structure of a fish (rainbow trout) growth

8/14/2019 Structure of a Fish (Rainbow Trout) Growth

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Structure of a Fish (Rainbow Trout) Growth Hormone Gene and Its Evolutionary Implications

L. B. Agellon, S. L. Davies, T. T. Chen, and D. A. Powers

doi:10.1073/pnas.85.14.51361988;85;5136-5140PNAS

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 8 5 , p p . 5 1 3 6 - 5 1 4 0 , J u l y 1 9 8 8E v o l u t i o n

S t r u c t u r e o f a f i s h ( r a i n b o w t r o u t ) g r o w t h h o r m o n e g e n e a n d i t se v o l u t i o n a r y i m p l i c a t i o n s( i n t e r n a l r e p e a t s / n u c l e o t i d e s e q u e n c e / e v o l u t i o n )

L . B . A G E L L O N * t , S . L . D A V I E S * t , T . T . C H E N t , AND D . A . P O W E R S * t * D e p a r t m e n t o f B i o l o g y a n d t T h e C h e s a p e a k e B a y I n s t i t u t e , T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y , B a l t i m o r e , MD 2 1 2 1 8 ; a n d C e n t e r f o r M a r i n e B i o t e c h n o l o g y ,U n i v e r s i t y o f M a r y l a n d , B a l t i m o r e , MD 2 1 2 0 2C o m m u n i c a t e d b y C . L a d d P r o s s e r , M a r c h 1 1 , 1 9 8 8ABSTRACT We h a v e i s o l a t e d a n d s e q u e n c e d a c l o n e f r o ma r a i n b o w t r o u t ( S a l m o g a i r d n e r i ) g e n o m i c l i b r a r y t h a t c a r r i e sa g e n e e n c o d i n g a f i s h g r o w t h h o r m o n e ( G H ) . T h i s g e n e s p a n sa r e g i o n o f =4 k i l o b a s e s , n e a r l y t w i c e t h a t o f m a m m a l i a n GHg e n e s . T h e t r o u t GH g e n e i s c o m p r i s e d o f s i x e x o n s , i n c o n t r a s tw i t h f i v e e x o n s i n m a m m a l s . T h e a d d i t i o n a l i n t r o n i n t h e f i s hg e n e i n t e r r u p t s t r a n s l a t e d r e g i o n s t h a t a r e a n a l o g o u s t o t h e l a s te x o n o f i t s m a m m a l i a n c o u n t e r p a r t . I n a d d i t i o n , t h e a l l e g e di n t e r n a l l y r e p e a t i n g s e q u e n c e i n m a m m a l i a n G H , p r o l a c t i n( P r l ) , o r p l a c e n t a l l a c t o g e n ( P L ) i s n o t o b s e r v e d i n t h e p r e d i c t e dp o l y p e p t i d e s e q u e n c e o f f i s h G H . D i r e c t r e p e a t s t h a t f l a n ke x o n s I , H I , a n d V o f t h e m a m m a l i a n G H , P r l , a n d PL g e n e sa r e a b s e n t i n t h e f i s h GH g e n e . T h e s e f i n d i n g s i n d i c a t e t h a t t h er a i n b o w t r o u t GH g e n e s t r u c t u r e d o e s n o t s u p p o r t t h e c u r r e n th y p o t h e s i s t h a t i n t e r n a l l y r e p e a t e d r e g i o n s i n G H , P r l , a n d PLa r o s e f r o m a s m a l l p r i m o r d i a l g e n e .G r o w t h h o r m o n e ( G H ) , p r o l a c t i n ( P r l ) , a n d p l a c e n t a l l a c t o g e n( P L ) f o r m a f a m i l y o f p o l y p e p t i d e s w i t h r e l a t e d s t r u c t u r e a n df u n c t i o n ( 1 - 3 ) . GH a n d P r l a r e s y n t h e s i z e d m a i n l y b y s o m a -t o t r o p h s a n d l a c t o t r o p h s , r e s p e c t i v e l y , i n t h e a n t e r i o r p i t u i t a r yg l a n d , w h e r e a s PL i s s y n t h e s i z e d b y s y n c y t i o t r o p h o b l a s t s i nt h e m a m m a l i a n p l a c e n t a . I n v e r t e b r a t e s , GH i s r e s p o n s i b l e f o rs t i m u l a t i n g g r o w t h , w h e r e a s P r l p r i m a r i l y f u n c t i o n s a s ar e p r o d u c t i v e h o r m o n e ( 4 ) . T h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f mamma-l i a n PL i s t h e l e a s t u n d e r s t o o d o f t h e s e t h r e e h o r m o n e s . O n ep o s s i b l e f u n c t i o n i s t o a u g m e n t t h e c a r b o h y d r a t e - r e g u l a t i n gp r o p e r t i e s o f GH d u r i n g p r e g n a n c y ( 5 ) .T h e n o t i o n t h a t t h e s e t h r e e h o r m o n e s s h a r e a commona n c e s t r y w a s i n i t i a l l y s u g g e s t e d b e c a u s e o f t h e i r r e l a t e db i o l o g i c a l a n d i m m u n o l o g i c a l p r o p e r t i e s ( 6 - 8 ) . B a s e d o n t h es t r u c t u r e o f t h e s e h o r m o n e s a n d t h e g e n e s t h a t e n c o d e t h e m ,i t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e y e v o l v e d f r o m a commona n c e s t o r , w h i c h , i n t u r n , a r o s e b y r e p e a t e d d u p l i c a t i o n o f as m a l l e r g e n e o r c o d i n g r e g i o n ( 3 , 9 , 1 0 ) . T h e m a j o r i t y o f t h ed a t a u s e d t o g e n e r a t e t h i s h y p o t h e s i s h a s b e e n d e r i v e d f r o mm a m m a l i a n s p e c i e s ( 6 - 8 ) . T o t e s t t h e a p p l i c a b i l i t y o f t h i se v o l u t i o n a r y m o d e l t o v e r t e b r a t e s i n g e n e r a l , we h a v e c l o n e da n d s e q u e n c e d a g e n e e n c o d i n g GH i n t h e t e l e o s t f i s h , r a i n -bow t r o u t ( S a l m o g a i r d n e r i ) .

MATERIALS AND METHODSM o l e c u l a r C l o n i n g a n d I s o l a t i o n o f G e n o m i c C l o n e s . DNAu s e d i n t h e c o n s t r u c t i o n o f t h e t r o u t g e n o m i c l i b r a r y w a sp u r i f i e d f r o m t e s t e s d i s s e c t e d f r o m a s i n g l e t r o u t . T h e l i b r a r yw a s p r e p a r e d b y p a r t i a l d i g e s t i o n o f t e s t e s DNA w i t h E c o R I ,c l o n i n g i n t o C h a r o n 4 , a n d a m p l i f i c a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l is t r a i n L E 3 9 2 . T h e r a i n b o w t r o u t GH cDNA [ t h e 9 0 0 - b a s e -p a i r ( b p ) P s t I / E c o R I f r a g m e n t o f p A F 5 1 ] ( 1 1 ) w a s l a b e l e d b y

A B C D E F2 3 . 1 *

9 . 456 . 5 0 ^, AM4 . 3 .

