sposobnost produkcije biofilma od strane odabranih … · zavisno od vrste mikroorganizama,...

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Nikola Mladenović

SPOSOBNOST PRODUKCIJE BIOFILMA OD STRANE

ODABRANIH SOJEVA MIKROORGANIZAMA

Master rad

Niš, 2015.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

SPOSOBNOST PRODUKCIJE BIOFILMA OD STRANE

ODABRANIH SOJEVA MIKROORGANIZAMA

Master rad

Kandidat: Mentor:

Nikola Mladenović 88 dr Zorica Stojanović-Radić

Niš, 2015.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

BIOFILM-FORMING ABILITY OF SELECTED MICROBIAL

STRAINS

Master thesis

Candidate: Mentor:

Nikola Mladenović 88 PhD Zorica Stojanović-Radić

Niš, 2015.

ZAHVALNICA

Najsrdačnije se zahvaljujem svojoj mentorki dr Zorici Stojanović-Radić

prvenstveno na ugodnoj saradanji i

pomoći tokom laboratorisjkih istraživanja, kao i na ukazanoj pomoći, razumevanju

i strpljenju tokom izrade ovog rada.

Beskrajnu zahvalnost dugujem svojim roditeljima, na neizmernoj

ljubavi, moralnoj podršci i razumevanju tokom studiranja.

Hvala.

Biografija

Nikola Mladenović, rođen je 13.01.1989. godine u Vranju, gde 2004. godine

završava osnovnu školu ”Radoje Domanović”. Iste godine upisuje srednju Poljoprivredno

- veterinarsku školu ”Stevan Sinđelić”, smer veterinarski tehničar, koju završava 2008.

godine. Prirodno-matematički fakultet Univerziteta u Nišu, upisao je školske 2008/2009

godine na Odseku za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2012.

godine sa zvanjem “biolog”. Iste godine upisuje master akademske studije, smer

Biologija na istom fakultetu.

Sažetak

Biofilm je zaštićena, sesilna zajednica mikroorganizama u kojoj oni pokazuju

drugačije fenotipske osobine u odnosu na istu vrstu, koja raste u uslovima van

biofilma. Sposobnost adhezije mikroorganizama na abiotičke i biotičke površine,

međusobna komunikacija ćelija i posledično funkcionisanje kao celina su od velike

važnosti u nastanku i preživljavanju biofilmova. Značaj biofilmova za čoveka je veliki,

što je posebno istaknuto u medicini, jer je utvrđeno da su biofilmovi uzročnici velikog

procenta hroničnih infektivnih bolesti.

Cilj master rada je bio da se ispita sposobnost produkcije biofilma odabranih

sojeva mikroorganizama u odnosu na tip podloge i koncentraciju dodatog šećera glukoze.

Testirani sojevi su deo kolekcije Mikrobiološke laboratorije Prirodno-matematičkog

fakulteta u Nišu, pri čemu je testirano više sojeva nekoliko vrsta patogenih

mikroogranizama i to: Staphylococcus aureus, Esherichia coli i Candida albicans.

Koncentracije šećera korišćene u eksperimentu iznosile su 0%, 0.25%, 0.5% i 1%.

Utvrđeno je da bakterije ostvaruju najveću produkciju biofilma u tripton soja bujonu

(TSB), dok je kvasac produkovao najveći biofilm kada je gajen u podlozi RPMI 1640.

Rezultati su pokazali odsustvo direktno proporcionalne veze između produkcije biofilma

i koncentracije dodatog šećera, osim u slučaju vrste Staphyloccocus aureus.

Ključne reči: biofilm, glukoza, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida

albicans.

Abstract

A biofilm is a protected, sessile community of microorganisms where the cells

show different phenotypic characteristics in comparison to the same species that grows

outside the biofilm. The adhesion of microorganisms to abiotic and biotic substrates, the

communication between cells and the consequently co-functioning are of the great

importance in the formation and survival of biofilms. Biofilms are very important to

humans, especially considering medicinal significance, because it was found that the

biofilms cause a large percentage of chronic infectious diseases.

The aim of the master thesis was to examine the ability of the selected strains of

microorganisms to produce the biofilm in relation to the type of substrate and

concentration of added glucose. The tested strains are part of a collection of the

Laboratory of Microbiology of the Faculty of Sciences and Mathematics in Niš, where

multiple strains of several species of pathogenic microorganisms were tested:

Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans. The concentrations of the

glucose used in the experiment were 0%, 0.25%. 0.5% and 1%. It has been found that the

bacteria produce the highest amount of biofilm in tryptic soy broth (TSB), whereas the

yeast has produced the largest biofilm when grown in RPMI 1640 medium. The results

showed the absence of directly proportional connection between the production of a

biofilm and the concentration of the added sugar, except in the case of Staphylococcus

aureus species.

Keywords: biofilm, glucose, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida

albicans.

Sadržaj:

1. UVOD .......................................................................................................................... 1

1.1. Fizičke i hemijske osobine biofilma ....................................................................... 3

1.2. Značaj adhezije u formiranju biofilma .................................................................... 5

1.2.1. Faze formiranja biofilma .................................................................................... 5

1.3. Rezistencija (otpornost) biofilma ............................................................................ 7

1.4. Uloga biofilma u nastanku hroničnih infekcija kod ljudi ....................................... 8

1.5. Značaj i stanište biofilma ........................................................................................ 9

1.6. Opis i značaj istraživanih vrsta mikroorganizama ................................................ 11

1.6.1. Opšte karakteristike vrste Staphylococcus aureus ........................................... 11

1.6.2. Opšte karakteristike vrste Escherichia coli ...................................................... 13

1.6.3. Opšte karakteristike vrste Candida albicans ................................................... 15

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ........................................................................................ 17

3. MATERIJAL I METODE.......................................................................................... 18

3.1. Rastvori, podloge i reagensi .................................................................................. 18

3.2. Sojevi mikroorganizama ....................................................................................... 20

3.3. Određivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih vrsta mikroorganizama . 22

3.4. Statistička analiza dobijenih rezultata ................................................................... 23

4. REZULTATI I DISKUSIJA ...................................................................................... 24

4.1. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva vrste Staphylococcus

aureus ............................................................................................................................. 25

4.2. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva vrste Escherichia

coli .................................................................................................................................. 30

4.3. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva vrste Candida

albicans .......................................................................................................................... 34

5. ZAKLJUČAK ............................................................................................................ 37

6. LITERATURA ........................................................................................................... 38

Master rad Nikola Mladenović

1

1. UVOD

U prirodi se mikroorganizmi mogu naći u individualnoj, slobodnoživećoj

planktonskoj formi ili u obliku sesilnih formi koje se nazivaju biofilmovi. U

biofilmovima su mikroorganizmi pričvršćeni za živi ili neživi supstrat i formiraju

zajednice u kompleksnom polimernom matriksu. Biofilm je rasprostranjen način života

mikroorganizama koji se može naći u svim sredinama (O'Toole et al., 2000), a razvija se

u cilju povećanja otpornosti i sposobnosti preživljavanja u specifičnom staništu.

