapie și
chimioterapie
156
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor
Analiza FTIR a fost utilizată pentru studiul structurii chimice a suporturilor rezultatele
fiind redate icircn figura 613
Icircntre suporturile radiate și neradiate (figura 613A) nu se observă diferențe de structură
chimică benzile de absorbție caracteristice biopolimerilor nanopaticulelor magnetice și
fosfaților de calciu fiind observate icircn toate spectrele FTIR Icircn ceea ce privește biopolimerii se
pot observa următoarele picuri caracteristice 3439 cm-1
3434 cm-1
și 3489 cm-1
pentru gruparea
hidroxil 2925 cm-1
2924 cm-1
și 2927 cm-1
pentru -CH2 1652 cm-1
1654 cm-1
și 1649 cm-1
pentru amida I 1552 cm-1
și 1554 cm-1
pentru amida II [216] Pentru CaP au fost observate
picuri ale grupărilor fosfat la 601 cm-1
și 603 cm-1
iar pentru MNPs au fost observate picuri
caracteristice la 561 cm-1
și 563 cm-1
[99 160]
Figura 613 Spectrele FTIR ale suporturilor
Spectrele FTIR ale suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și al DOX sunt redate icircn figura
613B Spectrul DOX prezintă următoarele benzi caracteristice 2929 cm-1
pentru vibrația de
icircntindere a legăturii C-H 1730 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii C=O 1617 cm-1
și
157
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
1525 cm-1
pentru legătura NndashH 1411 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashC și 1286
cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashOndashC O parte din aceste benzi au fost observate și
pe spectrele corespunzătoare suporturilor S5-DOX și S9-DOX ceea ce sugerează interacțiunea
medicamentului cu celelalte componente ale suporturilor Alte picuri observate pe spectrele celor
două suporturi au fost 3446 cm-1
și 3440 cm-1
pentru gruparea ndashOH 2925 cmminus1
pentru ndashCH2
1654 cm-1
și 1656 cm-1
pentru amida I și altele cu valori apropiate de cele ale suporturilor fără
DOX (figure 613A)
Morfologia suporturilor realizate cu scopul de a fi utilizate icircn regenerarea osoasă este o
caracteristică foarte importantă de care trebuie să se țină cont icircn procesul de sinteză Aceste
suporturi trebuie să aibă porozitatea și dimensiunea porilor adecvate aplicației vizate Rețelele cu
pori interconectați influențează puternic procesul de nutriție a celulelor proliferarea și migrarea
acestora precum și vascularizare suportului [217] Rezultatele acestei analize au fost prezentate
icircn figura 614
Figura 614 Morfologia suporturilor
158
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
Influența radiaților asupra suporturilor a fost analizată și din punct de vedere al
interacțiunii cu fluidele de interes biologic și anume PBS pH = 72 001M S-a utilizat aceași
metodă volumetrică descrisă și icircn capitolele anterioare și s-a calculat gradul maxim de retenție
PBS utilizacircnd formula (14) redată icircn capitolul 2 Rezultatele obținute sunt prezentate icircn tabelul
64 și icircn figura 615
Tabel 64 Gradul de retenţie PBS al suporturilor
Nr crt Denumirea
suportului
Gradul
de retenţie PBS ()
1 S5 995 plusmn 30
2 S5R 1040 plusmn 35
3 S9 990 plusmn 50
4 S9R 987 plusmn 19
Figura 615 Gradul de retenție a suporturilor radiate și acelor neradiate
Diferența dintre valorile gradului de retenție pentru S5 și S5R este de aproximativ 45
iar icircntre S9 și S9R este nesemnificativă Icircn cazul suporturilor S5 și S5R diferență poate fi
explicată de dimensiunea neuniformă a porilor (figura 614) la fel ca și icircn cazul suporturilor
realizate pentru studiul reproductibilității ale cărui rezultate au fost prezentate mai sus Avacircnd
0
200
400
600
800
1000
1200
S5 S5R S9 S9R
Gra
dul m
axim
de
rete
nți
e P
BS
72 ore
159
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
această explicație pentru diferența dintre valorile obținute s-a putut afirma că radiațiile X nu
influențează interacțiunea suporturilor cu fluidele de inters biologic
Degradarea enzimatică a suporturilor a fost studiată utilizacircnd un amestec de două enzime
lizozim și colagenază metoda fiind descrisă icircn detaliu icircn capitolul 2
Potrivit lui Brouwer și colaboratorii [218] concentrația de lizozimă icircn serul uman este de
950-2450 μgL dar niveluri crescute pot fi observate icircn bolile benigne bolile inflamatorii
intestinale unele afecțiuni hematologice (policitemia vera mielomul multiplu) și procesele
maligne cum ar fi leucemiile [219] De exemplu Firkin [220] a raportat un nivel foarte ridicat al
lizozimului seric 30-120 μgml icircn leucemia mieloidă cronică și mielofibroza Icircn ceea ce privește
aceste date din literatură s-a ales o concentrație de 1200 μgml dat fiind că suporturile sunt
destinate tratamentului tumorilor osoase și probabil un nivel ridicat de lizozim va fi găsit icircn os
Deoarece colagenul este cea mai predominantă proteină din corpul uman nivelurile de
colagenază sunt greu de măsurat cu precizie această enzimă fiind găsită icircn toate țesuturile
organele icircn care există colagen Colagenaza interstițială are un rol-cheie icircn remodelarea normală
și patologică a matricelor extracelulare colagen inclusiv a țesutului osos și a țesutului conjunctiv
[221] De asemenea există diferite tipuri de colagenază de ex icircn pielea umană colagenază
secretată de fibroblastelor are două forme de proenzime (57 și 52 kDa) [222]
Rezultatele studiului au fost redate icircn figura 616A ndash reprezentacircnd concentrația de chitosan
degradat și 616B ndash reprezentacircnd concentrația de colagen degradat
Figura 616 A Concentraţia de chitosan degradat B Concentrația de colagen degradat
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
S5 S5R S9 S9R
(Conce
ntr
ația
de
Cs
deg
radat
) ∙
100
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
0
001
002
003
004
005
006
007
008
S5 S5R S9 S9R
Conce
ntr
ați
a de
cola
gen
deg
radat
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile A B
160
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Se observă icircn ambele cazuri o creștere graduală a concentrației de polimer degradat
chitosan respective colagen Valorile obținute sunt comparabile de unde s-a ajuns la concluzia
că radiațiile nu influențează nici interacțiunea suporturilor cu fluide biologice simulate icircn cazul
de față un complex de enzime icircn PBS pH=72 001M
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată prin contactul direct a suporturilor cu
osteoblastele liniei MG-63 figura 617
Valoarea viabilității calculată conform ecuației (15) din capitolul 2 scade icircn timp
fenomen observat și icircn celelalte studii de citoxicitate pe aceast tip de celule La 72 ore de la
contactul direct al celulelor cu fragmente de suport se observă o diferență de aproximativ 10
procente icircntre suporturile care nu au fost expuse radiațiilor și cele care au fost expuse Rezultatul
nu trebuie interpretat ca și negativ icircn condițiile icircn care rolul radiațiilor este de a distruge ceulele
tumorale osteoblastele Mg-63 fiind o linie de celule tumorale (osteosarcoame)
Radiațiile au fost absorbite de aceste suporturi cu o posibilă formare de radicali liberi fără
icircnsă a influența structura lor chimică morfologia și interacțiunea cu medii biologice simulate
Fenomenul este dificil de icircnțeles studii complexe fiind necesare icircn acest sens
Figura 617 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile
0
20
40
60
80
100
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itat
ea c
elula
ră
Control S5 S5R S9 S9R
161
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn concluzie rezultatele primei părți a studiului și anume studiul influenței radiațiilor X
asupra suporturilor au arătat rezultate icircncurajatoare structura chimică a suportului morfologia și
comportamentul de degradare enzimatică nu sunt influențate de razele X utilizate icircn radioterapie
ceea ce icircnseamnă că suporturile pot fi utilizate icircn continuare icircn chimioterapie
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale
Sistemele magnetice de eliberare controlată a medicamentelor au multiple avantaje față de
metodele normale cum ar fi abilitatea de a viza un anumit loc țintă icircn organism și reducerea
cantității de medicament necesară pentru a atinge o anumită concentrație la locul țintă ceea ce
implică o reducere a concentrației medicamentului icircn organele din vecinătate fiind minimizate
efectele secundare [223]
Doxorubicina - DOX este un potențial medicament pentru tratamentul metastazelor osoase
și a tumorilor osoase dar utilizarea sa este limitată de efectele secundare sistemice DOX este un
antibiotic antraciclinic care la nivel molecular interacționează cu ADN-ul și interferează cu
sinteza acidului nucleic rezultacircnd un efect remarcabil asupra transcripției AND [224 225]
Pentru aplicații icircn chimioterapia osoasă DOX este utilizat icircn sistemele de eliberare a
medicamentelor fabricate din diferite suporturi magneticecompozite apatită nanocristalină
[226] hidroxiapatită [227] chitosan și hidroxiapatită [228] acid poliglicic-co-glicolic -
polietilenglicol (PEG-PLGA) [87] microsfere magnetice
Icircn ceea ce privește eliberarea in vitro a DOX din suporturi o eliberare treptată poate fi
observată icircn figura 617
162
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 617 Curbele cinetice de eliberare a DOX din suporturi
Pentru suportul S5-DOX eliberarea a fost mai constantă icircn timp De remarcat este faptul că
aceast suport are o cantitate considerabilă de chitosan icircn compoziție comparativ cu S9-DOX
Trebuie reamintit fapul că toate MNPs utilizate icircn teza de față au fost acoperite cu chitosan
pentru o mai bună citocompatibiliate și pentru a putea lega principii active
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
Interacțiunea suporturilor preparate icircn sub-capitolul de față a fost studiată icircn paralel cu
interacțiunea suporturilor fără medicament icircncorporat pentru a putea realiza o analiză
comparativă S-a optat pentru contactul direct al fragmentelor de suport iar drept celule
tumorale s-au utilizat tot osteoblaste din linia MG-63 Rezultatele studiului sunt redate icircn figura
618
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 50 100 150 200 250 300 350
Conce
ntr
ați
a d
e D
OX
(μgm
L)
Timp ore
S5-DOX S9-DOX
163
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 618 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct A Cu soluții
de DOX de concentrații diferite B Cu suporturile avacircnd DOX icircn compoziție și a celor fără DOX
Viabilitatea celulară a suporturilor a fost aproape de 100 la primii 2 timpi de contact 24
și 48 ore atacirct pentru suporturile cu medicament cacirct și pentru cele fără medicament Icircnsă la 72 ore
de contact a suporturilor cu osteoblastele s-a observat o scădere semnificativă a viabilității
acestora valorile obținute fiind 64 pentru S5-DOX respectiv 75 pentru S9-DOX pentru
suporturile fără DOX valorile au scăzut nesemnificativ Această scădere bruscă de viabilitate ar
putea fi explicată de faptul cu DOX este eliberată treptat din suporturi la un raport relativ scăzut
proprietate de eliberare lentă a DOX poate fi utilizată și pentru că alte medicamente anti-
tumorale puternice sau combinații de medicamente ar putea fi transportate la desemnate zona și
eliberat la un raport optim pentru combaterea tumorilor [229]
164
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
63 Concluzii
Reproductibilitatea un experiment este foarte importantă icircn vederea transpunerii
rezultatelor obținute icircn practică Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi
preparate și caracterizate icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai
adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate
Pentru a demonstra reproductibilitatea metodei 7 suporturi avacircnd compoziţia
teoretică a lui S9 au fost preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a
compoziției din punct de vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn
fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate
celulară cu Calceină-AM
Toate analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă
este reproductibilă
Icircn a doua parte a studiului s-a testat potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircn primul racircnd s-a demonstrat că o doză de radiații X
similară cu cea utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile
suporturilor cum ar fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea
in vitro
Suporturile conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic
pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și
lentă a DOX sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn
terapia combinată a tumorilor osoase maligne
165
Concluzii generale
Concluzii generale
Osul este un țesut care are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn cazul unor
afecţiuni minore fiind supus de-a lungul vieții la procese biologice complexe de creştere
modelare şi remodelare Procesul de regenerare nu este suficient icircn cazul defecte osoase grave ce
au drept factori determinați principali rezecţiile de tumoră osoasă malformaţiile congenitale
unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita Toate acestea fac ca anual la
nivel mondial să fie utilizate peste 2 milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă
Materiale de substituţie osoasă pot fi clasificate icircn mai multe categorii grefe de origine naturală
(autogrefe alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria
tisulară precum şi diverse combinaţii ale acestora
Biomaterialele prelucrate sub divere forme (suporturi macroporase sisteme injectabile
capsule filme matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri și altele) sunt
elemente cheie icircn ingineria tisulară Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de
calciu s-au dovedit a fi o soluție promițătoare icircn ingineria tisulară și medicina regenrativă a
țesutului osos unele variante comerciale fiind folosite cu succes icircn practica clinică La
prepararea acestora trebuie să se țină cont și de nano-structura osului nu doar de compoziția sa
suporturile obținute prin procedee biomimetice fiind cele mai de succes
Nanoparticulele magnetice sunt folosite la o varietate de aplicații medicale clinice și
preclinice Eliberarea controlată de medicamente este un domeniu intens studiat icircn zilele noastre
iar utilizarea nanoparticulele magnetice icircn acest scop reprezintă un subiect de mare interes pentru
un număr considerabil de cercetători
Obiectivul central al lucrării de față a fost obținerea și caracterizarea de suporturi
compozite printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare a precursorilor de fosfați de calciu pe
un amestec de biopolimeri și nanoparticule magnetice pentru a fi testate icircn regenerarea osoasă
Biopolimeri utilizați au fost colagen chitosan acid hialuronic albumină serică bovină și
gelatină iar fosfații de calciu au fost obținuți din precursori pornindu-se de la un raport teoretic
CaP comparabil cu cel identificat icircn osul uman Nanoparticulele magnetice au fost incluse
pentru studii ce au vizat icircncorporarea și eliberarea controlată de principii biologice
166
Concluzii generale
Suporturile au fost caracterizate riguros din punct de vedere fizico-chimic și biologic S-a
icircnceput cu studiul structurii chimice a compoziției și morfologiei suporturilor după care s-a
studiat interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și cu soluții enzimatice
Proprietățile mecanice ale suporturilor au fost analizate din perspectiva modului de elasticitate
Young iar proprietățile magnetice din perspectiva susceptibilității magnetice a acestora Din
punct de vedere biologic suporturile au interacționat direct sau indirect cu diverse linii celulare
și s-au implantat sub-cutanat la șoareci icircn vederea determinării citotoxicității acestora Conceptul
de terapie combinată ce implică utilizarea radioterapii și chimioterapii a fost analizat icircntr-o
ultimă etapă pentru suporturile obținute
Pentru stabilirea compoziției optime s-au realizat icircn paralel suporturi pe bază de
biopolimer amestecuri diferite de biopolimeri (chitosan chitosan ndash acid hialuronic chitosan ndash
albumină serică bovină și chitosan ndash gelatină) și fosfați de calciu obținuți din precursori raportul
teoretic CaP fiind de 165 Trei concentrații diferite de nanoparticule (1 3 5 ) au fost
icircncorporate pe racircnd icircn sinteza celor patru tipuri de suporturi Structura chimică și compoziția
suporturilor au indicat prezența picurilor caracteristice componetelor incluse icircn sinteză Datele cu
privire la compoziția suporturilor au indicat prezența unor tipuri de fosfați de calciu identificați și
icircn literatură preponderenți fiind hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul monocalcic anhidru
Ca(H2PO4)2 fosfatul tricalcic (Ca3(PO4)2) S-a calculat magnetizarea suporturilor concentrația
de 5 fiind cea mai apropiată de datele regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective Studiile
privind interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic soluții enzimatice și celule au
indicat o corelație icircntre porozitatea materialelor și proprietațile de interacțiune cu fluide și medii
biologice
Avacircnd icircn vederea datele obținute anterior obiectivul următor a fost realizarea și
caraterizarea de suporturi pe bază de colagen ndash chitosan ndash acid hialuronic nanoparticule
magentice și fosfați de calciu S-a selectat concentrația de 5 MNPs pentru a fi inclusă icircn etapă
de sinteză particulele fiind introduse icircn formă uscată O parte din proprietățile suporturilor au
fost studiate icircn paralel cu cele ale suporturilor expuse la radiații UV timp de 4 ore cu scopul de a
observa eventuale modificări survenite după această procedură de iradiere folosită icircn practica
clinicăpreclinică pentru sterilizare Nu au fost observate diferențe icircn ceea ce privește structura
167
Concluzii generale
chimică și morfologia suporturilor Gradul de retenție PBS a fost influențat semnificativă de
raportul CaP Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul ambilor
biopolimeriValorile obţinute pentru modului lui Young sunt comparabile cu cele ale ţesutului
osos spongios uman Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor Interacțiunea in vitro cu
celule (fibroblaste și osteoblaste) a dovedit faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor caracterul non-citotoxic fiind evidențiat de un test sub-cutanat in vivo
Respectacircnd compoziția de biopolimeri și fosfați de calciu precum și concentrația de
MNPs un lot nou a fost realizat diferența față de cel descris anterior fiind dată de metoda de
includere a MNPs și anume au fost introduse sub formă de suspensie coloidală icircn apă
urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura suporturilor S-au
utilizat aceleași tehnici de caracterizare ca cele descrise la punctul anterior Icircn plus un studiu mai
detaliat al morfologiei a fost realizat cu ajutorul analizei microCT Rezultatele au indicat o
influenţă semnificativă a conţinutului de fază minerală asupra porozităţii suporturilor
Proprietățile mecanice ale suporturilor sunt comparabile cu cele ale țesutului osos spongios iar
din punct de vedere al proprietăților magnetice suporturile sunt superparamagnetice
Interacțiuneain vitro a suporturilor cu celule a fost testată pe fibroblaste osteoblaste și celule
STEM Un test MTT standard a evidențiat faptul că suporturle nuafectează celulele cele mai
bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost
studiată pe șoareci femele din linia CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de
la implantarea subcutanată a fragmentelor sterilizate de suporturi iar icircn final s-a ajuns la
concluzia că suporturile nu au efect toxic in vivo Totodată s-a observat asimilarea și resorbția
suporturilor
Icircn urma unor analize detaliate ale celor două loturi de suporturi preparate și caracterizate
icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia
vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate Pentru evaluarea
reproductibilității metodei de obținere șapte suporturi avacircnd compoziţia teoretică a lui S9 au fost
preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a compoziției din punct de
vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
168
Concluzii generale
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM Toate
analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă este reproductibilă
Potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne a fost
studiată icircmtr-o ultimă etapă Inițial s-a demonstrat că o doză de radiații X similară cu cea
utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile suporturilor cum ar
fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea in vitroSuporturile
conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic pentru tratamentul
metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și lentă a DOX
sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn terapia combinată
a tumorilor osoase maligne
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
100
41 Obținerea suporturilor 100
42 Rezultate și discuții 103
421 Structura chimică a suporturilor 103
422 Morfologia suporturilor 105
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 106
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 108
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat 108
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat 109
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 110
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor 112
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro 113
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor 114
43 Concluzii 117
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid
hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
119
51 Obţinerea suporturilor 119
52 Rezultate și discuții 122
521 Structura chimică a suporturilor 122
522 Compoziția suporturilor 123
523 Morfologia suporturilor 124
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor 127
525 Proprietăţilor magnetice ale suporturilor 128
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 129
527 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor 130
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat 130
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat 131
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 132
5281 Testul MTT 133
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 133
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor 134
53 Concluzii 139
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
141
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
141
611 Obținerea suporturilor 142
612 Rezultate şi discuţii 143
6121 Structura chimică a suporturilor 143
6122 Morofologia suporturilor 144
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 146
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 146
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor 147
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 148
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
150
621 Obținerea suporturilor 152
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor 152
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină 154
624 Rezultate și discuții 155
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor 156
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
158
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 160
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale 161
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
162
63 Concluzii 164
Concluzii generale 165
1
Introducere
Introducere
Impactul clinic cacirct şi cel economic pentru tratamentul afecţiunilor osoase este uluitor osul
fiind al doilea cel mai transplantat ţesut după transfuziile de sacircnge Numeroase metode de
reconstrucţie a defectelor osoase sunt disponibile icircn practica clinică fiind utilizate autogrefe
alogrefe matrice osoasă demineralizată materiale metalice sau ceramice proteine osoase
morfogenetice factori de creştere și altele Succesul acestor materiale este icircnsă unul limitat
fiecare din ele prezentacircnd dezavantaje considerabile Icircn icircncercarea de a oferi o soluție pentru
rezolvarea problemei menționate tot mai mulți cercetători și-au icircndreptat atenția spre realizarea
de noi materiale pentru ingineria tisulară și regenerarea țesutului osos materiale cu proprietăți și
interacțiuni controlabile Aceste materiale se găsesc sub diverse forme de prezentare suporturi
poroase tridimensionale sisteme injectabile capsule filmemembrane și matrici fibroase și
nano-fibroase hidrogeluri
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă constă icircn rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea
unui material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și
regenerare osoasă ar putea fi un suport compozit poros cu incluziune de particule magnetice
Principalul motiv pentru care se optează pentru un suport compozit este acela că osul natural la
racircndul său este un compozit matricea extracelulară a țesutului osos fiind reprezentată de 60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă
Particulele magnetice care urmează a fi incluse icircn suporturi vor fi funcționalizate cu diferiți
bio-agenți factori de creștere medicamente cu efect chimioterapic icircn vederea unei eliberări
țintite ale principiilor active enumerate Unul din marele dezavantaje ale chimioterapiei efectele
adverse asupra stării generale a pacienților ar putea fi astfel icircnlăturat medicamentele acționacircnd
controlat doar la locul tumori osoase
Obiectivul central al tezei de față vizează obținerea unor astfel de suporturi pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice Cele mai importante
proprietățile impuse unor astfel de suporturi sunt biocompatibilitate lipsa toxicității proprietăți
de suprafață adecvate incluziuni și proliferării celulare osteoconductivitate osteoinductivitate
rata de degradare controlată proprietăți mecanice comparative cu cele ale osului natural etc De
2
Introducere
asemenea foarte important este ca suportul să fie biomimetic icircn vederea integrării adecvate icircn
osul gazdă
Teza de față este structurată icircn două secțiuni principale stadiul actual al cercetărilor icircn
domeniul vizat și rezultate originale
Prima secțiune sintetizează date de literatură și este reprezentată de primul capitol A doua
secțiune este formată din 5 capitole capitolul 2 prezintă materialele și metodele utilizate pentru
obținerea rezultatelor originale prezentate icircn capitolele 3 4 5 și 6
Capitolul 1 prezintă pe scurt date despre anatomia fiziologia și patologia țesutului osos
deoarece fără cunoșterea acestor noțiuni ar fi imposibil de realizat un suport care să permită
regenerarea adecvată a țesutului osos Capitolul cuprinde informații despre materialele deja
utilizate icircn practica clinică pentru regenerarea osoasă și variantele aflate icircn stadiul de cercetare
fiind prezentate pe scurt o parte din cele mai utilizate biomateriale icircn domeniul vizat O atenție
deosebită este acordată suporturilor biomimetice prin prezentarea caracteristicilor acestora
metodelor de obținere a acestora și a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
După un studiu amănunțit a suporturilor magnetice realizate și caracterizate pacircnă icircn prezent icircn
literatura de specialitate s-a realizat o clasificare a acestora icircn funcție de biomaterialele de bază
utilizate icircn sinteza acestora
Capitolul 2 redă inițial strategia experimentală și obiectivele lucrării de față după care sunt
enumerate caracteristicile principale ale materialelor utilizate pentru prepararea suporturilor și a
celor utilizate pentru caracterizarea acestora De asemenea sunt prezentate etapele procesului de
preparare a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule
magnetice precum și metodele de caracterizare a suporturilor obținute Sub capitolul Metode de
caracterizare evidențiază principiile de bază ale tehnicilor folosite condițiile de lucru parametrii
și dispozitivile utilizate
Capitolul 3 a avut drept scop principal realizare și caracterizarea unor suporturi compozite
folosind patru combinații diferite de biopolimeri și trei concentrații diferite de nanoparticule
magnetice Icircn urma analizei structurii chimice a suporturilor a compoziției și morfologiei
acestora a proprietăților magnetice precum și a interacțiunii suporturilor cu fluide de interes
biologic enzime și celule se vor stabili biopolimerii și concentrația de nanoparticule ce vor fi
utilizate icircn capitolele următoare
3
Introducere
Un program experimental s-a utilizat pentru a obține 13 suporturi pe bază de colagen
chitosan acid hialuronic și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată capitolul 4 prezentacircnd prepararea și caracterizarea acestora Pe lacircngă analizele realizate
pentru suporturile din capitolul 3 s-au analizat și proprietățile mecanice ale celor 13 suporturi
precum și citotoxicitate lor in vivo ultimul experiment menționat avacircnd o durată de 21 zile
Același program experimental și aceeași compoziție a suporturilor a fost utilizată și pentru
prepararea suporturilor descrise icircn capitolul 5 diferența fiind dată de faptul că particulele au fost
icircncorporate sub formă de suspensie coloidală Morfologia acestor suporturi a fost studiată icircn
detaliu cu ajutorul tehnicii microCT iar testele de toxicitate in vivo realizate pe aceași specie de
animale utilizate icircn capitolul anterior a avut o durată de mai mare de 64 zile
Capitolul 6 este structurat icircn două părți Prima parte prezintă reproductibilitatea metodei de
preparare a suporturilor iar a doua parte studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircntr-o primă etapă suporturile au fost iradiate cu o doza
unică de raze X administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase fiind analizată apoi
influența radiațiilor asupra proprietăților fizico-chimice și biologice a suporturilor A doua etapă
a studiului a constat icircn icircncărcarea nanoparticulelor incluse icircn suporturi cu doxorubicină
(medicament utilizat icircn practica clinică pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor
osoase) urmată de caracterizarea suporturilor obținute
Lucrarea se icircncheie cu un capitol de concluzii generale și bibliografia cosultată pentru
realizarea acesteia
4
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice pentru regenerarea osoasă
Osul este un țesut conjuctiv specializat dinamic care este suspus unui proces de
remodelare continuă pe parcursul vieții Are rolul atacirct de țesut cacirct și de organ funcțiile sale de
bază fiind de protecție a organelor vitale din cavitatea craniană toracică și a măduvei spinării de
suport a sistemului locomotor Matricea extracelulară a țesutului osos are o componentă organică
și o component anorganică iar celulele țesutului osos sunt osteoblastele osteocitele celulele de
suprafață și osteoclastele Din punct de vedere morfologic osul este fie spongios (trabecular) fie
compact (cortical) Țesutul osos spongios este asociat cu funcțiile metabolice iar țesutul osos
compact este asociat cu rezistența mecanică [1]
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta aceste
defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare Chiar dacă decenii icircntregi autogrefele
au fost utilizate cu precădere dezavantajele acestora au condus la cercetări riguroase pentru
fabricarea unor grefe osoase realizate din biomateriale (polimeri materiale ceramice materiale
metalice) Ingineria tisulară combină cu succes principiile biologiei țesutului osos și principiile
disciplinelor inginerești contribuind la consolidarea pierderilor osoase prin intermediul unor
matrici numite suporturi [2] Icircncorporarea unor sisteme de eliberarea controlată de principii
biologice icircn interiorul suporturilor vor conduce la rezultate remarcabile Nanoparticulele
magnetice funcționalizate pot fi un exemplu de astfel de sisteme
11 Ţesutul osos Structură Fiziologie Patologie
Țesutul osos este un organ foarte important pentru organismul viu Formarea sa este
moderată de mecanisme centrale și locale prin intermediul cărora este remodelat constant icircncă
din viața intrauterină și pe tot parcursul vieții pentru menținerea arhitecturii sale
microstructurale Procesul de remodelare este coordonat de activitățile osteoblastelor și
osteoclastelor care la racircndul lor sunt reglementate de procesele fiziologice de la nivel tisular și
de răspunsul la stimuli biomecanici
5
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
111 Funcțiile țesutului osos
Osul oferă protecție unor organe vitale și joacă de asemenea un rol important icircntr-o serie
de funcții fiziologice hematopoieză menținerea echilibrului acido-bazic funcția de rezervă
minerală funcția de suport a sistemului locomotor
Figura 11 Funcțiile țesutului osos [3]
Canalele medulare ale oaselor lungi găzduiesc celule stem mezenchimale capabile să se
diferențieze icircn precursorii hematopoietici care icircn cele din urmă dau naștere celulelor sanguine
mature
Icircn ceea ce privește menținere echilibrului acido-bazic oasele asigură organismului soluții
tampon carbonat și fosfat icircn timpul acidozei metabolice cronice proces observat icircn acidoza
renală tubulară și acidoza uremică Carbonatul de calciu este cel mai important dintre
componentele acestor soluții tampon asiguracircnd rezervorul de ioni de bicarbonat
6
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Din punct de vedere al rezervei de minerale țesutul osos este rezervorul a aproximativ
85 din fosforul din organism și 99 din calciu din organism
Osul are o rezistență mare la compresiune dar la forțe mari de tracțiune sau tensiune poate
fi fracturat Procentul mare de colagen din matricea organică (90 ) conferă un grad de
elasticitate considerabil țesutului osos dar cu toate acestea osul este un compozit casant [4]
112 Structura ţesutului osos
Țesutul osos este un material compozit format dintr-o matrice extracelulară şi din celule
proprii organizat pe cinci niveluri ierarhice (figura 12) macrostructura osului microstructura
osului sub-microstructura osului nanostructura osului și sub-nanostructura osului [5] [6]
Macrostructura osului este reprezentată de cele două tipuri de țesut osos compact icircntalnit
icircn literatură și sub denumirea de țesut osos cortical și spongios icircntalnit și sub denumirea de țesut
osos trabecular iar microstructura osului (10-500 microm) este reprezentată de componentele celor
două tipuri de țesuturi Țesutul osos cortical are o structură densă fiind format din sistemul
Haversian care la racircndul său este format dintr-un spațiu ce conține vase de sacircnge numit canal
haversian icircnconjurat de lamele osoase ce reprezintă sub-microstructura țesutului osos (1-10
microm) Țesutul osos spongios are o densitate mai mică decacirct a țesutului osos compact și este
format din spații areolare neregulate delimitate de trabecule osoase Spațiile areolare conțin
măduvă hematogenă bogată icircn sacircnge Icircn general țesutul osos compact reprezintă 80 din
sistemul osos dar distribuția celor două tipuri de țesut diferă icircn funcție de regiune
Figura 12 Organizarea structural ierarhică a osului [5]
7
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Nanostructura osului (cacircteva sute de nanometri ndash 1 microm) este reprezentată de fibrele de
colagen și de faza minerală iar sub-nanostructura osului (mai puțin de cacircteva sute de nanometri)
este reprezentată de structura moleculară a componentelor [7] [8]
1121 Matricea extracelulară
Matricea extracelulară este compusă dintr-o componenta organică ce reprezintă 33 din
masa uscată a matricei și o componenta anorganică ce reprezintă 67 din masa uscată a matricei
Componenta organică este formată icircn proporție de 90 din proteine colagenice
predominant colagen de tip I iar restul compoziției reprezintă proteine non-colagenice factori de
creștere și proteine morfogentice osoase Din proteinele non-colagenice regăsite icircn os fac parte
ostocalcina osteopontina fibronectina și sialoproteina osoasă II Osteocalcina cea mai
abundentă proteină non-colagenică din ţesutul osos reprezentacircnd 10-20 din cantitatea totală
are un rol important icircn procesul de mineralizare deoarece se leagă de cristalele de hidroxiapatită
[9] Osteopontina este o glicoproteină fosforilată icircntacirclnită icircn aproape toate ţesuturile
organismului uman piele creier fluidul sanguin cartilaj şi o varietate de tumori Osteonectina
este o glicoproteină bogată icircn cisteină care icircn procesul de mineralizare leagă colagenul de
hidroxiapatită avacircnd rolul unui nucleu de mineralizare reglacircnd formarea şi creşterea cristalelor
de hidroxiapatită [10] De asemenea icircn matricea organică au fost identificați glicozaminoglicanii
nesulfataţi (acid hialuronic) şi sulfataţi (condroitinsulfatul şi keratansulfatul)
Glicozaminoglicanii sulfataţi sunt legaţi covalent de molecule proteice formacircnd proteoglicani icircn
țesutul osos cei mai de icircntacirclniți fiind proteoglicani bogați icircn leucină cu masă moleculară mică
Componenta anorganică este reprezentată icircn cea mai mare parte din ioni de fosfat și ioni
de calciu Pe lacircngă acești ioni se găsesc icircntr-o cantitate considerabilă și bicarbonat sodiu
potasiu citrat magneziu carbonat fluor zinc bariu și stronțiu Ionii de calciu și fosfat formează
cristale de hidroxiapatită care se depun pe matricea colagenică proces icircn urma cărui rezultă
proprietățile de rezistență și rigiditate a țesutului osos [10] [11]
Matricea extracelulară osoasă constituie un cadru complex și organizat care oferă suport
mecanic și exercită un rol esențial homeostaza osoasă Matricea osoasă poate elibera mai multe
molecule care influențează activitatea celulelor osoase și prin urmare influențează procesul
complex de remodelarea osoasă Studiile icircn domeniu au indicat că doar pierderea masei osoase
8
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
este insuficientă pentru a provoca fracturi osoase alți factori inclusiv modificări ale proteinelor
matricei osoase au o contribuție colosală icircn producerea fracturilor osoase [12] [13]
1122 Celulele țesutului osos
Țesutul osos are icircn componență patru tipuri de celule osteoblaste osteoclaste osteocite și
celule de suprafaţă (figura 13)
Figura 13 Celulele țesutului osos
Osteoblastele celule localizate pe suprafața osului sunt derivate din celule stem
mezenchimale reprezentacircnd 4-6 din totalul de celule osoase Se găsesc icircn țesuturile tinere dar
apar și icircn condiții patologice Din punct de vedere morfologic sunt celule cu formă cubică de
dimensiuni mari (15-20 microm) ce prezintă caracteristici specifice celulelor implicate icircn sinteza
proteinelor reticulul endoplasmatic rugos și complexul Golgi ambele bine dezvoltate precum și
numeroase vezicule de secreție ce conțin precursori de matrice osoasă incluziuni lipidice și
mucopolizaharide Osteoblastele au un rol foarte important icircn procesul de formare al osului
Sinteza matricei osoase are loc icircn două etape depunerea matricei organice urmată de
mineralizarea acesteia Icircn etapa de depunere a matricei organice osteoblastele secretă proteine
colagenice non-colagenice și proteoglicani iar etapa a doua cea de mineralizarea a matricii
organice are o faza veziculară și o fază fibrilară [11]
Osteocitele sunt cele mai abundente celule osoase reprezentacircnd aproximativ 95 din
totalul acestora Sunt osteoblaste mature care ocupă spațiul lacunar fiind icircnconjurate de matrice
osoasă Ca și particularitate structurală osteocitele au prelungiri citoplasmatice asemănătoare
dendritelor neuronilor care formează o rețea de comunicare icircntre ele și suprafața osoasă Durata
9
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de viață a osteocitelor a fost estimată de Frost și colaboratorii [14] la 25 de ani dar acest lucru
nu poate fi apreciat cu exactitate deoarece procesul de remodelare osoasă presupune o reicircnnoire
a țesutului osos cu 4-10 pe an Icircn orice caz durata de viață a osteocitelor este cu mult mai
mare decacirct a osteoblastelor care au un ciclu de viață de aproximativ 3 luni Totodată nici rolul
osteocitelor nu este icircnțeles pe deplin numeroase studii concentracircndu-se pe asta [15]
Osteoclastele denumite și macrofagele ţesutului osos sunt celule multinucleate
diferențiate din celule stem hematopoetice sub influența a numeroși factori cum ar fi factorul de
stimulare a coloniilor de macrofage (M-CSF) și factorul de legătură nucleic kappa-B (RANKL)
M-CSF este secretat de celulele mezenchimale osteoprogenitoare și de osteoblaste iar RANKL
este secretat de osteoblaste osteocite și celule stromale Acești factori susțin activarea
transcripției expresiei genice icircn osteoclaste Osteoclastele conţin următoarele enzime fosfatază
acidă protează enzime oxidoreducătare ale glicolizei datorită cărora au o activitate enzimatică
intensă şi fagocitară Resorbţia osului nemineralizat (osteoidul) nu este realizată de osteoclaste
ci de elemente macrofagice histiocitare Osteoclastele intra icircn stare de repaus cacircnd formarea
osului definitiv este terminată Celulele redevin active icircn caz de fractura cacircnd are loc formarea
calusului [11] [8]
Celulele de suprafaţă sau bordantă sunt celule ce acoperă suprafeţele osoase icircn locurile
unde nu are loc nici resorbția nici formarea osoasă doua etape importante ale procesului de
remodelare osoasă Din punct de vedere structural sunt celule cu nucleu turtit o citoplasmă care
se extinde pe suprafața osoasă și doar cacircteva organite citoplasmatice cum ar fi aparatul Golgi
sau reticulul endoplasmatic rugos Funcțiile acestor tipuri de celule nu sunt pe deplin icircnțelese dar
studiile icircn domeniu susțin ideea că aceste celule au un rol important icircn prevenirea interacțiunii
directe dintre osteoblaste și matricea osoasă și totodată participă la procesul de diferențiere a
osteoclastelor
113 Fiziologia ţesutului osos
Pe parcursul icircntregii vieţii osul este supus proceselor biologice complexe procese de
creştere icircn lungime şi grosime modelare şi remodelare La racircndul lor la baza acestora stau
procesul de osteogenză ce constă icircn producerea de țesusut osos și osteoliză ce constă icircn
distrucția de țesut osos [8]
10
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1131 Osteogeneza și osteoliza
Osteogeneza este procesul de formare a osului osteoblastele fiind elementele esențiale icircn
acest proces Funcţionalitate osteoblastelor este controlată de molecule semnal hormoni factori
de creştere şi citokine [10] Pe scurt osteogeneza are trei pași de bază sinteza matricei
extracelulare organice (osteoid) mineralizarea matricei ce conduce la formarea osului și
remodelarea osului prin procesele de resorbție și reformar [16] Prin acţiunea concentrată a
moleculelor semnal osteoblastele produc icircntr-o primă etapă toate componentele matricei
organice a ţesutului osos ce va fi eliberată pe icircntreaga suprafaţă sub forma de osteoid
nemineralizat Pe seama precursorilor preluaţi din mediul extracelular se realizează după
modelul sintezei proteice sinteza matricei organice Concomitent cu producerea de matrice
organică are loc procesul de mineralizare a acestei ce reprezintă legarea substanţei anorganice de
matricea proteică o legatură particulară icircntre sărurile minerale şi proteină fiind realizată icircn urma
acestui proces La procesul mineralizării contribuie numeroşi factori locali şi generali un rol
cheie fiind jucat de factorii inhibitori naturali ioni de magneziu citrați pirofosfați și nucleotide
Icircn țesuturile conjuctive nemineralizate factorii anterior enumerați au o concentrație superioară
comparativ cu țesuturile conjuctive mineralizate Icircn cazul țesutului osos fosfataza alcalină
secretată de osteoblaste distruge parțial acești factori făcacircnd posibil procesul de mineralizare
Procesul de osteoliză ce corespunde distrucției osoase este atribuit osteoclastelor Procesul
icircncepe cu demineralizarea matricei osoase urmată de hidroliza enzimatică a componentelor
organice formacircndu-se zone de eroziune osoasă Pentru realizarea resorbţiei osteoclastul trebuie
să adere la o suprafaţă osoasă şi să formeze compartimentul subosteoclastic Icircnsă suprafeţele
osoase au o peliculă fină de matricea extracelulară nemineralizată acoperită de un strat de
osteoblaste icircntre care se stabilesc joncţiuni distanţate icircngreunacircnd fixarea osteoclastelor pe
suprafeţe osoase Osteoblastele au receptori pentru parathormon și 125-dihidroxicolecalciferol
prin stimularea cărora are loc restricția osteoblastelor urmată de eliberarea suprafeței osoase Prin
cuplarea substanțelor stimulante cu receptori specifici se declanșează sinteza de activator al
plasminogenului și sinteza de colagenază latentă urmate de activarea colagenazei latente de
către plasmină Activarea colagenazei va avea drept consecință icircndepărtarea peliculei de matrice
nemineralizată continuacircnd cu atașarea osteoclastelor [8]
11
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1132 Creşterea osului
Creşterea osului icircntacirclnită și sub denumirea de organogeneză osoasă este etapa care
urmează procesului de osteogeneză normală avacircnd drept rezultat formarea osului și a
articulaţiilor Mai precis constă icircn formarea şi creşterea oaselor icircn lungime icircn grosime şi
asigurarea formei epifizelor Pentru fiecare element osos există un punct de osificare specific icircn
care icircncepe formarea osoasă la o anumită vacircrstă [17] Se poate vorbi de două tipuri de osificare
osificarea endoconjunctivă sau intramembranară și osificarea endocondrală
Osificarea intramembranară este caracterizată de invazia capilarelor icircn zona mezenchimală
și de diferențierea celulelor mezenchimale icircn osteoblaste mature care vor depozita matrice
osoasă conducacircnd la formarea de corpusculi osoși Acești corpusculi vor crește și se vor
dezovolta iar apoi vor fuziona cu alți corpusculi și vor forma trabecule ososase Pe măsură ce
trabeculele osoase cresc icircn dimensiune și icircn număr devin interconectate formacircnd o formă de țesut
osos Această formă de țesut osos este o structură fără rezistență dezorganizată și are un număr
mare de osteocite Osificarea intramembranară are loc icircn timpul dezvoltării embrionare și este
implicată icircn formarea oaselor plate din structura cutiei craniene unele oase faciale o parte din
mandibulă și claviculă și adăugarea de țesut osos nou la diafiza majorității oaselor
Osificarea endocondrală utilizează proprietățile funcționale ale cartilajului și osului pentru
a asigura un mecanism de formare și creștere a scheletului Combinarea condrogenezei și a
osteogenezei icircn vederea osificării osoase este dependent de nivelul de vascularizare a cartilajului
de creștere Icircn figura 14 sunt prezentate la general etapele procesului de osificare endocondrală
[18] Osificarea endocondrală are 6 etape Celule mezenchimale se vor concentra (A) și se vor
diferenția icircn condrocite formacircnd un cartilaj nevascularizat (B) Icircn centrul cartilajului format
condrocitele se vor opri din proliferare și vor deveni hipertrofice (C) Condrocitele din
vecinătatea celor hipertrofice se vor diferenția icircn osteoblaste acestea din urmă formacircnd un colier
osos (D) Icircn continuare condrocitele hipertrofice vor regla formarea de matrice mineralizată Icircn
același timp icircn această etapă are loc eliberarea de factori angiogenetici care vor atrage vase de
sacircnge după care condrocitele hipertrofice vor intra icircn apoptoză (E) Coordonarea osteoblastelor
și invazia vaselor de sacircnge vor avea drept rezultat formarea țesutului spongios primar
Condrocitele se vor prolifera icircn continuare și icircn același timp va avea loc vascularizarea osului
aceste două etape contribuind la creșterea icircn lungime a osului Osteoblastele din colierul osos vor
12
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
contribui la formarea osului cortical pe cacircnd cele din țesutul spongios primar vor contribui la
formarea țesutului spongios final (F)
Figura 14 Osificarea endocondrală [18]
1133 Remodelarea osului
Osul este un organ activ remodelat pe tot parcursul vieții Procesul de remodelare osoasă
cuprinde patru faze distincte ce se desfăşoară permanent icircn anumite locuri faza de repaus faza
de resorbţie osoasă faza de inversie şi faza de formare reprezentate schematic icircn figura 15 Icircn
faza de repaus suprafaţa ţesutului osos este acoperită de celule de suprafaţă ancorate icircn matricea
mineralizată Icircn faza de resorbţie osoasă rolul principal revine osteoclastelor care vor forma o
cavitate numită lacună de resorbţie (lacuna Howship) Resorbţia are loc icircn două etape
demineralizarea fazei osoase și distrugerea fazei osoase Icircn faza de inversie are loc apariția
osteoblastelor icircn zona erodată ce vor acoperi lacuna de resorbţie printr-o depozitare activă de os
nemineralizat osteoid Osteoidul se depune pacircnă cănd grosimea acestuia ajunge la 20 microm
urmacircnd faza de mineralizare Pe măsură ce osteoidul este mineralizat locul unde a avut loc
remodelarea va fi icircnlocuit cu un os nou [19]
13
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 15 Remodelarea ţesutului osos
114 Patologia osoasă
Patologia osoasă poate fi de cauza traumatică ndash fractură sau netraumatică Icircn funcţie de
cauza fracturii putem vorbi de fracturi determinate de un accident traumtic fracturi de oboseală
şi fracturi de os patologic Cauzele netraumatice care pot cauza o anumită patolgie osoasă sunt
infecţiile osului tumorile osului și deformaţiile osului [17]
1141 Tumori osoase
Icircn literatura de specialitate tumorile sunt icircntalnite și sub denumirea de neoplasme și se
definesc ca proliferări tisulare anormale autonome persistente neconcordante cu ţesuturile din
jur care se dezvoltă continuu chiar și după icircncetarea stimului care a determinat proliferarea și nu
răspund la mecanisme normale de control ce guvernează creştere Icircn funcție de caracteristicile
morfo-funcționale și de evoluția acestora tumorile se clasifică icircn tumori begine şi tumori
maligne Cele benigne sunt caracterizate prin margini bine definite au o creştere lentă şi locală
sunt neinvazive şi compresive circumscrise şi icircncapsulate prezintă mitoze rare nu diseminează
icircn alte ţesuturi şi organe (non-metastazante) avacircnd un prognostic bun Tumorile maligne sunt
14
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
caracterizate prin margini nedefinite au o creştere rapidă fiind infiltrative şi icircncapsulante
invazive şi distructive sunt metastazante şi au un prognostic rezervat
Metastazarea reprezintă răspacircndirea celulelor maligne din tumora primară icircn organele
ţesuturile sau cavităţile organismului Comună majorităţii cancerelor umane metastazarea
transformă o tumoră de organ icircntr-o boală sistemică Este un proces complex multistadial şi
dinamic avacircnd la bază o serie de procese subtile interconectate ce rezultă din interacţiunile
gazdei cu tumora Fiecare etapă metastatică este subiectul unor influenţe multiple indispensabile
celulei maligne pentru a supravieţui variaţiilor de mediu (prin dobandirea de noi mutaţii) ce icirci
permit acesteia să invadeze ţesuturile vecine să patrundă icircn sistemul circulator (calea majoră de
răspacircndire prin vasele de sacircnge şisau limfatice) să extravazeze icircn ţesuturi noi să dezvolte un
sistem vascular propriu care să icircicirc suţină dezvoltarea şi chiar uneori să permită metastazei să dea
naştere la noi metastaze [20] [21]
Figura 16 Clasificarea tumorilor osoase
15
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Domeniul de patologie osteoarticulară icircn care se icircncadrează şi tumorile osoase este un
domeniu foarte vast şi delicat nu este constant fiind adesea descoperite noi metode de
diagnostic şi tratament ce ameliorează sau chiar schimbă radical prognosticul multor tumori
osoase Una din principalele probleme icircn ceea ce priveşte diagnosticul şi tratamentul tumorilor
osoase este aceea că nu există o separare netă icircntre tumora benignă şi tumora malignă
Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) propune o clasificare a tumorilor osoase bazată pe
capacitatea de diferenţiere a acestora ceea ce icircnseamnă că sunt grupate din punct de vedere
histologic şi citologic al ţesutului pe care acestea icircl reproduce clasificare redată icircn figura 16
[22]
Metastazele sunt cele mai icircntalnite tumori din os Acestea sunt considerate tumori
secundare osoase deoarece tumora primară nu icircşi are originea icircn os tipurile de cancer care dau
cel mai frecvent metastaze osoase fiind cancerul de prostată cancerul de sacircn şi cancerul
pulmonar Tumorile osoase primare cum sunt osteosarcoamele sau condrosarcoamele sunt
destul de rare statisticile sugeracircnd că doar icircn 1 din 20 cazuri de tumori osoase este vorbă de o
tumoră primară Cea mai frecvent intalnită tumoră osoasă primară este mielomul cu celule
plasmatice ce apare la pacienţi cu vacircrstă peste 40 ani urmată de diverse sarcoame Dintre
sarcoamele osoase primare ce reprezintă 02 din toate neoplasmele cele mai comune sunt
osteosarcoamele ndash 35 condrosarcoamele ndash 25 sarcomul Ewing ndash 16 condroamele ndash 8 şi
histiocitoamele maligne fibroase ndash 5
Incidenţa tumorilor primare benigne este mai dificil de determinat deoarece nu se
realizează biopsie pentru toate leziunile nou descoperite Atacircta timp cacirct leziunile pot fi complet
caracterizate ca şi bengine pe baza datelor clinice şi imagistice biopsia sau rezecţia sunt
nepotrivite şi neadecvate Cele mai comune tumori osoase benigne sunt următoarele
osteocondroamele ndash 35 encondroamele ndash 20 tumorile cu celule gigante ndash 15 osteomul
osteoid ndash 10 şi displazia fibroasă (maladia Jaffeacute) ndash 5 Icircn ciuda caracterului benign al
tumorilor tratamentul acestora trebuie să fie cacirct mai eficient posibil De exemplu o tumoră cu
celule gigante extinsă icircn suprafaţa articulară tibială poate duce la o fractura patologică dacă nu
este tratată adecvat
Tratamentul fiecărei tumori osoase depinde de mai mulţi factori caracterul benign sau
malign localizarea leziunii istoricul afecţiunii nivelul durerii Icircn cazul tumorilor benigne
icircndepărtarea leziunea urmată de grefarea sau biopsia excizională conduc icircn general la rezultate
16
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
bune Totuşi aceste două metode de tratament pot fi inadecvate icircn cazul tumorilor maligne atacircta
timp cacirct celule tumorale reziduale rămacircn la marginea leziunii Limfoamele osoase pot fi tratate
cu chimioterapie sau radioterapie fără a fi necesară o intrevenţie chirurgicală Alte tumori cum
ar fi de exemplu osteosarcoamele convenţionale sunt supuse icircntr-o primă etapă chimioterapiei
sau radioterapiei cu scopul de a micşora masa tumorală următoarea etapă fiind rezecţia
chirugicală Condrosarcoamele sunt tratate doar chirurgical chimioterapia dovedindu-se
ineficientă Multe procese maligne sau procese benigne agresive pot fi tratate prin rezecţie
chirurgicală atacirct a tumorii cacirct şi a unei margini de ţesut normal sau icircn cele mai grave cazuri prin
icircndepărtarea totală a osului muşchiului sau altor ţesuturi afectate de tumoră [23]
12 Metode de tratament a defectelor osoase
Spre deosebire de alte ţesuturi osul are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn
cazul unor afecţiuni minore fără formare de cicatrici Icircn schimb icircn cazul fracturilor patologice
sau a celor grave precum şi icircn pierderi mari de ţesut osos ce pot conduce la defecte osoase
grave procesele de regenerare şi reparare proprii vor avea nevoie de support [24] Principalii
factori ce conduc la defecte osoase grave sunt rezecţia de tumoră osoasă malformaţiile
congenitale unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita După sacircnge osul
este al doilea cel mai transplantat organ anual fiind efectuate la nivel mondial aproximativ 22
milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă [25] Materiale de substituţie osoasă
pot fi clasificate icircn mai multe categorii după cum urmează grefe de origine naturală (autogrefe
alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria tisulară
precum şi diverse combinaţii ale acestora [26]
121 Metode actuale de tratament a defectelor osoase
1211 Grefe osoase biologice
Icircn funcție de originea lor grefele biologice se clasifică icircn xenogrefe alogrefe și autogrefe
[27] Xenogrefe prelevate de la o specie diferită de a primitorului au fost utilizate o scurtă
perioada de timp deoarece după cacircteva decenii de studii icircndelungate s-au dovedit a fi cele mai
puţin adecvate grefe [28] Alogrefele sunt utilizate pentru reconstrucţia unor defecte osoase
grave Astfel alogrefele se utilizează icircn timpul intervenţiilor de revizie a artoplastiilor totale
17
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
pentru reconstrucţia pierderilor osoase Alogrefele sunt prelevate fie de la pacienţi vii fie de la
cadavre Icircn cazul icircn care donatorii sunt pacienţi vii o sursă foarte utilizată este capul femural
alogrefele fiind preluate icircn acest caz icircn timpul intervenţiilor primare de artoplastie totală de şold
Icircn cazul icircn care alogrefele sunt preluate de la cadavre oasele lungi şi pelvisul sunt sursele cele
mai utilizate [29] Icircn tabelul 11 sunt prezentate principalele avantaje și dezavantaje ale celor trei
tipuri de grefe osoase biologice
Tabel 11 Principalele avantaje și dezavantaje ale autogrefelor alogrefelor și xenogrefelor [24]
Grefă
osoasă
biologică
Avantaje Dezavantaje
Autogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
osteoconductivitate și osteogenice
histocompatibilie
nu există risc de imunogenicitate
sau transmitere de boli infecțioase
durere la locul prelevării și
moartea patului donator
sursă limitată de
disponibilitate și cantitate
timpi chirurgicali mai mari
ce implică pierderi de sacircnge
posibile infecții
Alogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
și osteoconductivitate
nu apare problema morbidității
patului donator
ușor de manevrat
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
osteoinductivitate variabilă
pierderea proprietăților
biologice și mecanice
respinse icircn anumite regiuni
geografice datorită unor aspecte
religioase
cost crescut
Xenogrefe
proprietăți osteoinductive și
osteoconductive
cost scăzut
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
risc imunogenic crescut
rezultate slabe
Un tip specializat de alogrefe este reprezentat de matricea osoasă demineralizată (DBM)
DBM se obține prin extracția acidă a alogrefelor și conține colagen de tip I proteine
18
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
noncolagenice și un număr variabil de factori de creștere osteoconductivi (de exemplu proteine
morfogenetice osoase - BMP) Concentrația de DBM este direct proporțională cu
osteoinductivitatea DBM se poate folosi fie singură fie icircn combinație cu alte alogrefe sau cu
grefe sintetice [27]
Autogrefele sunt utilizate pentru refacerea defectelor osoase primitorul și donatorul fiind
aceași persoană Sunt utilizate icircntr-un număr mare de intervenţii chirurgicale ortopedice
stomatologice şi maxilo-faciale cu scopul de a spori şi grăbi regenerarea osoasă sau de a restaura
defectele osoase Creasta iliacă este locul de unde se prelevă cel mai frecvent autogrefe datorită
accesului uşor şi a unei bune calităţi De asemenea autogrefele se mai pot preleva din tibia
proximală femurul distal coaste radiusul distal Şi canalul intramedular al oaselor lungi poate
reprezenta o potenţilă sursă de autogrefe precum şi o sursă bogată de celule şi factori de creştere
[30] [31]
1212 Grefe osoase și substituienți sintetici
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din biomateriale
sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea celulelor osoase icircn timpul
procesului de regenerarea osoasă [26] O gamă variată de materiale sintetice sunt utilizate ca și
substituenți osoși metale cum sunt tantalul titanul fierul sau magneziul polimeri sintetici cum
sunt poli acidul lactic poli acidul glicolic poliuretani sau poli ε-caprolactona și ceramice sum
sunt sticlele bioactive fosfații de calciu sau sulfați de calciu hidratați Icircn timp dintre toate aceste
materiale cele mai potrivite s-au dovedit a fi cele pe bază de fosfați de calciu datorită asemănării
cu compoziția osului natural (ce conține mai mult de 60 fosfați de calciu)
Substituenți sintetice sunt disponibili fie sub formă de granule (majoritatea au un diametru
cuprins icircntre 01 și 5 mm) fie sub formă suporturi cu porozitate variabilă icircn funcție de diverse
aspecte ce țin de locul unde vor fi implantate perioada necesară refaceriiregenerării complete
etc De asemenea icircn practica curentă se folosesc și substituienți injectabili denumiți adesea
cementuri un mare avantaj ala acestora fiind tehnica de implantare minim invazivă
Resorbabilitatea este o caracteristică esențială a substituienților osoși fiind intens studiată
Icircn tabelul 12 sunt prezentate principalele clase de substiutuenți osoși utilizați icircn prezent precum
și mecanismele de resorbție ale acestora
19
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Tabel 12 Principale tipuri de substituenți osoși și mecanismul de resorbție al acestora [32]
Clasa de
Material Tipul de material Mecanismul de resorbție
Materiale
Ceramice
Bioglas Resorbţie limitată
Sulfat de calciu hemihidrat (CSH)
Gips
Sulfat de calciu dehidrat (CSD)
Solubilizare
Solubilizare şisau conversie icircn
apatită
Fosfat dicalcic (DCP)
Fosfat octocalcic (OCP)
β-Fosfat tricalcic (β-TCP)
Fosfat de calciu bifazic (BCP)
Cristale de hidroxiapatită
precipitate
β-Pirofosfat de caciu (β-CPP)
Mediat cellular
Hidroxiapatită sinterizată Nu se resoarbe
Materiale
Metalice
Magneziu (aliaj) Coroziune
Fier (aliaj) Coroziune
Tantal titan Nu se resoarbe
Polimeri
Poli acid lactic poli acid glicolic
Poli ε-caprolactona Hidroliză
Celuloză
Hialuronan
Fibrină
Colagen
Chitosan
Transport la ganglioni limfatici
Hialuronidază
Plasmină
Colagenază
Lizozim
Icircn mod ideal un substituent osos ar trebui să fie icircnlocuit icircn timp de țesust osos nativ fără
pierderea suportului mecanic oferit de acesta Icircn unele cazuri defectele osoase sunt stabilizate
utilizacircnd fixarea metalică neresorbabilă defectul osos propriu-zis fiind completat cu un
substituent osos Rata de resorbție a substituienților osoși poate fi controlată prin optimizarea
geometriei materialului Prezența unei rețele cu pori interconectați sau a unor canale icircn structura
sa este o caracteristică cheie a unui substituent osos regăsindu-se inclusiv la cementurile
20
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
injectabile Icircn cazul substituenților pe bază de polimeri rata de resorbție poate fi controlată prin
unele modificări chimice [32]
122 Ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Dezavantajele substituenților osoși sintetici au condus la necesitatea unei metode
alternative şi efective avacircnd drept scop principal regenerarea osoasă S-au evidenţiat
următoarele alternative a substituenţilor osoşi utilizarea factorilor de creştere osteogenici (cum
ar fi proteienele morfogenetice osoase ndash BMPs) suporturi osteoinductive terapia genică
utilizarea celulelor stem toate acestea reprezentacircnd componentele inginerie tisulare (figura 17)
Figura 17 Triada ingineriei tisulare și aplicarea produsului rezultat icircn procesul de
regenerarea al țesutului osos afectat de tumoriinfecții
Componentele ingineriei tisulare o matrice sau un suport celule și molecule semnal au
fost stabilite plecacircnd de la structura țesuturilor biologice [33]
Matricea sau suportul este componenta cheie a ingineriei tisulare Acționează iniţial ca un
suport temporar pentru adeziunea și creșterea celulară apoi are rol definitoriu pentru sinteza de
matrice extracelulară iar icircn ultimă etapă contribuie la formarea de neo-țesut [34]
21
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau regenerarea
ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor artificiale și a suporturilor
Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase sisteme injectabile capsule
filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri etc [35]
1221 Biomateriale utilizate la realizarea de suporturi pentru regenerarea osoasă
La realizarea suporturilor pentru regenerarea osoasă sunt utilizate mai multe tipuri de
biomateriale biopolimeri polimeri sintetici și biomateriale ceramice
Polimeri atacirct de origine naturală cacirct și sintetică sunt utilizați pentru o varietate de aplicații
biomedicale Din clasa polimerilor naturali sau bioplomeri fac parte polizaharidele proteine și
poliesteri proveniți atacirct din regnul vegetal cacirct și din regnul animal Biopolimeri sunt utilizați
icircntr-o multitudine de domenii industria alimentară industria farmaceutică (foarte des ca și
excipienți) la realizare unor proteze icircn sisteme de eliberare controlată de medicamente etc
Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul biologic fiind dirijați spre degradarea metabolică
Datorită similarității dintre polimerii naturali și matricea extracelulară (ECM) aceste materiale
nu vor provoca o reacție imunologică cronică sau toxică reacții deseori icircntalnite icircn cazul
utilizării polimerilor sintetici [36]
12211 Biopolimeri
Printre cei mai utilizați biopolimeri se numără colagenulgelatina acidul hialuronic
chitosanulchitină albumina serică bovină fibroina din mătase [37]
Colagenul
Colagenul ndash Col proteina cea mai abundentă din organismul uman se remarcă ca
biopolimer printr-o serie de proprietăţi precum biocompatibilitatea excelentă
biodegradabilitatea rezistenţa mecanică ridicată toxicitatea scăzută reacţii imunologice slabe
fiind unul din cele mai utilizate biomateriale icircntr-o varietate de aplicaţii medicale
Din punct de vedere al structurii chimice colagenul are structură de triplu helix
macromolecula de colagen fiind formată din trei lanţuri α răsucite icircmpreună de la stacircnga la
dreapta icircn jurul unui ax comun [38] Există mai multe tipuri de colagen fiecare tip avacircnd
22
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
particularității proprii de structură precum și localizare icircn organe specific icircn organism Nu se ştie
cu exactitate cacircte tipuri de colagen există Cel mai intalnit colagen icircn racircndul vertebratelor este
colagenul de tip I de aceea este și cel mai utilizat și studiat icircn diverse domenii
Figura 18 Structura colagenului
Poate fi prelucrat sub o mare varietate de forme filme fibre structuri poroase
nanoparticule şi microparticule atacirct singur cacirct şi icircn combinaţie cu alte materiale Deoarece
structura sa chimică permite combinarea colagenului cu factori de creştere sau alţi agenţi
bioactivi una din cele mai importante aplicaţii ale colagenului este utilizarea lui icircn sisteme de
eliberarea controlată de medicamente membrane de colagen pentru aplicaţii oftalmice structuri
poroase pentru răni şi arsuri diferite geluri etc Remarcabilă este și utilizarea colagenului icircn
ingineria tisulară pentru realizarea unor substituenţi pentru piele a unor substituenţi osoşi sau a
unor valve artificiale [39]
Icircn domeniul ingineriei repararării şi regenerării ţesutului osos colagenul a fost unul dintre
primele biomateriale studiate fiind totodată şi unul din cele mai utilizate materiale de cele mai
multe ori utilizat icircn combinaţie cu alţi biopolimeri şi fosfaţi de calciu sub diverse forme de
prezentare hidrogeluri injectabile membranefilme suporturi poroase microsfere nanosfere
Un hidrogel pe bază de colagen reprezintă un candidat excelent pentru icircncapsularea de celule
datorită capacității sale de umflare icircn apă proprietăților fizice adecvate (de exemplu proprietăți
mecanice capacitatea de gelifiere) conținutului ridicat de apă ce facilitează transportul și
difuzia proprietăților biologice excelente și sensibilitații la degradarea enzimatică [40] De
23
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
exemplu hidrogeluri conținacircnd diferite rapoarte masice chitosancolagenul au fost fabricate icircn
următoarele condiții de sinteză gelifiere inițiată de utilizarea β-glicerofosfat utilizarea unui
mediu osteogenic suplimentar și a unei baze slabe și temperatură variată Prezența colagenului icircn
hidrogel a fost asociată cu creșterea proliferării celulare hidrogelul a fost mai compact rezultacircnd
o matrice rezistentă [41]
Membrane resorbabile pe bază de colagen au fost utilizate icircn ingineria tisulară și
regenerarea osoasă ghidată deoarece de-a lungul timpului numeroase studii au arătat că acestea
sunt biocompatibile și sporesc rata de regenerare Acestea sunt fabricate prin tehnici diverse
fiind adesea utilizate alături de polimeri sintetici de exemplu poli (tetrafluoroetilienă)
Variantele comerciale cele mai icircntalnite de membrane pe bază de colagen utilizate icircn practica
clinică sunt Bio-Gidereg (GeistlichPharma AG Wolhusen Elveția) DuraMatrix-Onlaytrade ndash
membrană pe bază de colagen pentru repararea țesutului dura mater (Collagen Matrix Inc NJ
SUA) TenoMendtrade (Collagen Matrix Inc) OssiPatchtrade ndash membrană protectoare pe bază de
colagen pentru regenerarea osoasă (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) și Collatenetrade
Fibrillar Collagen ndash pansament utilizat pentru afecțiuni maxilo-faciale (Ace Surgical Supply Co
Inc MA SUA)
Suporturile poroase pe bază de colagen au icircn componența lor și particule ceramice icircn acest
fel icircncercacircndu-se o imitare a structurii osului natural Din variantele comerciale cele mai des
utilizate se pot aminti Collagrafttrade (Collagen Corp SUA) ndash care combină hidroxiapatită fosfa
tricalcic cu măducă osoasă de la pacinet și colagen de origine bovină OssiMendtrade Bone Graft
Matrix (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) ndash combină minerale osoase sub formă poroasă
cu colagen și INFUSEreg Bone Graft (Medtronic Sofamor Danek Inc USA) ndash care pe langă un
suport poros pe bază de colagen conțin protein morfogenetice umane recombinate (rhBMP-2)
[40]
Gelatina
Gelatina este un derivat denaturat al colagenului Polielectrolit amfoteric gelatina este un
amestec de fragmente de proteine solubile icircn apă avacircnd aceleaşi secvenţe de aminoacizi ca şi
colagenul structura sa chimică fiind redată icircn figura 19 Colagenul diferă de gelatină prin aceea
că are mai multe structuri terţiare fiind mai puţin solubil icircn soluţii apoase decacirct gelatin [42]
Gelatina poate fi fabricată din diverse surse sursa de provenienţă a gelatinei influențacircnd
24
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţile acesteia Cel mai adesea se fabrică din piele porcină (46) piele bovină (294)
sau oase de origine porcină sau bovină (231) [43] Gelatina este un polimer biodegradabil
biocompatibil non-antigenic are cost scăzut susţine adeziunea celulară migrarea diferenţierea
şi proliferarea celulară Un dezavantaj al acestei proteine este acela că are proprietăţi mecanice
slabe De aceea pentru a fi utilizat la realizarea unor matrici suport pentru ingineria tisulară icircn
special a ţesuturilor dure gelatina se utilizează icircmpreună cu alţi polimeri de exemplu chitosan
unele ceramic (hidroxiapatită fosfat tricalcic) etc [44] [45]
Figura 19 Structura chimică a gelatinei
Albumina serică bovină
Albuminile serice sunt cele mai abundente proteine din sistemul circulator pentru o mare
varietate de organism fiind principalele molecule complexe care contribuie la presiunea arterială
osmotică Datorită potențialului său antioxidant albumina are un rol esențial icircn prepararea
mediilor pentru culturi de celule de mamifere atacirct icircn domeniul cercetării cacirct și icircn domenii
comerciale [46]
Icircn domeniul ingineriei tisulare și domeniul medicinei regenerative albumina serică bovină
ndash BSA este una dintre cele mai studiate proteine din punct de vedere al interacțiunii cu
polizaharidele datorită stabilității sale semnificative a faptului că este ușor accesibilă are o
solubilitate bună icircn apă și datorită asemănării structurale și funcționale cu albumina serică umană
[47]
Icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos albumina serică bovină este utilizată icircn
sisteme complexe pe bază de materiale ceramice Un studiu care evidențiază influența utilizării
albuminei alături de materiale ceramice a fost publicat de Chew și colaboratorii care au
25
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
demonstrat că adăugarea unei concentraţii scăzute de albumină serică bovină este utilă deoarece
susţine creşterea cristalelor de fosfaţi de calciu fiind astfel utilă procesului de mineralizare a
ţesutului osos Icircn comparaţie o concentraţie mare de albumină inhibă cristalizarea fosfaţilor de
calciu [48] Această proprietate a albuminei serice bovine precum și cele menționate anterior a
făcut ca aceasta să fie utilizată de unii autori la sinteza de cimenturi pe bază de fosfaţi de calciu
[49] [50]
De asemnea această proteină a fost utilizată ca adjuvant icircn studii vizacircnd regenerarea
osoasă cu ajutorul unor microsfere hibride alături de poliacrilatalginat de calciu [51]
Fibroină din mătase
Fibroina din mătase produsă de viermi de mătase Bombyx mori este o proteină naturală
cu o foarte bună biocompatibilitate non-toxică biodegradabilă De asemenea prezintă
proprietăţi intrinseci remarcabile şi o bună rezistenţă mecanică Datorită proprietăţilor
menţionate icircn ultimii ani a avut loc o creştere a interesului pentru utilizarea fibroinei din mătase
la obţinerea de suporturi poroase tridimensionale Studii recente au dovedit capacitatea unor
suporturi tridimensionale pe bază de fibroină de a susţine proliferarea celulară icircn aplicaţii vizacircnd
ingineria tisulară a osului a cartilajului şi a vaselor de sacircnge [52]
Figura 110 Structura chimică a fibroinei din mătase
Chitosan
Chitosanul ndash Cs descoperit icircntamplător de către Rouget la mijlocul secolului al XIX lea
este una din cele mai utilizate polizaharide icircn ingineria tisulară şi regenerare osului Acesta este
obţinut din chitină polizaharid structural ce are rol analog cu cel al colagenului icircn regnul animal
superior şi al celulozei icircn plantele Plantele produc celuloză icircn pereţii plantelor iar insectele şi
crustaceele produc chitină icircn aripi respectiv scoici Prin deacetilarea icircntre 40 şi 100 a
chitinei rezultă un polimer format din unităţi de β-(1-4)-2-acetamino-D-glucoză (N-acetil-D-
26
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
glucozamină) şi β-(1-4)-2-amino-D-glucoză (N-D-glucozamină) Icircn afara diferenţei de structură
dintre chitină şi chitosan o altă diferenţă este dată de solubilitatea celor doi biopolimeri chitina
este insolubilă icircn solvenţii uzuali chitosanul dizolvacircndu-se icircn aceştia Structura sa unică
biocompatibilitatea proprietăţi fizico-chimice (solubilitatea biodegradabilitate) versatilitate icircn
termeni de prelucrare proprietăţi multidimensionale şi funcţionalitate icircnaltă fac ca acest
biopolimer să aibă o multitudine de aplicaţii icircntr-o gamă variată de domenii domeniul
biomedical industria farmaceutică industria cosmetică biotehnologii industria alimentară
agricultură şi protecţia mediului [53] [54]
Figura 111 Structura chimică a chitosanului
Icircn ceea ce privește utilizarea chitosanului icircn domeniul regenerării osoase sunt elaborate
studii complexe icircncă de acum cacircteva deceni Borah şi colaboratorii fiind primii care au
demonstrate potenţialul osteogenic al acestuia [55] Au urmat apoi Muzarelli şi colaboratorii care
au realizat studii publicate icircn anii 1993 şi 1994 remarcante din punct de vedere al proprietăţilor
de regenerare osoasă ale chitosanului [56]
Acid hialuronic
Acidul hialuronic ndash Hya este un mucopolizaharid ce face parte din clasa
glicozaminoglicanilor ndash GAG avacircnd cea mai simplă structură chimică din această clasă de