232 . 0 0

F I G . 1 . B l o t a n a l y s i s o f RTGH14B2 a n d t r o u t t e s t e s DNA.R a i n b o w t r o u t t e s t e s DNA ( 1 0 A t g ) a n d RTGH14B2 DNA ( 5 n g ) w e r et r e a t e d w i t h v a r i o u s r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s , r e s o l v e d o n a 0 . 8 %a g a r o s e g e l , a n d t h e n t r a n s f e r r e d o n t o a n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e .T h e p r o b e ( E c o R I / P s t I f r a g m e n t o f p A F 5 1 ) ( 1 1 ) w a s l a b e l e d t o as p e c i f i c a c t i v i t y o f 1 x 1 0 i d p m / , u g b y r a n d o m p r i m i n g ( 1 2 ) a n dh y b r i d i z e d t o t h e b l o t t e d DNA o v e r n i g h t . A f t e r w a s h i n g , h y b r i d i z i n gf r a g m e n t s w e r e v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a p h y . L a n e s A - C , t r o u tt e s t e s DNA; D - F , RTGH14B2 DNA; A a n d D , E c o R I ; B a n d E ,E c o R I a n d H i n d I I I ; C a n d F , E c o R I a n d P s t I . M o b i l i t y o f s i z em a r k e r s ( A H i n d I I I f r a g m e n t s ) i s s h o w n ( i n k b p ) o n t h e l e f t .t h e r a n d o m p r i m i n g m e t h o d ( 1 2 ) a n d u s e d a s a p r o b e f o rp l a q u e h y b r i d i z a t i o n s c r e e n i n g o f t h e l i b r a r y ( 1 3 ) . H y b r i d -i z a t i o n w a s u n d e r s t r i n g e n t c o n d i t i o n s : 50% f o r m a m i d e / 1 %N a D o d S O 4 / 1 M N a C I / 1 0 % d e x t r a n s u l f a t e , 4 2 T C . DNA f r o mp o s i t i v e c l o n e s w a s p u r i f i e d a n d f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d b yr e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e m a p p i n g a n d DNA b l o t a n a l y s i s ( 1 4 ) .O n e c l o n e , R T G H 1 4 B 2 , w h i c h c a r r i e s a n i n s e r t o f 1 4 . 8 k b p ,w a s s e l e c t e d f o r s e q u e n c e a n a l y s i s .S e q u e n c e A n a l y s i s . T h e 6 . 8 - k b p P s t I f r a g m e n t o fRTGH14B2 t h a t h y b r i d i z e d w i t h t h e GH cDNA p r o b e w a ss u b c l o n e d i n t o t h e P s t I s i t e o f p l a s m i d pUC8 ( 1 5 ) . O r d e r e dA b b r e v i a t i o n s : G H , g r o w t h h o r m o n e ; P r l , p r o l a c t i n ; P L , p l a c e n t a ll a c t o g e n .t P r e s e n t a d d r e s s : C o l u m b i a U n i v e r s i t y C o l l e g e o f P h y s i c i a n s a n dS u r g e o n s , 6 3 0 W e s t 1 6 8 t h S t r e e t , New Y o r k , NY 1 0 0 3 2 .I T h e s e q u e n c e r e p o r t e d i n t h i s p a p e r i s b e i n g d e p o s i t ed i n t h eE M B L / G e n B a n k d a t a b a s e ( I n t e l l i G e n e t i c s , M o u n t a i n V i e w , C A ,a n d E u r . M o l . B i o l . L a b . , H e i d e l b e r g ) ( a c c e s s i o n n o . J 0 3 7 9 7 ) .

5 1 3 6

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h ar g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


3/6

E v o l u t i o n : A g e l l o n e t a l . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 5 ( 1 9 8 8 ) 5 1 3 7g t c a a gt t a c a g g g t t g t g t c t g t c t g t g t g a - 3 0 1

- 3 0 0 c t g a g t g t a a c t t t g t t c a t t c a t t a t g t c c t a g a c a a c a g a g g t t t g t g t c g t c t g t g t t t t g a c c c t c a t t t gt c a a g t c a t c ga g t a c g t t t t t t g t - 2 0 1- 2 0 0 t t t t a g g a g t c a c c t c t t c c c g a a c t c a t g g a a a a a t t c a t g a t t g a t t t g a c g c a t t a t a c t ga t t gt t c c a t a g t c a c a t a c a a a a a c a g g t c c c a t c - 1 0 1- 1 0 0 g g c g a g a g g t g g t a c a t g g a g a a a a t c t c a t g t t t c c t c c t g t t g a t a c a t t a a a a c a t g t g t t c t c c a t c t a t a a a a a c a g t g g c c c c a a a c a a g c g g c - 1

1 A A C A T A C T G A A C C G A C C A C C A C A CT T T C A A G T G A A G T A A T C A T C C T T G G C MTTAAGAGA AAAAMTGGG A C A A G g t a a a c c a g c t t t t a t t t t a t t t t t 1 0 01 0 1 t t a a g t g g g a a g t c a g t g t a c c a t t t a a t a c c a t t t a a c t t t a a c a t t t a a t c a c t g a g g c a g g g g c c a a g a a g g c a g a g a a a g a g t g a a c a a g t a a t g t 2 0 02 0 1 a c t g c c a t g a g g g t a t a a t c t a c t t a c a c a g a a c c a c t t c c t t t a a c a a c c t a a c c a t g t g a t c t a t t a g a t t t a c a t t t g a g t t a t t t a g c a g a g a c t c 3 0 03 0 1 t t a t c c a g a g c g a c t t a c a g g a gc a a t t a g g g t t a a g t g c c t t g c t c a a g g g c a c a t c a a c a g a t t t c t c a c c t a g t c a g c t c a g g g a t t c a a a c c a p t a 4 0 04 0 1 a c c t t t c a e t t a c t R e c c c a a c t c t c t t a a t c g c t a gg c t a a t g a g a aa g a t a g c a a a t t g a g a a t a t c t t a c t a t t g a g a a t a t c t t a c t a a c a t g t c g 5 0 05 0 1 c a a c a t c a t t t g a c t t a c t c g t t t t t a t a c a t t t c t t a t t t t c t g t c a t c t c t c t t t t a g T G T T T C T G C T G A T GC C A G T C T T A C T G G T C A G T T G T T T C C T 6 0 06 0 1 G G G T C A A G G G G C G G C G A T G G A A A A C C A A C G G C T C T T C M C A T C G C G G T C A A C C G G G T G C A A C A C C T C C A C C T A T T G GC T C A G A A A A T GT T CMCGACTTT 7 0 07 0 1 g t a a g a c a g c t t t t g a a t c t t c t t t t g a c a c a gc a ga t a a t g t t t c a ga g g t g t t t c c t c t t c t t t g t a g a c a a g t gt c c t c t t c a c gc a a a c c g a g c g g 8 0 08 0 1 c a a a a c a t t c t c t c t c c c g t c t t t gt g a t t t t g t g c a g G A A G G C A C C C T G T T G C C T G A T G A A C G C A G A C A G C T G A A C A A G A T A T T C C T G C T G G A C T T C T G 9 0 09 0 1 T A A C T C T G A C T C C A T C G T G A G C C C A A T C G A C M G C A G G A G A C T C A G A A G A G T T C A g t a a g t t a c c t g g c t g a ga c a a t c c t c c a t g a t g c a c g a t t c c a a 1 0 0 0

