Microorganisme recombinate -Sinteza de biopolimeriStudent: Mdlina-Oana POPAGenetic molecular, An I2014

Guma Xantan(E415) exopolizaharid; produs de Xanthomonas campestris - utilizeaz eficient glucoza, sucroza i amidonul;Proprieti:prezint vscozitate ridicat, chiar la concentraii reduse; stabil la temperaturi ridicate i o gam larg de pH,chiar i n prezena srurilor; lavitez mare de agitare vscozitatea scade foarte mult(pseudoplasticitate). seutilizeazpentrusosuri,buturi,deserturi,umpluturi,nlocuiete amidonul ca agent de ngroare.

X. campestris modificat genetic utilizarea lactozei (zer);Genele lac ZY (E.coli) - codific pentru -galactozidaz i lactoz-permeaz- i un promoter de la bacteriofagul X. campestris, au fost clonate ntr-un plasmid;constructul a fost introdus la E. coli, apoi transferat la X. campestris;X. campestris transformat a produs cantiti mari de gum Xantan pe mediu de glucoz, lactoz sau zer.

Fig. 1. Structura gumei Xantan: unitatea repetitiv (n) formeaz un lan de uniti de glucoz; trizaharidul este ataat a.. S alterneze cu rezidurile de glucoz din lanul repetitiv. Fig. 2. Genele lacZ (-galactozidaz) i lacY (lactoz-permeaz) de la E.coli expresia constitutiv la X. campestris

MelaninaBiopolimeri utilizai ca i pigmeni (loiuni de protecie solar, aditivi n produse cosmetice etc.); Formai din substane precum: indol, benzotiazol etc.Sinteza melaninelor:Oxidarea tirozinei la dihidroxi-fenilalanin chinon (catalizator monooxigenaz-tirozinaza, care conine Cu);ncorporarea de compui non-chinonici n structura polimeric. Transformarea E.coli, cu gene izolate de la Streptomyces antibioticus: o gen codificnd tirozinaza, iar cealalt o protein cu funcie necunoscut.Obinerea a dou constructe prin introducerea ntr-un vector de expresie de la E. coli doar gena pentru tirozinaz, iar n cellalt ambele gene (pentru tirozinaz i genele ORF438) pentru a testa care dintre gene este necesar pentru producia de melanin. S-a dovedit c biosinteza melaninei necesit produii ambelor gene.Proteina codificat de ctre ORF438 poate aciona ca i donor de Cu pentru apotirozinaz (precursorul inactiv al tirozinazei), care este activat prin achiziia de ioni de Cu.Fig. 3.Plasmide cu gene pentru biosinteza melaninei: pBGC619 conine gena pentru tirozinaz i pBGC620.3 conine gena pentru tirozinaz i genele ORF438.

Proteine adeziveCercettorii ncearc s produc o protein adeziv biopolimer, iniial izolat din midiile albastre Mytilus edulis, n celulele microbiene. Aceasta este extrem de puternic, impermeabil i permite scoicilor s se fixeze foarte bine pe suprafee variate.A fost izolat un precursor intracelular al proteinei adezive, numit precursorul de 130-kilodaltoni al proteinei; acesta este bogat n serin, treonin, lizin, prolin i tirozin (60-70% dintre aminoacizi conin o grupare OH).Majoritatea rezidurilor de prolin sunt hidroxilate la 3- sau 4-dihidroxiprolin, iar cele de tirozin la 3,4- dihidroxifenilalanin (DOPA).Analiza secvenei de aminoacizi ai precursorului a evideniat faptul c este compus din uniti repetitive, care constau dintr-o decapeptid cu secvena Ala-Lys-(Pro or Hyp)-Ser-(Tyr ori DOPA)-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys;7 din aceti 10 aminoacizi sunt hidroxilai.

A fost izolat cADN pentru precursor, care a fost apoi clonat ]n vectori de expresie de la drojdie, apoi introdui n celule, determinnd sinteza de noi forme active ale proteinei adezive (20-100 kDa).

Nivele de expresie considerabil mai ridicate au fost obinute cnd o secven de 600 bp (sintetizat chimic) pentru aceast protein a fost introdus n E. coli.

Fig. 4. Oligonucleotid sintetic utilizat pentru asamblarea genei adezive de la M. edulis

CauciucCauciucul natural, cis-1,4-poliizopren, este un biopolimer cu larg utilizare, care este obinut dintr-un numr mare de plante. Biosinteza de cauciuc pornete de la zaharuri simple i necesit aproximativ 17 pai enzimo-catalizai , pasul final fiind polimerizarea izopentenil fosfat n alil pirofosfat.