compuși biologici și fiind singurul glicozaminoglican nesulfatat Icircn organismul uman acidul
hialuronic se găseşte icircn lichidul sinovial umoarea vitroasă matricea extracelulară a ţesutului viu
iar icircn cea mai mare cantitate se regăsește icircn piele Hya este componentul principal al matricei
extracelulare a cartilajului articular acţionacircnd ca o ancoră pentru GAG sulfataţi din cartilaj [57]
27
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Este neramificat și inert din punct de vedere imunologic iar spre deosebire de alți GAG
este sintetizat ca un polizaharid liber și nu substituit la o miezul unei proteine [58] Structura
acidului hialuronic este reprezentată de unităţile dizaharidice polianionice acid D-glucoronic şi
N-acetil-D-glucozamină unite alternant prin legături β ndash 14 și β ndash 1-3 glicozidice (figura 112)
Figura 112 Structura acidului hialuronic
Hya se extrage adesea din surse de origine animală creastă de cocoș și umoare vitroasă de
origine bovină icircnsă procesul de izolare din aceste surse este dificil deoarece acesta formează
complexe stabile din punct de vedere chimic cu proteoglicani prezenți icircn țesutul animal fiind
foarte greu de controlat masa moleculară a acesti biopolimer Extragerea acidului hialuronic din
surse microbiene reprezintă o alternativă la metoda de extragere menționată anterior bacteriile
din familia Streptococcilor grupurile A și C producacircnd icircn mod natural o capsulă mucoidă de
acid hialuronic [59]
Icircn ciuda faptului că acidul hialuronic se găsește icircntr-o cantitate mică icircn matricea
extracelulară a ţesutului osos acest polimer este implicat icircn procesele biologice importante ale
osului Poate fi produs de osteoblaste şi osteoclaste fiind găsit şi icircn citoplasma celulelor
osteoprogenitoare și poate lega hidroxiapatita fără să afecteze dezvoltarea minerală Are un rol
important icircn osificarea endocondrală şi a platoului de creştere epifizar fiind găsit icircntr-o
concentraţie mare icircn zona condrocitelor hipertrofice Important de menționat este că acidul
hialuronic se găsește icircn concentraţie mare icircn calusul fracturilor nou formate [57]
28
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Alginații
Alginatul este un polimer anionic natural obținut din diverse specii de alge brune
(Phaeophyceae Laminaria hyperborea Laminaria digitata Laminaria japonica Ascophyllum
nodosum Macrocystis pyrifera) prin tratament cu soluții alcaline apoase cel mai adesea
utilizacircndu-se NaOH De-a lungul timpului a fost intens studiat fiind utilizat icircn prezent icircn
multiple aplicații biomedicale datorită proprietăților care le deține biocompatilitate toxicitate
scăzută costuri de obținere și procesare relativ scăzute [60]
Icircn literatură sunt prezentate rezultatele unor studii prinvind utilizarea alginatului la
fabricarea de suporturi pentru igineria tisulară [61] Hye-Lee și colaboratorii prezintă un studiu
cu privire la prepararea și caracterizarea de suporturi compozite pe bază de nano-hidroxiapatită
alginat și chitosan cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos [62] Icircntr-un alt studiu
Sharma și colaboratorii prezintă fabricare de suporturi nano-biocompozite a căror componente
sunt același ca icircn studiul publicat de Hey-Lee la care se adaugă gelatină procedeul de fabricare
al nano-biocompozitelor fiind unul complex [63]
12212 Polimeri sintetici
Două din cele mai mari avantaje ale polimerilor sintetici sunt reproductibilitate mare şi
posibilitatea de a fi fabricaţi pe scară largă De asemnea pot fi fabricați sub o gamă foarte variată
de forme Icircn comparație cu polimerii naturali este foarte important de menționat faptul că
polimerilor sintetici li se pot controla proprietăţile mecanice şi biodegradabilitatea icircnsă ridică
probleme deoarece nu au activitate biologică şi sunt foarte hidrofobi [64]
Poli (acidul lactic)
Poli (acidul lactic) ndash PLA este unul din cei mai utilizați polimeri sintetici datorită
proprietăților sale mecanice foarte bune fiind utilizat cu succes icircn diverse implanturi medicale
Datorită faptului că PLA are o viteză de degradare in vivo scăzută este cel mai adesea utilizat
pentru fixarea ososă [65] Deoarece prezintă doi carboni asimetrici PLA are trei forme izomerice
D(-)- PDLA L(+)-PLLA şi (DL)- PDLLA Ușurința icircn procesare cristalinitatea precum și viteza
de degradare depind de structura și compoziția lanțurilor polimerice icircn mod particular de
raportul izomerilor PLLA este considerat un homoplimer izotactic semicristalin avacircnd cea mai
mare temperatură de topire dintre cei trei izomeri ai PLA [66]
29
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 113 Structura PLA
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA este un copolimer al poli (acidului lactic) ndash PLA şi
al poli (acidului glicolic) ndash PGA Este utilizat la realizarea de produse farmaceutice și diverse
suporturi pentru ingineria tisulară fiind un polimer biocompatibil și biodegradabil [67]
Suporturile pentru inginerie tisulară pe bază de PLGA au avantajul de a fi degradate icircn mediul de
cultură celular produșii de degradare rezultați fiind lipsiți de toxicitate [68]
Figura 114 Structura PLGA
unde n ndash numărul de unităţi structural de acid lactic şi m ndash numărul de unităţi structurale de acid
glycolic
Poli (caprolactona)
Poli (caprolactona) ndash PCL este un polimer termoplastic biocompatibil avacircnd temperaturile
de topire şi de vitrifiere scăzute Este cristalin şi hirofob caracteristici ce conduc la o viteză de
degradare scăzută De asemenea are proprietăţi mecanice constante icircn timp Proprietăţile
prezentate fac ca acest polimer să fie adesea utilizat icircn ingineria tisulară [69]
30
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 115 Structura PCL
Poli (3- hidroxibutiratul)
Poli (hidroxialcanoaţii) ndash PHA sunt o clasă de poliesteri naturali produși de o varietate de
microorganisme Primul polihidroxialcanoat descoperit și totodată cel mai studiat este poli-3-
hidroxibutiratul ndash P(3HB) a cărui structură chimică este redată icircn figura 116 [70]
Figura 116 Structura P(3HB)
12213 Biomateriale cermice
Din categoria suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă biomaterialele
ceramice reprezintă o categorie foarte importantă cele mai multe variante comerciale pentru
aplicația vizată icircncadracircndu-se icircn această categorie Compoziţia şi morfologia acestor
biomateriale au o influență esențială asupra răspunsului tisular Icircn majoritatea cazurilor sunt non-
imunogenice nu provoacă reacții inflamatoare și sunt non-citotoxice Icircn practica clinică
ceramicele sunt utilizate icircntr-o mare varietate de aplicații biomateriale pentru regenerarea
articulaţiei artificiale a şoldului biomaterialele de reconstrucţie osoasă implanturi pentru
icircnlocuirea celor trei oscioare de la nivelul urechii (ciocănş nicovală şi scăriţă) rădăcini dentare
artificiale şi ceramice pentru diverse tratamente medicale [71]
31
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Ceramicile utilizate la fabricarea de implanturi se clasifică icircn ceramice neresorbabile
(bioinerte) ceramice bioactive sau cu suprafaţa activă (semi-inerte) şi ceramice biodegradabile
sau resorbabile (non-inerte)
Ceramicele neresorbabile inerte sunt stabile la interacţiunea cu mediul fiziologic şi nu
prezintă bioactivitate sau efecte dăunătoare pentru organismul uman cele mai reprezentative
fiind alumina ndash Al2O3 zirconia ndash ZnO2 carbonul și nitrura de siliciu Ceramicele bioactive
semi-inerte sunt ceramice desemnate să inducă o activitate biologică specifică avacircnd
capacitatea de a se lega direct la os caracteristică deosebit de importantă şi unică icircn racircndul
tuturor tipurilor de biomateriale Din categoria ceramicelor bioactive semi-inerte fac parte
apatitele sticlele bioactive şi sticlele ceramice bioactive Fosfaţii de calciu chiar daca fac parte
din clasa apatitelor se icircncadrează icircn categoria ceramicelor resorbabile [72] [73]
Sticlele bioactive au fost inventate de către Hench Universitatea din Florida icircn 1971
Acestea au drept compoziţie de bază SiO2-CaO-Na2O-P2O5 și la fel ca ceramicile bioactive au
capacitatea de a se lega de os fară a exista conexiuni tisulare fibroase icircntre ele Bioglassreg
45S5
este prima şi cea mai studiată sticlă bioactivă Bioglassreg S53P4 este o altă sticlă bioactivă
utilizată icircn ortopedie ca şi substituent osos sub varianta comercială BonAlivereg (Vivoxid
Finlanda) [74]
Sticlele bioactive ceramice se obţin prin precipitarea icircn sticlele bioactive a unei faze
cristaline rolul acestei etape de sinteză fiind de a mări rezistenţa mecanică a acestora din urmă
Spre deosebire de sticlele bioactive obișnuite au o bioactivitate mai scăzută dar au o rezistenţă
mecanică superioară Sunt utilizate la realizare vertebrelor artificiale spaţiului intervertebral
artificial şi a unor materiale de umplere poroase sau granulare [75]
Fosfați de calciu
Fosfații de calciu reprezintă componenta majoră a țesutului dur al vertebratelor
componenta anorganică (minerală) a osului avacircnd icircn compoziție nanocristale non-
stoichiometrice de apatită avacircnd următoarea formulă chimică
Ca10-x(PO4)6-x(HPO4CO3)x(OHF)2-x
unde 0lexle2 O particularitate aparte a structurii apatitelor este capacitatea lor de a putea
icircncorpora multe tipuri de ioni organici sau anorganici Astfel s-a dovedit că fosfați de calciu
32
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanocristalini non-stoichiometrici atacirct biologici cacirct și sintetici icircncorporează icircn structura lor ioni
din mediu chimic care nu corespund apatitelor acești ioni fiind denumiți non-apatitici [76] Icircn
tabelul 13 sunt prezentați diferite tipuri de fosfați de calciu
Tabel 13 Diferite forme de fosfaţi de calciu abrevierea lor formula chimică raportul
CaP mineral (dacă există) [77] [78]
Denumire Abreviere Formulă chimică Raport
CaP Mineral
Fosfat monocalcic
monohidrat MCPM Ca(H2PO4)2 H2O 05 ndash
Fosfat monocalcic
anhidru MCPA Ca(H2PO4)2 05 ndash
Fosfat dicalcic
anhidru DCPA CaHPO4 100 Moneit
Fosfat dicalcic
dihidrat DCPD CaHPO4 2H2O 100 Bruțit
Fosfat octocalcic OCP Ca8H2(PO4)6 5H2O 133 ndash
α-Fosfat tricalcic α-TCP α-Ca3(PO4)2 15 ndash
β-Fosfat tricalcic β-TCP β-Ca3(PO4)2 15 ndash
Hidroxiapatită
deficită icircn calciu CDHap Ca9(HPO4)(PO4)5OH 15 ndash
Hidroxiapatită
precipitată Hap
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x
unde 0lexle2
xx(OH)2-x
133 ndash167 ndash
Hidroxiapatită
sinterizată SHA Ca10(PO4)6(OH)2 167 Hidroxiapatită
Oxiapatită OXA Ca10(PO4)6O 167 ndash
Fosfat tetracalcic TeTCP Ca4(PO4)2O 20 Hilgenstockite
Hidroxiapatita este utilizată destul de des icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos
datorită similarității dintre compoziția sa și cea a fazei minerale a osului uman Faza minerală a
osului uman are formula chimică asemănătoare ce cea a hidroxiapatitei deficitară icircn calciu avacircnd
grupările OH- parțial substituite cu grupări CO3
2- Structura cristalină a hidroxiapatitei poate fi
descrisă ca un aranjament hexagonal unde cationii sunt orientați pe planurile tetraedral și
octaedral Icircn ultimii ani diverse suporturi ceramice pe bază de hidroxiapaptită au fost realizate
Cu toate că acestea prezintă proprietăți foarte bune pentru aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului
osos porozitate ridicată osteointegrare bună totuși au diverse neajunsuri icircn ceea ce privește o
refacere completă a defectelor ososoase [79]
33
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1222 Suporturi biomimetice pentru ingineria tisulară şi regenerarea osoasă
12221 Caracteristici ale suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Suporturile realizate pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă trebuie să aibă o serie
de proprietăți foarte importante pentru a putea fi utilizate cu succes proprietăți prezentate
schematic icircn figura 117
Figura 117 Proprietățile unui suport ideal realizat pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Icircn primul racircnd suporturile trebuie să aibă o serie de proprietăți biologice care sunt
esențiale pentru obținerea unor rezultate promițătoare biocompatibilitatea și bioactivitatea fiind
două din cele mai importante Un suport este considerat biocompatibil dacă nu are răspuns
imunogenic și nu are componente toxice sau inflamatoare care vor conduce la o rejecție
imunologică Bioactivitatea se referă la interacțiunea suportului cu țesutul gazdă și integrarea
acestuia De asemenea din punct de vedere al bioactivității suporturile trebuie să fie
osteoconductive osteoinductive și osteogenice Biodegradabilitatea o altă proprietate biologică
foarte important constă icircntr-o degradare controlată a suportului pe măsură ce se formează țesut
34
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nou menținacircnd totodată suport suficient pentru regenerarea completă a țesutului afectat Lipsa
unor produși de degradare toxici este o altă caracteristică care definește biodegradabilitatea [80]
Proprietăţile de suprafaţa sunt și ele esențiale la fel și proprietăţile morfologice pori
interconectați structură tridimensională microporozitatea macroporozitatea dimensiunea
porilor adaptată fiecărui tip de țesutcelule Porii trebuie să fie interconectați pentru a permite
difuziunea și migrarea celulelor iar dimensiunea porilor trebuie să fie adaptată fiecărui tip de
țesutcelule Microporozitate oferă o suprafață care permite interacțiunile celule-matrice și
macroporozitate permite migrarea celulelor și invazia vaselor de sacircnge Porozitate adecvată
permite creșterea celulelor fără să afecteze proprietățile mecanice
Suporturile trebuie să aibă proprietăţi mecanice similare cu cele ale ţesutului lacircngă care
sunt implantate mai concret trebuie să aibă rezistență la diverse solicitări biomecanice
comparabile cu ale osului uman pentru a permite mecano-reglarea celulară și păstrarea
integrității in vivo [34] [35]
12222 Metode de obținere a suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Metodele convenționale de obținere a suporturilor includ prelucrarea prin turnare icircn
solvent și solubilizarea a particulelor liofilizarea separarea fazelor indusă termic metoda de
formare a spumelor din fază gazoasă formarea prin pulverizare formarea prin tehnica sol-gel
electrofilarea și altele
Icircn cazul metodei prin turnarea icircn solvent și solubilizare a particulelor o soluție de polimer
este introdusă icircntr-o solvent cu particule de săruri avacircnd dimensiuni specifice dispersate
uniform Solventul se va evapora rezultacircnd un suport cu particule icircncorporate Suportul este
imersat apoi icircn apă particulele fiind solubilizate uneori se folosește și icircncălzirea pentru o
solubilizare completă rezultacircnd icircn final o structură cu porozitate ridicată Rezprezentarea
schematică a metodei este redată icircn figura 118 Dezavantajele metodei de formare a suporturilor
sunt formarea unor suporturi cu formă prestabilită și citotoxicitatea suporturilor datoră
rezidurilor de solvent
35
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 118 Obținerea suporturilor prin turnare icircn solvent și solubilizarea particulelor
Liofilizarea are la bază procesul de sublimare care se referă la trecerea apei din fază solidă
icircn fază gazoasă Suporturile obținute prin liofilizarea prezintă o structură poroasă cu pori
interconectați avacircnd dimensiuni medii icircn jur de 300 nm (figura 119) dimensiuni ce depind de
natura componentelor suportului Dezavantajele acestei metode sunt timpul icircndelungat necesar
obținerii suportului și faptul că pori rezultați nu au dimensiuni regulate
Figura 119 Obținerea suporturilor prin liofilizare
36
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Metoda de formare a suporturilor din spume gazoase a fost dezvoltată pentru a icircnlătura
utilizarea solvenților organici citotoxici Polimeri biodegradabili dizolvați icircn apă sau fluoroform
sunt ținuți sub presiune cu diverși agenți gazoși inerți (azot dioxid de carbon) pacircnă cacircnd soluția
este saturată și plină de bule de gaz Tehnica are drept rezultat suporturi poroase cu dimensiuni
medii a porilor icircn intervalul 30-700 microm și o porozitate ridicată de pacircnă la 85
Tehnica sol-gel se bazeză pe polimerizarea anorganică a metalelor alcaloide O soluție (sol)
este format prin adăugarea unui surfactant după care vor urma reacțiile de condensare și
gelifiere [81]
Tehnica de electrofilare a fost inventată icircn 1934 de către Formhals și se bazează pe un
cacircmp electric ce impune o icircntindere uniaxală a unui jet vacircscoelastic provenit dintr-o soluție de
polimer ce icircși reduce continuu diametrul icircn final rezultacircnd nanofibre Este o tehnică simplă și
rentabilă pentru prepararea nanofibrelor polimerice cu diameter cuprinse icircntre 3 nm și 5 μm
(figura 120) Proprietățile nanofibrelor electrofilate sunt influențate de mulți factori cum ar fi
proprietățile polimerului proprietățile solventului aditivii concentrația polimerului proprietățile
soluției și așa mai departe [82]
Figura 120 Obținerea suporturilor prin liofilizare
Există și tehnici moderne de sinteză a suporturilor pentru regenerarea osoasă denumite
tehnici de prototipare rapide Dintre acestea cele mai utilizate și cele care oferă pacircnă icircn present
rezultatele cele mai promițătoare sunt sinterizarea selectivă cu laser stereolitografia imprimarea
tridimensională (3D) bio-imprimarea [81]
37
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
12223 Suporturi biomimetie pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu pentru
regenerarea osoasă
Suporturi biomimetice
Icircn general metodele de regenerare osoasă sunt de preferat metodelor de icircnlocuire osoasă
datorită neajunsurilor celor din urmă Un număr mare de studii icircn domeniul ingineriei tisulare și
regenerare a osului au evidenţiat importanţa critică a caracteristicilor arhitecturii suporturilor
utilizate icircn domeniu
Ţesuturile vii sunt caracterizate de o arhitectură ierarhică tridimensională şi un
micromediu unic ce uşurează intercaţiunea celulelor cu molecule semnal componentele matricei
extracelulare şi unele molecule mici Acest micromediu complex controlează procesele celulare
importante pentru morfogeneza ţesutului şi menţine proliferarea diferenţierea şi migrarea
celulară Ingineria tisulară convenţională a icircncercat să imite proprietăţile ţesutului osos nativ doar
la nivel micromolecular şi macromolecular fiind neglijate icircnsă structurile de la nivel
submicromolecular şi nanomolecular [83]
De asemenea numeroase studii icircn acest domeniu au arătat că nu este suficientă realizarea
unor suporturi pentru regenerarea osoasă luacircnd icircn considerarea doar compoziţia chimică a
osului deoarece acestea nu vor avea proprietăţi mecanice similare cu ale osului natural şi vor
afecta metabolismul acestuia cacircnd vor fi implantate in vivo
Pentru realizarea unui substituent osos care să poată fi aplicat cu succes pentru tratarea
unor defecte osose de diferite cauze trebuie să se ţină cont atacirct de compoziţia naturală a osului
dar cel mai important trebuie să se imite nanostrucutura lui deoarece arhitectura nanostructurală
a osului este esenţa lui atacirct icircn ceeea ce priveşte proprietăţile mecanice cacirct şi bioresorbabilitatea
Realizarea unor matrici de colagen icircn care s-a icircncercat reproducerea mineralizării intrafibrilare a
dus la obţinerea unor suporturi ce pot fi aplicate cu succes icircn ingineria tisulară și regenerarea
ţesutului osos [84]
Avacircnd icircn vedere aspectele mai sus menționate se poate spune că suporturilor preparate
plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important imitacircnd nanostructura sa sunt
suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg procesele substanţele dispozitivele
sistemele facute de om care imită natura [85]
38
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Suporturi compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
Compozitele sunt materiale solide ce au la bază o combinație de minim două materiale cu
propietăți diferite dezavantajele individuale ale acestora sunt diminuate fiind păstrate și puse icircn
valoare doar avantajele fiecărui componet al compozitului
Icircn ingineria tisulară și medicina regenerativă se utilizează mai multe varinte de
compozite co-polimeri polimer ndash polimer sau polimer ndash ceramice Unul din cei mai utilizați co-
polimeri icircn ingineria tisulară osoasă este poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA Compozitele
polimer sintetic ndash polimer sintetic sunt amestecuri de minim doi polimeri sintetice un exemplu
fiind compozitul pe bază de PLGA și polifosfazene asocierea acestora avacircnd drept obiectiv
principal obținerea unor produși de degardare neutri Se pot combina și polimeri sintetici cu
polimeri naturali pentru realizarea de compozite de exemplu PLGA și colagen
Compozitele polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje
care pleacă de la faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele
matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă) De-a lungul timpului au fost studiate și compozite
polimeri sintetici ndash ceramice de exemplu compozite pe bază de poli (acid lactic) poli (acidul
lactic-co-glicolic) hidroxiapatită dar studiile concentrate pe compozitele polimeri naturali ndash
ceramice au avut cele mai bune rezultate de-a lungul timpului [34]
Avantajele unui compozit pe bază de biopolimeri și ceramice ar fi pe de o parte
proprietățile mecanice variabile degradarea controlată și structura fizică a polimerilor iar pe de
altă parte rezistența și natura biomimetică a ceramicelor Combinarea de biopolimeri cu
ceramice elimină un mare dezavantaj al acestora din urmă și anume faptul că sunt casante dar
totodată crește bioactivitatea și capacitatea de transport și eliberare de agenți bioactivi [75]
Compozitele pe bază de colagen și hidroxiapatită au fost de-a lungul timpului cele mai
studiate compozite biopolimeri ndash ceramice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
13 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Icircn ultimii ani interesul pentru nanotehnologie a crescut semnificativ Particulele magnetice
fac parte din grupul materialelor utilizate icircn nanotehnologii cu un impact considerabil icircn diverse
domenii chimie biosenzori nanomedicină etc Cele mai importante aplicații ale lor sunt legate
39
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de obținerea particulelor de dimensiuni nanometrice denumite nanoparticule magnetice ndash MNPs
utilizate ca metode de diagnostic prin separarea magnetică a unor entități biologice utilizarea icircn
scop terapeutic și ultima aplicație aceasta fiind una din cele mai des folosite icircn medicină
utilizarea la rezonanța magnetică nucleară [86]
Utilizate icircn scop terapeutic nanoparticulele magnetice au fost evaluate pentru eliberarea
controlată de medicamente Prin utilizarea atracției magnetice sau a direcționării specifice a unor
biomarkeri tumorali nanoparticulele magnetice oferă o soluție atractivă pentru terapia directă cu
agenți chimioterapici care vor fi eliberați icircntr-un loc specific doză de medicament care ar fi fost
utilizată icircn mod curent fiind astfel redusă semnificativ și o dată cu ea efectele adverse asociate
cu absorbția de către țesuturi sănătoase a medicamentului [87]
MNPs folosite icircn aplicaţiile biomedicale trebuie să fie superparamgnetice adică să aibă
proprietatea de a putea fi magnetizate doar icircn prezenţa unui cacircmp magnetic extern De asemenea
trebuie să aibă dimensiuni mici pentru a nu fi eliminate din circulaţie de către ficat sau splină
după ce cacircmpul magnetic este icircnlăturat Icircn general cu cacirct particulele au dimensiuni mai mari cu
atacirct este mai mic timpul lor de icircnjumătăţire icircn plasma
Cele mai utilizate surse de materiale magnetice sunt oxizii de fier cu structură de miez ce
au mai multe forme cristaline polimorfe hematită α-Fe2O3 maghemită β-Fe2O3 γ- Fe2O3 şi
magnetită ε-Fe2O3 Fe3O4 precum şi alte forme amorfe Singurele utilizate icircn aplicaţiile medicale
sunt maghemita şi magnetita Pentru realizarea miezului magnetic a unor nanoparticule
magnetice se utilizează icircn unele aplicaţii şi fierul carbonil datorită dimensiunilor mici ale
particulelor sale [88] [89]
Pentru a icircmbunătăţi proprietăţile fizice şi chimice ale particulelor magnetice acestea sunt
adesea acoperite cu silica polimeri anumiţi surfactanţi sau diverşi compuşi organici Acoperirea
cu polimeri oferă o serie de avantaje nanoparticulelor magnetice numărul mare de grupări
funcţionale ale polimerilor permite alte funcţionalizări ale particulelor toxicitatea este complet
redusă are rol icircn stoparea procesului de oxidare etc Datorită atracţiei puternice dipol-dipol
dintre particule MNP tind să se aglomereze dar pentru a icircnlătura acest dezavantaj MNP sunt
acoperite cu polimeri hidrofilici cum sunt dextranul şi chitosanul Grupările funcționale ale
chitosanului permit funcționalizarea nanoparticulelor cu diverși agenți bioactivi prin stabilirea de
legături chimice icircntre grupările chitosanului și cele ale agentului
Reprezentarea unei nanoparticule magnetice acoperită cu polimer este redată icircn figura 121
40
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 121 Reprezentarea schematică a unei nanoparticule acoperite cu polimer cu funcții
aminice
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular cercetările
științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind cel de eliberarea
de principii active controlată și țintită
Nanoparticulele sunt integrate prin diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale
pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă
creștere deorece studii mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația
vizată
Icircn urma unui studiu de literatură amănunţit se poate realiza o clasificarea a suporturilor
magnetice pe bază de biomateriale cu aplicaţii icircn ingineria tisulară şi regenerarea osoasă icircn
funcţie de compoziție și icircn funcție de forma de prezentare
Icircn funcție de compoziție suporturile magnetice se pot clasifica icircn suporturi magnetice cu
biopolimeri care se clasifică la racircndul lor icircn suporturi magnetice pe bază de proteine şi suporturi
magnetice pe bază de polizaharide suporturi magnetice cu polimeri sintetici suporturi magnetice
cu materiale ceramice Icircn funcție de forma de prezentare suporturile magnetice se clasifică icircn
suporturi magnetice poroase hidrogeluri magnetice membrane magnetice nanofibroase și sticle
bioactive magnetice (figura 122)
41
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 122 Clasificarea suporturilor magnetice
131 Suporturi magnetice cu biopolimeri
1311 Suporturi magnetice cu proteine
Colagenul gelatina și fibroina din mătase sunt trei din proteinele cele mai utilizate icircn
sinteza de suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi magnetice cu colagen
Unul din primele studii ce prezintă conceptul de suporturi magnetice a fost publicat icircn
2010 de Bock şi colaboratorii [90] prezentacircnd realizarea şi caracterizarea a două tipuri de
suporturi magnetice Primul tip de suport a fost obţinut din hidroxiapatită şi colagen (7030 ww)
reticulat cu 14-butandiol diglicidil eter sub formă de structuri liofilizate microporoase şi
macroporoase avacircnd diametrul de 122plusmn08 mm şi icircnălţimea 47plusmn08 mm Al doilea tip de suport
a fost obţinut din 100 colagen liofilizat sub formă de structuri poroase omogene cu diametrul
42
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de 123plusmn1 mm şi icircnălţime 28plusmn09 mm Icircn vederea magnetizării ambele tipuri de suporturi au
fost imersate pentru 15 min icircn 1ml fero-fluid trei tipuri diferite de fero-fluide fiind utilizate
(figura 123) Fero-fluidele reprezentacircnd nanoparticule magnetice cu dimensiunea de 200 nm
dispersate icircn apă au fost notate FF-DXS (nanoparticule de magnetită acoperite cu sulfat de
dextran și funcționalizate cu grupări funcționale de sulfat de sodiu) FF-PAA (nanoparticule de
magnetită acoperite cu acid poli-DL-aspartic și funcționalizate cu carboxilat de sodiu) și FF-DP
(nanoparticule de magnetită acoperite cu amidon și funcționalizate cu grupări fosfat)
Figura 123 Reprezentarea schematică a procedeului de preparare a suporturilor magnetice [90]
Valorile obținute pentru magnetizarea suporturilor sunt considerate potrivite pentru
generarea de gradient magnetic icircn suport precum și icircn vecinătatea acestuia Studiile in vitro de
biocompatibilitate au dovedit că suporturile magnetice obținute susțin adeziunea și proliferarea
celulelor stem Icircn concluzie suporturile obținute au potențialul de a fi considerate substituenți
osoși avacircnd ca și noutate față de variantele standard proprietatea de a atrage particule magnetice
funcționalizate cu medicamente [91]
Icircn 2013 Panseri și colaboratorii [92] descriu icircntr-un studiu obținerea și caracterizarea de
suporturi magnetice obținute prin două metode diferite metoda A și metoda B Metoda A are la
bază magnetizarea in situ și constă icircn nucleația de apatită biomimetică și 7 nanoparticule
magnetice (cu dimensiunea mai mică de 50 nm achiziționate de la Sigma Aldrich) pe fibrile de
colagen autoasamblate Metoda B reproduce procedeul de obținere descris icircn studiul mai sus
43
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
menționat (Bock și colaboartorii) un suport poros pe bază de hidroxiapatită și colagen fiind
imersat icircn fero-fluidul FF-DP Din datele de microscopie electronică de baleiaj (SEM) autorii au
observat icircn cazul suporturilor obținute prin metoda A o distribuție omogenă a nanoparticulelor
magnetice pe fibrele de colagen iar icircn cazul suporturilor obținute prin metoda B o aglomerare a
nanoparticulelor Teste in vivo complexe au fost realizate utilizacircnd suporturile obținute
rezulatele indicacircnd potențialul acestora de a fi utilizate icircn aplicații ale ingineriei tisulare a
țeustului osos Icircntr-un studiu următor autorii funcționalizează hidroxiapatita cu ioni de fier (Fe2+
şi Fe3+
) conferindu-i astfel proprietăţi superparamagnetice şi totodată diminuacircnd potenţialul
citotoxic ce poate fi uneori dat de magnetită sau de unii oxizi de fier
Suporturi magnetice cu gelatină
Samal şi colaboratorii [93] evidenţiază obţinerea şi caracterizarea de suporturi magnetice
pe bază de gelatină Soluţii de gelatină amestecate cu concentraţii diferite de fero-fluid (particule
de magnetită acoperite cu acid poli-acrilic dispersate icircn apă) au fost transferate icircn plăci de
polistiren cu mai multe straturirezultacircnd membrane ce au fost apoi legate chimic cu ajutorul
carbodiimidelor icircn vederea obţinerii suporturilor
Gelatina a fost utilizată şi de Dashnyam şi colaboratorii [94] pentru obţinerea unor
suporturi magnetice hibride Suporturile au fost obţinute din gelatină şi siloxan printr-un
procedeu sol-gel icircn timpul căruia au fost icircncorporate 3 nanoparticule magnetice ultimul pas
pentru obţinerea unor suporturi foarte poroase a fost liofilizarea Icircn urma unor teste mecanice
efectuate autorii au observat o icircmbunătăţire semnificativă a proprietăţilor mecanice ale
suporturilor datorită icircncorporării de nanoparticule magnetice icircn strucura acestora Icircn cadrul
studiului au fost realizate teste de populare cu celule (stem mezenchimale izolate din şobolan) a
suporturilor avacircnd nanoparticule magnetice icircncorporate precum şi a suporturilor fară
nanoparticule magnetice icircncorporate rezultatele indicacircnd o proliferare celulară icircmbunătăţită icircn
cazul primelor suporturi menţionate
Suporturi magnetice cu fibroină din mătase
Icircntr-un studiu publicat recent fibroina a fost utilizată icircmpreună cu chitosan şi nanoparticule
magnetice pentru realizarea unor suporturi cu porozitate controlată cu aplicaţii icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos O soluţie de fibroină şi chitosan a fost preparată avacircnd raportul masic
44
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
31 şi reticulată cu o soluţie 08 glutaraldehidă Patru fero-fluide avacircnd concentraţiile
nanoparticulelor magnetice 0 05 1 şi 2 au fost adăugate icircn soluţia de polimeri iar
soluţiile astfel obţinute au fost transferate icircntr-o matriţă de politetrafluoretilină aşezată icircntr-o
placă de cupru rece a cărui temperatură a fost controlată cu azot lichid Cristale de gheaţă
unidirecţionale s-au format cu o viteză de solidificare de 1degCminut soluţia icircngheţată rezultată
fiind icircntr-o ultimă etapă liofilizată (figura 124)
Activitatea fizico-chimică a suporturilor obţinute a fost studiată icircn soluţii saline de tampon
fosfat pentru a determina retenţia de fluide şi biodegradarea Stabilitatea nanoparticulelor
magnetice din suporturile obţinute a fost analizată utilizacircnd Spectroscopie de absorbţie atomică
Toate cele patru suporturi realizate s-au dovedit a avea o bună biocompatibilitate icircn urma
testelor MTT [95]
Figura 124 a) Reprezentarea schematică a procesului de obținere asuporturilor b) Structurile
chimice al polimeriloragentului reticulant și interacțiunile dintre aceștia c) Dimensiunea
suporturilor și diferența de culoare dată de variația concentrației de nanoparticule magnetice
d) Suportul este atras de un magnet permanent [95]
Suporturi magnetice pe bază de fibroină din mătase au fost realizate şi caracterizate de
Samal şi colaboratorii Nanoparticulele magnetice au fost integrate icircn suporturi prin imersare
rezultacircnd diferite grade de magnetizare Suporturile obţinute s-au dovedit a avea foarte bune
45
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţi de hipertermie ajungacircnd la temperaturi ce au crescut cu 8degC icircn 100 secunde Testele
de biocompatibilitate au indicat lipsa citotoxicităţii suporturilor precum şi capacitatea acestora de
a susţine adeziune şi proliferarea celulară [96]
Hidrogeluri magnetice au fost obţinute printr-un proces de electro-gelifiere a unui soluţii
concentrate de fibroină din mătase (8 ) cu scopul de a fi utilizate ca şi suporturi icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos Patru feluri de suporturi au fost realizate suporturi avacircnd icircncorporate
nanoparticule magnetice (Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice acoperite
cu albumină serică umană (HSA-Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice
acoperite cu albumină serică umană şi conjugate fizic cu factori de creştere fibroblastici bazali
(HSA-Fe3O4-bFGF) şi suporturi fără niciun fel de nanoparticule magnetice Morfologia
suporturilor a fost studiată cu ajutorului microscopiei electronice de baleiaj Citotoxicitatea lor a
fost analizată printr-un test MTT realizat pe osteoblaste de linie iar activitatea osteogenică a fost
studiată din punct de vedere a fosfatazei alcaline a cantităţii de calciu mineralizat şi a
colagenului Analizacircnd rezultatele testelor menţionate autorii consideră că suporturile obţinute
pot fi utilizate pentru aplicaţia vizată [97]
1312 Suporturi magnetice cu polizaharide
Chitosanul este polizaharidul cel mai utilizat icircn studiile privind sinteza și caracterizarea de
suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi biocompozite magnetice pe bază de chitosan şi carboximetilceluloză au fost
obţinute şi caracterizate de către Grumăzescu şi colaboratorii [98] Carboximetilceluloza cel mai
utilizat eter de celuloză este o polizaharidă cu lanţ liniar solubilă icircn apă datorită grupărilor
carboximetil (CH3COONa) introduse icircn molecula de celuloză Deoarece are icircncărcătură electrică
opusă chitosanului reacţionează puternic cu acesta utilizacircndu-se ca agent de reticulare ionic la
anumite valori ale pH-ului Autorii au studiat morfologia suporturilor eficacitatea utilizării
acestora ca şi sisteme de eliberare controlată de antibiotice in vitro precum şi intercaţiunea lor cu
celule eucariotice Rezultate studiilor menţionate au demonstrat că suporturile magnetice
biocompozite propuse de autori pot fi utilizate cu succes icircn viitor icircn domeniul medical icircn
special icircn ingineria tisulară
Heidari şi colaboratorii [99] prezintă icircntr-un studiu recent prepararea in situ a unor
nanoparticule de oxid de fier icircn matrici de hidroxiapatităchitosan pentru aplicaţii icircn ingineria
46
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
ţesutului osos Atacirct hidroxiapatita cacirct şi chitosanul au fost extrase din surse naturale os cortical
bovin pentru hidroxiapatită respectiv creveţi pentru chitosan Două cloruri de fier (FeCl2 FeCl3)
au fost dizolvate icircn soluţie de acid acetic sub agitare magnetică pentru 30 min S-a adăugat apoi
pulbere de hidroxiapatită iar după dizolvarea pentru o oră a acesteia s-a adăugat chitosan şi s-a
lăsat la solubilizat pentru icircncă o oră Alte etape au urmat obţinacircndu-se o matrice gel ce a fost
uscată icircn etuvă la 60degC pentru 24 ore Compozitele tridimensionale obţinute au fost supuse unui
număr foarte mare de analize distribuţia particulelor magnetice icircn funcţie de mărime a fost
analizată cu ajutorul unui analizor de particule şi cu ajutorul microscopiei electronice de
transmisie (TEM) morfologia probelor a fost analizată utilizacircnd SEM proprietăţile magnetice au
fost studiate cu ajutorul unui magnetometru cu vibraţii simple (VSM) şi multe altele
Y Wei și colaboratorii [100] publică un studiu icircn care prezintă fabricarea și caracterizarea
de membrane nanofibroase pe bază de oxizi de fier (Fe3O4) chitosan și polialcool vinilic
Chitosanul (CS) și alcoolul polivinilic (PVA) au fost dizolvate separat icircntr-o soluție de acid
acetic iar apoi au fost amsetecate icircn raport de masă CSPVA= 23Nanoparticule pe bază de
Fe3O4 obținute printr-o metodă de co-precipitare au fost adăugate icircmpreună cu etanol icircn
amestecul polimeric Membranele magnetice nanofibroase Fe3O4CSPVA au fost obținute prin
electrofilarea soluției polimerice conținacircnd Fe3O4 Datorită procesului de electrofilare s-a obținut
o porozitate foarte bună a membranelor 839-851 Datele TEM au arătat o distribuiție uniform
a nanoparticulelor magnetice Datele de spectroscopiei icircn infraroșu cu transformată Fourier
(FTIR) și datela de difracției cu raze X (XRD) au demonstrat că structura chimică și
cristalinitatea probelor nu a fost afectată de procesul de electrofilare De asemenea proprietățile
mecanice proprietățile magnetice și interacțiunea cu osteoblaste aparținacircnd linie de celule
tumorale MG-63 au sugerat că membranele magentice obținute au un real potential pentru
viitoare aplicații privind regenerarea osoasă
132 Suporturi magnetice cu polimeri sintetici
Icircn ultimii 100 ani materialele sintetice sunt utilizate pentru repararea şi regenerarea unei
varietăţi de ţesuturi şi organe [101] Deoarece in vivo osul este adesea supus forţelor mecanice
rezultate icircn urma acţiunii muşchilor şi a mişcărilor corpului una din cerinţele de bază impuse
unui suport realizat cu scopul de a fi utilizat icircn ingineria tisulară a ţesutului osos este aceea de a
fi capabile să suporte stimulii mecanici Biomaterialele sintetice rezultate icircn urma polimerizării
47
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
acidului lactic a acidului glicolic sau a caprolactonei sunt studiate pentru realizarea de suporturi
compozite de obicei icircn combinaţie cu polimeri naturali [102]
Poli (acidul lactic)
Suporturile magnetice pe bază de PLA sunt icircn prezent puțin studiate unul din puținele
studii pe această temă fiind publicat icircn 2007 Lucrarea respectivă se concentrează pe analiza
influenței orientării fibrelor unui suport magnetic pe bază de poli (acid L-lactic) ndash PLLA obținut
prin procedeul de electrofilare asupra proprietăților sale mecanice Pentru realizarea suportului
o soluție de 3 PLLA icircn hexafluoro-2-propanol a fost amestecată cu nanoparticule de magnetită
(Fe3O4) icircn raport PLLAFe3O4 - 955 Amestecul a fost sonicat și apoi electrofilat S-a studiat
morfologia suporturilor obținute interacținuea cu celule precum și rezistența mechanică [102]
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Suporturi nano-compozite superparamagnetice pe bază de PLGA pentru ingineria tisulară
au fost realizate de Lai și colaboratorii Icircntr-o primă etapă PLGA și nanoparticule de magnetită
superparamagnetice hidrofobe (MNPs) au fost amestecate separat icircn diverse rapoarte masice (19
și 11) Icircn a doua etapă cele două amestecuri au fost transferate separat icircntr-o seringă de sticlă de
10 ml conectată la un ac cu dimensiunea de 6 gauge Un electrod a fost montat la ac iar
amestecul respectiv a fost electrofilat icircn timpul procesului tensiunea fiind păstrată constantă la
20 kV viteza de filare fiind de 1 mlH Icircn funcție de raportul PLGA MNPs s-au obținut două
suporturi diferite PLGA-10 MNPs și PLGA-50 MNPs Datele SEM și TEM au evidențiat o
dimensiune a fibrelor suporturilor de 400-600 nm cu MNPs distribuite uniform Suporturile
compozite s-au dovedit a avea o biocompatibilitate excelentă susținacircnd semnificativproliferarea
celulară [103]
Poli (caprolactona)
Unul dintre primele studii care prezintă suporturi magnetice pe bază de PCL a fost
prezentat de Kim și colaboratorii [104] Pentru realizarea suporturilor s-a preparat icircntr-o primă
etapă o soluție de 10 PCL (cu masa molară 80 kDa) icircn cloroform După solubilizare completă
icircn soluția de 10 PCL s-au adăugat două concentrații diferite de nanoparticule magnetice
(MNPs) 05 și 10 față de cantitatea de PCL solubilizată Icircn funcție de concetrația de
48
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanoparticule adăugate suporturile au fost notate PCL-MNP5 (5 MNP) PCL-MNP10 (10
MNP) și PCL (nu conține MNPs) După ultrasonicare soluțiile au fost icircnghețate la -70degC iar
apoi liofilizate pentru 3 zile Adăugarea de MNPs icircn suporturile pe bază de PCL a condus la o
icircmbunătățire a hidrofilicității precum și a proprietăților mecanice a acestora Autorii au
demonstrat că suporturile PCL-MNP au capacitatea de a susține adeziunea celulară precum și
mineralizarea avacircnd o bună biocompatibilitate Suporturi realizate după același protocol
prezentat icircn studiul menționat mai sus sunt riguros studiate in vitro și in vivo din punct de vedere
al biocompatibilității și al interacțiunii cu celule și țesuturi Rezultatele obținute icircn respectivul
studiu indică un potențial considerabil al acestor suporturi de a fi utilizat pentru repararea și
regenerarea osoasă [105]
Suporturi magnetice nanofibroase pe bază de PCL sunt prezentate și icircntr-un studiu publicat
icircn 2016 Icircntr-o soluție de 10 PCL icircn diclometan-etanol s-au icircncorporat două concentrații
diferite de nanoparticule magnetice conjugate cu COOH (10 și 20 COOH-MNPs)
amestecurile obținute fiind electrofilate la temperatura camerei obținuacircndu-se astfel suporturi
magnetice nanofibroase Microstructura și nanostructura suporturilor a fost analizată cu ajutorul
SEM și a microscopiei electronice de transmisie TEM Structura chimică a fost studiată prin
intermediul FTIR iar cristalinitatea prin intermediul XRD S-au studiat de asemenea
proprietățile hidrofile al suporturile proprietățile magnetice și foarte important
biocompatibilitatea acestora și interacțiunea cu celulele [106]
Gloria și colaboratorii [107] prezintă realizarea și caracterizarea de suporturi magnetice pe
bază de PCL cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos După solubilizarea PCL (masa
molară 65 kDa) icircn tetrahidrofuran s-au adăugat separat 3 concentrații diferite de nanoparticule
magnetice (hidroxiapatită dopată cu ioni de fier ndash FeHA) cu diametrul de 20 nm respectacircndu-se
următoarele rapoarte masice PCLFeHA 9010 8020 și 7030 Pentru o distribuție uniformă a
nanoparticulelor magnetice icircn soluția polimerică cele trei amestecuri polimer-nanoparticule au
fost ultrasonicate Următoarea etapă pentru obținerea suporturilor a fost turnarea amestecului icircn
matrițe speciale obținacircndu-se icircn final suporturi cu diametrul de 64 mm și o grosime de 05 mm
Icircn urma analizei datelor XRD autorii au observat că procesul de formare al suporturilor nu
afecteză structura și cristalinitatea acestora Analiza biologică a substraturilor a evidențiat
abilitatea acestora de a susține diferențierea osteogenică
49
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
De remarcat este studiul publicat de Santis și colaboratorii icircn care prezintă realizarea și
caracterizarea unui suport hibrid pe bază de PCL și polietilen glicol (PEG) și nanoparticule
magnetice cu potențiale aplicații icircn regenerarea țesutului osteocartilaginos Suportul hibrid
multistrat a fost obținut prin combinarea a două tehnici de formare a suporturilor imprimare 3D
și stereolitografie [108]
Poli (3- hidroxibutiratul) ndash P(3HB)
Akaraonye și colaboratorii [109] prezintă realizarea și caracterizarea de nanocompozite
magnetice pe bază de P(3HB) cu potențiale aplicații icircn ingineria țesutului osos Două tipuri de
nanocompozite magnetice au fost realizate nanocompozite pe bază de P(3HB) și nanoparticule
magnetice ndash P(3HB)MNP și nanocompozite pe bază de P(3HB) și ferofluid - P(3HB)FF S-a
observat o icircmbunătățire a cristalinității suporturilor compozite ca urmare a icircncorporării
nanoparticulelor magnetice și a ferofluidului icircn suportul polimeric un grad de cristalintate ridicat
al suporturilor fiind benefic regenerării ososoase Propritățile termomecanice favorabile precum
și biocompatibilitatea suporturilor realizate icircn lucrare indică o potențială utilizare a acestora icircn
aplicații ce vizează repararea și regenerarea țesutului osos
133 Suporturi magnetice pe bază de biomateriale ceramice
1331 Sticle ceramice bioactive
Datorită biocompatibilității lor ridicate sticlele bioactive pe bază de siliciu sunt utilizate
pentru refacerea unor defecte mici și chiar medii fiind adesea utilizate cu rolul de grefe icircn
intervenții chirurgicale parodontale și maxilofaciale De asemenea se utilizează pentru refacerea
unor defecte osoase ale urechii medii sau ale coloanei vertebrale Superioare sticlelor bioactive
non-mezoporoase icircn ceea ce privește volumul nanoporos bioactivitatea și degradarea sticlele
bioactive mezoporoase (MBG) au fost fabricate pentru prima dată icircn 2004 de Yan și
colaboratorii avacircnd formula chimică SiO2-CaO-P2O5 [110] Loacutepez-Noriega și colaboratorii au
demonstrat icircntr-un studiu capacitatea sticlelor MBG de a lega și elibera medicamente anti-
osteoporotice [111]
Wu și colaboratorii [112] publică un studiu ce are drept obiectiv principal realizarea unor
suporturi multifuncționale pe bază de MBG și fier (Fe) cu potențiale aplicații icircn terapia
hipertermică (hipertermie) și eliberarea controlată de medicamente pentru tratamentul unor
50
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
afecțiuni osoase maligne Suporturile poroase Fe-MBG (avacircnd icircncorporat 5 sau 10 Fe) au
fost pregătite utilizacircnd co-șabloanele copolimerului tribloc Pluronic P123 (utilizat pentru a
conferi o structură mezoporoasă avacircnd o dimensiune de cacircțiva nanometri) și bureți de
poliuretan(utilizați pentru a creea pori mari avacircnd dimensiuni de cacircteva sute de micrometri)
Prima etapă pentru obținerea celor două suporturi magentice 10 Fe-MBG (10Fe-MBG) și 5
Fe-MBG (5Fe-MBG) a fost solubilizarea icircn etanol de cantități diferite de P123
tetraetilortosilicat (TEOS) Ca(NO3)2∙4H2O FeCl3 trietilfosfat (TEP) și HCl sub agitare
magnetică pentru 24 ore Bureți de poliuretan au fost imersați pentru 10 min icircn soluția obținută icircn
prima etapă iar după icircndepărtarea soluției icircn exces au fost lasați la uscat la temperatura camerei
pentru 24 ore Această etapă a fost repetată de 5 ori după care bureții au fost calcinați la 700degC
pentru 5 ore Pe lacircngă cele două suporturi a fost realizat și un suport 0Fe-MBG care după cum
indică și numele nu conține fier Suporturilor obținute au fost caracterizate utilizacircnd diferite
tehnici SEM și EDS (figura 125) precum și XRD și TEM
Figura 125 a) c) e) Rezultatele SEM b) d) f) Rezultatele EDS [112]
De asemenea s-au realizat diverse teste pentru analiza proprietăților magnetice a
proprietăților mecanice a eliberării controlate de medicament din suport și a contactului cu
51
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
celule stem din măduvă osoasă umană Rezultatele obținute icircn urma studiilor menționate indică
faptul că suporturile sunt magentice degradabile bioactive și au capacitatea de eliberare
controlată de medicamente
1332 Fosafați de calciu
Panseri și colaboratorii [113] prezintă icircntr-un studiu realizarea și caracterizare in vitro a
unor suporturi compozite ceramice poroase Trei tipuri diferite de suporturi au fost fabricate din
hidroxiapatită (HA) ce icircncorporează magnetită (Mgn) avacircnd următoarele rapoarte HAMgn
955 HAMgn 9010 și HAMgn 5050 De asemenea s-a realizat un suport avacircnd raportul
HAMgn 1000 ce a fost utilizat drept control Diverse teste in vitro de biocompatibilitate au fost
realizate utilizacircnd linii celulare de osteoblaste umane Saos-2 teste de proliferare celulară teste
privind activitatea fosfatazei alcaline a celulelor teste de viabilitate celulară livedead etc
Rezultatele acestor teste au indicat o foarte bună biocompatibilitate a suporturilor ceea ce indică
faptul că adăugarea de magnetită icircn structura suporturilor nu a condus la efecte negative asupra
celulelor De asemenea suporturile au fost implantate in vivo la iepuri obținacircndu-se rezultate
bune
14 Concluzii
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta
aceste defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din
biomateriale sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea
celulelor osoase icircn timpul procesului de regenerarea osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau
regenerarea ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor
artificiale și a suporturilor Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase
52
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
sisteme injectabile capsule filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte
tuburi geluri etc
Suporturilor preparate plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important
imitacircnd nanostructura sa sunt suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg
procesele substanţele dispozitivele sistemele facute de om care imită natura Compozitele
polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje care pleacă de la
faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele matricei
extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă)
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular
cercetările științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind
cel de eliberarea de principii active controlată și țintită Nanoparticulele sunt integrate prin
diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă creștere deorece studii
mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația vizată
53
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Obținerea și caracterizarea de suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi
de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Capitolul 2 Materiale şi metode experimentale
21 Strategie experimentală Obiective
Regenerarea osoasă și inginerie tisulară a țesutului osos sunt două domenii intens studiate
datorită creșterii numărului de afecțiuni osoase infecții osoase pierderi de cauză traumatică ale
masei de țesut osos tumori osoase Autogrefele au fost o perioadă mare de timp cele mai
utilizate materiale pentru regenerarea și substituția osoasă icircnsă au multiple dezavantaje
ingineria tisulară atragacircnd tot mai mult atenția icircn special unele suporturi complexe pentru
ingineria tisulară a țesutului osos Icircn capitolul 1 au fost prezentate limitările metodelor actuale de
tratament şi necesitatea reală de găsire a unei metode alternative efective care să aibă drept scop
regenerarea osoasă
Ingineria tisulară domeniu interdisciplinar de mare actualitate oferă soluţii promiţătoare
pentru realizarea de materiale pentru regenerarea tisulară Plecacircnd de la structura țesuturilor
biologice componentele ingineriei tisulare sunt următoarele o matrice sau un suport celule și
molecule semnal suportul fiind componenta cheie
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă este rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea unui
material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și regenerare
osoasă ar putea fi un suport magnetic biomimetic
Icircn urma analizei rezultatelor stiinţifice din domeniul ingineriei tisulare și regenerării osoase
s-a ales pentru lucrarea de faţă o strategie de cercetare care a avut ca obiectiv central
Avacircnd icircn vedere componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă) au fost selectate biomaterialele
utilizate icircn studiile de față după cum urmează pentru componenta organică au fost selectați
biopolimeri adesea utilizaţi icircn studii ce vizează regenerarea țesutului osos şi fosfați de calciu
54
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
pentru componenta anorganică Noutatea tezei este dată de adăugarea de particule magnetice
(magnetită funcţionalizată cu chitosan) icircn amestecul supus procedeului de co-precipitare ce vor
fi funcționalizate cu diverși bioagenți (medicamente) și vor avea rolul de transportori ai acestora
Un suport magnetic biomimetic cu design adecvat este dispozitivul ideal pentru a ghida
formarea de neo-ţesut atacirct in vitro cacirct şi in vivo Suporturile pentru ingineria tisulară a osului
trebuie să fie biocompatibile să mimeze structura şi funcţia biologică a matricei extracelulare şi
să ofere suport mecanic pentru ţesutul icircn formare şi de asemenea să elibereze icircn locul unde are
loc repararea ţesutului diverse molecule celule factori de creştere Totodată suportul trebuie să
fie osteoconductiv şi osteoinductiv şi să aibă o rată de degradarea controlată
O mare parte din suporturile propuse de unele studii icircn domeniu nu mimează şi arhitectura
matricii extracelulare naturale acesta fiind motivul pentru care rezulatele unor astfel de studii nu
sunt satisfăcătoare Suportul trebuie să fie biomimetic adică să mimeze nu doar compoziția
osului ci cel mai important nano-structura sa Astfel pentru tema de cercetare abordată s-a ales
un procedeu biomimetic de co-precipitare in situ a fosfaţilor de calciu icircn soluţii de biopolimeri
inspirat din procesul natural de mineralizare unde mineralele sintetizate de către organism sunt
combinate cu componentele organice ale matrici extracelulare a ţesutului osos
Pentru partea organică a suporturilor s-au utilizat diverși polimeri naturali chitosan acid
hialuronic gelatină albumină şi colagen
Pentru partea anorganică a suporturilor s-au utilizat fosfaţi de calciu sintetici deoarece
prezintă o strucutură similară cu cea a mineralului primar din componenţa ţesutului osos avacircnd
rolul de stimuli osteoconductivi şi osteoinductivi Aceştia s-au obţinut prin precipitarea din
precursori azotat de calciu ndash Ca(NO3)2 CaCl2 şi fosfat monosodic ndash NaH2PO4
Utilizarea particulelor magnetice este un concept intens studiat icircn domeniul inginerie
tisulare Acesta implică utilizarea de nanoparticule magnetice care sunt funcționalizate cu factori
de creștere medicamente sau alți agenți bioactivi care vor fi preluate de către suportul magnetic
ca urmare a acțiunii unui camp magnetic icircn apropierea zonei unde este implantat suportul
Nanoparticulele magnetice funcţionalizate acţionează ca transportatori de agenţi bioactivi către şi
icircn interiorul suportului magnetic După ce patrund icircn suportul magnetic aceste particule
magnetice eliberează succesiv moleculele pe care le transportă Suporturile obţinute au fost
riguros analizate din punct de vedere fizico-chimic şi biologic
55
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
22 Materiale utilizate
221 Materiale utilizate pentru prepararea suporturilor
Analizacircnd icircn amănunt proprietăţile biopolimerilor utilizaţi icircn studii ce vizează obţinerea de
suporturi pentru regenerarea osoasă prezentate icircn capitolul 1 cinci biopolimeri au fost utilizaţi
pentru prepararea loturilor de suporturi două polizaharide şi trei proteine
Fosfaţi de calciu se vor obţine din precursori lor
Polizaharide
Chitosan ndash Cs CAS 9012-76-4 cu masă molară medie M = 309900 Da grad de
deacetilare 792 achiziţionat de la Vascon Co Canada
Hialuronat de sodiu din Streptococcus equindash Hya CAS 9067-32-7 M = 15-18 x
10E6
Da solubilitate = 5 mgml (H2O)Sigma Aldrich Germania
Proteine
Colagen ndash Col tip I+III acido-solubil extras din derm bovin 096 ρ= 097 gcm3
obţinut de la firma Lohmann amp Rauscher Newied Germania
Gelatină ndash G CAS 9000-70-8 pH 38 ndash 76 solubilitate = 10 gL (H₂O 25degC) Merck
Germania
Albumină serică bovină ndash Bsa CAS 9048-46-8 pulbere liofilizată ge 98
(electroforeză icircn gel de agaroză) Sigma-Aldrich Germania
Precursori de fosfaţi de calciu (CP)
Azotatul de calciu ndash Ca(NO3)2∙4H2O CAS 13477-34-4 M = 23615 gmol Sigma-
Aldrich Germania
Clorură de calciu ndash CaCl2middot2H2O CAS 10035-04-8 M = 14701 gmol solubilitatea =
1280 gL ρ = 185 gcm3 (20degC) Merck Germania
Fosfatul monosodic ndash NaH2PO4∙ 2H2O CAS 13472-35-0 pH=41-45 (25degC 5 icircn
soluţie) M = 13799 gmol Sigma-Aldrich Germania
Amoniac soluţie ndash NH4OH CAS 1336-21-6 soluţie 25 Sigma-Aldrich Germania
56
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Particule magnetice (MNPs)
Magnetită ndash Mag sintetizată printr-un procedeu de co-precipitare [114]
Chitosan ndash Cs low CAS 9012-76-4 chitosan cu masă moleculară mică M = 50000-
190000 Da (icircn funcţie de vacircscozitate) vacircscozitate 20-300 cP pentru o soluţie 1 icircn acetic acid
(1 25degC) Sigma-Aldrich Germania
Pluronicreg F-127 CAS 9003-11-6 pH= 6-7 Sigma-Aldrich Germania
Tripolifosfat de sodiu ndash TPP CAS 7758-29-4 Na5P3O10 85 M = 36786 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Doxorubicin hydrochloride ndash DOX CAS 25316-40-9 C27H29NO11 ∙HCl M = 57998
gmol utilizată la pentru studiul de eliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi Sigma-
Aldrich Germania
222 Materiale utilizate pentru caracterizarea suporturilor
Soluţie tampon fosfat pH=72 001 M
Pentru prepararea soluţie tampon fosfat (PBS) pH=72 001 M s-au utilizat
Fosfat monosodic ndashNaH2PO4middot2H2O CAS 13472-35-0 M = 15601 gmol Sigma
Aldrich Germania
Fosfat disodic ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 gmol Sigma Aldrich
Germania
S-au preparat soluţii de fosfat monosodic şi fosfat disodic ambele de concentraţie 001 M
după care cele două soluţii s-au amestecat conform tabel 21
Tabel 21 Proporţiilor de amestecare pentru obţinerea soluţiei PBS pH=72 001M
Fosfat monosodic (ml) Fosfat disodic (ml) pH
28 72 72
Soluţie tampon fosfat (PBS) cu pH 72 şi concentraţie 001 M s-a utilizat pentru
determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic şi la studiile in vitro de
degradare enzimatică
57
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Soluție fluid biologic simulat
Soluția de fluid biologic simulat (SBF) a fost preparată prin dizolvarea icircn apă deionizată a
reactivilor NaCl NaHCO3 KCl Na2HPO4∙2H2O MgCl2∙6H2O CaCl2∙2H2O and Na2SO4 [115]
Reactivii achiziționați de la Merck Germania și Sigma-Aldrich Germania s-au adăugat
unul cacircte unul după ce fiecare reactiv s-a dizolvat complet icircn 700 ml apă deionizată strict icircn
ordinea precizată icircn tabelul 22
Tabel 22 Compoziția chimica a fluidului biologic simulat (SBF)
Ordinea
componentului Reactivi
Cantitate
(gL)
1 NaCl CAS 7647-14-5
M = 5844 gmol 6547
2 NaHCO3 CAS 144-55-8
M = 8401 gmol 2268
3 KCl CAS 7447-40-7
M = 7455 gmol 0373
4 Na2HPO4∙2H2O CAS 10028-24-7
M = 17799 gmol 0178
5 MgCl2∙6H2O CAS 7791-18-6
M = 20330 gmol 0305
6 CaCl2∙2H2O CAS 10035-04-8
M = 14701 gmol 0368
7 Na2SO4 CAS 7757-82-6
M = 14204 gmol 0071
8 (CH2OH)3CNH2 CAS 77-86-1
M = 12114 gmol 6057
Soluția obținută după amestecarea reactivilor s-a ajustat la pH = 74 utilizacircnd o soluție 1M
HCl Din volumul total de acid o parte (aproximativ 20 ml) s-a introdus icircnainte de adaosul celui
de-al șaselea component (CaCl2∙2H2O) pentru a evita apariția fenomenului de precipitare După
adaosul celui de-al 8-lea component [tris (hidroximetil) amino metan] s-a ridicat temperatura
soluției la 37ordmC
58
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Această soluție s-a titrat ulterior cu 1M HCl pacircnă la pH=74 la 37ordmC Icircn timpul procesului
de titrare soluția a fost diluată continuu prin adaos consecutiv de apă deionizată pentru a rezulta
volumul final de 1 L
Concentrația ionilor icircn SBF-ul realizat sunt apropiate de cele care se găsesc icircn plasma
umană așa cum se poate observa icircn tabelul 23
Tabel 23 Concentrațiile ionilor icircn SBF și icircn plasma umană
Concentrație (mM)
Na+
K+
Ca2+
Mg2+
HPO42-
Cl-
HCO32-
SO42-
Plasma umană 1420 50 25 15 10 1030 270 05
SBF 1422 502 247 151 102 1250 272 052
Soluţie tampon fosfat-citrat pH=5
Pentru prepararea soluţiei tampon fosfatndashcitrat pH=5 (după metoda Perse 1980) s-au
utilizat
Fosfat disodic anhidru ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 Sigma-Aldrich
Germania
Acid citric ndash C6H8O7 CAS 77-92-9 M = 19212 gmol Honeywell Riedel-de Haeumln
Germania
S-au preparat o soluţie de Na2HPO4 de concentraţie 02M și o soluție C6H8O7 de
concentraţie 01M după care s-au amestecat volumele specificate icircn tabel 24
Tabel 24 Proporţiile de amestecare pentru obţinerea a 100 ml tampon fosfat-citrat pH=5
Fosfat disodic (ml) Acid citric (ml) Apă distilată (ml) pH
257 243 50 5
59
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Studii in vitro de degradare enzimatică
Tabel 25 Reactivi utilizați pentru studiile in vitro de degradare enzimatică
Determinarea concentrației de
chitosan degradat
Determinarea concentrației de
colagen degradat
Enzime
utilizate
Lizozim ndash 100000 unităţimg
CAS 12650-88-3
M = 143 kDa (a unui singur lanţ)
Sigma-Aldrich Germania
Colagenază clostridium histolyticum
CAS 9001-12-1
M = 68 ndash 125 kDa
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
determinarea
produșilor de
degradare
Fericianură de potasiundash
K3Fe(CN)6
CAS13746-66-2 ge990
M = 32924 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Ninhidrină ndash C9H6O4
CAS 485-47-2
M = 17814 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Clorură de staniu ndashSnCl2
CAS 7772-99-8
M = 1896 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
realizarea
curbei etalon
N-acetil-D-glucozamină ndash
C8H15NO6
CAS 7512-17-6
M = 22121 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Glicină ndash C2H5NO2
CAS 56-406-6
M = 7507 gmol
Fluka Elveţia
Solvenți
Carbonat de sodiu ndash Na2CO3
CAS497-19-8
M = 10599 gmol
Chemical Company Iaşi
2-metoxietanol ndash CH3OCH2CH2OH
CAS 109-86-4
M = 7609 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Teste de citotoxicitate in vitro
Cu excepția solvenților care au fost achiziționați de la Chemical Company Iaşi toate
celelalte materiale prezentate icircn tabelul 26 au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich
Germania
60
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Tabel 26 Reactivi utilizați pentru studiile de citotoxicitate in vitro
Medii de cultură și soluții
de completare
Reactivi pentru
determinare
citotoxicității in vitro
Soluţie salină
Hanksrsquo Balanced
(HBSS)
Solvenți
Mediu de cultură DMEM
(Dulbeccorsquos Modified
Eaglersquos Medium) cu
4500 mgl glucoză
L-glutamat şi bicaronat
de sodiu
Tripsină din pancreas
de porc
CAS 9002-07-7
M = 238 kDa HBSS cu roşu fenol
fără clorură de calciu
şi sulfat de magneziu
Alcool isopropilic
(CH3)2CHOH
CAS 67-63-0
M = 6001 gmol
Mediu de cultură DMEM
F-12 HAM
(amestec de nutrienţi)
cu L-glutamat piruvat de
sodiu 055 gl
glucoză 315 gl
Acid etilen-diamino-
tetraacetic ndash EDTA
CAS 60-00-4
M = 29224 gmol
PSN ndash amestec de
penicilină streptomicină
neomicină
5000 unităţi penicilină 5
mg streptomicină 10
mgml neomicină
MTT ndash C18H16BrN5S
[bromură de (3-[45-
dimetiltiazol-2-il]-25-
difenil) tetrazoliu
CAS 298-93-1
M = 41432 gmol
HBSS cu clorură de
calciu şi sulfat de
magneziu
fără roşu fenol
Alcool etilic
absolut C2H5OH
CAS 64-17-5
M = 4607 gmol
Ser fetal bovin ndash BFS
Calceină AM
CAS 148504-34-1
Teste de citotoxixictate in vivo
Șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28plusmn3
grame materialul biologic provenit din Biobaza INCDMI Cantacuzino București - filiala
Băneasa Reactivi utilizați au fost aleși conform standardului ISO 10993
Betadină ndash soluție cutanată 10
Isofluran 4 ndash soluție pentru inducția anesteziă
Aldehidă formică 10 parafină colorant Tricromic Masson ndash pentru examenul
histopatologic
61
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
23 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu
incluziune de particule magnetice
231 Obţinerea particulelor magnetice
Particulele magnetice au fost obţinute conform protocolului descris de Bălan şi
colaboratorii [116] proprietățile lor fiind prezentate icircn tabelul 27
Tabel 27 Proprietățile particulelor magnetice
Dimensiunea medie
(nm)
Indicile de
polidispersitate
Potențialul Zeta
icircn soluție apoasă de
surfactant (mV)
Magnetizarea
(emug)
178 027 -186 4365
Pe scurt un volum de soluţie de chitosan de masă moleculară mică ndash Cs low a fost
amestecat cu un volum de magnetită ndash Mag şi pluronic F-127
După omogenizare amestecului se va adăuga o soluţie TPP icircn picătură Amestecul final se
va dializă contra apei distilate pentru mai multe zile
232 Obținerea suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu
incluziune de particule magnetice
Suporturilor magnetice au fost obţinute utilizacircnd o metodă biomimetică de co-precipitare a
fosfaţilor de calciu din precursorii săi icircn soluţii de biopolimeri inspirată din procesul natural de
mineralizare etapele procesului de obţinere fiind prezentate icircn figura 21
Soluţiile apoase de precursori de fosfaţi de calciu au fost adăugate icircn amestecul de soluţii
de polimeri Icircnainte de adăugarea precursorilor de fosfaţi de calciu icircn amestecul de soluţii de
polimeri s-au adăugat particule magnetice fie sub formă uscată fie sub formă de suspensie
coloidală
Co-precipitarea s-a realizat icircn prezenţa unei soluţii de amoniac NH4OH (25 ) pacircnă la
obținerea unei valori a pH-ului de 72-74 Fiecare amestec a fost spălat de 3 ori cu apă distilată
prin centrifugare (5000 rpm timp de 10 minute) iar icircn final amestecurile au fost liofilizate 24h la
-55degC
62
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Figura 21 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
233 Program experimental
Specialiștii din foarte multe domenii de activitate se confruntă deseori cu provocarea de a
face compromisuri icircntre diferiți factori pentru a obține rezultatele dorite optimizare fiind
procesul de a alege aceste compromisuri icircn cel mai eficient mod posibil Noțiunea de diferiți
factori face referire la existența unor diferite soluții posibile iar noțiunea de realizare a
rezultatelor dorite se referă la obiectivul de a căuta icircmbunătățirea modului de identificare a
soluției optime Prin urmare icircntr-o problemă de optimizare diferitele soluții posibile sunt
comparate calitatea soluției fiind fundamentală deoarece aceste soluții sunt de multe ori icircn
contrast [117]
Programe experimentale factoriale sunt foarte eficiente pentru studierea a doi sau mai mulți
factori Efectul unui factor poate fi definit ca schimbarea răspunsului produs de o modificare a
nivelului factorului acesta fiind considerat efectul principal Icircn unele experimente se poate
63
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
constata că diferența de răspuns dintre nivelurile unui factor nu este aceeași la toate nivelurile
celorlalți factori numit efect de interacțiune icircntre factori Icircn mod colectiv efectele principale și
efectele de interacțiune sunt numite efectele factoriale Un design factorial complet poate estima
toate efectele principale și interacțiunile de ordin superior
Programe experimentale factoriale sunt folosite icircn ingineria tisulară și icircn domeniul
biomaterialelor [118] icircn domeniul farmaceutic [119] etc
Icircn teza de față s-a utilizat un program experimental multifactorial icircn vederea optimizării
compoziției suporturilor Programul menționat este caracterizat prin faptul că fenomenul
procesul este urmărit prin intermediul unui număr finit de variabile variabile ce pot avea fiecare
un număr discret de valori icircntr-un domeniu de variaţie prestabilit Compoziția suporturilor a fost
optimizată din punct de vedere al raportului biopolimerbiopolimer un program experimental
factorial central compus rotabil de ordinul 2 fiind utilizat [120] Ecuația următoare stabilește
numărul total de experiențe posibile
NE = 2k + 2k + n0 icircn cazul icircn care k lt 5 (1)
sau
NE = 2k-1
+ 2k + n0 icircn cazul icircn care k gt 5 (2)
unde k este numărul de variabile iar n0 numărul de experiențe dispuse icircn centrul domeniului
experimental valoare sa fiind cuprinsă icircn intervalul 3 ndash 7
Structura programului experimental reprezentată de dispunerea punctelor generate de
valorile diferite acordate factorilor are drept ipoteză posibilă ajustarea suprafeţei de răspuns ce
corespunde unui indicator icircn raport cu variabilele independente prin intermediul unor expresii
matematice de tip polinomial de ordinul 2 de forma
Y = a0 + ndash
+
ndash (3)
unde a0 este coeficientul de regresie iar xi si xj sunt variabilele independente care influenţează
variabila răspuns F Valorile discrete ce se atribuie variabilelor sunt alese astfel icircncat printr-o
codificare simetrică faţă de centrul planului experimental să fie posibilă ortogonalizarea matricii
experimentale corespunzătoare si inducerea unei erori minime cu ocazia calculelor aferente
coeficienţilor prin metoda celor mai mici pătrate [121]
64
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Icircn lucrarea de față s-a optat pentru o codificare a valorilor discrete aferente variabilelor
independente conform datelor din tabelul 28
Tabelul 28 Codificarea variabilelor independente icircn cazul exprimării multifactoriale libere
Valoare codificată -1414 -1 0 -1 14141
Valoare reală
Valorile discrete se estimează din valorile ce definesc intervalul de variaţie al variabilei
independente xi conform următoarelor relaţiilor de atribuire
= rarr ndash2 (4)
= rarr +2 (5)
= ( + ) 2 rarr 0 (6)
= ( + ) rarr ndash1 (7)
= ( + ) rarr 1 (8)
Icircn contextul obiectivelor de cercetare s-a folosit un program factorial cu două variabile
(X1 X2) a cărei matrice experimentală este prezentată in Tabelul 29 [122]
Tabel 29 Matrice experimentală a programului factorial cu 2 variabile
Nr Crt X1cod X2 cod
1 ndash1 ndash1
2 1 ndash1
3 ndash1 1
4 1 1
5 ndash1414 0
6 1414 0
7 0 ndash1414
8 0 1414
9 0 0
10 0 0
11 0 0
12 0 0
13 0 0
65
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
24 Metode de caracterizare
241 Caracterizarea structurală a suporturilor
2411 Analiza prin Spectroscopia icircn infraroşu cu transformată Fourier (FTIR)
Spectroscopia FTIR se utilizează icircn vederea determinării grupărilor funcţionale ale probei
analizate Metoda se bazează pe vibraţia legăturilor chimice rezultată icircn urma absorbţiei energiei
luminoase infraroşii la frecvenţe caracteristice FTIR este o metodă uzuală icircn stabilirea structurii
şi identificarea unui compus chimic [123]
Pentru caracterizarea probelor solide există trei metode de pregătire a probelor pastilarea
icircn prezenţa unei sări suspensia icircn nujol utilizarea unui solvent Metoda de pregătire a probelor
este aleasă icircn funcţie de natura probei de analizat de exemplu icircn cazul probelor dificil de mojarat
se va utiliza un solvent pentru pregătirea probelor Acest solvent trebuie să aibă cacirct mai puţine
benzi şi intensitatea mică (exemplu sulfura de carbon şi tetraclorura de carbon)
Icircn ceea ce priveşte suspensia icircn nujol (ulei de parafină) cacircteva miligrame de probă se
amestecă cu 1-3 picături de ulei de parafină pacircnă la obţinerea unei suspensii omogene Icircn cazul
pastilării cel mai adesea se utilizează bromura de potasiu (KBr) Aproximativ 2-3 mg probă se
mojarează şi se amestecă cu 200 mg bromură de potasiu mojararea probei fiind un aspect
important de care trebuie să se ţină cont Pulberea obţinută se va introduce icircntr-o matriţă şi se va
comprima cu ajutorul unei prese hidraulice obţinacircndu-se un disc a cărui grosime este un alt
aspect important de care trebuie să se ţine cont o grosime de aproximativ 1 mm fiind
recomandată pentru rezultate cacirct mai bune [124]
Suporturile obţinute au fost pregătite pentru analiza FTIR prin metoda pastilării cu KBr
2412 Spectroscopia de raze x prin dispersie de energie (EDS)
Icircn general dispozitivele pentru microscopia electronică de baleiaj (SEM) sunt echipate cu
un spectroscop de raze X cu dispersie de energie (EDS) șisau un Spectroscop cu raze X cu
dispersie pe lungime de undă (WDS) utile pentru analiza elementală sau caracterizarea chimică
Atacirct EDS cacirct și WDS se bazează pe detectarea și investigarea razelor X caracteristice produse de
electronii primari Icircn timpul iradierii un electron din stratul intern al atomul țintă poate fi scos
66
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
din icircnvelișul electronic rezultacircnd o gaură de electroni Ulterior un electron din straturile
exterioare va umple gaura iar diferența de energie dintre electronii din icircnvelișul intern și cei din
icircnvelișul extern va fi emisă sub formă de rază X Deoarece energia acestei razei X este
caracteristică structurii atomice a elementului din care este emisă prin măsurarea cantității și a
energiei razele X emise dintr-un eșantion se poate determina compoziția elementală a probei
EDS este o metodă utilizată cel mai adesea pentru analiza de suprafața a unui material [125]
Pentru analiza probelor s-a utilizat un microscop electronic cu scanare SEM model VEGA
II LSH produs de firma TESCAN Cehia cuplat cu un detector EDX tip QUANTAX QX2
produs de firma BRUKERROENTEC Germania
2413 Difracţie cu raze X (XRD)
Spectrul XRD a fost icircnregistrat utilizacircnd aparatul XRD-6000 SHIMADZU (figura 22)
Difracţia cu raze X este o metodă simplă şi uşor de realizat pentru analiza fazei cristaline a
probelor oferind totodată şi date despre dimensiune şi orientarea cristalelor acesteia
Figura 22 Difractometru de raze X [126]
Principiul de bază al acestei metode implică cuantificarea precisă a lărgimii picurilor de
difracţie Plecacircnd de la acest principiu s-au dezvoltat mai multe tehnici pentru estimarea fazei
67
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
anorganice formate şi a dimensiunii cristalelor cele mai icircntacirclnite icircn literatură fiind ecuaţia lui
Scherrer analiza lui Hall-Williamson şi metoda Fourier a lui Warren-Averbach [127]
Pentru identificarea fazelor anorganice din suporturile obţinute au fost utilizate standardele
Centrului Internaţional pentru Difracţie (JCPDS)
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM)
Microscopia electronică de baleiaj se utilizează pentru a studia icircn detaliu suprafaţa
probelor Datele SEM sunt foarte importante deoarece oferă informaţii despre morfologia
probelor ce are o influenţă remarcabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale acestora (gradul de
retenţie a fluidelor biologic simulate proprietăţile mecanice adeziunea şi proliferarea celulară
etc) Icircn vederea studiului morfologiei suporturilor obţinute s-a utilizat microscopul TESCAN
VEGA SBH II prezentat icircn figura 23 Tensiunea de lucru a fost de 30 kV
Figura 23 Microscopul TESCAN VEGA SBH II [128]
Analiza constă icircn scanarea suprafaţei probelor de către un fascicul de electroni de energie
icircnaltă fascicul ce porneşte dintr-un filament de tungsten aflat icircn structura microscopului Icircnainte