1 0 0 1 c a t g a a t a a t a g g g c a t c t c a a t t t g a a c a a t c g a t a c a a c t t a g t c a t t a g t t a t t g g g c a a g c a g a t c c c c g a t t g t c t a a a c t c c a t g g g t a a t a t a 1 1 0 01 1 0 1 c t g t a g a t a a g c a g a a c c a g c a t c a t g t a t g g t g ga a a t t a a a t c t a gc c a t g a c a gg g a g t t t t a a a t t g t a c a c t t a a a a t c gg c a gt a a a a t a a t g c 1 2 0 01 2 0 1 t a t a c c t c a g t g c c t t c a a a a a c a a c c a c a t a t c a t a g t c c t t g t a a g t a a a a c c c a t c a c t c t c t a a a t c g g c g gt t t c t c t a c g t c t a c a t t c t c c a g 1 3 0 0

1 3 0 1 c c a t g t a t c a t g t a a a t g a t a t gg c a t c t c a a g c t g t a c a a t t a c a t c t c a a c t t c a t t t t c t a a t a a t c t g t g g t t t c t c t a c a t c t a c a c a c a c a g GT 1 4 0 01 4 0 1 C C T GA A G C T G C T C C A T A T C T C T T T C C G C C T G A T T G A A T C C T G G G A GT A C C C T A GC C A G A C C C T GA C C A T C T C C A A C A G C C T A A T G G T C A G A M C T C C A A C 1 5 0 01 5 0 1 C A G A T C T C T G A G A A G C T C A G C G A C C T C A A A G T G G G C A T C A A C C T G C T C A T C M A G g t a a t g g t c a a t g a c c a t t t g t gg t g a c g c a c t t t g t c g a t t t t t a 1 6 0 01 6 0 1 a c t c a a a t a c t t c t a g t a a g t t g a a gt c a g t c a a t g a a a a g t c a t t a t t a c t t c a a a t g t c t a t g t gg t a c t g gc t c a a a t c t a a a t g a g t c a c a t c a a t 1 7 0 01 7 0 1 g c a a t t t t t t a a a g t t a t a a g a a a t g a a c t t t t t a c c c a g c a t g c t c t a c t a c a g g t a g a t t t t t t g g a a t t g t t t t t a a t a t c t gt g t t t t t g c a t g t a 1 8 0 01 8 0 1 c a g t a c a t t g a g t g a t t g a t t g a t t g a t t c a t c t t a t gc t a c a c a c a g a t a t a t g a c g t a c a t t t t t c t a c a t t t t c a c a a a g g t a a a t a a c a t a c a a g g 1 9 0 01 9 0 1 t a c c g a a a t t t t g c a a a c c t a c t t g c a g g c c t g a t g t g g c c t g t a a a c c a t g a g t t t c a g g c c a c t g t a t t t g g g a a a a g ctacacctca a a a t a a g g c c 2 0 0 02 0 0 1 t t a t a a g a t a t g t a a t a t a t t g t t a t a a a g a g t t t a a c t a t a a t g a t a a t a t t t g c c t a g aaaatcactt g a a g g c c a c a g g a c t g a a a a t t a a t g a c a a 2 1 0 02 1 0 1 c a a a c a t g a t aattctacaa ttcactcaaa a g g c a a g g c a c a c t t g g a a a g t a t a t t g g a g a c a t g t c t t a g t g g g g g c a ttactaaaaa a t g t c a a g c t 2 2 0 02 2 0 1 g a t a c c a c t c a a a t c t c a a c c c t c t a c a g g g c ga c t c t a t a g g t t t g a g t a a t g a c t a t a a a a t c a c t t t a a g c g a c t g t a g t c a g a t t c t g t a t a t t a a 2 3 0 02 3 0 1 g t g c a a c g g t ttcctcaaaa g t t t t g a g t a a t g a c a gc a c a t t s g g g t t t a c a a t a t t g t t g t t a t c t t c c a c t g a c a t g a a a g t g a a a t a c a a c t a t a c 2 4 0 02 4 0 1 t t t c c t a g t t a g a a a a c a t a a t t a g g a c c a c gt a t g t c t c t t c t c a g c a g a t c t t t c a g c g c t t t c c a t t g t g a c g g g g t a a c t c a c c t c a t c g a t c a t 2 5 0 02 5 0 1 c a c t a a t a g t gactatatca g t a a c a c c c c a t t c a a t g a c ' t g a a t a t t g g c c c a t t c a a g g a c a t t t a t g c a t g t g t c t t t t g c c a t a t g t g c t t g t a g a 2 6 0 02 6 0 1 a t g g c c a a a t a a a c a a g t a t t g t t a t g c a c a c c t c c a c c c c a c c a t gc a t c t c t c t c t g t c t c c c a c a g G G G A G C C A G G A T G GC G T A C T G A G C C T G GA T G 2 7 0 02 7 0 1 A C A A T G AC T C T C A G C A T C T G C C C C C C T A C G G G A A C T A C T A C C A GA A C CT G G G G G G C G A C G G C A A C G T C A G GAGGMCTAC G A GC T G T T GG C C T GC T T C A A 2 8 0 02 8 0 1 G A A G G A C A T G C A T A A G g t g g a a g a c c a t g t t g c c t t c a a t t g c a t g t g c c ttcctatatt t c c t a c a g t g c g a t t g t t t t t t t g t g a t c t c t a t t g t g a a 2 9 0 02 9 0 1 g t a t c t t t a t a g g t c t t t a a c c c a t t t g t t attactatta t t g t t c a t t g a t c a a g a c t g g t c t c g a ga a a g t c c t g gt g a c t t a ga a c a t t c a c a t t a a 3 0 0 03 0 0 1 a a t g t g t c a a c t a t a a c c t a t t c t t c t t g t cccccccccc cccccccccc ccacccccaa g G T T G A G A C C T A C C T G A C C G T C G C C A A G T G C A G G A A G T A T 3 1 0 03 1 0 1 C T G G A G G C C A A C T G C A C T C T G T A A A C G T G G G C C G G A G C G G A G C A G C A A G A G C C T G T C T C C A G G G T T C G G T T T C C C A G A T A C A G A T G A G A C C I T T C C C T G C 3 2 0 03 2 0 1 A C T G A A G A G C A T G T T C A A T T G A G A T T C T C C A T T A G G C A T G T 1 T m T l T A G T C T A G A G T A G A T T T C A T T T G G A T C T G G T A G A G C C T G G C T C C A G G G G T r 3 3 0 03 3 0 1 C A A G C A T T T T G C A T T T T G T T C T C T G A A A T C A A C T T T C T A T G A T T T T C A C T C C A T T A C T C G G A G C T A C C A C T G A T C C A T G G A C A T T I T A G A T T A G T A C A T T 3 4 0 03 4 0 1 T A T T G A A A A G G T T T A A A T A T G T C T T A T T T A G A T A T A T G A T T C A A G G T G G T GG T GC C A T T T A T G CA T A A A T T A A T A r T T A G A G G T G A A A T G G G A A C A T G 3 5 0 03 5 0 1 T A G AG C T CC A A T C T T T AG GT A C G T C C A C A G A T G G A T A A T A T A I T T T T A G A G T C A T T T C CT T G A AG T A T T T T C A T T C C T T T A T C T T A C T G T T T G A A A C G A A T 3 6 0 03 6 0 1 A G T G A T T C G T TTTCAAA C I r c T c T G C g g t a c a t g a t c t c t t g g c t a c t a t t t g c t a t ctttcaaatc a a c a t t t t t g t t a c a a g t t t c t a g c c c c a a 3 7 0 03 7 0 1 c a t t c c t a t t g t g t c c c t t g g a c a a c t t a a g g c t g g a t t c a a t t c g t a t c g c a g a c g c t c c a t t g a a a t g t a a a g g c a a t g t t c c c t g c g t t c g t g g a g a 3 8 0 03 8 0 1 c g g c a t t c a c c g c a a a c gc t g c a t a t g t c a g g c t c g t t c