Biofilm je prvi put opisan 1978. godine od strane J. Williams Costertona, koji je

utvrdio da zreo biofilm sačinjava zajednica mikroorganizama u kojoj su ćelije

međusobno povezane i uklopljene u vanćelijski matriks koga su same stvorile.

Mikroorganizmi koji grade biofilm imaju izmenjen fenotip usled promenjene brzine

razmnožavanja i drugačije transkripcije gena, što su osobine koje nisu uočene kod

planktonskih organizama iste vrste (Donlan & Costerton, 2002). Biofilm može činiti

samo jedna vrsta, ali je ipak u prirodi sastav mnogo kompleksniji (bakterije, kvasci,

virusi, amebe, plesni, alge, protozoe i njihovi produkti mogu činiti biofilm). Održavanje

formirane zajednice biofilma bilo bi nemoguće da ne postoji razvijena međusobna

komunikacija ćelija unutar biofilma, koja se vrši uz pomoć signalnih molekula (Hentzer

& Givskov, 2003). Unutar biofilma, mikroorganizmi su skriveni i zaštićeni od uticaja

faktora spoljašnje sredine. Sposobnost formiranja biofilma je najbitnija osobina

mikroorganizama i razvila se zbog toga što pruža ekološku prednost u preživljavanju

istih.

Biofilmovi se mogu formirati na živim (tkiva) i neživim površinama (plastika,

staklo, metal, drvo, kamen, hrana, čestice zemlje, medicinski implantati), a za njihov

razvoj neophodno je prisustvo biofilm formirajućih mikroorganizama, dostupnost

hranljivih materija, adekvatna podloga i vlažnost (Costerton et al., 1999). Adhezija

mikroorganizama, a samim tim i formiranje biofilma u velikoj meri zavisi od fizičko


2

hemijskog svojstva podloge. Utvrđeno je da mikroorganizmi lakše formiraju biofilmove

na hrapavim površinama, kao i da se bolje vezuju za nepolarne hidrofobne površine

(plastika), nego za hidrofilne materijale (metal, staklo). Vlažnost je od izuzetnog značaja

imajući u vidu činjenicu da se biofilmovi najbolje razvijaju na čvrstim površinama koje

su potopljene u vodu (Donlan, 2001).

Najveći značaj na ljudsku populaciju imaju biofilm produkujući mikroorganizmi

koji se javljaju u industriji za preradu i distribuciju vode, prehrambenoj industriji, i u

medicini kao izazivači infekcija (Donlan, 2001). Smatra se da je čak 65% humanih

infekcija izazvano biofilm produkujućim mikroorganizmima.

Zbog navedenog medicinskog značaja i činjenice da su za većinu humanih

infekcija odgovorni biofilmovi a ne planktonske ćelije, istraživanja kontrole ovih

mikroorganizama (efekta antimikrobnih supstanci) bi trebalo vršiti na biofilmovima, a ne

na planktonskim ćelijama. Metodologija koja se koristi pri istraživanjima biofilmova

uključuje nekoliko često korišćenih podloga, kao i dodatak šećera koji se razlikuje u

različitim literaturnim izvorima. Zbog toga je neophodno ispitivanje koja je metodologija

u smislu podloge i dodatka šećera najadekvatnija za datu vrstu mikroorganizma. U ovom

master radu je vršeno ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma sojeva koji postoje u

kolekciji Mikrobiološke laboratorije Prirodno-matematičkog fakulteta, kao i njihova

zavisnost od vrste podloge i koncentracije dodate glukoze.


3

1.1. Fizičke i hemijske osobine biofilma

Mikroorganizmi koji žive unutar biofilma imaju značajno drugačije osobine od

slobodnoživećih formi iste vrste, jer im gusta i zaštićena sredina biofilma omogućava da

komuniciraju na različite načine (Stewart & Costerton, 2001).

Najvažniji deo biofilma je matriks, produkt samih bakterija i čini 50-90% mase

biofilma. Najvećim delom se sastoji od vode (95-99%), ekstracelularnih polisaharidnih

polimera (EPS, 2%) i mikroorganizama (2-5%). Kroz sam matriks prolaze mnogobrojni

vodeni kanali koji povezuju celokupni kompleks biofilma i služe za prenos hranljivih

materija i kiseonika do svih delova biofilma. Različite bakterijske vrste formiraju matriks

različitog hemijskog sastava, koji se vremenom povećava. Matriksni polimeri mogu

vezati jone metala, dvovalentne katjone (kalcijum ili magnezijum) i makromolekule

(lipide, DNK, proteine) koji pojačavaju vezu između komponenti matriksa (Dorlan,

2002). Hiperprodukcija ekstracelularnih polimera se javlja u uslovima povećane

koncentracije ugljenika i smanjene koncentracije fosfata, azota i kalijuma, kao i tokom

faze usporenog rasta bakterija i razmnožavanja unutar biofilma (Sutherland, 2001).

Ekstracelularni polisaharidni polimer (EPS) je visoko hidrirani biopolimer sličan gelu.

Odgovoran je za adheziju, stabilizaciju matriksa i za dostupnost hranljivih materija svim

delovima biofilma. Biofilm može delovati poput filtera i koncentrisati čestice sredine u

kojoj se nalazi, te zbog toga može biti različitog sastava (fibrin, eritrociti, trombociti,

DNK, RNK, lipidi, proteini, enzimi), što zavisi od površine na kojoj je formiran (Durack,

1975).

Zavisno od vrste mikroorganizama, količine dostupne hrane, kao i fizičkih faktora

sredine, postoje tri različita strukturna tipa biofilma: heterogeni mozaični tip, porozni

tip ispresecan vodenim kanalima i gusti konfluentni tip. Za sva tri tipa je zajedničko

to da sadrže mikroorganizme, ekstracelularne polisaharidne polimere (EPS) i delove sa

manjom gustinom koji im služe kao transportni kanali.