Au fost efectuate studii pentru a determina dac cauciucul poate fi sintetizat din microorganisme modificate genetic. Ca un prim pas n aceast direcie, s-a construit o bibliotec de ADNc , prin utilizarea de ARNm din plante productoare de cauciuc, precum Hevea brasiliensis. Aceast bibliotec a fost apoi analizat cu o scurt prob de hibridizare ADN sintetic a crei secven a fost bazat pe succesiunea aminoacizilor dintr-o poriune de enzim polimeraz.

Clona ADNc poate acum fi folosit, eventual mpreun cu alte gene n sinteza de cauciuc, n ncercarea de a produce cauciuc natural ntr-un sistem microbin. Alternativ, poate fi folosit ca o surs de cauciuc a polimerazei pentru a dezvolta un sistem de catalizator n vitro. n orice caz, cercetarea care ar putea duce la o nou rut sintetic pentru producia de cauciuc este n curs de desfurare.

PolihidroxialcanoaiClas de polimeri biodegradabili, produi de variate microorganisme, n special Alcaligenes eutrophus.Poli (acidul 3- hidroxibutiric) a fost cel mai intens studiat, cunoscdu-se att structura polimerului ct i genele implicate n sinteza acestuia.E. coli a fost transformat folosindu-se genele pentru sinteza Poli (acidului 3- hidroxibutiric), dar plasmidele erau instabile, motiv pentru care a fost introdus locusul parB, care a dus la stabilizarea acestora (mediaz stabilitatea prin omorrea post-segregaional a celulelor care nu conin transformantul).Poli (acidul 3- hidroxibutiric) este sintetizat din acetil-CoA n trei etape catalizate de trei enzime.

Fig. 5.Sinteza poli (acidului 3- hidroxibutiric) din acetil-CoA.

Acid hialuronicAcidul hialuronic este un polisulfat, un polimer constnd dintr-o unitate repetitiv de dizaharid (acizii d-glucuronic i d-N-acetilglucozamin unite prin legturi glicosidic -1,4 i -1,3) (Fig. 6)

Transformarea B. subtilis pentru a producea de acid hialuronic.Izolarea de la Streptoccocus pyogenes a genei pentru sinteza (de tip A) acidului hialuronic, prin screeningul imunologic Utilizarea PCR-ului pentru a amplifica gena pentru sintaza acidului hialuronic de tip C (hasA) din S. equisimilis ,bazat pe secvena de gene din S. pyogenes Crearea unui operon sintetic care conine gena hasA i analogii si din B. Subtilis, genele hasB i hasC, sub controlul promotorului amyQ de la B. AmyloliquefaciensIntroducerea operonului sintetic ntr- o plasmid din B. subtilisIntegrarea operonului sintetic n genomul B. subtilis

Fig. 6. Structura repetabil a unitii dizaharidice de acid hialuronic.

Bibliografie selectivPfeifer, B. A., S. J. Admiraal, H.Gramajo, D. E. Cane, C. Khosla, 2001, Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science 291:17901792.Salerno, A. J., I. Goldberg. 1993.Cloning, expression, and characterization of a synthetic analog to the bioadhesive precursor protein of the sea mussel Mytilus edulis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:221226.Nikel, P. I., A. de Almeida, E. C. Melillo, M. A. Galvagno, M. J. Pettinari, 2006, New recombinant Escherichia coli strain tailored for the production of poly(3-hydroxybutyrate) from agroindustrial by-products. Appl. Environ. Microbiol. 72:39493954.

Biopolimerii sunt macromolecule sintetizate de microorganisme, plante si animale. Unii dintre acesti polimeri au proprietati fizice si chimice care sunt utile in industria alimentar (procesare), farmaceutic etc.Abilitatea de a modifica genetic organismele a stimulat cercettorii s creeze noi biopolimeri, s nlocuiasc polimerii sintetici cu echivaleni biologici, s modifice biopolimerii existeni, s le mbunteasc caracteristicile fizice i structurale i s identifice moduri de a crete productivitatea i de a scdea costurile de producie a biopolimerilor la nivel industrial.**Xanthanul a fost descoperit in 1940 de ctre Allene Rosalind Jeans i echipa sa de cercetare de la Departamentul de Agricultur a Statelor Unite, care l-au izolat din vegetalele infectate cu Xanthomonas campestris. El a fost primul poliglucid microbian obinut la nivel industrial. Guma Xanthan este un heteropoliglucid anionic ,extracelular, ramificat, constituit dintr-o unitate pentaglucidic care se repet i care formeaz coloana vertebral a glucanului, constituit din dou reziduri de -D glucozil, dou reziduuri de D-manoz i un rest de acid D-glucuronic(figura 1). Din punct de vedere chimic Xanthanul conine, n principal , D-glucoz (40%), D-manoz(22%), acid D-glucuronic(22%), acid piruvic (4%), grupri acetil(2%). Compoziia chimic a gumei xanthan difer n funcie de tulpina Xanthomonas utilizat n procesul de biosintez, de compoziia mediului de cultur (sursa de carbon folosit, prezena i nivelul fosforului din mediu), de parametrii de fermentare i de timpul de cultivare. *Melaninele pot fi obinute n cantiti mici prin extracie din surse naturale sau prin sintez chimic. Tehnologia ADN recombinat a fcut posibil producerea de melamine cu diferite proprieti fizice, ieftin i la scar larg.Sinteza melaninelor are ca prim pas oxidarea tirozinei. Stadiile finale ale polimerizrii melaninei sunt non-enzimatice i depind de natura chimic a compuilor non-quinonici care sunt ncorporai n structura polimeric (n general compui organici hidroxilai). Produsul final poate fi negru, maro, galben, rou sau violet. n condiii naturale, dup ce dihidroxi-fenilalanin chinon este produs, o varietate de compui cu greutate molecular mic (non-chinone) pot fi ncorporai n polimerul final. Natura fizic i chimic a melaninei care se formeaz, inclusiv culoarea, poate fi manipulat pn la un anumit punct prin adiia n mediu al unor cantiti variate de compui specifici cu greutate molecular mic. Genele izolate de la Streptomyces antibioticus au fost selectate pe baza abilitii de a schimba culoarea n prezena unor compui specifici care au fost adugai n mediu.