F I G . 2 . T h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e t r o u t GH g e n e was d e t e r m i n e d f r o m a s e r i e s o f c l o n e s c a r r y i n g d e l e t i o n s o r i g i n a t i n g f r o m e i t h e r e n do f t h e P s t I f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e t r o u t GH g e n e . T h e g e n e s p a n s a r e g i o n o f - 4 0 0 0 b p i n t h e t r o u t g e n o m e . T h e "TATA b o x " a n d t h e p o l y ( A )s i g n a l a r e s h o w n o v e r l i n e d a n d i n b o l d p r i n t . T h e p u t a t i v e c a p s i t e ( + 1 ) , l o c a t e d 2 2 n u c l e o t i d e s d o w n s t r e a m f r o m t h e TATA b o x , w as d e t e r m i n e db y a l i g n i n g t h e GH g e n o m i c a n d cDNA s e q u e n c e s . E x o n s a r e s h o w n i n u p p e r c a s e ; i n t r o n s a n d f l a n k i n g r e g i o n s a r e i n l o w e r c a s e . S e q u e n c e sc a p a b l e o f f o r m i n g h a i r p i n s t r u c t u r e s a n d a t a n d e m l y r e p e a t e d s e q u e n c e a r e u n d e r l i n e d .d e l e t i o n s ( 1 5 0 - 2 0 0 b a s e s ) o r i g i n a t i n g f r o m e i t h e r e n d o f t h e M 1 3 m p l 9 ( 1 7 ) . T h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e GH g e n e w a s6 . 8 - k b p P s t I f r a g m e n t w e r e c r e a t e d b y u s i n g B A L - 3 1 ( 1 6 ) a n d d e t e r m i n e d f r o m t h e s e d e l e t i o n d e r i v a t i v e s b y u s i n g t h er e s u l t i n g f r a g m e n t s w e r e r e c l o n e d i n t o e i t h e r M 1 3 m p l 8 o r S a n g e r s e q u e n c i n g p r o c e d u r e ( 1 8 ) .


4/6

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 5 ( 1 9 8 8 )RESULTS

I s o l a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e R a i n b o w T r o u t GHG e n e . T h i r t y c l o n e s ( o u t o f 5 0 0 , 0 0 0 c l o n e s s c r e e n e d ) w e r ei s o l a t e d f r o m a r a i n b o w t r o u t g e n o m i c l i b r a r y b y v i r t u e o ft h e i r h y b r i d i z a t i o n t o t h e 9 0 0 - b p E c o R I / P s t I f r a g m e n t o f t h er a i n b o w t r o u t GH cDNA c l o n e ( p A F 5 1 ) ( 1 1 ) . O n e c l o n e( R T G H 1 4 B 2 ) , w h i c h c o n t a i n s a 1 4 . 8 - k b p E c o R I f r a g m e n t ,w a s s e l e c t e d f o r d e t a i l e d a n a l y s i s . F i g . 1 s h o w s t h e h y b r i d -i z a t i o n p a t t e r n o f t r o u t t e s t e s DNA a n d RTGH14B2 DNA.T r o u t t e s t e s DNA d i g e s t e d w i t h E c o R I p r o d u c e d s e v e r a lf r a g m e n t s , r a n g i n g i n s i z e f r o m 6 t o 1 5 k b p , w h i c h h y b r i d i z ew i t h p A F 5 1 . T h e l a r g e s t o f t h e s e f r a g m e n t s c o m i g r a t e s w i t ht h e E c o R I f r a g m e n t c a r r i e d b y c l o n e R T G H 1 4 B 2 . T h e h y -b r i d i z a t i o n p a t t e r n o f RTGH14B2 DNA t r e a t e d w i t h E c o R Ia n d H i n d I I I o r w i t h E c o R I a n d P s t I i s a s u b s e t o f t h e p a t t e r no b s e r v e d i n t h e c o r r e s p o n d i n g g e n o m i c l a n e s ( F i g . 1 ) . T h ea d d i t i o n a l h y b r i d i z i n g f r a g m e n t s i n t h e t r o u t t e s t e s DNA ( F i g .1 , l a n e s A- ) r e p r e s e n t t h e o t h e r c o p y o f t h e GH g e n e( u n p u b l i s h e d d a t a ) a n d n o t t h e P r I g e n e . S a l m o n i d GH a n d P r ls h a r e n o d e t e c t a b l e i m m u n o l o g i c a l r e l a t e d n e s s ( 1 9 ) .T h e s m a l l e s t s i n g l e f r a g m e n t o f c l o n e RTGH14B2 s h o w n i nF i g . 1 t h a t c a r r i e s t h e GH t r a n s c r i p t i o n u n i t i s a 6 . 8 - k b p P s tI f r a g m e n t . A f t e r s u b c l o n i n g t h i s f r a g m e n t , d e l e t i o n d e r i v a -t i v e s o r i g i n a t i n g f r o m e i t h e r e n d o f t h e f r a g m e n t w e r ec o n s t r u c t e d a n d s e q u e n c e d ( F i g . 2 ) .T h e o r g a n i z a t i o n o f t h e t r o u t GH g e n e w a s d e t e r m i n e d b ya l i g n i n g t h e t r o u t GH cDNA s e q u e n c e ( 1 1 ) w i t h t h e c o r r e -s p o n d i n g r e g i o n s o f t h e GH g e n o m i c g e n e . T h e 5 ' r e g i o n o ft h e GH g e n e c o n t a i n s t h e s e q u e n c e 5 ' TATAAAAA 3 ' ( 2 0 ) 2 2n u c l e o t i d e s f r o m t h e p u t a t i v e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e . A n a l -y s i s o f t h e 5 ' s e q u e n c e , u p t o 3 3 2 n u c l e o t i d e s u p s t r e a m f r o mt h e c a p s i t e , d i d n o t r e v e a l t h e e x i s t e n c e o f a n y s e q u e n c es i m i l a r t o o t h e r c o n s e n s u s p r o m o t e r e l e m e n t s . T h e DNAb i n d i n g s i t e s o f t h e g l u c o c o r t i c o i d - a n d t h y r o i d h o r m o n e -r e c e p t o r c o m p l e x e s h a v e b e e n l o c a l i z e d i n t h e m a m m a l i a nGH g e n e s ( 2 1 , 2 2 ) . S e q u e n c e s w i t h s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y t ot h e s e s i t e s w e r e n o t o b v i o u s i n t h e t r o u t GH g e n e . H o w e v e r ,i t i s c u r r e n t l y n o t c l e a r w h e t h e r t h y r o i d a n d g l u c o c o r t i c o i dh o r m o n e s c o n t r o l f i s h GH g e n e e x p r e s s i o n i n a m a n n e rs i m i l a r t o t h a t i n m a m m a l s ( 2 3 - 2 5 ) . T h e p o l y ( A ) s i g n a l 5 'AATAAA 3 ' ( 2 6 ) i s l o c a t e d a t t h e 3 ' r e g i o n o f t h e g e n e( p o s i t i o n + 3 6 1 5 ) . T h u s , t h e r a i n b o w t r o u t GH g e n e s p a n s ar e g i o n o f = 4 0 0 0 b a s e s , n e a r l y t w i c e t h e s i z e o f i t s m a m m a l i a nc o u n t e r p a r t s ( F i g . 3 ) .S i x e x o n s ( e x o n 1 , 7 5 b p ; e x o n I I , 1 4 0 b p ; e x o n I I I , 1 1 7 b p ;e x o n I V , 1 5 6 b p ; e x o n V , 1 4 7 b p ; e x o n V I , 5 6 8 b p ) a n d f i v e