4

Heterogeni mozaični tip biofilma se može naći u sredinama sa nedovoljnom

količinom hranljivih materija, pri čemu se na supstratu stvara tanak i gust bakterijski sloj

od kojeg u okolinu polaze mikrokolonije u vidu stubića. Porozni tip, u obliku gljive,

građen je od većih mikrokolonija, koje su povezane sa supstratom preko tanjih traka

ekstracelularnih polimera. Između mikrokolonija i traka se nalaze vodeni kanali koji

dopremaju materije i nutritijente iz okoline do pojedinačnih bakterija. Ovaj tip se javlja u

prirodi i sadrži ne samo različite vrste bakterija, nego i gljive i protozoe. Treći,

konfluentni tip biofilma se može naći na dentalnom plaku. Građen je od različitih

bakterijskih vrsta koje međusobno razmenjuju hranljive materije. Iako se čini da u ovom

tipu postoje ograničenja rasta zbog nutritijenata, ovakav tip biofilma može da dostigne

najveću gustinu i debljinu (Durack, 1975).

Unutar biofilma, različite bakterijske vrste su u međusobnim mutualističkim

odnosima i imaju sposobnost komunikacije putem signalnih molekula, koja se naziva

‘quorum sensing’ (osećaj grupe). To je primitivan oblik komunikacije, koji je vrlo

značajan kada je u pitanju preživljavanje bakterija u ovoj zajednici. Bakterije tako jedna

drugoj mogu preneti informaciju o nekim promenama u okolini, nakon čega dolazi do

prilagođavanja metabolizma samih bakterija uslovima spoljašnje sredine (Greenberg,

2003). Zajednicu biofilma karakterišu pozitivna homeostaza i primitivni cirkulatorni

sistem (Costerton et al., 1995).

Biofilm može biti jako male visine, kada raste u vidu samo jednog sloja ćelija. Sa

druge strane, njegova debljina može biti i više centimetara, što zavisi od uslova rasta, ali i

od kvalitativnog i kvantitativnog sastava vrsta mikroorganizama koji ga sačinjavaju.

Rasejavanje biofilma je korisno za biofilm, jer obezbeđuju nove zajednice i širenje

biofilma. Neki od faktora koji utiču na rasejavanje su debljina biofilma, brzina i tok

tečnosti, prisustvo nutritijenata, kao i fizičke sile stresa (Lappin Scot & Costerton, 1992).


5

1.2. Značaj adhezije u formiranju biofilma

Najznačajniji korak u formiranju biofilma je adhezija planktonskih ćelija za

podlogu. Podrazumeva pripajanje ovih ćelija za ćelije domaćina, kao i prelazak na

kolektivni način života putem signala, pri čemu bakterije dobijaju zaštitni matriksni

omotač. Prve bakterije se vežu za podlogu van der Walls-ovim silama koje su jako slabe.

Najvažniji faktori koji utiču na adheziju su karakteristika bakterija i sredine, kao i

podloga na kojoj se biofilm formira. Što je podloga hrapavija, adhezija za podlogu je

bolja (Dorlan, 2002). Biofilm najčešće nastaje na granici dva agregatna stanja, nejčešće

čvrstog i tečnog. Njega najčešće formiraju bakterije, ali mogu i svi ostali

mikroorganizmi. Formiranje biofilma se odvija u nekoliko faza. Prvo se stvara mladi

biofilm koji vremenom sazreva, dobija nove karakteristike i postaje stabilan. Jedna od

značajnih osobina zrelog biofilma je odvajanje njegovih delova i otpuštanje (rasipanje)

bakterija u okolinu. U slučaju patogenih vrsta ovim procesom se delovi biofilma raznose

putem krvi u druge delove organizma, omogućavajući širenje postojeće i eventualni

nastanak sistemske infekcije.

1.2.1. Faze formiranja biofilma

Formiranje biofilma predstavlja složeni proces koji od bakterija iziskuje

kolektivno ponašanje. U okviru niše, bakterije će biti privučene ka određenim

površinama, što zavisi od količine nutritijenata, pH sredine, jonskih sila i temperature.

Podobnost površine u ovim parametrima, kao i karakteristike površine ćelija su od

izuzetnog značaja za to da li će ćelije imati afinitet za neku površinu. Ukoliko je površina

bogata organskim materijama i ima odgovarajuće naelektrisanje, ona će elektrostatičkim

silama privući bakterije i formirati vezu sa njima (Kostakioti et al., 2013). Ova veza je

slaba i u ovoj fazi procesa, bakterije se lako mogu otkačiti sa površine i neće doći do

formiranja biofilma. Pokretne bakterije imaju kompetitivnu prednost nad nepokretnim


6

bakterijama, jer brže i lakše dolaze do ovakvog supstrata pošto ne moraju da savladavaju

hidrodinamičke i odbojne sile. U drugoj fazi se stvaraju ireverzibilne veze sa supstratom

pomoću adhezina (pili, fimbrije, flagele, površinski protein poput Antigena 43). U trećoj

fazi bakterije rastu, razmnožavaju se prostom deobom i stvaraju mikrokolonije uronjene u

polimerni matriks. U četvrtoj fazi se količina i masa biofilma maksimalno povećavaju,

dok u petoj fazi dolazi do otkidanja i odvajanja pojedinih delova mikrokolonija i

kolonizacije novih, udaljenih površina i supstrata. Odvajanje delova biofilma nastaje

zbog promene strukture biofilma tokom vremena; samim tim bakterije mogu opet postati

pokretne i preći iz jedne mikrokolonije u drugu, zbog čega dolazi do slabljenja veza

između mikrokolonija i do disperzije biofilma (Tolker-Nielsen et al., 2000). To je faza u

kojoj je biofilm stvoren i mogu se menjati samo njegov oblik i veličina.

Slika 1. Formiranje biofilma

(preuzeto sa https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm)


7

1.3. Rezistencija (otpornost) biofilma

Dobro je poznato da su bakterije unutar biofilma čak do 1000 puta otpornije na

dejstvo antimikrobnih jedinjenja nego kada se nalaze u planktonskoj formi (Costerton et

al.,1995). Razlika između planktonskih i biofilm bakterija je u tome što planktonske

bakterije ne poseduju zaštitni matriksni sloj, nemaju komunikaciju sa drugim ćelijama,

kao ni usporeni metabolizam. Zbog svega navedenog su osetljivije na imuni sistem

domaćina, kao i na antibiotike. Unutar biofilma mikroorganizmi su zaštićeni od imunog

sistema domaćina (antitela, leukocita), kao i od dejstva antibiotika (Suci et al., 1994).

Matriks biofilma najvećim delom se sastoji od vode, što onemogućava brzo isušivanje

biofilma. Pored navedene funkcije, matriks štiti bakterije od promene pH i UV zračenja

(Flemming, 1991). Značajna osobina patogenih bakterija u biofilmu je pojačana aktivnost

efluks pumpi za izbacivanje antibiotika. Najveća aktivnost ovih pumpi je zabeležena u

dubljim slojevima biofilma, gde su metabolizam i razmnožavanje ćelija najsporiji (Maira-

Litran et al., 2000).