68
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
de a fi analizate probele trebuie să se acoperite cu un film subţire de aur sau platină pentru un
contrast icircmbunăţit Pe măsură ce fasciculul de electroni trece de-a lungul probei interacţiunea
dintre probă şi fascicul are drept rezultat diferite tipuri de semnale de electroni emise la suprafaţa
probei sau icircn apropierea acesteia Semnalele sunt culese procesate şi redate pe un monitor ca şi
pixeli ceea ce duce la formarea unei imagini a suprafeţei probei imagine ce apare
tridimensională [129]
2422 Micro computer-tomografia (microCT)
Micro-computer tomografia (microCT) este o analiză de icircnaltă precizie a morfologiei
suporturilor oferind date precise şi informații despre dimensiunea şi distribuţia porilor icircntr-un
suport Tehnica este asemănătoare cu cea utilizată icircn sistemele de tomografie cu raze X folosite
icircn medicină doar că are o rezoluţie mult mai bună Această tehnică studiază interiorul suportului
icircn mare detaliu fără a fi utilizate substanţe toxice sau fără a fi necesară o pregătire specială a
probei Astfel după scanare proba intactă poate fi analizată prin alte tehnici
Icircn timpul scanării micro CT proba este icircmpărțită icircntr-o serie de secţiuni transversale 2D
care sunt iradiate din margine cu raze X La trecerea prin secţiune razele X sunt atenuate iar
razele X emergente avacircnd intensități reduse sunt capturate de un detector din componenţa micro-
computer tomografului Traictoriile razelor X sunt calculate și coeficienții de atenuare sunt
derivați O hartă bidimensională cu pixeli este creată utilizacircnd datele obţinute și fiecare pixel este
notat cu o valoare de prag care corespunde atenuării coeficientul măsurat la un punct similar icircn
interiorul specimen Deoarece coeficientul de atenuare este corelat cu densitatea materialului
hărțile 2D rezultate oferă o imagine a fazelor materialului analizat Calitatea imaginilor obţinute
este dependentă de rezoluţia de scanare care este cuprinsă icircntre 1 şi 50 microm precum şi de
software-ul utilizat [130]
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor
Testul de compresiune a fost realizat cu ajutorul dispozitivului Texture Analyzer
TAXTplus Dispozitivul poate fi utilizat pentru teste fundamentale sau empirice cum ar fi cele
legate de analiza texturii ştiinţa materialelor şi reologia solidelor semi-solidelor lichidelor
vacircscoase pudrelor sau materialelor granulate Numeroase proprietăţi pot fi analizate cu ajutorul
69
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
acestui dispozitiv dintre care enumerăm duritate fragilitatea aderența rezistența la tracțiune
extensibilitate Icircn funcţie de proprietate testată şi tipul probei dispozitivul are o serie de
platforme şi accesorii Pentru testul de compresiune la dispozitiv se va ataşa platforma pentru
greutate mare (figura 24)
Figura 24 Ansamblu pentru testul de compresiune Texture Analyzer TAXTplus [131]
Datele sunt achiziționate de software-ul Exponent icircn timpul procedurii şi prezentate sub
formă de grafice ce oferă detalii despre comportamentul fiecărei probe la forţe specificate
Dispozitivul este utilizat icircn numeroase domenii alimentar farmaceutic cosmetic medical etc
Accesoriile ce se ataşează de partea de sus a dispozitivului printr-un adaptor special pot
avea forme diverse Majoritatea au formă cilindrică și suprafața de acțiune plată cu diametrul
cuprins icircntre 2 mm şi 50 mm şi sunt realizate din diverse materiale oţel inoxidabil aluminiu
polioximetilenă (cunoscut şi sub denumirea de poliacetal şi comercializat sub marca Delrin) şi
poli (metacrilat de metil) sub denumirea comercială Perspex Atacirct diametrul variabil cacirct şi faptul
că sunt realizate din patru tipuri diferite de material fac posibilă utilizarea pentru numeroase teste
a unor probe diferite [132]
Pentru realizarea testului de compresiune a suporturilor obţinute s-a utilizat accesoriul
cilindric fabricat din aluminiu cu diametrul de 1 inch (337 mm) Suporturile au fost tăiate icircn
70
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
fragmente aproximativ egale iar după ce s-au determinat dimensiunile au fost supuse testului de
compresiune folosind următorii parametrii
viteza de pre-test ndash 01 mmsec
viteza de testare ndash 05 mmsec
distanța de icircntoarcere ndash 6 mm
Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru fiecare
fragment s-au calculat
A = L times l ( ) (9)
unde A este aria probei L este lungimea probei iar l este lățimea probei
F =
(N) (10)
unde Fmax este valoarea forţei măsurată de dispozitiv iar F este forţa de greutate
(11)
unde σ este rezistenţa la compresiune iar icircn final s-a calculat modulul de elasticitate icircntacirclnit
adesea icircn literatură sub denumirea de modulul lui Young (Legea lui Hooke)
(12)
unde ε este deformarea
244 Propritățile magnetice ale suporturilor
Susceptibilitatea magnetică este o măsură a proprietăţilor magnetice a unui material
Această mărime este o constantă adimensională ce indică gradul de magnetizare a unui material
ca răspuns la aplicarea unui cacircmp magentic
Icircn literatură se mai icircntacirclneşte şi termenul de magnetizare şi reprezintă raportul dintre
momentul magnetic şi densitatea de flux magentic Există trei mărimi ale susceptibilităţii
magnetice susceptibilitatea magnetică de masă susceptibilitatea magnetică molară şi
71
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
susceptibilitatea magnetică de volum Susceptibilitatea magnetică de volum se mai numeşte şi
permeabilitatea [133]
Susceptibilitatea magnetică a suporturilor notată cu χm a fost determinată utilizacircnd balanţa
de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto prezentată icircn figura 25
Figura 25 Balanţa de susceptibilitate magnetic Sherwood Scientific MSB Auto [134]
Dacă valoarea obţinută este pozitivă atunci materialul se numeşte paramagnetic iar dacă
este negativă se numeşte diamagnetic [135] Măsurarea susceptibilităţii magnetice s-a făcut la o
intensitatea a campului magnetic H= 45 kGauss (1 Gauss = 1 Oestred) Cunoscacircnd valorile
susceptibilităţii magnetice a unui material se poate calcula magnetizarea acestuia notată cu M
utilizacircnd formula
χm∙H (emug) (13)
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic
Acestă analiză este foarte importantă pentru că oferă informaţii despre cantitatea de fluide
reţinute de suporturi in vitro Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes
biologic s-a realizat cu ajutorul metodei volumetrice prin contactul suporturilor cu soluție PBS
și cu o soluție SBF icircn paralel
72
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Un fragment din suportul analizat a fost pus icircn contact cu PBSSBF pH=72 001 M icircntr-o
microcoloană QIAquickregSpin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o seringă de 1 ml prin
intermediul unei membrane de silicon (figura 26)
Figura 26 Ansamblu de dispozitive utilizat pentru determinarea gradului de retenţie maxim
Dispozitivele au fost incubate la 37degC pentru un interval de timp determinat după care s-a
stabilit volumul de soluţie reţinut de fiecare probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim
notat GRmax utilizacircnd formula
GRmax =
times100 () (14)
unde mf=mi+mabs mabs reprezintă masa de solvent absorbită după intervalul de timp stabilit
iar mi este masa iniţială a probei Densitatea PBS-ului respectiv a SBF-ului se consideră avacircnd
valoarea 1
246 Studii de degradare enzimatică in vitro
Suporturile pe bază de biopolimeri pentru ingineria tisulară şi regenerarea ţesutului osos
sunt degradate in vivo de către enzime icircn mod particular cum ar fi de exemplu hialuronidaza
pentru acidul hialuronic lizozimul pentru chitosan şi colagenaza pentru colagen şi gelatină
Pentru a studia şi cuantifica procesul de biodegradarea al suporturilor pentru ingineria tisulară icircn
literatură există două metode
73
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- metoda directă prin care se cacircntăreşte suport analizat icircnainte şi după ce este supus
procesului de degradare pentru un anumit interval de timp şi se face raportul dintre
greutatea iniţială şi greutatea finală
- metoda indirectă prin care se analizează compuşii rezultaţi icircn urma procesului de
degradare [136]
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd fie lizozim
(enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al chitosanului icircn organismul uman) fie un
complex de lizozim și colagenază (enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al
colagenului icircn organismul uman) Primul pas a fost imersarea unui fragment din fiecare probă
icircntr-un volum de PBS cu lizozim (1200 μgml) sau lizozim cu colagenază (100 μgml) aflată
icircntr-o membrană de dializă introdusă apoi icircn soluţie PBS fără enzime Probele au fost apoi
incubate la 37degC iar la anumite intervale de timp un volum din soluţia de PBS icircn care este
imersată membrana de dializă cu proba de analizat a fost extras şi analizat
Determinarea concentrației de chitosan degradat
Cs este predominat degradat de enzime care hidrolizează legăturile glucozamină ndash
glucoazamină glucozamină ndash N-acetil-glucozamină şi N-acetil-glucozamină ndash N-acetil-
glucozamină Lizozimul şi enzimele bacteriene din colon sunt principalele enzime implicate icircn
procesul de degradare al Cs-ului Lizozimul poate hidroliza atacirct chitina cacirct şi Cs viteza de
degradare fiind invers proporţională cu cristalinitatea polimerilor şi cu gradul de deacetilare al
Cs-ului Icircn corpul uman lizozimul se găseşte icircn diferite concentraţii icircn ser lacrimi salivă şi
urină unde are activitate antibacteriană importantă
Figura 27 Ruperea legăturii β-(1-4) glicozidică din structura chitosanului de către lizozim
74
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Chiar dacă lizozimul din corpul uman este diferit din punct de vedere structural de cel
utilizat icircn testele in vitro studiile au demonstrat că are activitate similară icircn procesul de
biodegradare al chitosanului Activitatea lizozimului creşte o dată cu creşterea gradului de
acetilare al chitosanului sugeracircnd că la locul de acţiune al lizozimului trebuie să existe un minim
de unităţi acetilate pentru a se obţine o rată de degradare iniţială maximă Lizozimul este prezent
icircn mod natural icircn serul uman salivă și alte fluide hidrolizacircnd legătura β-(1-4) glicozidică dintre
N-acetilglucozamină (NAGA) și reziduri ale acidului N-acetil-muramic ce se depun pe pereții
celulei bacteriei [137]
Icircn ceea ce priveşte analiza concentraţiei de chitosan degradat s-a determinat cantitatea de
produşi de biodegradare enzimatică prin evaluarea complexului format cu o soluţie de
K3Fe(CN)6 Soluţia de fericanură de potasiu s-a obţinut prin solubilizarea a 05 g K3Fe(CN)6 icircn
1000 ml de 05 M Na2CO3
1 ml extras din probele de analizat s-a incubat cu 4 ml de K3Fe(CN)6 icircntr-o eprubetă icircn apă
adusă la fierbere timp de 15 minute Soluţia din eprubete s-a răcit la temperatura camerei s-a
transferat icircntr-un flacon de 25 ml s-a adus la semn cu soluţie carbonat de sodiu 05 M după care
s-a citit absorbanţa soluţiei la spectrofotometru UV-VIS la o lungime de undă de 420 nm
Concentraţia de chitosan degradat s-a calculat utilizacircnd o curbă etalon (figura 28)
Figura 28 Curba etalon pentru determinarea concentraţie de chitosan degradat
y = -92591x + 02402 Rsup2 = 09964
0
005
01
015
02
025
0 0004 0008 0012 0016 002 0024
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația N-acetil-D-glucozamină ()
75
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Pentru realizarea curbei etalon s-a preparat o soluţie de N-acetil-D-glucozamină de
concentraţie 002 după care s-au realizat 10 diluţii şi s-a determinat absorbanţa fiecărei soluţii
utilizacircnd aceaşi metodă spectofotometrică menţionată anterior
Determinarea concentrației de colagen degradat
Ninhidrina este o pulbere albă si cristalină solubilă icircn apă si alcool Reacţiile ninhidrinei
utilizacircnd tehnici manuale sau automate sunt folosite pentru analiza şi caracterizarea amino-
acizilor peptidelor proteinelor precum şi a unui număr mare de compuşi icircn numeroase domenii
biomedical clinic alimentar microbiologic histochimic şi altele Icircn ceea ce priveşte
caracterizarea proteinelor icircn urma reacţiei ninhidrinei cu grupările amino rezultă cromoforul
ninhidrinei icircntalnit icircn literatură sub denumirea de violet Ruhemann ndash RP (figura 29) după
numele cerecetătorului care a descoperit reacţia icircn 1910 ce absoarbe radiaţia luminoasă la o
lungime de undă de 570 nm Icircn unele cazuri cantitatea de cromofor formată nu e
stoechiometrică de aceea pentru obţinerea unor rezultate reproductibile icircn reacţie se introduce
un agent reducător cum este de exemplu SnCl2 ce are ca rezultat creșterea intensităţii culorii
[138]
Figura 29 Reacţia dintre ninhidrină şi aminoacizi
Reactivul de ninhdrină s-a preparat prin solubilizarea a 0283times10-3
moli de SnCl2∙2H2O icircn
500mL soluţie tampon citrat-fosfat pH = 5 urmat de adăugarea a 500 mL de 2-metoxietanol care
conţine 20 g de ninhidrină 1 mL extras din probele de analizat probă s-a incubat cu 5 ml reactiv
ninhidrinăicircntr-o eprubetă icircn apă adusă la fierbere timp de 20 minute Soluţia s-a răcit imediat
latemperatura camerei apoi s-au adăugat 20 ml de soluţie amestec apă distilată2 - propanol
(11) Absorbanţa a fost măsurată la 570 nm in celulă de cuarţ cu spectrofotometrul UV-VIS
76
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Curba de calibrare pentru determinarea concentraţiei de grupări NH2 terminale din colagen s-a
realizat utilizacircnd glicină (figura 210)
Figura 210 Curba etalon pentru determinarea concentraţiei de colagen degradat
247 Teste de citotoxicitate in vitro
Un material realizat cu scopul de a fi utilizat icircn contact direct cu un ţestut viu trebuie să fie
obligatoriu citocompatibil Primele teste ce trebuie realizate pentru a analiza această
caracteristică sunt testele in vitro de biocompatibilitate pe culturi de celule Doar după testări
riguroase a unui material pe diverse culturi de celule se poate merge mai departe la realizarea de
teste de citotoxicitate in vivo
Icircntr-un laborator de culturi de celule conservarea celulelor primare sau a liniilor celulare
este o condiţie esenţială deoarece permite atacirct păstrarea calităţii materialului biologic cacirct şi o
organizare eficientă a activităţilor De aceea celulele primare şi liniile celulare sunt criostocate
fie la -86degC fie la -196degC icircn prezenţa de soluţii crioprotectoare evitacircndu-se astfel formarea
cristalelor de gheaţă
Celule care au fost utilizate pentru a testa in vitro biocompatibilitatea suporturilor obţinute
au fost păstrate la -86degC utilizacircndu-se drept agent crioprotectant dimetilsulfoxid ndash DMSO
Suporturile au fost testate pe mai multe linii celulare
- fibroblaste primare NHDF LONZA
- celule stem isolate din ţesut adipos de iepure
y = 16194x + 00799 Rsup2 = 09968
0
01
02
03
04
05
0 00005 0001 00015 0002 00025
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația de glicină ()
77
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- pre-osteoblaste din linia celulară MC-3T3
- osteoblaste din linia celulară MG-63 (celule tumorale)
Prima etapă pentru realizarea unui test de biocompatibilitatea a fost dezgheţarea celulelor
Icircn funcţie de numărul de material testate şi de tipul plăcilor de cultură utilizate s-au folosit fie
flacoane de cultură medii cu suprafaţa de cultură de 75 cm2 fie flacoane de cultură mari cu
suprafaţa de cultură de 175 cm2 Flacoanele s-au incubat(la 37degC 55 CO2 şi umiditate relative
96) cu un anumit volum de mediu de cultură complet (mediu de cultură care se suplimentează
cu 10BFS şi 1 PSN) icircn funcţie de dimensiunea flaconului cu aproxiamtiv 2 ore icircnainte de
dezgheţarea celulelor Criotubul s-a scos de la -86degC s-a imersat rapid icircn apă avacircnd temperatura
37degC şi s-a agitat uşor pacircnă la dezgheţare completă Celule din criotub s-au centrifugat cu mediu
de cultură complet pentru icircndepărtarea agentului crioprotectant după care supernatantul s-a
icircnlocuit cu mediu de cultură complet După ce s-au numărat celulele s-a adăugat icircn flaconul de
cultură un volum potrivit de suspensie celulară Mediul de cultură din flacon a fost icircnlocuit zilnic
cu mediu proaspăt pacircnă la formarea unui monostrat confluent
După formarea monostratului următoare etapă a fost popularea cu celule a plăcilor de
cultură pe care au fost testate suporturile Pentru a desprinde celulele din flacon şi a realiza o
suspensie celulară s-a utilizat o soluţie de tripsină 025 EDTA 002 Icircnainte de adăugarea
soluţie tripsinăEDTA s-a icircndepărtat mediului de cultură din flacon iar apoi suprafaţa de cultură
a fost spălată de cateva ori cu HBSS cu roşu fenol fără calciu pentru a fi icircndepărtate urmele de
mediu care ar icircngreuna acţiunea tripsinei După centrifugare cu mediu de cultură complet icircn
vederea icircndepărtării resturilor de tripsină s-a icircnlocuit supernatantul cu mediu complet după care
s-au numărat celulele cu ajutorul unei camere de numărat celule Neubauer s-a realizat o
suspensie de celule icircn mediu complet după care s-a distribuit icircn fiecare godeu al plăcilor de
cultură un anumit volum de suspensie conţinacircnd numărul de celule calculat icircn funcţie de tipul de
celule şi numărul de godeuri al plăcilor de cultură
Icircn funcţie de tipul materialului analizat (pudre nanoparticule emulsii suporturi compacte
suporturi poroase etc) se pot realiza teste de biocompatibilitate prin contact direct prin metoda
eluţiei (contact indirect) sau prin metoda difuziei Contactul direct presupune adăugarea propriu-
zisă a fragmentelor din materialul testat icircn godeurile plăcilor de cultură cultivate cu celule
contactul indirect presupune adăugarea unui extract din materialul analizat analizacircndu-se de cele
mai multe ori diverse concentraţii ale extractului iar metoda difuziei constă icircn acţiunea
78
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
compusului analizat asupra celulelor printr-un strat de gel de agaroză ce acoperă cultura de
celule Suporturile obţinute icircn studiul de faţă au fost analizate prin contact direct şi prin contact
indirect [139]
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare după ce suporturile au fost sterilizate
fragmente de suportextract de suport au fost puse pe plăcile de cultură conţinacircnd celule ce au
fost incubate icircn placi cu 24 ore icircnainte
Testele realizate pentru studiul biocompatibilităţii suporuturilor au fost testul MTT la 24
48 și 72 ore de contact şi testul de viabilitate celulară cu Calceina-AM
2471 Testul MTT
Pentru realizarea testului MTT ndash [bromură de (3-[45-dimetiltiazol-2-il]-25-difenil)
tetrazoliu] fragmentele de material au fost extrase şi mediul de cultură icircnlocuit cu soluție de
lucru MTT (MTT 5 icircn mediu de cultură fără BFS şi amestec de antibiotice) Testul MTT se
bazează pe capacitatea celulelor viabile cu metabolism activ să reducă MTT-ul icircn cristale de
formazan de culoare albastru-violet (figura 211) [140]
Figura 211 Structura bromurii de tetrazolium MTT şi a produsului redus formazan
Celulele cu soluția MTT au fost incubate la 37degC pentru un anumit interval de timp icircn
funcţie de tipul de celule după care s-a extras soluţia MTT cristalele de formazan formate fiind
solubilizate cu alcool izopropilic Absorbanța soluției de formazan rezultată (culoare albastru-
violet) a fost măsurată spectrofotometric la λ=570nm cu ajutorul unui cititor de plăci (Tecan
Sun-rise Plate Reader) Rezultatele citirii spectrofotometrice din godeurile experimentale au fost
79
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
raportate la godeurile de control icircn care nu au fost prezente fragmente de materialextract
Raportul calculat a constituit viabilitatea celulară (V)
V =
(15)
unde abs suport este absorbanța din godeul conţinacircnd fragment de suportextract iar abs control
este absorbanța controlului
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Calceina AM este un colorant care are capacitatea de a colora icircn verde doar celule viabile
icircn mod particular citoplasma acestora După ce pătrunde icircn celulă calceina AM substanţă
incoloră este hidrolizată de esteraza din citoplasmă icircntr-un produs verde fluorescent (figura
212) [139] Pentru realizarea testului mediul de cultură din godeuri a fost extras iar apoi celule
au fost spălate de două ori cu HBSS cu calciu fără roşu fenol Icircn final s-a adăugat soluţie de
calceină (1-2 microL calceină la 1 mL HBSS cu calciu fără roşu fenol) iar placa de cultura a fost
introdusă icircn incubator pentru 20 min După cele 20 min celulele s-au vizualizat la microscop
confocal cu fluorescenţă (Leica Germania) şi s-au preluat imagini Testul s-a realizat la intervale
de timp diferite icircn funcţie de metoda de contact şi tipul celulelor
Figura 212 Schema de legare a Caleinei ndash AM la celulele viabile
80
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
248 Teste de citotoxicitatea in vivo
Pentru a demonstra siguranța unui material medical după o caracterizare riguroasă acesta
trebuie testat din punct de vedere al citotoxicității in vivo
Testele de citotoxicitate in vivo au fost realizate conform recomandărilor ISO Standard
10993 la Facultate de Medicină Veterinară din Iaşi sub coordonarea domnului Prof Dr Mareş
Mihai Studiile au fost realizate conform Directivei UE 632010 și cu acordul comitetului de
etică din cadrul instituției
S-au utilizat șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie
de 28 plusmn 3 grame materialul biologic provenind din Biobaza INCDMI Cantacuzino București
- filiala Băneasa Animalele au fost ţinute icircn condiții zooigienice corespunzătoare speciei și
vacircrstei temperatură și umiditate constante regim de iluminare 12 orezi acces liber la hrană
(furaj combinat complex) manipularea animalelor fiind făcută cu blacircndețe fără a le produce
stres sau durere Cu 3 zile icircnainte de icircnceperea experimentului animalele au fost mutate icircn
laborator pentru a se acomoda cu mediul ambiant
Pentru implant materialele au fost secționate sub diverse forme pătrate sau discuri apoi
au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 4 ore Animalele au fost grupate
icircn loturi icircn funcţie de numărul de suporturi analizate fiecare lot cuprinzacircnd un anumit număr de
animale
Icircnainte de intervenția chirurgicală zona de implant a fost tunsă și aseptizată cu betadină
soluție cutanată 10 Implantarea fragmentelor de suporturi s-a realizat subcutanat icircn condiții
aseptice prin incizia sterilă a pielii din regiunea dorsală a șoarecilor Inducția anestezică (15-30
de secunde) s-a realizat cu isofluran 4 iar pentru a se asigura liniștea intraoperatorie pe
parcursul a 15 minute (timp necesar inciziei depunerii fragmentului de suport și suturii pielii) a
fost utilizată concentrația de 15
Durata experimentului a fost diferită icircn funcție de lotul de suporturi testate După
sacrificarea animalelor s-au efectuat examene histopatologice Icircn vederea realizării preparatelor
microscopice fragmentele de țesut (cu sau fară material) au fost fixate icircn soluţie de formaldehidă
10 timp de 7 zile şi apoi incluse icircn blocuri de parafină prin metoda rapidă de includere
Blocurile de parafină au fost secţionate apoi icircn secţiuni de 5 microm cu ajutorul microtomului de
laborator Secţiunile rezultate au fost etalate pe lame histologice cu ajutorul albuminei Mayer
81
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
colorate Tricromic Masson și examinate microscopic Preparatele au fost examinate la microscop
şi interpretate
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
La nivel mondial cancerul rămacircne a doua cea mai comună cauză de deces icircn ciuda
icircncercărilor avansate de prevenție diagnosticării icircn stadiu incipient și a protocoalelor de
tratament riguroase [141] Icircn ceea ce privește tumorile osoase acestea sunt diagnosticate icircn
special la pacienți adulți sau vacircrstnici excepție făcacircnd osteosarcomul tumoră icircntacirclnită
preponderent la pacienți cu vacircrste cuprinse icircntre 10 și 20 și destul de rar la vacircrstnici
Icircn unele cazuri tratamentul tumorilor osoase maligne are drept primă etapă rezecția
chirurgicală a tumorii iar icircn a doua etapă pacientul urmează ședințe de radioterapie Cele două
tehnici nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral chimioterapia precedacircndu-le de regulă
Plecacircnd de la această schemă de tratament s-au realizat studii privind potențiala aplicație a
suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircntr-o primă fază suporturile au fost expuse la raze X după care au fost caracterizate din
punct de vedere fizico-chimic și biologic icircn vederea analizei influenței radiațiilor asupra
proprietăților suporturilor
Iradierea suporturilor cu raze X s-a realizat cu ajutorul dispozitivului CT-Sim Siemens
Somatom Definition figura 213 Deoarce grosimea materialului iradiat a fost de aproximativ 12
mm acesta a fost fixat pe un suport de 5 mm a cărui dimensiune a fost inclusă icircn calculul
parametrilor de iradiere
Figura 213 Dispozitivul CT-Sim Siemens Somatom Definition (stacircnga)Simularea CT
(dreapta)
82
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi
Sistemele de eliberare controlată de medicamente sunt studiate pentru tratamentul
alternativ a unor tipuri diferite de cancer Cele mai studiate sisteme sunt cele pe bază de polimeri
ceramice sau compozite ale acetora Polimerii cei mai utilizați la realizarea de sisteme de
eliberare sunt polietilen glicolul (PEG) polietilen oxidul poli (caprolactona) chitosanul
alginatul alcoolul polivinilic polimetil metacrilatul celuloza etc Și unele proteine
preponderant colagenul sunt utilizate pentru realizarea de sisteme de eliberare controlată dar
instabilitate lor chimică și fizică ridică anumite probleme tehnice [141]
Doxorubicina a fost medicamentul chimioterapic avut icircn vedere pentru studiul de față
Pentru prepararea de suporturilor cu potențial de utilizare ca sistem de eliberare de medicament
icircntr-o suspensie coloidală de nanoparticule magnetice (1 ) obținute conform protocolului
descris anterior (subcaptiol 231) s-a solubilizat 0125 doxorubicină Nanoparticulele
icircncărcate cu medicament au fost folosite la prepararea de suporturi după protocolul descris icircn
subcapitolul 23
Eliberarea in vitro a medicamentului a fost studiată cu atenție Primul pas a fost imersarea
a 20 mg din fiecare probă icircn PBS pH = 72 001M icircntr-o memebrană de dializă care a fost
complet imersată icircntr-un alt volum de PBS Studiul de eliberare a fost efectuat la 37ordmC pe o
perioadă de 14 zile La anumite intervale de timp un volum de PBS icircn care a fost imersată
membrana de dializă a fost extras pentru analiza UV-Vis și icircnlocuit cu același volum de PBS
proaspăt Absorbanța fiecărui volum de PBS extras a fost analizată utilizacircnd spectrofotometrul
NanoDrop ND 1000 (Thermo Fisher) la 480 nm Pentru trasarea curbei etalon s-au preparat
soluţii de diferite concentraţii de medicament (pe domeniul 1 microg ndash 10 microg) icircn PBS
83
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe
bază de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic
gelatină) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și apatite hidroxiapatite sau alți fosfați de
calciu cu aplicații icircn ingineria tisualră a țesutului osos sunt studiate icircn detaliu de aproape două
decenii Imitarea matricei extracelulare a țesuturilor umane a devenit o provocare pentru
ingineria tisulară datorită complexității sale fizice chimice și biologice prin urmare este
esențială alegerea biopolimerilor care să satisfacă criterii de compatibilitate chimică
biocompabibiltate biodegradabilitate controlată Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul
biologic și degradați metabolic Chitosanul colagenul gelatina alginatul condroitin sulfatul și
acidul hialuronic sunt printre cei mai studiați biopolimeri datorită argumentelor menționate
anterior și a similarității lor cu componentele matricei extracelulare [142-144]
Chitosanul ndash Cs un biopolimeri foarte versatil este unul din cei mai studiaţi pentru
ingineria tisulară a țesutului osos datorită proprietăţilor sale remarcabile biocompatibilitate
biodegradabilitate proprietăţi antibacteriene hemostatice şi antitumorale [55 56 145-148] De
asemenea susţine in vitro adeziunea şi proliferarea celulară a osteoblastelor precum şi formarea
de matrice osoasă mineralizat [149] Icircn ceea ce priveşte comportamentul in vivo un număr
semnificativ de studii au demonstrat faptul că suporturile pe bază de chitosan susţin
osteoconductivitatea icircn defecte osoase obţinute chirurgical [150]
Gelatina ndash G proteină derivată din colagen este un biopolimer degradabil cu
biocompatibilitate excelentă adesea utilizată icircn domeniile biomedical şi farmaceutic Icircn
combinaţie cu alţi biopolimeri adesea cu chitosanul gelatina contribuie la creşterea adeziunii
celulare [151] [152]
Acidul hialuronic ndash Hya susţine regenerarea tisulară la locul defectelor osoase prin
stimularea formării de calus [153] De asemenea rezultatele unor studii in vitro și in vivo au
sugerat o legătură icircntre creștere sintezei de acid hialuronic după tratatamentul cu parathormon și
resorbția osoasă ulterioară ceea ce ar putea indica o posibilă relație icircntre sinteza biopolimerului
și creșterea activității osteoclastelor [154]
Studiile icircn domeniu au evidenţiat faptul că o concentraţie scăzută de albumină serică
bovină ndash Bsa poate susţine mineralizarea ţesutului osos prin stimularea creşterii cristalelor de
84
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
fosfaţi de calciu [155] [156] icircn schimb o concentraţie mare de albumină poate chiar inhiba
creşterea lor [157]
Avacircnd icircn vedere proprietăţile menţionate mai sus ale celor patru biopolimeri (chitosan
acid hialuronic gelatină şi albumină) s-a emis ipoteza că prin realizarea unor combinații ale
acestora cu fosfați de calciu și particule magnetice se pot obține suporturi magnetice cu
performanțe crescute icircn regnerarea tisulară osoasă (Figura 31)
Figura 31 Suporturi pe bază de biopolimeri fosfați de calciu și nanoparticule magentice
Fosfații de calciu componenta fazei anorganice a țesutului osos uman stimulează
osteoconductivitatea și osteoinductivitatea Importanța utilizării nanoparticulelor magnetice icircn
suporturi compozite pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost detaliată icircn capitolul 1
Alegerea unei concentrații de nanoparticule adecvată este o provocare o concentrație prea mică
poate avea riscul de a nu conferi proprietăți magnetice suportului icircn care sunt incluse iar o
concentrație prea mare poate duce la un eventual caracter citotoxic al suportului Studiile icircn
85
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
domeniu prezintă prepararea de suporturi magnetice ce au icircncoporate concentrații diferite de
particule 05 1 2 3 7 5 sau 10 [9091 92] etc
Pentru a putea concluziona care ar fi concentrația optimă de particule introdusă icircn sinteză
s-au selectat trei concentraţii diferite de particule magentice 1 3 și 5 astfel icircncacirct să se
evite efectele toxice menținacircndu-le pe cele magnetice icircn domeniile terapeutice
31 Obţinerea suporturilor
Suporturile s-au obţinut printr-o metodă biomimetică de co-precipitare a fosfaţilor de
calciu din precursorii săi icircn prezențicirc de biopolimeri și particule magnetice Astfel soluții de
Ca(NO₃)₂∙4H2O(40 icircn apă distilată) şi NaH2PO4middotH2O (25 icircn apă distilată) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri (Cs (1 icircn soluție 15 HCl) Hya (2 in apă distilată)
Bsa (2 in apă distilată) G (2 in apă distilată)) Soluţia de Cs (1) a fost obţinută prin
dizolvare de Cs icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Separat s-au adăugat soluții de Hya (2)
Bsa (2) și G (2) (icircn apă distilată) astfel icircncacirct concentraţia să fie 10 faţă de cantitatea totală
de chitosan introdusă icircn sinteză Icircn fiecare amestec de biopolimercombinaţii de biopolimeri şi
precursori de fosfaţi de calciu s-au integrat concentraţii diferite de particule magnetice 1 3
şi 5 raportat faţă de cantitatea de substanţă uscată introdusă icircn procesul de sinteză pH-ul
amestecului final a fost ajustat la 72-74 prin adaos de soluţie de amoniac NH4OH (25 )
Raportul CaP a fost menținut la 165 icircn toate suporturile valoare comparabilă cu cea din ţesutul
osos uman [158]
Fiecare amestec compozit a fost spălat de 3 ori cu apă distilată separat prin centrifugare
(5000 rpm 10 minute) iar ultimul pas a constat icircn liofilizarea amestecurilor timp de 24 h
Cele patru tipuri diferite de suporturi au fost codificate icircn funcţie de compoziţia lor după
cum se observă icircn tabelul 31
Tabel 31 Compoziţia şi codificarea suporturilor
Denumirea
Suportului
ChitosanAlt biopolimer Concentraţia de
MNPs
Cs 1
Cs
1
Cs 3 3
Cs 5 5
Cs-Hya 1 Cs-Hya 1
86
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs-Hya 3 3
Cs-Hya 5 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa
1
Cs-Bsa 3 3
Cs-Bsa 5 5
Cs-G 1
Cs-G
1
Cs-G 3 3
Cs-G 5 5
Suporturile biomimetice pe bază de diferite amestecuri de chitosan și biopolimeri
(albumină acid hialuronic gelatină) cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei (spectroscopia IR cu
transformată Fourier ndash FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de energie ndash EDS) difracţie
cu raze X (XRD) și morfologic (microscopie electronică de baleiaj ndash SEM) De asemenea s-a
urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au
analizat proprietăţile magnetice Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi
printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
32 Rezultate și discuții
321 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR picuri caracteristice
biopolimerilor din compoziţie fosfaţilor de calciu şi particulelor magnetice fiind identificate pe
spectrele FTIR (figura 32)
Icircn ceea ce priveşte spectrul FTIR al suportului Cs 3 s-au observat benzile caracteristice
Cs-ului după cum urmează gruparea -OH la 3430 cm-1
gruparea ndashCH2 la 2923 cmminus1
amida I la
1655 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii CndashN la 1322 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării
CndashO la 1029 cm-1
[159] Pentru acelaşi suport s-au mai putut observa picuri specifice grupării
fosfat PO43-
icircn regiunea 600 cm-1
[99] şi grupării FendashO din particulele magnetice la 560 cm
-1
[160]
87
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Icircn cazul suportului Cs-Bsa 3 s-a observat o creştere semnificativă a intensităţii picului
1657 cmminus1
ce corespunde amidei I drept rezultat a vibraţiei de icircntindere a grupării C=O din
legătura peptidică Picul de la numărul de undă 1546 cm-1
corespunde amidei II iar picul de la
1240 cm-1
amidei III din componenta proteică [161]
Figura 32 Spectrele FTIR ale suporturilor
Pe spectrul FTIR pentru suportul Cs-Hya 3 s-au observat următoarele picuri picul pentru
vibraţia de icircntindere a grupăriindashOH la 3422 cm-1
picul pentru gruparea -CH2 la 2923 cm-1
picul
pentru amida primară I la 1654 cm-1
picul pentru COO- la 1420 cm
-1 şi picul pentru C-O la 1029
cm-1
[162]
322 Compoziția suporturilor
Icircn figura 33 este redată difractograma XRD pentru suporturile obţinute datele XRD
oferind informaţii despre faza anorganică şi despre cristalinitatea acestora
88
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
S-au observat următoarele picuri caracteristice 303ordm 356ordm 535ordm şi 574ordm ce pot fi
associate planelor (220) (311) (422) şi (511) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF
No 65-3107) Picuri specifice fosfaţilor de calciu de la unghiurile 23ordm 26ordm 28ordm 32ordm 335ordm 40ordm
48ordm şi 50ordm sunt corelate cu planurile (121) (002) (210) (112) (300) (310) (203) (213) şi
confirmă formarea următoarelor tipuri de fosfaţi de claciu Ca(H2PO4)22H2OmCaHPO4
Ca4(HPO4)3 25 H2O respectiv Ca3H2(P2O7)24H2O [47]
De asemenea un aspect foarte important care a fost observat a fost acela că principalul tip
de fosfat de calciu format icircn structura suporturilor compozite este hidroxiapatita
(Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul de calciu cu cele mai bune proprietăţi pentru formarea de ţesut osos
Figura 33 Spectrul XRD pentru suporturile obţinute
Compoziţia chimică a suporturilor a fost studiată cu ajutorul analizei EDX rezultatele fiind
redate icircn figura 34 Principalele tipuri de fosfați de calciu identificati pe spectrele XRD și EDX
sunt prezentați icircn tabelul 32
Tabel 32 Diferite forme de CP prezente icircn compozitele Cs-CP conform datelor XRD și EDX
Forme de fosfați de
calciu Formulă chimică Raport CaP
MCPM Ca(H2PO4)2middotH2O 05
Fosfat monocalcic
anhidru Ca(H2PO4)2 05
89
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Fosfat dicalcic
anhidru CaHPO4 100
Hidroxiapatită Ca10(PO4)6(OH)2 167
Fosfat tricalcic Ca3(PO4)2 15
Figura 34 Spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3
Pe spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3 s-au observat semnale intense icircn
regiunea elementelor Ca P O C Fe ceea ce confirmă compoziţia suporturilor fosfaţi de calciu
biopolimeri particule magnetice De asemenea din datele EDX obţinute s-a calculat raportul
molar al fazei minerale dintre calciu şi fosfor rezultatele indicacircnd formarea de diferite tipuri de
fosfaţi de calciu icircn structura suporturilor evidenţiindu-se fosfatul tricalcic (CaP = 152) icircn cazul
suportului Cs-Bsa 3 şi hidroxiapatita icircn cazul suportului Cs-G 3 [163]
90
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
323 Morfologia suporturilor
Icircn figura 35 sunt prezentate datele SEM obținute pentru suporturile Cs 3 Cs-Hya 3
Cs-Bsa 3 și Cs-G 3 la diferite grade de mărire Morfologia a fost studiată icircn secţiunea
suporturilor imaginile evidenţiind o porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea
fosfaţilor de calciu pe structura polimerică Particulele magnetice sunt complet integrate icircn
structura compozită
Figura 35 Morfologia suporturilor la două ordine diferite de mărire
Suporturile sintetizate pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară a ţesutului osos trebuie să aibă o
structură poroasă specifică şi o dimensiune a porilor adecvată aplicaţiei vizate Icircn primul racircnd
porii suportului trebuie să fie interconectaţi pentru a promova adeziunea şi creşterea
osteoblastelor migrarea nutrienţilor şi vascularizarea precum şi infiltrarea icircn matricea biologică
[164] [165] Icircn ceea ce priveşte dimensiune porilor icircn literatură există date contradictorii acest
aspect fiind explicat de complexitatea procesului de regenerare osoasă in vivo Astfel unele
studii recomandă utilizarea suporturilor cu dimensiunea a porilor cuprinsă icircntr-un interval foarte
larg de la 20 microm pacircnă la 1500 microm [166] [167] alte studii recomandă o dimensiune a porilor
icircntre 150 şi 600 microm sau icircntre 400 şi 1500 microm [168]
91
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Dimensiunile porilor suporturilor sintetizate (tabel 33) au fost calculate din imaginile
SEM prin analiza cantitativă a parametrilor imaginilor utilizacircnd funcția threshold a programului
ImageJ
Pentru fiecare imagine SEM măsurătorile au fost repetate de 10 ori la final fiind calculate
dimensiunea maximă a porilor dimensiunea medie a porilor dimensiunea minimă a porilor și
deviația standard S-a observat că dimensiunile maxime ale porilor au fost icircnregistrate pentru
suportul Cs-Hya 3 iar dimensiunile minime pentru suportul Cs-Bsa 3 Cel mai mic interval
dintre minimul și maximul dimensiunilor unui suport a fost calculat pentru suportul Cs-Bsa 3
ceea ce indică că acest suport are cea mai uniformă distribuție a porilor
Tabel 33 Dimensiunea porilor (microm)
Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
Deviația
standard 99458plusmn18938 111525plusmn16967 75084plusmn9075 92383plusmn13549
Dimensiunea
minimă 398541 451762 319411 456391
Dimensiunea
maximă 1946331 213656 1121936 154929
Dimensiunea
medie 952598 988953 672699 8149395
324 Proprietăţi magnetice
Deoarece obiectivul tezei de faţă implică utilizarea de particule magnetice ce vor fi
funcţionalizate cu medicamente rolul particulelor fiind de transportori a principiilor active ce
vor fi eliberate controlat studiul proprietăţilor magnetice ale suporturilor este esenţială Pentru a
stabili concentraţia optimă de particule introduse icircn sinteză icircn acest prim studiu s-au analizat trei
concentraţii diferite Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 34
Tabel 34 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Susceptibilitatea
magnetică de
masă
Magnetizarea
(emug)
Cs 1 1 0016middot e-4
132
Cs 3 3 009middot e-4
742
92
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs 5 5 0123middot e-4
1014
Cs-Hya 1 1 0003middot e-4
025
Cs-Hya 3 3 minus minus
Cs-Hya 5 5 0152middot e-4
1253
Cs-Bsa 1 1 0027middot e-4
226
Cs-Bsa 3 3 0074middot e-4
610
Cs-Bsa 5 5 0099middot e-4
816
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de masă a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 025 şi 1253 emug au fost mai mici decacirct cele ale
particulelor magnetice (4365 emug) [160] ce nu au fost icircncorporate icircn suport sau icircn oricare altă
structură compozită complexă
Icircntr-un studiu publicat de Heidari şi colaboratorii [99] s-au obţinut şi caracterizat nano-
suporturi magnetice pe bază de chitosan şi hidroxiapatită cu o valoare a magnetizării de 304
emug măsurată la o intensitate a cacircmpului magnetic H = 5189 kOe la temperatura camerei Un
alt studiu publicat de Bock şi colaboratorii [90] prezintă sinteza şi caracterizarea de suporturi pe
bază de hidroxiapatită şi colagen cu incluziune de tipuri diferite de fero-fluide magnetice La o
intensitate a cacircmpului magnetic de 10 kOe s-au obţinut valori ale magnetizării cuprinse icircntre 12
şi 15 emug pentru toate tipurile de suporturi sintetizate S-a observat că pentru o concentrație de
1 particule magnetice valorile obținute pentru magnetizare sunt prea mici comparabile cu cele
din literatură pentru concentrația de 5 fiind obținute valorile cele mai apropiate Comparacircnd
valorile obţinute cu datele de literatură s-a putut afirma că suporturile obţinute sunt
superparamagentice
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Interacţiunea suporturilor cu fluidele de interes biologic este un aspect important icircn ceea ce
priveşte potenţialele aplicaţii ale acestora icircn domeniul ingineriei tisulare a osului Pentru
suporturile obținute s-a studiat interacțiunea suporturilor cu două fluide soluție tampon fosfat-
PBS și fluid biologic simulat - SBF
93
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de aproximativ 5 mg din fiecare suport a fost pus icircn contact cu o soluţie PBSSBF pH = 72
001M icircntr-o microcoloană QIAquickreg
Spin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o
seringă de 1 ml prin intermediul unei membrane de silicon Dispozitivele au fost incubate la
37ordmC pentru un interval de 48 ore după care s-a stabilit volumul de PBSSBF reţinut de fiecare
probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din capitolul 2
Rezultatele obţinute cu privire la acest studiu sunt redate icircn tabelul 35
Tabel 35 Gradul de retenţie PBS și SBF () al suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Gradul de
retenţie PBS
()
Grad de retenție
SBF
()
Cs 1 1 704plusmn22 680plusmn35
Cs 3 3 645plusmn12 632plusmn14
Cs 5 5 676plusmn21 530plusmn25
Cs-Hya 1 1 784plusmn24 667plusmn31
Cs-Hya 3 3 714plusmn45 630plusmn29
Cs-Hya 5 5 490plusmn22 475plusmn17
Cs-Bsa 1 1 700plusmn39 654plusmn41
Cs-Bsa 3 3 454plusmn61 567plusmn16
Cs-Bsa 5 5 806plusmn78 515plusmn20
Cs-G 1 1 465plusmn35 421plusmn34
Cs-G 3 3 805plusmn42 625plusmn09
Cs-G 5 5 755plusmn27 722plusmn15
Pentru toate suporturile s-au obţinut valori mari ale gradului de retenţie PBS () acestea
fiind cuprinse icircntre 400 şi 800 Aceste valori au fost corelate pe de o parte cu structura
poroasă tridimensională a suporturilor iar pe de altă parte cu proprietăţile hidrofile ale
biopolimerilor atribuite grupărilor lor funcţionale
Icircn cazul suporturilor icircn care matricea polimerică este reprezentată doar de chitosan s-a
observat o variaţie foarte mică a valorile gradului de retenţie cea mai mare valoare fiind
măsurată la suporturile cu o concentraţie minimă de particule magnetice Icircn schimb icircn cazul
94
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
suporturilor Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G s-a observat o influenţă semnificativă a particule magnetice
asupra gradului de retenție Astfel icircn cazul suporturilor care au Hya icircn compoziţie s-a observat o
descreştere a gradului de retenţie pe măsură ce concentraţia de particule magnetice creşte pe
cacircnd pentru suporturile ce conţin albumină s-a observat o valoare maximă a gradului de retenţie
pentru suportul cu cea mai mare concentraţie de particule magnetice Suporturile Cs-G au
valorile gradului de retenţie apropiate pentru concentraţiile de particule magnetice de 3
respectiv 5 valoarea minimă fiind icircn cazul suportului Cs-G 1
Icircn ceea ce privește interacțiunea suporturilor cu soluția SBF prezența ionilor pozitivi (Na+
K+ Ca
2+ Mg
2+) și a ionilor negativi (HPO4
2- Cl
- HCO3
2- SO4
2- ) precum și abilitatea acestora
de a interacționa cu componentele suporturilor diminuează retenția de fază apoasă a suporturilor
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea suporturilor a fost studiată in vitro icircn prezenţa lizozimului pentru o perioadă
de 16 zile rezultatele studiului fiind prezentate icircn figura 36 A fost utilizată o concentraţie de
lizozim cu valoare apropiată de concentraţia lizozimului icircn serul uman [169]
Figura 36 Degradarea suporturilor
Analizacircnd rezultatele (tabel 36) s-a observat că procesul de degradare are practic două
etape Icircn prima etapă ce corespunde primelor 8 zile a avut loc o degradare mai accentuată a
suporturilor pe cacircnd icircn a doua etapă a urmat o icircncetinire a procesului de degradare Acest proces
de degradare icircn două etape a fost prezentat şi icircn alte studii şi poate fi explicat de faptul că
02
0
4
06
0
8
Cs 1 Cs 3 Cs 5 Cs-Hya 1
Cs-Hya 3
Cs-Hya 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa 3
Cs-Bsa 5
Cs-G 1
Cs-G 3
Cs-G 5
Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat
m
moli
L
2 zile 8 zile 16 zile
95
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
lizozimul conține un loc de legare hexameric iar secvențele hexazaharidice conținacircnd 3-4 sau
mai multe unități acetilate au o puternică influenţă asupra vitezei inițiale de degradare a
chitosanului După o pierdere mare de masă inițială viteza de degradare a suporturilor a scăzut
considerabil ca rezultat al pierderii secvențelor de hexazaharidă [170]
Tabel 36 Degradarea in vitro a suporturilor icircn prezenţă de lizozim
Denumirea
suportului
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
2 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
8 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
16 zile (mmoliL)
Cs 1 04045plusmn00014 06800plusmn00042 07452plusmn00028
Cs 3 04081plusmn00007 06292plusmn00028 06727plusmn00057
Cs 5 03791plusmn00064 06510plusmn00014 07343plusmn00021
Cs-Hya 1 03574plusmn00049 05132plusmn00028 06075plusmn00014
Cs-Hya 3 03827plusmn00028 07017plusmn00028 07379plusmn00071
Cs-Hya 5 03755plusmn00064 07742plusmn00028 07814plusmn00014
Cs-Bsa 1 03175plusmn00042 05640plusmn00085 07162plusmn00028
Cs-Bsa 3 03538plusmn00028 06510plusmn00035 06655plusmn00014
Cs-Bsa 5 03538plusmn00028 06582plusmn00028 06655plusmn00014
Cs-G 1 04226plusmn00049 07669plusmn00014 07814plusmn00014
Cs-G 3 04154plusmn00007 07887plusmn00042 08032plusmn00014
Cs-G 5 05024plusmn00035 07887plusmn00014 08249plusmn00042
După cum se poate observa icircn tabelul 36 pentru toate cele patru tipuri diferite de suporturi
Cs Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G concentraţia de particule magntice adăugate nu influenţează
semnificativ degradarea acestora Pentru toate cele trei intervale de timp la care s-a analizat
concentraţia de Cs degradat cele mai mari valori au fost obţinute pentru matricile Cs-G 5
96
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
3271 Testul MTT
Pentru evaluarea citotoxicității in vitro pe culturi de celule s-a utilizat metoda contactului
indirect realizacircndu-se un extract din suporturile obținute care icircn prealabil au fost sterilizate 10
mg din suporturile Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3 au fost introduse icircntr-o membrană
de dializă conținacircnd 4 ml alcool etilic 70 membrana de dializă fiind introdusă la racircndul ei icircntr-
un flacon steril conținacircnd 25 ml alcool etilic 70 După 30 minute alcool din flacon a fost
evacuat membrana de dializă fiind lasată icircn hotă pentru evaporarea alcoolui după care a fost
spălată icircn repetate racircnduri prin imersare icircn 25 ml PBS Fiecare probă din membrană de dializă a
fost imersată icircn 4 ml mediu de cultură complet și lasată la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului După cele 24 ore extractul a fost filtrat printr-un filtru de 70 microm
după care s-a măsurat volumul rezultat şi s-au adăugat 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost adus icircn contact cu două linii celulare diferite preosteoblaste MC3T3
(figura 37) și fibroblaste din derm uman (figura 38) icircn placi de 96 godeuri fiecare godeu
conținacircnd 3000 celule Cele două tipuri de celule au fost incubate pentru 24 ore icircn mediu de
cultură DMEM conținacircnd 10 BFS și 1 PSN Mediul complet a fost icircnlocuit complet după
cele 24 ore cu 150 μL extract Testul MTT s-a realizat la 24 48 și 72 ore calculacircndu-se
viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (15) din capitolul 2
Figura 37 Viabilitatea celulară a preosteoblatelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
97
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 38 Viabilitatea celulară a fibroblastelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
După 24 ore viabilitatea preosteoblastelor a fost cuprinsă icircntre 91 (Cs 3) şi 95 (Cs-
Bsa 3) pe cacircnd viabilitatea fibroblastelor a fost icircn jur de 96 pentru toate cele patru suporturi
analizate diferenţa foarte mică de procente fiind explicată de sensibilitatea crescută a
preosteobastelor Pentru ambele linii celulare s-a observat o uşoară scădere icircn timp a viabilităţii
celulare cea mai mică valoare calculată 88 fiind pentru suportul Cs-Hya 3 după 72 de ore
de contact a extractului cu fibroblastele
Datele obţinute icircn urma testului MTT au indicat faptul că suporturile nu au eliberat
compuşi citotoxici icircnglobaţi icircn structura suporturilor icircn momentul sintezei sau neicircndepărtaţi
care să influenţeze negativ ataşarea şi proliferarea celulară
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată biocompatibilitatea suporturilor şi lipsa unor efecte adverse a
acestora asupra celulelor s-a realizat un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM rezultatele
testului fiind redate icircn figura 39 Acelaşi extract utilizat la testul MTT a fost incubat cu
fibroblaste pentru 24 respectiv 96 ore
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
98
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 39 Viabilitatea celulară icircn urma testului cu Calceină-AM
Comparacircnd imaginile reprezentacircnd celulele incubate cu extractul suporturilor Cs-Bsa 3
respectiv Cs-G 3 cu imaginile reprezentacircnd celule care au fost incubate fără extract s-a
observat că nu există diferenţe de densitate celulară la niciunul din cei doi timpi de contact ceea
ce indică lipsa efectelor adverse a suporturilor asupra fibroblastelor
Atacirct rezultatele obţinute icircn urma testului MTT cacirct şi rezultatele obţinute icircn urma testului
cu Calceină-AM au evidenţiat un comportament bun al suporturilor la contactul cu cele două linii
celulare (fibroblaste şi preosteoblaste) ceea ce a condus la concluzia că suporturilor sunt
biocompatibile in vitro
99
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
33 Concluzii
Icircn capitolul de față s-au obținut și caracterizat suporturi compozite pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de concentrații diferite de particule magentice
Chitosanul unul din biopolimeri cei mai utilizați icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost
combinat cu acid hialuronic albumină serică bovină sau gelatină
Analizacircnd structura chimică a suporturilor s-a observat icircn spectrele FTIR
prezența picurilor caracteristice tuturor componentelor introduse icircn sinteza Diferite tipuri de
fosfați de calciu au fost identificate icircn faza cristalină a suporturilor cel mai impotant dintre
aceștia fiind hidroxiapatita identificată icircn suportul Cs-G 3
Morfologia a fost studiată icircn secţiunea suporturilor imaginile evidenţiind o
porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea fosfaţilor de calciu pe structura polimerică
Particulele magnetice sunt complet integrate icircn structura compozită Dimensiunea minimă a
porilor a fost icircn jur de 300 microm iar dimensiunea maximă icircn jur de 2000 microm
Comparacircnd valorile obţinute pentru magnetizarea suporturilor cu datele de
literatură concentrația de 5 particule magnetice s-a dovedit a fi cea mai apropiată de datele
regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective De asemenea se poate afirma că suporturile sunt
superparamagnetice
Retenția fluidelor biologice simulate este influențată de morfologia suporturilor și
proprietățile hidrofile ale suporturilor iar viteza de degradare enzimatică in vitro este corelată cu
conținutul de fază polimerică
Testele de citotoxicitate in vitro indică faptul că suporturile obținute nu eliberează
substanţe citotoxice care să influenţeze negativ proliferarea celulară
100
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub
formă uscată
Icircn ingineria tisulară a ţesutului osos polizaharidele (chitosan acid hialuronic) şi proteinele
(colagengelatină fibroină din mătase albumină) se numără printre cele mai utilizate
biomateriale pentru sinteza de suporturi [37]
Chitosanul ndash Cs este unul din cei mai utilizaţi biopolimeri icircn ingineria tisulară datorită
proprietăţilor sale remarcabile Numeroase studii prezintă rezultate foarte bune ale acestui
biopolimer icircn aplicaţii vizacircnd regenerarea şi repararea ososă [56 148 151 171] Colagenul ndash
Col este un alt biopolimer adesea utilizat icircn ingineria tisulară proprietăţile ce icircl recomandă
pentru ingineria tisulară a ţesutului osos icircn mod particular fiind osteoconductivitatea şi
biocompatibilitatea Asocierea cu fosfaţi de calciu ajută la o integrare foarte bună a unui suport
pe bază de colagen şi fosfaţi de calciu icircn ţesutul osos icircn studii in vivo [90] Acidul hialuronic ndash
Hya un alt biopolimer cu proprietăţi foarte bune ce susţine regenerarea tisulară la locul defectelor
osoase contribuind la formarea de calus Icircn aplicaţii pentru regenerarea osoasă acidul hialuronic
este combinat cu fosfaţi de calciu şi cu alţi biopolimeri [142 172]
Plecacircnd de la componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă
anorganică 20-30 componentă organică și apă) cei trei biopolimeri mai sus menţionaţi au fost
amestecaţi cu fosfaţi de calciu din precursori Icircn sinteză a fost integrată şi o concentraţie de 5
particule magneticendash MNPs concentraţie stabilită icircn urma rezultatelor obţinute icircn capitolul 3 icircn
care au fost studiate trei concentraţii diferite de MNPs
41 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute printr-un procedeu biomimetic prin precipitarea de fosfați de
calciu (CP) din precursorii CaCl2 şi NaH2PO4 icircntr-o amestec de biopolimeri CsndashColndashHya
(chitosan ndash colagen ndash acid hialuronic) icircn prezenţă de soluţie apoasă de amoniacSoluţia de Cs
(1) a fost obţinută prin dizolvare de Cs purificat icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Soluția
de Col (tip I + III) a fost obţinută de la LohmannampRauscher GmbH Germania Concentraţia de
Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză Icircnainte de
procesul de precipitare icircn soluția de polimeri CsndashColndashHya s-au adăugat 5 particule magnetice
101
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sub formă uscată (5 față de cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza
suporturilor) Soluţiile apoase de CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost adăugate peste
amestecul de soluţii de biopolimeri şi particule magnetice şi omogenizate prin agitarea mecanică
după care pH-ul soluţiei a fost adus la valoarea de 72-74 cu ajutorul soluţiei de NH4OH (25)
S-a urmărit menţinerea pH la valoare menţionată pentru 24 orePentru eliminarea compuşilor
nereacţionaţi amestecul final a fost spălat cu apă distilată prin centrifugare la 5000 rotații pe
minut timp de 10 minute etapă repetată de trei ori Ultima etapă icircn obţinerea suporturilor a fost
liofilizarea la temperatura de -55ordmC timp de 24 h Etapele procesului de obţinere sunt prezentate
icircn figura 41
Figura 41 Obţinerea suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat un program
experimental cu două variabile (concentrația de Col - raporată la concentrația de Cs
respectiv raportul CaP) Icircn tabelul 41 este prezentată codificarea variabilelor independente ale
programului experimental iar icircn tabelul 42 domeniile de variaţie precum şi codificarea
suporturilor (P1 - P13)
102
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Tabel 41 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 42 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Cod suport X1 X2 Col Cs CaP
P1 -1 -1 35 65 16
P2 1 -1 65 35 16
P3 -1 1 35 65 17
P4 1 1 65 35 17
P5 -1141 0 2879 7121 165
P6 1141 0 7121 2879 165
P7 0 -1141 50 50 1579
P8 0 1141 50 50 1721
P9 0 0 50 50 165
P10 0 0 50 50 165
P11 0 0 50 50 165
P12 0 0 50 50 165
P13 0 0 50 50 165
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii chimice utilizacircnd
analiza FTIR iar din punct de vedere al morfologiei prin SEM De asemenea s-au analizat
comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora proprietăţile
mecanice și proprietăţile magnetice al suporturilor Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată
printr-un test MTT in vitro (contact indirect) şi in vivo pe şobolani Wistar
Deoarece orice suport ce se dorește a fi implantat icircn organismul uman trebuie sterilizat
icircnainte de implantare se urmărește realizare de suporturi care să nu-și modifice morfologia și
structura fizică şi chimică după sterilzare Icircn acest scop suporturile P5 P6 P7 P8 și P9 au fost
103
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru 4 ore Pentru suporturile sterilizate au
fost studiate morfologia și structura chimică
42 Rezultate și discuții
421 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR La fel ca icircn cazul
morfologiei suporturilor au fost analizate prin FTIR suporturile icircnainte şi după expunere la UV
pentru 4 ore
Icircn figura 42A se pot observa spectrele suporturilor P5 P6 P7 P9 şi a particulelor
magnetice ndash MNPs sub formă uscată icircnainte de expunere la UV iar icircn figura 42B spectrele
suporturilor P5 P6 P7 P8 P9 după expunere la UV
Structura chimică a MNPs a fost confirmată de prezenţa benzilor de absorbţie caracteristice
chitosanului gruparea -OH la 3431 cm-1
amida I la 1637 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii
CndashN la 1384 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1072 cm-1
precum şi grupării FendashO
a magnetitei la 560 cm-1
[160]
Pe spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P9 (icircnainte de expunere la UV) au putut fi
identificate benzi de absorbţie caracteristice celor trei biopolimeri după cum urmează gruparea -
OH la 3429 cm-1
(P6) 3430 cm-1
(P7) 3431 cm-1
(P5 P9) gruparea ndashCH2 la 2924 cmminus1
(P5 P9)
şi la 2925 cm-1
(P6 P7) amida I la 1637 cmminus1
(P5) 1638 cm-1
(P9) 1653 cm-1
(P6) 1655 cm-1
(P7) amida II la 1555 cmminus1
(P7) 1563 cm-1
(P6) amida III la 1240 cmminus1
(P7 P9) 1242 cmminus1
(P5) 1246 cmminus1
(P6) şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1031 cmminus1
(P5 P7) 1032 cmminus1
(P9) 1035 cmminus1
(P6) Icircn cazul suportului P6 care conţine cea mai mare cantitate de colagen s-a
observat o intesitate mai mare a benzilor amidelor I II şi III după cum era de aşteptat Icircn plus icircn
toate spectrele s-a observat prezenţa picului asociat grupării COO- a hialuronatului de sodiu la
1405 cmminus1
(P7 P9) 1406 cmminus1
(P6) şi 1410 cmminus1
(P5) [173]
Benzile caracteristice magnetitei din particulele magnetice icircncorporate icircn suporturi au fost
observate la 561 cm-1
(P5 P7 P9) şi 562 cm-1
(P6) Icircn toate spectrele se pot observa picuri
specifice grupării fosfat PO43-
la 603 cm-1
(P5) şi 604 cm-1
(P6 P7 P9) Datorită faptului că
benzile caracteristice magnetitei sunt foarte aproape de cele caracteristice grupării fosfat
sugerează o suprapunere a acestora şi faptul că nu pot fi separate [99]
104
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 42 Spectrele FTIR ale suporturilor A icircnainte de expunere UV B după expunere UV
Icircn figura 42B sunt redate spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P8 şi P9 după
sterilizare prin expunere la radiaţii UV La fel ca icircn cazul suporturilor care nu au fost sterilizate
s-a observat prezenţa picurilor caracteristice celor trei biopolimeri a picurilor caracteristice
fosfaţilor de calciu şi a picurilor caracteristice particulelor magnetice la numere de undă
apropiate de cele ale picurilor caracteristice componentelor suporturilor nesterilizate ceea ce a
indicat faptul că procesul de sterilizare utilizat nu influenţează structura chimică a suporturilor
obţinute
105
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
422 Morfologia suporturilor
Datele SEM oferă informaţii importante despre suporturile realizate pentru ingineria
tisulară a ţesutului osos deoarece studiază morfologia lor aceasta avacircnd o influenţă
considerabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale suporturilor Morfologia a fost studiată icircn
secţiunea suporturilor Pentru o privire de ansamblu 5suporturi cu compoziţii diferite au fost
analizate la diverse ordine de mărire De asemnenea s-au analizat suporturi ce au fost expuse
pentru 4 ore la radiaţii UV pentru a vedea dacă acest proces de sterilizare influenţează
morfologia suporturilor
Icircn figura 43 sunt prezentate datele SEM ale suporturilor P5 P6 P7 şi P8 icircnainte de
expunere la UV iar icircn fugura 44 după expunere la UV la două ordine de mărire diferite Se
observă o structură poroasă tridimensională cu pori interconecaţi
Figura 43 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 icircnainte de expunere la UV
La ambele ordine de mărire s-a observat o distribuţie uniform a particulelor magnetice şi a
fosfaţilor de calciu icircn structura compozită polimerică Distribuţia uniformă a particulelor
magnetice se datorează procedeului de icircncorporarea directă a acestora icircn sinteză date
106
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
asemănătoare ce susţin acestă metodă de icircncorporarea fiind regăsite şi icircn alte studii din literatura
de specialitate
Figura 44 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 după expunere la UV
Comparacircnd imaginile din figura 43 cu cele din figura 44 nu s-au observat diferenţe de
morfologie a suporturilor aceaşi structură tridimensională poroasă fiind prezentă şi icircn acest caz
ceea ce indică faptul că procesul de sterilizare prin expunere la radiaţii UV pentru 4 ore nu
influenţează morfologia suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de 5 mg din fiecare probă a fost imersat icircn PBS pH= 72 icircntr-o microcoloană (QIAquickreg
Spin
Colummn 50 diametru 10 mm) ataşată la o microseringă de 1 ml icircntreg sistemul fiind incubat la
37ordmC pentru 72 ore după care s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din
capitolul 2 S-au analizat două fragmente din fiecare tip de suport şi s-a calculat deviaţia
standard Rezultatele obținute icircn urma acestui studiu sunt redate icircn figura 45
107
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Gradul de retenție al suporturilor preparate pentru aplicații icircn inginerie tisulară influențează
răspunsul suporturilor la difuziunea celulelor nutrienților și medicamentelor caracteristici foarte
importante pentru aplicația vizată [174]
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor ce
a fost observată pe imaginile SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei biopolimeri
utilizați icircn procesul de sinteză O parte din PBS este implicat icircn interacțiunea cu matricea
polimerică iar o altă parte este reținută fizic icircn porii suporturilor Cea mai mare valoare a
gradului de retenție a fost calculată pentru P7 suport ce are cel mai mic raport CaP = 1579 iar
una din cele mai mici valori ale gradului de retenţie a fost calculată pentru P8 suport ce are cel
mai mare raport CaP = 1721 ceea ce indică o influenţă semnificativă a raportului CaP asupra
retenţie de fluide biologice simulate Practic fosfaţi de calciu acoperă matricea polimerică
icircngreunacircnd pătrunderea soluţie PBS icircn interior
Figura 45 Gradul de retenție maxim PBS () pentru suporturile obținute
Se poate observa de asemenea că valorile gradului de retenție măsurate pentru suporturile
cu aceași compoziție teoretică sunt apropiate ceea ce indică reproductibilitatea metodei utilizate
pentru sinteza suporturilor
108
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat reacția cu enzime utilizacircnd lizozim și
colagenază Primul pas a fost imersarea a aproximativ 10 mg din fiecare probă icircn 5 mL soluţ ie de
PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de dializă
introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS Două mostre din fiecare probă au fost supuse degradării
Probele au fost apoi incubate la 37ordmC La intervale de 4 ore 48 ore 72 ore 7 zile și 14 zile de la
incubare un volum de 2 ml din fiecare probă a fost extras şi analizat din soluţia de PBS icircn care
este imersată membrana de dializă cu proba de analizat din punct de vedere al concentraţiei de
chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la intervalele de timp mai sus
menţionate datele obţinute icircn urma studiului fiind redate icircn figura 46 Icircn toate cazurile s-a
observat o creștere a ratei de degradare icircn timp avantajul suporturilor biodegradabile icircn
comparaţie cu cele care nu se degradadează este resorbţia materialului icircn timp fiind astfel exclus
riscul de rejecţie a suportului de către organism
Suporturile P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri (65 Cs 35 Col) şi raport
CaP diferit P1 are raportul CaP = 16 iar P3 are raportul CaP = 17 Icircn cazul suporturile P2 şi
P4 a fost aceeaşi situaţie ca icircn cazul suporturilor P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri
(35 Cs 65 Col) diferenţa dintre ele fiind dată de raportul CaP P2ndash CaP = 16 P4ndash CaP =
17 Nu au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute pentru cele patru suporturi fiind
observată o degradare ce creşte gradual icircn timp
Icircn cazul suporturilor P7 şi P8 suporturi ce au cel mai mic raport CaP (1579) ndash P7 și cel
mai mare raport CaP (1721) ndash P8 şi aceeaşi compoziţie polimerică nu au fost observate
diferențe semnificative icircn ceea ce priveşte cantitatea de chitosan degradat la niciunul din cele 5
intervalele de timp Icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 care au aceeaşi compoziţie nu au fost
observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute icircn toate cazurile fiind observată o degradare
constatantă icircn timp
109
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 46 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturi
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat
Rezultatele privind analiza concentraţia de colagen degradat au fost redate icircn figura 47 Icircn
cazul suporturilor P1ndash P4 s-a observat o legătură evidentă icircntre concentrația de colagen degradat
și compoziția polimerică a suporturilor
Icircn acest studiu pentru a determina viteza de degradare a suporturilor s-a utilizat colagenaza
bacteriană o enzimă specifică pentru degradarea in vivo a colagenului care hidrolizează
preferențial legăturile X-Gly icircn următoarele grupe de aminoacizi glicină-leucină (Gly-Leu)
glicină-izoleucină (Gly-Ile) alanin-prolină-glicină (Ala-Pro-Gly)
Icircn ceea ce privește concentraţia de colagen degradat pentru suporturile P5 ndash P9 s-a
observat şi icircn acest caz o legătură stracircnsă icircntre concentrația de colagen degradat și compoziția
polimerică a suporturilor cele mai mari valori fiind obţinute pentru suportul P6 ce conţine 7121
colagen şi doar 2879 chitosan şi cele mai mici valori pentu suportul P5 ce conţine 7121
chitosan şi 2879 colagen
La fel ca şi icircn studiul concentraţie de chitosan degradat icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 nu
au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute ceea ce confirmă reproductibilitatea
metodei
110
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 47 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturi
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ egale iar după ce s-au
determinat dimensiunile au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii specificaţi icircn
capitolul 2 Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru
fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a calculat modulul lui Young iar
la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind prezentate grafic icircn figura 48
Oasele sunt organe rigide formate din ţesut osos măduvă osoasă endost periost cartilaj
nervi şi canale vertebrale Icircn funcţie de structura sa ţesutul osos este de două tipuri ţesut osos
compact (cortical) şi ţesut osos spongios (trabecular) Ţesutul osos compact este localizat la
suprafaţa osului şi după cum sugerează şi denumirea sa are o macrostructură omogenă şi
compactă Se găseşte la diafiza oaselor iar grosimea sa variază icircn funcţie de localizarea
anatomică Ţesutul osos spongios este o reţea de pori interconectaţi volumul de spaţiu gol fiind
cuprins icircntre 50 şi 90 şi este localizat icircn epifiza oaselor lungi
Cele două tipuri de ţesuturi spongios şi compact au o influenţă semnificativă asupra
proprietăţilor mecanice ale osului Scheletul uman este supus zilnic la diferite forţe icircn funcţie de
activităţile icircntreprinse forţele de tensiune forţele de compresiune şi forţele de forfecare fiind
cele care acţionează cel mai adesea asupra ţesutului osos Solicitările mai complexe cum ar fi de
111
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
exemplu icircncovoierea osului pot fi descompuse la racircndul lor icircn cele trei forţe menţionate
anterior Pentru a studia solicitările la care este supus ţesutul osos proprietăţile mecanice ale
osului cum sunt modulul de elasticitate (Young) rezistenţa la compresiune şi tensiunea trebuie să
fie pe deplin icircnţelese Icircn ceea ce priveşte modului lui Young notat cu E acesta are valori diferite
pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut osos astfel E este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru
ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru ţesutul osos spongios [168]
Figura 48 Modulul lui Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de
calciu cu incluziune de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young icircn cazul suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi
fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice au fost cuprinse icircntre 3841 MPa şi
22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător
valorilor Modulului Young al ţesutului osos spongios Asemănarea suporturilor obţinute cu
ţesutul osos spongios poate fi susţinută şi de datele SEM care au evidenţiat o structură poroasă
tridimensională
Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru suportul P5 suport ce are cea mai mare
cantitate de chitosan icircn compoziţie (7121 Cs 2879 Col) iar cea mai mică valoare s-a
obţinut pentru P2 unul din suporturile cu cea mai mică cantitate de chitosan (35 ) ceea ce
indică o icircmbunătăţire a rezistenţei la compresiune a suporturilor prin adăugare de chitosan icircn
sinteza suporturilor Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie P9 ndash P13 valorile obţinute
112
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
pentru E sunt apropiate ceea ce indică faptul că metoda de sinteza a suporturilor este
reproductibilă
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 rezultatele obținute fiind prezentate icircn tabelul 43
Tabel 43 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire
suport
Susceptibilitate
magnetică (volum)
Magnetizarea
(emug)
P1 0160 middot e-4
1319
P2 0154 middot e-4
1269
P3 0135 middot e-4
1113
P4 0254 middot e-4
2093
P5 0160 middot e-4
1319
P6 0047 middot e-4
387
P7 0242 middot e-4
1995
P8 0112 middot e-4
923
P9 0257 middot e-4
2118
P10 0254 middot e-4
2093
P11 0432 middot e-4
3561
P12 0810 middot e-4
6676
P13 0514 middot e-4
4236
S-a observat că valorile obținute sunt cuprinse icircntre 387 şi 6676 emug amintind că s-a
introdus in sinteză o concentrație de 5 particule magnetice sub formă uscată (5 față de
cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor) ceea ce indică că
suporturile obţinute sunt superparamagentice
113
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare s-a utilizat metoda contactului indirect
realizacircndu-se un extract din suporturile P5 şi P6 care icircn prealabil au fost sterilizate după aceeaşi
metodă descrisă icircn capitolul 3 subpunctul 327 Fragmentele de suporturi sterilizate au fost
ulterior imersate icircn 4 ml mediu de cultură DMEM și lăsate la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului urmacircnd apoi filtrarea extractului printr-un filtru de 70 microm
măsurarea volumul final şi adăugarea a 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost pus icircn contact cu două linii celulare diferite fibroblaste din derm uman
(NHDF Lonza) și preosteoblaste MC3T3 icircn placi de 96 godeuri 3000 celule godeuCele două
tipuri de celule au fost incubate separat pentru 24 ore icircn mediu de cultură DMEM complet
icircnlocuit după cele 24 ore cu 150 μl extract Testul MTT a fost realizat la 24 48 și 72 ore
calculacircndu-se viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (7) din capitolul 2 rezultatele testului fiind
prezentate icircn figura 49 pentru contactul indirect al suporturilor cu fibroblaste şi icircn figura 410
pentru contactul indirect al suporturilor cu preosteoblaste
Figura 49 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu fibroblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea fibroblastelor s-a observat o uşoară creştere icircn timp a
acesteia pentru ambele suporturi analizate Icircn cazul suportului P5 valorile calculate pentru
viabilitate au fost cuprinse icircntre 964 şi 979 valori ce au sugerat lipsa unor efecte adverse
ale extractului asupra fibroblastelor deci suportul a fost considerat biocompatibil Pentru
114
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
suportul P6 s-au calculat valori uşor mai scăzute ale viabilităţii celulare icircntre 88 şi 924 dar
chiar şi aşa acestea s-au icircncadrat icircn limitele care au permis să se afirme că suportul este
biocompatibil
Figura 410 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu preosteoblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea preosteoblastelor s-au calculat valori mai mici decat icircn
cazul fibroblastelor S-a observat o tendinţă de scădere a viabilităţii icircn timp cea mai mică
valoare de 83 fiind calculată pentru suportul P6 Icircn cazul suportului P5 cea mai mică valoare