pI ME I m

E E1 lhE..IE

pI r t G H

hGH

i n t r o n s ( i n t r o n 1 , 4 8 5 b p ; i n t r o n 2 , 1 3 8 b p ; i n t r o n 3 , 4 4 3 b p ;i n t r o n 4 , 1 1 1 5 b p ; i n t r o n 5 , 2 4 5 b p ) m a k e u p t h e t r o u t GHg e n e . T h e i n t r o n b o u n d a r i e s a r e l o c a t e d a t p o s i t i o n s 7 6 / 5 6 0 ,7 0 1 / 8 3 8 , 9 5 6 / 1 3 9 8 , 1 5 5 5 / 2 6 6 9 , a n d 2 8 1 7 / 3 0 6 1 . A l l d o n o r a n da c c e p t o r s i t e s r e s em b l e c o n s e n s u s s e q u e n c e s ( 3 0 ) . T h e a c -c e p t o r s i t e o f i n t r o n 5 i s i n t e r e s t i n g i n t h a t i t i s p r e c e d e d b ya n e x c e p t i o n a l l y c y t i d i n e - r i c h r e g i o n .T h e s e q u e n c e w a s s e a r c h e d f o r p e r f e c t a n d i m p e r f e c t ,d i r e c t a n d i n v e r t e d r e p e a t s >6 n u c l e o t i d e s . A 1 7 - b p t a n d e mr e p e a t , b e g i n n i n g a t p o s i t i o n + 4 5 8 , a n d a r e g i o n o f d y a ds y m m e t r y ( s t e m o f 8 b p , l o o p o f 6 n u c l e o t i d e s ) b e g i n n i n g a tp o s i t i o n + 3 9 5 w e r e f o u n d i n i n t r o n 1 . Two o t h e r r e g i o n s o fd y a d s y m m e t r y w e r e f o u n d i n i n t r o n 4 , t h e l a r g e s t o f t h e s i xi n t r o n s . T h e f i r s t r e g i o n , c a p a b l e o f f o r mi n g a s t e m a n d l o o pw i t h 7 b p a n d 7 n u c l e o t i d e s , r e s p e c t i v e l y , b e g i n s a t p o s i t i o n+ 2 3 9 4 . T h e s e c o n d r e g i o n , c a p a b l e o f f o r m i n g a s t e m o f 1 1b p a n d a l o o p o f 8 n u c l e o t i d e s , b e g i n s a t p o s i t i o n + 2 4 2 0 . T h es i g n i f i c a n c e o f t h e s e s t r u c t u r e s i s u n k n o w n .A l i g n m e n t o f t r o u t a n d h u m a n GH g e n e s e q u e n c e s , s o t h a tt h e p o l y p e p t i d e s s h a r e m a x i m u m s e q u e n c e s i m i l a r i t y , i n d i -c a t e s t h a t t h e f i r s t f o u r e x o n s o f b o t h g e n e s e n c o d e a n a l o g o u sp o r t i o n s o f t h e GH p o l y p e p t i d e . T r o u t e x o n s V a n d V I , w h i c ha r e i n t e r r u p t e d b y t h e a d d i t i o n a l i n t r o n ( i . e . , i n t r o n 5 ) , e n c o d ea r e g i o n o f t h e GH p o l y p e p t i d e t h a t i s e q u i v a l e n t t o t h e r e g i o ne n c o d e d b y t h e l a s t e x o n o f t h e h u m a n GH g e n e . T h ei n t r o d u c t i o n o f i n t r o n 5 i n t o t h e t r o u t g e n e l i k e l y t o o k p l a c ea f t e r t h e d i v e r g e n c e o f f i s h a n d t e t r a p o d s b e c a u s e t h em a m m a l i a n G H , P r l , a n d PL g e n e s a l l c o n t a i n f i v e e x o n s ( 9 ,2 7 - 2 9 , 3 1 ) . T e s t i n g o f t h i s h y p o t h e s i s , h o w e v e r , m u s t a w a i tt h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e t r o u t P r l g e n e .

DISCUSSIONT h e c u r r e n t m o d e l f o r GH g e n e e v o l u t i o n i s s c h e m a t i c a l l yr e p r e s e n t e d i n F i g . 4 . N i a l l e t a l . ( 3 ) w e r e f i r s t t o s u g g e s t t h a ta s m a l l p r i m o r d i a l g e n e w a s r e p e a t e d l y d u p l i c a t e d t o f o r m al a r g e r g e n e t h a t b e c a m e t h e " p r e c u r s o r g e n e . " We h a v ePha se / -IZI- p r i m o r d i a l g e n e

-in-it

i n t r o n

Ph ase / /EI bGH

I i --t-I + [}C}

V- i n t r o n+ -{I}

I rcI I I V V~ L i i Z~uZ p r e c u r s o r g e n e

d u p l i c a t i o n , d i v e r g e n c e

E HI rGH

F I G . 3 . O r ga n i z a ti o n o f f i s h a n d m a m m a l i a n GH g e n e s . R e s t r i c -t i o n f r a g m e n t s c o n t a i n i n g GH genes ar e s h o w n . B o x e s r e p r e s e n texons; l i n e s b e t w e e n b o x e s ar e i n t r o n s . T h e t r o u t GH gene c o n t a i n san a d d i t i o n a l i n t r o n ( i n t r o n 5 ) t h a t i n t e r r u p t s a r e g i o n e q u i v a l e n t t oexon 5 o f m a m m a l i a n GH genes. T h e r e g i o n o f t h e t r o u t gene t h a te n c o d e s t h e u n t r a n s l a t e d p o r t i o n o f GH mRNA i s a p p r o x i m a t e l y f o u rt i m e s l a r g e r t h a n i t s m a m m a l i a n c o u n t e r p a r t . r t G H , t r o u t ; h GH ( 2 7 ) ,h u m a n ; bGH ( 2 8 ) , c o w; rGH ( 9 , 2 9 ) , r a t ; E , E c o R I ; H , H i n d l I ; P ,P s t I . S c a l e b a r r e p r e s e n t s 5 0 0 b p .

I GH P r l PLF I G . 4 . C u r r e n t m o d e l f o r e v o l u t i o n o f t h e GH g e n e f a m i l y ,a d a p t e d f r o m B a r t a e t a l . ( 9 ) , M i l l e r a n d E b e r h a r d t ( 7 ) , S e l b y e t a l .( 1 0 ) , a n d S l a t e r e t a l . ( 8 ) . D u r i n g p h a s e I , a p r i m o r d i a l g e n e ( o r c o d i n gr e g i o n ) w a s r e p e a t e d l y d u p l i c a t e d . S u b s e q u e n t l y , a n i n t e r v e n i n gs e q u e n c e s e p a r a t i n g t w o o f t h e d u p l i c a t e d d o m a i n s w a s l o s t . L a t e r ,t w o o t h e r d o m a i n s w e r e i n c o r p o r a t e d t o f o r m t h e p r e c u r s o r g e n ec o n t a i n i n g f i v e e x o n s . I n p h a s e I I , t h e p r e c u r s o r g e n e w a s d u p l i -c a t e d . D i v e r g e n c e g a v e r i s e t o t h e g e n e s t h a t p r e s e n t l y e n c o d e GHa n d P r l a n d e v e n t u a l l y P L . H a t c h e d b o x e s r e p r e s e n t e x o n s t h a t a r et h o u g h t t o h a v e s e p a r a t e o r i g i n s . Roman n u m e r a l s r e p r e s e n t e x o n si n t h e p r e s e n t g e n e s t r u c t u r e .