Međućelijska komunikacija koju vrše bakterije je još jedan faktor odgovoran za

rezistenciju biofilmova, jer bakterije mogu ‘upozoriti’ jedna drugu na delovanje

antibiotika. Bakterije koje prve dođu u kontakt sa antibiotikom pošalju informacije u

dublje slojeve biofilma, što dovodi do promene u ekspresiji gena (a samim tim i

metabolizma i fenotipa) ćelija koje su dobile te signale. Na taj način se modifikuju

membranski receptori i onemogućava antibiotiku da se veže za površinu ćelija.

Ipak, ne pokazuju svi biofilmovi visoku otpornost na antibiotike. Primer za to je

biofilm forma vrste Pseudomonas aeruginosa koja ne pokazuje veću otpornost na

antimikrobne lekove od planktonskih ćelija iste vrste (Spoering & Lewis, 2001).


8

1.4. Uloga biofilma u nastanku hroničnih infekcija kod ljudi

Akutne infekcije uzrokovane bakterijama vekovima su odnosile ljudske živote.

Razvojem medicine i farmaceutske industrije napravljeni su različiti lekovi i vakcine, što

je omogućilo kontrolu ovih akutnih infektivnih bolesti (Costerton et al., 2003). Uzročnici

biofilm infekcija su najčešće bakterijske vrste koje se nalaze u okolini, ali i one koje se

nalaze u organizmu kao komensali. Biofilm se u organizmu razvija na vitalnom i

nekrotičkom tkivu. Najvažnija karakteristika koja čini biofilm jedinstvenim u procesu

nastanka infekcije je mogućnost disperzije, što dovodi do nastanka embolije, infekcija

mokraćnog i krvnog sistema (Prakash et al., 2003), kao i izbegavanja imunog odgovora

domaćina. Danas su biofilmovi često izazivači hroničnih i teško izlečivih infekcija, pa se

iz tog razloga sve češće efikasnost antimikrobnih jedinjenja testira na biofilmu nego na

planktonskim ćelijama (Mah & O'Toole, 2001). Imuni sistem organizma uništava i

uklanja planktonske ćelije, ali je nemoćan protiv ćelija biofilma. Nakon što se smanji

koncentracija leka u organizmu ili prekine terapija usled poboljšanja zdravstvenog stanja,

biofilm se obnavlja i vraćaju se simptomi bolesti. Zbog toga je jako važno terapiju

ispoštovati do kraja kako bi antibiotici delovali u dubinu biofilma (Stewart & Costerton,

2001).

Biofilmovi nastali na medicinskim uređajima (kateteri ili implantati) i uzrokuju

hronične infekcije koje se jako teško leče (Donlan, 2008). Urinarni kateteri često sadrže

biofilm sačinjen od bakterija koje produkuju ureazu i razlažu ureu do amonijaka, pri

čemu se povećava pH sredine i stvaraju precipitati kalcijum i magnezijum fosfata koji

dovode do začepljenja katetera (Tunney et al., 1999).

Najčešće hronične infekcije uzrokovane biofilmovima su:

- cistična fibroza koju uzrokuje Pseudomonas aeruginosa

- mišićno-koštane infekcije koje uzrokuju Gram-pozitivne aerobne koke


9

- hronične rane, čiji su uzročnici različite aerobne i anaerobne bakterijske vrste

- infekcije urinarnog trakta i katetera

- upala srednjeg uva

1.5. Značaj i stanište biofilma

Biofilmovi se koriste u sistemima za prečišćavanje vode, kao i pri uklanjanju

opasnih materija koje su kontaminirale zemlju i podzemne vode. Poznato je da ove

sesilne zajednice mogu učestvovati u razgradnji brojnih zagadjivača životne sredine,

stvaranju i razgradnji organske materije, kao i kruženju azota. Međutim, štetno dejstvo

koje uzrokuje ogromne gubitke u industriji, kao i velike probleme u medicini uveliko

nadmašuje korisne aspekte upotrebe biofilmova. U medicini se biofilmovi povezuju sa

velikim brojem hroničnih infekcija, koje nastaju kao posledica infekcija biomaterijala

poput katetera, proteza, implantata i drugih medicinskih pomagala. Učestalost kao i

rezistencija na antimikrobnu terapiju su samo neke od bitnijih karakteristika biofilm

infekcija, koje predstavljaju jedan od najvećih izazova medicine danas (Beech et al.,

2004).

Biofilm možemo naći svuda oko nas. Formiraju se bukvalno na svakoj nesterilnoj

površini, kao i u veoma vlažnim sredinama.

- biofilmovi se mogu naći u najekstremnijim životnim uslovima, izuzetno toplim i

slanim vodama, veoma kiselim i alkalnim vodama, kao i u zamrznutim glečerima.

- važne su komponente lanaca ishrane u rekama i potocima, i predstavljaju hranu

ribama. Često se formiraju na površinama basena stajaćih voda.

- u ljudskom okruženju mogu da rastu u kupatilima, a posebno na slavinama i

tuševima jer oni predstavljaju toplo i vlažno stanište za njihov razvoj. Uzročnici su

korozije i začepljenja na cevima.

- nalaze se na površini i u unutrašnjosti biljaka, jako su štetni jer su uzročnici

različitih bolesti useva.


10

- biofilmovi u industriji nafte i gasa mogu da dovedu do ozbiljnih korozija

(Schwermer et al., 2008).

- biofilmovi se mogu naći na zubima većine životinja i mogu da izazovu karijes i

bolesti desni. Čovek ih korišćenjem četkice i paste delimično eliminiše.

- nedavne studije su otkrile da imuni sistem čoveka podržava razvoj biofilma u

debelom i slepom crevu. Ovo otkriće objašnjava moguće funkcije slepog creva i ideje da

slepo crevo može pomoći dobroj crevnoj flori.


11

1.6. Opis i značaj istraživanih vrsta mikroorganizama

1.6.1. Opšte karakteristike vrste Staphylococcus aureus

Gram-pozitivne koke

Raspoređene u grozdovima

Nepokretne

Fakultativno anaerobne

Nisu nutritivni probirači

Katalaza +

Striktni patogeni

Slika 2. Staphylococcus aureus

(preuzeto sa http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xsa/xsa01.jpg)

U rodu Staphylococcus se nalazi više vrsta. Sve vrste stafilokoka su široko

rasprostranjene. Za medicinu je značajno da se patogene vrste često nalaze na koži i u

nosu čoveka kao deo normalne flore malog procenta zdrave populacije ljudi. Mogu se

naći u vazduhu zatvorenih prostorija, u prašini, mleku i drugim životnim namirnicama.