calculată a fost de 87 Rezulatele obţinute icircn urma contactului indirect cu preosteoblastele au
indicat faptul că suporturile nu au eliberat compuşi citotoxici acestea fiind biocompatibile
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor
Testele in vivo pentru determinarea citotoxicității s-au realizat pe femele icircn vacircrstă de 6
săptămacircni Animalele au fost grupate icircn 2 loturi lotul martor format din 9 șoareci a fost utilizat
ca bază de comparație pentru lotul cu implant (II) ndash suportul P9 compus din 18 șoareci Cu
excepţia celor de control tuturor celorlalţi li s-au implantat subcutanat fragmente de suporturi cu
dimensiunea 1 cm x 1 cm
Durata experimentului a fost de 21 de zile La finalul primelor 7 zile de experiment au fost
sacrificați 3 șoareci din lotul martor și 6 din lotul II Inițial animalele au fost supuse zilnic unei
observații clinice amănunțite pentru a depista eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca
115
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
urmare a intolerabilității implantului după care au fost sacrificate iar tesuturile adiacente
implantului au fost examinate histologic La fel s-a procedat si pentru ceilalți șoareci sacrificați
la 14 și respectiv 21 de zile
Preparatele au fost citite la microscop şi interpretate Macroscopic nu s-au remarcat
modificări locale evidente Microscopic pe probele de ţesut recoltat ce includeau implantul şi
ţesutul din jur imaginile au indicat o reacţie inflamatorie cronică uşoară infiltraţie limfoidă
difuză şi capsulă conjunctivă icircn jurul implantului La loturile testate suportul compozit a icircnfaţişat
aspecte de biodegradare superficială La lotul martor fals implantat unul din animale a dezvoltat
o reacţie inflamatorie uşoară cu infiltraţii limfocitare perivasculare restul secţiunilor au relevat
o vindecare normală a plăgii chirurgicale
După 7 zile de la implantare icircn jurul materialului implantat se remarcă un infiltrat
inflamator moderat reprezentat de leucocite neutrofile histiocite și macrofage (figura 411A)
Totodată icircn țesutul conjunctiv din jurul implantului se observă un infiltrat celular mononuclear
interfibrilar susținut de o congestie a capilarelor limitrofe ce se regăsește și icircn structura
materialului implantat (figura 411B) Structurile profunde ale pielii (dermul și hipodermul) nu
suferă modificări alterative Se remarcă o ușoară densificare a țesutului conjunctiv subcutanat
printr-o sporire a elementelor celulare (fibroblastele) și fibrilare (fibrele de colagen ) ale acestuia
(fugura 411C)
Figura 411 Examen histopatologic după 7 zile de la implantare Colorare tricromic Masson
După 14 zile de la implantare materialul implantat are o structură mai ldquoaerisitărdquo probabil
consecință a resorbției tisulare a unor constituienți Icircn jurul materialului implantat se observă o
veritabilă capsulă conjunctivă formată din țesut conjunctiv tacircnăr ce are tendința de sechestrare a
acestuia și care trimite scurte travei spre zona centrală a materialului implantat (figura 412A)
Se observă la periferia materialului implantat travei (septe) conjunctive pornite din capsula
116
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
conjunctivă periferică ce infiltrează materialul implantat remarcacircndu-se tendința de icircnglobare a
acestuia (figura 412B) icircntr-un țesut conjunctiv neoformat lax icircncă imatur reprezentat din
fibroblaste și fibre de colagen tinere (figura 412C)
Figura 412 Examen histopatologic după 14 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
După sacrificarea animalelor la 21 zile de la intervenția chirurgicală de implantare
subcutatantă macroscopic (figura 413A) nu există modificări locale evidente icircn structurile
cutanate din dreptul implantului la nici unul dintre animalele examinate histopatologic
Microscopic s-a observat un țesutul conjunctiv neoformat icircncă imatur dezorganizat
constituit din fibroblaste active și fibre de colagen cu un aranjament anarhic repezentat de
vacircrtejuri și cordoane (figura 414A) De asemenea au fost remarcate mici depozite de fosfat de
calciu sechestrate icircn masa conjunctivă neoformată (figura 414B) și septe conjunctive constituite
din țesut conjunctiv cu dispoziție diametrală și care străbat materialul implantat cu tendința de a-
l icircngloba
Figura 413 Analiza macroscopică a implantului
117
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 414 Examen histopatologic după 21 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
Drept concluzie a studiilor in vivo ce au urmărit interacțiunile dintre suporturi și țesuturile
vii s-a remarcat o lipsă de citotoxicitate a implantului subcutanat susținută de absența oricărei
reacții locale sau sistemice de respingere
43 Concluzii
Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu au fost obținute
prin precipitarea de fosfați de calciu din precursori CaCl2 și NaH2PO4 icircntr-un amestec de trei
biopolimeri cu proprietăți remarcabile pentru regenerarea osoasă Cs Col și Hya Un program
experimental a fost folosit pentru optimizarea metodei 13 suporturi fiind preparate P1 ndash P13 Icircn
sinteză a fost integrate o concentrație de 5 MNPs
Structura chimică a suporturilor precum și morfologia acestora au fost studiate și
pentru suporturi ce au fost expuse la radiații UV timp de 4 ore procedeu utilizat icircn unele aplicații
biomedicale pentru sterilizare
Benzi de frecvență caracteristice biopolimerilor CP și MNPs au fost observate icircn
toate spectrele FTIR Nu au fost observate diferențe icircntre spectrele suporturilor expuse la radiații
UV și cele normale ceea ce icircnseamnă că acest proces de sterilizare nu influențează structura
chimică a suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată icircn secțiune cu ajutorul SEM S-a remarcat
o structură poroasă a suporturilor cu CP și MNPs distribuite uniform pe scheletul polimeric
Distribuția uniform a MNPs este atribuită procedeului de icircncorporare direct a acestora icircn etapa de
118
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sinteză La fel ca icircn cazul structurii chimice radiațiile UV nu infleunțează morfologia
suporturilor astfel acest proces de sterilizare poate fi utilizat pentru testele in vitro și in vivo
Determinarea gradului de retenție PBS s-a realizat utilizacircnd o metodă
volumetrică valorile obținute după 72 ore de la interacțiunea suportului cu fluidul la 37degC
indicacircnd o influență semnificativă a raportului CaP asupra proprietății studiate
Pentru studiile de degradare in vitro s-a studiat interacțiunea cu un complex de
două enzime lizozim și colagenază enzime implicate in vivo icircn procesele de degradarea a
chitosanului respectiv colagenului Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul
ambilor biopolimeri
Modului lui Young are valori diferite pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut
osos este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru
ţesutul osos spongios Valorile obţinute icircn cazul suporturile preparate au fost cuprinse icircntre 3841
MPa şi 22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul corespunzător modulului Young al
ţesutului osos spongios
Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor
Teste de citotoxicitate in vitro realizate icircn paralel pe două linii celulare diferite
fibroblaste și osteoblaste au indicat faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra celulelor
Caracterul non-citotoxic al suporturilor a fost evidențiat și in vivo după ce fragmente de
suporturi au fost implantate subcutanat la șoareci După 21 zile aceștia au fost sacrificați iar
fragmentele de țesut cu implant au fost analizate macroscopic și microscopic
119
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de
particule magnetice
Avacircnd icircn vedere proprietăţile biopolimerilor Cs Col şi Hya descrise icircn amănunt icircn
capitolele anterioare precum şi procedeul biomimetic de co-precipitarea de fosfați de calciu (CP)
din precursori CaCl2 şi NaH2PO4 un lot nou de suporturi a fost realizat conform metodei de
obţinere utilizate icircn capitolul 4 diferenţa dintre acest lot de suporturi şi lotul de suporturi
descrise icircn capitolul 4 fiind dată de modalitatea de incluziune a particulelor magnetice icircn etapa
de sinteză a suporturilor icircn cazul lotului din capitol 4 particulele au fost incorporate sub formă
uscată iar icircn cazul acestui lot particulele au fost icircncorporate sub formă de suspensie coloidală
51 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute prin acelaşi procedeu biomimetic utilizat icircn capitolul 4 Icircn
acest scop soluţii de precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri Cs (1) Col (1) Hya (1) şi 5 suspensie coloidală de
MNPs icircn apă (raportată la cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor)
pH-ul amestecului a fost apoi ajustat la 72-74 utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac iar după
spălare cu apă distilată pentru eliminarea compuşilor nereacţionaţi amestecurile au fost
liofilizate pentru 24h
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat şi de această dată
acelaşi program experimental cu două variabile (concentrația de Col - raportată la
concentrația de Cs respectiv raportul CaP) utilizat icircn capitolul 4 Icircn tabelul 51 este
prezentată codificarea varabilelor programului experimental iar icircn tabelul 52 sunt prezentate
domeniile de variaţie precum şi codificarea suporturilor (S1 - S13)
Utilizacircnd ecuației (3) din capitolul 2 s-au determinat valorile variabilelor investigate din
programul experimental icircmpreună cu răspunsurile obținute Coeficienţii de regresie au fost
determinaţi si sunt prezentaţi icircn tabelul 53 alături de coeficienți de corelație și de abatere
standard Variabila răspuns Y1 corespunde gradului de retenție PBS a suporturilor preparate ()
iar Y2 corespunde modului de elasticitate E (MPa) ndash tabel 54
120
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 51 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 52 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Codificare
Support X1 X2 Col Cs CaP
S1 -1 -1 35 65 16
S2 1 -1 65 35 16
S3 -1 1 35 65 17
S4 1 1 65 35 17
S5 -1141 0 2879 7121 165
S6 1141 0 7121 2879 165
S7 0 -1141 50 50 1579
S8 0 1141 50 50 1721
S9 0 0 50 50 165
S10 0 0 50 50 165
S11 0 0 50 50 165
S12 0 0 50 50 165
S13 0 0 50 50 165
Tabel 54 Eroarea asimetrică coeficienţii de corelare si de regresie determinați
a1 a2 a3 a4 a5 a6 COR ASE
Y1 0256534 0006965 0001565 -0033 -000592 -004559 0980261 0024421
Y2 894655 8300833 -204625 486659 -394375 9217909 0986554 7447254
121
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 54 Programul experimental icircmpreună cu valorile determinate pentru retenție PBS
() și E (MPa)
Codificare
suport X1 X2 Y1 ndash Retenție PBS () Y2 ndash E (MPa)
S1 -1 -1 121714plusmn21973 20925plusmn32
S2 1 -1 109649plusmn32378 27947plusmn22
S3 -1 1 239234plusmn17309 12001plusmn34
S4 1 1 163522plusmn10871 16201plusmn24
S5 -1141 0 138888plusmn24263 8668plusmn33
S6 1141 0 100628plusmn20724 12261plusmn29
S7 0 -1141 109091plusmn22104 9038plusmn21
S8 0 1141 121213plusmn5471 8372plusmn12
S9 0 0 138889plusmn18159 7628plusmn32
S10 0 0 138960plusmn18209 7873plusmn12
S11 0 0 146019plusmn1502 8089plusmn24
S12 0 0 141067plusmn10022 7942plusmn8
S13 0 0 141844plusmn9215 8034plusmn32
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei utilizacircnd
spectroscopia IR cu transformare Fourier (FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de
energie (EDS) şi difracţie cu raze X (XRD) Din punct de vedere al morfologiei au fost
caracterizate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM) și prin micro computer-tomografie
(microCT) De asemenea s-au analizat comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora proprietățile mecanice și proprietățile magnetice Citotoxicitatea
suporturilor a fost analizată printr-un test MTT in vitro (contact direct) şi in vivo pe şoareci din
linia CD1
Suporturile S7 S8 și S9 au fost sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru
4 ore şi au fost studiate morfologia și structura lor chimică cu scopul de a observa influenţa
porcesului de sterilizare asupra carcteristicilor menţionate
122
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
52 Rezultate și discuții
521 Structura chimică a suporturilor
Datele obţinute icircn urma analizei FTIR oferă informaţii despre structura suporturilor
Suporturile au fost analizate icircnainte şi după expunere la UV pentru 4 ore rezultatele fiind redate
icircn figura 51 S-au observat picuri pentru cei trei biopolimeri (Amide I C=O Amide II N-H
funcțiile OH grupari alifatice) fosfații de calciu (PO3-
4 la 563 cm-1
) și nanoparticule magnetice
[99 175]
Figura 51 Spectrele FTIR pentru suporturile S7 S8 S9
A icircnainte de expunere la UV B după expunere la UV
Benzile reprezentative pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 55 După cum se poate
observa benzile reprezentative pentru suporturile expuse la UV au valori foarte apropiate sau
chiar identice cu cele ale suporturilor care nu au fost expuse la UV ceea ce icircnseamnă că
123
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
radiațiile UV nu influențează structura chimică a acestora chiar și după o periadă mare de timp
(4 ore)
Tabel 52 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S1 și S3
IcircIcircnainte de expunere la UV DuDupă expunere la UV
Grupări
funcționale
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
OH 3421 3418 3409 3421 3419 3415
C-H 2937 2936 2934 2937 2942 2936
Amida I
C=O 1653 1659 1655 1655 1652 1655
Amida II
N-H 1556 1556 1552 1557 1556 1552
C-O 1030 1031 1030 1031 1030 1030
Fe-O 603 603 602 603 603 602
PO3_4
561 561 560 561 561 561
522 Compoziția suporturilor
Icircn figura 52 este redată difractograma XRD pentru suporturile S7 S8 și S9 Picurile
caracteristice specifice fosfaţilor de calciu ce pot fi associate planelor (002) (210) (112) (213)
și (004) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF No 65-3107) și unghiurile cu care
acestea sunt corelate sunt redate icircn tabelul 56 [176]
Figura 52 Spectrul XRD pentru suporturile S7 S8 și S9
124
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 56 Diferite forme de CP prezente icircn suporturile analizate conform JCPDS
Unghi 2ϴ (deg) Intensitate (ua) Index conform JCPDS Formula chimică
26 002 44-0778 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
28 210 44-0810 Ca3H2(P2O7)2 ∙ H2O
31 112 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
49 213 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
53 004 02-1350 CaHPO4
Icircn figura 53 este redat spectrul EDS pentru suportul S5 Numărul atomic pentru Ca a fost
292 iar pentru P a fost 148 ceea ce a indicat un raport CaP= 197 această valoare fiind
apropiată de valoare raportului CaP al fosfatului tertacalcic (TTCP) ndash Ca4(PO4)2O care este 200
[177]
Figura 53 Spectrul EDX pentru suportul S5
523 Morfologia suporturilor
Porozitatea caracterizată drept procentul de spaţiu gol dintr-un solideste una din cele mai
importante caracteristici ale unui suport realizat pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară şi
regenerarea ţesutului osos Porozitatea unui suport este influenţată de natura materialelor din
compoziţia sa precum şi de procesul de obţinere Un suport pentru regenerarea osoasă trebuie să
susţină migrarea şi proliferarea osteoblastelor şi a celulelor mezenchimale să permită
pătrunderea vaselor de sacircnge şi angiogeneza iar icircn final să contribuie la formarea de neoţesut
[178] Porozitatea unui suport influenţeză o serie de alte caracteristici esenţiale pentru un suport
125
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
realizat pentru aplicaţia menţionată anterior cele mai semnificative fiind biodegradabilitatea şi
proprietăţile mecanice
Rezultatele SEM sunt prezentate icircn figura 54 Figura 54A reprezintă suporturile S7 S8
S9 icircnainte de expunere la radiații UV iar figura 54B aceleași suporturi după expunere la
radiații UV La 500 microm se poate observa o structură poroasă a suporturilor şi icircncorporarea
particulelor magnetice și a cristalelor de calciu icircn matricea polimerică şi faptul că nu există
diferențe icircntre suporturile sterilizate și cele nesterilizate
Figura 54 Morfologia suporturilor S7 S8 S9 A Icircnainte de expunere la UV B După expunere
la UV
Pentru un studiu mai detaliat al morfologiei suporturilor fragmente din acestea au fost
scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi o
rotaţie de 05ordm Proiecţiile astfel obţinute au fost procesate şi reconstruite utilizacircnd programul
NRecon (Bruker Belgium) Trei regiuni de interes au fost selectate pentru fiecare proba iar
programul CTAn a fost utilizat pentru calcularea dimensiunii porilor precum şi dimaterului de
percolaţie Pentru calcularea porozităţii s-a utilizat metoda ldquosphere-fittingrdquo regasită icircn aplicaţia
BatMan a programului CTAn Pentru calcularea diametrului de percolaţie s-a utilizat metoda
126
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
descrisă de Ashworth şi colab [179] Pe scurt metoda ldquoshrink wraprdquo a fost aplicată pentru a
identifica volumul accesibil unui obiect virtual care poate penetra icircntreaga regiune de interes
utilizacircnd urmatoare ecuaţie
(16)
unde este o constantă de percolaţie egală cu 088 pentru sistemele 3D [180]
Vizualizarea distribuţiei porilor a fost efectuată utilizacircnd programul CTVox (Bruker
Belgium) Astfel o funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste
reconstrucţia 3D a probei de investigat iar un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare
Suportul care are cea mai mare dimensiune a porilor a fost suportul S7 iar suportul cu cea
mai mică dimensiune a porilor a fost suportul S8 Aceste două suporturi sunt practic suporturile
cu cel mai mic raport CaP ndash S7 (CaP = 1579) şi cel mai mare raport CaP ndash S8 (CaP = 1721)
ceea ce a indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra porozităţii
suporturilor Icircn ceea ce priveşte comparaţia porozităţii suporturilor din punct de vedere al
compoziţiei de biopolimeri s-a observat o dimensiune mai mare a porilor suportului S6
(conţinacircnd un raport mai mare de colagen)
Figura 55 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suporturile S6 S7 S8 S9
127
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn tabelul 57 sunt prezentate date despre dimensiunea şi distribuţia porilor (prezentate şi
icircn figura 55) volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
Tabel 57 Dimensiunea porilor suporturilor S5 S6 S7 S8
Denumirea
suportului
Dimensiunea
porilor (microm)
Volumul
regiunii de interes (mm3)
Aria regiunii de
interes (mm2)
S6 2121plusmn9091 222051 1027245
S7 27341plusmn10952 200577 955451
S8 13309plusmn6785 255724 1139832
S9 1388plusmn5284 316728 1343793
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost analizate icircn aceleaşi condiţii experimentale ca şi suporturile prezentate
icircn capitolul 4 Icircntr-o primă etapă suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ
egale s-au determinat dimensiunile şi au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii
specificaţi icircn capitolul 2 Pentru fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a
calculat modulul Young iar la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind redate icircn figura 56 și icircn
tabelul 53
Figura 56 Modulul Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu
cu incluziune suspensie coloidală de particule magnetice
0
50
100
150
200
250
300
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13
20925
27947
12001
16201
8668
12261
9038 8372 7628 7873 8089 7942 8034 E (
MP
a)
128
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young au fost cuprinse icircntre 7628 MPa şi 27947
MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător valorilor
Modulului Young al ţesutului osos spongios interval icircn care s-au icircncadrat şi valorile obţinute
pentru suporturile caracterizate icircn capitolul 4 Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru
suportul S2 avacircnd următoarea compoziţe 35 Cs 65 Col şi raportul CaP = 16 iar cea mai
mică valoare s-a obţinut pentru suportul S9 avacircnd următoarea compoziţe 50 Cs 50 Col şi
raportul CaP = 165 Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie S9 ndash S13 valorile obţinute
pentru E au fost apropiate ceea ce indică că metodă poate fi considerată reproductibilă din punct
de vedere al proprietăților mecanice Analizacircnd valoarea lui E din punct de vedere al influenţei
raportului CaP deci comparacircnd suporturile S7 (CaP = 1579 50 Cs 50 Col) cu S8 (CaP
= 1721 50 Cs 50 Col) s-au observat valori apropiate ale lui E de unde se poate
concluziona că raportul CaP nu influențează proprietățile mecanice ale suporturilor
525 Proprietăţi magnetice ale suporturilor
Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 58 S-a măsurat
susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime adimensională)
utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Tabel 58 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire suport
Susceptibilitate magnetică (volum)
Magnetizarea (emug)
S1 0295middot e-4
2431
S2 0382middot e-4
3148
S3 0414middot e-4
3412
S4 0304middot e-4
2505
S5 0272middot e-4
2241
S6 0439middot e-4
3618
S7 0476middot e-4
3923
S8 0399middot e-4
3288
S9 0539middot e-4
4442
S10 0749middot e-4
6173
S11 061middot e-4
5027
S12 0703middot e-4
5794
S13 0817middot e-4
6733
129
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13)
din capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 2241 şi 6733 emug indică faptul că suporturile
obținute sunt superparamagnetice
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Valorile gradului de retenție obținute pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 53 și
figura 57 Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a
suporturilor dovedită de datele SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei
biopolimeri utilizați la fabricarea suporturilor
Figura 57 Grad de retenţie PBS
Se poate afirma că o parte din PBS interacționează cu matricea polimerică iar o altă parte
este reținută fizic icircn porii suporturilor Inițial icircn PBS moleculele de H2O intră icircn suporturi prin
1579
165
1721
900
1200
1500
1800
2100
2400
287
9
37
27
45
75
542
3
627
1
712
1
CaP
GR
(
)
Colagen ()
2100-2400
1800-2100
1500-1800
1200-1500
900-1200
130
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
pori pentru a umple spațiile interne Pe de altă parte numărul de grupuri polar este de asemenea
un factor important care afectează hidrofilia materialului [181] Adăugarea de fosfați de calciu
icircn compoziția suporturilor duce la o scădere a gradului de retenție
527 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd un amesctec
de două enzime lizozim și colagenază Metoda de lucru utilizată a fost aceeaşi ca cea utilizată pentru
degradarea suporturilor obţinute şi caracterizate icircn capitolul 4 10 mg din fiecare probă s-a imersat icircn
5 ml soluţie de PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de
dializă introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS după care au fost incubate la 37degC La anumite
intervale de timp s-a extras şi analizat un volum din cei 10 ml PBS din punct de vedere al
concentraţiei de chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la 2 ore 48 ore 7 zile şi 14 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate icircn figura 58
Figura 58 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Comparacircnd valorile obținute nu s-a observat o dependență clară a vitezei de degradare a
concentrația de chitosan chiar dacă toate materialele sunt degradate treptat Comportamentul se
0
02
04
06
08
1
S5 S6 S7 S8 S9
(Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat)
middot100
m
moli
L
2 ore 48 ore 7 zile 14 zile
131
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
datorează interacțiunilor ionice ale chitosanului cu colagenul și fosfații de calciu care modifică
conformația situsului de legare pentru lizozim [182]
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat
Concentraţia de colagen degradat a fost analizată la 4 ore 48 ore 72 ore şi 7 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate sub formă de grafic
Figura 59 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Hidrolizarea colagenului din suporturi de către colagenază enzima implicată icircn procesul de
degradare al acestei proteine in vivo are două etape Icircntr-o primă etapă enzima se atașează la
suport și apoi rupe locurile specifice care corespund structurilor de aminoacizi pentru care
enzima are specificitate Condițiile de mediu (pH tărie ionică inhibitori de enzime) și
caracteristicile materialelor (compoziție structură supramoleculară și porozitate) sunt parametri
care dictează viteza de degradare și biointegrarea controlată a suportului Toate suporturile au
fost degradate icircn timp cu vitezediferite
0
005
01
015
02
025
S5 S6 S7 S8 S9
Con
centr
aţi
a d
e co
lagen
deg
rad
at
mm
oli
L
4 ore 48 ore 72 ore 7 zile
132
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
5281 Testul MTT
Citotoxicitatea in vitro a suporturile obținute a fost analizată utilizacircnd un test MTT test ce
a oferit informații despre viabilitatea a trei linii diferite de celule fibroblate celule STEM și
osteoblaste la contactul direct cu fragmente de suporturi
Rezultatele prezentate icircn figura 510 indică lipsa citotoxicităţii suporturilor asupra
fibroblastelor valorile viabilităţii celulare fiind mai mari de 80 pentru toate cele trei suporturi
S7 S8 S9 şi pentru toţi cei trei timpi de contact
Icircn urma contactului direct al suporturilor S1 S3 S13 pentru 24 ore 48 ore respectiv 72
ore cu celule stem rezultate redate icircn figura 511A s-au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce
cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de 97 (S1) 98 (S13) și 99 (S3) ceea ce indică a
foarte bună biocompatibilitate a probelor
Figura 510Viabilitatea fibroblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile S7 S8 S9
Suporturile S1 S3 şi S13 au fost puse icircn contact direct şi cu osteoblaste rezultate fiind
redate icircn figura 511B dar rezulatele obţinute icircn acest caz nu sunt la fel de bune ca icircn cazul
contactului direct cu celulele stem osteoblastele fiind celule cu o sensibilitate ridicată Teste
suplimentare sunt necesare icircn acest caz
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
()
Control S7 S8 S9
133
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Figura 511 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile S1 S3 S13
A Utilizacircnd celule stem B Utilizacircnd osteoblaste
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată lipsa de citotoxicitate suporturile la contactul direct cu
celulele stem s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-AM rezultatele obţinute
fiind prezentate icircn figura 512
Figura 512 Viabilitatea celulelor STEM icircn contact cu suporturile S1 şi S3
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
cel
ula
ră
Control S1 S3 S13 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
Control S1 S3 S13 B
134
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu
suporturile S1 şi S3 atacirct la 24 ore cacirct şi la 96 ore ce ce confirmă icircncă o dată faptul că suporturile
nu eliberează compuși citotoxici și totodată structura lor nu influențează negativ activitatea
celulelor stem
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor
La fel ca icircn capitolul 4 citotoxicitatea in vivo a suporturilor din acest lot a fost studiată pe
șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28 plusmn 30 grame
icircntr-o stare de icircntreţinere foarte bună găzduițiți icircn condițiile adecvate
Pentru implant materialele au fost secționate sub forma unor discuri cu diametrul de 15
mm (A=17671 mm2) apoi au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 10
minute Animalele au fost grupate icircn 3 loturi lotul 7 (corespunzător suportului S7) lotul 8
(corespunzător suportului S8) și lotul 9 (corespunzător suportului S9) fiecare lot cuprinzacircnd un
număr de 12 animale
Animalele au fost supuse la o intervenție chirurgicală de implantare subcutanată descrisă
icircn capitol 2 subcapitolul 248 Durata studiului a fost de 64 de zile La finalul primelor 48 ore de
experiment au fost sacrificați cacircte 3 șoareci din fiecare lot (7 8 9) apoi cacircte alți 3 din fiecare lot
la intervale de 12 34 respectiv 64 de zile
Inițial animalele au fost supuse zilnic unei observații clinice amănunțite pentru a depista
eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca urmare a respingerii implantului după care au
fost eutanasiate prin administrarea unei supradoze de izofluran Zona de implant a fost deschisă
chirurgical fără a leziona excesiv țesutul Țesuturile adiacente au fost examinate macroscopic
fiind apreciate modificările din zona de implant (porțiunea centrală a implantului) și din jurul
acesteia respectiv prezența hemoragiei necrozei infecției și modificarea culorii țesutului
Histologic fiecărui șoarece i s-au recoltat probe de țesut din zona de implant și adiacentă
acesteia pentru a evalua populația de celule din jurul implantului Aceste probe au fost fixate icircn
formol 10 apoi incluse la parafină colorate Tricromic Masson și examinate microscopic
Pentru suporturile din acest lot deoarece durata experimentului a fost mai mare s-a evaluat
gradul de icircncapsulare a materialelor (granulom de corp străin) măsuracircnd grosimea capsulei de la
periferia spațiului ocupat de implant pacircna la marginea exterioară a acesteia Scorul icircncapsulării a
fost realizat conform recomandărilor ISO Standard 10993 prezentate icircn tabelul 59
135
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 59 Scorul icircncapsulării
Capsulă Scor
Absentă 0
gt 05 mm 1
06 ndash 10 mm 2
11 ndash 20 mm 3
gt 20 mm 4
Cerințele testului sunt icircndeplinite dacă diferențele dintre scorul mediu al animalelor din lot
este lt 10 mm
Icircn urma observațiilor clinice nu se observă modificări ale țesuturilor adiacente implantului
integritatea pielii nu este modificată nu sunt prezente semne de turgescență icircnroșire erupție sau
piloerecție La racircndul lor datele histologice susțin ipoteza biocompatibilității compozitului pe
baza de polimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Figura 513 Suportul S7 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
Icircn cazul bioimplanturilor diferite tipuri de celule interacționează și conduc la răspunsuri
specifice iar icircnțelegerea acestor mecanisme ne conduc către realizare unor suprafețe de implant
136
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
cu o mult mai mare compatibilitate cu structurile biologice Fiecare implant ne-natural induce un
răspuns inflamator acutdin partea organismului dar nu răspunsul icircn sine este important ci
icircntinderea și intensitatea sa Prin urmare orice test de biocompatibilitate a unui anumit material
trebuie să se bazeze pe evaluarea populației de celule din jurul implantului
Markeri importanți pentru biocompatibilitate sunt tipurile de celule care apar după
implantarea materialului străin Icircn literatura de specialitate nu este clar dacă prezența celulelor
gigant de corp străin marchează o incompatibilitate a biomaterialului sau dacă acestea denotă un
comportament de degradare normală a materialelor biomaterialelor resorbabile [183] Orice
biomaterial implantat este recunoscut de către organism ca un rdquonon selfrdquo Icircn mod obișnuit toate
biomaterialele implantate icircn țesutul conjunctiv induc un răspuns din partea gazdei proces
inflamator acut a cărei formă de manifestare și intensitate diferă
Figura 514 Suportul S8 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
După Hench și Best dacă biomaterialul este (I) toxic țesuturile din jur mor (II) netoxic și
biologic inactiv (aproape inert) apare un țesut fibros de formă și grosime variabilă (III) netoxic
și biologic activ (bioactiv) se produce o legătură interfacială stracircnsă material-structură biologică
(IV) netoxic și se dizolvă țesuturile din jur icircl icircnlocuiesc [184] Amplitudinea și durata
137
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
procesului inflamator are o influență determinantă asupra stabilității și compatibilității
biomaterialului implantat [185]
Figura 515 Suportul S9 la 48 ore 12 zile și 64 zile post-implantare
Reacția organismului este evidentă icircn primele 48 de ore de la implantare manifestată
printr-un proces inflamator accentuat la materialele 7 și 8 și mai redus ca intensitate icircn cazul
suportului S9 Se constată un aflux celular semnificativ reprezentat de macrofage neutrofile
leucocite rare limfocite fibroblaste și fibre de colagen Infiltratul inflamator a fost mai redus
caracterizat prin prezența de rare leucocite neutrofile și macrofage la S9
La 10 zile de la prima evaluare (12 zile de la debutul experimentului) la suporturile S7 și
S8 reacția fibroasă periferică este mai intens exprimată prin fiboblaste și fibre de colagen cu
orientare concentrică Infiltratul inflamator este reprezentat de macrofage limfocite histiocite și
fibroblaste La suportul S9 se icircnregistrează o proliferare fibroasă cu tendință de icircnglobare a
materialului Reacție giganto-celulară cu celule gigante de corp străin icircn ale căror citoplasme se
pot observa particule fagocitate din biomaterial Primele celule care se atașează materialului de
implant sunt fibroblastele Ele produc un colagen imatur observabil pe suprafața implantului
[186]
Prezența fibrelor de colagen și a fibroblastelor este considerată o reacție tisulară normală
Icircn acest strat (fibrinos) prezența de macrofage și neutrofile joacă un rol important icircn
138
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
transformarea implantului icircntr-un material biologic recunoscut și acceptat de către organism
[187]
Prezența macrofagelor inclusiv dezvoltarea țesutului de granulație este un răspuns firesc din
partea organismului ca parte a comportamentului normal de degradare a materialelor cel puțin
icircn cazul biomaterialelor degradabile [188]
De asemenea macrofagele modulează reacția tisulară prin producerea de interleukine
factori de creștere și alți agenți bioactivi precursori ai celulelor gigant de corp străin [189]
Interacțiunea macrofage-limfocite este una complementară Probabil adeziunea macrofagelor la
o suprafață este semnalul pentru activarea limfocitelor iar prezența limfocitelor influențează la
racircndul lor activitatea macrofagelor [190] și fuziunea [191]
Următoarea etapă a răspunsului gazdei este marcată de atracția monocitelor și acțiunea
mastocitelor cu eliberarea de histamină [192] Această reacție este unică și nu pare să depindă de
tipul de implant Amploarea reacției și grosimea stratului inflamator (index pentru
biocompatibilitate) depinde de natura chimică și topografia implantului Anderson consideră că
prezența celulelor mononucleare inclusiv limfocite și celule plasmatice este considerată
inflamație cronică icircn timp ce reacția la corp străin cu dezvoltarea țesutului de granulație este
considerată un proces de videcare normal a unei răni ca răspuns la implantul de biomateriale La
34 de zile de la implant icircn cazul tuturor celor trei suporturi se observă o tendință de icircnglobare
tisulară a acestora prin invazie conjunctivă (scorul mediu al icircncapsulării a fost de 1 sub 05 mm)
și un infiltrat inflamator redus Este un proces normal de invazie a fibroblastelor și de sinteză a
matricei extracelulare prin acești fibroblaști activi Se termină icircntr-un strat interior de macrofage
șisau celule de corp străin cu o zonă secundară icircn afara fibroblaștilor și țesutului conjunctiv care
icircnconjoară materialul de implant [193]
După 64 de zile de la implantare se icircnregistrează o tendință evidentă de asimilare și
resorbție a celor trei tipuri de biomateriale și delimitarea acestora icircn insule mici izolate de țesut
fibros Răspunsul organismului icircn cazul celor trei tipuri de materiale a fost unul normal
caracterizat printr-o reacție inflamatorie acută a cărei intensitate s-a redus după primele 48 de
ore Grosimea capsulei fibroase este sub 05 mm (scor 1) aspect care influențează icircn mod pozitiv
degradarea și resorbția materialului icircn timp acestea făcacircdu-se ușor și fără o reacție celulară
semnificativă
139
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
53 Concluzii
Utilizacircnd același procedeu biomimetic de co-precipitare și același program
experimental folosite și icircn capitolul 4 s-au preparat 13 suporturi notate S1 ndash S13 Diferența icircntre
cele două loturi de suporturi preparate pentru potențiale aplicații icircn regenerarea osoasă a fost dată
de forma de prezentare a MNPs incluse icircn compoziție Icircn capitolul 4 MNPs au fost incluse icircn
sinteză sub formă uscată pe cacircnd icircn capitolul de față au fost introduse sub formă de suspensie
coloidală icircn apă urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura
suporturilor Pentru ambele loturi s-a folosit o concentrație de 5 MNPs față de cantitatea de
substanță uscată de biopolimeri și fosfați de calciu introduse icircn sinteză
Datele FTIR au evidențiat prezența de picuri caracteristice pentru toate
componentele suporturilor La fel ca icircn capitolul precedent o parte din suporturi au fost
sterilizate prin expunere la radiații UV timp de 4 ore Comparacircnd datele FTIR pentru suporturile
expuse la UV și cele ne-expuse nu s-au observat diferențe benzile reprezentative ale grupărilor
funcționale specifice componentelor suporturilor avacircnd valori foarte apropiate sau chiar egale
Datele XRD și EDS au analizat tipurile de fosfați de calciu formate pe matricea
polimerică cele mai reprezentative forme identificate fiind fosfat dicalcic ndash CaHPO4
hidroxiapatită ndash Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2 și fosfatul tetracalcic ndash Ca4(PO4)2O
Datele SEM au evidențiat o structură poroasă CP și MNPs fiind distribuite
uniform icircn matricea polimerică Ca și icircn cazul datelor FTIR s-a studiat icircn paralel și morfologia
suporturilor expuse la radiații UV demonstracircndu-se că acest tip de sterilizare nu influențează
morfologia acestora Un studiu mai detaliat al morfologiei a fost studiat cu ajutorul analizei
microCT Rezultatele au indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra
porozităţii suporturilor
Valorile obţinute pentru modulul lui Young se situează icircn intervalul 7628 MPa ndash
279 47 MPa Rezultatele sunt icircncurajatoare deoarece modului lui Young pentru osul spongios
se icircncadrează icircntre 20 MPa și 500 MPa
140
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn ceea ce privește proprietățile magnetice ale suporturilor s-a calculat
magnetizarea valorile obținute fiind cuprinse icircntre 2241 și 6733 emug Aceste valori indică
faptul cu suporturile sunt superparamagnetice
Gradul de retenție al suporturilor are valori foarte mari cuprinse icircntre 945 și
2248 valori corelate cu structura poroasă și proprietățile hidrofile ale biopolimerilor din
compoziție Degradarea enzimatică a suporturilor s-a realizat cu o viteză constantă icircn timp atacirct
pentru Cs cacirct și pentru Col
Citotoxicitatea in vitro a suporturilor a fost testată pe trei linii celulare diferite
fibroblaste osteoblaste și celule STEM Un test MTT standard a fost realizat la 24 ore 48 ore și
72 ore la fiecare timp calculacircndu-se viabilitatea celulară Suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor cele mai bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Pentru osteoblaste s-au
obținut valori mai reduse ale viabilității celulare comparativ cu celelate două linii celulare
explicate de sensibilitatea ridicată a acestui tip de celule
Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost studiată pe șoareci femele din linia
CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de la implantarea subcutanată a
fragmentelor sterilizate de suporturi O reacție inflamatorie acută a avut loc icircn primele ore de la
implantarea a cărei intensitate s-a redus dupăprimele 48 ore Analizacircnd icircn amănunt datele
histlogice obținute la diverse intervale de timp la sfacircrșitul testului s-a ajuns la concluzia că
suporturile nu au efect citotoxic in vivo totodată s-a observat asimilarea și resorbția suporturilor
141
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
Reproductibilitatea este una din ipotezele de bază icircn experimentele științifice Dacă un
experiment nu este reproductibil rezultatele lui nu poate fi dovedite deci prin urmare nu pot fi
acceptate
Acest aspect a creat dificultăți majore icircn majoritatea domeniilor științifice De exemplu icircn
domeniul biologic probele de microbiologie depind direct de tulpinile acestora ceea ce conduce
la o lipsă de consecvență a rezultatelor deoarece fiecare grup de cercetare poate folosi propriile
tulpini Dificultăți icircn reproductibilitatea experimentelor științifice sunt observate și icircn domeniul
ingineriei tisulare Icircn acest sens icircn timpul oricărui experiment științific trebuie avute icircn vedere
două aspecte importante repetabilitatea și reproductibilitatea metodei acestea fiind componente
ale preciziei icircntr-un sistem de măsurare Cei doi termini se referă la măsurarea unui set de
condiții care includ aceeași procedură aceeași operatori același sistem de măsurare și aceleași
condiții de funcționare Repetabilitatea are loc icircn aceași locație pe cacircnd reproductibilitatea are
loc icircn locații diferite [196 197]
Reproductibilitatea slabă pune la icircndoială rezultatele științelor biomedicale Problema
principală este dată de complexitatea procesul de cercetare științifice
Icircn capitolele 4 și 5 au fost prezentate prepararea și caracterizarea a două loturi de suporturi
ambele fiind realizate printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare Icircn acest scop soluţii de
precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost amestecate cu soluţii de
biopolimeri Cs (1) C (1) Hya (1) şi MNPs pH-ul amestecului a fost ajustat la 72-74
utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac ndash NH4OH iar după spălare amestecurile au fost liofilizate
pentru 24 h
Diferenţa dintre cele două loturi de material este data de modalitatea de incluziune a
particulelor magnetice icircn etapa de sinteză a suporturilor obţinacircndu-se icircn cele din urmă
142
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Lot numărul 1 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată
Lot numărul 2 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
Pentru ambele loturi a fost utilizat un program experimental cu două variabile (concentrația
de chitosancolagen și raportul CaP) cu scopul de a se determina compoziția optimă a
suporturilor Respectacircnd valorile teoretice din programul experimental s-au obţinut 13 probe
Concentraţia de Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză
iar pentru raportul CaP au fost alese valori apropiate de cele identificate icircn țesutul osos uman
611 Obținerea suporturilor
Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi lotul numărul 2 s-a
dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul numărul
9 ndash S9 s-a dovedit a fi cel mai aproape de un suport ideal
Astfel pentru a demonstra reproductibilitatea metodei obiectivele următoare au fost
obţinerea şi caracterizarea a 7 suporturi avacircnd compoziţia teoretică a suportului 9
Suporturile obţinute au fost notate S91 ndash S97 și au fost caracterizate din punct de vedere
al structurii chimice utilizacircnd spectroscopia IR cu transformată Fourier ndash FTIR iar din punct de
vedere al morfologiei prin microscopie electronică de baleiaj ndash SEM și micro computer-
tomografie (microCT)
De asemenea s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
143
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
612 Rezultate şi discuţii
6121 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată utilizacircnd spectroscopia icircn infraroşu cu transformată
Fourier ce determină interacțiunile dintre cei trei biopolimeri fosfați de calciu și particulele
magnetice Rezultatele redate icircn figura 61 indică prezenţa picurilor caracteristice tuturor
componentelor cei trei biopolimeri fosfații de calciu și nanoparticule magnetice iar icircn tabelul
61 sunt prezentate benzile lor representative [136]
Figura 61 Structura chimică a suporturilor
După cum se poate observa atacirct icircn figura 61 cacirct și icircn tabelul 61 suporturile analizate au
structură chimică asemănătoare componentele din structura lor avacircnd benzile reprezentative
apropiate sau chiar egale
144
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Tabel 61 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S92 şi S97
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
S92 S97
3422 OH 3420 OH
2927 C-H 2926 C-H
1655 Amida I C=O 1656 Amida I C=O
1554 Amida II N-H 1554 Amida II N-H
1074 C-O-C 1069 C-O-C
604 Fe-O 602 Fe-O
562 PO3_4
561 PO3-4
6122 Morofologia suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată pentru o imagine de ansamblu cu ajutorul
microscopiei electronice de baleiaj (figura 62) Nu se observă diferenţe de morfologie icircntre
suporturile analizate fiind observată icircn ambele cazuri și la ordine de mărire diferite o structură
tridimensională cu pori intercomunicabili structură ce include atacirct cristale de fosfaţi de calciu cacirct
şi nanoparticule magnetice distribuite icircn matricea polimerică
Pentru o imagine mai detaliată asupra morfologiei suporturilor fragmente din acestea au
fost scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi
o rotaţie de 05deg Tehnica utilizată a fost descrisă pe larg icircn capitolul 5 sub-capitolul 523
Programul CTVox (Bruker Belgium) a fost utilizat icircn vederea vizualizării distribuţiei
porozităţii O funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste reconstrucţia 3D
a probei de investigat iar apoi un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare după cum se
poate observa icircn figura 63 Icircn tabelul 62 sunt prezentate dimensiunea distribuţia porilor
volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
145
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 62 Morfologia suporturilor
Figura 63 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suportul S94
Tabel 62 Dimensiunea porilor suportului S94
Dimensiunea porilor Volumul regiunii de interes Aria regiunii de interes
121plusmn5613 microm
144912 mm
3 769888 mm
2
146
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn figurile 64 Valorile obţinute pentru rezistența
la compresiune se situează icircn jurul valorii de 58 MPa iar valorile modulului Young sunt
cuprinse icircntre 215 MPa şi 220 MPa valori
Figura 64 A Rezistenţa la compresiune a suporturilor B Modulul Young pentru suporturi
Aceste valori sunt icircn mare parte determinate de porozitatea ridicată a compozitelor obţinute
prin procedeul de liofilizare Se observă valori apropiate ale rezistenței la compresiune a
suporturilor precum și a modului Young calculat metoda este deci reproductibilă și din punct de
vedere al proprietăților mecanice ale suporturilor obținute
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Rezultatele obținute icircn urma studiului de determinare a retenției fluidelor de interes
biologic sunt redate icircn figura 65
Figura 65 Grad de retenţie maxim
0
200
400
600
800
1000
1200
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Gra
d d
e re
ten
ție
maxi
m
()
72 ore
147
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor
dovedită de datele de microscopie electronică de baleiaj (figura 62) Acestea sunt cuprinse icircntre
685 și 909 cu o medie a valorilor obținute de 781 Această diferență de 224 icircntre
valoarea maximă și valoarea minimă obținute poate fi explicată de faptul că dimensiunea porilor
nu este uniformă conform tabelului 62 această este de 121 plusmn 5613 pentru suportul S94
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea enzimatică este cea mai utilizată metodă de caracterizare a biodegradabilității
unui suport Suporturile S91 ndash S97 au fost supuse degradării enzimatice determinacircndu-se
concentraţia de chitosan respectiv de colagen degradat la intervalie stabilite
Concentraţia de chitosan degradat
Se observă o creştere graduală icircn timp a concentraţie de chitosan degradat (figura 66) ceea
ce indică o degradare controlată a suporturilor proprietate foarte importantă pentru aplicaţia
vizată deoarece o rată de degradare prea rapidă implică o refacere incompletă a ţesutului osos
iar o rată de degradare prea lentă poate duce la o fractură sau la o deformaţie a osului Se pot
observa valori apropiate ale concentraţie de chitosan degradat ceea ce indică reproductibilitatea
metodei de sinteză
Figura 66 Concentraţia de chitosan degradat
0
015
03
045
06
075
09
105
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
(Co
nce
ntr
aţi
e ch
ito
saln
deg
radat)
∙
10
0 m
mo
liL
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
148
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Concentraţia de colagen degradat
Analizacircnd figura 67 se observă valori constante icircn timp ale concentraţie de colagen
degradat Ca și icircn cazul chitosanului degradarea colagenului se realizeză gradual pe măsură ce
enzima icircn cazul de față colagenaza reușește să străbată matricea anorganică formată din fosfați
de calciu și să ajungă la matricea organică polimerică
Valorile obținute pentru cele 7 suporturi analizate sunt apropiate procesul de degragare
gradual fiind observată pentru toate cazurile
Figura 67 Concentraţia de colagen degradat
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
Fragmente de suporturi au fost puse icircn contact direct cu osteoblaste rezultatele fiind redate
icircn figura 68A Valorile obţinute pentru viabilitatea celulară sunt icircn jur de 80 pentru toate
intervalele de contact ceea ce indică faptul sunt lipsite de citotxicitate
Icircn urma contactului direct al suporturilor cu fibroblaste rezultate redate icircn figura 68B s-
au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de
aproximativ 100 pentru toate ambele suporturi ceea ce indică a foarte bună citompatibilitate a
probelor
0
05
1
15
2
25
3
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Co
nce
ntr
ţia
de
cola
gen
deg
rad
at
m
moli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
149
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 68 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile
A Utilizacircnd osteoblate B Utilizacircnd fibroblaste
Pentru a reconfirma citocompatibilitatea suporturile la contactul direct cu fibroblastele și
reproductibilitatea metodei de sinteză s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-
AM rezultatele obţinute fiind prezentate icircn figura 69
Figura 69 Viabilitatea fibroblastelor icircn contact direct cu suporturile
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu fragmente
de suporturi după 72 ore de contact direct
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 B
150
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
Corelate cu alte afecțiuni maligne tumorile primare sunt destul de rare și mai puțin
frecvente reprezentacircnd doar 02 din toate neoplasmele raportate icircn Marea Britanie și Statele
Unite [198] Icircn plus tumorile primare sunt depășite ca număr de metastaze date de carcinom
melanom sau afecțiunile maligne hematologice cum ar fi plasmacitomul De asemenea alte
condiții non-neoplazice cum ar fi unele procese inflamatorii chisturile osoase displazia fibroasă
sau boala Paget depășesc cazurile de tumori osoase primare [199] Cele mai frecvente tumori
osoase maligne sunt osteosarcomul (35) condrosarcomul (25) sarcomul Ewing (16)
chordomul (8) și histiocitomul fibros malign (5) [200]
Tratamentul tumorilor osoase maligne reprezintă o adevărată provocare clinică deoarece
rezecția chirurgicală a tumorii și radioterapia nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral
Chimioterapia care precede de regulă celelalte două tehnici are efecte adverse semnificative și
totodată icircn unele cazuri poate apărea o rezistență la aceste medicamente Există icircnsă și o serie de
tratamente alternative cum ar fi hipertermia terapia țintită imunoterapia fototerapia utilizarea
nanoparticulelor transplant de celule stem și altele unele din ele aflate icircncă icircn faza de studiu dar
care vor oferi cel mai probabil soluții foarte bune icircn viitor [201] Imunoterapia icircmbunătățește
capacitatea celulelor imune de a recunoaște și ținti celulele tumorale ceea ce duce la eliminarea
lor Avantajele imunoterapiei includ specificitate ridicată anti-tumorală și efecte secundare
minime prin folosirea propriului sistem imunitar al pacientului Hipertermia este un tratament
modern ce implică creșterea temperaturii la locul țintă pentru a induce astfel un stres termic
temperatura la care se ajunge fiind icircn medie 40degC (39ndash43degC icircn funcție de strategia terapeutică)
[202]
Icircn mod particular protocolul de tratament al osteosarcoamelor icircncepe cu rezecția
chirurgicală a tumorii osoase primare și a eventualelor metastaze Defectul osos obținut este
acoperit cu un material de substituție osoasă pentru a preveni fracturile sau deformațiile osoase
[203] Deoarce tumorile osoase sunt aproape imposibil de icircndepărtat icircn totalitate intervențiile
chirurgicale sunt urmate de radiochimioterapie [204]
Icircn cazul unor tumori osoase tratamentul implică două etape Icircntr-o primă etapă țesutul
tumoral este icircndepărtat chirurgical iar icircntr-o a doua etapă defectul osos obținut este acoperit cu
151
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
un material de substituție osoasă tot mai studiate fiind suporturile magentice biomimetice Icircn
prezența unui cacircmp magnetic aceste suporturi vor atrage alte particule magnetice introduse icircn
circulație Acestea din urmă vor fi funcționalizate cu medicamente chimioterapice precum și cu
factori de creștere care să susțină procesul de regenerare osoasă și formare de neo-țesut
Radioterapia se icircncadrează adesea icircn schemele de tratament a diferitelor tipuri de cancer
rezultatele obținute de-a lungul timpului icircn practica clinică fiind eficiente Utilizacircnd radiații
ionizate raze X radioterapia generează stres oxidativ excesiv și induce denaturarea ADN-ului
ce va conduce la moartea celulelor tumorale Radioterapia este o metodă neinvazivă de
tratament radiația fiind aplicată la locul țintă pe cacirct posibil Un dezavantaj al metodei este acelă
că unele celule sunt radiorezistente Icircn cazul icircn care este observat acest fenomen se impune
utilizarea unei doze excesive de radiații care icircnsă va distruge celulele adiacente sănătoase Din
acest motiv există scheme de tratament de radio-sensibilizare de exemplu se poate combina
chimioterapia de radio-sensibilizare cu radioterapia [205] Icircn ceea ce privește tumorile osoase
radioterapia are ca efect de scurtă durată o reducere a densității minerale osoase imediat după
expunerea la radiații dar ulterior induce re-calcifierea leziunii etapă a procesului complex de
remodelarea osoasă Se presupune că icircn cazul pacienților cu răspuns bun la acest tip de terapie
este nevoie de aproximativ 3 luni pentru ca osul să fie refăcut [206]
Medicamentele chimioterapeutice sau citostatice sunt fie substanțe naturale fie derivați
sintetici ai acestora extrase din plante specii marine sau unele microorganisme [207]
Dezavantajele acestei terapii sunt toxicitatea și biodistribuția nefavorabilă a compușilor Sisteme
pentru eliberarea țintită a acestor principii active sunt intens studiate [208]
Icircn acest context polimerii sunt materiale adecvate pentru a transporta medicamente
icircncapsulate sau legate chimic De-a lungul timpului polimerii și nanoparticulele polimerice au
jucat un rol cheie icircn dezvoltarea tehnologiei de eliberare a medicamentelor oferind eliberarea
controlată a agenților terapeutici icircn doze constante pe perioade lungi dozare ciclică și eficiență
mai bună a medicamentelor hidrofile sau hidrofobe [209 210]
Suporturile obținute icircn capitolele anterioare au potențial de a fi utilizate pentru umplerea
defectului osos rezultat după rejecția chirurgicală a tumorii și totodată pentru eliberarea țintită
de chimioterapice icircncorporate icircn nanoparticulele magnetice din structura lor Scopul strategiilor
experimentale descrise icircn cele ce urmează a fost testare potențialului suporturilor obținute de a fi
utilizate icircn radiochimioterapia tumorilor osoase maligne Inițial suporturile au fost expuse la
152
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
radiații X pentru a stabili influența asupra structurii și proprietăților acestora Icircn etapa următoare
s-a studiat icircncărcarea și eliberarea de chimioterapice (doxorubicină ndash DOX) din nanoparticulele
magnetice incluse icircn suporturi
621 Obținerea suporturilor
Șase suporturi au fost preparate după protocolul descris icircn capitolul 5 Pe scurt suporturile
au fost obținute prin co-precipitarea CaCl2 și a NaH2PO4 pe un suport de biopolimeri Cs Col
Hya și MNPs icircn prezența unei soluții apoase de amoniac NH4OH Icircn tabelul 63 sunt detaliate
codificările compoziția și caracteristicile distinctive ale suporturilor
Tabel 63 Codificarea și compoziția suporturile obținute și caracteristica lor distinctivă
Codificare
suport Compoziția biopolimerică CaP
Concentrația
de MNPs Caracteristica distinctivă
S5 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Control
S9 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Control
S5R 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S9R 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S5-DOX 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
S9-DOX 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor
Icircn vederea iradierii suporturilor cu raze X s-au urmat pași specificați icircn capitolul 2 sub-
capitolul 2491 și anume
a avut loc o simulare computer-tomograf (CT) icircn condiții similare radioterapiei
(poziționarea laserului plasarea markerilor radio-opaci externi scanarea volumului iradiat cu un
dispoziti de scanare CT special)
conturarea volumului țintă pe imagini complexe CT
stabilirea dozei de radiație
determinarea parametrilor fascicului de radiație (energia de lucru unghiul de incidență
dimensiuni și forme utilizarea accesoriilor optime)
analiza histogramei doză-volum pentru a verifica dacă cel puțin 95 din volumul țintă
a iradiat minim 95 de doza prescrisă
153
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn planul de iradiere denumit CILINDRU secțiunile obținute au fost conturate astfel
suprafața exterioară ca referință (S) materialul (V1) și volumul țintă (V2) V2 = V1 + 5mm
pentru a compensa posibilele eroari de poziție figura 610A
Doza de radiații utilizată a fost de 8 Gy fracțiune unică aceasta fiind doza unică
administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase [211 212 213]
Realizarea unui plan de tratament care să respecte atacirct distribuția omogenă icircn volumul țintă
a dozei prescrise cacirct și constracircngerile legate de doză cu privire la riscul de a afecta organele din
vecinătate impun alegerea cu atenție sporită a tehnicii de iradiere icircn unele cazuri fiind necesară
aplicarea unui bolus la suprafața volumului iradiat De exemplu iradierea peretelui toracic după
mastectomie radicală solicită utilizarea unui bolus icircn vederea obținerii parametrilor optimi ai
planului de tratament tipul și grosimea bolusului fiind incluse icircn algoritmul de calcul Bolusul
permite iradierea pielii cu 100 din doza prescrisă icircn timp ce icircn lipsa acestuia pielea (icircn care icircn
cancerul de sacircn apar aproape toate recidivele locale) este iradiată cu 70 din doza prescrisă iar
țesuturile nețintă (mușchi coaste) primesc 100 din doză Icircn mod similar bolusul este indicat
pentru iradierea tumorilor laringelui cu extensie la comisura anterioară sau a tumorilor vulvare
primare [214]
Planul de tratament a fost realizat utilizacircnd software-ul Eclipsetrade Planning Treatment
System Pentru o distribuție omogenă a dozei icircn volumul materialului a fost plasat un bolus de
10 mm grosime pe suprafața materialului rezultacircnd o includere suficientă icircn izodoza 95
(prezentată icircn verde icircn figura 610B) pentru V2 Termenul de izodoză se referă la suprafețele
care unesc toate punctele la nivelul cărora are loc absorbția unor doze egale de energie radiantă
[215]
Figura 610 A Conturarea volumului țintă pe imaginile CT ale eșantionului B Distribuția dozei
de radiații icircn volum de suport după aplicarea bolusului
154
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Parametrii stabiliți pentru planul de iradiere au fost două raze opuse izocentrice egale
una din poziția zero (AP) cu 6 MV și una posterioră poziționată la 180 de grade (PA) cu 15 MV
(figura 611)
Figura 611 Parametrii planului de iradiere
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină
Nanoparticulele magnetice au fost icircncărcate cu doxorubicină conform protocolului descris
anterior icircn subcaptiol 2492 Pe scurt icircntr-o suspensie coloidală de 1 MNPs icircn apă s-a
solubilizat 0125 doxorubicină nanoparticulele astfel obținute fiind notate cu MNPs-DOX
Suspensia finală a fost utilizată la prepararea suporturilor S5-DOX și S9-DOX conform datelor
experimentale din tabelul 63
Pentru caracterizarea suporturilor s-au analizat morfologia acestora eliberarea controlată
de medicamente antitumorale și citotoxicitatea in vitro la contactul direct cu celule tumorale
Structura chimică a suporturilor preparate a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR
iar morfologia lor cu ajutorul microscopiei electronice SEM
Pentru suporturile S5 S5R S9 S9R a fost analizată interacțiunea cu PBS (grad de retenție
maxim PBS) și s-au efectuat studii de degradare in vitro utilizacircnd un complex de enzime lizozim
(1200 μgml) și colagenază (100 μgml ) conform datelor experimentale din subcapitolul 246
155
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
De asemenea a fost studiată citotoxicitatea citotoxicitatea suporturilor sterilizate (expuse la o oră
la radiațiile UV) utilizacircnd celule osoase din linia MG-63 Un test MTT standard a fost efectuat la
24 48 și 72 de ore și a fost calculată viabilitatea celulară
Pentru suporturile S5-DOX și S9-DOX s-a analizat eliberarea de medicament in vitro
(subcapitol 2492) și interacțiunea cu celule MG-63 Suporturile au fost sterilizate tot prin
expunere la UV pentru o oră după care au fost puse icircn contact direct cu celulele Icircn paralel o
soluție stoc de doxorubincină a fost preparată icircn condiții sterile diferite concentrații fiind
analizate din punct de vedere al interacțiunii cu același tip de celulele Viabilitatea celulară a fost
calculată cu ajutorul unui test MTT standard
624 Rezultate și discuții
Suporturile preparate au fost testate icircn vederea unei potențiale utilizări icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne tehnică redată schematic icircn figura 612
Figura 612 Tratamentul tumorilor osoase maligne utilizacircnd tehnici de radioterapie și
chimioterapie
156
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor
Analiza FTIR a fost utilizată pentru studiul structurii chimice a suporturilor rezultatele
fiind redate icircn figura 613
Icircntre suporturile radiate și neradiate (figura 613A) nu se observă diferențe de structură
chimică benzile de absorbție caracteristice biopolimerilor nanopaticulelor magnetice și
fosfaților de calciu fiind observate icircn toate spectrele FTIR Icircn ceea ce privește biopolimerii se
pot observa următoarele picuri caracteristice 3439 cm-1
3434 cm-1
și 3489 cm-1
pentru gruparea
hidroxil 2925 cm-1
2924 cm-1
și 2927 cm-1
pentru -CH2 1652 cm-1
1654 cm-1
și 1649 cm-1
pentru amida I 1552 cm-1
și 1554 cm-1
pentru amida II [216] Pentru CaP au fost observate
picuri ale grupărilor fosfat la 601 cm-1
și 603 cm-1
iar pentru MNPs au fost observate picuri
caracteristice la 561 cm-1
și 563 cm-1
[99 160]
Figura 613 Spectrele FTIR ale suporturilor
Spectrele FTIR ale suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și al DOX sunt redate icircn figura
613B Spectrul DOX prezintă următoarele benzi caracteristice 2929 cm-1
pentru vibrația de
icircntindere a legăturii C-H 1730 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii C=O 1617 cm-1
și
157
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
1525 cm-1
pentru legătura NndashH 1411 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashC și 1286
cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashOndashC O parte din aceste benzi au fost observate și
pe spectrele corespunzătoare suporturilor S5-DOX și S9-DOX ceea ce sugerează interacțiunea
medicamentului cu celelalte componente ale suporturilor Alte picuri observate pe spectrele celor
două suporturi au fost 3446 cm-1
și 3440 cm-1
pentru gruparea ndashOH 2925 cmminus1
pentru ndashCH2
1654 cm-1
și 1656 cm-1
pentru amida I și altele cu valori apropiate de cele ale suporturilor fără
DOX (figure 613A)
Morfologia suporturilor realizate cu scopul de a fi utilizate icircn regenerarea osoasă este o
caracteristică foarte importantă de care trebuie să se țină cont icircn procesul de sinteză Aceste
suporturi trebuie să aibă porozitatea și dimensiunea porilor adecvate aplicației vizate Rețelele cu
pori interconectați influențează puternic procesul de nutriție a celulelor proliferarea și migrarea
acestora precum și vascularizare suportului [217] Rezultatele acestei analize au fost prezentate
icircn figura 614
Figura 614 Morfologia suporturilor
158
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
Influența radiaților asupra suporturilor a fost analizată și din punct de vedere al
interacțiunii cu fluidele de interes biologic și anume PBS pH = 72 001M S-a utilizat aceași
metodă volumetrică descrisă și icircn capitolele anterioare și s-a calculat gradul maxim de retenție
PBS utilizacircnd formula (14) redată icircn capitolul 2 Rezultatele obținute sunt prezentate icircn tabelul
64 și icircn figura 615
Tabel 64 Gradul de retenţie PBS al suporturilor
Nr crt Denumirea
suportului
Gradul
de retenţie PBS ()
1 S5 995 plusmn 30
2 S5R 1040 plusmn 35
3 S9 990 plusmn 50
4 S9R 987 plusmn 19
Figura 615 Gradul de retenție a suporturilor radiate și acelor neradiate
Diferența dintre valorile gradului de retenție pentru S5 și S5R este de aproximativ 45
iar icircntre S9 și S9R este nesemnificativă Icircn cazul suporturilor S5 și S5R diferență poate fi
explicată de dimensiunea neuniformă a porilor (figura 614) la fel ca și icircn cazul suporturilor
realizate pentru studiul reproductibilității ale cărui rezultate au fost prezentate mai sus Avacircnd
0
200
400
600
800
1000
1200
S5 S5R S9 S9R
Gra
dul m
axim
de
rete
nți
e P
BS
72 ore
159
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
această explicație pentru diferența dintre valorile obținute s-a putut afirma că radiațiile X nu
influențează interacțiunea suporturilor cu fluidele de inters biologic
Degradarea enzimatică a suporturilor a fost studiată utilizacircnd un amestec de două enzime
lizozim și colagenază metoda fiind descrisă icircn detaliu icircn capitolul 2
Potrivit lui Brouwer și colaboratorii [218] concentrația de lizozimă icircn serul uman este de
950-2450 μgL dar niveluri crescute pot fi observate icircn bolile benigne bolile inflamatorii
intestinale unele afecțiuni hematologice (policitemia vera mielomul multiplu) și procesele
maligne cum ar fi leucemiile [219] De exemplu Firkin [220] a raportat un nivel foarte ridicat al
lizozimului seric 30-120 μgml icircn leucemia mieloidă cronică și mielofibroza Icircn ceea ce privește
aceste date din literatură s-a ales o concentrație de 1200 μgml dat fiind că suporturile sunt
destinate tratamentului tumorilor osoase și probabil un nivel ridicat de lizozim va fi găsit icircn os
Deoarece colagenul este cea mai predominantă proteină din corpul uman nivelurile de
colagenază sunt greu de măsurat cu precizie această enzimă fiind găsită icircn toate țesuturile
organele icircn care există colagen Colagenaza interstițială are un rol-cheie icircn remodelarea normală
și patologică a matricelor extracelulare colagen inclusiv a țesutului osos și a țesutului conjunctiv
[221] De asemenea există diferite tipuri de colagenază de ex icircn pielea umană colagenază
secretată de fibroblastelor are două forme de proenzime (57 și 52 kDa) [222]
Rezultatele studiului au fost redate icircn figura 616A ndash reprezentacircnd concentrația de chitosan
degradat și 616B ndash reprezentacircnd concentrația de colagen degradat
Figura 616 A Concentraţia de chitosan degradat B Concentrația de colagen degradat
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
S5 S5R S9 S9R
(Conce
ntr
ația
de
Cs
deg
radat
) ∙
100
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
0
001
002
003
004
005
006
007
008
S5 S5R S9 S9R
Conce
ntr
ați
a de
cola
gen
deg
radat
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile A B
160
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Se observă icircn ambele cazuri o creștere graduală a concentrației de polimer degradat
chitosan respective colagen Valorile obținute sunt comparabile de unde s-a ajuns la concluzia
că radiațiile nu influențează nici interacțiunea suporturilor cu fluide biologice simulate icircn cazul
de față un complex de enzime icircn PBS pH=72 001M
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată prin contactul direct a suporturilor cu
osteoblastele liniei MG-63 figura 617
Valoarea viabilității calculată conform ecuației (15) din capitolul 2 scade icircn timp
fenomen observat și icircn celelalte studii de citoxicitate pe aceast tip de celule La 72 ore de la
contactul direct al celulelor cu fragmente de suport se observă o diferență de aproximativ 10
procente icircntre suporturile care nu au fost expuse radiațiilor și cele care au fost expuse Rezultatul
nu trebuie interpretat ca și negativ icircn condițiile icircn care rolul radiațiilor este de a distruge ceulele
tumorale osteoblastele Mg-63 fiind o linie de celule tumorale (osteosarcoame)
Radiațiile au fost absorbite de aceste suporturi cu o posibilă formare de radicali liberi fără
icircnsă a influența structura lor chimică morfologia și interacțiunea cu medii biologice simulate
Fenomenul este dificil de icircnțeles studii complexe fiind necesare icircn acest sens
Figura 617 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile
0
20
40
60
80
100
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itat
ea c
elula
ră
Control S5 S5R S9 S9R
161
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn concluzie rezultatele primei părți a studiului și anume studiul influenței radiațiilor X
asupra suporturilor au arătat rezultate icircncurajatoare structura chimică a suportului morfologia și
comportamentul de degradare enzimatică nu sunt influențate de razele X utilizate icircn radioterapie
ceea ce icircnseamnă că suporturile pot fi utilizate icircn continuare icircn chimioterapie
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale
Sistemele magnetice de eliberare controlată a medicamentelor au multiple avantaje față de
metodele normale cum ar fi abilitatea de a viza un anumit loc țintă icircn organism și reducerea
cantității de medicament necesară pentru a atinge o anumită concentrație la locul țintă ceea ce
implică o reducere a concentrației medicamentului icircn organele din vecinătate fiind minimizate
efectele secundare [223]
Doxorubicina - DOX este un potențial medicament pentru tratamentul metastazelor osoase
și a tumorilor osoase dar utilizarea sa este limitată de efectele secundare sistemice DOX este un
antibiotic antraciclinic care la nivel molecular interacționează cu ADN-ul și interferează cu
sinteza acidului nucleic rezultacircnd un efect remarcabil asupra transcripției AND [224 225]
Pentru aplicații icircn chimioterapia osoasă DOX este utilizat icircn sistemele de eliberare a
medicamentelor fabricate din diferite suporturi magneticecompozite apatită nanocristalină
[226] hidroxiapatită [227] chitosan și hidroxiapatită [228] acid poliglicic-co-glicolic -
polietilenglicol (PEG-PLGA) [87] microsfere magnetice
Icircn ceea ce privește eliberarea in vitro a DOX din suporturi o eliberare treptată poate fi
observată icircn figura 617
162
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 617 Curbele cinetice de eliberare a DOX din suporturi
Pentru suportul S5-DOX eliberarea a fost mai constantă icircn timp De remarcat este faptul că
aceast suport are o cantitate considerabilă de chitosan icircn compoziție comparativ cu S9-DOX
Trebuie reamintit fapul că toate MNPs utilizate icircn teza de față au fost acoperite cu chitosan
pentru o mai bună citocompatibiliate și pentru a putea lega principii active
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
Interacțiunea suporturilor preparate icircn sub-capitolul de față a fost studiată icircn paralel cu
interacțiunea suporturilor fără medicament icircncorporat pentru a putea realiza o analiză
comparativă S-a optat pentru contactul direct al fragmentelor de suport iar drept celule
tumorale s-au utilizat tot osteoblaste din linia MG-63 Rezultatele studiului sunt redate icircn figura
618
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 50 100 150 200 250 300 350
Conce
ntr
ați
a d
e D
OX
(μgm
L)
Timp ore
S5-DOX S9-DOX
163
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 618 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct A Cu soluții
de DOX de concentrații diferite B Cu suporturile avacircnd DOX icircn compoziție și a celor fără DOX
Viabilitatea celulară a suporturilor a fost aproape de 100 la primii 2 timpi de contact 24
și 48 ore atacirct pentru suporturile cu medicament cacirct și pentru cele fără medicament Icircnsă la 72 ore
de contact a suporturilor cu osteoblastele s-a observat o scădere semnificativă a viabilității
acestora valorile obținute fiind 64 pentru S5-DOX respectiv 75 pentru S9-DOX pentru
suporturile fără DOX valorile au scăzut nesemnificativ Această scădere bruscă de viabilitate ar
putea fi explicată de faptul cu DOX este eliberată treptat din suporturi la un raport relativ scăzut
proprietate de eliberare lentă a DOX poate fi utilizată și pentru că alte medicamente anti-
tumorale puternice sau combinații de medicamente ar putea fi transportate la desemnate zona și
eliberat la un raport optim pentru combaterea tumorilor [229]
164
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
63 Concluzii
Reproductibilitatea un experiment este foarte importantă icircn vederea transpunerii
rezultatelor obținute icircn practică Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi
preparate și caracterizate icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai
adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate
Pentru a demonstra reproductibilitatea metodei 7 suporturi avacircnd compoziţia
teoretică a lui S9 au fost preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a
compoziției din punct de vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn
fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate
celulară cu Calceină-AM
Toate analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă
este reproductibilă
Icircn a doua parte a studiului s-a testat potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircn primul racircnd s-a demonstrat că o doză de radiații X
similară cu cea utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile
suporturilor cum ar fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea
in vitro
Suporturile conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic
pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și
lentă a DOX sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn
terapia combinată a tumorilor osoase maligne
165
Concluzii generale
Concluzii generale
Osul este un țesut care are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn cazul unor
afecţiuni minore fiind supus de-a lungul vieții la procese biologice complexe de creştere