5 1 3 8 E v o l u t i o n : A g e l l o n e t a l .


5/6

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 5 ( 1 9 8 8 ) 5 1 3 9T a b l e 1 . A l i g n m e n t o f t h e i n t e r n a l l y r e p e a t i n g r e g i o n s i n h u m a n GH a n d c o r r e s p o n d i n g r e g i o n s i n t r o u t GH

E x o n E n c o d e d p o l y p e p t i d e s e q u e n c e I d e n t i t y S i m i l a r i t yHuman GH

E1/E2 15 L R - - : : A H f 1 L H LAI7:(i E 32 3 0 . 0 5 1 . 3E 2 93 LXJ-- - : V L V )(NE5A 1 2 8 LIEDG ::WP FK(D 1 4 7E5B 163 Y - - ::C F M D K V : L R II 1 81

Trout GHEl 12 N R ----VHL HL)QM-i9 10.9 3 9 . 1E2 89 I_ -_ -Q I 103E5 A 1 2 1 S D G V L S L D H L f t 3 Y i)Y 143E5B/E6 1 59i)KM3---CFKK(bM H KrnE Y - L V 176

Human GH compared t o Trout GHE1/E2 15Lj1J-- - A H LA F DT E 3 2 3 0 . 4 47.8El 1 2 N RI- ---V Q L H LL Q K M (i- E29E2 93[LR - - - - S V F Nf G[-@)- SG110 2 1 .7 5 2. 2E2 8 9NJ-T----TI~ S L ) R IJ-9-()I 1 0 3E5A 1 28L --[P R IFQ Y - S LD 1 47 1 3 . 0 4 3.5E5A 1 2 1 S4DGVVWL DC S Q(P9L(9P Y G N9Y 1 43E5B 1 6 3 L Y - - - - TFV-[V 1 81 43. 5 6 0 . 9E5B/E6 159 W A----CLFIKD M H[V - L T (y)A 176

A l i g n m e n t o f t h e i n t e r n a l l y r e p e a t e d r e g i o n s i n h u m a n G H , e q u i v a l e n t r e g i o n s i n t r o u t G H , a n d c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e h u m a n a n d t r o u tGH s e g m e n t s a r e s h o w n . T h e i n t e r n a l l y r e p e a t e d r e g i o n s i n h u m a n GH w e r e t a k e n f r o m N i a l l e t a l . ( 3 ) . G a p s ( - ) w e r e i n t r o d u c e d i n t h e s e q u e n c e st o o b t a i n t h e b e s t a l i g n m e n t . E a c h g a p w a s c o u n t ed a s o n e p o s i t i o n i n t h e c a l c u l a t i o n o f % s i m i l a r i t y a n d % i d e n t i t y . S p a c e s ( : ) i n t h e h u m a nGH s e q u e n c e w e r e a d d e d f o r c l a r i t y o f a l i g n m e n t s a n d w e r e n o t i n c l u d e d i n t h e c a l c u l a t i o n s . I d e n t i c a l a m i n o a c i d r e s i d u e s a r e s h o w n i n b o x e s .A m i n o a c i d r e s i d u e s s c o r e d a s s i m i l a r ( c i r c l e d ) a r e b a s e d o n D a y h o f f s h i g h l y a c c e p t a b l e s u b s t i t u t i o n s ( 3 2 ) .d e s i g n a t e d t h e s e e v e n t s a s p h a s e I . S u b s e q u e n t d u p l i c a t i o na n d d i v e r g e n c e o f t h i s p r e c u r s o r g e n e , w h i c h we d e s i g n a t e a sp h a s e I I , l e d t o t h e e v o l u t i o n o f G H , P r l , a n d P L .T h e GH e v o l u t i o n a r y m o d e l h a s b e e n r e v i e we d i n d e t a i le l s e w h e r e ( 6 - 8 ) . We s h a l l b r i e f l y s u m m a r i z e t h e k e y f e a t u r e so f t h i s m o d e l . Much o f t h e r a t i o n a l e f o r p h a s e I ( F i g . 4 ) o f t h eGH e v o l u t i o n a r y m o d e l i s b a s e d o n t h e e x i s t e n c e o f a p p a r e n ti n t e r n a l l y h o m o l o g o u s r e g i o n s w i t h i n G H , P r l , a n d PL ( 3 ) . I nh u m a n GH, f o r e x a m p l e , t h e f i r s t t w o o f t h e f o u r r e g i o n s o fi n t e r n a l h o m o l o g y a r e e a c h e n c o d e d b y s e p a r a t e e x o n s( e x o n s I I a n d I V ) b u t t h e l a s t t w o r e g i o n s a r e e n c o d e d b y o n el a r g e r e x o n ( e x o n V ) . T h e l a t t e r e x o n may h a v e b e e ng e n e r a t e d a f t e r t h e d e l e t i o n o f t h e i n t e r v e n i n g s e q u e n c e t h a ts e p a r a t e d t h e t w o r e d u p l i c a t e d c o d i n g d o m a i n s e i t h e r p r i o r t oo r a f t e r i t s i n c o r p o r a t i o n i n t o t h e g e n e . T h e t w o o t h e r e x o n s( e x o n s I a n d I I I ) o f t h e h u m a n g e n e a r e t h o u g h t t o h a v es e p a r a t e o r i g i n s . E x o n I , w h i c h e v e n t u a l l y t o o k o v e r t h ec o n t r o l l i n g f u n c t i o n s o f t h e g e n e , w a s i n c o r p o r a t e d a t t h e 5 'u p s t r e a m r e g i o n , a n d e x o n I I I , w h i c h c o n f e r r e d t h e h o r m o n ew i t h c a r b o h y d r a t e - r e g u l a t i n g p r o p e r t i e s , w a s i n c o r p o r a t e db e t w e e n t h e o r i g i n a l l y d u p l i c a t e d r e g i o n s . I m p e r f e c t d i r e c tr e p e a t s h a v e a l s o b e e n f o u n d f l a n k i n g e x o n s I , I I I , a n d V o fr a t GH, r a t P r l , h u m a n GH, a n d h u m a n PL g e n e s . T h i so b s e r v a t i o n w a s t a k e n a s f u r t h e r e v i d e n c e t h a t t h e s e r e g i o n sa r o s e b y s e p a r a t e i n s e r t i o n e v e n t s b y a m e c h a n i s m a n a l o g o u st o DNA t r a n s p o s i t i o n . T h e f o r m a t i o n o f t h e p r e c u r s o r g e n e