Stafilokoke su Gram-pozitivne bakterije loptastog oblika (koke), koje su grupisane

u vidu grozdova. Postoji tridesetak vrsta stafilokoka, od kojih je najpoznatija

Staphylococcus aureus. Ova vrsta je najvažnija zbog svoje patogenosti. Određeni

patogeni sojevi ove vrste su razvili otpornost na veliki broj antibiotika, što je posledica

njihove prekomerne upotrebe.

Staphylococcus aureus ili zlatni stafilokok je bakterija iz grupe stafilokoka. Ime je

dobila po zlatno žutoj boji njegovih kolonija. Stafilokoke ove vrste kao i ostalih vrsta su

loptastog ili jajolikog oblika. Prečnik im iznosi 0,8 do 1 µm, ali im veličina varira od soja

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%93%D1%80%D0%BE%D0%B7%D0%B4


12

do soja. Pri razmnožavanju stvaraju grozdolike nakupine, jer im se ćelije dele u tri i više

ravni. Stafilokoke formiraju ovakve nakupine uglavnom samo na površini čvrstih

podloga. Kada se razmnožavaju u tečnim podlogama, naročito u hranljivom bujonu često

obrazuju parove, ponekad i kratke lance. Kolonije Staphylococcus aureus su obično

zlatno žute boje, ali mogu biti i svetlo žute boje, krem pa čak i potpuno bele.

Kulturalne osobine. Većina sojeva stafilokoka se obilno razmnožava na mnogim

tečnim i čvrstim podlogama. Na hranljivom agaru obrazuju okrugle, konveksne, glatke

sjajne i žućkaste kolonije. Na krvnom agaru obrazuju kolonije koje su slične onima u

hranljivom. U hranljivom bujonu većina sojeva stafilokoka uzrokuje osrednje zamućenje,

a na dnu prašinasti talog. U tečnim podlogama ne proizvodi pigmente. Staphylococcus

aureus se razmnožava u želatinu i vrši njegovu razgradnju.

Otpornost. Spadaju u jako otporne bakterije. Većina ugine na temperaturi od

60°C tek posle jednog časa. Njihova važna osobina je znatna otpornost prema natrijum

hloridu (NaCl) i šećeru. Zbog toga se sojevi ove bakterije u slanim i slatkim namirnicama

ne samo vrlo brzo i obilno razmnožavaju, nego u njemu produkuju i znatne količine

svojih toksina.

Toksičnost. Ova vrsta je najvažnija zbog svoje patogenosti i izaziva mnoštvo

različitih infekcija i intoksikacija, počev od manjih infekcija kože (furunkul, karbunkul,

infekcija rane, itd.) do teških bolesti poput sepse, zapaljenja pluća, apscesa, sindroma

toksičnog šoka. Spada u fakultativno anaerobne bakterije, potreban joj je kiseonik za

dobijanje energije, ali može opstati i bez njega (Karakašević, 1987).

Važan je patogen koji uzrokuje biofilm infekcije kod ljudi, najčešće hroničnih

infekcija kože (hroničnih rana). Brojni sojevi stafilokoka produkuju biofilm. Koža i

sluzokoža su odlične barijere protiv ove bakterije, ali njihovo oštećenje može uzrokovati

stvaranje apscesa. Ako stafilokok prodre do krvi izaziva sepsu. Otpornost ove bakterije

prema antibioticima je kodirana genima u plazmidima što uzrokuje rezistentnost bakterije

na antibiotik (Marris et al., 1998). Biofilm stafilokoka se sastoji od polisaharidnog

intracelularnog adhezina (Gatz, 2002). Uloga ovog adhezina je u odbrani bakterija od

imunog sistema domaćina.


13

1.6.2. Opšte karakteristike vrste Escherichia coli

Gram-negativni bacili

Pokretni (peritrihe)

Fakultativno anaerobni

Asporogeni

Inkapsulirani

Laktoza +

Deo su fiziološke mikroflore

Uslovni patogeni

Slika 3. Escherichia coli

(https://www.studyblue.com/notes/note/n/test-1-bacteria-and-fungus/deck/5692531)

U rodu Escherichia nalazi se nekoliko vrsta. Medicinski značaj ima samo jedna

vrsta Escherichia coli, koja predstavlja jednu od najčešće izolovanih bakterija do sada.

Escherichia coli je Gram-negativan, kratak štapić dužine 2 do 6 µm, a debljine 1.0 do 1.5

µm. Ćelije mogu biti pojedinačne, u parovima ili nepravilnim nakupinama, a raspolažu

peritrihalnim flagelama i jako su pokretne.

Kulturalne osobine. Escherichia coli je aerobna i fakultativno anaerobna

bakterija. Uspeva dobro na svim podlogama. Kolonije ove bakterije na površini čvrstih

podloga mogu biti okrugle, glatke, sjajne, bezbojne. Neki sojevi ponekad imaju tanku

kapsulu. Fermentiše mnoge šećere uz produkciju kiseline i gasa.

Otpornost. Bakterije ove vrste su veoma otporne, mogu živeti mesecima u vodi i

zemlji. U različitim vrstama hrane se lako i brzo razmnožavaju. Otporne su prema niskim

temperaturama, a toplota od 60 °C ih ubija nakon 15 minuta. Kao i sve enterobakterije i

Escherichia coli je jako osetljiva na hlor i hlorna jedinjenja. Relativno lako i brzo postaje


14

otporna na antibiotike i hemioterapeutike prema kojima je bila osetljiva. Optimalna

temperatura za njhovo razmnožavanje iznosi od 30 do 42 °C.

Toksičnost. Među sojevima ove bakterije ima onih koje luče ili sadrže razne

otrovne supstance (enterotoksine, adhezine). Pojedini sojevi izazivaju kod ljudi niz

različitih oboljenja (infekcije urogenitalnih organa, koli-sepsu, crevna oboljenja,

diarealna oboljenja) (Karakašević, 1987). Iako Escherichia coli čini deo ljudske crevne

flore, njeno prisustvo u hrani može biti znak nehigijenske upotrebe hrane i može poslužiti

kao pokazatelj fekalne kontaminacije (Norazah et al., 1998). Pasterizacijom i kuvanjem

hrane se može obezbediti eliminacija ćelija bakterije Escherichia coli, ali termička obrada

nije poželjna za sve vrste hrane i kontaminacija se ne može uvek sprečiti (Mead &

Griffin, 1998). Doza od 106-107 ćelija/gramu je potrebno da izazove infekciju (Norazah et

al., 1998). Najčešće od ove bakterije oboljevaju mala deca i starije osobe sa

kompromitovanim imunim odgovorom, što govori da odrasli ljudi imaju određene

mehanizme specifične otpornosti prema patogenim sojevima ove bakterije.