modelare şi remodelare Procesul de regenerare nu este suficient icircn cazul defecte osoase grave ce
au drept factori determinați principali rezecţiile de tumoră osoasă malformaţiile congenitale
unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita Toate acestea fac ca anual la
nivel mondial să fie utilizate peste 2 milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă
Materiale de substituţie osoasă pot fi clasificate icircn mai multe categorii grefe de origine naturală
(autogrefe alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria
tisulară precum şi diverse combinaţii ale acestora
Biomaterialele prelucrate sub divere forme (suporturi macroporase sisteme injectabile
capsule filme matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri și altele) sunt
elemente cheie icircn ingineria tisulară Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de
calciu s-au dovedit a fi o soluție promițătoare icircn ingineria tisulară și medicina regenrativă a
țesutului osos unele variante comerciale fiind folosite cu succes icircn practica clinică La
prepararea acestora trebuie să se țină cont și de nano-structura osului nu doar de compoziția sa
suporturile obținute prin procedee biomimetice fiind cele mai de succes
Nanoparticulele magnetice sunt folosite la o varietate de aplicații medicale clinice și
preclinice Eliberarea controlată de medicamente este un domeniu intens studiat icircn zilele noastre
iar utilizarea nanoparticulele magnetice icircn acest scop reprezintă un subiect de mare interes pentru
un număr considerabil de cercetători
Obiectivul central al lucrării de față a fost obținerea și caracterizarea de suporturi
compozite printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare a precursorilor de fosfați de calciu pe
un amestec de biopolimeri și nanoparticule magnetice pentru a fi testate icircn regenerarea osoasă
Biopolimeri utilizați au fost colagen chitosan acid hialuronic albumină serică bovină și
gelatină iar fosfații de calciu au fost obținuți din precursori pornindu-se de la un raport teoretic
CaP comparabil cu cel identificat icircn osul uman Nanoparticulele magnetice au fost incluse
pentru studii ce au vizat icircncorporarea și eliberarea controlată de principii biologice
166
Concluzii generale
Suporturile au fost caracterizate riguros din punct de vedere fizico-chimic și biologic S-a
icircnceput cu studiul structurii chimice a compoziției și morfologiei suporturilor după care s-a
studiat interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și cu soluții enzimatice
Proprietățile mecanice ale suporturilor au fost analizate din perspectiva modului de elasticitate
Young iar proprietățile magnetice din perspectiva susceptibilității magnetice a acestora Din
punct de vedere biologic suporturile au interacționat direct sau indirect cu diverse linii celulare
și s-au implantat sub-cutanat la șoareci icircn vederea determinării citotoxicității acestora Conceptul
de terapie combinată ce implică utilizarea radioterapii și chimioterapii a fost analizat icircntr-o
ultimă etapă pentru suporturile obținute
Pentru stabilirea compoziției optime s-au realizat icircn paralel suporturi pe bază de
biopolimer amestecuri diferite de biopolimeri (chitosan chitosan ndash acid hialuronic chitosan ndash
albumină serică bovină și chitosan ndash gelatină) și fosfați de calciu obținuți din precursori raportul
teoretic CaP fiind de 165 Trei concentrații diferite de nanoparticule (1 3 5 ) au fost
icircncorporate pe racircnd icircn sinteza celor patru tipuri de suporturi Structura chimică și compoziția
suporturilor au indicat prezența picurilor caracteristice componetelor incluse icircn sinteză Datele cu
privire la compoziția suporturilor au indicat prezența unor tipuri de fosfați de calciu identificați și
icircn literatură preponderenți fiind hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul monocalcic anhidru
Ca(H2PO4)2 fosfatul tricalcic (Ca3(PO4)2) S-a calculat magnetizarea suporturilor concentrația
de 5 fiind cea mai apropiată de datele regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective Studiile
privind interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic soluții enzimatice și celule au
indicat o corelație icircntre porozitatea materialelor și proprietațile de interacțiune cu fluide și medii
biologice
Avacircnd icircn vederea datele obținute anterior obiectivul următor a fost realizarea și
caraterizarea de suporturi pe bază de colagen ndash chitosan ndash acid hialuronic nanoparticule
magentice și fosfați de calciu S-a selectat concentrația de 5 MNPs pentru a fi inclusă icircn etapă
de sinteză particulele fiind introduse icircn formă uscată O parte din proprietățile suporturilor au
fost studiate icircn paralel cu cele ale suporturilor expuse la radiații UV timp de 4 ore cu scopul de a
observa eventuale modificări survenite după această procedură de iradiere folosită icircn practica
clinicăpreclinică pentru sterilizare Nu au fost observate diferențe icircn ceea ce privește structura
167
Concluzii generale
chimică și morfologia suporturilor Gradul de retenție PBS a fost influențat semnificativă de
raportul CaP Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul ambilor
biopolimeriValorile obţinute pentru modului lui Young sunt comparabile cu cele ale ţesutului
osos spongios uman Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor Interacțiunea in vitro cu
celule (fibroblaste și osteoblaste) a dovedit faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor caracterul non-citotoxic fiind evidențiat de un test sub-cutanat in vivo
Respectacircnd compoziția de biopolimeri și fosfați de calciu precum și concentrația de
MNPs un lot nou a fost realizat diferența față de cel descris anterior fiind dată de metoda de
includere a MNPs și anume au fost introduse sub formă de suspensie coloidală icircn apă
urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura suporturilor S-au
utilizat aceleași tehnici de caracterizare ca cele descrise la punctul anterior Icircn plus un studiu mai
detaliat al morfologiei a fost realizat cu ajutorul analizei microCT Rezultatele au indicat o
influenţă semnificativă a conţinutului de fază minerală asupra porozităţii suporturilor
Proprietățile mecanice ale suporturilor sunt comparabile cu cele ale țesutului osos spongios iar
din punct de vedere al proprietăților magnetice suporturile sunt superparamagnetice
Interacțiuneain vitro a suporturilor cu celule a fost testată pe fibroblaste osteoblaste și celule
STEM Un test MTT standard a evidențiat faptul că suporturle nuafectează celulele cele mai
bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost
studiată pe șoareci femele din linia CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de
la implantarea subcutanată a fragmentelor sterilizate de suporturi iar icircn final s-a ajuns la
concluzia că suporturile nu au efect toxic in vivo Totodată s-a observat asimilarea și resorbția
suporturilor
Icircn urma unor analize detaliate ale celor două loturi de suporturi preparate și caracterizate
icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia
vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate Pentru evaluarea
reproductibilității metodei de obținere șapte suporturi avacircnd compoziţia teoretică a lui S9 au fost
preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a compoziției din punct de
vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
168
Concluzii generale
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM Toate
analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă este reproductibilă
Potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne a fost
studiată icircmtr-o ultimă etapă Inițial s-a demonstrat că o doză de radiații X similară cu cea
utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile suporturilor cum ar
fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea in vitroSuporturile
conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic pentru tratamentul
metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și lentă a DOX
sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn terapia combinată
a tumorilor osoase maligne
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 132
5281 Testul MTT 133
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM 133
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor 134
53 Concluzii 139
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
141
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
141
611 Obținerea suporturilor 142
612 Rezultate şi discuţii 143
6121 Structura chimică a suporturilor 143
6122 Morofologia suporturilor 144
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor 146
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic 146
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor 147
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro 148
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
150
621 Obținerea suporturilor 152
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor 152
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină 154
624 Rezultate și discuții 155
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor 156
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
158
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor 160
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale 161
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
162
63 Concluzii 164
Concluzii generale 165
1
Introducere
Introducere
Impactul clinic cacirct şi cel economic pentru tratamentul afecţiunilor osoase este uluitor osul
fiind al doilea cel mai transplantat ţesut după transfuziile de sacircnge Numeroase metode de
reconstrucţie a defectelor osoase sunt disponibile icircn practica clinică fiind utilizate autogrefe
alogrefe matrice osoasă demineralizată materiale metalice sau ceramice proteine osoase
morfogenetice factori de creştere și altele Succesul acestor materiale este icircnsă unul limitat
fiecare din ele prezentacircnd dezavantaje considerabile Icircn icircncercarea de a oferi o soluție pentru
rezolvarea problemei menționate tot mai mulți cercetători și-au icircndreptat atenția spre realizarea
de noi materiale pentru ingineria tisulară și regenerarea țesutului osos materiale cu proprietăți și
interacțiuni controlabile Aceste materiale se găsesc sub diverse forme de prezentare suporturi
poroase tridimensionale sisteme injectabile capsule filmemembrane și matrici fibroase și
nano-fibroase hidrogeluri
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă constă icircn rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea
unui material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și
regenerare osoasă ar putea fi un suport compozit poros cu incluziune de particule magnetice
Principalul motiv pentru care se optează pentru un suport compozit este acela că osul natural la
racircndul său este un compozit matricea extracelulară a țesutului osos fiind reprezentată de 60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă
Particulele magnetice care urmează a fi incluse icircn suporturi vor fi funcționalizate cu diferiți
bio-agenți factori de creștere medicamente cu efect chimioterapic icircn vederea unei eliberări
țintite ale principiilor active enumerate Unul din marele dezavantaje ale chimioterapiei efectele
adverse asupra stării generale a pacienților ar putea fi astfel icircnlăturat medicamentele acționacircnd
controlat doar la locul tumori osoase
Obiectivul central al tezei de față vizează obținerea unor astfel de suporturi pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice Cele mai importante
proprietățile impuse unor astfel de suporturi sunt biocompatibilitate lipsa toxicității proprietăți
de suprafață adecvate incluziuni și proliferării celulare osteoconductivitate osteoinductivitate
rata de degradare controlată proprietăți mecanice comparative cu cele ale osului natural etc De
2
Introducere
asemenea foarte important este ca suportul să fie biomimetic icircn vederea integrării adecvate icircn
osul gazdă
Teza de față este structurată icircn două secțiuni principale stadiul actual al cercetărilor icircn
domeniul vizat și rezultate originale
Prima secțiune sintetizează date de literatură și este reprezentată de primul capitol A doua
secțiune este formată din 5 capitole capitolul 2 prezintă materialele și metodele utilizate pentru
obținerea rezultatelor originale prezentate icircn capitolele 3 4 5 și 6
Capitolul 1 prezintă pe scurt date despre anatomia fiziologia și patologia țesutului osos
deoarece fără cunoșterea acestor noțiuni ar fi imposibil de realizat un suport care să permită
regenerarea adecvată a țesutului osos Capitolul cuprinde informații despre materialele deja
utilizate icircn practica clinică pentru regenerarea osoasă și variantele aflate icircn stadiul de cercetare
fiind prezentate pe scurt o parte din cele mai utilizate biomateriale icircn domeniul vizat O atenție
deosebită este acordată suporturilor biomimetice prin prezentarea caracteristicilor acestora
metodelor de obținere a acestora și a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
După un studiu amănunțit a suporturilor magnetice realizate și caracterizate pacircnă icircn prezent icircn
literatura de specialitate s-a realizat o clasificare a acestora icircn funcție de biomaterialele de bază
utilizate icircn sinteza acestora
Capitolul 2 redă inițial strategia experimentală și obiectivele lucrării de față după care sunt
enumerate caracteristicile principale ale materialelor utilizate pentru prepararea suporturilor și a
celor utilizate pentru caracterizarea acestora De asemenea sunt prezentate etapele procesului de
preparare a suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule
magnetice precum și metodele de caracterizare a suporturilor obținute Sub capitolul Metode de
caracterizare evidențiază principiile de bază ale tehnicilor folosite condițiile de lucru parametrii
și dispozitivile utilizate
Capitolul 3 a avut drept scop principal realizare și caracterizarea unor suporturi compozite
folosind patru combinații diferite de biopolimeri și trei concentrații diferite de nanoparticule
magnetice Icircn urma analizei structurii chimice a suporturilor a compoziției și morfologiei
acestora a proprietăților magnetice precum și a interacțiunii suporturilor cu fluide de interes
biologic enzime și celule se vor stabili biopolimerii și concentrația de nanoparticule ce vor fi
utilizate icircn capitolele următoare
3
Introducere
Un program experimental s-a utilizat pentru a obține 13 suporturi pe bază de colagen
chitosan acid hialuronic și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată capitolul 4 prezentacircnd prepararea și caracterizarea acestora Pe lacircngă analizele realizate
pentru suporturile din capitolul 3 s-au analizat și proprietățile mecanice ale celor 13 suporturi
precum și citotoxicitate lor in vivo ultimul experiment menționat avacircnd o durată de 21 zile
Același program experimental și aceeași compoziție a suporturilor a fost utilizată și pentru
prepararea suporturilor descrise icircn capitolul 5 diferența fiind dată de faptul că particulele au fost
icircncorporate sub formă de suspensie coloidală Morfologia acestor suporturi a fost studiată icircn
detaliu cu ajutorul tehnicii microCT iar testele de toxicitate in vivo realizate pe aceași specie de
animale utilizate icircn capitolul anterior a avut o durată de mai mare de 64 zile
Capitolul 6 este structurat icircn două părți Prima parte prezintă reproductibilitatea metodei de
preparare a suporturilor iar a doua parte studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircntr-o primă etapă suporturile au fost iradiate cu o doza
unică de raze X administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase fiind analizată apoi
influența radiațiilor asupra proprietăților fizico-chimice și biologice a suporturilor A doua etapă
a studiului a constat icircn icircncărcarea nanoparticulelor incluse icircn suporturi cu doxorubicină
(medicament utilizat icircn practica clinică pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor
osoase) urmată de caracterizarea suporturilor obținute
Lucrarea se icircncheie cu un capitol de concluzii generale și bibliografia cosultată pentru
realizarea acesteia
4
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice pentru regenerarea osoasă
Osul este un țesut conjuctiv specializat dinamic care este suspus unui proces de
remodelare continuă pe parcursul vieții Are rolul atacirct de țesut cacirct și de organ funcțiile sale de
bază fiind de protecție a organelor vitale din cavitatea craniană toracică și a măduvei spinării de
suport a sistemului locomotor Matricea extracelulară a țesutului osos are o componentă organică
și o component anorganică iar celulele țesutului osos sunt osteoblastele osteocitele celulele de
suprafață și osteoclastele Din punct de vedere morfologic osul este fie spongios (trabecular) fie
compact (cortical) Țesutul osos spongios este asociat cu funcțiile metabolice iar țesutul osos
compact este asociat cu rezistența mecanică [1]
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta aceste
defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare Chiar dacă decenii icircntregi autogrefele
au fost utilizate cu precădere dezavantajele acestora au condus la cercetări riguroase pentru
fabricarea unor grefe osoase realizate din biomateriale (polimeri materiale ceramice materiale
metalice) Ingineria tisulară combină cu succes principiile biologiei țesutului osos și principiile
disciplinelor inginerești contribuind la consolidarea pierderilor osoase prin intermediul unor
matrici numite suporturi [2] Icircncorporarea unor sisteme de eliberarea controlată de principii
biologice icircn interiorul suporturilor vor conduce la rezultate remarcabile Nanoparticulele
magnetice funcționalizate pot fi un exemplu de astfel de sisteme
11 Ţesutul osos Structură Fiziologie Patologie
Țesutul osos este un organ foarte important pentru organismul viu Formarea sa este
moderată de mecanisme centrale și locale prin intermediul cărora este remodelat constant icircncă
din viața intrauterină și pe tot parcursul vieții pentru menținerea arhitecturii sale
microstructurale Procesul de remodelare este coordonat de activitățile osteoblastelor și
osteoclastelor care la racircndul lor sunt reglementate de procesele fiziologice de la nivel tisular și
de răspunsul la stimuli biomecanici
5
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
111 Funcțiile țesutului osos
Osul oferă protecție unor organe vitale și joacă de asemenea un rol important icircntr-o serie
de funcții fiziologice hematopoieză menținerea echilibrului acido-bazic funcția de rezervă
minerală funcția de suport a sistemului locomotor
Figura 11 Funcțiile țesutului osos [3]
Canalele medulare ale oaselor lungi găzduiesc celule stem mezenchimale capabile să se
diferențieze icircn precursorii hematopoietici care icircn cele din urmă dau naștere celulelor sanguine
mature
Icircn ceea ce privește menținere echilibrului acido-bazic oasele asigură organismului soluții
tampon carbonat și fosfat icircn timpul acidozei metabolice cronice proces observat icircn acidoza
renală tubulară și acidoza uremică Carbonatul de calciu este cel mai important dintre
componentele acestor soluții tampon asiguracircnd rezervorul de ioni de bicarbonat
6
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Din punct de vedere al rezervei de minerale țesutul osos este rezervorul a aproximativ
85 din fosforul din organism și 99 din calciu din organism
Osul are o rezistență mare la compresiune dar la forțe mari de tracțiune sau tensiune poate
fi fracturat Procentul mare de colagen din matricea organică (90 ) conferă un grad de
elasticitate considerabil țesutului osos dar cu toate acestea osul este un compozit casant [4]
112 Structura ţesutului osos
Țesutul osos este un material compozit format dintr-o matrice extracelulară şi din celule
proprii organizat pe cinci niveluri ierarhice (figura 12) macrostructura osului microstructura
osului sub-microstructura osului nanostructura osului și sub-nanostructura osului [5] [6]
Macrostructura osului este reprezentată de cele două tipuri de țesut osos compact icircntalnit
icircn literatură și sub denumirea de țesut osos cortical și spongios icircntalnit și sub denumirea de țesut
osos trabecular iar microstructura osului (10-500 microm) este reprezentată de componentele celor
două tipuri de țesuturi Țesutul osos cortical are o structură densă fiind format din sistemul
Haversian care la racircndul său este format dintr-un spațiu ce conține vase de sacircnge numit canal
haversian icircnconjurat de lamele osoase ce reprezintă sub-microstructura țesutului osos (1-10
microm) Țesutul osos spongios are o densitate mai mică decacirct a țesutului osos compact și este
format din spații areolare neregulate delimitate de trabecule osoase Spațiile areolare conțin
măduvă hematogenă bogată icircn sacircnge Icircn general țesutul osos compact reprezintă 80 din
sistemul osos dar distribuția celor două tipuri de țesut diferă icircn funcție de regiune
Figura 12 Organizarea structural ierarhică a osului [5]
7
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Nanostructura osului (cacircteva sute de nanometri ndash 1 microm) este reprezentată de fibrele de
colagen și de faza minerală iar sub-nanostructura osului (mai puțin de cacircteva sute de nanometri)
este reprezentată de structura moleculară a componentelor [7] [8]
1121 Matricea extracelulară
Matricea extracelulară este compusă dintr-o componenta organică ce reprezintă 33 din
masa uscată a matricei și o componenta anorganică ce reprezintă 67 din masa uscată a matricei
Componenta organică este formată icircn proporție de 90 din proteine colagenice
predominant colagen de tip I iar restul compoziției reprezintă proteine non-colagenice factori de
creștere și proteine morfogentice osoase Din proteinele non-colagenice regăsite icircn os fac parte
ostocalcina osteopontina fibronectina și sialoproteina osoasă II Osteocalcina cea mai
abundentă proteină non-colagenică din ţesutul osos reprezentacircnd 10-20 din cantitatea totală
are un rol important icircn procesul de mineralizare deoarece se leagă de cristalele de hidroxiapatită
[9] Osteopontina este o glicoproteină fosforilată icircntacirclnită icircn aproape toate ţesuturile
organismului uman piele creier fluidul sanguin cartilaj şi o varietate de tumori Osteonectina
este o glicoproteină bogată icircn cisteină care icircn procesul de mineralizare leagă colagenul de
hidroxiapatită avacircnd rolul unui nucleu de mineralizare reglacircnd formarea şi creşterea cristalelor
de hidroxiapatită [10] De asemenea icircn matricea organică au fost identificați glicozaminoglicanii
nesulfataţi (acid hialuronic) şi sulfataţi (condroitinsulfatul şi keratansulfatul)
Glicozaminoglicanii sulfataţi sunt legaţi covalent de molecule proteice formacircnd proteoglicani icircn
țesutul osos cei mai de icircntacirclniți fiind proteoglicani bogați icircn leucină cu masă moleculară mică
Componenta anorganică este reprezentată icircn cea mai mare parte din ioni de fosfat și ioni
de calciu Pe lacircngă acești ioni se găsesc icircntr-o cantitate considerabilă și bicarbonat sodiu
potasiu citrat magneziu carbonat fluor zinc bariu și stronțiu Ionii de calciu și fosfat formează
cristale de hidroxiapatită care se depun pe matricea colagenică proces icircn urma cărui rezultă
proprietățile de rezistență și rigiditate a țesutului osos [10] [11]
Matricea extracelulară osoasă constituie un cadru complex și organizat care oferă suport
mecanic și exercită un rol esențial homeostaza osoasă Matricea osoasă poate elibera mai multe
molecule care influențează activitatea celulelor osoase și prin urmare influențează procesul
complex de remodelarea osoasă Studiile icircn domeniu au indicat că doar pierderea masei osoase
8
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
este insuficientă pentru a provoca fracturi osoase alți factori inclusiv modificări ale proteinelor
matricei osoase au o contribuție colosală icircn producerea fracturilor osoase [12] [13]
1122 Celulele țesutului osos
Țesutul osos are icircn componență patru tipuri de celule osteoblaste osteoclaste osteocite și
celule de suprafaţă (figura 13)
Figura 13 Celulele țesutului osos
Osteoblastele celule localizate pe suprafața osului sunt derivate din celule stem
mezenchimale reprezentacircnd 4-6 din totalul de celule osoase Se găsesc icircn țesuturile tinere dar
apar și icircn condiții patologice Din punct de vedere morfologic sunt celule cu formă cubică de
dimensiuni mari (15-20 microm) ce prezintă caracteristici specifice celulelor implicate icircn sinteza
proteinelor reticulul endoplasmatic rugos și complexul Golgi ambele bine dezvoltate precum și
numeroase vezicule de secreție ce conțin precursori de matrice osoasă incluziuni lipidice și
mucopolizaharide Osteoblastele au un rol foarte important icircn procesul de formare al osului
Sinteza matricei osoase are loc icircn două etape depunerea matricei organice urmată de
mineralizarea acesteia Icircn etapa de depunere a matricei organice osteoblastele secretă proteine
colagenice non-colagenice și proteoglicani iar etapa a doua cea de mineralizarea a matricii
organice are o faza veziculară și o fază fibrilară [11]
Osteocitele sunt cele mai abundente celule osoase reprezentacircnd aproximativ 95 din
totalul acestora Sunt osteoblaste mature care ocupă spațiul lacunar fiind icircnconjurate de matrice
osoasă Ca și particularitate structurală osteocitele au prelungiri citoplasmatice asemănătoare
dendritelor neuronilor care formează o rețea de comunicare icircntre ele și suprafața osoasă Durata
9
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de viață a osteocitelor a fost estimată de Frost și colaboratorii [14] la 25 de ani dar acest lucru
nu poate fi apreciat cu exactitate deoarece procesul de remodelare osoasă presupune o reicircnnoire
a țesutului osos cu 4-10 pe an Icircn orice caz durata de viață a osteocitelor este cu mult mai
mare decacirct a osteoblastelor care au un ciclu de viață de aproximativ 3 luni Totodată nici rolul
osteocitelor nu este icircnțeles pe deplin numeroase studii concentracircndu-se pe asta [15]
Osteoclastele denumite și macrofagele ţesutului osos sunt celule multinucleate
diferențiate din celule stem hematopoetice sub influența a numeroși factori cum ar fi factorul de
stimulare a coloniilor de macrofage (M-CSF) și factorul de legătură nucleic kappa-B (RANKL)
M-CSF este secretat de celulele mezenchimale osteoprogenitoare și de osteoblaste iar RANKL
este secretat de osteoblaste osteocite și celule stromale Acești factori susțin activarea
transcripției expresiei genice icircn osteoclaste Osteoclastele conţin următoarele enzime fosfatază
acidă protează enzime oxidoreducătare ale glicolizei datorită cărora au o activitate enzimatică
intensă şi fagocitară Resorbţia osului nemineralizat (osteoidul) nu este realizată de osteoclaste
ci de elemente macrofagice histiocitare Osteoclastele intra icircn stare de repaus cacircnd formarea
osului definitiv este terminată Celulele redevin active icircn caz de fractura cacircnd are loc formarea
calusului [11] [8]
Celulele de suprafaţă sau bordantă sunt celule ce acoperă suprafeţele osoase icircn locurile
unde nu are loc nici resorbția nici formarea osoasă doua etape importante ale procesului de
remodelare osoasă Din punct de vedere structural sunt celule cu nucleu turtit o citoplasmă care
se extinde pe suprafața osoasă și doar cacircteva organite citoplasmatice cum ar fi aparatul Golgi
sau reticulul endoplasmatic rugos Funcțiile acestor tipuri de celule nu sunt pe deplin icircnțelese dar
studiile icircn domeniu susțin ideea că aceste celule au un rol important icircn prevenirea interacțiunii
directe dintre osteoblaste și matricea osoasă și totodată participă la procesul de diferențiere a
osteoclastelor
113 Fiziologia ţesutului osos
Pe parcursul icircntregii vieţii osul este supus proceselor biologice complexe procese de
creştere icircn lungime şi grosime modelare şi remodelare La racircndul lor la baza acestora stau
procesul de osteogenză ce constă icircn producerea de țesusut osos și osteoliză ce constă icircn
distrucția de țesut osos [8]
10
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1131 Osteogeneza și osteoliza
Osteogeneza este procesul de formare a osului osteoblastele fiind elementele esențiale icircn
acest proces Funcţionalitate osteoblastelor este controlată de molecule semnal hormoni factori
de creştere şi citokine [10] Pe scurt osteogeneza are trei pași de bază sinteza matricei
extracelulare organice (osteoid) mineralizarea matricei ce conduce la formarea osului și
remodelarea osului prin procesele de resorbție și reformar [16] Prin acţiunea concentrată a
moleculelor semnal osteoblastele produc icircntr-o primă etapă toate componentele matricei
organice a ţesutului osos ce va fi eliberată pe icircntreaga suprafaţă sub forma de osteoid
nemineralizat Pe seama precursorilor preluaţi din mediul extracelular se realizează după
modelul sintezei proteice sinteza matricei organice Concomitent cu producerea de matrice
organică are loc procesul de mineralizare a acestei ce reprezintă legarea substanţei anorganice de
matricea proteică o legatură particulară icircntre sărurile minerale şi proteină fiind realizată icircn urma
acestui proces La procesul mineralizării contribuie numeroşi factori locali şi generali un rol
cheie fiind jucat de factorii inhibitori naturali ioni de magneziu citrați pirofosfați și nucleotide
Icircn țesuturile conjuctive nemineralizate factorii anterior enumerați au o concentrație superioară
comparativ cu țesuturile conjuctive mineralizate Icircn cazul țesutului osos fosfataza alcalină
secretată de osteoblaste distruge parțial acești factori făcacircnd posibil procesul de mineralizare
Procesul de osteoliză ce corespunde distrucției osoase este atribuit osteoclastelor Procesul
icircncepe cu demineralizarea matricei osoase urmată de hidroliza enzimatică a componentelor
organice formacircndu-se zone de eroziune osoasă Pentru realizarea resorbţiei osteoclastul trebuie
să adere la o suprafaţă osoasă şi să formeze compartimentul subosteoclastic Icircnsă suprafeţele
osoase au o peliculă fină de matricea extracelulară nemineralizată acoperită de un strat de
osteoblaste icircntre care se stabilesc joncţiuni distanţate icircngreunacircnd fixarea osteoclastelor pe
suprafeţe osoase Osteoblastele au receptori pentru parathormon și 125-dihidroxicolecalciferol
prin stimularea cărora are loc restricția osteoblastelor urmată de eliberarea suprafeței osoase Prin
cuplarea substanțelor stimulante cu receptori specifici se declanșează sinteza de activator al
plasminogenului și sinteza de colagenază latentă urmate de activarea colagenazei latente de
către plasmină Activarea colagenazei va avea drept consecință icircndepărtarea peliculei de matrice
nemineralizată continuacircnd cu atașarea osteoclastelor [8]
11
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1132 Creşterea osului
Creşterea osului icircntacirclnită și sub denumirea de organogeneză osoasă este etapa care
urmează procesului de osteogeneză normală avacircnd drept rezultat formarea osului și a
articulaţiilor Mai precis constă icircn formarea şi creşterea oaselor icircn lungime icircn grosime şi
asigurarea formei epifizelor Pentru fiecare element osos există un punct de osificare specific icircn
care icircncepe formarea osoasă la o anumită vacircrstă [17] Se poate vorbi de două tipuri de osificare
osificarea endoconjunctivă sau intramembranară și osificarea endocondrală
Osificarea intramembranară este caracterizată de invazia capilarelor icircn zona mezenchimală
și de diferențierea celulelor mezenchimale icircn osteoblaste mature care vor depozita matrice
osoasă conducacircnd la formarea de corpusculi osoși Acești corpusculi vor crește și se vor
dezovolta iar apoi vor fuziona cu alți corpusculi și vor forma trabecule ososase Pe măsură ce
trabeculele osoase cresc icircn dimensiune și icircn număr devin interconectate formacircnd o formă de țesut
osos Această formă de țesut osos este o structură fără rezistență dezorganizată și are un număr
mare de osteocite Osificarea intramembranară are loc icircn timpul dezvoltării embrionare și este
implicată icircn formarea oaselor plate din structura cutiei craniene unele oase faciale o parte din
mandibulă și claviculă și adăugarea de țesut osos nou la diafiza majorității oaselor
Osificarea endocondrală utilizează proprietățile funcționale ale cartilajului și osului pentru
a asigura un mecanism de formare și creștere a scheletului Combinarea condrogenezei și a
osteogenezei icircn vederea osificării osoase este dependent de nivelul de vascularizare a cartilajului
de creștere Icircn figura 14 sunt prezentate la general etapele procesului de osificare endocondrală
[18] Osificarea endocondrală are 6 etape Celule mezenchimale se vor concentra (A) și se vor
diferenția icircn condrocite formacircnd un cartilaj nevascularizat (B) Icircn centrul cartilajului format
condrocitele se vor opri din proliferare și vor deveni hipertrofice (C) Condrocitele din
vecinătatea celor hipertrofice se vor diferenția icircn osteoblaste acestea din urmă formacircnd un colier
osos (D) Icircn continuare condrocitele hipertrofice vor regla formarea de matrice mineralizată Icircn
același timp icircn această etapă are loc eliberarea de factori angiogenetici care vor atrage vase de
sacircnge după care condrocitele hipertrofice vor intra icircn apoptoză (E) Coordonarea osteoblastelor
și invazia vaselor de sacircnge vor avea drept rezultat formarea țesutului spongios primar
Condrocitele se vor prolifera icircn continuare și icircn același timp va avea loc vascularizarea osului
aceste două etape contribuind la creșterea icircn lungime a osului Osteoblastele din colierul osos vor
12
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
contribui la formarea osului cortical pe cacircnd cele din țesutul spongios primar vor contribui la
formarea țesutului spongios final (F)
Figura 14 Osificarea endocondrală [18]
1133 Remodelarea osului
Osul este un organ activ remodelat pe tot parcursul vieții Procesul de remodelare osoasă
cuprinde patru faze distincte ce se desfăşoară permanent icircn anumite locuri faza de repaus faza
de resorbţie osoasă faza de inversie şi faza de formare reprezentate schematic icircn figura 15 Icircn
faza de repaus suprafaţa ţesutului osos este acoperită de celule de suprafaţă ancorate icircn matricea
mineralizată Icircn faza de resorbţie osoasă rolul principal revine osteoclastelor care vor forma o
cavitate numită lacună de resorbţie (lacuna Howship) Resorbţia are loc icircn două etape
demineralizarea fazei osoase și distrugerea fazei osoase Icircn faza de inversie are loc apariția
osteoblastelor icircn zona erodată ce vor acoperi lacuna de resorbţie printr-o depozitare activă de os
nemineralizat osteoid Osteoidul se depune pacircnă cănd grosimea acestuia ajunge la 20 microm
urmacircnd faza de mineralizare Pe măsură ce osteoidul este mineralizat locul unde a avut loc
remodelarea va fi icircnlocuit cu un os nou [19]
13
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 15 Remodelarea ţesutului osos
114 Patologia osoasă
Patologia osoasă poate fi de cauza traumatică ndash fractură sau netraumatică Icircn funcţie de
cauza fracturii putem vorbi de fracturi determinate de un accident traumtic fracturi de oboseală
şi fracturi de os patologic Cauzele netraumatice care pot cauza o anumită patolgie osoasă sunt
infecţiile osului tumorile osului și deformaţiile osului [17]
1141 Tumori osoase
Icircn literatura de specialitate tumorile sunt icircntalnite și sub denumirea de neoplasme și se
definesc ca proliferări tisulare anormale autonome persistente neconcordante cu ţesuturile din
jur care se dezvoltă continuu chiar și după icircncetarea stimului care a determinat proliferarea și nu
răspund la mecanisme normale de control ce guvernează creştere Icircn funcție de caracteristicile
morfo-funcționale și de evoluția acestora tumorile se clasifică icircn tumori begine şi tumori
maligne Cele benigne sunt caracterizate prin margini bine definite au o creştere lentă şi locală
sunt neinvazive şi compresive circumscrise şi icircncapsulate prezintă mitoze rare nu diseminează
icircn alte ţesuturi şi organe (non-metastazante) avacircnd un prognostic bun Tumorile maligne sunt
14
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
caracterizate prin margini nedefinite au o creştere rapidă fiind infiltrative şi icircncapsulante
invazive şi distructive sunt metastazante şi au un prognostic rezervat
Metastazarea reprezintă răspacircndirea celulelor maligne din tumora primară icircn organele
ţesuturile sau cavităţile organismului Comună majorităţii cancerelor umane metastazarea
transformă o tumoră de organ icircntr-o boală sistemică Este un proces complex multistadial şi
dinamic avacircnd la bază o serie de procese subtile interconectate ce rezultă din interacţiunile
gazdei cu tumora Fiecare etapă metastatică este subiectul unor influenţe multiple indispensabile
celulei maligne pentru a supravieţui variaţiilor de mediu (prin dobandirea de noi mutaţii) ce icirci
permit acesteia să invadeze ţesuturile vecine să patrundă icircn sistemul circulator (calea majoră de
răspacircndire prin vasele de sacircnge şisau limfatice) să extravazeze icircn ţesuturi noi să dezvolte un
sistem vascular propriu care să icircicirc suţină dezvoltarea şi chiar uneori să permită metastazei să dea
naştere la noi metastaze [20] [21]
Figura 16 Clasificarea tumorilor osoase
15
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Domeniul de patologie osteoarticulară icircn care se icircncadrează şi tumorile osoase este un
domeniu foarte vast şi delicat nu este constant fiind adesea descoperite noi metode de
diagnostic şi tratament ce ameliorează sau chiar schimbă radical prognosticul multor tumori
osoase Una din principalele probleme icircn ceea ce priveşte diagnosticul şi tratamentul tumorilor
osoase este aceea că nu există o separare netă icircntre tumora benignă şi tumora malignă
Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) propune o clasificare a tumorilor osoase bazată pe
capacitatea de diferenţiere a acestora ceea ce icircnseamnă că sunt grupate din punct de vedere
histologic şi citologic al ţesutului pe care acestea icircl reproduce clasificare redată icircn figura 16
[22]
Metastazele sunt cele mai icircntalnite tumori din os Acestea sunt considerate tumori
secundare osoase deoarece tumora primară nu icircşi are originea icircn os tipurile de cancer care dau
cel mai frecvent metastaze osoase fiind cancerul de prostată cancerul de sacircn şi cancerul
pulmonar Tumorile osoase primare cum sunt osteosarcoamele sau condrosarcoamele sunt
destul de rare statisticile sugeracircnd că doar icircn 1 din 20 cazuri de tumori osoase este vorbă de o
tumoră primară Cea mai frecvent intalnită tumoră osoasă primară este mielomul cu celule
plasmatice ce apare la pacienţi cu vacircrstă peste 40 ani urmată de diverse sarcoame Dintre
sarcoamele osoase primare ce reprezintă 02 din toate neoplasmele cele mai comune sunt
osteosarcoamele ndash 35 condrosarcoamele ndash 25 sarcomul Ewing ndash 16 condroamele ndash 8 şi
histiocitoamele maligne fibroase ndash 5
Incidenţa tumorilor primare benigne este mai dificil de determinat deoarece nu se
realizează biopsie pentru toate leziunile nou descoperite Atacircta timp cacirct leziunile pot fi complet
caracterizate ca şi bengine pe baza datelor clinice şi imagistice biopsia sau rezecţia sunt
nepotrivite şi neadecvate Cele mai comune tumori osoase benigne sunt următoarele
osteocondroamele ndash 35 encondroamele ndash 20 tumorile cu celule gigante ndash 15 osteomul
osteoid ndash 10 şi displazia fibroasă (maladia Jaffeacute) ndash 5 Icircn ciuda caracterului benign al
tumorilor tratamentul acestora trebuie să fie cacirct mai eficient posibil De exemplu o tumoră cu
celule gigante extinsă icircn suprafaţa articulară tibială poate duce la o fractura patologică dacă nu
este tratată adecvat
Tratamentul fiecărei tumori osoase depinde de mai mulţi factori caracterul benign sau
malign localizarea leziunii istoricul afecţiunii nivelul durerii Icircn cazul tumorilor benigne
icircndepărtarea leziunea urmată de grefarea sau biopsia excizională conduc icircn general la rezultate
16
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
bune Totuşi aceste două metode de tratament pot fi inadecvate icircn cazul tumorilor maligne atacircta
timp cacirct celule tumorale reziduale rămacircn la marginea leziunii Limfoamele osoase pot fi tratate
cu chimioterapie sau radioterapie fără a fi necesară o intrevenţie chirurgicală Alte tumori cum
ar fi de exemplu osteosarcoamele convenţionale sunt supuse icircntr-o primă etapă chimioterapiei
sau radioterapiei cu scopul de a micşora masa tumorală următoarea etapă fiind rezecţia
chirugicală Condrosarcoamele sunt tratate doar chirurgical chimioterapia dovedindu-se
ineficientă Multe procese maligne sau procese benigne agresive pot fi tratate prin rezecţie
chirurgicală atacirct a tumorii cacirct şi a unei margini de ţesut normal sau icircn cele mai grave cazuri prin
icircndepărtarea totală a osului muşchiului sau altor ţesuturi afectate de tumoră [23]
12 Metode de tratament a defectelor osoase
Spre deosebire de alte ţesuturi osul are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn
cazul unor afecţiuni minore fără formare de cicatrici Icircn schimb icircn cazul fracturilor patologice
sau a celor grave precum şi icircn pierderi mari de ţesut osos ce pot conduce la defecte osoase
grave procesele de regenerare şi reparare proprii vor avea nevoie de support [24] Principalii
factori ce conduc la defecte osoase grave sunt rezecţia de tumoră osoasă malformaţiile
congenitale unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita După sacircnge osul
este al doilea cel mai transplantat organ anual fiind efectuate la nivel mondial aproximativ 22
milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă [25] Materiale de substituţie osoasă
pot fi clasificate icircn mai multe categorii după cum urmează grefe de origine naturală (autogrefe
alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria tisulară
precum şi diverse combinaţii ale acestora [26]
121 Metode actuale de tratament a defectelor osoase
1211 Grefe osoase biologice
Icircn funcție de originea lor grefele biologice se clasifică icircn xenogrefe alogrefe și autogrefe
[27] Xenogrefe prelevate de la o specie diferită de a primitorului au fost utilizate o scurtă
perioada de timp deoarece după cacircteva decenii de studii icircndelungate s-au dovedit a fi cele mai
puţin adecvate grefe [28] Alogrefele sunt utilizate pentru reconstrucţia unor defecte osoase
grave Astfel alogrefele se utilizează icircn timpul intervenţiilor de revizie a artoplastiilor totale
17
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
pentru reconstrucţia pierderilor osoase Alogrefele sunt prelevate fie de la pacienţi vii fie de la
cadavre Icircn cazul icircn care donatorii sunt pacienţi vii o sursă foarte utilizată este capul femural
alogrefele fiind preluate icircn acest caz icircn timpul intervenţiilor primare de artoplastie totală de şold
Icircn cazul icircn care alogrefele sunt preluate de la cadavre oasele lungi şi pelvisul sunt sursele cele
mai utilizate [29] Icircn tabelul 11 sunt prezentate principalele avantaje și dezavantaje ale celor trei
tipuri de grefe osoase biologice
Tabel 11 Principalele avantaje și dezavantaje ale autogrefelor alogrefelor și xenogrefelor [24]
Grefă
osoasă
biologică
Avantaje Dezavantaje
Autogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
osteoconductivitate și osteogenice
histocompatibilie
nu există risc de imunogenicitate
sau transmitere de boli infecțioase
durere la locul prelevării și
moartea patului donator
sursă limitată de
disponibilitate și cantitate
timpi chirurgicali mai mari
ce implică pierderi de sacircnge
posibile infecții
Alogrefe
proprietăți de osteoinductivitate
și osteoconductivitate
nu apare problema morbidității
patului donator
ușor de manevrat
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
osteoinductivitate variabilă
pierderea proprietăților
biologice și mecanice
respinse icircn anumite regiuni
geografice datorită unor aspecte
religioase
cost crescut
Xenogrefe
proprietăți osteoinductive și
osteoconductive
cost scăzut
disponibilitate mare
nu prezintă proprietăți
osteogenice
risc imunogenic crescut
rezultate slabe
Un tip specializat de alogrefe este reprezentat de matricea osoasă demineralizată (DBM)
DBM se obține prin extracția acidă a alogrefelor și conține colagen de tip I proteine
18
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
noncolagenice și un număr variabil de factori de creștere osteoconductivi (de exemplu proteine
morfogenetice osoase - BMP) Concentrația de DBM este direct proporțională cu
osteoinductivitatea DBM se poate folosi fie singură fie icircn combinație cu alte alogrefe sau cu
grefe sintetice [27]
Autogrefele sunt utilizate pentru refacerea defectelor osoase primitorul și donatorul fiind
aceași persoană Sunt utilizate icircntr-un număr mare de intervenţii chirurgicale ortopedice
stomatologice şi maxilo-faciale cu scopul de a spori şi grăbi regenerarea osoasă sau de a restaura
defectele osoase Creasta iliacă este locul de unde se prelevă cel mai frecvent autogrefe datorită
accesului uşor şi a unei bune calităţi De asemenea autogrefele se mai pot preleva din tibia
proximală femurul distal coaste radiusul distal Şi canalul intramedular al oaselor lungi poate
reprezenta o potenţilă sursă de autogrefe precum şi o sursă bogată de celule şi factori de creştere
[30] [31]
1212 Grefe osoase și substituienți sintetici
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din biomateriale
sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea celulelor osoase icircn timpul
procesului de regenerarea osoasă [26] O gamă variată de materiale sintetice sunt utilizate ca și
substituenți osoși metale cum sunt tantalul titanul fierul sau magneziul polimeri sintetici cum
sunt poli acidul lactic poli acidul glicolic poliuretani sau poli ε-caprolactona și ceramice sum
sunt sticlele bioactive fosfații de calciu sau sulfați de calciu hidratați Icircn timp dintre toate aceste
materiale cele mai potrivite s-au dovedit a fi cele pe bază de fosfați de calciu datorită asemănării
cu compoziția osului natural (ce conține mai mult de 60 fosfați de calciu)
Substituenți sintetice sunt disponibili fie sub formă de granule (majoritatea au un diametru
cuprins icircntre 01 și 5 mm) fie sub formă suporturi cu porozitate variabilă icircn funcție de diverse
aspecte ce țin de locul unde vor fi implantate perioada necesară refaceriiregenerării complete
etc De asemenea icircn practica curentă se folosesc și substituienți injectabili denumiți adesea
cementuri un mare avantaj ala acestora fiind tehnica de implantare minim invazivă
Resorbabilitatea este o caracteristică esențială a substituienților osoși fiind intens studiată
Icircn tabelul 12 sunt prezentate principalele clase de substiutuenți osoși utilizați icircn prezent precum
și mecanismele de resorbție ale acestora
19
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Tabel 12 Principale tipuri de substituenți osoși și mecanismul de resorbție al acestora [32]
Clasa de
Material Tipul de material Mecanismul de resorbție
Materiale
Ceramice
Bioglas Resorbţie limitată
Sulfat de calciu hemihidrat (CSH)
Gips
Sulfat de calciu dehidrat (CSD)
Solubilizare
Solubilizare şisau conversie icircn
apatită
Fosfat dicalcic (DCP)
Fosfat octocalcic (OCP)
β-Fosfat tricalcic (β-TCP)
Fosfat de calciu bifazic (BCP)
Cristale de hidroxiapatită
precipitate
β-Pirofosfat de caciu (β-CPP)
Mediat cellular
Hidroxiapatită sinterizată Nu se resoarbe
Materiale
Metalice
Magneziu (aliaj) Coroziune
Fier (aliaj) Coroziune
Tantal titan Nu se resoarbe
Polimeri
Poli acid lactic poli acid glicolic
Poli ε-caprolactona Hidroliză
Celuloză
Hialuronan
Fibrină
Colagen
Chitosan
Transport la ganglioni limfatici
Hialuronidază
Plasmină
Colagenază
Lizozim
Icircn mod ideal un substituent osos ar trebui să fie icircnlocuit icircn timp de țesust osos nativ fără
pierderea suportului mecanic oferit de acesta Icircn unele cazuri defectele osoase sunt stabilizate
utilizacircnd fixarea metalică neresorbabilă defectul osos propriu-zis fiind completat cu un
substituent osos Rata de resorbție a substituienților osoși poate fi controlată prin optimizarea
geometriei materialului Prezența unei rețele cu pori interconectați sau a unor canale icircn structura
sa este o caracteristică cheie a unui substituent osos regăsindu-se inclusiv la cementurile
20
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
injectabile Icircn cazul substituenților pe bază de polimeri rata de resorbție poate fi controlată prin
unele modificări chimice [32]
122 Ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Dezavantajele substituenților osoși sintetici au condus la necesitatea unei metode
alternative şi efective avacircnd drept scop principal regenerarea osoasă S-au evidenţiat
următoarele alternative a substituenţilor osoşi utilizarea factorilor de creştere osteogenici (cum
ar fi proteienele morfogenetice osoase ndash BMPs) suporturi osteoinductive terapia genică
utilizarea celulelor stem toate acestea reprezentacircnd componentele inginerie tisulare (figura 17)
Figura 17 Triada ingineriei tisulare și aplicarea produsului rezultat icircn procesul de
regenerarea al țesutului osos afectat de tumoriinfecții
Componentele ingineriei tisulare o matrice sau un suport celule și molecule semnal au
fost stabilite plecacircnd de la structura țesuturilor biologice [33]
Matricea sau suportul este componenta cheie a ingineriei tisulare Acționează iniţial ca un
suport temporar pentru adeziunea și creșterea celulară apoi are rol definitoriu pentru sinteza de
matrice extracelulară iar icircn ultimă etapă contribuie la formarea de neo-țesut [34]
21
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau regenerarea
ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor artificiale și a suporturilor
Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase sisteme injectabile capsule
filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri etc [35]
1221 Biomateriale utilizate la realizarea de suporturi pentru regenerarea osoasă
La realizarea suporturilor pentru regenerarea osoasă sunt utilizate mai multe tipuri de
biomateriale biopolimeri polimeri sintetici și biomateriale ceramice
Polimeri atacirct de origine naturală cacirct și sintetică sunt utilizați pentru o varietate de aplicații
biomedicale Din clasa polimerilor naturali sau bioplomeri fac parte polizaharidele proteine și
poliesteri proveniți atacirct din regnul vegetal cacirct și din regnul animal Biopolimeri sunt utilizați
icircntr-o multitudine de domenii industria alimentară industria farmaceutică (foarte des ca și
excipienți) la realizare unor proteze icircn sisteme de eliberare controlată de medicamente etc
Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul biologic fiind dirijați spre degradarea metabolică
Datorită similarității dintre polimerii naturali și matricea extracelulară (ECM) aceste materiale
nu vor provoca o reacție imunologică cronică sau toxică reacții deseori icircntalnite icircn cazul
utilizării polimerilor sintetici [36]
12211 Biopolimeri
Printre cei mai utilizați biopolimeri se numără colagenulgelatina acidul hialuronic
chitosanulchitină albumina serică bovină fibroina din mătase [37]
Colagenul
Colagenul ndash Col proteina cea mai abundentă din organismul uman se remarcă ca
biopolimer printr-o serie de proprietăţi precum biocompatibilitatea excelentă
biodegradabilitatea rezistenţa mecanică ridicată toxicitatea scăzută reacţii imunologice slabe
fiind unul din cele mai utilizate biomateriale icircntr-o varietate de aplicaţii medicale
Din punct de vedere al structurii chimice colagenul are structură de triplu helix
macromolecula de colagen fiind formată din trei lanţuri α răsucite icircmpreună de la stacircnga la
dreapta icircn jurul unui ax comun [38] Există mai multe tipuri de colagen fiecare tip avacircnd
22
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
particularității proprii de structură precum și localizare icircn organe specific icircn organism Nu se ştie
cu exactitate cacircte tipuri de colagen există Cel mai intalnit colagen icircn racircndul vertebratelor este
colagenul de tip I de aceea este și cel mai utilizat și studiat icircn diverse domenii
Figura 18 Structura colagenului
Poate fi prelucrat sub o mare varietate de forme filme fibre structuri poroase
nanoparticule şi microparticule atacirct singur cacirct şi icircn combinaţie cu alte materiale Deoarece
structura sa chimică permite combinarea colagenului cu factori de creştere sau alţi agenţi
bioactivi una din cele mai importante aplicaţii ale colagenului este utilizarea lui icircn sisteme de
eliberarea controlată de medicamente membrane de colagen pentru aplicaţii oftalmice structuri
poroase pentru răni şi arsuri diferite geluri etc Remarcabilă este și utilizarea colagenului icircn
ingineria tisulară pentru realizarea unor substituenţi pentru piele a unor substituenţi osoşi sau a
unor valve artificiale [39]
Icircn domeniul ingineriei repararării şi regenerării ţesutului osos colagenul a fost unul dintre
primele biomateriale studiate fiind totodată şi unul din cele mai utilizate materiale de cele mai
multe ori utilizat icircn combinaţie cu alţi biopolimeri şi fosfaţi de calciu sub diverse forme de
prezentare hidrogeluri injectabile membranefilme suporturi poroase microsfere nanosfere
Un hidrogel pe bază de colagen reprezintă un candidat excelent pentru icircncapsularea de celule
datorită capacității sale de umflare icircn apă proprietăților fizice adecvate (de exemplu proprietăți
mecanice capacitatea de gelifiere) conținutului ridicat de apă ce facilitează transportul și
difuzia proprietăților biologice excelente și sensibilitații la degradarea enzimatică [40] De
23
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
exemplu hidrogeluri conținacircnd diferite rapoarte masice chitosancolagenul au fost fabricate icircn
următoarele condiții de sinteză gelifiere inițiată de utilizarea β-glicerofosfat utilizarea unui
mediu osteogenic suplimentar și a unei baze slabe și temperatură variată Prezența colagenului icircn
hidrogel a fost asociată cu creșterea proliferării celulare hidrogelul a fost mai compact rezultacircnd
o matrice rezistentă [41]
Membrane resorbabile pe bază de colagen au fost utilizate icircn ingineria tisulară și
regenerarea osoasă ghidată deoarece de-a lungul timpului numeroase studii au arătat că acestea
sunt biocompatibile și sporesc rata de regenerare Acestea sunt fabricate prin tehnici diverse
fiind adesea utilizate alături de polimeri sintetici de exemplu poli (tetrafluoroetilienă)
Variantele comerciale cele mai icircntalnite de membrane pe bază de colagen utilizate icircn practica
clinică sunt Bio-Gidereg (GeistlichPharma AG Wolhusen Elveția) DuraMatrix-Onlaytrade ndash
membrană pe bază de colagen pentru repararea țesutului dura mater (Collagen Matrix Inc NJ
SUA) TenoMendtrade (Collagen Matrix Inc) OssiPatchtrade ndash membrană protectoare pe bază de
colagen pentru regenerarea osoasă (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) și Collatenetrade
Fibrillar Collagen ndash pansament utilizat pentru afecțiuni maxilo-faciale (Ace Surgical Supply Co
Inc MA SUA)
Suporturile poroase pe bază de colagen au icircn componența lor și particule ceramice icircn acest
fel icircncercacircndu-se o imitare a structurii osului natural Din variantele comerciale cele mai des
utilizate se pot aminti Collagrafttrade (Collagen Corp SUA) ndash care combină hidroxiapatită fosfa
tricalcic cu măducă osoasă de la pacinet și colagen de origine bovină OssiMendtrade Bone Graft
Matrix (Collagen Matrix Inc New Jersey SUA) ndash combină minerale osoase sub formă poroasă
cu colagen și INFUSEreg Bone Graft (Medtronic Sofamor Danek Inc USA) ndash care pe langă un
suport poros pe bază de colagen conțin protein morfogenetice umane recombinate (rhBMP-2)
[40]
Gelatina
Gelatina este un derivat denaturat al colagenului Polielectrolit amfoteric gelatina este un
amestec de fragmente de proteine solubile icircn apă avacircnd aceleaşi secvenţe de aminoacizi ca şi
colagenul structura sa chimică fiind redată icircn figura 19 Colagenul diferă de gelatină prin aceea
că are mai multe structuri terţiare fiind mai puţin solubil icircn soluţii apoase decacirct gelatin [42]
Gelatina poate fi fabricată din diverse surse sursa de provenienţă a gelatinei influențacircnd
24
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţile acesteia Cel mai adesea se fabrică din piele porcină (46) piele bovină (294)
sau oase de origine porcină sau bovină (231) [43] Gelatina este un polimer biodegradabil
biocompatibil non-antigenic are cost scăzut susţine adeziunea celulară migrarea diferenţierea
şi proliferarea celulară Un dezavantaj al acestei proteine este acela că are proprietăţi mecanice
slabe De aceea pentru a fi utilizat la realizarea unor matrici suport pentru ingineria tisulară icircn
special a ţesuturilor dure gelatina se utilizează icircmpreună cu alţi polimeri de exemplu chitosan
unele ceramic (hidroxiapatită fosfat tricalcic) etc [44] [45]
Figura 19 Structura chimică a gelatinei
Albumina serică bovină
Albuminile serice sunt cele mai abundente proteine din sistemul circulator pentru o mare
varietate de organism fiind principalele molecule complexe care contribuie la presiunea arterială
osmotică Datorită potențialului său antioxidant albumina are un rol esențial icircn prepararea
mediilor pentru culturi de celule de mamifere atacirct icircn domeniul cercetării cacirct și icircn domenii
comerciale [46]
Icircn domeniul ingineriei tisulare și domeniul medicinei regenerative albumina serică bovină
ndash BSA este una dintre cele mai studiate proteine din punct de vedere al interacțiunii cu
polizaharidele datorită stabilității sale semnificative a faptului că este ușor accesibilă are o
solubilitate bună icircn apă și datorită asemănării structurale și funcționale cu albumina serică umană
[47]
Icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos albumina serică bovină este utilizată icircn
sisteme complexe pe bază de materiale ceramice Un studiu care evidențiază influența utilizării
albuminei alături de materiale ceramice a fost publicat de Chew și colaboratorii care au
25
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
demonstrat că adăugarea unei concentraţii scăzute de albumină serică bovină este utilă deoarece
susţine creşterea cristalelor de fosfaţi de calciu fiind astfel utilă procesului de mineralizare a
ţesutului osos Icircn comparaţie o concentraţie mare de albumină inhibă cristalizarea fosfaţilor de
calciu [48] Această proprietate a albuminei serice bovine precum și cele menționate anterior a
făcut ca aceasta să fie utilizată de unii autori la sinteza de cimenturi pe bază de fosfaţi de calciu
[49] [50]
De asemnea această proteină a fost utilizată ca adjuvant icircn studii vizacircnd regenerarea
osoasă cu ajutorul unor microsfere hibride alături de poliacrilatalginat de calciu [51]
Fibroină din mătase
Fibroina din mătase produsă de viermi de mătase Bombyx mori este o proteină naturală
cu o foarte bună biocompatibilitate non-toxică biodegradabilă De asemenea prezintă
proprietăţi intrinseci remarcabile şi o bună rezistenţă mecanică Datorită proprietăţilor
menţionate icircn ultimii ani a avut loc o creştere a interesului pentru utilizarea fibroinei din mătase
la obţinerea de suporturi poroase tridimensionale Studii recente au dovedit capacitatea unor
suporturi tridimensionale pe bază de fibroină de a susţine proliferarea celulară icircn aplicaţii vizacircnd
ingineria tisulară a osului a cartilajului şi a vaselor de sacircnge [52]
Figura 110 Structura chimică a fibroinei din mătase
Chitosan
Chitosanul ndash Cs descoperit icircntamplător de către Rouget la mijlocul secolului al XIX lea
este una din cele mai utilizate polizaharide icircn ingineria tisulară şi regenerare osului Acesta este
obţinut din chitină polizaharid structural ce are rol analog cu cel al colagenului icircn regnul animal
superior şi al celulozei icircn plantele Plantele produc celuloză icircn pereţii plantelor iar insectele şi
crustaceele produc chitină icircn aripi respectiv scoici Prin deacetilarea icircntre 40 şi 100 a
chitinei rezultă un polimer format din unităţi de β-(1-4)-2-acetamino-D-glucoză (N-acetil-D-
26
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
glucozamină) şi β-(1-4)-2-amino-D-glucoză (N-D-glucozamină) Icircn afara diferenţei de structură
dintre chitină şi chitosan o altă diferenţă este dată de solubilitatea celor doi biopolimeri chitina
este insolubilă icircn solvenţii uzuali chitosanul dizolvacircndu-se icircn aceştia Structura sa unică
biocompatibilitatea proprietăţi fizico-chimice (solubilitatea biodegradabilitate) versatilitate icircn
termeni de prelucrare proprietăţi multidimensionale şi funcţionalitate icircnaltă fac ca acest
biopolimer să aibă o multitudine de aplicaţii icircntr-o gamă variată de domenii domeniul
biomedical industria farmaceutică industria cosmetică biotehnologii industria alimentară
agricultură şi protecţia mediului [53] [54]
Figura 111 Structura chimică a chitosanului
Icircn ceea ce privește utilizarea chitosanului icircn domeniul regenerării osoase sunt elaborate
studii complexe icircncă de acum cacircteva deceni Borah şi colaboratorii fiind primii care au
demonstrate potenţialul osteogenic al acestuia [55] Au urmat apoi Muzarelli şi colaboratorii care
au realizat studii publicate icircn anii 1993 şi 1994 remarcante din punct de vedere al proprietăţilor
de regenerare osoasă ale chitosanului [56]
Acid hialuronic
Acidul hialuronic ndash Hya este un mucopolizaharid ce face parte din clasa
glicozaminoglicanilor ndash GAG avacircnd cea mai simplă structură chimică din această clasă de
compuși biologici și fiind singurul glicozaminoglican nesulfatat Icircn organismul uman acidul
hialuronic se găseşte icircn lichidul sinovial umoarea vitroasă matricea extracelulară a ţesutului viu
iar icircn cea mai mare cantitate se regăsește icircn piele Hya este componentul principal al matricei
extracelulare a cartilajului articular acţionacircnd ca o ancoră pentru GAG sulfataţi din cartilaj [57]
27
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Este neramificat și inert din punct de vedere imunologic iar spre deosebire de alți GAG
este sintetizat ca un polizaharid liber și nu substituit la o miezul unei proteine [58] Structura
acidului hialuronic este reprezentată de unităţile dizaharidice polianionice acid D-glucoronic şi
N-acetil-D-glucozamină unite alternant prin legături β ndash 14 și β ndash 1-3 glicozidice (figura 112)
Figura 112 Structura acidului hialuronic
Hya se extrage adesea din surse de origine animală creastă de cocoș și umoare vitroasă de
origine bovină icircnsă procesul de izolare din aceste surse este dificil deoarece acesta formează
complexe stabile din punct de vedere chimic cu proteoglicani prezenți icircn țesutul animal fiind
foarte greu de controlat masa moleculară a acesti biopolimer Extragerea acidului hialuronic din
surse microbiene reprezintă o alternativă la metoda de extragere menționată anterior bacteriile
din familia Streptococcilor grupurile A și C producacircnd icircn mod natural o capsulă mucoidă de
acid hialuronic [59]
Icircn ciuda faptului că acidul hialuronic se găsește icircntr-o cantitate mică icircn matricea
extracelulară a ţesutului osos acest polimer este implicat icircn procesele biologice importante ale
osului Poate fi produs de osteoblaste şi osteoclaste fiind găsit şi icircn citoplasma celulelor
osteoprogenitoare și poate lega hidroxiapatita fără să afecteze dezvoltarea minerală Are un rol
important icircn osificarea endocondrală şi a platoului de creştere epifizar fiind găsit icircntr-o
concentraţie mare icircn zona condrocitelor hipertrofice Important de menționat este că acidul
hialuronic se găsește icircn concentraţie mare icircn calusul fracturilor nou formate [57]
28
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Alginații
Alginatul este un polimer anionic natural obținut din diverse specii de alge brune
(Phaeophyceae Laminaria hyperborea Laminaria digitata Laminaria japonica Ascophyllum
nodosum Macrocystis pyrifera) prin tratament cu soluții alcaline apoase cel mai adesea
utilizacircndu-se NaOH De-a lungul timpului a fost intens studiat fiind utilizat icircn prezent icircn
multiple aplicații biomedicale datorită proprietăților care le deține biocompatilitate toxicitate
scăzută costuri de obținere și procesare relativ scăzute [60]
Icircn literatură sunt prezentate rezultatele unor studii prinvind utilizarea alginatului la
fabricarea de suporturi pentru igineria tisulară [61] Hye-Lee și colaboratorii prezintă un studiu
cu privire la prepararea și caracterizarea de suporturi compozite pe bază de nano-hidroxiapatită
alginat și chitosan cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos [62] Icircntr-un alt studiu
Sharma și colaboratorii prezintă fabricare de suporturi nano-biocompozite a căror componente
sunt același ca icircn studiul publicat de Hey-Lee la care se adaugă gelatină procedeul de fabricare
al nano-biocompozitelor fiind unul complex [63]
12212 Polimeri sintetici
Două din cele mai mari avantaje ale polimerilor sintetici sunt reproductibilitate mare şi
posibilitatea de a fi fabricaţi pe scară largă De asemnea pot fi fabricați sub o gamă foarte variată
de forme Icircn comparație cu polimerii naturali este foarte important de menționat faptul că
polimerilor sintetici li se pot controla proprietăţile mecanice şi biodegradabilitatea icircnsă ridică
probleme deoarece nu au activitate biologică şi sunt foarte hidrofobi [64]
Poli (acidul lactic)
Poli (acidul lactic) ndash PLA este unul din cei mai utilizați polimeri sintetici datorită
proprietăților sale mecanice foarte bune fiind utilizat cu succes icircn diverse implanturi medicale
Datorită faptului că PLA are o viteză de degradare in vivo scăzută este cel mai adesea utilizat
pentru fixarea ososă [65] Deoarece prezintă doi carboni asimetrici PLA are trei forme izomerice
D(-)- PDLA L(+)-PLLA şi (DL)- PDLLA Ușurința icircn procesare cristalinitatea precum și viteza
de degradare depind de structura și compoziția lanțurilor polimerice icircn mod particular de
raportul izomerilor PLLA este considerat un homoplimer izotactic semicristalin avacircnd cea mai
mare temperatură de topire dintre cei trei izomeri ai PLA [66]
29
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 113 Structura PLA
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA este un copolimer al poli (acidului lactic) ndash PLA şi
al poli (acidului glicolic) ndash PGA Este utilizat la realizarea de produse farmaceutice și diverse
suporturi pentru ingineria tisulară fiind un polimer biocompatibil și biodegradabil [67]
Suporturile pentru inginerie tisulară pe bază de PLGA au avantajul de a fi degradate icircn mediul de
cultură celular produșii de degradare rezultați fiind lipsiți de toxicitate [68]
Figura 114 Structura PLGA
unde n ndash numărul de unităţi structural de acid lactic şi m ndash numărul de unităţi structurale de acid
glycolic
Poli (caprolactona)
Poli (caprolactona) ndash PCL este un polimer termoplastic biocompatibil avacircnd temperaturile
de topire şi de vitrifiere scăzute Este cristalin şi hirofob caracteristici ce conduc la o viteză de
degradare scăzută De asemenea are proprietăţi mecanice constante icircn timp Proprietăţile
prezentate fac ca acest polimer să fie adesea utilizat icircn ingineria tisulară [69]
30
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 115 Structura PCL
Poli (3- hidroxibutiratul)
Poli (hidroxialcanoaţii) ndash PHA sunt o clasă de poliesteri naturali produși de o varietate de
microorganisme Primul polihidroxialcanoat descoperit și totodată cel mai studiat este poli-3-
hidroxibutiratul ndash P(3HB) a cărui structură chimică este redată icircn figura 116 [70]
Figura 116 Structura P(3HB)
12213 Biomateriale cermice
Din categoria suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă biomaterialele
ceramice reprezintă o categorie foarte importantă cele mai multe variante comerciale pentru
aplicația vizată icircncadracircndu-se icircn această categorie Compoziţia şi morfologia acestor
biomateriale au o influență esențială asupra răspunsului tisular Icircn majoritatea cazurilor sunt non-
imunogenice nu provoacă reacții inflamatoare și sunt non-citotoxice Icircn practica clinică
ceramicele sunt utilizate icircntr-o mare varietate de aplicații biomateriale pentru regenerarea
articulaţiei artificiale a şoldului biomaterialele de reconstrucţie osoasă implanturi pentru
icircnlocuirea celor trei oscioare de la nivelul urechii (ciocănş nicovală şi scăriţă) rădăcini dentare
artificiale şi ceramice pentru diverse tratamente medicale [71]
31
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Ceramicile utilizate la fabricarea de implanturi se clasifică icircn ceramice neresorbabile
(bioinerte) ceramice bioactive sau cu suprafaţa activă (semi-inerte) şi ceramice biodegradabile
sau resorbabile (non-inerte)
Ceramicele neresorbabile inerte sunt stabile la interacţiunea cu mediul fiziologic şi nu
prezintă bioactivitate sau efecte dăunătoare pentru organismul uman cele mai reprezentative
fiind alumina ndash Al2O3 zirconia ndash ZnO2 carbonul și nitrura de siliciu Ceramicele bioactive
semi-inerte sunt ceramice desemnate să inducă o activitate biologică specifică avacircnd
capacitatea de a se lega direct la os caracteristică deosebit de importantă şi unică icircn racircndul
tuturor tipurilor de biomateriale Din categoria ceramicelor bioactive semi-inerte fac parte
apatitele sticlele bioactive şi sticlele ceramice bioactive Fosfaţii de calciu chiar daca fac parte
din clasa apatitelor se icircncadrează icircn categoria ceramicelor resorbabile [72] [73]
Sticlele bioactive au fost inventate de către Hench Universitatea din Florida icircn 1971
Acestea au drept compoziţie de bază SiO2-CaO-Na2O-P2O5 și la fel ca ceramicile bioactive au
capacitatea de a se lega de os fară a exista conexiuni tisulare fibroase icircntre ele Bioglassreg
45S5
este prima şi cea mai studiată sticlă bioactivă Bioglassreg S53P4 este o altă sticlă bioactivă
utilizată icircn ortopedie ca şi substituent osos sub varianta comercială BonAlivereg (Vivoxid
Finlanda) [74]
Sticlele bioactive ceramice se obţin prin precipitarea icircn sticlele bioactive a unei faze
cristaline rolul acestei etape de sinteză fiind de a mări rezistenţa mecanică a acestora din urmă
Spre deosebire de sticlele bioactive obișnuite au o bioactivitate mai scăzută dar au o rezistenţă
mecanică superioară Sunt utilizate la realizare vertebrelor artificiale spaţiului intervertebral
artificial şi a unor materiale de umplere poroase sau granulare [75]
Fosfați de calciu
Fosfații de calciu reprezintă componenta majoră a țesutului dur al vertebratelor
componenta anorganică (minerală) a osului avacircnd icircn compoziție nanocristale non-
stoichiometrice de apatită avacircnd următoarea formulă chimică
Ca10-x(PO4)6-x(HPO4CO3)x(OHF)2-x
unde 0lexle2 O particularitate aparte a structurii apatitelor este capacitatea lor de a putea
icircncorpora multe tipuri de ioni organici sau anorganici Astfel s-a dovedit că fosfați de calciu
32
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanocristalini non-stoichiometrici atacirct biologici cacirct și sintetici icircncorporează icircn structura lor ioni
din mediu chimic care nu corespund apatitelor acești ioni fiind denumiți non-apatitici [76] Icircn
tabelul 13 sunt prezentați diferite tipuri de fosfați de calciu
Tabel 13 Diferite forme de fosfaţi de calciu abrevierea lor formula chimică raportul
CaP mineral (dacă există) [77] [78]
Denumire Abreviere Formulă chimică Raport
CaP Mineral
Fosfat monocalcic
monohidrat MCPM Ca(H2PO4)2 H2O 05 ndash
Fosfat monocalcic
anhidru MCPA Ca(H2PO4)2 05 ndash
Fosfat dicalcic
anhidru DCPA CaHPO4 100 Moneit
Fosfat dicalcic
dihidrat DCPD CaHPO4 2H2O 100 Bruțit
Fosfat octocalcic OCP Ca8H2(PO4)6 5H2O 133 ndash
α-Fosfat tricalcic α-TCP α-Ca3(PO4)2 15 ndash
β-Fosfat tricalcic β-TCP β-Ca3(PO4)2 15 ndash
Hidroxiapatită
deficită icircn calciu CDHap Ca9(HPO4)(PO4)5OH 15 ndash
Hidroxiapatită
precipitată Hap
Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x
unde 0lexle2
xx(OH)2-x
133 ndash167 ndash
Hidroxiapatită
sinterizată SHA Ca10(PO4)6(OH)2 167 Hidroxiapatită
Oxiapatită OXA Ca10(PO4)6O 167 ndash
Fosfat tetracalcic TeTCP Ca4(PO4)2O 20 Hilgenstockite
Hidroxiapatita este utilizată destul de des icircn domeniul ingineriei tisulare a țesutului osos
datorită similarității dintre compoziția sa și cea a fazei minerale a osului uman Faza minerală a
osului uman are formula chimică asemănătoare ce cea a hidroxiapatitei deficitară icircn calciu avacircnd
grupările OH- parțial substituite cu grupări CO3
2- Structura cristalină a hidroxiapatitei poate fi
descrisă ca un aranjament hexagonal unde cationii sunt orientați pe planurile tetraedral și
octaedral Icircn ultimii ani diverse suporturi ceramice pe bază de hidroxiapaptită au fost realizate
Cu toate că acestea prezintă proprietăți foarte bune pentru aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului
osos porozitate ridicată osteointegrare bună totuși au diverse neajunsuri icircn ceea ce privește o
refacere completă a defectelor ososoase [79]
33
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
1222 Suporturi biomimetice pentru ingineria tisulară şi regenerarea osoasă
12221 Caracteristici ale suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Suporturile realizate pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă trebuie să aibă o serie
de proprietăți foarte importante pentru a putea fi utilizate cu succes proprietăți prezentate
schematic icircn figura 117
Figura 117 Proprietățile unui suport ideal realizat pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Icircn primul racircnd suporturile trebuie să aibă o serie de proprietăți biologice care sunt
esențiale pentru obținerea unor rezultate promițătoare biocompatibilitatea și bioactivitatea fiind
două din cele mai importante Un suport este considerat biocompatibil dacă nu are răspuns
imunogenic și nu are componente toxice sau inflamatoare care vor conduce la o rejecție
imunologică Bioactivitatea se referă la interacțiunea suportului cu țesutul gazdă și integrarea
acestuia De asemenea din punct de vedere al bioactivității suporturile trebuie să fie
osteoconductive osteoinductive și osteogenice Biodegradabilitatea o altă proprietate biologică
foarte important constă icircntr-o degradare controlată a suportului pe măsură ce se formează țesut
34
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nou menținacircnd totodată suport suficient pentru regenerarea completă a țesutului afectat Lipsa
unor produși de degradare toxici este o altă caracteristică care definește biodegradabilitatea [80]
Proprietăţile de suprafaţa sunt și ele esențiale la fel și proprietăţile morfologice pori
interconectați structură tridimensională microporozitatea macroporozitatea dimensiunea
porilor adaptată fiecărui tip de țesutcelule Porii trebuie să fie interconectați pentru a permite
difuziunea și migrarea celulelor iar dimensiunea porilor trebuie să fie adaptată fiecărui tip de
țesutcelule Microporozitate oferă o suprafață care permite interacțiunile celule-matrice și
macroporozitate permite migrarea celulelor și invazia vaselor de sacircnge Porozitate adecvată
permite creșterea celulelor fără să afecteze proprietățile mecanice
Suporturile trebuie să aibă proprietăţi mecanice similare cu cele ale ţesutului lacircngă care
sunt implantate mai concret trebuie să aibă rezistență la diverse solicitări biomecanice
comparabile cu ale osului uman pentru a permite mecano-reglarea celulară și păstrarea
integrității in vivo [34] [35]
12222 Metode de obținere a suporturilor pentru ingineria tisulară și regenerarea
osoasă
Metodele convenționale de obținere a suporturilor includ prelucrarea prin turnare icircn
solvent și solubilizarea a particulelor liofilizarea separarea fazelor indusă termic metoda de