m a r k s t h e e n d o f p h a s e I . A t t h e b e g i n n i n g o f p h a s e I I , t h ee n t i r e p r e c u r s o r s t r u c t u r e w a s d u p l i c a t e d a n d s u b s e q u e n td i v e r g e n c e g a v e r i s e t o t h e g e n e s t h a t e n c o d e GH a n d P r l ( s e eb o t t o m o f F i g . 4 ) .T h e e x i s t e n c e o f an a d d i t i o n a l i n t r o n ( i n t r o n 5 ) i n t h e t r o u tGH g e n e i s a n o t a b l e d i f f e r e n c e b e t w e e n f i s h a n d m a m m a l i a nGH g e n e s . A t f i r s t i n s p e c t i o n , t h e p r e s e n c e o f i n t r o n 5 i n t h et r o u t GH g e n e m i g h t a p p e a r t o s u p p o r t p h a s e I o f t h e GHe v o l u t i o n a r y m o d e l . C l o s e r e x a m i n a t i o n o f t h e s e q u e n c ed a t a , h o w e v e r , r e v e a l s t h a t t h e l o c a t i o n o f i n t r o n 5 i n t e r r u p t st h e l a s t p r e s u m p t i v e r e p e a t e d s e g m e n t i n h u m a n GH ( E S B ,b e t w e e n L y s - 1 7 2 a n d V a l - 1 7 3 ; T a b l e 1 ) . I n t r o n 5 i s l i k e l y ar e c e n t i n t r o d u c t i o n t o t h e t r o u t GH g e n e . Two o b s e r v a t i o n ss u p p o r t t h i s h y p o t h e s i s . ( i ) T h e e v e n t t h a t g a v e r i s e t o GHa n d P r l g e n e s ( p h a s e I I ) o c c u r r e d a r o u n d 3 5 0 - 4 0 0 m i l l i o ny e a r s a g o , b e f o r e t h e d i v e r g e n c e o f f i s h a n d t e t r a p o d s . T h ee x i s t e n c e o f GH a n d P r l i n t h e s e t w o g r o u p s o f a n i m a l s a t t e s t st o t h i s n o t i o n . ( i t ) M a m m a l i a n g e n e s f o r GH a n d P r l a r eo r g a n i z e d i n a s i m i l a r m a n n e r - i . e . , b o t h g e n e s h a v e f i v ee x o n s a n d f o u r i n t r o n s . T h u s , i n t r o n 5 o f t h e t r o u t GH g e n ec o u l d n o t h a v e e x i s t e d p r i o r t o t h e d i v e r g e n c e o f f i s h a n dt e t r a p o d s .C o m p a r i s o n o f r e g i o n s i n t h e t r o u t GH p o l y p e p t i d e s e -q u e n c e , e q u i v a l e n t t o t h o s e d e s c r i b e d b y N i a l l e t a l . ( 3 ) , d on o t s h o w t h e e x i s t e n c e o f i n t e r n a l l y h o m o l o g o u s r e g i o n s( T a b l e 1 ) . M o r e o v e r , d i r e c t r e p e a t s s i m i l a r t o t h o s e f l a n k i n g

E v o l u t i o n : A g e l l o n e t A


6/6

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 5 ( 1 9 8 8 )e x o n s I , I I I , a n d V o f t h e r a t GH, r a t P r l , h u m a n GH, a n dh u m a n PL g e n e s w e r e n o t f o u n d i n t h e t r o u t GH g e n e .T h er e f o r e, a l t h o u gh t h e s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e p o l y p e p t i d es e q u e n c e s o f f i s h GH a n d f i s h P r I ( 3 3 , 3 4 ) i s c o n s i s t e n t w i t hp h a s e I I o f t h e m o d e l ( F i g . 4 ) , t h e t r o u t GH g e n e s t r u c t u r e i si n c o n s i s t e n t w i t h p h a s e I .I n h u m a n GH, t h e a p p a r e n t i n t e r n a l r e p e a t s s h a r e 3 0 % oi d e n t i c a l a m i n o a c i d r e s i d u e s a n d 5 1 . 3 % s i m i l a r i t y w h e nc o n s e r v a t i v e s u b s t i t u t i o n s a r e t a k e n i n t o a c c o u n t ( T a b l e 1 ) .By c o m p a r i s o n , t h e e q u i v a l e n t r e g i o n s i n t h e t r o u t GH h a v eo n l y 1 0 . 9 % o i d e n t i c a l r e s i d u e s a n d 3 9 . 1 % s i m i l a r i t y . F u r t h e r -m o r e , t h e g r o u p s o f s i m i l a r a m i n o a c i d r e s i d u e s a m o n g t h es e l e c t e d r e g i o n s i n t r o u t GH a r e n o t i n t h e s a m e c a t e g o r y o fa c c e p t a b l e s u b s t i t u t i o n s ( 3 2 ) a s t h o s e f o u n d i n t h e a p p a r e n ti n t e r n a l l y r e p e t i t i v e r e g i o n s o f h u m a n GH. S i g n i f i c a n t s e -q u e n c e s i m i l a r i t y , h o w e v e r , i s o b s e r v e d b e t w e e n e q u i v a l e n tr e g i o n s o f t r o u t a n d h u m a n GH ( T a b l e 1 ) . T h e s e c o m p a r i s o n ss u g g e s t t h a t t h e p r e s u m e d i n t e r n a l r e p e a t s i n t h e h u m a n GHa r e n o t p r e s e n t i n t r o u t GH.N i c o l l e t a l . ( 3 5 ) h a v e s h o w n t h a t s i m i l a r i t y b e t w e e nr a n d o m l y s e l e c t e d r e g i o n s i n h u m a n GH, h u m a n P L , o r o v i n eP r l c a n b e d e m o n s t r a t e d b y t h e i n t r o d u c t i o n o f a p p r o p r i a t eg a p s i n t h e s e q u e n c e . I n t h e i r e x a m p l e , t h e s e l e c t e d r e g i o n sh a v e a t l e a s t t h e s a m e e x t e n t o f s i m i l a r i t y a s t h o s e d e s c r i b e db y N i a l l e t a l . ( 3 ) . O u r a n a l y s i s o f t h e t r o u t GH s t r u c t u r e a n dt h a t o f N i c o l l e t a l . ( 3 5 ) d o n o t s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a ti n t e r n a l l y r e p e a t e d r e g i o n s i n GH, P r l , o r PL a r o s e f r o m as m a l l p r i m o r d i a l g e n e ( p h a s e I , F i g . 4 ) .I t w o u l d b e p r e m a t u r e t o g e n e r a t e a n a l t e r n a t e m o d e l t oa c c o u n t f o r t h e t r o u t GH g e n e s t r u c t u r e u n t i l t h e GH g e n es t r u c t u r e f r o m a t l e a s t o n e o r g a n i s m , common t o b o t hb r a n c h e s l e a d i n g t o t e l e o s t e a n a n d m a m m a l i a n e v o l u t i o n , i sd e t e r m i n e d .We a r e g r a t e f u l t o D i n s d a l e G o o d e n f o r p r o v i d i n g e x c e l l e n tt e c h n i c a l a s s i s t a n c e . T h i s p r o j e c t w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t ( D C B -8 5 1 - 8 0 6 9 ) f r o m t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n t o D . A . P . a n dT . T . C . T h i s a r t i c l e i s c o n t r i b u t i o n 1 4 1 0 f r o m t h e D e p a r t m e n t o fB i o l o g y , T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y , a n d c o n t r i b u t i o n 1 0 9 f r o m

t h e C e n t e r f o r M a r i n e B i o t e c h n o l o g y , U n i v e r s i t y o f M a r y l a n d .1 . C a t t , K . J . , M o f f a t , B . & N i a l l , H . D . ( 1 9 6 7 ) S c i e n c e 1 5 7 , 3 2 1 .2 . S h e r w o o d , L . M . ( 1 9 6 7 ) P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 5 8 , 2 3 0 7 -2 3 1 4 .3 . N i a l l , H . D . , H o g a n , M . L . , S a u e r , R . , R o s e n b l u m , I . Y . &G r e e n w o o d , F . C . ( 1 9 7 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 6 8 , 8 6 6 -8 6 9 .4 . B e n t l e y , P . J . ( 1 9 8 2 ) C o m p a r a t i v e V e r t e b r a t e E n d o c r i n o l o g y( C a m b r i d g e U n i v . P r e s s , C a m b r i d g e , E n g l a n d ) , 2 n d E d .5 . S i m p s o n , E . R . & M a c D o n a l d , P . C . ( 1 9 8 1 ) A n n u . R e v . P h y s -i o l . 4 3 , 1 6 3 - 1 8 8 .6 . M o o r e , D . D . , W a l k e r , M . D . , D i a m o n d , D . J . , C o n k l i n g ,M . A . & G o o d m a n , H . M . ( 1 9 8 2 ) R e c . P r o g . H o r m . R e s . 3 8 ,1 9 7 - 2 2 5 .7 . M i l l e r , W. L . & E b e r h a r d t , N . L . ( 1 9 8 3 ) E n d o c r . R e v . 4 , 9 7 -