15

1.6.3. Opšte karakteristike vrste Candida albicans

Jednoćelijska gljiva koja pripada

grupi kvasaca

Loptastog ili elipsoidnog oblika,

glatkih zidova

Bojenje po Gramu pozitivno ili

gram varijabilno

Najčešća vrsta koja izaziva

gljivične infekcije kod ljudi

(preuzeto od https://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans)

Kvascima se nazivaju jednoćelijske gljive koje se razmnožavaju pupljenjem, mada

ima kvasaca koji se razmnožavaju prostom deobom kao bakterije. Najčešći i najvažniji

patogeni kvasci se nalaze u rodu Candida. Mnoge vrste su komensali

ili endosimbionti domaćina i mogu se naći u digestivnom ili genitalnom sistemu. Od svih

vrsta kandida, za medicinu je najvažnija Candida albicans koja predstavlja

oportunističkog patogena. Na podlogama se najčešće vide pojedinačne ili grupisane

blastospore, loptastog ili jajolikog oblika, prečnika 2 do 4 µm, glatkih zidova.

Kulturalne osobine. Candida albicans raste na sabouraud dekstroznoj podlozi sa

4% maltoze ili glukoze, a dobro uspeva i na krvnom agaru. Najbolja podloga za

kultivaciju ove vrste je RPMI 1640. Posle inkubacije od 24 h do 48 h na temperaturi od

37°C porastu okrugle, glatke, bele kolonije. Kultura miriše na kvasac. Boji se po gramu

pozitivno ili varijabilno.

Toksičnost. Candida albicans može da uzrokuje infekcije (kandidijaze) kod ljudi i

životinja, posebno kod imunokompromitovanih pacijenata. Kandidijaza je relativno česta

Slika 4. Candida albicans


16

gljivična infekcija koja se sreće u oba pola i obično je lokalizovana, ali se u nekim

slučajevima sreću i sistemske infekcije izazvane ovom vrstom gljive. Candida albicans je

sve češći izazivač gljivičnih oboljena kože, sluzokože noktiju i unutrašnjih organa. Kod

čoveka može se pojaviti u svakom životnom dobu, ali se najčešće javlja kod dece i

starijih osoba. Normalni je stanovnik čovekovih organa za varenje, ali se nikada ne nalazi

kao slobodna u prirodi. Kod zdravih osoba može da se nađe u ustima ili vaginalnoj

sluzokoži, a do bolesti dolazi u slučaju slabljenja imuniteta i/ili narušavanja ravnoteže

normalne flore. Smatra se da glavni razlog leži u opadanju moći imunog sistema koji je

zadužen da drži populaciju na normalnom nivou. Gljivica ima veliku sposobnost adhezije

za ćelije sluzokože, što je posebno izraženo u prisustvu šećera, ugljen dioksida i niže pH

vrednosti (kisela sredina) (Karakašević, 1987).

Ramage et al. (2001) su u svojim studijama otkrili da patogene gljivice iz ovog

roda mogu izazvati površinske, kao i ozbiljne sistemske bolesti. Mnoge infekcije koje

izaziva ova vrsta su uključene u stvaranju biofilma na kateterima i implantatima.


17

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Selekcija sojeva iz kolekcije Mikrobiološke laboratorije PMF-a u Nišu koje su

potencijalni producenti biofilma na osnovu literaturnih podataka

Ispitivanje produkcije biofilma odabranih sojeva mikroorganizama u odnosu na tip

korišćene podloge

Ispitivanje produkcije biofilma odabranih sojeva mikroorganizama u odnosu na

koncentraciju šećera u podlozi

Utvrđivanje zavisnosti produkcije biofilma od tipa podloge i koncentracije šećera i

utvrđivanje najproduktivnijeg soja


18

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Rastvori, podloge i reagensi

Fiziološki rastvor je 0.85% (m/V) rastvor natrijum hlorida (NaCl) u destilovanoj

sterilisanoj vodi. Dobija se rastvaranjem 0.85 g natrijum hlorida (NaCl) u 100 ml

destilovane vode.

Hranljivi agar (HA) je podloga čija je namena kultivisanje širokog sprektra

mikroorganizama. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepton 15.00 g, mesni

ekstrakt 3.00 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum fosfat 0.30 g, agar-agar 18.00 g

(konačna pH vrednost 7.3 na 25 °C). Priprema ove podloge je vršena suspendovanjem

38.00 g suve podloge u 1000 ml destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i

inicijalnog zagrevanja na rešou do potpunog rastvaranja, vršeno je razlivanje podloge i

autoklaviranje u trajanju od 20 minuta na 121 °C. Pre upotrebe podlogu ostaviti na

radnom mestu dok ne dostigne temperaturu okoline.

Sabouraud dekstrozni agar (SDA). Podloga koja sadrži 4% dekstroze, za

izolovanje i kultivaciju gljivica i kvasaca. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći:

pepsin 10.0 g, dekstroza 40.0 g i agar 15.0 g. Odmeriti 65 g praha podloge i dodati 1000

ml hladne destilovane vode. Ostavi da stoji 15 minuta. Podlogu zatim pažljivo i uz

mešanje zagrevati do ključanja, da se potpuno rastvori i sterilisati u autoklavu 15 minuta

na 121 °C. Podlogu ohladiti na 50 °C, promešati i sterilno razliti u Petri ploče. Razlivenu

podlogu u pločama ostaviti da se ohladi i očvrsne.

Tripton soja bujon (TSB) je podloga za kultivaciju velikog broja

mikroorganizama. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepsin od kazeina 17.0 g,

soja pepsin 3.00 g, dekstroza 2.50 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g i kalijum-

hidrogenfosfat 2.50 g. Odmerti 30 g praha podloge i dodati 1000 ml hladne destilovane

vode. Podlogu pažljivo i uz mešanje zagrevati do ključanja, da se potpuno rastvori.


19

Rastvorenu podlogu razliti u epruvete i sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.

Podlogu u epruvetama posle sterilizacije ostaviti da se ohladi i koristiti , ili do upotrebe

čuvati na temperaturi od 2 °C do 8 °C. Pre upotrebe podlogu ostaviti na radnom mestu

dok ne dostigne temperaturu okoline.

Hranljivi bujon (HB) je podloga za kultivaciju velikog broja mikroorganizama.

Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepton 15.00 g, mesni ekstrakt 3.00 g, natrijum

hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum-hidrogenfosfat 0.30 g. Odmeriti 27.3 g praha podloge i

dodati 1000 ml hladne destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog

zagrevanja na rešou do potpunog rastvaranja, vršeno je razlivanje podloge i

autoklaviranje u trajanju od 20 minuta na 121 °C. Podlogu u epruvetama posle

sterilizacije ostaviti da se ohladi i koristiti, ili do upotrebe čuvati na temperaturi od 2 °C

do 8 °C. Pre upotrebe podlogu ostaviti na radnom mestu dok ne dostigne temperaturu

okoline.

Laktozni bujon (LB) je podloga čija je namena kultivisanje širokog spektra

mikroorganizama. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: tripsin 10.00 g, natrijum

hlorid (NaCl) 5.00 g i ekstrakt kvasca 5.00 g. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog

zagrevanja na rešou do potpunog rastvaranja, vršeno je razlivanje podloge i

autoklaviranje u trajanju od 20 minuta na 121 °C. Pre upotrebe podlogu ostaviti na

radnom mestu dok ne dostigne temperaturu okoline.

Kristal violet 1%. Osnova trifenilmetilenskog bojenja, koristi se u Gram bojenju

bakterija. Dobija se rastvaranjem 1.00 g NaCl u 1000 ml destilovane vode.

Fosfatni pufer (PBS-Phosphate Buffer Saline). Sastav ove podloge na 1000 ml

je sledeći: natrijum hlorid (NaCl) 8.00 g, kalijum hlorid (KCl) 0,20 g, Na2HPO4 1.44 g i

KH2PO4 0.24 g.

Sabouraud dekstrozni bujon (SDB) je podloga koja sadrži 2% dekstroze čija je

namena kultivisanje gljivica i kvasaca, kao i za njihovu detekciju pri kontroli sterilnosti

materijala. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepsin 10.00 g i dekstroza 20.00 g.

Koncentracija dekstroze od 2% i kisela sredina podloge favorizuju rast gljivica. Rast

mikroorganizama se vidi kao zamućenje podloge.


20

RPMI 1640 medium je namenjen za gajenje humanih i drugih ćelija u kulturi koje

rastu u suspenziji. RPMI 1640 podloga je proizvod istraživača Moore et al., sa instituta

"Roswell Park Memorial lnstitute", ро čemu је i dat naziv RPMI. Osnovni sadržaj

podloge je fosfatni pufer (PBS-Phosphate Buffer Saline), u koji se dodaju amino-kiseline

i vitamini. Hemijski sastav RPMI 1640 podloge je izuzetno kompleksan i sačinjavaju ga

veći broj neorganskih soli, aminokiselina, vitamina i ostalih komponenti (D-glukoza,

HEPES, fenol crveno i drugi).

3.2. Sojevi mikroorganizama

Za testiranje sposobnosti produkcije biofilma korišćene su 2 vrste bakterija i 1

vrsta kvasca. U eksperimentalnom delu korišćeno je 5 sojeva Staphyloccocus aureus, 8

sojeva Escherichia coli i 10 sojeva Candida albicans. U tabeli 1 su prikazani sojevi

mikroorganizama i poreklo izabranih sojeva.

Sojevi mikroorganizama Poreklo izabranih sojeva Šifra soja

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus ATCC 25923 S1

Staphylococcus aureus izolat iz rane S2

Staphylococcus aureus humani izolat S3

Staphylococcus aureus humani izolat S4

Staphylococcus aureus ATCC 6538 S5

Escherichia coli

Escherichia coli ATCC 8739 E1


Escherichia coli izolat iz rane E3

Escherichia coli izolat iz hrane E4


21


Escherichia coli izolat iz fecesa E6

Escherichia coli izolat iz urina E7


Candida albicans

Candida albicans izolat iz krvi C1







Candida albicans ATCC 24433 C8



Tabela 1. Sojevi mikroorganizama korišćenih u eksperimentu


22

3.3. Određivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih vrsta

mikroorganizama

Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma je rađeno u plastičnim mikrotitar

pločama sa 96 bunarčića. Od prekonoćnih kultura bakterija i kvasca koje su uzgajane na

hranljivom agaru (bakterije) i Sabouraud dekstroznom agaru (kvasci), napravljene su

suspenzije u sterilnom fiziološkom rastvoru. Podešavanje turbiditeta suspenzija vršeno je

tako da odgovara turbiditetu 0.5 McFarland-a, koji odgovara koncentraciji bakterija 1-5 x

108 CFU/ml (Colony Forming Unit-jedinica za formiranje kolonija) na McFarland

densitometru (DEN-1, Biosan).

Slika 5. Suspenzije ispitivanih sojeva vrste Candida albicans podešenih na turbiditet od 0.5

McFarland jedinica

Bujoni koji su korišćeni za bakterije su tripton soja bujon (TSB), laktozni bujon

(LB) i hranljivi bujon (HB), dok je za kvasce korišćen RPMI 1640 i Sabouraud

dekstrozni bujon (SDB). U eksperimentu je testiran čist bujon bez dodate glukoze (0%

glukoze), kao i isti bujon sa tri različite koncentracije šećera. U bujone je nakon

autoklaviranja dodat šećer glukoza u odgovarajućim koncentracijama (0.25%, 0.5% i


23

1.0%), a zatim je rastvor sterilisan filtriranjem kroz filter sa porama prečnika 0.45 μm.

Finalna koncentracija ćelija (106 ćelija/ml) podešavana je dodavanjem određenog

volumena McFarland suspenzije u adekvatnu podlogu, nakon čega je zasejan bujon sipan

u bunačiće mikrotitar ploče u volumenu od po 100 μl. Ovako pripremljene mikrotitar

ploče stavljene su na inkubaciju, za bakterije 24 h, a kvasce 48 h.

Nakon inkubacije uklonjene su ćelije pipetom i vršeno je ispiranje 2 puta sa po 300

μl PBS-a, nakon čega su mikrotitar ploče stavljene na sušenje u sterilizatoru na 60 °C (20

minuta). U svaki bunarčić nakon sušenja je dodato po 200 μl 1% kristal violeta (CV) (20

minuta), nakon čega su mikrotitar ploče isprane 4 puta fiziološkim rastvorom i dodato po

250 μl 95% EtOH (30 minuta). Na kraju je prebačeno po 200 μl EtOH u druge mikrotitar

ploče i vršeno merenje na ELISA čitaču (A595), na Medicinskom fakultetu u Nišu.

Slika 6. Mikrotitar ploča nakon bojenja kristal violetom

3.4. Statistička analiza dobijenih rezultata

Dobijeni rezultati su obrađeni analizom varijanse (ANOVA) i tom prilikom je

rađeno poređenje srednjih vrednosti i računanje standardnih devijacija.