formare a spumelor din fază gazoasă formarea prin pulverizare formarea prin tehnica sol-gel
electrofilarea și altele
Icircn cazul metodei prin turnarea icircn solvent și solubilizare a particulelor o soluție de polimer
este introdusă icircntr-o solvent cu particule de săruri avacircnd dimensiuni specifice dispersate
uniform Solventul se va evapora rezultacircnd un suport cu particule icircncorporate Suportul este
imersat apoi icircn apă particulele fiind solubilizate uneori se folosește și icircncălzirea pentru o
solubilizare completă rezultacircnd icircn final o structură cu porozitate ridicată Rezprezentarea
schematică a metodei este redată icircn figura 118 Dezavantajele metodei de formare a suporturilor
sunt formarea unor suporturi cu formă prestabilită și citotoxicitatea suporturilor datoră
rezidurilor de solvent
35
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 118 Obținerea suporturilor prin turnare icircn solvent și solubilizarea particulelor
Liofilizarea are la bază procesul de sublimare care se referă la trecerea apei din fază solidă
icircn fază gazoasă Suporturile obținute prin liofilizarea prezintă o structură poroasă cu pori
interconectați avacircnd dimensiuni medii icircn jur de 300 nm (figura 119) dimensiuni ce depind de
natura componentelor suportului Dezavantajele acestei metode sunt timpul icircndelungat necesar
obținerii suportului și faptul că pori rezultați nu au dimensiuni regulate
Figura 119 Obținerea suporturilor prin liofilizare
36
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Metoda de formare a suporturilor din spume gazoase a fost dezvoltată pentru a icircnlătura
utilizarea solvenților organici citotoxici Polimeri biodegradabili dizolvați icircn apă sau fluoroform
sunt ținuți sub presiune cu diverși agenți gazoși inerți (azot dioxid de carbon) pacircnă cacircnd soluția
este saturată și plină de bule de gaz Tehnica are drept rezultat suporturi poroase cu dimensiuni
medii a porilor icircn intervalul 30-700 microm și o porozitate ridicată de pacircnă la 85
Tehnica sol-gel se bazeză pe polimerizarea anorganică a metalelor alcaloide O soluție (sol)
este format prin adăugarea unui surfactant după care vor urma reacțiile de condensare și
gelifiere [81]
Tehnica de electrofilare a fost inventată icircn 1934 de către Formhals și se bazează pe un
cacircmp electric ce impune o icircntindere uniaxală a unui jet vacircscoelastic provenit dintr-o soluție de
polimer ce icircși reduce continuu diametrul icircn final rezultacircnd nanofibre Este o tehnică simplă și
rentabilă pentru prepararea nanofibrelor polimerice cu diameter cuprinse icircntre 3 nm și 5 μm
(figura 120) Proprietățile nanofibrelor electrofilate sunt influențate de mulți factori cum ar fi
proprietățile polimerului proprietățile solventului aditivii concentrația polimerului proprietățile
soluției și așa mai departe [82]
Figura 120 Obținerea suporturilor prin liofilizare
Există și tehnici moderne de sinteză a suporturilor pentru regenerarea osoasă denumite
tehnici de prototipare rapide Dintre acestea cele mai utilizate și cele care oferă pacircnă icircn present
rezultatele cele mai promițătoare sunt sinterizarea selectivă cu laser stereolitografia imprimarea
tridimensională (3D) bio-imprimarea [81]
37
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
12223 Suporturi biomimetie pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu pentru
regenerarea osoasă
Suporturi biomimetice
Icircn general metodele de regenerare osoasă sunt de preferat metodelor de icircnlocuire osoasă
datorită neajunsurilor celor din urmă Un număr mare de studii icircn domeniul ingineriei tisulare și
regenerare a osului au evidenţiat importanţa critică a caracteristicilor arhitecturii suporturilor
utilizate icircn domeniu
Ţesuturile vii sunt caracterizate de o arhitectură ierarhică tridimensională şi un
micromediu unic ce uşurează intercaţiunea celulelor cu molecule semnal componentele matricei
extracelulare şi unele molecule mici Acest micromediu complex controlează procesele celulare
importante pentru morfogeneza ţesutului şi menţine proliferarea diferenţierea şi migrarea
celulară Ingineria tisulară convenţională a icircncercat să imite proprietăţile ţesutului osos nativ doar
la nivel micromolecular şi macromolecular fiind neglijate icircnsă structurile de la nivel
submicromolecular şi nanomolecular [83]
De asemenea numeroase studii icircn acest domeniu au arătat că nu este suficientă realizarea
unor suporturi pentru regenerarea osoasă luacircnd icircn considerarea doar compoziţia chimică a
osului deoarece acestea nu vor avea proprietăţi mecanice similare cu ale osului natural şi vor
afecta metabolismul acestuia cacircnd vor fi implantate in vivo
Pentru realizarea unui substituent osos care să poată fi aplicat cu succes pentru tratarea
unor defecte osose de diferite cauze trebuie să se ţină cont atacirct de compoziţia naturală a osului
dar cel mai important trebuie să se imite nanostrucutura lui deoarece arhitectura nanostructurală
a osului este esenţa lui atacirct icircn ceeea ce priveşte proprietăţile mecanice cacirct şi bioresorbabilitatea
Realizarea unor matrici de colagen icircn care s-a icircncercat reproducerea mineralizării intrafibrilare a
dus la obţinerea unor suporturi ce pot fi aplicate cu succes icircn ingineria tisulară și regenerarea
ţesutului osos [84]
Avacircnd icircn vedere aspectele mai sus menționate se poate spune că suporturilor preparate
plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important imitacircnd nanostructura sa sunt
suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg procesele substanţele dispozitivele
sistemele facute de om care imită natura [85]
38
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Suporturi compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu
Compozitele sunt materiale solide ce au la bază o combinație de minim două materiale cu
propietăți diferite dezavantajele individuale ale acestora sunt diminuate fiind păstrate și puse icircn
valoare doar avantajele fiecărui componet al compozitului
Icircn ingineria tisulară și medicina regenerativă se utilizează mai multe varinte de
compozite co-polimeri polimer ndash polimer sau polimer ndash ceramice Unul din cei mai utilizați co-
polimeri icircn ingineria tisulară osoasă este poli (acidul lactic-co-glicolic) ndash PLGA Compozitele
polimer sintetic ndash polimer sintetic sunt amestecuri de minim doi polimeri sintetice un exemplu
fiind compozitul pe bază de PLGA și polifosfazene asocierea acestora avacircnd drept obiectiv
principal obținerea unor produși de degardare neutri Se pot combina și polimeri sintetici cu
polimeri naturali pentru realizarea de compozite de exemplu PLGA și colagen
Compozitele polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje
care pleacă de la faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele
matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă) De-a lungul timpului au fost studiate și compozite
polimeri sintetici ndash ceramice de exemplu compozite pe bază de poli (acid lactic) poli (acidul
lactic-co-glicolic) hidroxiapatită dar studiile concentrate pe compozitele polimeri naturali ndash
ceramice au avut cele mai bune rezultate de-a lungul timpului [34]
Avantajele unui compozit pe bază de biopolimeri și ceramice ar fi pe de o parte
proprietățile mecanice variabile degradarea controlată și structura fizică a polimerilor iar pe de
altă parte rezistența și natura biomimetică a ceramicelor Combinarea de biopolimeri cu
ceramice elimină un mare dezavantaj al acestora din urmă și anume faptul că sunt casante dar
totodată crește bioactivitatea și capacitatea de transport și eliberare de agenți bioactivi [75]
Compozitele pe bază de colagen și hidroxiapatită au fost de-a lungul timpului cele mai
studiate compozite biopolimeri ndash ceramice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
13 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Icircn ultimii ani interesul pentru nanotehnologie a crescut semnificativ Particulele magnetice
fac parte din grupul materialelor utilizate icircn nanotehnologii cu un impact considerabil icircn diverse
domenii chimie biosenzori nanomedicină etc Cele mai importante aplicații ale lor sunt legate
39
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de obținerea particulelor de dimensiuni nanometrice denumite nanoparticule magnetice ndash MNPs
utilizate ca metode de diagnostic prin separarea magnetică a unor entități biologice utilizarea icircn
scop terapeutic și ultima aplicație aceasta fiind una din cele mai des folosite icircn medicină
utilizarea la rezonanța magnetică nucleară [86]
Utilizate icircn scop terapeutic nanoparticulele magnetice au fost evaluate pentru eliberarea
controlată de medicamente Prin utilizarea atracției magnetice sau a direcționării specifice a unor
biomarkeri tumorali nanoparticulele magnetice oferă o soluție atractivă pentru terapia directă cu
agenți chimioterapici care vor fi eliberați icircntr-un loc specific doză de medicament care ar fi fost
utilizată icircn mod curent fiind astfel redusă semnificativ și o dată cu ea efectele adverse asociate
cu absorbția de către țesuturi sănătoase a medicamentului [87]
MNPs folosite icircn aplicaţiile biomedicale trebuie să fie superparamgnetice adică să aibă
proprietatea de a putea fi magnetizate doar icircn prezenţa unui cacircmp magnetic extern De asemenea
trebuie să aibă dimensiuni mici pentru a nu fi eliminate din circulaţie de către ficat sau splină
după ce cacircmpul magnetic este icircnlăturat Icircn general cu cacirct particulele au dimensiuni mai mari cu
atacirct este mai mic timpul lor de icircnjumătăţire icircn plasma
Cele mai utilizate surse de materiale magnetice sunt oxizii de fier cu structură de miez ce
au mai multe forme cristaline polimorfe hematită α-Fe2O3 maghemită β-Fe2O3 γ- Fe2O3 şi
magnetită ε-Fe2O3 Fe3O4 precum şi alte forme amorfe Singurele utilizate icircn aplicaţiile medicale
sunt maghemita şi magnetita Pentru realizarea miezului magnetic a unor nanoparticule
magnetice se utilizează icircn unele aplicaţii şi fierul carbonil datorită dimensiunilor mici ale
particulelor sale [88] [89]
Pentru a icircmbunătăţi proprietăţile fizice şi chimice ale particulelor magnetice acestea sunt
adesea acoperite cu silica polimeri anumiţi surfactanţi sau diverşi compuşi organici Acoperirea
cu polimeri oferă o serie de avantaje nanoparticulelor magnetice numărul mare de grupări
funcţionale ale polimerilor permite alte funcţionalizări ale particulelor toxicitatea este complet
redusă are rol icircn stoparea procesului de oxidare etc Datorită atracţiei puternice dipol-dipol
dintre particule MNP tind să se aglomereze dar pentru a icircnlătura acest dezavantaj MNP sunt
acoperite cu polimeri hidrofilici cum sunt dextranul şi chitosanul Grupările funcționale ale
chitosanului permit funcționalizarea nanoparticulelor cu diverși agenți bioactivi prin stabilirea de
legături chimice icircntre grupările chitosanului și cele ale agentului
Reprezentarea unei nanoparticule magnetice acoperită cu polimer este redată icircn figura 121
40
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 121 Reprezentarea schematică a unei nanoparticule acoperite cu polimer cu funcții
aminice
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular cercetările
științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind cel de eliberarea
de principii active controlată și țintită
Nanoparticulele sunt integrate prin diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale
pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă
creștere deorece studii mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația
vizată
Icircn urma unui studiu de literatură amănunţit se poate realiza o clasificarea a suporturilor
magnetice pe bază de biomateriale cu aplicaţii icircn ingineria tisulară şi regenerarea osoasă icircn
funcţie de compoziție și icircn funcție de forma de prezentare
Icircn funcție de compoziție suporturile magnetice se pot clasifica icircn suporturi magnetice cu
biopolimeri care se clasifică la racircndul lor icircn suporturi magnetice pe bază de proteine şi suporturi
magnetice pe bază de polizaharide suporturi magnetice cu polimeri sintetici suporturi magnetice
cu materiale ceramice Icircn funcție de forma de prezentare suporturile magnetice se clasifică icircn
suporturi magnetice poroase hidrogeluri magnetice membrane magnetice nanofibroase și sticle
bioactive magnetice (figura 122)
41
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
Figura 122 Clasificarea suporturilor magnetice
131 Suporturi magnetice cu biopolimeri
1311 Suporturi magnetice cu proteine
Colagenul gelatina și fibroina din mătase sunt trei din proteinele cele mai utilizate icircn
sinteza de suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi magnetice cu colagen
Unul din primele studii ce prezintă conceptul de suporturi magnetice a fost publicat icircn
2010 de Bock şi colaboratorii [90] prezentacircnd realizarea şi caracterizarea a două tipuri de
suporturi magnetice Primul tip de suport a fost obţinut din hidroxiapatită şi colagen (7030 ww)
reticulat cu 14-butandiol diglicidil eter sub formă de structuri liofilizate microporoase şi
macroporoase avacircnd diametrul de 122plusmn08 mm şi icircnălţimea 47plusmn08 mm Al doilea tip de suport
a fost obţinut din 100 colagen liofilizat sub formă de structuri poroase omogene cu diametrul
42
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
de 123plusmn1 mm şi icircnălţime 28plusmn09 mm Icircn vederea magnetizării ambele tipuri de suporturi au
fost imersate pentru 15 min icircn 1ml fero-fluid trei tipuri diferite de fero-fluide fiind utilizate
(figura 123) Fero-fluidele reprezentacircnd nanoparticule magnetice cu dimensiunea de 200 nm
dispersate icircn apă au fost notate FF-DXS (nanoparticule de magnetită acoperite cu sulfat de
dextran și funcționalizate cu grupări funcționale de sulfat de sodiu) FF-PAA (nanoparticule de
magnetită acoperite cu acid poli-DL-aspartic și funcționalizate cu carboxilat de sodiu) și FF-DP
(nanoparticule de magnetită acoperite cu amidon și funcționalizate cu grupări fosfat)
Figura 123 Reprezentarea schematică a procedeului de preparare a suporturilor magnetice [90]
Valorile obținute pentru magnetizarea suporturilor sunt considerate potrivite pentru
generarea de gradient magnetic icircn suport precum și icircn vecinătatea acestuia Studiile in vitro de
biocompatibilitate au dovedit că suporturile magnetice obținute susțin adeziunea și proliferarea
celulelor stem Icircn concluzie suporturile obținute au potențialul de a fi considerate substituenți
osoși avacircnd ca și noutate față de variantele standard proprietatea de a atrage particule magnetice
funcționalizate cu medicamente [91]
Icircn 2013 Panseri și colaboratorii [92] descriu icircntr-un studiu obținerea și caracterizarea de
suporturi magnetice obținute prin două metode diferite metoda A și metoda B Metoda A are la
bază magnetizarea in situ și constă icircn nucleația de apatită biomimetică și 7 nanoparticule
magnetice (cu dimensiunea mai mică de 50 nm achiziționate de la Sigma Aldrich) pe fibrile de
colagen autoasamblate Metoda B reproduce procedeul de obținere descris icircn studiul mai sus
43
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
menționat (Bock și colaboartorii) un suport poros pe bază de hidroxiapatită și colagen fiind
imersat icircn fero-fluidul FF-DP Din datele de microscopie electronică de baleiaj (SEM) autorii au
observat icircn cazul suporturilor obținute prin metoda A o distribuție omogenă a nanoparticulelor
magnetice pe fibrele de colagen iar icircn cazul suporturilor obținute prin metoda B o aglomerare a
nanoparticulelor Teste in vivo complexe au fost realizate utilizacircnd suporturile obținute
rezulatele indicacircnd potențialul acestora de a fi utilizate icircn aplicații ale ingineriei tisulare a
țeustului osos Icircntr-un studiu următor autorii funcționalizează hidroxiapatita cu ioni de fier (Fe2+
şi Fe3+
) conferindu-i astfel proprietăţi superparamagnetice şi totodată diminuacircnd potenţialul
citotoxic ce poate fi uneori dat de magnetită sau de unii oxizi de fier
Suporturi magnetice cu gelatină
Samal şi colaboratorii [93] evidenţiază obţinerea şi caracterizarea de suporturi magnetice
pe bază de gelatină Soluţii de gelatină amestecate cu concentraţii diferite de fero-fluid (particule
de magnetită acoperite cu acid poli-acrilic dispersate icircn apă) au fost transferate icircn plăci de
polistiren cu mai multe straturirezultacircnd membrane ce au fost apoi legate chimic cu ajutorul
carbodiimidelor icircn vederea obţinerii suporturilor
Gelatina a fost utilizată şi de Dashnyam şi colaboratorii [94] pentru obţinerea unor
suporturi magnetice hibride Suporturile au fost obţinute din gelatină şi siloxan printr-un
procedeu sol-gel icircn timpul căruia au fost icircncorporate 3 nanoparticule magnetice ultimul pas
pentru obţinerea unor suporturi foarte poroase a fost liofilizarea Icircn urma unor teste mecanice
efectuate autorii au observat o icircmbunătăţire semnificativă a proprietăţilor mecanice ale
suporturilor datorită icircncorporării de nanoparticule magnetice icircn strucura acestora Icircn cadrul
studiului au fost realizate teste de populare cu celule (stem mezenchimale izolate din şobolan) a
suporturilor avacircnd nanoparticule magnetice icircncorporate precum şi a suporturilor fară
nanoparticule magnetice icircncorporate rezultatele indicacircnd o proliferare celulară icircmbunătăţită icircn
cazul primelor suporturi menţionate
Suporturi magnetice cu fibroină din mătase
Icircntr-un studiu publicat recent fibroina a fost utilizată icircmpreună cu chitosan şi nanoparticule
magnetice pentru realizarea unor suporturi cu porozitate controlată cu aplicaţii icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos O soluţie de fibroină şi chitosan a fost preparată avacircnd raportul masic
44
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
31 şi reticulată cu o soluţie 08 glutaraldehidă Patru fero-fluide avacircnd concentraţiile
nanoparticulelor magnetice 0 05 1 şi 2 au fost adăugate icircn soluţia de polimeri iar
soluţiile astfel obţinute au fost transferate icircntr-o matriţă de politetrafluoretilină aşezată icircntr-o
placă de cupru rece a cărui temperatură a fost controlată cu azot lichid Cristale de gheaţă
unidirecţionale s-au format cu o viteză de solidificare de 1degCminut soluţia icircngheţată rezultată
fiind icircntr-o ultimă etapă liofilizată (figura 124)
Activitatea fizico-chimică a suporturilor obţinute a fost studiată icircn soluţii saline de tampon
fosfat pentru a determina retenţia de fluide şi biodegradarea Stabilitatea nanoparticulelor
magnetice din suporturile obţinute a fost analizată utilizacircnd Spectroscopie de absorbţie atomică
Toate cele patru suporturi realizate s-au dovedit a avea o bună biocompatibilitate icircn urma
testelor MTT [95]
Figura 124 a) Reprezentarea schematică a procesului de obținere asuporturilor b) Structurile
chimice al polimeriloragentului reticulant și interacțiunile dintre aceștia c) Dimensiunea
suporturilor și diferența de culoare dată de variația concentrației de nanoparticule magnetice
d) Suportul este atras de un magnet permanent [95]
Suporturi magnetice pe bază de fibroină din mătase au fost realizate şi caracterizate de
Samal şi colaboratorii Nanoparticulele magnetice au fost integrate icircn suporturi prin imersare
rezultacircnd diferite grade de magnetizare Suporturile obţinute s-au dovedit a avea foarte bune
45
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
proprietăţi de hipertermie ajungacircnd la temperaturi ce au crescut cu 8degC icircn 100 secunde Testele
de biocompatibilitate au indicat lipsa citotoxicităţii suporturilor precum şi capacitatea acestora de
a susţine adeziune şi proliferarea celulară [96]
Hidrogeluri magnetice au fost obţinute printr-un proces de electro-gelifiere a unui soluţii
concentrate de fibroină din mătase (8 ) cu scopul de a fi utilizate ca şi suporturi icircn ingineria
tisulară a ţesutului osos Patru feluri de suporturi au fost realizate suporturi avacircnd icircncorporate
nanoparticule magnetice (Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice acoperite
cu albumină serică umană (HSA-Fe3O4) suporturi avacircnd icircncorporate nanoparticule magnetice
acoperite cu albumină serică umană şi conjugate fizic cu factori de creştere fibroblastici bazali
(HSA-Fe3O4-bFGF) şi suporturi fără niciun fel de nanoparticule magnetice Morfologia
suporturilor a fost studiată cu ajutorului microscopiei electronice de baleiaj Citotoxicitatea lor a
fost analizată printr-un test MTT realizat pe osteoblaste de linie iar activitatea osteogenică a fost
studiată din punct de vedere a fosfatazei alcaline a cantităţii de calciu mineralizat şi a
colagenului Analizacircnd rezultatele testelor menţionate autorii consideră că suporturile obţinute
pot fi utilizate pentru aplicaţia vizată [97]
1312 Suporturi magnetice cu polizaharide
Chitosanul este polizaharidul cel mai utilizat icircn studiile privind sinteza și caracterizarea de
suporturi magnetice pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă
Suporturi biocompozite magnetice pe bază de chitosan şi carboximetilceluloză au fost
obţinute şi caracterizate de către Grumăzescu şi colaboratorii [98] Carboximetilceluloza cel mai
utilizat eter de celuloză este o polizaharidă cu lanţ liniar solubilă icircn apă datorită grupărilor
carboximetil (CH3COONa) introduse icircn molecula de celuloză Deoarece are icircncărcătură electrică
opusă chitosanului reacţionează puternic cu acesta utilizacircndu-se ca agent de reticulare ionic la
anumite valori ale pH-ului Autorii au studiat morfologia suporturilor eficacitatea utilizării
acestora ca şi sisteme de eliberare controlată de antibiotice in vitro precum şi intercaţiunea lor cu
celule eucariotice Rezultate studiilor menţionate au demonstrat că suporturile magnetice
biocompozite propuse de autori pot fi utilizate cu succes icircn viitor icircn domeniul medical icircn
special icircn ingineria tisulară
Heidari şi colaboratorii [99] prezintă icircntr-un studiu recent prepararea in situ a unor
nanoparticule de oxid de fier icircn matrici de hidroxiapatităchitosan pentru aplicaţii icircn ingineria
46
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
ţesutului osos Atacirct hidroxiapatita cacirct şi chitosanul au fost extrase din surse naturale os cortical
bovin pentru hidroxiapatită respectiv creveţi pentru chitosan Două cloruri de fier (FeCl2 FeCl3)
au fost dizolvate icircn soluţie de acid acetic sub agitare magnetică pentru 30 min S-a adăugat apoi
pulbere de hidroxiapatită iar după dizolvarea pentru o oră a acesteia s-a adăugat chitosan şi s-a
lăsat la solubilizat pentru icircncă o oră Alte etape au urmat obţinacircndu-se o matrice gel ce a fost
uscată icircn etuvă la 60degC pentru 24 ore Compozitele tridimensionale obţinute au fost supuse unui
număr foarte mare de analize distribuţia particulelor magnetice icircn funcţie de mărime a fost
analizată cu ajutorul unui analizor de particule şi cu ajutorul microscopiei electronice de
transmisie (TEM) morfologia probelor a fost analizată utilizacircnd SEM proprietăţile magnetice au
fost studiate cu ajutorul unui magnetometru cu vibraţii simple (VSM) şi multe altele
Y Wei și colaboratorii [100] publică un studiu icircn care prezintă fabricarea și caracterizarea
de membrane nanofibroase pe bază de oxizi de fier (Fe3O4) chitosan și polialcool vinilic
Chitosanul (CS) și alcoolul polivinilic (PVA) au fost dizolvate separat icircntr-o soluție de acid
acetic iar apoi au fost amsetecate icircn raport de masă CSPVA= 23Nanoparticule pe bază de
Fe3O4 obținute printr-o metodă de co-precipitare au fost adăugate icircmpreună cu etanol icircn
amestecul polimeric Membranele magnetice nanofibroase Fe3O4CSPVA au fost obținute prin
electrofilarea soluției polimerice conținacircnd Fe3O4 Datorită procesului de electrofilare s-a obținut
o porozitate foarte bună a membranelor 839-851 Datele TEM au arătat o distribuiție uniform
a nanoparticulelor magnetice Datele de spectroscopiei icircn infraroșu cu transformată Fourier
(FTIR) și datela de difracției cu raze X (XRD) au demonstrat că structura chimică și
cristalinitatea probelor nu a fost afectată de procesul de electrofilare De asemenea proprietățile
mecanice proprietățile magnetice și interacțiunea cu osteoblaste aparținacircnd linie de celule
tumorale MG-63 au sugerat că membranele magentice obținute au un real potential pentru
viitoare aplicații privind regenerarea osoasă
132 Suporturi magnetice cu polimeri sintetici
Icircn ultimii 100 ani materialele sintetice sunt utilizate pentru repararea şi regenerarea unei
varietăţi de ţesuturi şi organe [101] Deoarece in vivo osul este adesea supus forţelor mecanice
rezultate icircn urma acţiunii muşchilor şi a mişcărilor corpului una din cerinţele de bază impuse
unui suport realizat cu scopul de a fi utilizat icircn ingineria tisulară a ţesutului osos este aceea de a
fi capabile să suporte stimulii mecanici Biomaterialele sintetice rezultate icircn urma polimerizării
47
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
acidului lactic a acidului glicolic sau a caprolactonei sunt studiate pentru realizarea de suporturi
compozite de obicei icircn combinaţie cu polimeri naturali [102]
Poli (acidul lactic)
Suporturile magnetice pe bază de PLA sunt icircn prezent puțin studiate unul din puținele
studii pe această temă fiind publicat icircn 2007 Lucrarea respectivă se concentrează pe analiza
influenței orientării fibrelor unui suport magnetic pe bază de poli (acid L-lactic) ndash PLLA obținut
prin procedeul de electrofilare asupra proprietăților sale mecanice Pentru realizarea suportului
o soluție de 3 PLLA icircn hexafluoro-2-propanol a fost amestecată cu nanoparticule de magnetită
(Fe3O4) icircn raport PLLAFe3O4 - 955 Amestecul a fost sonicat și apoi electrofilat S-a studiat
morfologia suporturilor obținute interacținuea cu celule precum și rezistența mechanică [102]
Poli (acidul lactic-co-glicolic)
Suporturi nano-compozite superparamagnetice pe bază de PLGA pentru ingineria tisulară
au fost realizate de Lai și colaboratorii Icircntr-o primă etapă PLGA și nanoparticule de magnetită
superparamagnetice hidrofobe (MNPs) au fost amestecate separat icircn diverse rapoarte masice (19
și 11) Icircn a doua etapă cele două amestecuri au fost transferate separat icircntr-o seringă de sticlă de
10 ml conectată la un ac cu dimensiunea de 6 gauge Un electrod a fost montat la ac iar
amestecul respectiv a fost electrofilat icircn timpul procesului tensiunea fiind păstrată constantă la
20 kV viteza de filare fiind de 1 mlH Icircn funcție de raportul PLGA MNPs s-au obținut două
suporturi diferite PLGA-10 MNPs și PLGA-50 MNPs Datele SEM și TEM au evidențiat o
dimensiune a fibrelor suporturilor de 400-600 nm cu MNPs distribuite uniform Suporturile
compozite s-au dovedit a avea o biocompatibilitate excelentă susținacircnd semnificativproliferarea
celulară [103]
Poli (caprolactona)
Unul dintre primele studii care prezintă suporturi magnetice pe bază de PCL a fost
prezentat de Kim și colaboratorii [104] Pentru realizarea suporturilor s-a preparat icircntr-o primă
etapă o soluție de 10 PCL (cu masa molară 80 kDa) icircn cloroform După solubilizare completă
icircn soluția de 10 PCL s-au adăugat două concentrații diferite de nanoparticule magnetice
(MNPs) 05 și 10 față de cantitatea de PCL solubilizată Icircn funcție de concetrația de
48
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
nanoparticule adăugate suporturile au fost notate PCL-MNP5 (5 MNP) PCL-MNP10 (10
MNP) și PCL (nu conține MNPs) După ultrasonicare soluțiile au fost icircnghețate la -70degC iar
apoi liofilizate pentru 3 zile Adăugarea de MNPs icircn suporturile pe bază de PCL a condus la o
icircmbunătățire a hidrofilicității precum și a proprietăților mecanice a acestora Autorii au
demonstrat că suporturile PCL-MNP au capacitatea de a susține adeziunea celulară precum și
mineralizarea avacircnd o bună biocompatibilitate Suporturi realizate după același protocol
prezentat icircn studiul menționat mai sus sunt riguros studiate in vitro și in vivo din punct de vedere
al biocompatibilității și al interacțiunii cu celule și țesuturi Rezultatele obținute icircn respectivul
studiu indică un potențial considerabil al acestor suporturi de a fi utilizat pentru repararea și
regenerarea osoasă [105]
Suporturi magnetice nanofibroase pe bază de PCL sunt prezentate și icircntr-un studiu publicat
icircn 2016 Icircntr-o soluție de 10 PCL icircn diclometan-etanol s-au icircncorporat două concentrații
diferite de nanoparticule magnetice conjugate cu COOH (10 și 20 COOH-MNPs)
amestecurile obținute fiind electrofilate la temperatura camerei obținuacircndu-se astfel suporturi
magnetice nanofibroase Microstructura și nanostructura suporturilor a fost analizată cu ajutorul
SEM și a microscopiei electronice de transmisie TEM Structura chimică a fost studiată prin
intermediul FTIR iar cristalinitatea prin intermediul XRD S-au studiat de asemenea
proprietățile hidrofile al suporturile proprietățile magnetice și foarte important
biocompatibilitatea acestora și interacțiunea cu celulele [106]
Gloria și colaboratorii [107] prezintă realizarea și caracterizarea de suporturi magnetice pe
bază de PCL cu aplicații icircn ingineria tisulară a țesutului osos După solubilizarea PCL (masa
molară 65 kDa) icircn tetrahidrofuran s-au adăugat separat 3 concentrații diferite de nanoparticule
magnetice (hidroxiapatită dopată cu ioni de fier ndash FeHA) cu diametrul de 20 nm respectacircndu-se
următoarele rapoarte masice PCLFeHA 9010 8020 și 7030 Pentru o distribuție uniformă a
nanoparticulelor magnetice icircn soluția polimerică cele trei amestecuri polimer-nanoparticule au
fost ultrasonicate Următoarea etapă pentru obținerea suporturilor a fost turnarea amestecului icircn
matrițe speciale obținacircndu-se icircn final suporturi cu diametrul de 64 mm și o grosime de 05 mm
Icircn urma analizei datelor XRD autorii au observat că procesul de formare al suporturilor nu
afecteză structura și cristalinitatea acestora Analiza biologică a substraturilor a evidențiat
abilitatea acestora de a susține diferențierea osteogenică
49
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
De remarcat este studiul publicat de Santis și colaboratorii icircn care prezintă realizarea și
caracterizarea unui suport hibrid pe bază de PCL și polietilen glicol (PEG) și nanoparticule
magnetice cu potențiale aplicații icircn regenerarea țesutului osteocartilaginos Suportul hibrid
multistrat a fost obținut prin combinarea a două tehnici de formare a suporturilor imprimare 3D
și stereolitografie [108]
Poli (3- hidroxibutiratul) ndash P(3HB)
Akaraonye și colaboratorii [109] prezintă realizarea și caracterizarea de nanocompozite
magnetice pe bază de P(3HB) cu potențiale aplicații icircn ingineria țesutului osos Două tipuri de
nanocompozite magnetice au fost realizate nanocompozite pe bază de P(3HB) și nanoparticule
magnetice ndash P(3HB)MNP și nanocompozite pe bază de P(3HB) și ferofluid - P(3HB)FF S-a
observat o icircmbunătățire a cristalinității suporturilor compozite ca urmare a icircncorporării
nanoparticulelor magnetice și a ferofluidului icircn suportul polimeric un grad de cristalintate ridicat
al suporturilor fiind benefic regenerării ososoase Propritățile termomecanice favorabile precum
și biocompatibilitatea suporturilor realizate icircn lucrare indică o potențială utilizare a acestora icircn
aplicații ce vizează repararea și regenerarea țesutului osos
133 Suporturi magnetice pe bază de biomateriale ceramice
1331 Sticle ceramice bioactive
Datorită biocompatibilității lor ridicate sticlele bioactive pe bază de siliciu sunt utilizate
pentru refacerea unor defecte mici și chiar medii fiind adesea utilizate cu rolul de grefe icircn
intervenții chirurgicale parodontale și maxilofaciale De asemenea se utilizează pentru refacerea
unor defecte osoase ale urechii medii sau ale coloanei vertebrale Superioare sticlelor bioactive
non-mezoporoase icircn ceea ce privește volumul nanoporos bioactivitatea și degradarea sticlele
bioactive mezoporoase (MBG) au fost fabricate pentru prima dată icircn 2004 de Yan și
colaboratorii avacircnd formula chimică SiO2-CaO-P2O5 [110] Loacutepez-Noriega și colaboratorii au
demonstrat icircntr-un studiu capacitatea sticlelor MBG de a lega și elibera medicamente anti-
osteoporotice [111]
Wu și colaboratorii [112] publică un studiu ce are drept obiectiv principal realizarea unor
suporturi multifuncționale pe bază de MBG și fier (Fe) cu potențiale aplicații icircn terapia
hipertermică (hipertermie) și eliberarea controlată de medicamente pentru tratamentul unor
50
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
afecțiuni osoase maligne Suporturile poroase Fe-MBG (avacircnd icircncorporat 5 sau 10 Fe) au
fost pregătite utilizacircnd co-șabloanele copolimerului tribloc Pluronic P123 (utilizat pentru a
conferi o structură mezoporoasă avacircnd o dimensiune de cacircțiva nanometri) și bureți de
poliuretan(utilizați pentru a creea pori mari avacircnd dimensiuni de cacircteva sute de micrometri)
Prima etapă pentru obținerea celor două suporturi magentice 10 Fe-MBG (10Fe-MBG) și 5
Fe-MBG (5Fe-MBG) a fost solubilizarea icircn etanol de cantități diferite de P123
tetraetilortosilicat (TEOS) Ca(NO3)2∙4H2O FeCl3 trietilfosfat (TEP) și HCl sub agitare
magnetică pentru 24 ore Bureți de poliuretan au fost imersați pentru 10 min icircn soluția obținută icircn
prima etapă iar după icircndepărtarea soluției icircn exces au fost lasați la uscat la temperatura camerei
pentru 24 ore Această etapă a fost repetată de 5 ori după care bureții au fost calcinați la 700degC
pentru 5 ore Pe lacircngă cele două suporturi a fost realizat și un suport 0Fe-MBG care după cum
indică și numele nu conține fier Suporturilor obținute au fost caracterizate utilizacircnd diferite
tehnici SEM și EDS (figura 125) precum și XRD și TEM
Figura 125 a) c) e) Rezultatele SEM b) d) f) Rezultatele EDS [112]
De asemenea s-au realizat diverse teste pentru analiza proprietăților magnetice a
proprietăților mecanice a eliberării controlate de medicament din suport și a contactului cu
51
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
celule stem din măduvă osoasă umană Rezultatele obținute icircn urma studiilor menționate indică
faptul că suporturile sunt magentice degradabile bioactive și au capacitatea de eliberare
controlată de medicamente
1332 Fosafați de calciu
Panseri și colaboratorii [113] prezintă icircntr-un studiu realizarea și caracterizare in vitro a
unor suporturi compozite ceramice poroase Trei tipuri diferite de suporturi au fost fabricate din
hidroxiapatită (HA) ce icircncorporează magnetită (Mgn) avacircnd următoarele rapoarte HAMgn
955 HAMgn 9010 și HAMgn 5050 De asemenea s-a realizat un suport avacircnd raportul
HAMgn 1000 ce a fost utilizat drept control Diverse teste in vitro de biocompatibilitate au fost
realizate utilizacircnd linii celulare de osteoblaste umane Saos-2 teste de proliferare celulară teste
privind activitatea fosfatazei alcaline a celulelor teste de viabilitate celulară livedead etc
Rezultatele acestor teste au indicat o foarte bună biocompatibilitate a suporturilor ceea ce indică
faptul că adăugarea de magnetită icircn structura suporturilor nu a condus la efecte negative asupra
celulelor De asemenea suporturile au fost implantate in vivo la iepuri obținacircndu-se rezultate
bune
14 Concluzii
Defectele osoase grave rezultate icircn urma unor rezecții tumorale sau fracturi grave necesită
intervenții chirurgicale majore pentru corecția acestora chiar dacă osul are un potențial de
regenerare semnificativ Grefele osoase sunt utilizate icircn practica clinică pentru a corecta
aceste defecte osoase și pentru a susține procesul de regenerare
Datorită neajunsurilor autogrefelor şi alogrefelor substituienţi osoşi sintetici au fost
realizaţi ca o alternativă a celor două grefe naturale şi sunt suporturi realizate din
biomateriale sintetice sau naturale ce permit migrarea proliferarea şi diferenţierea
celulelor osoase icircn timpul procesului de regenerarea osoasă
Biomaterialele au un rol critic icircn ingineria tisulară funcţionacircnd ca matrici extracelulare
artificiale sau suporturi tridimensionale pentru celule utilizate pentru repararea sau
regenerarea ţesuturilor afectate Există mai multe forme de prezentare a matricilor
artificiale și a suporturilor Acestea sunt prelucrate fie sub formă de suporturi macroporase
52
Capitol 1 Stadiul actual al cercetărilor icircn domeniul preparării suporturilor biomimetice pe bază de
biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea
osoasă
sisteme injectabile capsule filme și matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte
tuburi geluri etc
Suporturilor preparate plecacircnd de la compoziția țesutului osos dar cel mai important
imitacircnd nanostructura sa sunt suporturi biomimetice deoarce prin biomimetică se icircnţeleg
procesele substanţele dispozitivele sistemele facute de om care imită natura Compozitele
polimeri ndash ceramice sunt cele mai de success avacircnd numeroase avantaje care pleacă de la
faptul că aceste compozite sunt biomimetice avacircnd icircn vedere componentele matricei
extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă anorganică ndash hidroxiapatită 20-30
componentă organică ndash biopolimeri și apă)
Icircn ceea ce privește utilizarea nanoparticulelor magnetice icircn ingineria tisulară și medicina
regenerativă icircn general și icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă icircn particular
cercetările științifice au icircnceput cu aproape un deceniu icircn urmă rolul nanoparticulelor fiind
cel de eliberarea de principii active controlată și țintită Nanoparticulele sunt integrate prin
diverse metode icircn suporturile pe bază de biomateriale pentru ingineria tisulară și
regenerarea osoasă numărul studiilor icircn domeniu fiind icircn continuă creștere deorece studii
mai vechi au avut rezultate complexe promițătoare pentru aplicația vizată
53
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Obținerea și caracterizarea de suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi
de calciu cu incluziune de particule magnetice pentru regenerarea osoasă
Capitolul 2 Materiale şi metode experimentale
21 Strategie experimentală Obiective
Regenerarea osoasă și inginerie tisulară a țesutului osos sunt două domenii intens studiate
datorită creșterii numărului de afecțiuni osoase infecții osoase pierderi de cauză traumatică ale
masei de țesut osos tumori osoase Autogrefele au fost o perioadă mare de timp cele mai
utilizate materiale pentru regenerarea și substituția osoasă icircnsă au multiple dezavantaje
ingineria tisulară atragacircnd tot mai mult atenția icircn special unele suporturi complexe pentru
ingineria tisulară a țesutului osos Icircn capitolul 1 au fost prezentate limitările metodelor actuale de
tratament şi necesitatea reală de găsire a unei metode alternative efective care să aibă drept scop
regenerarea osoasă
Ingineria tisulară domeniu interdisciplinar de mare actualitate oferă soluţii promiţătoare
pentru realizarea de materiale pentru regenerarea tisulară Plecacircnd de la structura țesuturilor
biologice componentele ingineriei tisulare sunt următoarele o matrice sau un suport celule și
molecule semnal suportul fiind componenta cheie
Tumorile osoase maligne afecțiuni cu caracter degenerativ reprezintă unul din principali
factori ce conduc la defecte osoase critice Tratamentul unor astfel de afecţiuni osoase constă icircn
două etape prima etapă este rezecţia ţesutului afectat iar cea de a doua este implantarea unui
material de substituţie și regenerare osoasă Un potențial material de substituție și regenerare
osoasă ar putea fi un suport magnetic biomimetic
Icircn urma analizei rezultatelor stiinţifice din domeniul ingineriei tisulare și regenerării osoase
s-a ales pentru lucrarea de faţă o strategie de cercetare care a avut ca obiectiv central
Avacircnd icircn vedere componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70
componentă anorganică 20-30 componentă organică și apă) au fost selectate biomaterialele
utilizate icircn studiile de față după cum urmează pentru componenta organică au fost selectați
biopolimeri adesea utilizaţi icircn studii ce vizează regenerarea țesutului osos şi fosfați de calciu
54
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
pentru componenta anorganică Noutatea tezei este dată de adăugarea de particule magnetice
(magnetită funcţionalizată cu chitosan) icircn amestecul supus procedeului de co-precipitare ce vor
fi funcționalizate cu diverși bioagenți (medicamente) și vor avea rolul de transportori ai acestora
Un suport magnetic biomimetic cu design adecvat este dispozitivul ideal pentru a ghida
formarea de neo-ţesut atacirct in vitro cacirct şi in vivo Suporturile pentru ingineria tisulară a osului
trebuie să fie biocompatibile să mimeze structura şi funcţia biologică a matricei extracelulare şi
să ofere suport mecanic pentru ţesutul icircn formare şi de asemenea să elibereze icircn locul unde are
loc repararea ţesutului diverse molecule celule factori de creştere Totodată suportul trebuie să
fie osteoconductiv şi osteoinductiv şi să aibă o rată de degradarea controlată
O mare parte din suporturile propuse de unele studii icircn domeniu nu mimează şi arhitectura
matricii extracelulare naturale acesta fiind motivul pentru care rezulatele unor astfel de studii nu
sunt satisfăcătoare Suportul trebuie să fie biomimetic adică să mimeze nu doar compoziția
osului ci cel mai important nano-structura sa Astfel pentru tema de cercetare abordată s-a ales
un procedeu biomimetic de co-precipitare in situ a fosfaţilor de calciu icircn soluţii de biopolimeri
inspirat din procesul natural de mineralizare unde mineralele sintetizate de către organism sunt
combinate cu componentele organice ale matrici extracelulare a ţesutului osos
Pentru partea organică a suporturilor s-au utilizat diverși polimeri naturali chitosan acid
hialuronic gelatină albumină şi colagen
Pentru partea anorganică a suporturilor s-au utilizat fosfaţi de calciu sintetici deoarece
prezintă o strucutură similară cu cea a mineralului primar din componenţa ţesutului osos avacircnd
rolul de stimuli osteoconductivi şi osteoinductivi Aceştia s-au obţinut prin precipitarea din
precursori azotat de calciu ndash Ca(NO3)2 CaCl2 şi fosfat monosodic ndash NaH2PO4
Utilizarea particulelor magnetice este un concept intens studiat icircn domeniul inginerie
tisulare Acesta implică utilizarea de nanoparticule magnetice care sunt funcționalizate cu factori
de creștere medicamente sau alți agenți bioactivi care vor fi preluate de către suportul magnetic
ca urmare a acțiunii unui camp magnetic icircn apropierea zonei unde este implantat suportul
Nanoparticulele magnetice funcţionalizate acţionează ca transportatori de agenţi bioactivi către şi
icircn interiorul suportului magnetic După ce patrund icircn suportul magnetic aceste particule
magnetice eliberează succesiv moleculele pe care le transportă Suporturile obţinute au fost
riguros analizate din punct de vedere fizico-chimic şi biologic
55
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
22 Materiale utilizate
221 Materiale utilizate pentru prepararea suporturilor
Analizacircnd icircn amănunt proprietăţile biopolimerilor utilizaţi icircn studii ce vizează obţinerea de
suporturi pentru regenerarea osoasă prezentate icircn capitolul 1 cinci biopolimeri au fost utilizaţi
pentru prepararea loturilor de suporturi două polizaharide şi trei proteine
Fosfaţi de calciu se vor obţine din precursori lor
Polizaharide
Chitosan ndash Cs CAS 9012-76-4 cu masă molară medie M = 309900 Da grad de
deacetilare 792 achiziţionat de la Vascon Co Canada
Hialuronat de sodiu din Streptococcus equindash Hya CAS 9067-32-7 M = 15-18 x
10E6
Da solubilitate = 5 mgml (H2O)Sigma Aldrich Germania
Proteine
Colagen ndash Col tip I+III acido-solubil extras din derm bovin 096 ρ= 097 gcm3
obţinut de la firma Lohmann amp Rauscher Newied Germania
Gelatină ndash G CAS 9000-70-8 pH 38 ndash 76 solubilitate = 10 gL (H₂O 25degC) Merck
Germania
Albumină serică bovină ndash Bsa CAS 9048-46-8 pulbere liofilizată ge 98
(electroforeză icircn gel de agaroză) Sigma-Aldrich Germania
Precursori de fosfaţi de calciu (CP)
Azotatul de calciu ndash Ca(NO3)2∙4H2O CAS 13477-34-4 M = 23615 gmol Sigma-
Aldrich Germania
Clorură de calciu ndash CaCl2middot2H2O CAS 10035-04-8 M = 14701 gmol solubilitatea =
1280 gL ρ = 185 gcm3 (20degC) Merck Germania
Fosfatul monosodic ndash NaH2PO4∙ 2H2O CAS 13472-35-0 pH=41-45 (25degC 5 icircn
soluţie) M = 13799 gmol Sigma-Aldrich Germania
Amoniac soluţie ndash NH4OH CAS 1336-21-6 soluţie 25 Sigma-Aldrich Germania
56
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Particule magnetice (MNPs)
Magnetită ndash Mag sintetizată printr-un procedeu de co-precipitare [114]
Chitosan ndash Cs low CAS 9012-76-4 chitosan cu masă moleculară mică M = 50000-
190000 Da (icircn funcţie de vacircscozitate) vacircscozitate 20-300 cP pentru o soluţie 1 icircn acetic acid
(1 25degC) Sigma-Aldrich Germania
Pluronicreg F-127 CAS 9003-11-6 pH= 6-7 Sigma-Aldrich Germania
Tripolifosfat de sodiu ndash TPP CAS 7758-29-4 Na5P3O10 85 M = 36786 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Doxorubicin hydrochloride ndash DOX CAS 25316-40-9 C27H29NO11 ∙HCl M = 57998
gmol utilizată la pentru studiul de eliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi Sigma-
Aldrich Germania
222 Materiale utilizate pentru caracterizarea suporturilor
Soluţie tampon fosfat pH=72 001 M
Pentru prepararea soluţie tampon fosfat (PBS) pH=72 001 M s-au utilizat
Fosfat monosodic ndashNaH2PO4middot2H2O CAS 13472-35-0 M = 15601 gmol Sigma
Aldrich Germania
Fosfat disodic ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 gmol Sigma Aldrich
Germania
S-au preparat soluţii de fosfat monosodic şi fosfat disodic ambele de concentraţie 001 M
după care cele două soluţii s-au amestecat conform tabel 21
Tabel 21 Proporţiilor de amestecare pentru obţinerea soluţiei PBS pH=72 001M
Fosfat monosodic (ml) Fosfat disodic (ml) pH
28 72 72
Soluţie tampon fosfat (PBS) cu pH 72 şi concentraţie 001 M s-a utilizat pentru
determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic şi la studiile in vitro de
degradare enzimatică
57
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Soluție fluid biologic simulat
Soluția de fluid biologic simulat (SBF) a fost preparată prin dizolvarea icircn apă deionizată a
reactivilor NaCl NaHCO3 KCl Na2HPO4∙2H2O MgCl2∙6H2O CaCl2∙2H2O and Na2SO4 [115]
Reactivii achiziționați de la Merck Germania și Sigma-Aldrich Germania s-au adăugat
unul cacircte unul după ce fiecare reactiv s-a dizolvat complet icircn 700 ml apă deionizată strict icircn
ordinea precizată icircn tabelul 22
Tabel 22 Compoziția chimica a fluidului biologic simulat (SBF)
Ordinea
componentului Reactivi
Cantitate
(gL)
1 NaCl CAS 7647-14-5
M = 5844 gmol 6547
2 NaHCO3 CAS 144-55-8
M = 8401 gmol 2268
3 KCl CAS 7447-40-7
M = 7455 gmol 0373
4 Na2HPO4∙2H2O CAS 10028-24-7
M = 17799 gmol 0178
5 MgCl2∙6H2O CAS 7791-18-6
M = 20330 gmol 0305
6 CaCl2∙2H2O CAS 10035-04-8
M = 14701 gmol 0368
7 Na2SO4 CAS 7757-82-6
M = 14204 gmol 0071
8 (CH2OH)3CNH2 CAS 77-86-1
M = 12114 gmol 6057
Soluția obținută după amestecarea reactivilor s-a ajustat la pH = 74 utilizacircnd o soluție 1M
HCl Din volumul total de acid o parte (aproximativ 20 ml) s-a introdus icircnainte de adaosul celui
de-al șaselea component (CaCl2∙2H2O) pentru a evita apariția fenomenului de precipitare După
adaosul celui de-al 8-lea component [tris (hidroximetil) amino metan] s-a ridicat temperatura
soluției la 37ordmC
58
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Această soluție s-a titrat ulterior cu 1M HCl pacircnă la pH=74 la 37ordmC Icircn timpul procesului
de titrare soluția a fost diluată continuu prin adaos consecutiv de apă deionizată pentru a rezulta
volumul final de 1 L
Concentrația ionilor icircn SBF-ul realizat sunt apropiate de cele care se găsesc icircn plasma
umană așa cum se poate observa icircn tabelul 23
Tabel 23 Concentrațiile ionilor icircn SBF și icircn plasma umană
Concentrație (mM)
Na+
K+
Ca2+
Mg2+
HPO42-
Cl-
HCO32-
SO42-
Plasma umană 1420 50 25 15 10 1030 270 05
SBF 1422 502 247 151 102 1250 272 052
Soluţie tampon fosfat-citrat pH=5
Pentru prepararea soluţiei tampon fosfatndashcitrat pH=5 (după metoda Perse 1980) s-au
utilizat
Fosfat disodic anhidru ndash Na2HPO4 CAS 7558-79-4 M = 14196 Sigma-Aldrich
Germania
Acid citric ndash C6H8O7 CAS 77-92-9 M = 19212 gmol Honeywell Riedel-de Haeumln
Germania
S-au preparat o soluţie de Na2HPO4 de concentraţie 02M și o soluție C6H8O7 de
concentraţie 01M după care s-au amestecat volumele specificate icircn tabel 24
Tabel 24 Proporţiile de amestecare pentru obţinerea a 100 ml tampon fosfat-citrat pH=5
Fosfat disodic (ml) Acid citric (ml) Apă distilată (ml) pH
257 243 50 5
59
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Studii in vitro de degradare enzimatică
Tabel 25 Reactivi utilizați pentru studiile in vitro de degradare enzimatică
Determinarea concentrației de
chitosan degradat
Determinarea concentrației de
colagen degradat
Enzime
utilizate
Lizozim ndash 100000 unităţimg
CAS 12650-88-3
M = 143 kDa (a unui singur lanţ)
Sigma-Aldrich Germania
Colagenază clostridium histolyticum
CAS 9001-12-1
M = 68 ndash 125 kDa
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
determinarea
produșilor de
degradare
Fericianură de potasiundash
K3Fe(CN)6
CAS13746-66-2 ge990
M = 32924 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Ninhidrină ndash C9H6O4
CAS 485-47-2
M = 17814 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Clorură de staniu ndashSnCl2
CAS 7772-99-8
M = 1896 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Reactivi
pentru
realizarea
curbei etalon
N-acetil-D-glucozamină ndash
C8H15NO6
CAS 7512-17-6
M = 22121 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Glicină ndash C2H5NO2
CAS 56-406-6
M = 7507 gmol
Fluka Elveţia
Solvenți
Carbonat de sodiu ndash Na2CO3
CAS497-19-8
M = 10599 gmol
Chemical Company Iaşi
2-metoxietanol ndash CH3OCH2CH2OH
CAS 109-86-4
M = 7609 gmol
Sigma-Aldrich Germania
Teste de citotoxicitate in vitro
Cu excepția solvenților care au fost achiziționați de la Chemical Company Iaşi toate
celelalte materiale prezentate icircn tabelul 26 au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich
Germania
60
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Tabel 26 Reactivi utilizați pentru studiile de citotoxicitate in vitro
Medii de cultură și soluții
de completare
Reactivi pentru
determinare
citotoxicității in vitro
Soluţie salină
Hanksrsquo Balanced
(HBSS)
Solvenți
Mediu de cultură DMEM
(Dulbeccorsquos Modified
Eaglersquos Medium) cu
4500 mgl glucoză
L-glutamat şi bicaronat
de sodiu
Tripsină din pancreas
de porc
CAS 9002-07-7
M = 238 kDa HBSS cu roşu fenol
fără clorură de calciu
şi sulfat de magneziu
Alcool isopropilic
(CH3)2CHOH
CAS 67-63-0
M = 6001 gmol
Mediu de cultură DMEM
F-12 HAM
(amestec de nutrienţi)
cu L-glutamat piruvat de
sodiu 055 gl
glucoză 315 gl
Acid etilen-diamino-
tetraacetic ndash EDTA
CAS 60-00-4
M = 29224 gmol
PSN ndash amestec de
penicilină streptomicină
neomicină
5000 unităţi penicilină 5
mg streptomicină 10
mgml neomicină
MTT ndash C18H16BrN5S
[bromură de (3-[45-
dimetiltiazol-2-il]-25-
difenil) tetrazoliu
CAS 298-93-1
M = 41432 gmol
HBSS cu clorură de
calciu şi sulfat de
magneziu
fără roşu fenol
Alcool etilic
absolut C2H5OH
CAS 64-17-5
M = 4607 gmol
Ser fetal bovin ndash BFS
Calceină AM
CAS 148504-34-1
Teste de citotoxixictate in vivo
Șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28plusmn3
grame materialul biologic provenit din Biobaza INCDMI Cantacuzino București - filiala
Băneasa Reactivi utilizați au fost aleși conform standardului ISO 10993
Betadină ndash soluție cutanată 10
Isofluran 4 ndash soluție pentru inducția anesteziă
Aldehidă formică 10 parafină colorant Tricromic Masson ndash pentru examenul
histopatologic
61
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
23 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu
incluziune de particule magnetice
231 Obţinerea particulelor magnetice
Particulele magnetice au fost obţinute conform protocolului descris de Bălan şi
colaboratorii [116] proprietățile lor fiind prezentate icircn tabelul 27
Tabel 27 Proprietățile particulelor magnetice
Dimensiunea medie
(nm)
Indicile de
polidispersitate
Potențialul Zeta
icircn soluție apoasă de
surfactant (mV)
Magnetizarea
(emug)
178 027 -186 4365
Pe scurt un volum de soluţie de chitosan de masă moleculară mică ndash Cs low a fost
amestecat cu un volum de magnetită ndash Mag şi pluronic F-127
După omogenizare amestecului se va adăuga o soluţie TPP icircn picătură Amestecul final se
va dializă contra apei distilate pentru mai multe zile
232 Obținerea suporturilor pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu cu
incluziune de particule magnetice
Suporturilor magnetice au fost obţinute utilizacircnd o metodă biomimetică de co-precipitare a
fosfaţilor de calciu din precursorii săi icircn soluţii de biopolimeri inspirată din procesul natural de
mineralizare etapele procesului de obţinere fiind prezentate icircn figura 21
Soluţiile apoase de precursori de fosfaţi de calciu au fost adăugate icircn amestecul de soluţii
de polimeri Icircnainte de adăugarea precursorilor de fosfaţi de calciu icircn amestecul de soluţii de
polimeri s-au adăugat particule magnetice fie sub formă uscată fie sub formă de suspensie
coloidală
Co-precipitarea s-a realizat icircn prezenţa unei soluţii de amoniac NH4OH (25 ) pacircnă la
obținerea unei valori a pH-ului de 72-74 Fiecare amestec a fost spălat de 3 ori cu apă distilată
prin centrifugare (5000 rpm timp de 10 minute) iar icircn final amestecurile au fost liofilizate 24h la
-55degC
62
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Figura 21 Obţinerea suporturilor pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
233 Program experimental
Specialiștii din foarte multe domenii de activitate se confruntă deseori cu provocarea de a
face compromisuri icircntre diferiți factori pentru a obține rezultatele dorite optimizare fiind
procesul de a alege aceste compromisuri icircn cel mai eficient mod posibil Noțiunea de diferiți
factori face referire la existența unor diferite soluții posibile iar noțiunea de realizare a
rezultatelor dorite se referă la obiectivul de a căuta icircmbunătățirea modului de identificare a
soluției optime Prin urmare icircntr-o problemă de optimizare diferitele soluții posibile sunt
comparate calitatea soluției fiind fundamentală deoarece aceste soluții sunt de multe ori icircn
contrast [117]
Programe experimentale factoriale sunt foarte eficiente pentru studierea a doi sau mai mulți
factori Efectul unui factor poate fi definit ca schimbarea răspunsului produs de o modificare a
nivelului factorului acesta fiind considerat efectul principal Icircn unele experimente se poate
63
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
constata că diferența de răspuns dintre nivelurile unui factor nu este aceeași la toate nivelurile
celorlalți factori numit efect de interacțiune icircntre factori Icircn mod colectiv efectele principale și
efectele de interacțiune sunt numite efectele factoriale Un design factorial complet poate estima
toate efectele principale și interacțiunile de ordin superior
Programe experimentale factoriale sunt folosite icircn ingineria tisulară și icircn domeniul
biomaterialelor [118] icircn domeniul farmaceutic [119] etc
Icircn teza de față s-a utilizat un program experimental multifactorial icircn vederea optimizării
compoziției suporturilor Programul menționat este caracterizat prin faptul că fenomenul
procesul este urmărit prin intermediul unui număr finit de variabile variabile ce pot avea fiecare
un număr discret de valori icircntr-un domeniu de variaţie prestabilit Compoziția suporturilor a fost
optimizată din punct de vedere al raportului biopolimerbiopolimer un program experimental
factorial central compus rotabil de ordinul 2 fiind utilizat [120] Ecuația următoare stabilește
numărul total de experiențe posibile
NE = 2k + 2k + n0 icircn cazul icircn care k lt 5 (1)
sau
NE = 2k-1
+ 2k + n0 icircn cazul icircn care k gt 5 (2)
unde k este numărul de variabile iar n0 numărul de experiențe dispuse icircn centrul domeniului
experimental valoare sa fiind cuprinsă icircn intervalul 3 ndash 7
Structura programului experimental reprezentată de dispunerea punctelor generate de
valorile diferite acordate factorilor are drept ipoteză posibilă ajustarea suprafeţei de răspuns ce
corespunde unui indicator icircn raport cu variabilele independente prin intermediul unor expresii
matematice de tip polinomial de ordinul 2 de forma
Y = a0 + ndash
+
ndash (3)
unde a0 este coeficientul de regresie iar xi si xj sunt variabilele independente care influenţează
variabila răspuns F Valorile discrete ce se atribuie variabilelor sunt alese astfel icircncat printr-o
codificare simetrică faţă de centrul planului experimental să fie posibilă ortogonalizarea matricii
experimentale corespunzătoare si inducerea unei erori minime cu ocazia calculelor aferente
coeficienţilor prin metoda celor mai mici pătrate [121]
64
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Icircn lucrarea de față s-a optat pentru o codificare a valorilor discrete aferente variabilelor
independente conform datelor din tabelul 28
Tabelul 28 Codificarea variabilelor independente icircn cazul exprimării multifactoriale libere
Valoare codificată -1414 -1 0 -1 14141
Valoare reală
Valorile discrete se estimează din valorile ce definesc intervalul de variaţie al variabilei
independente xi conform următoarelor relaţiilor de atribuire
= rarr ndash2 (4)
= rarr +2 (5)
= ( + ) 2 rarr 0 (6)
= ( + ) rarr ndash1 (7)
= ( + ) rarr 1 (8)
Icircn contextul obiectivelor de cercetare s-a folosit un program factorial cu două variabile
(X1 X2) a cărei matrice experimentală este prezentată in Tabelul 29 [122]
Tabel 29 Matrice experimentală a programului factorial cu 2 variabile
Nr Crt X1cod X2 cod
1 ndash1 ndash1
2 1 ndash1
3 ndash1 1
4 1 1
5 ndash1414 0
6 1414 0
7 0 ndash1414
8 0 1414
9 0 0
10 0 0
11 0 0
12 0 0
13 0 0
65
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
24 Metode de caracterizare
241 Caracterizarea structurală a suporturilor
2411 Analiza prin Spectroscopia icircn infraroşu cu transformată Fourier (FTIR)
Spectroscopia FTIR se utilizează icircn vederea determinării grupărilor funcţionale ale probei
analizate Metoda se bazează pe vibraţia legăturilor chimice rezultată icircn urma absorbţiei energiei
luminoase infraroşii la frecvenţe caracteristice FTIR este o metodă uzuală icircn stabilirea structurii
şi identificarea unui compus chimic [123]
Pentru caracterizarea probelor solide există trei metode de pregătire a probelor pastilarea
icircn prezenţa unei sări suspensia icircn nujol utilizarea unui solvent Metoda de pregătire a probelor
este aleasă icircn funcţie de natura probei de analizat de exemplu icircn cazul probelor dificil de mojarat
se va utiliza un solvent pentru pregătirea probelor Acest solvent trebuie să aibă cacirct mai puţine
benzi şi intensitatea mică (exemplu sulfura de carbon şi tetraclorura de carbon)
Icircn ceea ce priveşte suspensia icircn nujol (ulei de parafină) cacircteva miligrame de probă se
amestecă cu 1-3 picături de ulei de parafină pacircnă la obţinerea unei suspensii omogene Icircn cazul
pastilării cel mai adesea se utilizează bromura de potasiu (KBr) Aproximativ 2-3 mg probă se
mojarează şi se amestecă cu 200 mg bromură de potasiu mojararea probei fiind un aspect
important de care trebuie să se ţină cont Pulberea obţinută se va introduce icircntr-o matriţă şi se va
comprima cu ajutorul unei prese hidraulice obţinacircndu-se un disc a cărui grosime este un alt
aspect important de care trebuie să se ţine cont o grosime de aproximativ 1 mm fiind
recomandată pentru rezultate cacirct mai bune [124]
Suporturile obţinute au fost pregătite pentru analiza FTIR prin metoda pastilării cu KBr
2412 Spectroscopia de raze x prin dispersie de energie (EDS)
Icircn general dispozitivele pentru microscopia electronică de baleiaj (SEM) sunt echipate cu
un spectroscop de raze X cu dispersie de energie (EDS) șisau un Spectroscop cu raze X cu
dispersie pe lungime de undă (WDS) utile pentru analiza elementală sau caracterizarea chimică
Atacirct EDS cacirct și WDS se bazează pe detectarea și investigarea razelor X caracteristice produse de
electronii primari Icircn timpul iradierii un electron din stratul intern al atomul țintă poate fi scos
66
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
din icircnvelișul electronic rezultacircnd o gaură de electroni Ulterior un electron din straturile
exterioare va umple gaura iar diferența de energie dintre electronii din icircnvelișul intern și cei din
icircnvelișul extern va fi emisă sub formă de rază X Deoarece energia acestei razei X este
caracteristică structurii atomice a elementului din care este emisă prin măsurarea cantității și a
energiei razele X emise dintr-un eșantion se poate determina compoziția elementală a probei
EDS este o metodă utilizată cel mai adesea pentru analiza de suprafața a unui material [125]
Pentru analiza probelor s-a utilizat un microscop electronic cu scanare SEM model VEGA
II LSH produs de firma TESCAN Cehia cuplat cu un detector EDX tip QUANTAX QX2
produs de firma BRUKERROENTEC Germania
2413 Difracţie cu raze X (XRD)
Spectrul XRD a fost icircnregistrat utilizacircnd aparatul XRD-6000 SHIMADZU (figura 22)
Difracţia cu raze X este o metodă simplă şi uşor de realizat pentru analiza fazei cristaline a
probelor oferind totodată şi date despre dimensiune şi orientarea cristalelor acesteia
Figura 22 Difractometru de raze X [126]
Principiul de bază al acestei metode implică cuantificarea precisă a lărgimii picurilor de
difracţie Plecacircnd de la acest principiu s-au dezvoltat mai multe tehnici pentru estimarea fazei
67
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
anorganice formate şi a dimensiunii cristalelor cele mai icircntacirclnite icircn literatură fiind ecuaţia lui
Scherrer analiza lui Hall-Williamson şi metoda Fourier a lui Warren-Averbach [127]
Pentru identificarea fazelor anorganice din suporturile obţinute au fost utilizate standardele
Centrului Internaţional pentru Difracţie (JCPDS)
242 Caracterizarea morfologică a suporturilor
2421 Microscopie electronică de baleiaj (SEM)
Microscopia electronică de baleiaj se utilizează pentru a studia icircn detaliu suprafaţa
probelor Datele SEM sunt foarte importante deoarece oferă informaţii despre morfologia
probelor ce are o influenţă remarcabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale acestora (gradul de
retenţie a fluidelor biologic simulate proprietăţile mecanice adeziunea şi proliferarea celulară
etc) Icircn vederea studiului morfologiei suporturilor obţinute s-a utilizat microscopul TESCAN
VEGA SBH II prezentat icircn figura 23 Tensiunea de lucru a fost de 30 kV
Figura 23 Microscopul TESCAN VEGA SBH II [128]
Analiza constă icircn scanarea suprafaţei probelor de către un fascicul de electroni de energie
icircnaltă fascicul ce porneşte dintr-un filament de tungsten aflat icircn structura microscopului Icircnainte
68
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
de a fi analizate probele trebuie să se acoperite cu un film subţire de aur sau platină pentru un
contrast icircmbunăţit Pe măsură ce fasciculul de electroni trece de-a lungul probei interacţiunea
dintre probă şi fascicul are drept rezultat diferite tipuri de semnale de electroni emise la suprafaţa
probei sau icircn apropierea acesteia Semnalele sunt culese procesate şi redate pe un monitor ca şi
pixeli ceea ce duce la formarea unei imagini a suprafeţei probei imagine ce apare
tridimensională [129]
2422 Micro computer-tomografia (microCT)
Micro-computer tomografia (microCT) este o analiză de icircnaltă precizie a morfologiei
suporturilor oferind date precise şi informații despre dimensiunea şi distribuţia porilor icircntr-un
suport Tehnica este asemănătoare cu cea utilizată icircn sistemele de tomografie cu raze X folosite
icircn medicină doar că are o rezoluţie mult mai bună Această tehnică studiază interiorul suportului
icircn mare detaliu fără a fi utilizate substanţe toxice sau fără a fi necesară o pregătire specială a
probei Astfel după scanare proba intactă poate fi analizată prin alte tehnici
Icircn timpul scanării micro CT proba este icircmpărțită icircntr-o serie de secţiuni transversale 2D
care sunt iradiate din margine cu raze X La trecerea prin secţiune razele X sunt atenuate iar
razele X emergente avacircnd intensități reduse sunt capturate de un detector din componenţa micro-
computer tomografului Traictoriile razelor X sunt calculate și coeficienții de atenuare sunt
derivați O hartă bidimensională cu pixeli este creată utilizacircnd datele obţinute și fiecare pixel este
notat cu o valoare de prag care corespunde atenuării coeficientul măsurat la un punct similar icircn
interiorul specimen Deoarece coeficientul de atenuare este corelat cu densitatea materialului
hărțile 2D rezultate oferă o imagine a fazelor materialului analizat Calitatea imaginilor obţinute
este dependentă de rezoluţia de scanare care este cuprinsă icircntre 1 şi 50 microm precum şi de
software-ul utilizat [130]
243 Proprietățile mecanice ale suporturilor
Testul de compresiune a fost realizat cu ajutorul dispozitivului Texture Analyzer
TAXTplus Dispozitivul poate fi utilizat pentru teste fundamentale sau empirice cum ar fi cele
legate de analiza texturii ştiinţa materialelor şi reologia solidelor semi-solidelor lichidelor
vacircscoase pudrelor sau materialelor granulate Numeroase proprietăţi pot fi analizate cu ajutorul
69
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
acestui dispozitiv dintre care enumerăm duritate fragilitatea aderența rezistența la tracțiune
extensibilitate Icircn funcţie de proprietate testată şi tipul probei dispozitivul are o serie de
platforme şi accesorii Pentru testul de compresiune la dispozitiv se va ataşa platforma pentru
greutate mare (figura 24)
Figura 24 Ansamblu pentru testul de compresiune Texture Analyzer TAXTplus [131]
Datele sunt achiziționate de software-ul Exponent icircn timpul procedurii şi prezentate sub
formă de grafice ce oferă detalii despre comportamentul fiecărei probe la forţe specificate
Dispozitivul este utilizat icircn numeroase domenii alimentar farmaceutic cosmetic medical etc
Accesoriile ce se ataşează de partea de sus a dispozitivului printr-un adaptor special pot
avea forme diverse Majoritatea au formă cilindrică și suprafața de acțiune plată cu diametrul
cuprins icircntre 2 mm şi 50 mm şi sunt realizate din diverse materiale oţel inoxidabil aluminiu
polioximetilenă (cunoscut şi sub denumirea de poliacetal şi comercializat sub marca Delrin) şi
poli (metacrilat de metil) sub denumirea comercială Perspex Atacirct diametrul variabil cacirct şi faptul
că sunt realizate din patru tipuri diferite de material fac posibilă utilizarea pentru numeroase teste
a unor probe diferite [132]
Pentru realizarea testului de compresiune a suporturilor obţinute s-a utilizat accesoriul
cilindric fabricat din aluminiu cu diametrul de 1 inch (337 mm) Suporturile au fost tăiate icircn
70
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
fragmente aproximativ egale iar după ce s-au determinat dimensiunile au fost supuse testului de
compresiune folosind următorii parametrii
viteza de pre-test ndash 01 mmsec
viteza de testare ndash 05 mmsec
distanța de icircntoarcere ndash 6 mm
Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru fiecare
fragment s-au calculat
A = L times l ( ) (9)
unde A este aria probei L este lungimea probei iar l este lățimea probei
F =
(N) (10)
unde Fmax este valoarea forţei măsurată de dispozitiv iar F este forţa de greutate
(11)
unde σ este rezistenţa la compresiune iar icircn final s-a calculat modulul de elasticitate icircntacirclnit
adesea icircn literatură sub denumirea de modulul lui Young (Legea lui Hooke)
(12)
unde ε este deformarea
244 Propritățile magnetice ale suporturilor
Susceptibilitatea magnetică este o măsură a proprietăţilor magnetice a unui material
Această mărime este o constantă adimensională ce indică gradul de magnetizare a unui material
ca răspuns la aplicarea unui cacircmp magentic
Icircn literatură se mai icircntacirclneşte şi termenul de magnetizare şi reprezintă raportul dintre
momentul magnetic şi densitatea de flux magentic Există trei mărimi ale susceptibilităţii
magnetice susceptibilitatea magnetică de masă susceptibilitatea magnetică molară şi
71
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
susceptibilitatea magnetică de volum Susceptibilitatea magnetică de volum se mai numeşte şi
permeabilitatea [133]
Susceptibilitatea magnetică a suporturilor notată cu χm a fost determinată utilizacircnd balanţa
de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto prezentată icircn figura 25
Figura 25 Balanţa de susceptibilitate magnetic Sherwood Scientific MSB Auto [134]
Dacă valoarea obţinută este pozitivă atunci materialul se numeşte paramagnetic iar dacă
este negativă se numeşte diamagnetic [135] Măsurarea susceptibilităţii magnetice s-a făcut la o
intensitatea a campului magnetic H= 45 kGauss (1 Gauss = 1 Oestred) Cunoscacircnd valorile
susceptibilităţii magnetice a unui material se poate calcula magnetizarea acestuia notată cu M
utilizacircnd formula
χm∙H (emug) (13)
245 Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic
Acestă analiză este foarte importantă pentru că oferă informaţii despre cantitatea de fluide
reţinute de suporturi in vitro Determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes
biologic s-a realizat cu ajutorul metodei volumetrice prin contactul suporturilor cu soluție PBS
și cu o soluție SBF icircn paralel
72
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Un fragment din suportul analizat a fost pus icircn contact cu PBSSBF pH=72 001 M icircntr-o
microcoloană QIAquickregSpin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o seringă de 1 ml prin
intermediul unei membrane de silicon (figura 26)
Figura 26 Ansamblu de dispozitive utilizat pentru determinarea gradului de retenţie maxim
Dispozitivele au fost incubate la 37degC pentru un interval de timp determinat după care s-a
stabilit volumul de soluţie reţinut de fiecare probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim
notat GRmax utilizacircnd formula
GRmax =
times100 () (14)
unde mf=mi+mabs mabs reprezintă masa de solvent absorbită după intervalul de timp stabilit
iar mi este masa iniţială a probei Densitatea PBS-ului respectiv a SBF-ului se consideră avacircnd
valoarea 1
246 Studii de degradare enzimatică in vitro
Suporturile pe bază de biopolimeri pentru ingineria tisulară şi regenerarea ţesutului osos
sunt degradate in vivo de către enzime icircn mod particular cum ar fi de exemplu hialuronidaza
pentru acidul hialuronic lizozimul pentru chitosan şi colagenaza pentru colagen şi gelatină
Pentru a studia şi cuantifica procesul de biodegradarea al suporturilor pentru ingineria tisulară icircn
literatură există două metode
73
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- metoda directă prin care se cacircntăreşte suport analizat icircnainte şi după ce este supus
procesului de degradare pentru un anumit interval de timp şi se face raportul dintre
greutatea iniţială şi greutatea finală
- metoda indirectă prin care se analizează compuşii rezultaţi icircn urma procesului de
degradare [136]
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd fie lizozim
(enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al chitosanului icircn organismul uman) fie un
complex de lizozim și colagenază (enzimă ce este implicată icircn procesul de degradare al
colagenului icircn organismul uman) Primul pas a fost imersarea unui fragment din fiecare probă
icircntr-un volum de PBS cu lizozim (1200 μgml) sau lizozim cu colagenază (100 μgml) aflată
icircntr-o membrană de dializă introdusă apoi icircn soluţie PBS fără enzime Probele au fost apoi
incubate la 37degC iar la anumite intervale de timp un volum din soluţia de PBS icircn care este
imersată membrana de dializă cu proba de analizat a fost extras şi analizat
Determinarea concentrației de chitosan degradat
Cs este predominat degradat de enzime care hidrolizează legăturile glucozamină ndash
glucoazamină glucozamină ndash N-acetil-glucozamină şi N-acetil-glucozamină ndash N-acetil-
glucozamină Lizozimul şi enzimele bacteriene din colon sunt principalele enzime implicate icircn
procesul de degradare al Cs-ului Lizozimul poate hidroliza atacirct chitina cacirct şi Cs viteza de
degradare fiind invers proporţională cu cristalinitatea polimerilor şi cu gradul de deacetilare al
Cs-ului Icircn corpul uman lizozimul se găseşte icircn diferite concentraţii icircn ser lacrimi salivă şi
urină unde are activitate antibacteriană importantă
Figura 27 Ruperea legăturii β-(1-4) glicozidică din structura chitosanului de către lizozim
74
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Chiar dacă lizozimul din corpul uman este diferit din punct de vedere structural de cel
utilizat icircn testele in vitro studiile au demonstrat că are activitate similară icircn procesul de
biodegradare al chitosanului Activitatea lizozimului creşte o dată cu creşterea gradului de
acetilare al chitosanului sugeracircnd că la locul de acţiune al lizozimului trebuie să existe un minim
de unităţi acetilate pentru a se obţine o rată de degradare iniţială maximă Lizozimul este prezent
icircn mod natural icircn serul uman salivă și alte fluide hidrolizacircnd legătura β-(1-4) glicozidică dintre
N-acetilglucozamină (NAGA) și reziduri ale acidului N-acetil-muramic ce se depun pe pereții
celulei bacteriei [137]
Icircn ceea ce priveşte analiza concentraţiei de chitosan degradat s-a determinat cantitatea de
produşi de biodegradare enzimatică prin evaluarea complexului format cu o soluţie de
K3Fe(CN)6 Soluţia de fericanură de potasiu s-a obţinut prin solubilizarea a 05 g K3Fe(CN)6 icircn
1000 ml de 05 M Na2CO3
1 ml extras din probele de analizat s-a incubat cu 4 ml de K3Fe(CN)6 icircntr-o eprubetă icircn apă
adusă la fierbere timp de 15 minute Soluţia din eprubete s-a răcit la temperatura camerei s-a
transferat icircntr-un flacon de 25 ml s-a adus la semn cu soluţie carbonat de sodiu 05 M după care
s-a citit absorbanţa soluţiei la spectrofotometru UV-VIS la o lungime de undă de 420 nm
Concentraţia de chitosan degradat s-a calculat utilizacircnd o curbă etalon (figura 28)
Figura 28 Curba etalon pentru determinarea concentraţie de chitosan degradat
y = -92591x + 02402 Rsup2 = 09964
0
005
01
015
02
025
0 0004 0008 0012 0016 002 0024
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația N-acetil-D-glucozamină ()
75
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Pentru realizarea curbei etalon s-a preparat o soluţie de N-acetil-D-glucozamină de
concentraţie 002 după care s-au realizat 10 diluţii şi s-a determinat absorbanţa fiecărei soluţii
utilizacircnd aceaşi metodă spectofotometrică menţionată anterior
Determinarea concentrației de colagen degradat
Ninhidrina este o pulbere albă si cristalină solubilă icircn apă si alcool Reacţiile ninhidrinei
utilizacircnd tehnici manuale sau automate sunt folosite pentru analiza şi caracterizarea amino-
acizilor peptidelor proteinelor precum şi a unui număr mare de compuşi icircn numeroase domenii
biomedical clinic alimentar microbiologic histochimic şi altele Icircn ceea ce priveşte
caracterizarea proteinelor icircn urma reacţiei ninhidrinei cu grupările amino rezultă cromoforul
ninhidrinei icircntalnit icircn literatură sub denumirea de violet Ruhemann ndash RP (figura 29) după
numele cerecetătorului care a descoperit reacţia icircn 1910 ce absoarbe radiaţia luminoasă la o
lungime de undă de 570 nm Icircn unele cazuri cantitatea de cromofor formată nu e
stoechiometrică de aceea pentru obţinerea unor rezultate reproductibile icircn reacţie se introduce