1 3 0 .8 . S l a t e r , E . P . , B a x t e r , J . D . & E b e r h a r d t , N . L . ( 1 9 8 6 ) A m .Z o o ! . 2 6 , 9 3 9 - 9 4 9 .9 . B a r t a , A . , R i c h a r d s , R . I . , B a x t e r , J . D . & S h i n e , J . ( 1 9 8 1 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 8 , 4 8 6 7 - 4 8 7 1 .1 0 . S e l b y , M . J . , B a r t a , A . , B a x t e r , J . D . , B e l l , G . I . & E b e r h a r d t ,N . L . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 1 3 1 3 1 - 1 3 1 3 8 .1 1 . A g e l l o n , L . B . & C h e n , T . T . ( 1 9 8 6 ) DNA 5 , 4 6 3 - 4 7 1 .1 2 . F e i n b e r g , A . P . & V o g e l s t e i n , B . ( 1 9 8 3 ) A n a l . B i o c h e m . 1 3 2 , 6 -1 3 .1 3 . B e n t o n , W. D . & D a v i s , R . W. ( 1 9 7 7 ) S c i e n c e 1 9 6 , 1 8 0 - 1 8 2 .1 4 . M a n i a t i s , T . , F r i t s c h , E . F . & S a m b r o o k , J . ( 1 9 8 2 ) M o l e c u l a rC l o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b . , C o l dS p r i n g H a r b o r , N Y ) .1 5 . V i e i r a , J . & M e s s i n g , J . ( 1 9 8 2 ) G e n e 1 9 , 2 5 9 - 2 6 8 .1 6 . P o n c z , M . , S o l o w i e j c z y k , D . , B a l l a n t i n e , M . , S c h w a r t z , E . &S u r r e y , S . ( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 9 , 4 2 9 8 - 4 3 0 2 .1 7 . N o r r a n d e r , J . , K e m p e , T . & M e s s i n g , J . ( 1 9 8 3 ) G e n e 2 6 , 1 0 1 -1 0 6 .1 8 . S a n g e r , F . , N i c k l e n , S . & C o u l s o n , A . R . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 7 4 , 5 4 6 3 - 5 4 6 7 .1 9 . A g e l l o n , L . B . , C h e n , T . T . , v a n B e n e d e n , R . J . , S o n s t e g a r d ,R . A . , W a g n e r , G . F . & McKeown, B . A . ( 1 9 8 6 ) C a n . J . F i s h .A q u a t . S c i . 4 3 , 1 3 2 7 - 1 3 3 1 .2 0 . B r e a t h n a c h , R . & C h a m b o n , P . ( 1 9 8 1 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 0 ,3 4 9 - 3 8 3 .

2 1 . M o o r e , D . D . , M a r k s , A . R . , B u c k l e y , D . I . , K a p l e r , G . ,P a y v a r , F . & G o o d m a n , H . M . ( 1 9 8 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .USA 8 2 , 6 9 9 - 7 0 2 .2 2 . B a r l o w , J . W . , V o z , M . L . J . , E l i a r d , P . H . , M a t h y - H a r t e r t ,M . , De N a y e r , P . , E c o n o m i d i s , I . V . , B e l a y e w , A . , M a r t i a l ,J . A . & R o u s s e a u , G . G . ( 1 9 8 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 3 ,9 0 2 1 - 9 0 2 5 .2 3 . M a r t i a l , J . A . , B a x t e r , J . D . , G o o d m a n , H . M . & S e e b u r g ,P . H . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t ! . A c a d . S c i . USA 7 4 , 1 8 1 6 - 1 8 2 0 .2 4 . S a m u e l s , H . H . , S t a n l e y , F . & S h a p i r o , L . E . ( 1 9 7 9 ) B i o c h e m -i s t r y 1 8 , 7 1 5 - 7 2 1 .2 5 . D o b n e r , P . R . , K a w a s a k i , E . S . , Y u , L . - Y . & B a n c r o f t , F . C .( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t ! . A c a d . S c i . USA 7 8 , 2 2 3 0 - 2 2 3 4 .2 6 . P r o u d f o o t , N . J . & B r o w n l e e , G . G . ( 1 9 7 6 ) N a t u r e ( L o n d o n )2 6 3 , 2 1 1 - 2 1 4 .2 7 . D e N o t o , F . M . , M o o r e , D . D . & G o o d m a n , H . M . ( 1 9 8 1 )N u c l e i c A c i d s R e s . 9 , 3 7 1 9 - 3 7 3 0 .2 8 . W o y c h i k , R . P . , C a m p e r , S . A . , L y o n s , R . H . , G o o d w i n ,E . C . & R o t t m a n , F . M . ( 1 9 8 2 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 0 , 7 1 9 7 -7 2 1 0 .2 9 . P a g e , G . S . , S m i t h , S . & G o o d m a n , H . M . ( 1 9 8 1 ) N u c l e i c A c i d sR e s . 9 , 2 0 8 7 - 2 1 0 4 .3 0 . M o u n t , S . M . ( 1 9 8 2 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 0 , 4 5 9 - 4 7 2 .3 1 . C o o k e , N . E . & B a x t e r , J . D . ( 1 9 8 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 9 7 , 6 0 3 -6 0 6 .3 2 . D a y h o f f , M . O . , e d . ( 1 9 7 2 ) A t l a s o f P r o t e i n S e q u e n c e a n dS t r u c t u r e ( N a t l . B i o m e d . R e s . F o u n d . , S i l v e r S p r i n g , M D ) .3 3 . Y a s u d a , A . , I t o h , H . , & K a w a u c h i , H . ( 1 9 8 6 ) A r c h . B i o c h e m .B i o p h y s . 2 4 4 , 5 2 8 - 5 4 1 .3 4 . K a w a u c h i , H . , M o r i y a m a , S . , Y a s u d a , A . , Y a m a g u c h i , K . ,S h i r a h a t a , K . , K u b o t a , J . & H i r a n o , T . ( 1 9 8 6 ) A r c h . B i o c h e m .B i o p h y s . 2 4 4 , 5 4 2 - 5 5 2 .3 5 . N i c o l l , C . S . , M a y e r , G . L . & R u s s e l l , S . M . ( 1 9 8 6 ) E n d o c r .R e v . 7 , 1 6 9 - 2 0 3 .

5 1 4 0 E v o l u t i o n : A g e l l o n e t a l .

structure of a fish (rainbow trout) growth

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