*Proteina adeziv i ADNc au trsturi neobinuite, care ar putea face clonarea, exprimarea i producerea unei proteine funcionale adezive dificile ntr-o gazd heterolog. n primul rnd, natura extrem de repetitiv a proteinei adezive ADNc ar putea face instabil recombinarea omologat i, ulterior, pierderea de poriuni de secven clonat. n al doilea rnd, prolina, lizina si tirozina reprezint aproximativ 70% din aminoacizii proteinei ; prin urmare, niveluri foarte ridicate de sintez nu pot fi realizabile deoarece transferul intracelular corespunztor ar putea fi limitat. De aceea a fost izolat un precursor al proteinei.*Ca muli ali adezivi sau cleiuri, proteinele adezive trebuie s fie activate nainte de utilizarea efectiv. Atunci cnd forma precursoare a proteinei adezive este oxidat, proteinele cross-linked se pot prinde de suprafee variate, inclusiv polistiren, sticl, hidrogel i colagen. Se anticipeaz c biopolimerii adezivi vor fi utilizai pe scar larg att n medicin ct i n stomatologie. Din pcate, proprietile adezive ale acestei proteine o face extrem de dificil de purificat ( se lipeste totul) limitnd, astfel, posibilitile sale comerciale.Calea pentru hidroxilarea posttranslaional n vitro a unor reziduuri de tirozin n proteine adezive din M. edulis: Tirozina este convertit la DOPA prin aciunea enzimei tirozinazei i apoi poate fi oxidat la o-chinon, de ctre catecol oxidaz sau tirozinaz. Oxidarea DOPA la o-chinon poate fi prevenit prin adugarea de acid ascorbic .

*Polihidroxialcanoai sunt o clas de polimeri biodegradabili, care sunt produi de un numr de diferite microorganisme, mai ales Alcaligenes eutrophus, i folosii ca material intracelular de stocare de carbon i energie. Aceti compui au proprieti termoplastice sau elastice, n funcie de compoziia polimerului, i sunt luai n considerare pentru utilizarea n sinteza unei game largi de materiale plastice biodegradabile. Poli (acid 3-hidroxibutiric) este cel mai bine studiat i caracterizat polihidroxialcanoat. Poli (3-hidroxibutiric acid), copolimer su [poly(3-hidroxibutirat-co-3-hidroxivalerat)], i un alt polihidroxialcanoat [poli (3-hidroxivaleric acid)] sunt produse comerciale n Marea Britanie prin fermentarea de A. eutrophus. Dei este posibil s se produc poli (acid 3-hidroxibutiric) ca un produs secundar de cretere de A. eutrophus, organismul crete relativ lent, necesit o temperatur relativ sczut, este dificil a liza [face purificarea de poli (3-hidroxibutiric acid) granule dificil] i folosete doar un numr limitat de surse de carbon pentru cretere. Pe de alt parte, cnd genele pentru biosinteza acestui polimer au fost transferate la E. coli, rezultatul transformant a crescut rapid la o densitate mare de celule i a acumulat cantiti foarte mari (pn la 95% din greutatea uscat de celule) de poli (3-hidroxibutiric acid). Poli (3-hidroxibutiric acid) este sintetizat de acetil-CoA n trei etape catalizate de trei enzime.

*Acest polimer este o component a cartilajului articular, caz n care este prezent ca o hain n jurul celulelor; este important n esutul hidrodinamicii, micare i proliferarea celulelor; este utilizat pentru a trata osteoartrita i pentru a facilita vindecarea rnilor. Acidul hialuronic este folosit ca o component a unor produse cosmetice i creme hidratante ale pielii.

*