un agent reducător cum este de exemplu SnCl2 ce are ca rezultat creșterea intensităţii culorii
[138]
Figura 29 Reacţia dintre ninhidrină şi aminoacizi
Reactivul de ninhdrină s-a preparat prin solubilizarea a 0283times10-3
moli de SnCl2∙2H2O icircn
500mL soluţie tampon citrat-fosfat pH = 5 urmat de adăugarea a 500 mL de 2-metoxietanol care
conţine 20 g de ninhidrină 1 mL extras din probele de analizat probă s-a incubat cu 5 ml reactiv
ninhidrinăicircntr-o eprubetă icircn apă adusă la fierbere timp de 20 minute Soluţia s-a răcit imediat
latemperatura camerei apoi s-au adăugat 20 ml de soluţie amestec apă distilată2 - propanol
(11) Absorbanţa a fost măsurată la 570 nm in celulă de cuarţ cu spectrofotometrul UV-VIS
76
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
Curba de calibrare pentru determinarea concentraţiei de grupări NH2 terminale din colagen s-a
realizat utilizacircnd glicină (figura 210)
Figura 210 Curba etalon pentru determinarea concentraţiei de colagen degradat
247 Teste de citotoxicitate in vitro
Un material realizat cu scopul de a fi utilizat icircn contact direct cu un ţestut viu trebuie să fie
obligatoriu citocompatibil Primele teste ce trebuie realizate pentru a analiza această
caracteristică sunt testele in vitro de biocompatibilitate pe culturi de celule Doar după testări
riguroase a unui material pe diverse culturi de celule se poate merge mai departe la realizarea de
teste de citotoxicitate in vivo
Icircntr-un laborator de culturi de celule conservarea celulelor primare sau a liniilor celulare
este o condiţie esenţială deoarece permite atacirct păstrarea calităţii materialului biologic cacirct şi o
organizare eficientă a activităţilor De aceea celulele primare şi liniile celulare sunt criostocate
fie la -86degC fie la -196degC icircn prezenţa de soluţii crioprotectoare evitacircndu-se astfel formarea
cristalelor de gheaţă
Celule care au fost utilizate pentru a testa in vitro biocompatibilitatea suporturilor obţinute
au fost păstrate la -86degC utilizacircndu-se drept agent crioprotectant dimetilsulfoxid ndash DMSO
Suporturile au fost testate pe mai multe linii celulare
- fibroblaste primare NHDF LONZA
- celule stem isolate din ţesut adipos de iepure
y = 16194x + 00799 Rsup2 = 09968
0
01
02
03
04
05
0 00005 0001 00015 0002 00025
Ab
sorb
anța
(
)
Concentrația de glicină ()
77
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
- pre-osteoblaste din linia celulară MC-3T3
- osteoblaste din linia celulară MG-63 (celule tumorale)
Prima etapă pentru realizarea unui test de biocompatibilitatea a fost dezgheţarea celulelor
Icircn funcţie de numărul de material testate şi de tipul plăcilor de cultură utilizate s-au folosit fie
flacoane de cultură medii cu suprafaţa de cultură de 75 cm2 fie flacoane de cultură mari cu
suprafaţa de cultură de 175 cm2 Flacoanele s-au incubat(la 37degC 55 CO2 şi umiditate relative
96) cu un anumit volum de mediu de cultură complet (mediu de cultură care se suplimentează
cu 10BFS şi 1 PSN) icircn funcţie de dimensiunea flaconului cu aproxiamtiv 2 ore icircnainte de
dezgheţarea celulelor Criotubul s-a scos de la -86degC s-a imersat rapid icircn apă avacircnd temperatura
37degC şi s-a agitat uşor pacircnă la dezgheţare completă Celule din criotub s-au centrifugat cu mediu
de cultură complet pentru icircndepărtarea agentului crioprotectant după care supernatantul s-a
icircnlocuit cu mediu de cultură complet După ce s-au numărat celulele s-a adăugat icircn flaconul de
cultură un volum potrivit de suspensie celulară Mediul de cultură din flacon a fost icircnlocuit zilnic
cu mediu proaspăt pacircnă la formarea unui monostrat confluent
După formarea monostratului următoare etapă a fost popularea cu celule a plăcilor de
cultură pe care au fost testate suporturile Pentru a desprinde celulele din flacon şi a realiza o
suspensie celulară s-a utilizat o soluţie de tripsină 025 EDTA 002 Icircnainte de adăugarea
soluţie tripsinăEDTA s-a icircndepărtat mediului de cultură din flacon iar apoi suprafaţa de cultură
a fost spălată de cateva ori cu HBSS cu roşu fenol fără calciu pentru a fi icircndepărtate urmele de
mediu care ar icircngreuna acţiunea tripsinei După centrifugare cu mediu de cultură complet icircn
vederea icircndepărtării resturilor de tripsină s-a icircnlocuit supernatantul cu mediu complet după care
s-au numărat celulele cu ajutorul unei camere de numărat celule Neubauer s-a realizat o
suspensie de celule icircn mediu complet după care s-a distribuit icircn fiecare godeu al plăcilor de
cultură un anumit volum de suspensie conţinacircnd numărul de celule calculat icircn funcţie de tipul de
celule şi numărul de godeuri al plăcilor de cultură
Icircn funcţie de tipul materialului analizat (pudre nanoparticule emulsii suporturi compacte
suporturi poroase etc) se pot realiza teste de biocompatibilitate prin contact direct prin metoda
eluţiei (contact indirect) sau prin metoda difuziei Contactul direct presupune adăugarea propriu-
zisă a fragmentelor din materialul testat icircn godeurile plăcilor de cultură cultivate cu celule
contactul indirect presupune adăugarea unui extract din materialul analizat analizacircndu-se de cele
mai multe ori diverse concentraţii ale extractului iar metoda difuziei constă icircn acţiunea
78
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
compusului analizat asupra celulelor printr-un strat de gel de agaroză ce acoperă cultura de
celule Suporturile obţinute icircn studiul de faţă au fost analizate prin contact direct şi prin contact
indirect [139]
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare după ce suporturile au fost sterilizate
fragmente de suportextract de suport au fost puse pe plăcile de cultură conţinacircnd celule ce au
fost incubate icircn placi cu 24 ore icircnainte
Testele realizate pentru studiul biocompatibilităţii suporuturilor au fost testul MTT la 24
48 și 72 ore de contact şi testul de viabilitate celulară cu Calceina-AM
2471 Testul MTT
Pentru realizarea testului MTT ndash [bromură de (3-[45-dimetiltiazol-2-il]-25-difenil)
tetrazoliu] fragmentele de material au fost extrase şi mediul de cultură icircnlocuit cu soluție de
lucru MTT (MTT 5 icircn mediu de cultură fără BFS şi amestec de antibiotice) Testul MTT se
bazează pe capacitatea celulelor viabile cu metabolism activ să reducă MTT-ul icircn cristale de
formazan de culoare albastru-violet (figura 211) [140]
Figura 211 Structura bromurii de tetrazolium MTT şi a produsului redus formazan
Celulele cu soluția MTT au fost incubate la 37degC pentru un anumit interval de timp icircn
funcţie de tipul de celule după care s-a extras soluţia MTT cristalele de formazan formate fiind
solubilizate cu alcool izopropilic Absorbanța soluției de formazan rezultată (culoare albastru-
violet) a fost măsurată spectrofotometric la λ=570nm cu ajutorul unui cititor de plăci (Tecan
Sun-rise Plate Reader) Rezultatele citirii spectrofotometrice din godeurile experimentale au fost
79
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
raportate la godeurile de control icircn care nu au fost prezente fragmente de materialextract
Raportul calculat a constituit viabilitatea celulară (V)
V =
(15)
unde abs suport este absorbanța din godeul conţinacircnd fragment de suportextract iar abs control
este absorbanța controlului
2472 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Calceina AM este un colorant care are capacitatea de a colora icircn verde doar celule viabile
icircn mod particular citoplasma acestora După ce pătrunde icircn celulă calceina AM substanţă
incoloră este hidrolizată de esteraza din citoplasmă icircntr-un produs verde fluorescent (figura
212) [139] Pentru realizarea testului mediul de cultură din godeuri a fost extras iar apoi celule
au fost spălate de două ori cu HBSS cu calciu fără roşu fenol Icircn final s-a adăugat soluţie de
calceină (1-2 microL calceină la 1 mL HBSS cu calciu fără roşu fenol) iar placa de cultura a fost
introdusă icircn incubator pentru 20 min După cele 20 min celulele s-au vizualizat la microscop
confocal cu fluorescenţă (Leica Germania) şi s-au preluat imagini Testul s-a realizat la intervale
de timp diferite icircn funcţie de metoda de contact şi tipul celulelor
Figura 212 Schema de legare a Caleinei ndash AM la celulele viabile
80
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
248 Teste de citotoxicitatea in vivo
Pentru a demonstra siguranța unui material medical după o caracterizare riguroasă acesta
trebuie testat din punct de vedere al citotoxicității in vivo
Testele de citotoxicitate in vivo au fost realizate conform recomandărilor ISO Standard
10993 la Facultate de Medicină Veterinară din Iaşi sub coordonarea domnului Prof Dr Mareş
Mihai Studiile au fost realizate conform Directivei UE 632010 și cu acordul comitetului de
etică din cadrul instituției
S-au utilizat șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie
de 28 plusmn 3 grame materialul biologic provenind din Biobaza INCDMI Cantacuzino București
- filiala Băneasa Animalele au fost ţinute icircn condiții zooigienice corespunzătoare speciei și
vacircrstei temperatură și umiditate constante regim de iluminare 12 orezi acces liber la hrană
(furaj combinat complex) manipularea animalelor fiind făcută cu blacircndețe fără a le produce
stres sau durere Cu 3 zile icircnainte de icircnceperea experimentului animalele au fost mutate icircn
laborator pentru a se acomoda cu mediul ambiant
Pentru implant materialele au fost secționate sub diverse forme pătrate sau discuri apoi
au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 4 ore Animalele au fost grupate
icircn loturi icircn funcţie de numărul de suporturi analizate fiecare lot cuprinzacircnd un anumit număr de
animale
Icircnainte de intervenția chirurgicală zona de implant a fost tunsă și aseptizată cu betadină
soluție cutanată 10 Implantarea fragmentelor de suporturi s-a realizat subcutanat icircn condiții
aseptice prin incizia sterilă a pielii din regiunea dorsală a șoarecilor Inducția anestezică (15-30
de secunde) s-a realizat cu isofluran 4 iar pentru a se asigura liniștea intraoperatorie pe
parcursul a 15 minute (timp necesar inciziei depunerii fragmentului de suport și suturii pielii) a
fost utilizată concentrația de 15
Durata experimentului a fost diferită icircn funcție de lotul de suporturi testate După
sacrificarea animalelor s-au efectuat examene histopatologice Icircn vederea realizării preparatelor
microscopice fragmentele de țesut (cu sau fară material) au fost fixate icircn soluţie de formaldehidă
10 timp de 7 zile şi apoi incluse icircn blocuri de parafină prin metoda rapidă de includere
Blocurile de parafină au fost secţionate apoi icircn secţiuni de 5 microm cu ajutorul microtomului de
laborator Secţiunile rezultate au fost etalate pe lame histologice cu ajutorul albuminei Mayer
81
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
colorate Tricromic Masson și examinate microscopic Preparatele au fost examinate la microscop
şi interpretate
249 Studii privind aplicația suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase
maligne
La nivel mondial cancerul rămacircne a doua cea mai comună cauză de deces icircn ciuda
icircncercărilor avansate de prevenție diagnosticării icircn stadiu incipient și a protocoalelor de
tratament riguroase [141] Icircn ceea ce privește tumorile osoase acestea sunt diagnosticate icircn
special la pacienți adulți sau vacircrstnici excepție făcacircnd osteosarcomul tumoră icircntacirclnită
preponderent la pacienți cu vacircrste cuprinse icircntre 10 și 20 și destul de rar la vacircrstnici
Icircn unele cazuri tratamentul tumorilor osoase maligne are drept primă etapă rezecția
chirurgicală a tumorii iar icircn a doua etapă pacientul urmează ședințe de radioterapie Cele două
tehnici nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral chimioterapia precedacircndu-le de regulă
Plecacircnd de la această schemă de tratament s-au realizat studii privind potențiala aplicație a
suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircntr-o primă fază suporturile au fost expuse la raze X după care au fost caracterizate din
punct de vedere fizico-chimic și biologic icircn vederea analizei influenței radiațiilor asupra
proprietăților suporturilor
Iradierea suporturilor cu raze X s-a realizat cu ajutorul dispozitivului CT-Sim Siemens
Somatom Definition figura 213 Deoarce grosimea materialului iradiat a fost de aproximativ 12
mm acesta a fost fixat pe un suport de 5 mm a cărui dimensiune a fost inclusă icircn calculul
parametrilor de iradiere
Figura 213 Dispozitivul CT-Sim Siemens Somatom Definition (stacircnga)Simularea CT
(dreapta)
82
Capitol 2 Materiale şi metode experimentale
2491 Teste de icircncărcareeliberare controlată a chimioterapicelor din suporturi
Sistemele de eliberare controlată de medicamente sunt studiate pentru tratamentul
alternativ a unor tipuri diferite de cancer Cele mai studiate sisteme sunt cele pe bază de polimeri
ceramice sau compozite ale acetora Polimerii cei mai utilizați la realizarea de sisteme de
eliberare sunt polietilen glicolul (PEG) polietilen oxidul poli (caprolactona) chitosanul
alginatul alcoolul polivinilic polimetil metacrilatul celuloza etc Și unele proteine
preponderant colagenul sunt utilizate pentru realizarea de sisteme de eliberare controlată dar
instabilitate lor chimică și fizică ridică anumite probleme tehnice [141]
Doxorubicina a fost medicamentul chimioterapic avut icircn vedere pentru studiul de față
Pentru prepararea de suporturilor cu potențial de utilizare ca sistem de eliberare de medicament
icircntr-o suspensie coloidală de nanoparticule magnetice (1 ) obținute conform protocolului
descris anterior (subcaptiol 231) s-a solubilizat 0125 doxorubicină Nanoparticulele
icircncărcate cu medicament au fost folosite la prepararea de suporturi după protocolul descris icircn
subcapitolul 23
Eliberarea in vitro a medicamentului a fost studiată cu atenție Primul pas a fost imersarea
a 20 mg din fiecare probă icircn PBS pH = 72 001M icircntr-o memebrană de dializă care a fost
complet imersată icircntr-un alt volum de PBS Studiul de eliberare a fost efectuat la 37ordmC pe o
perioadă de 14 zile La anumite intervale de timp un volum de PBS icircn care a fost imersată
membrana de dializă a fost extras pentru analiza UV-Vis și icircnlocuit cu același volum de PBS
proaspăt Absorbanța fiecărui volum de PBS extras a fost analizată utilizacircnd spectrofotometrul
NanoDrop ND 1000 (Thermo Fisher) la 480 nm Pentru trasarea curbei etalon s-au preparat
soluţii de diferite concentraţii de medicament (pe domeniul 1 microg ndash 10 microg) icircn PBS
83
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Capitolul 3 Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe
bază de compozite din chitosan alți biopolimeri (albumină acid hialuronic
gelatină) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și apatite hidroxiapatite sau alți fosfați de
calciu cu aplicații icircn ingineria tisualră a țesutului osos sunt studiate icircn detaliu de aproape două
decenii Imitarea matricei extracelulare a țesuturilor umane a devenit o provocare pentru
ingineria tisulară datorită complexității sale fizice chimice și biologice prin urmare este
esențială alegerea biopolimerilor care să satisfacă criterii de compatibilitate chimică
biocompabibiltate biodegradabilitate controlată Biopolimerii sunt recunoscuți de mediul
biologic și degradați metabolic Chitosanul colagenul gelatina alginatul condroitin sulfatul și
acidul hialuronic sunt printre cei mai studiați biopolimeri datorită argumentelor menționate
anterior și a similarității lor cu componentele matricei extracelulare [142-144]
Chitosanul ndash Cs un biopolimeri foarte versatil este unul din cei mai studiaţi pentru
ingineria tisulară a țesutului osos datorită proprietăţilor sale remarcabile biocompatibilitate
biodegradabilitate proprietăţi antibacteriene hemostatice şi antitumorale [55 56 145-148] De
asemenea susţine in vitro adeziunea şi proliferarea celulară a osteoblastelor precum şi formarea
de matrice osoasă mineralizat [149] Icircn ceea ce priveşte comportamentul in vivo un număr
semnificativ de studii au demonstrat faptul că suporturile pe bază de chitosan susţin
osteoconductivitatea icircn defecte osoase obţinute chirurgical [150]
Gelatina ndash G proteină derivată din colagen este un biopolimer degradabil cu
biocompatibilitate excelentă adesea utilizată icircn domeniile biomedical şi farmaceutic Icircn
combinaţie cu alţi biopolimeri adesea cu chitosanul gelatina contribuie la creşterea adeziunii
celulare [151] [152]
Acidul hialuronic ndash Hya susţine regenerarea tisulară la locul defectelor osoase prin
stimularea formării de calus [153] De asemenea rezultatele unor studii in vitro și in vivo au
sugerat o legătură icircntre creștere sintezei de acid hialuronic după tratatamentul cu parathormon și
resorbția osoasă ulterioară ceea ce ar putea indica o posibilă relație icircntre sinteza biopolimerului
și creșterea activității osteoclastelor [154]
Studiile icircn domeniu au evidenţiat faptul că o concentraţie scăzută de albumină serică
bovină ndash Bsa poate susţine mineralizarea ţesutului osos prin stimularea creşterii cristalelor de
84
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
fosfaţi de calciu [155] [156] icircn schimb o concentraţie mare de albumină poate chiar inhiba
creşterea lor [157]
Avacircnd icircn vedere proprietăţile menţionate mai sus ale celor patru biopolimeri (chitosan
acid hialuronic gelatină şi albumină) s-a emis ipoteza că prin realizarea unor combinații ale
acestora cu fosfați de calciu și particule magnetice se pot obține suporturi magnetice cu
performanțe crescute icircn regnerarea tisulară osoasă (Figura 31)
Figura 31 Suporturi pe bază de biopolimeri fosfați de calciu și nanoparticule magentice
Fosfații de calciu componenta fazei anorganice a țesutului osos uman stimulează
osteoconductivitatea și osteoinductivitatea Importanța utilizării nanoparticulelor magnetice icircn
suporturi compozite pentru ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost detaliată icircn capitolul 1
Alegerea unei concentrații de nanoparticule adecvată este o provocare o concentrație prea mică
poate avea riscul de a nu conferi proprietăți magnetice suportului icircn care sunt incluse iar o
concentrație prea mare poate duce la un eventual caracter citotoxic al suportului Studiile icircn
85
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
domeniu prezintă prepararea de suporturi magnetice ce au icircncoporate concentrații diferite de
particule 05 1 2 3 7 5 sau 10 [9091 92] etc
Pentru a putea concluziona care ar fi concentrația optimă de particule introdusă icircn sinteză
s-au selectat trei concentraţii diferite de particule magentice 1 3 și 5 astfel icircncacirct să se
evite efectele toxice menținacircndu-le pe cele magnetice icircn domeniile terapeutice
31 Obţinerea suporturilor
Suporturile s-au obţinut printr-o metodă biomimetică de co-precipitare a fosfaţilor de
calciu din precursorii săi icircn prezențicirc de biopolimeri și particule magnetice Astfel soluții de
Ca(NO₃)₂∙4H2O(40 icircn apă distilată) şi NaH2PO4middotH2O (25 icircn apă distilată) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri (Cs (1 icircn soluție 15 HCl) Hya (2 in apă distilată)
Bsa (2 in apă distilată) G (2 in apă distilată)) Soluţia de Cs (1) a fost obţinută prin
dizolvare de Cs icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Separat s-au adăugat soluții de Hya (2)
Bsa (2) și G (2) (icircn apă distilată) astfel icircncacirct concentraţia să fie 10 faţă de cantitatea totală
de chitosan introdusă icircn sinteză Icircn fiecare amestec de biopolimercombinaţii de biopolimeri şi
precursori de fosfaţi de calciu s-au integrat concentraţii diferite de particule magnetice 1 3
şi 5 raportat faţă de cantitatea de substanţă uscată introdusă icircn procesul de sinteză pH-ul
amestecului final a fost ajustat la 72-74 prin adaos de soluţie de amoniac NH4OH (25 )
Raportul CaP a fost menținut la 165 icircn toate suporturile valoare comparabilă cu cea din ţesutul
osos uman [158]
Fiecare amestec compozit a fost spălat de 3 ori cu apă distilată separat prin centrifugare
(5000 rpm 10 minute) iar ultimul pas a constat icircn liofilizarea amestecurilor timp de 24 h
Cele patru tipuri diferite de suporturi au fost codificate icircn funcţie de compoziţia lor după
cum se observă icircn tabelul 31
Tabel 31 Compoziţia şi codificarea suporturilor
Denumirea
Suportului
ChitosanAlt biopolimer Concentraţia de
MNPs
Cs 1
Cs
1
Cs 3 3
Cs 5 5
Cs-Hya 1 Cs-Hya 1
86
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs-Hya 3 3
Cs-Hya 5 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa
1
Cs-Bsa 3 3
Cs-Bsa 5 5
Cs-G 1
Cs-G
1
Cs-G 3 3
Cs-G 5 5
Suporturile biomimetice pe bază de diferite amestecuri de chitosan și biopolimeri
(albumină acid hialuronic gelatină) cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei (spectroscopia IR cu
transformată Fourier ndash FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de energie ndash EDS) difracţie
cu raze X (XRD) și morfologic (microscopie electronică de baleiaj ndash SEM) De asemenea s-a
urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au
analizat proprietăţile magnetice Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi
printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
32 Rezultate și discuții
321 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR picuri caracteristice
biopolimerilor din compoziţie fosfaţilor de calciu şi particulelor magnetice fiind identificate pe
spectrele FTIR (figura 32)
Icircn ceea ce priveşte spectrul FTIR al suportului Cs 3 s-au observat benzile caracteristice
Cs-ului după cum urmează gruparea -OH la 3430 cm-1
gruparea ndashCH2 la 2923 cmminus1
amida I la
1655 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii CndashN la 1322 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării
CndashO la 1029 cm-1
[159] Pentru acelaşi suport s-au mai putut observa picuri specifice grupării
fosfat PO43-
icircn regiunea 600 cm-1
[99] şi grupării FendashO din particulele magnetice la 560 cm
-1
[160]
87
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Icircn cazul suportului Cs-Bsa 3 s-a observat o creştere semnificativă a intensităţii picului
1657 cmminus1
ce corespunde amidei I drept rezultat a vibraţiei de icircntindere a grupării C=O din
legătura peptidică Picul de la numărul de undă 1546 cm-1
corespunde amidei II iar picul de la
1240 cm-1
amidei III din componenta proteică [161]
Figura 32 Spectrele FTIR ale suporturilor
Pe spectrul FTIR pentru suportul Cs-Hya 3 s-au observat următoarele picuri picul pentru
vibraţia de icircntindere a grupăriindashOH la 3422 cm-1
picul pentru gruparea -CH2 la 2923 cm-1
picul
pentru amida primară I la 1654 cm-1
picul pentru COO- la 1420 cm
-1 şi picul pentru C-O la 1029
cm-1
[162]
322 Compoziția suporturilor
Icircn figura 33 este redată difractograma XRD pentru suporturile obţinute datele XRD
oferind informaţii despre faza anorganică şi despre cristalinitatea acestora
88
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
S-au observat următoarele picuri caracteristice 303ordm 356ordm 535ordm şi 574ordm ce pot fi
associate planelor (220) (311) (422) şi (511) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF
No 65-3107) Picuri specifice fosfaţilor de calciu de la unghiurile 23ordm 26ordm 28ordm 32ordm 335ordm 40ordm
48ordm şi 50ordm sunt corelate cu planurile (121) (002) (210) (112) (300) (310) (203) (213) şi
confirmă formarea următoarelor tipuri de fosfaţi de claciu Ca(H2PO4)22H2OmCaHPO4
Ca4(HPO4)3 25 H2O respectiv Ca3H2(P2O7)24H2O [47]
De asemenea un aspect foarte important care a fost observat a fost acela că principalul tip
de fosfat de calciu format icircn structura suporturilor compozite este hidroxiapatita
(Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul de calciu cu cele mai bune proprietăţi pentru formarea de ţesut osos
Figura 33 Spectrul XRD pentru suporturile obţinute
Compoziţia chimică a suporturilor a fost studiată cu ajutorul analizei EDX rezultatele fiind
redate icircn figura 34 Principalele tipuri de fosfați de calciu identificati pe spectrele XRD și EDX
sunt prezentați icircn tabelul 32
Tabel 32 Diferite forme de CP prezente icircn compozitele Cs-CP conform datelor XRD și EDX
Forme de fosfați de
calciu Formulă chimică Raport CaP
MCPM Ca(H2PO4)2middotH2O 05
Fosfat monocalcic
anhidru Ca(H2PO4)2 05
89
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Fosfat dicalcic
anhidru CaHPO4 100
Hidroxiapatită Ca10(PO4)6(OH)2 167
Fosfat tricalcic Ca3(PO4)2 15
Figura 34 Spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3
Pe spectrele EDX ale suporturilor Cs-Bsa 3 şi Cs-G 3 s-au observat semnale intense icircn
regiunea elementelor Ca P O C Fe ceea ce confirmă compoziţia suporturilor fosfaţi de calciu
biopolimeri particule magnetice De asemenea din datele EDX obţinute s-a calculat raportul
molar al fazei minerale dintre calciu şi fosfor rezultatele indicacircnd formarea de diferite tipuri de
fosfaţi de calciu icircn structura suporturilor evidenţiindu-se fosfatul tricalcic (CaP = 152) icircn cazul
suportului Cs-Bsa 3 şi hidroxiapatita icircn cazul suportului Cs-G 3 [163]
90
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
323 Morfologia suporturilor
Icircn figura 35 sunt prezentate datele SEM obținute pentru suporturile Cs 3 Cs-Hya 3
Cs-Bsa 3 și Cs-G 3 la diferite grade de mărire Morfologia a fost studiată icircn secţiunea
suporturilor imaginile evidenţiind o porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea
fosfaţilor de calciu pe structura polimerică Particulele magnetice sunt complet integrate icircn
structura compozită
Figura 35 Morfologia suporturilor la două ordine diferite de mărire
Suporturile sintetizate pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară a ţesutului osos trebuie să aibă o
structură poroasă specifică şi o dimensiune a porilor adecvată aplicaţiei vizate Icircn primul racircnd
porii suportului trebuie să fie interconectaţi pentru a promova adeziunea şi creşterea
osteoblastelor migrarea nutrienţilor şi vascularizarea precum şi infiltrarea icircn matricea biologică
[164] [165] Icircn ceea ce priveşte dimensiune porilor icircn literatură există date contradictorii acest
aspect fiind explicat de complexitatea procesului de regenerare osoasă in vivo Astfel unele
studii recomandă utilizarea suporturilor cu dimensiunea a porilor cuprinsă icircntr-un interval foarte
larg de la 20 microm pacircnă la 1500 microm [166] [167] alte studii recomandă o dimensiune a porilor
icircntre 150 şi 600 microm sau icircntre 400 şi 1500 microm [168]
91
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Dimensiunile porilor suporturilor sintetizate (tabel 33) au fost calculate din imaginile
SEM prin analiza cantitativă a parametrilor imaginilor utilizacircnd funcția threshold a programului
ImageJ
Pentru fiecare imagine SEM măsurătorile au fost repetate de 10 ori la final fiind calculate
dimensiunea maximă a porilor dimensiunea medie a porilor dimensiunea minimă a porilor și
deviația standard S-a observat că dimensiunile maxime ale porilor au fost icircnregistrate pentru
suportul Cs-Hya 3 iar dimensiunile minime pentru suportul Cs-Bsa 3 Cel mai mic interval
dintre minimul și maximul dimensiunilor unui suport a fost calculat pentru suportul Cs-Bsa 3
ceea ce indică că acest suport are cea mai uniformă distribuție a porilor
Tabel 33 Dimensiunea porilor (microm)
Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
Deviația
standard 99458plusmn18938 111525plusmn16967 75084plusmn9075 92383plusmn13549
Dimensiunea
minimă 398541 451762 319411 456391
Dimensiunea
maximă 1946331 213656 1121936 154929
Dimensiunea
medie 952598 988953 672699 8149395
324 Proprietăţi magnetice
Deoarece obiectivul tezei de faţă implică utilizarea de particule magnetice ce vor fi
funcţionalizate cu medicamente rolul particulelor fiind de transportori a principiilor active ce
vor fi eliberate controlat studiul proprietăţilor magnetice ale suporturilor este esenţială Pentru a
stabili concentraţia optimă de particule introduse icircn sinteză icircn acest prim studiu s-au analizat trei
concentraţii diferite Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 34
Tabel 34 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Susceptibilitatea
magnetică de
masă
Magnetizarea
(emug)
Cs 1 1 0016middot e-4
132
Cs 3 3 009middot e-4
742
92
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Cs 5 5 0123middot e-4
1014
Cs-Hya 1 1 0003middot e-4
025
Cs-Hya 3 3 minus minus
Cs-Hya 5 5 0152middot e-4
1253
Cs-Bsa 1 1 0027middot e-4
226
Cs-Bsa 3 3 0074middot e-4
610
Cs-Bsa 5 5 0099middot e-4
816
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de masă a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 025 şi 1253 emug au fost mai mici decacirct cele ale
particulelor magnetice (4365 emug) [160] ce nu au fost icircncorporate icircn suport sau icircn oricare altă
structură compozită complexă
Icircntr-un studiu publicat de Heidari şi colaboratorii [99] s-au obţinut şi caracterizat nano-
suporturi magnetice pe bază de chitosan şi hidroxiapatită cu o valoare a magnetizării de 304
emug măsurată la o intensitate a cacircmpului magnetic H = 5189 kOe la temperatura camerei Un
alt studiu publicat de Bock şi colaboratorii [90] prezintă sinteza şi caracterizarea de suporturi pe
bază de hidroxiapatită şi colagen cu incluziune de tipuri diferite de fero-fluide magnetice La o
intensitate a cacircmpului magnetic de 10 kOe s-au obţinut valori ale magnetizării cuprinse icircntre 12
şi 15 emug pentru toate tipurile de suporturi sintetizate S-a observat că pentru o concentrație de
1 particule magnetice valorile obținute pentru magnetizare sunt prea mici comparabile cu cele
din literatură pentru concentrația de 5 fiind obținute valorile cele mai apropiate Comparacircnd
valorile obţinute cu datele de literatură s-a putut afirma că suporturile obţinute sunt
superparamagentice
325 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Interacţiunea suporturilor cu fluidele de interes biologic este un aspect important icircn ceea ce
priveşte potenţialele aplicaţii ale acestora icircn domeniul ingineriei tisulare a osului Pentru
suporturile obținute s-a studiat interacțiunea suporturilor cu două fluide soluție tampon fosfat-
PBS și fluid biologic simulat - SBF
93
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de aproximativ 5 mg din fiecare suport a fost pus icircn contact cu o soluţie PBSSBF pH = 72
001M icircntr-o microcoloană QIAquickreg
Spin Colummn 50 cu diametru 10 mm ataşată la o
seringă de 1 ml prin intermediul unei membrane de silicon Dispozitivele au fost incubate la
37ordmC pentru un interval de 48 ore după care s-a stabilit volumul de PBSSBF reţinut de fiecare
probă Icircn final s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din capitolul 2
Rezultatele obţinute cu privire la acest studiu sunt redate icircn tabelul 35
Tabel 35 Gradul de retenţie PBS și SBF () al suporturilor
Denumirea
Suportului
Concentraţia de
MNPs
Gradul de
retenţie PBS
()
Grad de retenție
SBF
()
Cs 1 1 704plusmn22 680plusmn35
Cs 3 3 645plusmn12 632plusmn14
Cs 5 5 676plusmn21 530plusmn25
Cs-Hya 1 1 784plusmn24 667plusmn31
Cs-Hya 3 3 714plusmn45 630plusmn29
Cs-Hya 5 5 490plusmn22 475plusmn17
Cs-Bsa 1 1 700plusmn39 654plusmn41
Cs-Bsa 3 3 454plusmn61 567plusmn16
Cs-Bsa 5 5 806plusmn78 515plusmn20
Cs-G 1 1 465plusmn35 421plusmn34
Cs-G 3 3 805plusmn42 625plusmn09
Cs-G 5 5 755plusmn27 722plusmn15
Pentru toate suporturile s-au obţinut valori mari ale gradului de retenţie PBS () acestea
fiind cuprinse icircntre 400 şi 800 Aceste valori au fost corelate pe de o parte cu structura
poroasă tridimensională a suporturilor iar pe de altă parte cu proprietăţile hidrofile ale
biopolimerilor atribuite grupărilor lor funcţionale
Icircn cazul suporturilor icircn care matricea polimerică este reprezentată doar de chitosan s-a
observat o variaţie foarte mică a valorile gradului de retenţie cea mai mare valoare fiind
măsurată la suporturile cu o concentraţie minimă de particule magnetice Icircn schimb icircn cazul
94
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
suporturilor Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G s-a observat o influenţă semnificativă a particule magnetice
asupra gradului de retenție Astfel icircn cazul suporturilor care au Hya icircn compoziţie s-a observat o
descreştere a gradului de retenţie pe măsură ce concentraţia de particule magnetice creşte pe
cacircnd pentru suporturile ce conţin albumină s-a observat o valoare maximă a gradului de retenţie
pentru suportul cu cea mai mare concentraţie de particule magnetice Suporturile Cs-G au
valorile gradului de retenţie apropiate pentru concentraţiile de particule magnetice de 3
respectiv 5 valoarea minimă fiind icircn cazul suportului Cs-G 1
Icircn ceea ce privește interacțiunea suporturilor cu soluția SBF prezența ionilor pozitivi (Na+
K+ Ca
2+ Mg
2+) și a ionilor negativi (HPO4
2- Cl
- HCO3
2- SO4
2- ) precum și abilitatea acestora
de a interacționa cu componentele suporturilor diminuează retenția de fază apoasă a suporturilor
326 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea suporturilor a fost studiată in vitro icircn prezenţa lizozimului pentru o perioadă
de 16 zile rezultatele studiului fiind prezentate icircn figura 36 A fost utilizată o concentraţie de
lizozim cu valoare apropiată de concentraţia lizozimului icircn serul uman [169]
Figura 36 Degradarea suporturilor
Analizacircnd rezultatele (tabel 36) s-a observat că procesul de degradare are practic două
etape Icircn prima etapă ce corespunde primelor 8 zile a avut loc o degradare mai accentuată a
suporturilor pe cacircnd icircn a doua etapă a urmat o icircncetinire a procesului de degradare Acest proces
de degradare icircn două etape a fost prezentat şi icircn alte studii şi poate fi explicat de faptul că
02
0
4
06
0
8
Cs 1 Cs 3 Cs 5 Cs-Hya 1
Cs-Hya 3
Cs-Hya 5
Cs-Bsa 1
Cs-Bsa 3
Cs-Bsa 5
Cs-G 1
Cs-G 3
Cs-G 5
Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat
m
moli
L
2 zile 8 zile 16 zile
95
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
lizozimul conține un loc de legare hexameric iar secvențele hexazaharidice conținacircnd 3-4 sau
mai multe unități acetilate au o puternică influenţă asupra vitezei inițiale de degradare a
chitosanului După o pierdere mare de masă inițială viteza de degradare a suporturilor a scăzut
considerabil ca rezultat al pierderii secvențelor de hexazaharidă [170]
Tabel 36 Degradarea in vitro a suporturilor icircn prezenţă de lizozim
Denumirea
suportului
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
2 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
8 zile (mmoliL)
Concentraţia de
chitosan degradat ndash
16 zile (mmoliL)
Cs 1 04045plusmn00014 06800plusmn00042 07452plusmn00028
Cs 3 04081plusmn00007 06292plusmn00028 06727plusmn00057
Cs 5 03791plusmn00064 06510plusmn00014 07343plusmn00021
Cs-Hya 1 03574plusmn00049 05132plusmn00028 06075plusmn00014
Cs-Hya 3 03827plusmn00028 07017plusmn00028 07379plusmn00071
Cs-Hya 5 03755plusmn00064 07742plusmn00028 07814plusmn00014
Cs-Bsa 1 03175plusmn00042 05640plusmn00085 07162plusmn00028
Cs-Bsa 3 03538plusmn00028 06510plusmn00035 06655plusmn00014
Cs-Bsa 5 03538plusmn00028 06582plusmn00028 06655plusmn00014
Cs-G 1 04226plusmn00049 07669plusmn00014 07814plusmn00014
Cs-G 3 04154plusmn00007 07887plusmn00042 08032plusmn00014
Cs-G 5 05024plusmn00035 07887plusmn00014 08249plusmn00042
După cum se poate observa icircn tabelul 36 pentru toate cele patru tipuri diferite de suporturi
Cs Cs-Hya Cs-Bsa şi Cs-G concentraţia de particule magntice adăugate nu influenţează
semnificativ degradarea acestora Pentru toate cele trei intervale de timp la care s-a analizat
concentraţia de Cs degradat cele mai mari valori au fost obţinute pentru matricile Cs-G 5
96
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
327 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
3271 Testul MTT
Pentru evaluarea citotoxicității in vitro pe culturi de celule s-a utilizat metoda contactului
indirect realizacircndu-se un extract din suporturile obținute care icircn prealabil au fost sterilizate 10
mg din suporturile Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3 au fost introduse icircntr-o membrană
de dializă conținacircnd 4 ml alcool etilic 70 membrana de dializă fiind introdusă la racircndul ei icircntr-
un flacon steril conținacircnd 25 ml alcool etilic 70 După 30 minute alcool din flacon a fost
evacuat membrana de dializă fiind lasată icircn hotă pentru evaporarea alcoolui după care a fost
spălată icircn repetate racircnduri prin imersare icircn 25 ml PBS Fiecare probă din membrană de dializă a
fost imersată icircn 4 ml mediu de cultură complet și lasată la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului După cele 24 ore extractul a fost filtrat printr-un filtru de 70 microm
după care s-a măsurat volumul rezultat şi s-au adăugat 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost adus icircn contact cu două linii celulare diferite preosteoblaste MC3T3
(figura 37) și fibroblaste din derm uman (figura 38) icircn placi de 96 godeuri fiecare godeu
conținacircnd 3000 celule Cele două tipuri de celule au fost incubate pentru 24 ore icircn mediu de
cultură DMEM conținacircnd 10 BFS și 1 PSN Mediul complet a fost icircnlocuit complet după
cele 24 ore cu 150 μL extract Testul MTT s-a realizat la 24 48 și 72 ore calculacircndu-se
viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (15) din capitolul 2
Figura 37 Viabilitatea celulară a preosteoblatelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
97
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 38 Viabilitatea celulară a fibroblastelor icircn urma contactului indirect cu suporturile
După 24 ore viabilitatea preosteoblastelor a fost cuprinsă icircntre 91 (Cs 3) şi 95 (Cs-
Bsa 3) pe cacircnd viabilitatea fibroblastelor a fost icircn jur de 96 pentru toate cele patru suporturi
analizate diferenţa foarte mică de procente fiind explicată de sensibilitatea crescută a
preosteobastelor Pentru ambele linii celulare s-a observat o uşoară scădere icircn timp a viabilităţii
celulare cea mai mică valoare calculată 88 fiind pentru suportul Cs-Hya 3 după 72 de ore
de contact a extractului cu fibroblastele
Datele obţinute icircn urma testului MTT au indicat faptul că suporturile nu au eliberat
compuşi citotoxici icircnglobaţi icircn structura suporturilor icircn momentul sintezei sau neicircndepărtaţi
care să influenţeze negativ ataşarea şi proliferarea celulară
3272 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată biocompatibilitatea suporturilor şi lipsa unor efecte adverse a
acestora asupra celulelor s-a realizat un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM rezultatele
testului fiind redate icircn figura 39 Acelaşi extract utilizat la testul MTT a fost incubat cu
fibroblaste pentru 24 respectiv 96 ore
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră (
)
Control Cs 3 Cs-Hya 3 Cs-Bsa 3 Cs-G 3
98
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
Figura 39 Viabilitatea celulară icircn urma testului cu Calceină-AM
Comparacircnd imaginile reprezentacircnd celulele incubate cu extractul suporturilor Cs-Bsa 3
respectiv Cs-G 3 cu imaginile reprezentacircnd celule care au fost incubate fără extract s-a
observat că nu există diferenţe de densitate celulară la niciunul din cei doi timpi de contact ceea
ce indică lipsa efectelor adverse a suporturilor asupra fibroblastelor
Atacirct rezultatele obţinute icircn urma testului MTT cacirct şi rezultatele obţinute icircn urma testului
cu Calceină-AM au evidenţiat un comportament bun al suporturilor la contactul cu cele două linii
celulare (fibroblaste şi preosteoblaste) ceea ce a condus la concluzia că suporturilor sunt
biocompatibile in vitro
99
Capitol 3
Studii experimentale privind obţinerea de suporturi biomimetice pe bază de diferite
amestecuri de chitosan și biopolimeri (albumină acid hialuronic gelatină) și fosfați de calciu
cu incluziune de concentraţii diferite de particule magnetice
33 Concluzii
Icircn capitolul de față s-au obținut și caracterizat suporturi compozite pe bază de
biopolimeri și fosfați de calciu cu incluziune de concentrații diferite de particule magentice
Chitosanul unul din biopolimeri cei mai utilizați icircn ingineria tisulară și regenerarea osoasă a fost
combinat cu acid hialuronic albumină serică bovină sau gelatină
Analizacircnd structura chimică a suporturilor s-a observat icircn spectrele FTIR
prezența picurilor caracteristice tuturor componentelor introduse icircn sinteza Diferite tipuri de
fosfați de calciu au fost identificate icircn faza cristalină a suporturilor cel mai impotant dintre
aceștia fiind hidroxiapatita identificată icircn suportul Cs-G 3
Morfologia a fost studiată icircn secţiunea suporturilor imaginile evidenţiind o
porozitate ridicată a suporturilor precum şi formarea fosfaţilor de calciu pe structura polimerică
Particulele magnetice sunt complet integrate icircn structura compozită Dimensiunea minimă a
porilor a fost icircn jur de 300 microm iar dimensiunea maximă icircn jur de 2000 microm
Comparacircnd valorile obţinute pentru magnetizarea suporturilor cu datele de
literatură concentrația de 5 particule magnetice s-a dovedit a fi cea mai apropiată de datele
regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective De asemenea se poate afirma că suporturile sunt
superparamagnetice
Retenția fluidelor biologice simulate este influențată de morfologia suporturilor și
proprietățile hidrofile ale suporturilor iar viteza de degradare enzimatică in vitro este corelată cu
conținutul de fază polimerică
Testele de citotoxicitate in vitro indică faptul că suporturile obținute nu eliberează
substanţe citotoxice care să influenţeze negativ proliferarea celulară
100
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Capitolul 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub
formă uscată
Icircn ingineria tisulară a ţesutului osos polizaharidele (chitosan acid hialuronic) şi proteinele
(colagengelatină fibroină din mătase albumină) se numără printre cele mai utilizate
biomateriale pentru sinteza de suporturi [37]
Chitosanul ndash Cs este unul din cei mai utilizaţi biopolimeri icircn ingineria tisulară datorită
proprietăţilor sale remarcabile Numeroase studii prezintă rezultate foarte bune ale acestui
biopolimer icircn aplicaţii vizacircnd regenerarea şi repararea ososă [56 148 151 171] Colagenul ndash
Col este un alt biopolimer adesea utilizat icircn ingineria tisulară proprietăţile ce icircl recomandă
pentru ingineria tisulară a ţesutului osos icircn mod particular fiind osteoconductivitatea şi
biocompatibilitatea Asocierea cu fosfaţi de calciu ajută la o integrare foarte bună a unui suport
pe bază de colagen şi fosfaţi de calciu icircn ţesutul osos icircn studii in vivo [90] Acidul hialuronic ndash
Hya un alt biopolimer cu proprietăţi foarte bune ce susţine regenerarea tisulară la locul defectelor
osoase contribuind la formarea de calus Icircn aplicaţii pentru regenerarea osoasă acidul hialuronic
este combinat cu fosfaţi de calciu şi cu alţi biopolimeri [142 172]
Plecacircnd de la componentele matricei extracelulare a țesutului osos (60-70 componentă
anorganică 20-30 componentă organică și apă) cei trei biopolimeri mai sus menţionaţi au fost
amestecaţi cu fosfaţi de calciu din precursori Icircn sinteză a fost integrată şi o concentraţie de 5
particule magneticendash MNPs concentraţie stabilită icircn urma rezultatelor obţinute icircn capitolul 3 icircn
care au fost studiate trei concentraţii diferite de MNPs
41 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute printr-un procedeu biomimetic prin precipitarea de fosfați de
calciu (CP) din precursorii CaCl2 şi NaH2PO4 icircntr-o amestec de biopolimeri CsndashColndashHya
(chitosan ndash colagen ndash acid hialuronic) icircn prezenţă de soluţie apoasă de amoniacSoluţia de Cs
(1) a fost obţinută prin dizolvare de Cs purificat icircntr-o soluţie apoasă de HCl (15 ) Soluția
de Col (tip I + III) a fost obţinută de la LohmannampRauscher GmbH Germania Concentraţia de
Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză Icircnainte de
procesul de precipitare icircn soluția de polimeri CsndashColndashHya s-au adăugat 5 particule magnetice
101
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sub formă uscată (5 față de cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza
suporturilor) Soluţiile apoase de CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost adăugate peste
amestecul de soluţii de biopolimeri şi particule magnetice şi omogenizate prin agitarea mecanică
după care pH-ul soluţiei a fost adus la valoarea de 72-74 cu ajutorul soluţiei de NH4OH (25)
S-a urmărit menţinerea pH la valoare menţionată pentru 24 orePentru eliminarea compuşilor
nereacţionaţi amestecul final a fost spălat cu apă distilată prin centrifugare la 5000 rotații pe
minut timp de 10 minute etapă repetată de trei ori Ultima etapă icircn obţinerea suporturilor a fost
liofilizarea la temperatura de -55ordmC timp de 24 h Etapele procesului de obţinere sunt prezentate
icircn figura 41
Figura 41 Obţinerea suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat un program
experimental cu două variabile (concentrația de Col - raporată la concentrația de Cs
respectiv raportul CaP) Icircn tabelul 41 este prezentată codificarea variabilelor independente ale
programului experimental iar icircn tabelul 42 domeniile de variaţie precum şi codificarea
suporturilor (P1 - P13)
102
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Tabel 41 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 42 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Cod suport X1 X2 Col Cs CaP
P1 -1 -1 35 65 16
P2 1 -1 65 35 16
P3 -1 1 35 65 17
P4 1 1 65 35 17
P5 -1141 0 2879 7121 165
P6 1141 0 7121 2879 165
P7 0 -1141 50 50 1579
P8 0 1141 50 50 1721
P9 0 0 50 50 165
P10 0 0 50 50 165
P11 0 0 50 50 165
P12 0 0 50 50 165
P13 0 0 50 50 165
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii chimice utilizacircnd
analiza FTIR iar din punct de vedere al morfologiei prin SEM De asemenea s-au analizat
comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic degradarea acestora proprietăţile
mecanice și proprietăţile magnetice al suporturilor Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată
printr-un test MTT in vitro (contact indirect) şi in vivo pe şobolani Wistar
Deoarece orice suport ce se dorește a fi implantat icircn organismul uman trebuie sterilizat
icircnainte de implantare se urmărește realizare de suporturi care să nu-și modifice morfologia și
structura fizică şi chimică după sterilzare Icircn acest scop suporturile P5 P6 P7 P8 și P9 au fost
103
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru 4 ore Pentru suporturile sterilizate au
fost studiate morfologia și structura chimică
42 Rezultate și discuții
421 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR La fel ca icircn cazul
morfologiei suporturilor au fost analizate prin FTIR suporturile icircnainte şi după expunere la UV
pentru 4 ore
Icircn figura 42A se pot observa spectrele suporturilor P5 P6 P7 P9 şi a particulelor
magnetice ndash MNPs sub formă uscată icircnainte de expunere la UV iar icircn figura 42B spectrele
suporturilor P5 P6 P7 P8 P9 după expunere la UV
Structura chimică a MNPs a fost confirmată de prezenţa benzilor de absorbţie caracteristice
chitosanului gruparea -OH la 3431 cm-1
amida I la 1637 cmminus1
vibraţiei de icircntindere a legăturii
CndashN la 1384 cm-1
şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1072 cm-1
precum şi grupării FendashO
a magnetitei la 560 cm-1
[160]
Pe spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P9 (icircnainte de expunere la UV) au putut fi
identificate benzi de absorbţie caracteristice celor trei biopolimeri după cum urmează gruparea -
OH la 3429 cm-1
(P6) 3430 cm-1
(P7) 3431 cm-1
(P5 P9) gruparea ndashCH2 la 2924 cmminus1
(P5 P9)
şi la 2925 cm-1
(P6 P7) amida I la 1637 cmminus1
(P5) 1638 cm-1
(P9) 1653 cm-1
(P6) 1655 cm-1
(P7) amida II la 1555 cmminus1
(P7) 1563 cm-1
(P6) amida III la 1240 cmminus1
(P7 P9) 1242 cmminus1
(P5) 1246 cmminus1
(P6) şi vibraţiei de absorbţie a grupării CndashO la 1031 cmminus1
(P5 P7) 1032 cmminus1
(P9) 1035 cmminus1
(P6) Icircn cazul suportului P6 care conţine cea mai mare cantitate de colagen s-a
observat o intesitate mai mare a benzilor amidelor I II şi III după cum era de aşteptat Icircn plus icircn
toate spectrele s-a observat prezenţa picului asociat grupării COO- a hialuronatului de sodiu la
1405 cmminus1
(P7 P9) 1406 cmminus1
(P6) şi 1410 cmminus1
(P5) [173]
Benzile caracteristice magnetitei din particulele magnetice icircncorporate icircn suporturi au fost
observate la 561 cm-1
(P5 P7 P9) şi 562 cm-1
(P6) Icircn toate spectrele se pot observa picuri
specifice grupării fosfat PO43-
la 603 cm-1
(P5) şi 604 cm-1
(P6 P7 P9) Datorită faptului că
benzile caracteristice magnetitei sunt foarte aproape de cele caracteristice grupării fosfat
sugerează o suprapunere a acestora şi faptul că nu pot fi separate [99]
104
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 42 Spectrele FTIR ale suporturilor A icircnainte de expunere UV B după expunere UV
Icircn figura 42B sunt redate spectrele FTIR ale suporturilor P5 P6 P7 P8 şi P9 după
sterilizare prin expunere la radiaţii UV La fel ca icircn cazul suporturilor care nu au fost sterilizate
s-a observat prezenţa picurilor caracteristice celor trei biopolimeri a picurilor caracteristice
fosfaţilor de calciu şi a picurilor caracteristice particulelor magnetice la numere de undă
apropiate de cele ale picurilor caracteristice componentelor suporturilor nesterilizate ceea ce a
indicat faptul că procesul de sterilizare utilizat nu influenţează structura chimică a suporturilor
obţinute
105
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
422 Morfologia suporturilor
Datele SEM oferă informaţii importante despre suporturile realizate pentru ingineria
tisulară a ţesutului osos deoarece studiază morfologia lor aceasta avacircnd o influenţă
considerabilă asupra unor proprietăţi esenţiale ale suporturilor Morfologia a fost studiată icircn
secţiunea suporturilor Pentru o privire de ansamblu 5suporturi cu compoziţii diferite au fost
analizate la diverse ordine de mărire De asemnenea s-au analizat suporturi ce au fost expuse
pentru 4 ore la radiaţii UV pentru a vedea dacă acest proces de sterilizare influenţează
morfologia suporturilor
Icircn figura 43 sunt prezentate datele SEM ale suporturilor P5 P6 P7 şi P8 icircnainte de
expunere la UV iar icircn fugura 44 după expunere la UV la două ordine de mărire diferite Se
observă o structură poroasă tridimensională cu pori interconecaţi
Figura 43 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 icircnainte de expunere la UV
La ambele ordine de mărire s-a observat o distribuţie uniform a particulelor magnetice şi a
fosfaţilor de calciu icircn structura compozită polimerică Distribuţia uniformă a particulelor
magnetice se datorează procedeului de icircncorporarea directă a acestora icircn sinteză date
106
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
asemănătoare ce susţin acestă metodă de icircncorporarea fiind regăsite şi icircn alte studii din literatura
de specialitate
Figura 44 Morfologia suporturilor P5 P6 P7 P8 după expunere la UV
Comparacircnd imaginile din figura 43 cu cele din figura 44 nu s-au observat diferenţe de
morfologie a suporturilor aceaşi structură tridimensională poroasă fiind prezentă şi icircn acest caz
ceea ce indică faptul că procesul de sterilizare prin expunere la radiaţii UV pentru 4 ore nu
influenţează morfologia suporturilor pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice
423 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Pentru determinarea caracteristicilor de retenţie a fluidelor de interes biologic un fragment
de 5 mg din fiecare probă a fost imersat icircn PBS pH= 72 icircntr-o microcoloană (QIAquickreg
Spin
Colummn 50 diametru 10 mm) ataşată la o microseringă de 1 ml icircntreg sistemul fiind incubat la
37ordmC pentru 72 ore după care s-a calculat gradul de retenţie maxim utilizacircnd ecuaţia (14) din
capitolul 2 S-au analizat două fragmente din fiecare tip de suport şi s-a calculat deviaţia
standard Rezultatele obținute icircn urma acestui studiu sunt redate icircn figura 45
107
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Gradul de retenție al suporturilor preparate pentru aplicații icircn inginerie tisulară influențează
răspunsul suporturilor la difuziunea celulelor nutrienților și medicamentelor caracteristici foarte
importante pentru aplicația vizată [174]
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor ce
a fost observată pe imaginile SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei biopolimeri
utilizați icircn procesul de sinteză O parte din PBS este implicat icircn interacțiunea cu matricea
polimerică iar o altă parte este reținută fizic icircn porii suporturilor Cea mai mare valoare a
gradului de retenție a fost calculată pentru P7 suport ce are cel mai mic raport CaP = 1579 iar
una din cele mai mici valori ale gradului de retenţie a fost calculată pentru P8 suport ce are cel
mai mare raport CaP = 1721 ceea ce indică o influenţă semnificativă a raportului CaP asupra
retenţie de fluide biologice simulate Practic fosfaţi de calciu acoperă matricea polimerică
icircngreunacircnd pătrunderea soluţie PBS icircn interior
Figura 45 Gradul de retenție maxim PBS () pentru suporturile obținute
Se poate observa de asemenea că valorile gradului de retenție măsurate pentru suporturile
cu aceași compoziție teoretică sunt apropiate ceea ce indică reproductibilitatea metodei utilizate
pentru sinteza suporturilor
108
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
424 Degradarea enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat reacția cu enzime utilizacircnd lizozim și
colagenază Primul pas a fost imersarea a aproximativ 10 mg din fiecare probă icircn 5 mL soluţ ie de
PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de dializă
introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS Două mostre din fiecare probă au fost supuse degradării
Probele au fost apoi incubate la 37ordmC La intervale de 4 ore 48 ore 72 ore 7 zile și 14 zile de la
incubare un volum de 2 ml din fiecare probă a fost extras şi analizat din soluţia de PBS icircn care
este imersată membrana de dializă cu proba de analizat din punct de vedere al concentraţiei de
chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
4241 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la intervalele de timp mai sus
menţionate datele obţinute icircn urma studiului fiind redate icircn figura 46 Icircn toate cazurile s-a
observat o creștere a ratei de degradare icircn timp avantajul suporturilor biodegradabile icircn
comparaţie cu cele care nu se degradadează este resorbţia materialului icircn timp fiind astfel exclus
riscul de rejecţie a suportului de către organism
Suporturile P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri (65 Cs 35 Col) şi raport
CaP diferit P1 are raportul CaP = 16 iar P3 are raportul CaP = 17 Icircn cazul suporturile P2 şi
P4 a fost aceeaşi situaţie ca icircn cazul suporturilor P1 şi P3 au aceeaşi compoziţie de biopolimeri
(35 Cs 65 Col) diferenţa dintre ele fiind dată de raportul CaP P2ndash CaP = 16 P4ndash CaP =
17 Nu au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute pentru cele patru suporturi fiind
observată o degradare ce creşte gradual icircn timp
Icircn cazul suporturilor P7 şi P8 suporturi ce au cel mai mic raport CaP (1579) ndash P7 și cel
mai mare raport CaP (1721) ndash P8 şi aceeaşi compoziţie polimerică nu au fost observate
diferențe semnificative icircn ceea ce priveşte cantitatea de chitosan degradat la niciunul din cele 5
intervalele de timp Icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 care au aceeaşi compoziţie nu au fost
observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute icircn toate cazurile fiind observată o degradare
constatantă icircn timp
109
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 46 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturi
4242 Determinarea concentrației de colagen degradat
Rezultatele privind analiza concentraţia de colagen degradat au fost redate icircn figura 47 Icircn
cazul suporturilor P1ndash P4 s-a observat o legătură evidentă icircntre concentrația de colagen degradat
și compoziția polimerică a suporturilor
Icircn acest studiu pentru a determina viteza de degradare a suporturilor s-a utilizat colagenaza
bacteriană o enzimă specifică pentru degradarea in vivo a colagenului care hidrolizează
preferențial legăturile X-Gly icircn următoarele grupe de aminoacizi glicină-leucină (Gly-Leu)
glicină-izoleucină (Gly-Ile) alanin-prolină-glicină (Ala-Pro-Gly)
Icircn ceea ce privește concentraţia de colagen degradat pentru suporturile P5 ndash P9 s-a
observat şi icircn acest caz o legătură stracircnsă icircntre concentrația de colagen degradat și compoziția
polimerică a suporturilor cele mai mari valori fiind obţinute pentru suportul P6 ce conţine 7121
colagen şi doar 2879 chitosan şi cele mai mici valori pentu suportul P5 ce conţine 7121
chitosan şi 2879 colagen
La fel ca şi icircn studiul concentraţie de chitosan degradat icircn cazul suporturilor P9 ndash P13 nu
au fost observate diferenţe mari icircntre valorile obţinute ceea ce confirmă reproductibilitatea
metodei
110
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 47 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturi
425 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ egale iar după ce s-au
determinat dimensiunile au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii specificaţi icircn
capitolul 2 Pentru precizia rezultatelor 5 fragmente din fiecare suport au fost analizate Pentru
fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a calculat modulul lui Young iar
la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind prezentate grafic icircn figura 48
Oasele sunt organe rigide formate din ţesut osos măduvă osoasă endost periost cartilaj
nervi şi canale vertebrale Icircn funcţie de structura sa ţesutul osos este de două tipuri ţesut osos
compact (cortical) şi ţesut osos spongios (trabecular) Ţesutul osos compact este localizat la
suprafaţa osului şi după cum sugerează şi denumirea sa are o macrostructură omogenă şi
compactă Se găseşte la diafiza oaselor iar grosimea sa variază icircn funcţie de localizarea
anatomică Ţesutul osos spongios este o reţea de pori interconectaţi volumul de spaţiu gol fiind
cuprins icircntre 50 şi 90 şi este localizat icircn epifiza oaselor lungi
Cele două tipuri de ţesuturi spongios şi compact au o influenţă semnificativă asupra
proprietăţilor mecanice ale osului Scheletul uman este supus zilnic la diferite forţe icircn funcţie de
activităţile icircntreprinse forţele de tensiune forţele de compresiune şi forţele de forfecare fiind
cele care acţionează cel mai adesea asupra ţesutului osos Solicitările mai complexe cum ar fi de
111
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
exemplu icircncovoierea osului pot fi descompuse la racircndul lor icircn cele trei forţe menţionate
anterior Pentru a studia solicitările la care este supus ţesutul osos proprietăţile mecanice ale
osului cum sunt modulul de elasticitate (Young) rezistenţa la compresiune şi tensiunea trebuie să
fie pe deplin icircnţelese Icircn ceea ce priveşte modului lui Young notat cu E acesta are valori diferite
pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut osos astfel E este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru
ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru ţesutul osos spongios [168]
Figura 48 Modulul lui Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de
calciu cu incluziune de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young icircn cazul suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi
fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice au fost cuprinse icircntre 3841 MPa şi
22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător
valorilor Modulului Young al ţesutului osos spongios Asemănarea suporturilor obţinute cu
ţesutul osos spongios poate fi susţinută şi de datele SEM care au evidenţiat o structură poroasă
tridimensională
Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru suportul P5 suport ce are cea mai mare
cantitate de chitosan icircn compoziţie (7121 Cs 2879 Col) iar cea mai mică valoare s-a
obţinut pentru P2 unul din suporturile cu cea mai mică cantitate de chitosan (35 ) ceea ce
indică o icircmbunătăţire a rezistenţei la compresiune a suporturilor prin adăugare de chitosan icircn
sinteza suporturilor Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie P9 ndash P13 valorile obţinute
112
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
pentru E sunt apropiate ceea ce indică faptul că metoda de sinteza a suporturilor este
reproductibilă
426 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
S-a măsurat susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime
adimensională) utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13) din
capitolul 2 rezultatele obținute fiind prezentate icircn tabelul 43
Tabel 43 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire
suport
Susceptibilitate
magnetică (volum)
Magnetizarea
(emug)
P1 0160 middot e-4
1319
P2 0154 middot e-4
1269
P3 0135 middot e-4
1113
P4 0254 middot e-4
2093
P5 0160 middot e-4
1319
P6 0047 middot e-4
387
P7 0242 middot e-4
1995
P8 0112 middot e-4
923
P9 0257 middot e-4
2118
P10 0254 middot e-4
2093
P11 0432 middot e-4
3561
P12 0810 middot e-4
6676
P13 0514 middot e-4
4236
S-a observat că valorile obținute sunt cuprinse icircntre 387 şi 6676 emug amintind că s-a
introdus in sinteză o concentrație de 5 particule magnetice sub formă uscată (5 față de
cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor) ceea ce indică că
suporturile obţinute sunt superparamagentice
113
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
427 Testul MTT de citotoxicitatea in vitro
Pentru evaluarea biocompatibilităţii celulare s-a utilizat metoda contactului indirect
realizacircndu-se un extract din suporturile P5 şi P6 care icircn prealabil au fost sterilizate după aceeaşi
metodă descrisă icircn capitolul 3 subpunctul 327 Fragmentele de suporturi sterilizate au fost
ulterior imersate icircn 4 ml mediu de cultură DMEM și lăsate la agitare la 37ordmC pentru 24 ore icircn
vederea realizării extractului urmacircnd apoi filtrarea extractului printr-un filtru de 70 microm
măsurarea volumul final şi adăugarea a 10 BFS şi 1 PSN
Extractul a fost pus icircn contact cu două linii celulare diferite fibroblaste din derm uman
(NHDF Lonza) și preosteoblaste MC3T3 icircn placi de 96 godeuri 3000 celule godeuCele două
tipuri de celule au fost incubate separat pentru 24 ore icircn mediu de cultură DMEM complet
icircnlocuit după cele 24 ore cu 150 μl extract Testul MTT a fost realizat la 24 48 și 72 ore
calculacircndu-se viabilitatea celulară cu ajutorul ecuaţiei (7) din capitolul 2 rezultatele testului fiind
prezentate icircn figura 49 pentru contactul indirect al suporturilor cu fibroblaste şi icircn figura 410
pentru contactul indirect al suporturilor cu preosteoblaste
Figura 49 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu fibroblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea fibroblastelor s-a observat o uşoară creştere icircn timp a
acesteia pentru ambele suporturi analizate Icircn cazul suportului P5 valorile calculate pentru
viabilitate au fost cuprinse icircntre 964 şi 979 valori ce au sugerat lipsa unor efecte adverse
ale extractului asupra fibroblastelor deci suportul a fost considerat biocompatibil Pentru
114
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
suportul P6 s-au calculat valori uşor mai scăzute ale viabilităţii celulare icircntre 88 şi 924 dar
chiar şi aşa acestea s-au icircncadrat icircn limitele care au permis să se afirme că suportul este
biocompatibil
Figura 410 Viabilitatea celulară icircn urma contactului indirect al suporturile cu preosteoblaste
Icircn ceea ce priveşte viabilitatea preosteoblastelor s-au calculat valori mai mici decat icircn
cazul fibroblastelor S-a observat o tendinţă de scădere a viabilităţii icircn timp cea mai mică
valoare de 83 fiind calculată pentru suportul P6 Icircn cazul suportului P5 cea mai mică valoare
calculată a fost de 87 Rezulatele obţinute icircn urma contactului indirect cu preosteoblastele au
indicat faptul că suporturile nu au eliberat compuşi citotoxici acestea fiind biocompatibile
428 Citotoxicitate in vivo a suporturilor
Testele in vivo pentru determinarea citotoxicității s-au realizat pe femele icircn vacircrstă de 6
săptămacircni Animalele au fost grupate icircn 2 loturi lotul martor format din 9 șoareci a fost utilizat
ca bază de comparație pentru lotul cu implant (II) ndash suportul P9 compus din 18 șoareci Cu
excepţia celor de control tuturor celorlalţi li s-au implantat subcutanat fragmente de suporturi cu
dimensiunea 1 cm x 1 cm
Durata experimentului a fost de 21 de zile La finalul primelor 7 zile de experiment au fost
sacrificați 3 șoareci din lotul martor și 6 din lotul II Inițial animalele au fost supuse zilnic unei
observații clinice amănunțite pentru a depista eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca
115
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
urmare a intolerabilității implantului după care au fost sacrificate iar tesuturile adiacente
implantului au fost examinate histologic La fel s-a procedat si pentru ceilalți șoareci sacrificați
la 14 și respectiv 21 de zile
Preparatele au fost citite la microscop şi interpretate Macroscopic nu s-au remarcat
modificări locale evidente Microscopic pe probele de ţesut recoltat ce includeau implantul şi
ţesutul din jur imaginile au indicat o reacţie inflamatorie cronică uşoară infiltraţie limfoidă
difuză şi capsulă conjunctivă icircn jurul implantului La loturile testate suportul compozit a icircnfaţişat
aspecte de biodegradare superficială La lotul martor fals implantat unul din animale a dezvoltat
o reacţie inflamatorie uşoară cu infiltraţii limfocitare perivasculare restul secţiunilor au relevat
o vindecare normală a plăgii chirurgicale
După 7 zile de la implantare icircn jurul materialului implantat se remarcă un infiltrat
inflamator moderat reprezentat de leucocite neutrofile histiocite și macrofage (figura 411A)
Totodată icircn țesutul conjunctiv din jurul implantului se observă un infiltrat celular mononuclear
interfibrilar susținut de o congestie a capilarelor limitrofe ce se regăsește și icircn structura
materialului implantat (figura 411B) Structurile profunde ale pielii (dermul și hipodermul) nu
suferă modificări alterative Se remarcă o ușoară densificare a țesutului conjunctiv subcutanat
printr-o sporire a elementelor celulare (fibroblastele) și fibrilare (fibrele de colagen ) ale acestuia
(fugura 411C)
Figura 411 Examen histopatologic după 7 zile de la implantare Colorare tricromic Masson
După 14 zile de la implantare materialul implantat are o structură mai ldquoaerisitărdquo probabil
consecință a resorbției tisulare a unor constituienți Icircn jurul materialului implantat se observă o
veritabilă capsulă conjunctivă formată din țesut conjunctiv tacircnăr ce are tendința de sechestrare a
acestuia și care trimite scurte travei spre zona centrală a materialului implantat (figura 412A)
Se observă la periferia materialului implantat travei (septe) conjunctive pornite din capsula
116
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
conjunctivă periferică ce infiltrează materialul implantat remarcacircndu-se tendința de icircnglobare a
acestuia (figura 412B) icircntr-un țesut conjunctiv neoformat lax icircncă imatur reprezentat din
fibroblaste și fibre de colagen tinere (figura 412C)
Figura 412 Examen histopatologic după 14 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
După sacrificarea animalelor la 21 zile de la intervenția chirurgicală de implantare
subcutatantă macroscopic (figura 413A) nu există modificări locale evidente icircn structurile
cutanate din dreptul implantului la nici unul dintre animalele examinate histopatologic
Microscopic s-a observat un țesutul conjunctiv neoformat icircncă imatur dezorganizat
constituit din fibroblaste active și fibre de colagen cu un aranjament anarhic repezentat de
vacircrtejuri și cordoane (figura 414A) De asemenea au fost remarcate mici depozite de fosfat de
calciu sechestrate icircn masa conjunctivă neoformată (figura 414B) și septe conjunctive constituite
din țesut conjunctiv cu dispoziție diametrală și care străbat materialul implantat cu tendința de a-
l icircngloba
Figura 413 Analiza macroscopică a implantului
117
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
Figura 414 Examen histopatologic după 21 zile de la implantare Colorare tricomic Masson
Drept concluzie a studiilor in vivo ce au urmărit interacțiunile dintre suporturi și țesuturile
vii s-a remarcat o lipsă de citotoxicitate a implantului subcutanat susținută de absența oricărei
reacții locale sau sistemice de respingere
43 Concluzii
Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri și fosfați de calciu au fost obținute
prin precipitarea de fosfați de calciu din precursori CaCl2 și NaH2PO4 icircntr-un amestec de trei
biopolimeri cu proprietăți remarcabile pentru regenerarea osoasă Cs Col și Hya Un program
experimental a fost folosit pentru optimizarea metodei 13 suporturi fiind preparate P1 ndash P13 Icircn
sinteză a fost integrate o concentrație de 5 MNPs
Structura chimică a suporturilor precum și morfologia acestora au fost studiate și
pentru suporturi ce au fost expuse la radiații UV timp de 4 ore procedeu utilizat icircn unele aplicații
biomedicale pentru sterilizare
Benzi de frecvență caracteristice biopolimerilor CP și MNPs au fost observate icircn
toate spectrele FTIR Nu au fost observate diferențe icircntre spectrele suporturilor expuse la radiații
UV și cele normale ceea ce icircnseamnă că acest proces de sterilizare nu influențează structura
chimică a suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată icircn secțiune cu ajutorul SEM S-a remarcat
o structură poroasă a suporturilor cu CP și MNPs distribuite uniform pe scheletul polimeric
Distribuția uniform a MNPs este atribuită procedeului de icircncorporare direct a acestora icircn etapa de
118
Capitol 4 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă uscată
sinteză La fel ca icircn cazul structurii chimice radiațiile UV nu infleunțează morfologia
suporturilor astfel acest proces de sterilizare poate fi utilizat pentru testele in vitro și in vivo
Determinarea gradului de retenție PBS s-a realizat utilizacircnd o metodă
volumetrică valorile obținute după 72 ore de la interacțiunea suportului cu fluidul la 37degC
indicacircnd o influență semnificativă a raportului CaP asupra proprietății studiate
Pentru studiile de degradare in vitro s-a studiat interacțiunea cu un complex de
două enzime lizozim și colagenază enzime implicate in vivo icircn procesele de degradarea a
chitosanului respectiv colagenului Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul
ambilor biopolimeri
Modului lui Young are valori diferite pentru fiecare din cele două tipuri de ţesut
osos este cuprins icircntre 7 şi 30 GPa pentru ţesutul osos compact şi icircntre 002 şi 05 GPa pentru
ţesutul osos spongios Valorile obţinute icircn cazul suporturile preparate au fost cuprinse icircntre 3841
MPa şi 22671 MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul corespunzător modulului Young al
ţesutului osos spongios
Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor
Teste de citotoxicitate in vitro realizate icircn paralel pe două linii celulare diferite
fibroblaste și osteoblaste au indicat faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra celulelor
Caracterul non-citotoxic al suporturilor a fost evidențiat și in vivo după ce fragmente de
suporturi au fost implantate subcutanat la șoareci După 21 zile aceștia au fost sacrificați iar
fragmentele de țesut cu implant au fost analizate macroscopic și microscopic
119
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Capitolul 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen
acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de
particule magnetice
Avacircnd icircn vedere proprietăţile biopolimerilor Cs Col şi Hya descrise icircn amănunt icircn
capitolele anterioare precum şi procedeul biomimetic de co-precipitarea de fosfați de calciu (CP)
din precursori CaCl2 şi NaH2PO4 un lot nou de suporturi a fost realizat conform metodei de
obţinere utilizate icircn capitolul 4 diferenţa dintre acest lot de suporturi şi lotul de suporturi
descrise icircn capitolul 4 fiind dată de modalitatea de incluziune a particulelor magnetice icircn etapa
de sinteză a suporturilor icircn cazul lotului din capitol 4 particulele au fost incorporate sub formă
uscată iar icircn cazul acestui lot particulele au fost icircncorporate sub formă de suspensie coloidală
51 Obţinerea suporturilor
Suporturile au fost obţinute prin acelaşi procedeu biomimetic utilizat icircn capitolul 4 Icircn
acest scop soluţii de precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost
amestecate cu soluţii de biopolimeri Cs (1) Col (1) Hya (1) şi 5 suspensie coloidală de
MNPs icircn apă (raportată la cantitatea totală de substanță uscată introdusă icircn sinteza suporturilor)
pH-ul amestecului a fost apoi ajustat la 72-74 utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac iar după
spălare cu apă distilată pentru eliminarea compuşilor nereacţionaţi amestecurile au fost
liofilizate pentru 24h
Icircn vederea determinării compoziției optime a suporturilor s-a utilizat şi de această dată
acelaşi program experimental cu două variabile (concentrația de Col - raportată la
concentrația de Cs respectiv raportul CaP) utilizat icircn capitolul 4 Icircn tabelul 51 este
prezentată codificarea varabilelor programului experimental iar icircn tabelul 52 sunt prezentate
domeniile de variaţie precum şi codificarea suporturilor (S1 - S13)
Utilizacircnd ecuației (3) din capitolul 2 s-au determinat valorile variabilelor investigate din
programul experimental icircmpreună cu răspunsurile obținute Coeficienţii de regresie au fost
determinaţi si sunt prezentaţi icircn tabelul 53 alături de coeficienți de corelație și de abatere
standard Variabila răspuns Y1 corespunde gradului de retenție PBS a suporturilor preparate ()
iar Y2 corespunde modului de elasticitate E (MPa) ndash tabel 54
120
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 51 Codificarea variabilelor independente
Valori -1414 -1 0 1 1414
Col (X1
raportat la Cs ) 2879 35 50 65 7121
CaP (X2) 1579 16 165 17 1721
Tabel 52 Valorile teoretice pentru compoziția suporturilor
Codificare
Support X1 X2 Col Cs CaP
S1 -1 -1 35 65 16
S2 1 -1 65 35 16
S3 -1 1 35 65 17
S4 1 1 65 35 17
S5 -1141 0 2879 7121 165
S6 1141 0 7121 2879 165
S7 0 -1141 50 50 1579
S8 0 1141 50 50 1721
S9 0 0 50 50 165
S10 0 0 50 50 165
S11 0 0 50 50 165
S12 0 0 50 50 165
S13 0 0 50 50 165
Tabel 54 Eroarea asimetrică coeficienţii de corelare si de regresie determinați
a1 a2 a3 a4 a5 a6 COR ASE
Y1 0256534 0006965 0001565 -0033 -000592 -004559 0980261 0024421
Y2 894655 8300833 -204625 486659 -394375 9217909 0986554 7447254
121
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 54 Programul experimental icircmpreună cu valorile determinate pentru retenție PBS
() și E (MPa)
Codificare
suport X1 X2 Y1 ndash Retenție PBS () Y2 ndash E (MPa)
S1 -1 -1 121714plusmn21973 20925plusmn32
S2 1 -1 109649plusmn32378 27947plusmn22
S3 -1 1 239234plusmn17309 12001plusmn34
S4 1 1 163522plusmn10871 16201plusmn24
S5 -1141 0 138888plusmn24263 8668plusmn33
S6 1141 0 100628plusmn20724 12261plusmn29
S7 0 -1141 109091plusmn22104 9038plusmn21
S8 0 1141 121213plusmn5471 8372plusmn12
S9 0 0 138889plusmn18159 7628plusmn32
S10 0 0 138960plusmn18209 7873plusmn12
S11 0 0 146019plusmn1502 8089plusmn24
S12 0 0 141067plusmn10022 7942plusmn8
S13 0 0 141844plusmn9215 8034plusmn32
Suporturile biomimetice pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu cu incluziune de
particule magnetice au fost caracterizate din punct de vedere al structurii şi compoziţiei utilizacircnd
spectroscopia IR cu transformare Fourier (FTIR) spectroscopia de raze X prin dispersie de
energie (EDS) şi difracţie cu raze X (XRD) Din punct de vedere al morfologiei au fost
caracterizate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM) și prin micro computer-tomografie
(microCT) De asemenea s-au analizat comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora proprietățile mecanice și proprietățile magnetice Citotoxicitatea
suporturilor a fost analizată printr-un test MTT in vitro (contact direct) şi in vivo pe şoareci din
linia CD1
Suporturile S7 S8 și S9 au fost sterilizate prin expunere la radiații ultraviolete (UV) pentru
4 ore şi au fost studiate morfologia și structura lor chimică cu scopul de a observa influenţa
porcesului de sterilizare asupra carcteristicilor menţionate
122
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
52 Rezultate și discuții
521 Structura chimică a suporturilor
Datele obţinute icircn urma analizei FTIR oferă informaţii despre structura suporturilor
Suporturile au fost analizate icircnainte şi după expunere la UV pentru 4 ore rezultatele fiind redate
icircn figura 51 S-au observat picuri pentru cei trei biopolimeri (Amide I C=O Amide II N-H
funcțiile OH grupari alifatice) fosfații de calciu (PO3-
4 la 563 cm-1
) și nanoparticule magnetice
[99 175]
Figura 51 Spectrele FTIR pentru suporturile S7 S8 S9
A icircnainte de expunere la UV B după expunere la UV
Benzile reprezentative pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 55 După cum se poate
observa benzile reprezentative pentru suporturile expuse la UV au valori foarte apropiate sau
chiar identice cu cele ale suporturilor care nu au fost expuse la UV ceea ce icircnseamnă că
123
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
radiațiile UV nu influențează structura chimică a acestora chiar și după o periadă mare de timp
(4 ore)
Tabel 52 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S1 și S3
IcircIcircnainte de expunere la UV DuDupă expunere la UV
Grupări
funcționale
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S7
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S8
Benzile reprezentative
(cm-1
) ndash S9
OH 3421 3418 3409 3421 3419 3415
C-H 2937 2936 2934 2937 2942 2936
Amida I
C=O 1653 1659 1655 1655 1652 1655
Amida II
N-H 1556 1556 1552 1557 1556 1552
C-O 1030 1031 1030 1031 1030 1030
Fe-O 603 603 602 603 603 602
PO3_4
561 561 560 561 561 561
522 Compoziția suporturilor
Icircn figura 52 este redată difractograma XRD pentru suporturile S7 S8 și S9 Picurile
caracteristice specifice fosfaţilor de calciu ce pot fi associate planelor (002) (210) (112) (213)
și (004) unei celule cubice elementare (JCPDS file PDF No 65-3107) și unghiurile cu care
acestea sunt corelate sunt redate icircn tabelul 56 [176]
Figura 52 Spectrul XRD pentru suporturile S7 S8 și S9
124
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 56 Diferite forme de CP prezente icircn suporturile analizate conform JCPDS
Unghi 2ϴ (deg) Intensitate (ua) Index conform JCPDS Formula chimică
26 002 44-0778 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
28 210 44-0810 Ca3H2(P2O7)2 ∙ H2O
31 112 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
49 213 72-1243 Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2
53 004 02-1350 CaHPO4
Icircn figura 53 este redat spectrul EDS pentru suportul S5 Numărul atomic pentru Ca a fost
292 iar pentru P a fost 148 ceea ce a indicat un raport CaP= 197 această valoare fiind
apropiată de valoare raportului CaP al fosfatului tertacalcic (TTCP) ndash Ca4(PO4)2O care este 200
[177]
Figura 53 Spectrul EDX pentru suportul S5
523 Morfologia suporturilor
Porozitatea caracterizată drept procentul de spaţiu gol dintr-un solideste una din cele mai
importante caracteristici ale unui suport realizat pentru aplicaţii icircn ingineria tisulară şi
regenerarea ţesutului osos Porozitatea unui suport este influenţată de natura materialelor din
compoziţia sa precum şi de procesul de obţinere Un suport pentru regenerarea osoasă trebuie să
susţină migrarea şi proliferarea osteoblastelor şi a celulelor mezenchimale să permită
pătrunderea vaselor de sacircnge şi angiogeneza iar icircn final să contribuie la formarea de neoţesut
[178] Porozitatea unui suport influenţeză o serie de alte caracteristici esenţiale pentru un suport
125
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
realizat pentru aplicaţia menţionată anterior cele mai semnificative fiind biodegradabilitatea şi
proprietăţile mecanice
Rezultatele SEM sunt prezentate icircn figura 54 Figura 54A reprezintă suporturile S7 S8
S9 icircnainte de expunere la radiații UV iar figura 54B aceleași suporturi după expunere la
radiații UV La 500 microm se poate observa o structură poroasă a suporturilor şi icircncorporarea
particulelor magnetice și a cristalelor de calciu icircn matricea polimerică şi faptul că nu există
diferențe icircntre suporturile sterilizate și cele nesterilizate
Figura 54 Morfologia suporturilor S7 S8 S9 A Icircnainte de expunere la UV B După expunere
la UV
Pentru un studiu mai detaliat al morfologiei suporturilor fragmente din acestea au fost
scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi o
rotaţie de 05ordm Proiecţiile astfel obţinute au fost procesate şi reconstruite utilizacircnd programul
NRecon (Bruker Belgium) Trei regiuni de interes au fost selectate pentru fiecare proba iar
programul CTAn a fost utilizat pentru calcularea dimensiunii porilor precum şi dimaterului de
percolaţie Pentru calcularea porozităţii s-a utilizat metoda ldquosphere-fittingrdquo regasită icircn aplicaţia
BatMan a programului CTAn Pentru calcularea diametrului de percolaţie s-a utilizat metoda
126
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
descrisă de Ashworth şi colab [179] Pe scurt metoda ldquoshrink wraprdquo a fost aplicată pentru a
identifica volumul accesibil unui obiect virtual care poate penetra icircntreaga regiune de interes
utilizacircnd urmatoare ecuaţie
(16)
unde este o constantă de percolaţie egală cu 088 pentru sistemele 3D [180]
Vizualizarea distribuţiei porilor a fost efectuată utilizacircnd programul CTVox (Bruker
Belgium) Astfel o funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste
reconstrucţia 3D a probei de investigat iar un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare
Suportul care are cea mai mare dimensiune a porilor a fost suportul S7 iar suportul cu cea
mai mică dimensiune a porilor a fost suportul S8 Aceste două suporturi sunt practic suporturile
cu cel mai mic raport CaP ndash S7 (CaP = 1579) şi cel mai mare raport CaP ndash S8 (CaP = 1721)
ceea ce a indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra porozităţii
suporturilor Icircn ceea ce priveşte comparaţia porozităţii suporturilor din punct de vedere al
compoziţiei de biopolimeri s-a observat o dimensiune mai mare a porilor suportului S6
(conţinacircnd un raport mai mare de colagen)
Figura 55 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suporturile S6 S7 S8 S9
127
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn tabelul 57 sunt prezentate date despre dimensiunea şi distribuţia porilor (prezentate şi
icircn figura 55) volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
Tabel 57 Dimensiunea porilor suporturilor S5 S6 S7 S8
Denumirea
suportului
Dimensiunea
porilor (microm)
Volumul
regiunii de interes (mm3)
Aria regiunii de
interes (mm2)
S6 2121plusmn9091 222051 1027245
S7 27341plusmn10952 200577 955451
S8 13309plusmn6785 255724 1139832
S9 1388plusmn5284 316728 1343793
524 Proprietăţilor mecanice ale suporturilor
Suporturile au fost analizate icircn aceleaşi condiţii experimentale ca şi suporturile prezentate
icircn capitolul 4 Icircntr-o primă etapă suporturile au fost tăiate icircn fragmente rectangulare aproximativ
egale s-au determinat dimensiunile şi au fost supuse testului de compresiune folosind parametrii
specificaţi icircn capitolul 2 Pentru fiecare fragment s-a calculat forţa de compresiune după care s-a
calculat modulul Young iar la sfacircrşit s-a făcut media rezultatele fiind redate icircn figura 56 și icircn
tabelul 53
Figura 56 Modulul Young (MPa) pentru suporturile pe bază de CsndashColndashHya şi fosfaţi de calciu
cu incluziune suspensie coloidală de particule magnetice
0
50
100
150
200
250
300
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13
20925
27947
12001
16201
8668
12261
9038 8372 7628 7873 8089 7942 8034 E (
MP
a)
128
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile obţinute pentru modulul lui Young au fost cuprinse icircntre 7628 MPa şi 27947
MPa valori ce se icircncadrează icircn intervalul 002 ndash 05 GPa (20 ndash 500 MPa) corespunzător valorilor
Modulului Young al ţesutului osos spongios interval icircn care s-au icircncadrat şi valorile obţinute
pentru suporturile caracterizate icircn capitolul 4 Cea mai mare valoare a lui E s-a obţinut pentru
suportul S2 avacircnd următoarea compoziţe 35 Cs 65 Col şi raportul CaP = 16 iar cea mai
mică valoare s-a obţinut pentru suportul S9 avacircnd următoarea compoziţe 50 Cs 50 Col şi
raportul CaP = 165 Icircn cazul suporturilor avacircnd aceaşi compoziţie S9 ndash S13 valorile obţinute
pentru E au fost apropiate ceea ce indică că metodă poate fi considerată reproductibilă din punct
de vedere al proprietăților mecanice Analizacircnd valoarea lui E din punct de vedere al influenţei
raportului CaP deci comparacircnd suporturile S7 (CaP = 1579 50 Cs 50 Col) cu S8 (CaP
= 1721 50 Cs 50 Col) s-au observat valori apropiate ale lui E de unde se poate
concluziona că raportul CaP nu influențează proprietățile mecanice ale suporturilor
525 Proprietăţi magnetice ale suporturilor
Proprietăţile magnetice ale suporturilor sunt prezentate icircn tabelul 58 S-a măsurat
susceptibilitatea magnetică de volum a suporturilor notată cu χm (mărime adimensională)
utilizacircnd balanţa de susceptibilitate magnetică Sherwood Scientific MSB Auto
Tabel 58 Proprietăţile magnetice ale suporturilor
Denumire suport
Susceptibilitate magnetică (volum)
Magnetizarea (emug)
S1 0295middot e-4
2431
S2 0382middot e-4
3148
S3 0414middot e-4
3412
S4 0304middot e-4
2505
S5 0272middot e-4
2241
S6 0439middot e-4
3618
S7 0476middot e-4
3923
S8 0399middot e-4
3288
S9 0539middot e-4
4442
S10 0749middot e-4
6173
S11 061middot e-4
5027
S12 0703middot e-4
5794
S13 0817middot e-4
6733
129
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Valorile indicate de dispozitiv au ajutat la calculul magnetizării M utilizacircnd ecuaţia (13)
din capitolul 2 Valorile obţinute cuprinse icircntre 2241 şi 6733 emug indică faptul că suporturile
obținute sunt superparamagnetice
526 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Valorile gradului de retenție obținute pentru suporturi sunt prezentate icircn tabelul 53 și
figura 57 Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a
suporturilor dovedită de datele SEM precum și de proprietățile hidrofile ale celor trei
biopolimeri utilizați la fabricarea suporturilor
Figura 57 Grad de retenţie PBS
Se poate afirma că o parte din PBS interacționează cu matricea polimerică iar o altă parte
este reținută fizic icircn porii suporturilor Inițial icircn PBS moleculele de H2O intră icircn suporturi prin
1579
165
1721
900
1200
1500
1800
2100
2400
287
9
37
27
45
75
542
3
627
1
712
1
CaP
GR
(
)
Colagen ()
2100-2400
1800-2100
1500-1800
1200-1500
900-1200
130
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
pori pentru a umple spațiile interne Pe de altă parte numărul de grupuri polar este de asemenea
un factor important care afectează hidrofilia materialului [181] Adăugarea de fosfați de calciu
icircn compoziția suporturilor duce la o scădere a gradului de retenție
527 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Pentru studiile de degradare in vitro s-a utilizat degradarea enzimatică utilizacircnd un amesctec
de două enzime lizozim și colagenază Metoda de lucru utilizată a fost aceeaşi ca cea utilizată pentru
degradarea suporturilor obţinute şi caracterizate icircn capitolul 4 10 mg din fiecare probă s-a imersat icircn
5 ml soluţie de PBS cu lizozim (1200 μgml) și colagenază (100 μgml) aflată icircntr-o membrană de
dializă introdusă apoi icircn 10 ml din acelaşi PBS după care au fost incubate la 37degC La anumite
intervale de timp s-a extras şi analizat un volum din cei 10 ml PBS din punct de vedere al
concentraţiei de chitosan degradat şi din punct de vedere al concentraţiei de colagen degradat
5271 Determinarea concentrației de chitosan degradat
Concentraţia de chitosan degradat a fost analizată la 2 ore 48 ore 7 zile şi 14 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate icircn figura 58
Figura 58 Concentraţia de chitosan degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Comparacircnd valorile obținute nu s-a observat o dependență clară a vitezei de degradare a
concentrația de chitosan chiar dacă toate materialele sunt degradate treptat Comportamentul se
0
02
04
06
08
1
S5 S6 S7 S8 S9
(Conce
ntr
ați
e ch
itosa
n d
egra
dat)
middot100
m
moli
L
2 ore 48 ore 7 zile 14 zile
131
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
datorează interacțiunilor ionice ale chitosanului cu colagenul și fosfații de calciu care modifică
conformația situsului de legare pentru lizozim [182]
5272 Determinarea concentrației de colagen degradat
Concentraţia de colagen degradat a fost analizată la 4 ore 48 ore 72 ore şi 7 zile datele
obţinute icircn urma studiului fiind prezentate sub formă de grafic
Figura 59 Concentraţia de colagen degradat pentru suporturile S5 ndash S9
Hidrolizarea colagenului din suporturi de către colagenază enzima implicată icircn procesul de
degradare al acestei proteine in vivo are două etape Icircntr-o primă etapă enzima se atașează la
suport și apoi rupe locurile specifice care corespund structurilor de aminoacizi pentru care
enzima are specificitate Condițiile de mediu (pH tărie ionică inhibitori de enzime) și
caracteristicile materialelor (compoziție structură supramoleculară și porozitate) sunt parametri
care dictează viteza de degradare și biointegrarea controlată a suportului Toate suporturile au
fost degradate icircn timp cu vitezediferite
0
005
01
015
02
025
S5 S6 S7 S8 S9
Con
centr
aţi
a d
e co
lagen
deg
rad
at
mm
oli
L
4 ore 48 ore 72 ore 7 zile
132
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
528 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
5281 Testul MTT
Citotoxicitatea in vitro a suporturile obținute a fost analizată utilizacircnd un test MTT test ce
a oferit informații despre viabilitatea a trei linii diferite de celule fibroblate celule STEM și
osteoblaste la contactul direct cu fragmente de suporturi
Rezultatele prezentate icircn figura 510 indică lipsa citotoxicităţii suporturilor asupra
fibroblastelor valorile viabilităţii celulare fiind mai mari de 80 pentru toate cele trei suporturi
S7 S8 S9 şi pentru toţi cei trei timpi de contact
Icircn urma contactului direct al suporturilor S1 S3 S13 pentru 24 ore 48 ore respectiv 72
ore cu celule stem rezultate redate icircn figura 511A s-au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce
cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de 97 (S1) 98 (S13) și 99 (S3) ceea ce indică a
foarte bună biocompatibilitate a probelor
Figura 510Viabilitatea fibroblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile S7 S8 S9
Suporturile S1 S3 şi S13 au fost puse icircn contact direct şi cu osteoblaste rezultate fiind
redate icircn figura 511B dar rezulatele obţinute icircn acest caz nu sunt la fel de bune ca icircn cazul
contactului direct cu celulele stem osteoblastele fiind celule cu o sensibilitate ridicată Teste
suplimentare sunt necesare icircn acest caz
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
()
Control S7 S8 S9
133
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Figura 511 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile S1 S3 S13
A Utilizacircnd celule stem B Utilizacircnd osteoblaste
5282 Testul de viabilitate celulară cu Calceină-AM
Pentru a confirma icircncă o dată lipsa de citotoxicitate suporturile la contactul direct cu
celulele stem s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-AM rezultatele obţinute
fiind prezentate icircn figura 512
Figura 512 Viabilitatea celulelor STEM icircn contact cu suporturile S1 şi S3
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
cel
ula
ră
Control S1 S3 S13 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elula
ră
Control S1 S3 S13 B
134
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu
suporturile S1 şi S3 atacirct la 24 ore cacirct şi la 96 ore ce ce confirmă icircncă o dată faptul că suporturile
nu eliberează compuși citotoxici și totodată structura lor nu influențează negativ activitatea
celulelor stem
529 Citotoxicitatea in vivo a suporturilor
La fel ca icircn capitolul 4 citotoxicitatea in vivo a suporturilor din acest lot a fost studiată pe
șoareci femele din linia CD1 icircn vacircrstă de 6 săptămacircni și cu greutatea medie de 28 plusmn 30 grame
icircntr-o stare de icircntreţinere foarte bună găzduițiți icircn condițiile adecvate
Pentru implant materialele au fost secționate sub forma unor discuri cu diametrul de 15
mm (A=17671 mm2) apoi au fost sterilizate prin expunerea la radiații ultraviolete timp de 10
minute Animalele au fost grupate icircn 3 loturi lotul 7 (corespunzător suportului S7) lotul 8
(corespunzător suportului S8) și lotul 9 (corespunzător suportului S9) fiecare lot cuprinzacircnd un
număr de 12 animale
Animalele au fost supuse la o intervenție chirurgicală de implantare subcutanată descrisă
icircn capitol 2 subcapitolul 248 Durata studiului a fost de 64 de zile La finalul primelor 48 ore de
experiment au fost sacrificați cacircte 3 șoareci din fiecare lot (7 8 9) apoi cacircte alți 3 din fiecare lot
la intervale de 12 34 respectiv 64 de zile
Inițial animalele au fost supuse zilnic unei observații clinice amănunțite pentru a depista
eventuale modificări tisulare ce se pot dezvolta ca urmare a respingerii implantului după care au
fost eutanasiate prin administrarea unei supradoze de izofluran Zona de implant a fost deschisă
chirurgical fără a leziona excesiv țesutul Țesuturile adiacente au fost examinate macroscopic
fiind apreciate modificările din zona de implant (porțiunea centrală a implantului) și din jurul
acesteia respectiv prezența hemoragiei necrozei infecției și modificarea culorii țesutului
Histologic fiecărui șoarece i s-au recoltat probe de țesut din zona de implant și adiacentă
acesteia pentru a evalua populația de celule din jurul implantului Aceste probe au fost fixate icircn
formol 10 apoi incluse la parafină colorate Tricromic Masson și examinate microscopic
Pentru suporturile din acest lot deoarece durata experimentului a fost mai mare s-a evaluat
gradul de icircncapsulare a materialelor (granulom de corp străin) măsuracircnd grosimea capsulei de la
periferia spațiului ocupat de implant pacircna la marginea exterioară a acesteia Scorul icircncapsulării a
fost realizat conform recomandărilor ISO Standard 10993 prezentate icircn tabelul 59
135
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Tabel 59 Scorul icircncapsulării
Capsulă Scor
Absentă 0
gt 05 mm 1
06 ndash 10 mm 2
11 ndash 20 mm 3
gt 20 mm 4
Cerințele testului sunt icircndeplinite dacă diferențele dintre scorul mediu al animalelor din lot
este lt 10 mm
Icircn urma observațiilor clinice nu se observă modificări ale țesuturilor adiacente implantului
integritatea pielii nu este modificată nu sunt prezente semne de turgescență icircnroșire erupție sau
piloerecție La racircndul lor datele histologice susțin ipoteza biocompatibilității compozitului pe
baza de polimeri și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice
Figura 513 Suportul S7 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
Icircn cazul bioimplanturilor diferite tipuri de celule interacționează și conduc la răspunsuri
specifice iar icircnțelegerea acestor mecanisme ne conduc către realizare unor suprafețe de implant
136
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
cu o mult mai mare compatibilitate cu structurile biologice Fiecare implant ne-natural induce un
răspuns inflamator acutdin partea organismului dar nu răspunsul icircn sine este important ci
icircntinderea și intensitatea sa Prin urmare orice test de biocompatibilitate a unui anumit material
trebuie să se bazeze pe evaluarea populației de celule din jurul implantului
Markeri importanți pentru biocompatibilitate sunt tipurile de celule care apar după
implantarea materialului străin Icircn literatura de specialitate nu este clar dacă prezența celulelor
gigant de corp străin marchează o incompatibilitate a biomaterialului sau dacă acestea denotă un
comportament de degradare normală a materialelor biomaterialelor resorbabile [183] Orice
biomaterial implantat este recunoscut de către organism ca un rdquonon selfrdquo Icircn mod obișnuit toate
biomaterialele implantate icircn țesutul conjunctiv induc un răspuns din partea gazdei proces
inflamator acut a cărei formă de manifestare și intensitate diferă
Figura 514 Suportul S8 la 48 ore 12 zile 34 zile și 64 zile post-implantare
Col tricromică Masson
După Hench și Best dacă biomaterialul este (I) toxic țesuturile din jur mor (II) netoxic și
biologic inactiv (aproape inert) apare un țesut fibros de formă și grosime variabilă (III) netoxic
și biologic activ (bioactiv) se produce o legătură interfacială stracircnsă material-structură biologică
(IV) netoxic și se dizolvă țesuturile din jur icircl icircnlocuiesc [184] Amplitudinea și durata
137
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
procesului inflamator are o influență determinantă asupra stabilității și compatibilității
biomaterialului implantat [185]
Figura 515 Suportul S9 la 48 ore 12 zile și 64 zile post-implantare
Reacția organismului este evidentă icircn primele 48 de ore de la implantare manifestată
printr-un proces inflamator accentuat la materialele 7 și 8 și mai redus ca intensitate icircn cazul
suportului S9 Se constată un aflux celular semnificativ reprezentat de macrofage neutrofile
leucocite rare limfocite fibroblaste și fibre de colagen Infiltratul inflamator a fost mai redus
caracterizat prin prezența de rare leucocite neutrofile și macrofage la S9
La 10 zile de la prima evaluare (12 zile de la debutul experimentului) la suporturile S7 și
S8 reacția fibroasă periferică este mai intens exprimată prin fiboblaste și fibre de colagen cu
orientare concentrică Infiltratul inflamator este reprezentat de macrofage limfocite histiocite și
fibroblaste La suportul S9 se icircnregistrează o proliferare fibroasă cu tendință de icircnglobare a
materialului Reacție giganto-celulară cu celule gigante de corp străin icircn ale căror citoplasme se
pot observa particule fagocitate din biomaterial Primele celule care se atașează materialului de
implant sunt fibroblastele Ele produc un colagen imatur observabil pe suprafața implantului
[186]
Prezența fibrelor de colagen și a fibroblastelor este considerată o reacție tisulară normală
Icircn acest strat (fibrinos) prezența de macrofage și neutrofile joacă un rol important icircn
138
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
transformarea implantului icircntr-un material biologic recunoscut și acceptat de către organism
[187]
Prezența macrofagelor inclusiv dezvoltarea țesutului de granulație este un răspuns firesc din
partea organismului ca parte a comportamentului normal de degradare a materialelor cel puțin
icircn cazul biomaterialelor degradabile [188]
De asemenea macrofagele modulează reacția tisulară prin producerea de interleukine
factori de creștere și alți agenți bioactivi precursori ai celulelor gigant de corp străin [189]
Interacțiunea macrofage-limfocite este una complementară Probabil adeziunea macrofagelor la
o suprafață este semnalul pentru activarea limfocitelor iar prezența limfocitelor influențează la
racircndul lor activitatea macrofagelor [190] și fuziunea [191]
Următoarea etapă a răspunsului gazdei este marcată de atracția monocitelor și acțiunea
mastocitelor cu eliberarea de histamină [192] Această reacție este unică și nu pare să depindă de
tipul de implant Amploarea reacției și grosimea stratului inflamator (index pentru
biocompatibilitate) depinde de natura chimică și topografia implantului Anderson consideră că
prezența celulelor mononucleare inclusiv limfocite și celule plasmatice este considerată
inflamație cronică icircn timp ce reacția la corp străin cu dezvoltarea țesutului de granulație este
considerată un proces de videcare normal a unei răni ca răspuns la implantul de biomateriale La
34 de zile de la implant icircn cazul tuturor celor trei suporturi se observă o tendință de icircnglobare
tisulară a acestora prin invazie conjunctivă (scorul mediu al icircncapsulării a fost de 1 sub 05 mm)
și un infiltrat inflamator redus Este un proces normal de invazie a fibroblastelor și de sinteză a
matricei extracelulare prin acești fibroblaști activi Se termină icircntr-un strat interior de macrofage
șisau celule de corp străin cu o zonă secundară icircn afara fibroblaștilor și țesutului conjunctiv care
icircnconjoară materialul de implant [193]
După 64 de zile de la implantare se icircnregistrează o tendință evidentă de asimilare și
resorbție a celor trei tipuri de biomateriale și delimitarea acestora icircn insule mici izolate de țesut
fibros Răspunsul organismului icircn cazul celor trei tipuri de materiale a fost unul normal
caracterizat printr-o reacție inflamatorie acută a cărei intensitate s-a redus după primele 48 de
ore Grosimea capsulei fibroase este sub 05 mm (scor 1) aspect care influențează icircn mod pozitiv
degradarea și resorbția materialului icircn timp acestea făcacircdu-se ușor și fără o reacție celulară
semnificativă
139
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
53 Concluzii
Utilizacircnd același procedeu biomimetic de co-precipitare și același program
experimental folosite și icircn capitolul 4 s-au preparat 13 suporturi notate S1 ndash S13 Diferența icircntre
cele două loturi de suporturi preparate pentru potențiale aplicații icircn regenerarea osoasă a fost dată
de forma de prezentare a MNPs incluse icircn compoziție Icircn capitolul 4 MNPs au fost incluse icircn
sinteză sub formă uscată pe cacircnd icircn capitolul de față au fost introduse sub formă de suspensie
coloidală icircn apă urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura
suporturilor Pentru ambele loturi s-a folosit o concentrație de 5 MNPs față de cantitatea de
substanță uscată de biopolimeri și fosfați de calciu introduse icircn sinteză
Datele FTIR au evidențiat prezența de picuri caracteristice pentru toate
componentele suporturilor La fel ca icircn capitolul precedent o parte din suporturi au fost
sterilizate prin expunere la radiații UV timp de 4 ore Comparacircnd datele FTIR pentru suporturile
expuse la UV și cele ne-expuse nu s-au observat diferențe benzile reprezentative ale grupărilor
funcționale specifice componentelor suporturilor avacircnd valori foarte apropiate sau chiar egale
Datele XRD și EDS au analizat tipurile de fosfați de calciu formate pe matricea
polimerică cele mai reprezentative forme identificate fiind fosfat dicalcic ndash CaHPO4
hidroxiapatită ndash Ca10(PO4)6 ∙ (OH)2 și fosfatul tetracalcic ndash Ca4(PO4)2O
Datele SEM au evidențiat o structură poroasă CP și MNPs fiind distribuite
uniform icircn matricea polimerică Ca și icircn cazul datelor FTIR s-a studiat icircn paralel și morfologia
suporturilor expuse la radiații UV demonstracircndu-se că acest tip de sterilizare nu influențează
morfologia acestora Un studiu mai detaliat al morfologiei a fost studiat cu ajutorul analizei
microCT Rezultatele au indicat o influenţă semnificativă a conţinutului de fază mineral asupra
porozităţii suporturilor
Valorile obţinute pentru modulul lui Young se situează icircn intervalul 7628 MPa ndash
279 47 MPa Rezultatele sunt icircncurajatoare deoarece modului lui Young pentru osul spongios
se icircncadrează icircntre 20 MPa și 500 MPa
140
Capitol 5 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan colagen acid hialuronic) și fosfați
de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule magnetice
Icircn ceea ce privește proprietățile magnetice ale suporturilor s-a calculat
magnetizarea valorile obținute fiind cuprinse icircntre 2241 și 6733 emug Aceste valori indică
faptul cu suporturile sunt superparamagnetice
Gradul de retenție al suporturilor are valori foarte mari cuprinse icircntre 945 și
2248 valori corelate cu structura poroasă și proprietățile hidrofile ale biopolimerilor din
compoziție Degradarea enzimatică a suporturilor s-a realizat cu o viteză constantă icircn timp atacirct
pentru Cs cacirct și pentru Col
Citotoxicitatea in vitro a suporturilor a fost testată pe trei linii celulare diferite
fibroblaste osteoblaste și celule STEM Un test MTT standard a fost realizat la 24 ore 48 ore și
72 ore la fiecare timp calculacircndu-se viabilitatea celulară Suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor cele mai bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Pentru osteoblaste s-au
obținut valori mai reduse ale viabilității celulare comparativ cu celelate două linii celulare
explicate de sensibilitatea ridicată a acestui tip de celule
Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost studiată pe șoareci femele din linia
CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de la implantarea subcutanată a
fragmentelor sterilizate de suporturi O reacție inflamatorie acută a avut loc icircn primele ore de la
implantarea a cărei intensitate s-a redus dupăprimele 48 ore Analizacircnd icircn amănunt datele
histlogice obținute la diverse intervale de timp la sfacircrșitul testului s-a ajuns la concluzia că
suporturile nu au efect citotoxic in vivo totodată s-a observat asimilarea și resorbția suporturilor
141
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Capitol 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor
biomimetice pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule
magnetice Studii privind aplicația a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
61 Reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice pe
bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice
Reproductibilitatea este una din ipotezele de bază icircn experimentele științifice Dacă un
experiment nu este reproductibil rezultatele lui nu poate fi dovedite deci prin urmare nu pot fi
acceptate
Acest aspect a creat dificultăți majore icircn majoritatea domeniilor științifice De exemplu icircn
domeniul biologic probele de microbiologie depind direct de tulpinile acestora ceea ce conduce
la o lipsă de consecvență a rezultatelor deoarece fiecare grup de cercetare poate folosi propriile
tulpini Dificultăți icircn reproductibilitatea experimentelor științifice sunt observate și icircn domeniul
ingineriei tisulare Icircn acest sens icircn timpul oricărui experiment științific trebuie avute icircn vedere
două aspecte importante repetabilitatea și reproductibilitatea metodei acestea fiind componente
ale preciziei icircntr-un sistem de măsurare Cei doi termini se referă la măsurarea unui set de
condiții care includ aceeași procedură aceeași operatori același sistem de măsurare și aceleași
condiții de funcționare Repetabilitatea are loc icircn aceași locație pe cacircnd reproductibilitatea are
loc icircn locații diferite [196 197]
Reproductibilitatea slabă pune la icircndoială rezultatele științelor biomedicale Problema
principală este dată de complexitatea procesul de cercetare științifice
Icircn capitolele 4 și 5 au fost prezentate prepararea și caracterizarea a două loturi de suporturi
ambele fiind realizate printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare Icircn acest scop soluţii de
precursori de fosfaţi de calciu CaCl2 (40 ) şi NaH2PO4 (25 ) au fost amestecate cu soluţii de
biopolimeri Cs (1) C (1) Hya (1) şi MNPs pH-ul amestecului a fost ajustat la 72-74
utilizacircnd o soluţie apoasă de amoniac ndash NH4OH iar după spălare amestecurile au fost liofilizate
pentru 24 h
Diferenţa dintre cele două loturi de material este data de modalitatea de incluziune a
particulelor magnetice icircn etapa de sinteză a suporturilor obţinacircndu-se icircn cele din urmă
142
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Lot numărul 1 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de particule magnetice sub formă
uscată
Lot numărul 2 Suporturi biomimetice pe bază de biopolimeri (chitosan
colagen acid hialuronic) și fosfați de calciu cu incluziune de suspensie coloidală de particule
magnetice
Pentru ambele loturi a fost utilizat un program experimental cu două variabile (concentrația
de chitosancolagen și raportul CaP) cu scopul de a se determina compoziția optimă a
suporturilor Respectacircnd valorile teoretice din programul experimental s-au obţinut 13 probe
Concentraţia de Hya (1) este de 5 faţă de cantitatea totală de biopolimer introdusă icircn sinteză
iar pentru raportul CaP au fost alese valori apropiate de cele identificate icircn țesutul osos uman
611 Obținerea suporturilor
Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi lotul numărul 2 s-a
dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul numărul
9 ndash S9 s-a dovedit a fi cel mai aproape de un suport ideal
Astfel pentru a demonstra reproductibilitatea metodei obiectivele următoare au fost
obţinerea şi caracterizarea a 7 suporturi avacircnd compoziţia teoretică a suportului 9
Suporturile obţinute au fost notate S91 ndash S97 și au fost caracterizate din punct de vedere
al structurii chimice utilizacircnd spectroscopia IR cu transformată Fourier ndash FTIR iar din punct de
vedere al morfologiei prin microscopie electronică de baleiaj ndash SEM și micro computer-
tomografie (microCT)
De asemenea s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM
143
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
612 Rezultate şi discuţii
6121 Structura chimică a suporturilor
Structura suporturilor a fost analizată utilizacircnd spectroscopia icircn infraroşu cu transformată
Fourier ce determină interacțiunile dintre cei trei biopolimeri fosfați de calciu și particulele
magnetice Rezultatele redate icircn figura 61 indică prezenţa picurilor caracteristice tuturor
componentelor cei trei biopolimeri fosfații de calciu și nanoparticule magnetice iar icircn tabelul
61 sunt prezentate benzile lor representative [136]
Figura 61 Structura chimică a suporturilor
După cum se poate observa atacirct icircn figura 61 cacirct și icircn tabelul 61 suporturile analizate au
structură chimică asemănătoare componentele din structura lor avacircnd benzile reprezentative
apropiate sau chiar egale
144
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Tabel 61 Benzile FTIR pentru suporturile compozite S92 şi S97
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
Benzile
reprezentative
(cm-1
)
Grupările
funcționale
S92 S97
3422 OH 3420 OH
2927 C-H 2926 C-H
1655 Amida I C=O 1656 Amida I C=O
1554 Amida II N-H 1554 Amida II N-H
1074 C-O-C 1069 C-O-C
604 Fe-O 602 Fe-O
562 PO3_4
561 PO3-4
6122 Morofologia suporturilor
Morfologia suporturilor a fost analizată pentru o imagine de ansamblu cu ajutorul
microscopiei electronice de baleiaj (figura 62) Nu se observă diferenţe de morfologie icircntre
suporturile analizate fiind observată icircn ambele cazuri și la ordine de mărire diferite o structură
tridimensională cu pori intercomunicabili structură ce include atacirct cristale de fosfaţi de calciu cacirct
şi nanoparticule magnetice distribuite icircn matricea polimerică
Pentru o imagine mai detaliată asupra morfologiei suporturilor fragmente din acestea au
fost scanate utilizacircnd sistemul Skyscan Bruker 1172 parametrii de lucru fiind 25 kV 130 μA şi
o rotaţie de 05deg Tehnica utilizată a fost descrisă pe larg icircn capitolul 5 sub-capitolul 523
Programul CTVox (Bruker Belgium) a fost utilizat icircn vederea vizualizării distribuţiei
porozităţii O funcţie de transfer a distribuţiei porozităţii a fost suprapusă peste reconstrucţia 3D
a probei de investigat iar apoi un cod de culoare a fost desemnat pentru vizualizare după cum se
poate observa icircn figura 63 Icircn tabelul 62 sunt prezentate dimensiunea distribuţia porilor
volumul regiunii de interes şi suprafaţa regiunii de interes
145
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 62 Morfologia suporturilor
Figura 63 Dimensiunea şi distribuţia porilor pentru suportul S94
Tabel 62 Dimensiunea porilor suportului S94
Dimensiunea porilor Volumul regiunii de interes Aria regiunii de interes
121plusmn5613 microm
144912 mm
3 769888 mm
2
146
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6123 Proprietăţile mecanice ale suporturilor
Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn figurile 64 Valorile obţinute pentru rezistența
la compresiune se situează icircn jurul valorii de 58 MPa iar valorile modulului Young sunt
cuprinse icircntre 215 MPa şi 220 MPa valori
Figura 64 A Rezistenţa la compresiune a suporturilor B Modulul Young pentru suporturi
Aceste valori sunt icircn mare parte determinate de porozitatea ridicată a compozitelor obţinute
prin procedeul de liofilizare Se observă valori apropiate ale rezistenței la compresiune a
suporturilor precum și a modului Young calculat metoda este deci reproductibilă și din punct de
vedere al proprietăților mecanice ale suporturilor obținute
6124 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic
Rezultatele obținute icircn urma studiului de determinare a retenției fluidelor de interes
biologic sunt redate icircn figura 65
Figura 65 Grad de retenţie maxim
0
200
400
600
800
1000
1200
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Gra
d d
e re
ten
ție
maxi
m
()
72 ore
147
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Valorile mari ale gradului de retenție pot fi explicate de structura poroasă a suporturilor
dovedită de datele de microscopie electronică de baleiaj (figura 62) Acestea sunt cuprinse icircntre
685 și 909 cu o medie a valorilor obținute de 781 Această diferență de 224 icircntre
valoarea maximă și valoarea minimă obținute poate fi explicată de faptul că dimensiunea porilor
nu este uniformă conform tabelului 62 această este de 121 plusmn 5613 pentru suportul S94
6125 Degradare enzimatică in vitro a suporturilor
Degradarea enzimatică este cea mai utilizată metodă de caracterizare a biodegradabilității
unui suport Suporturile S91 ndash S97 au fost supuse degradării enzimatice determinacircndu-se
concentraţia de chitosan respectiv de colagen degradat la intervalie stabilite
Concentraţia de chitosan degradat
Se observă o creştere graduală icircn timp a concentraţie de chitosan degradat (figura 66) ceea
ce indică o degradare controlată a suporturilor proprietate foarte importantă pentru aplicaţia
vizată deoarece o rată de degradare prea rapidă implică o refacere incompletă a ţesutului osos
iar o rată de degradare prea lentă poate duce la o fractură sau la o deformaţie a osului Se pot
observa valori apropiate ale concentraţie de chitosan degradat ceea ce indică reproductibilitatea
metodei de sinteză
Figura 66 Concentraţia de chitosan degradat
0
015
03
045
06
075
09
105
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
(Co
nce
ntr
aţi
e ch
ito
saln
deg
radat)
∙
10
0 m
mo
liL
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
148
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Concentraţia de colagen degradat
Analizacircnd figura 67 se observă valori constante icircn timp ale concentraţie de colagen
degradat Ca și icircn cazul chitosanului degradarea colagenului se realizeză gradual pe măsură ce
enzima icircn cazul de față colagenaza reușește să străbată matricea anorganică formată din fosfați
de calciu și să ajungă la matricea organică polimerică
Valorile obținute pentru cele 7 suporturi analizate sunt apropiate procesul de degragare
gradual fiind observată pentru toate cazurile
Figura 67 Concentraţia de colagen degradat
6126 Citotoxicitatea suporturilor in vitro
Fragmente de suporturi au fost puse icircn contact direct cu osteoblaste rezultatele fiind redate
icircn figura 68A Valorile obţinute pentru viabilitatea celulară sunt icircn jur de 80 pentru toate
intervalele de contact ceea ce indică faptul sunt lipsite de citotxicitate
Icircn urma contactului direct al suporturilor cu fibroblaste rezultate redate icircn figura 68B s-
au obţinut valori ale viabilităţii celulare ce cresc icircn timp ajungacircnd la 72 ore la valori de
aproximativ 100 pentru toate ambele suporturi ceea ce indică a foarte bună citompatibilitate a
probelor
0
05
1
15
2
25
3
S91 S92 S93 S94 S95 S96 S97
Co
nce
ntr
ţia
de
cola
gen
deg
rad
at
m
moli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
149
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 68 Viabilitatea celulară icircn urma contactului direct cu suporturile
A Utilizacircnd osteoblate B Utilizacircnd fibroblaste
Pentru a reconfirma citocompatibilitatea suporturile la contactul direct cu fibroblastele și
reproductibilitatea metodei de sinteză s-a realizat şi un test de viabilitate celulară cu calceină-
AM rezultatele obţinute fiind prezentate icircn figura 69
Figura 69 Viabilitatea fibroblastelor icircn contact direct cu suporturile
Nu se observă diferenţe de densitate celulară icircntre control şi celulele incubate cu fragmente
de suporturi după 72 ore de contact direct
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 A
0
20
40
60
80
100
120
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itate
a c
elu
lară
Control S95 S97 B
150
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
62 Studii privind potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia
tumorilor osoase maligne
Corelate cu alte afecțiuni maligne tumorile primare sunt destul de rare și mai puțin
frecvente reprezentacircnd doar 02 din toate neoplasmele raportate icircn Marea Britanie și Statele
Unite [198] Icircn plus tumorile primare sunt depășite ca număr de metastaze date de carcinom
melanom sau afecțiunile maligne hematologice cum ar fi plasmacitomul De asemenea alte
condiții non-neoplazice cum ar fi unele procese inflamatorii chisturile osoase displazia fibroasă
sau boala Paget depășesc cazurile de tumori osoase primare [199] Cele mai frecvente tumori
osoase maligne sunt osteosarcomul (35) condrosarcomul (25) sarcomul Ewing (16)
chordomul (8) și histiocitomul fibros malign (5) [200]
Tratamentul tumorilor osoase maligne reprezintă o adevărată provocare clinică deoarece
rezecția chirurgicală a tumorii și radioterapia nu reușesc să elimine complet țesutul tumoral
Chimioterapia care precede de regulă celelalte două tehnici are efecte adverse semnificative și
totodată icircn unele cazuri poate apărea o rezistență la aceste medicamente Există icircnsă și o serie de
tratamente alternative cum ar fi hipertermia terapia țintită imunoterapia fototerapia utilizarea
nanoparticulelor transplant de celule stem și altele unele din ele aflate icircncă icircn faza de studiu dar
care vor oferi cel mai probabil soluții foarte bune icircn viitor [201] Imunoterapia icircmbunătățește
capacitatea celulelor imune de a recunoaște și ținti celulele tumorale ceea ce duce la eliminarea
lor Avantajele imunoterapiei includ specificitate ridicată anti-tumorală și efecte secundare
minime prin folosirea propriului sistem imunitar al pacientului Hipertermia este un tratament
modern ce implică creșterea temperaturii la locul țintă pentru a induce astfel un stres termic
temperatura la care se ajunge fiind icircn medie 40degC (39ndash43degC icircn funcție de strategia terapeutică)
[202]
Icircn mod particular protocolul de tratament al osteosarcoamelor icircncepe cu rezecția
chirurgicală a tumorii osoase primare și a eventualelor metastaze Defectul osos obținut este
acoperit cu un material de substituție osoasă pentru a preveni fracturile sau deformațiile osoase
[203] Deoarce tumorile osoase sunt aproape imposibil de icircndepărtat icircn totalitate intervențiile
chirurgicale sunt urmate de radiochimioterapie [204]
Icircn cazul unor tumori osoase tratamentul implică două etape Icircntr-o primă etapă țesutul
tumoral este icircndepărtat chirurgical iar icircntr-o a doua etapă defectul osos obținut este acoperit cu
151
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
un material de substituție osoasă tot mai studiate fiind suporturile magentice biomimetice Icircn
prezența unui cacircmp magnetic aceste suporturi vor atrage alte particule magnetice introduse icircn
circulație Acestea din urmă vor fi funcționalizate cu medicamente chimioterapice precum și cu
factori de creștere care să susțină procesul de regenerare osoasă și formare de neo-țesut
Radioterapia se icircncadrează adesea icircn schemele de tratament a diferitelor tipuri de cancer
rezultatele obținute de-a lungul timpului icircn practica clinică fiind eficiente Utilizacircnd radiații
ionizate raze X radioterapia generează stres oxidativ excesiv și induce denaturarea ADN-ului
ce va conduce la moartea celulelor tumorale Radioterapia este o metodă neinvazivă de
tratament radiația fiind aplicată la locul țintă pe cacirct posibil Un dezavantaj al metodei este acelă
că unele celule sunt radiorezistente Icircn cazul icircn care este observat acest fenomen se impune
utilizarea unei doze excesive de radiații care icircnsă va distruge celulele adiacente sănătoase Din
acest motiv există scheme de tratament de radio-sensibilizare de exemplu se poate combina
chimioterapia de radio-sensibilizare cu radioterapia [205] Icircn ceea ce privește tumorile osoase
radioterapia are ca efect de scurtă durată o reducere a densității minerale osoase imediat după
expunerea la radiații dar ulterior induce re-calcifierea leziunii etapă a procesului complex de
remodelarea osoasă Se presupune că icircn cazul pacienților cu răspuns bun la acest tip de terapie
este nevoie de aproximativ 3 luni pentru ca osul să fie refăcut [206]
Medicamentele chimioterapeutice sau citostatice sunt fie substanțe naturale fie derivați
sintetici ai acestora extrase din plante specii marine sau unele microorganisme [207]
Dezavantajele acestei terapii sunt toxicitatea și biodistribuția nefavorabilă a compușilor Sisteme
pentru eliberarea țintită a acestor principii active sunt intens studiate [208]
Icircn acest context polimerii sunt materiale adecvate pentru a transporta medicamente
icircncapsulate sau legate chimic De-a lungul timpului polimerii și nanoparticulele polimerice au
jucat un rol cheie icircn dezvoltarea tehnologiei de eliberare a medicamentelor oferind eliberarea
controlată a agenților terapeutici icircn doze constante pe perioade lungi dozare ciclică și eficiență
mai bună a medicamentelor hidrofile sau hidrofobe [209 210]
Suporturile obținute icircn capitolele anterioare au potențial de a fi utilizate pentru umplerea
defectului osos rezultat după rejecția chirurgicală a tumorii și totodată pentru eliberarea țintită
de chimioterapice icircncorporate icircn nanoparticulele magnetice din structura lor Scopul strategiilor
experimentale descrise icircn cele ce urmează a fost testare potențialului suporturilor obținute de a fi
utilizate icircn radiochimioterapia tumorilor osoase maligne Inițial suporturile au fost expuse la
152
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
radiații X pentru a stabili influența asupra structurii și proprietăților acestora Icircn etapa următoare
s-a studiat icircncărcarea și eliberarea de chimioterapice (doxorubicină ndash DOX) din nanoparticulele
magnetice incluse icircn suporturi
621 Obținerea suporturilor
Șase suporturi au fost preparate după protocolul descris icircn capitolul 5 Pe scurt suporturile
au fost obținute prin co-precipitarea CaCl2 și a NaH2PO4 pe un suport de biopolimeri Cs Col
Hya și MNPs icircn prezența unei soluții apoase de amoniac NH4OH Icircn tabelul 63 sunt detaliate
codificările compoziția și caracteristicile distinctive ale suporturilor
Tabel 63 Codificarea și compoziția suporturile obținute și caracteristica lor distinctivă
Codificare
suport Compoziția biopolimerică CaP
Concentrația
de MNPs Caracteristica distinctivă
S5 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Control
S9 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Control
S5R 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S9R 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs Iradiate cu raze X
S5-DOX 2879 Col 7121 Cs 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
S9-DOX 50 Cs 50 Col 165 5 MNPs-DOX MNPs icircncărcate cu DOX
622 Tehnica de iradierea cu raze X a suporturilor
Icircn vederea iradierii suporturilor cu raze X s-au urmat pași specificați icircn capitolul 2 sub-
capitolul 2491 și anume
a avut loc o simulare computer-tomograf (CT) icircn condiții similare radioterapiei
(poziționarea laserului plasarea markerilor radio-opaci externi scanarea volumului iradiat cu un
dispoziti de scanare CT special)
conturarea volumului țintă pe imagini complexe CT
stabilirea dozei de radiație
determinarea parametrilor fascicului de radiație (energia de lucru unghiul de incidență
dimensiuni și forme utilizarea accesoriilor optime)
analiza histogramei doză-volum pentru a verifica dacă cel puțin 95 din volumul țintă
a iradiat minim 95 de doza prescrisă
153
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn planul de iradiere denumit CILINDRU secțiunile obținute au fost conturate astfel
suprafața exterioară ca referință (S) materialul (V1) și volumul țintă (V2) V2 = V1 + 5mm
pentru a compensa posibilele eroari de poziție figura 610A
Doza de radiații utilizată a fost de 8 Gy fracțiune unică aceasta fiind doza unică
administrată icircn mod obișnuit icircn cazul metastazelor osoase [211 212 213]
Realizarea unui plan de tratament care să respecte atacirct distribuția omogenă icircn volumul țintă
a dozei prescrise cacirct și constracircngerile legate de doză cu privire la riscul de a afecta organele din
vecinătate impun alegerea cu atenție sporită a tehnicii de iradiere icircn unele cazuri fiind necesară
aplicarea unui bolus la suprafața volumului iradiat De exemplu iradierea peretelui toracic după
mastectomie radicală solicită utilizarea unui bolus icircn vederea obținerii parametrilor optimi ai
planului de tratament tipul și grosimea bolusului fiind incluse icircn algoritmul de calcul Bolusul
permite iradierea pielii cu 100 din doza prescrisă icircn timp ce icircn lipsa acestuia pielea (icircn care icircn
cancerul de sacircn apar aproape toate recidivele locale) este iradiată cu 70 din doza prescrisă iar
țesuturile nețintă (mușchi coaste) primesc 100 din doză Icircn mod similar bolusul este indicat
pentru iradierea tumorilor laringelui cu extensie la comisura anterioară sau a tumorilor vulvare
primare [214]
Planul de tratament a fost realizat utilizacircnd software-ul Eclipsetrade Planning Treatment
System Pentru o distribuție omogenă a dozei icircn volumul materialului a fost plasat un bolus de
10 mm grosime pe suprafața materialului rezultacircnd o includere suficientă icircn izodoza 95
(prezentată icircn verde icircn figura 610B) pentru V2 Termenul de izodoză se referă la suprafețele
care unesc toate punctele la nivelul cărora are loc absorbția unor doze egale de energie radiantă
[215]
Figura 610 A Conturarea volumului țintă pe imaginile CT ale eșantionului B Distribuția dozei
de radiații icircn volum de suport după aplicarea bolusului
154
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Parametrii stabiliți pentru planul de iradiere au fost două raze opuse izocentrice egale
una din poziția zero (AP) cu 6 MV și una posterioră poziționată la 180 de grade (PA) cu 15 MV
(figura 611)
Figura 611 Parametrii planului de iradiere
623 Teste in vitro de icircncărcareeliberare doxorubicină
Nanoparticulele magnetice au fost icircncărcate cu doxorubicină conform protocolului descris
anterior icircn subcaptiol 2492 Pe scurt icircntr-o suspensie coloidală de 1 MNPs icircn apă s-a
solubilizat 0125 doxorubicină nanoparticulele astfel obținute fiind notate cu MNPs-DOX
Suspensia finală a fost utilizată la prepararea suporturilor S5-DOX și S9-DOX conform datelor
experimentale din tabelul 63
Pentru caracterizarea suporturilor s-au analizat morfologia acestora eliberarea controlată
de medicamente antitumorale și citotoxicitatea in vitro la contactul direct cu celule tumorale
Structura chimică a suporturilor preparate a fost analizată cu ajutorul spectroscopiei FTIR
iar morfologia lor cu ajutorul microscopiei electronice SEM
Pentru suporturile S5 S5R S9 S9R a fost analizată interacțiunea cu PBS (grad de retenție
maxim PBS) și s-au efectuat studii de degradare in vitro utilizacircnd un complex de enzime lizozim
(1200 μgml) și colagenază (100 μgml ) conform datelor experimentale din subcapitolul 246
155
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
De asemenea a fost studiată citotoxicitatea citotoxicitatea suporturilor sterilizate (expuse la o oră
la radiațiile UV) utilizacircnd celule osoase din linia MG-63 Un test MTT standard a fost efectuat la
24 48 și 72 de ore și a fost calculată viabilitatea celulară
Pentru suporturile S5-DOX și S9-DOX s-a analizat eliberarea de medicament in vitro
(subcapitol 2492) și interacțiunea cu celule MG-63 Suporturile au fost sterilizate tot prin
expunere la UV pentru o oră după care au fost puse icircn contact direct cu celulele Icircn paralel o
soluție stoc de doxorubincină a fost preparată icircn condiții sterile diferite concentrații fiind
analizate din punct de vedere al interacțiunii cu același tip de celulele Viabilitatea celulară a fost
calculată cu ajutorul unui test MTT standard
624 Rezultate și discuții
Suporturile preparate au fost testate icircn vederea unei potențiale utilizări icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne tehnică redată schematic icircn figura 612
Figura 612 Tratamentul tumorilor osoase maligne utilizacircnd tehnici de radioterapie și
chimioterapie
156
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6241 Structura chimică și morfologia suporturilor
Analiza FTIR a fost utilizată pentru studiul structurii chimice a suporturilor rezultatele
fiind redate icircn figura 613
Icircntre suporturile radiate și neradiate (figura 613A) nu se observă diferențe de structură
chimică benzile de absorbție caracteristice biopolimerilor nanopaticulelor magnetice și
fosfaților de calciu fiind observate icircn toate spectrele FTIR Icircn ceea ce privește biopolimerii se
pot observa următoarele picuri caracteristice 3439 cm-1
3434 cm-1
și 3489 cm-1
pentru gruparea
hidroxil 2925 cm-1
2924 cm-1
și 2927 cm-1
pentru -CH2 1652 cm-1
1654 cm-1
și 1649 cm-1
pentru amida I 1552 cm-1
și 1554 cm-1
pentru amida II [216] Pentru CaP au fost observate
picuri ale grupărilor fosfat la 601 cm-1
și 603 cm-1
iar pentru MNPs au fost observate picuri
caracteristice la 561 cm-1
și 563 cm-1
[99 160]
Figura 613 Spectrele FTIR ale suporturilor
Spectrele FTIR ale suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și al DOX sunt redate icircn figura
613B Spectrul DOX prezintă următoarele benzi caracteristice 2929 cm-1
pentru vibrația de
icircntindere a legăturii C-H 1730 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii C=O 1617 cm-1
și
157
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
1525 cm-1
pentru legătura NndashH 1411 cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashC și 1286
cm-1
pentru vibrația de icircntindere a legăturii CndashOndashC O parte din aceste benzi au fost observate și
pe spectrele corespunzătoare suporturilor S5-DOX și S9-DOX ceea ce sugerează interacțiunea
medicamentului cu celelalte componente ale suporturilor Alte picuri observate pe spectrele celor
două suporturi au fost 3446 cm-1
și 3440 cm-1
pentru gruparea ndashOH 2925 cmminus1
pentru ndashCH2
1654 cm-1
și 1656 cm-1
pentru amida I și altele cu valori apropiate de cele ale suporturilor fără
DOX (figure 613A)
Morfologia suporturilor realizate cu scopul de a fi utilizate icircn regenerarea osoasă este o
caracteristică foarte importantă de care trebuie să se țină cont icircn procesul de sinteză Aceste
suporturi trebuie să aibă porozitatea și dimensiunea porilor adecvate aplicației vizate Rețelele cu
pori interconectați influențează puternic procesul de nutriție a celulelor proliferarea și migrarea
acestora precum și vascularizare suportului [217] Rezultatele acestei analize au fost prezentate
icircn figura 614
Figura 614 Morfologia suporturilor
158
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
6242 Interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și degradarea
enzimatică a acestora
Influența radiaților asupra suporturilor a fost analizată și din punct de vedere al
interacțiunii cu fluidele de interes biologic și anume PBS pH = 72 001M S-a utilizat aceași
metodă volumetrică descrisă și icircn capitolele anterioare și s-a calculat gradul maxim de retenție
PBS utilizacircnd formula (14) redată icircn capitolul 2 Rezultatele obținute sunt prezentate icircn tabelul
64 și icircn figura 615
Tabel 64 Gradul de retenţie PBS al suporturilor
Nr crt Denumirea
suportului
Gradul
de retenţie PBS ()
1 S5 995 plusmn 30
2 S5R 1040 plusmn 35
3 S9 990 plusmn 50
4 S9R 987 plusmn 19
Figura 615 Gradul de retenție a suporturilor radiate și acelor neradiate
Diferența dintre valorile gradului de retenție pentru S5 și S5R este de aproximativ 45
iar icircntre S9 și S9R este nesemnificativă Icircn cazul suporturilor S5 și S5R diferență poate fi
explicată de dimensiunea neuniformă a porilor (figura 614) la fel ca și icircn cazul suporturilor
realizate pentru studiul reproductibilității ale cărui rezultate au fost prezentate mai sus Avacircnd
0
200
400
600
800
1000
1200
S5 S5R S9 S9R
Gra
dul m
axim
de
rete
nți
e P
BS
72 ore
159
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
această explicație pentru diferența dintre valorile obținute s-a putut afirma că radiațiile X nu
influențează interacțiunea suporturilor cu fluidele de inters biologic
Degradarea enzimatică a suporturilor a fost studiată utilizacircnd un amestec de două enzime
lizozim și colagenază metoda fiind descrisă icircn detaliu icircn capitolul 2
Potrivit lui Brouwer și colaboratorii [218] concentrația de lizozimă icircn serul uman este de
950-2450 μgL dar niveluri crescute pot fi observate icircn bolile benigne bolile inflamatorii
intestinale unele afecțiuni hematologice (policitemia vera mielomul multiplu) și procesele
maligne cum ar fi leucemiile [219] De exemplu Firkin [220] a raportat un nivel foarte ridicat al
lizozimului seric 30-120 μgml icircn leucemia mieloidă cronică și mielofibroza Icircn ceea ce privește
aceste date din literatură s-a ales o concentrație de 1200 μgml dat fiind că suporturile sunt
destinate tratamentului tumorilor osoase și probabil un nivel ridicat de lizozim va fi găsit icircn os
Deoarece colagenul este cea mai predominantă proteină din corpul uman nivelurile de
colagenază sunt greu de măsurat cu precizie această enzimă fiind găsită icircn toate țesuturile
organele icircn care există colagen Colagenaza interstițială are un rol-cheie icircn remodelarea normală
și patologică a matricelor extracelulare colagen inclusiv a țesutului osos și a țesutului conjunctiv
[221] De asemenea există diferite tipuri de colagenază de ex icircn pielea umană colagenază
secretată de fibroblastelor are două forme de proenzime (57 și 52 kDa) [222]
Rezultatele studiului au fost redate icircn figura 616A ndash reprezentacircnd concentrația de chitosan
degradat și 616B ndash reprezentacircnd concentrația de colagen degradat
Figura 616 A Concentraţia de chitosan degradat B Concentrația de colagen degradat
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
S5 S5R S9 S9R
(Conce
ntr
ația
de
Cs
deg
radat
) ∙
100
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile
0
001
002
003
004
005
006
007
008
S5 S5R S9 S9R
Conce
ntr
ați
a de
cola
gen
deg
radat
mm
oli
L
4 ore 24 ore 48 ore 7 zile 14 zile A B
160
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Se observă icircn ambele cazuri o creștere graduală a concentrației de polimer degradat
chitosan respective colagen Valorile obținute sunt comparabile de unde s-a ajuns la concluzia
că radiațiile nu influențează nici interacțiunea suporturilor cu fluide biologice simulate icircn cazul
de față un complex de enzime icircn PBS pH=72 001M
6243 Citotoxicitatea in vitro a suporturilor
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată prin contactul direct a suporturilor cu
osteoblastele liniei MG-63 figura 617
Valoarea viabilității calculată conform ecuației (15) din capitolul 2 scade icircn timp
fenomen observat și icircn celelalte studii de citoxicitate pe aceast tip de celule La 72 ore de la
contactul direct al celulelor cu fragmente de suport se observă o diferență de aproximativ 10
procente icircntre suporturile care nu au fost expuse radiațiilor și cele care au fost expuse Rezultatul
nu trebuie interpretat ca și negativ icircn condițiile icircn care rolul radiațiilor este de a distruge ceulele
tumorale osteoblastele Mg-63 fiind o linie de celule tumorale (osteosarcoame)
Radiațiile au fost absorbite de aceste suporturi cu o posibilă formare de radicali liberi fără
icircnsă a influența structura lor chimică morfologia și interacțiunea cu medii biologice simulate
Fenomenul este dificil de icircnțeles studii complexe fiind necesare icircn acest sens
Figura 617 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct cu suporturile
0
20
40
60
80
100
24 ore 48 ore 72 ore
Via
bil
itat
ea c
elula
ră
Control S5 S5R S9 S9R
161
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Icircn concluzie rezultatele primei părți a studiului și anume studiul influenței radiațiilor X
asupra suporturilor au arătat rezultate icircncurajatoare structura chimică a suportului morfologia și
comportamentul de degradare enzimatică nu sunt influențate de razele X utilizate icircn radioterapie
ceea ce icircnseamnă că suporturile pot fi utilizate icircn continuare icircn chimioterapie
6424 Eliberarea controlată de medicamente antitumorale
Sistemele magnetice de eliberare controlată a medicamentelor au multiple avantaje față de
metodele normale cum ar fi abilitatea de a viza un anumit loc țintă icircn organism și reducerea
cantității de medicament necesară pentru a atinge o anumită concentrație la locul țintă ceea ce
implică o reducere a concentrației medicamentului icircn organele din vecinătate fiind minimizate
efectele secundare [223]
Doxorubicina - DOX este un potențial medicament pentru tratamentul metastazelor osoase
și a tumorilor osoase dar utilizarea sa este limitată de efectele secundare sistemice DOX este un
antibiotic antraciclinic care la nivel molecular interacționează cu ADN-ul și interferează cu
sinteza acidului nucleic rezultacircnd un efect remarcabil asupra transcripției AND [224 225]
Pentru aplicații icircn chimioterapia osoasă DOX este utilizat icircn sistemele de eliberare a
medicamentelor fabricate din diferite suporturi magneticecompozite apatită nanocristalină
[226] hidroxiapatită [227] chitosan și hidroxiapatită [228] acid poliglicic-co-glicolic -
polietilenglicol (PEG-PLGA) [87] microsfere magnetice
Icircn ceea ce privește eliberarea in vitro a DOX din suporturi o eliberare treptată poate fi
observată icircn figura 617
162
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 617 Curbele cinetice de eliberare a DOX din suporturi
Pentru suportul S5-DOX eliberarea a fost mai constantă icircn timp De remarcat este faptul că
aceast suport are o cantitate considerabilă de chitosan icircn compoziție comparativ cu S9-DOX
Trebuie reamintit fapul că toate MNPs utilizate icircn teza de față au fost acoperite cu chitosan
pentru o mai bună citocompatibiliate și pentru a putea lega principii active
6245 Interacțiunea in vitro a suporturilor conținacircnd MNPs-DOX și a
medicamentului antitumoral cu celule
Interacțiunea suporturilor preparate icircn sub-capitolul de față a fost studiată icircn paralel cu
interacțiunea suporturilor fără medicament icircncorporat pentru a putea realiza o analiză
comparativă S-a optat pentru contactul direct al fragmentelor de suport iar drept celule
tumorale s-au utilizat tot osteoblaste din linia MG-63 Rezultatele studiului sunt redate icircn figura
618
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 50 100 150 200 250 300 350
Conce
ntr
ați
a d
e D
OX
(μgm
L)
Timp ore
S5-DOX S9-DOX
163
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
Figura 618 Viabilitatea celulară a osteoblastelor icircn urma contactului direct A Cu soluții
de DOX de concentrații diferite B Cu suporturile avacircnd DOX icircn compoziție și a celor fără DOX
Viabilitatea celulară a suporturilor a fost aproape de 100 la primii 2 timpi de contact 24
și 48 ore atacirct pentru suporturile cu medicament cacirct și pentru cele fără medicament Icircnsă la 72 ore
de contact a suporturilor cu osteoblastele s-a observat o scădere semnificativă a viabilității
acestora valorile obținute fiind 64 pentru S5-DOX respectiv 75 pentru S9-DOX pentru
suporturile fără DOX valorile au scăzut nesemnificativ Această scădere bruscă de viabilitate ar
putea fi explicată de faptul cu DOX este eliberată treptat din suporturi la un raport relativ scăzut
proprietate de eliberare lentă a DOX poate fi utilizată și pentru că alte medicamente anti-
tumorale puternice sau combinații de medicamente ar putea fi transportate la desemnate zona și
eliberat la un raport optim pentru combaterea tumorilor [229]
164
Capitolul 6 Studii privind reproductibilitatea metodei de preparare a suporturilor biomimetice
pe bază de biopolimeri şi fosfaţi de calciu cu incluziune de particule magnetice Studii privind
potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne
63 Concluzii
Reproductibilitatea un experiment este foarte importantă icircn vederea transpunerii
rezultatelor obținute icircn practică Icircn urma unor analize riguroase ale celor două loturi de suporturi
preparate și caracterizate icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai
adecvate pentru aplicaţia vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate
Pentru a demonstra reproductibilitatea metodei 7 suporturi avacircnd compoziţia
teoretică a lui S9 au fost preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a
compoziției din punct de vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn
fluide de interes biologic degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice
Citotoxicitatea suporturilor a fost analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate
celulară cu Calceină-AM
Toate analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă
este reproductibilă
Icircn a doua parte a studiului s-a testat potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-
chimioterapia tumorilor osoase maligne Icircn primul racircnd s-a demonstrat că o doză de radiații X
similară cu cea utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile
suporturilor cum ar fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea
in vitro
Suporturile conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic
pentru tratamentul metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și
lentă a DOX sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn
terapia combinată a tumorilor osoase maligne
165
Concluzii generale
Concluzii generale
Osul este un țesut care are capacitatea de regenerare şi reparare proprie icircn cazul unor
afecţiuni minore fiind supus de-a lungul vieții la procese biologice complexe de creştere
modelare şi remodelare Procesul de regenerare nu este suficient icircn cazul defecte osoase grave ce
au drept factori determinați principali rezecţiile de tumoră osoasă malformaţiile congenitale
unele traume fracturi sau afecţiuni precum osteoporoza şi artrita Toate acestea fac ca anual la
nivel mondial să fie utilizate peste 2 milioane de implanturi de materiale de substituţie ososasă
Materiale de substituţie osoasă pot fi clasificate icircn mai multe categorii grefe de origine naturală
(autogrefe alogrefe xenogrefe) grefe osoase și substituenţi sintetici materiale pentru ingineria
tisulară precum şi diverse combinaţii ale acestora
Biomaterialele prelucrate sub divere forme (suporturi macroporase sisteme injectabile
capsule filme matrici fibroase și nano-fibroase plăci compacte tuburi geluri și altele) sunt
elemente cheie icircn ingineria tisulară Suporturile compozite pe bază de biopolimeri și fosfați de
calciu s-au dovedit a fi o soluție promițătoare icircn ingineria tisulară și medicina regenrativă a
țesutului osos unele variante comerciale fiind folosite cu succes icircn practica clinică La
prepararea acestora trebuie să se țină cont și de nano-structura osului nu doar de compoziția sa
suporturile obținute prin procedee biomimetice fiind cele mai de succes
Nanoparticulele magnetice sunt folosite la o varietate de aplicații medicale clinice și
preclinice Eliberarea controlată de medicamente este un domeniu intens studiat icircn zilele noastre
iar utilizarea nanoparticulele magnetice icircn acest scop reprezintă un subiect de mare interes pentru
un număr considerabil de cercetători
Obiectivul central al lucrării de față a fost obținerea și caracterizarea de suporturi
compozite printr-un procedeu biomimetic de co-precipitare a precursorilor de fosfați de calciu pe
un amestec de biopolimeri și nanoparticule magnetice pentru a fi testate icircn regenerarea osoasă
Biopolimeri utilizați au fost colagen chitosan acid hialuronic albumină serică bovină și
gelatină iar fosfații de calciu au fost obținuți din precursori pornindu-se de la un raport teoretic
CaP comparabil cu cel identificat icircn osul uman Nanoparticulele magnetice au fost incluse
pentru studii ce au vizat icircncorporarea și eliberarea controlată de principii biologice
166
Concluzii generale
Suporturile au fost caracterizate riguros din punct de vedere fizico-chimic și biologic S-a
icircnceput cu studiul structurii chimice a compoziției și morfologiei suporturilor după care s-a
studiat interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic și cu soluții enzimatice
Proprietățile mecanice ale suporturilor au fost analizate din perspectiva modului de elasticitate
Young iar proprietățile magnetice din perspectiva susceptibilității magnetice a acestora Din
punct de vedere biologic suporturile au interacționat direct sau indirect cu diverse linii celulare
și s-au implantat sub-cutanat la șoareci icircn vederea determinării citotoxicității acestora Conceptul
de terapie combinată ce implică utilizarea radioterapii și chimioterapii a fost analizat icircntr-o
ultimă etapă pentru suporturile obținute
Pentru stabilirea compoziției optime s-au realizat icircn paralel suporturi pe bază de
biopolimer amestecuri diferite de biopolimeri (chitosan chitosan ndash acid hialuronic chitosan ndash
albumină serică bovină și chitosan ndash gelatină) și fosfați de calciu obținuți din precursori raportul
teoretic CaP fiind de 165 Trei concentrații diferite de nanoparticule (1 3 5 ) au fost
icircncorporate pe racircnd icircn sinteza celor patru tipuri de suporturi Structura chimică și compoziția
suporturilor au indicat prezența picurilor caracteristice componetelor incluse icircn sinteză Datele cu
privire la compoziția suporturilor au indicat prezența unor tipuri de fosfați de calciu identificați și
icircn literatură preponderenți fiind hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) fosfatul monocalcic anhidru
Ca(H2PO4)2 fosfatul tricalcic (Ca3(PO4)2) S-a calculat magnetizarea suporturilor concentrația
de 5 fiind cea mai apropiată de datele regăsite icircn alte studii avacircnd aceleași obiective Studiile
privind interacțiunea suporturilor cu fluide de interes biologic soluții enzimatice și celule au
indicat o corelație icircntre porozitatea materialelor și proprietațile de interacțiune cu fluide și medii
biologice
Avacircnd icircn vederea datele obținute anterior obiectivul următor a fost realizarea și
caraterizarea de suporturi pe bază de colagen ndash chitosan ndash acid hialuronic nanoparticule
magentice și fosfați de calciu S-a selectat concentrația de 5 MNPs pentru a fi inclusă icircn etapă
de sinteză particulele fiind introduse icircn formă uscată O parte din proprietățile suporturilor au
fost studiate icircn paralel cu cele ale suporturilor expuse la radiații UV timp de 4 ore cu scopul de a
observa eventuale modificări survenite după această procedură de iradiere folosită icircn practica
clinicăpreclinică pentru sterilizare Nu au fost observate diferențe icircn ceea ce privește structura
167
Concluzii generale
chimică și morfologia suporturilor Gradul de retenție PBS a fost influențat semnificativă de
raportul CaP Viteza de degradare a crescut gradual icircn timp icircn cazul ambilor
biopolimeriValorile obţinute pentru modului lui Young sunt comparabile cu cele ale ţesutului
osos spongios uman Din punct de vedere al proprietăților magnetice valorile obținute pentru
magnetizare au indicat un caracter superparamagnetic al suporturilor Interacțiunea in vitro cu
celule (fibroblaste și osteoblaste) a dovedit faptul că suporturile nu au efect citotoxic asupra
celulelor caracterul non-citotoxic fiind evidențiat de un test sub-cutanat in vivo
Respectacircnd compoziția de biopolimeri și fosfați de calciu precum și concentrația de
MNPs un lot nou a fost realizat diferența față de cel descris anterior fiind dată de metoda de
includere a MNPs și anume au fost introduse sub formă de suspensie coloidală icircn apă
urmărindu-se obținerea unei distribuții mai uniforme a acestora icircn structura suporturilor S-au
utilizat aceleași tehnici de caracterizare ca cele descrise la punctul anterior Icircn plus un studiu mai
detaliat al morfologiei a fost realizat cu ajutorul analizei microCT Rezultatele au indicat o
influenţă semnificativă a conţinutului de fază minerală asupra porozităţii suporturilor
Proprietățile mecanice ale suporturilor sunt comparabile cu cele ale țesutului osos spongios iar
din punct de vedere al proprietăților magnetice suporturile sunt superparamagnetice
Interacțiuneain vitro a suporturilor cu celule a fost testată pe fibroblaste osteoblaste și celule
STEM Un test MTT standard a evidențiat faptul că suporturle nuafectează celulele cele mai
bune rezultate fiind observate pentru celulele STEM Citotoxicitatea in vivo a suporturilor a fost
studiată pe șoareci femele din linia CD1 Experimentul s-a desfășurat pe o perioadă de 64 zile de
la implantarea subcutanată a fragmentelor sterilizate de suporturi iar icircn final s-a ajuns la
concluzia că suporturile nu au efect toxic in vivo Totodată s-a observat asimilarea și resorbția
suporturilor
Icircn urma unor analize detaliate ale celor două loturi de suporturi preparate și caracterizate
icircn capitolele 4 și 5 lotul numărul 2 s-a dovedit a avea proprietăţi mai adecvate pentru aplicaţia
vizată iar din acest lot suportul S9 a avut cele mai bune rezultate Pentru evaluarea
reproductibilității metodei de obținere șapte suporturi avacircnd compoziţia teoretică a lui S9 au fost
preparate și caracterizate din punct de vedere al structurii chimice și a compoziției din punct de
vedere al morfologiei s-a urmărit comportamentul suporturilor icircn fluide de interes biologic
168
Concluzii generale
degradarea acestora şi s-au analizat proprietăţile mecanice Citotoxicitatea suporturilor a fost
analizată printr-un test MTT şi printr-un test de viabilitate celulară cu Calceină-AM Toate
analizele menționate au demonstrat faptul că metode de preparare propusă este reproductibilă
Potențiala aplicație a suporturilor icircn radio-chimioterapia tumorilor osoase maligne a fost
studiată icircmtr-o ultimă etapă Inițial s-a demonstrat că o doză de radiații X similară cu cea
utilizată icircn cazul iradierii metastazelor osoase nu a influențat caracteristicile suporturilor cum ar
fi structura morfologia proprietățile de degradare in vitro și citotoxicitatea in vitroSuporturile
conținacircnd MNPs icircncărcate cu DOX un medicament chimioterapeutic pentru tratamentul
metastazelor osoase și a tumorilor osoase au prezentat o eliberare graduală și lentă a DOX
sugeracircnd că aceste suporturi pot fi luate icircn considerare pentru studii viitoare icircn terapia combinată
a tumorilor osoase maligne