24

4. REZULTATI I DISKUSIJA

Na osnovu dobijenih rezultata izračunate su srednje vrednosti sa standardnim

devijacijama što je prikazano u vidu grafika u ovom radu. Dobijene vrednosti su

poređene sa kontrolnim vrednostima za svaku podlogu, koje su predstavljale apsorbancu

izmerenu za bunariće u kojima je bila određena podloga bez dodatih ćelija (apsorbanca

same podloge). Rezultati su predstavljeni u Tabeli 2.

Bujon Srednje vrednosti Standardne devijacije

Tripton soja bujon (TSB) 0.35 0.03

Laktozni bujon (LB) 0.27 0.06

Hranljivi bujon (HB) 0.24 0.09

Sabouraud dekstrozni bujon (SDB) 0.28 0.08

RPMI 1640 0.37 0.07

Tabela 2. Apsorbance podloga bez dodatih ćelija (kontrolne vrednosti)


25

4.1. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva

vrste Staphylococcus aureus

Rezultati o sposobnosti vrste S. aureus da formira biofilm u tripton soja bujonu

(TSB) predstavljeni su na grafiku 1. Rezultati pokazuju da najveću produkciju biofilma

ima soj S5- S. aureus (ATCC 6538), dok je najmanja produktivnost zabeležena kod soja

S4- S. aureus (humani izolat). Ukupan opseg apsorbanci u ovom bujonu je iznosio od 0.15

- 4.08, pri čemu je najveća vrednost zabeležena kod soja S5- S. aureus (ATCC 6538) sa

1% glukozom, a najmanja kod soja S2- S. aureus (izolat iz rane) bez glukoze.

Koncentracije šećera u ovom bujonu koje izazivaju najveću produkciju biofilma su 0.5%

i 1%, a najmanje vrednosti su zabeležene bez dodavanja šećera, što je i očekivano.

Grafik 1. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Staphylococcus aureus

pri različitim koncentracijama šećera u TSB-u. S1- Staphylococcus aureus (ATCC 25923); S2- S.

aureus ( izolat iz rane); S3- S. aureus (humani izolat); S4- S. aureus (humani izolat); S5- S. aureus

(ATCC 6538).


26

Na grafiku 2 se vidi sposobnost formiranja biofilma vrste S. aureus u laktoznom

bujonu (LB). Ukupan opseg apsorbanci u ovom bujonu je iznosio od 0.19 - 1.65.

Analizom rezultata je dobijeno da najveću produkciju biofilma ima soj S3- S. aureus

(humani izolat), dok su najmanje produktivni sojevi S1- S. aureus (ATCC 25923) i S5- S.

aureus (ATCC 6538). Najveća vrednost apsorbance je zabeležena kod soja S3- S. aureus

(humani izolat) sa 1% glukozom, a najniža kod soja S2- S. aureus (izolat iz rane) bez

glukoze. Koncentracija šećera koja je u ovoj podlozi izazvala najveću produkciju

biofilma je 1%, dok najmanje vrednosti, kao i u TSB-u, imamo sa 0% šećera.


pri različitim koncentracijama šećera u LB-u. S1- Staphylococcus aureus (ATCC 25923); S2- S.

aureus ( izolat iz rane); S3- S. aureus (humani izolat); S4- S. aureus (humani izolat); S5- S. aureus

(ATCC 6538).


27

Formiranje biofilma stafilokoke u hranljivom bujonu (HB) je predstavljeno na

grafiku 3. Rezultati pokazuju da je najveću produkciju biofilma imao soj S4- S. aureus

(humani izolat), dok je najmanja produktivnost zabeležena kod sojeva S1- S. aureus

(ATCC 25923) i S5- S. aureus (ATCC 6538). Ukupan opseg apsorbanci u hranljivom

bujonu iznosio je od 0.09 – 0.69. Najviša vrednost je zabeležena kod soja S4- S. aureus

(humani izolat) sa 1% glukozom, a najniža kod soja S3- S. aureus (humani izolat) bez

glukoze. Koncentracije šećera koje su izazvale najveću produktivnost bakterija bile su

0.5% i 1%. Kao i u predhodne dve podloge, najmanje vrednosti apsorbance

(proporcionalna produkciji biofilma) su zabeležene bez dodatka šećera.


pri različitim koncentracijama šećera u HB-u. S1- Staphylococcus aureus (ATCC 25923); S2- S.

aureus (izolat iz rane); S3- S. aureus (humani izolat); S4- S. aureus (humani izolat); S5- S. aureus

(ATCC 6538).


28

Kada se uporede produkcije biofilma u sve tri podloge, najveću produktivnost od

testiranih pet sojeva imao je referentni soj S5- S. aureus (ATCC 6538) u TSB-u sa

vrednošću apsorbance od 4.08, a najmanju od 0.09 referentni soj S1- S. aureus (ATCC

25923) u HB-u. Soj S1- S. aureus (ATCC 25923) je pokazao najmanju sposobnost

formiranja biofilma u svim podlogama. Kod soja S2- S. aureus (izolat iz rane) i S3- S.

aureus (humani izolat) je utvrđeno da dodavanje šećera pozitivno utiče na razvoj biofilma

u svim podlogama. S4- S. aureus (humani izolat) je imao bolju produkciju u LB-u, nego u

TSB-u, što je potpuno obratno kod soja S5- S. aureus (ATCC 6538) koji je imao najbolju

produkciju u TSB-u.

Do sada je nekoliko istraživanja vršilo testiranja uticaja različitih koncentracija

glukoze na produkciju biofilmova ove vrste bakterije. U studiji Sarah et al.(1999) je

testirano koji su faktori značajni za produkciju biofilma ove bakterijske vrste, kao i utiče

li povećanje koncentracije glukoze na ovaj proces. Pri tome su testirani čist tripton soja

bujon i tripton soja bujon sa dodatkom 0.25% glukoze. Pored utvrđivanja činjenice da je

adhezija od osnovnog značaja za nastanak biofilma, istraživači su utvrdili da neki sojevi

stafilokoke formiraju jake biofilmove, neki slabe, a neki uopšte nisu biofilm produkujući.

Dodavanje glukoze kod većine ispitanih sojeva pospešuje produkciju biofilma u ovom

bujonu.

Yong Lim i saradnici (2003) su u svom istraživanju ispitivali sposobnost vrste

Staphyloccocus aureus da produkuje biofilm u odnosu na određene količine dodate

glukoze u TSB-u. Koncentracije šećera koje su koristili bile su 0.10%, 0.30%, 0.90% i

2.7%. Ukupan opseg apsorbanci im se kretao od 0.2 sa 0.10%, do 2.1 sa 2.7% glukoze.

Zaključili su da dodavanje šećera pospešuje produkciju biofilma. Takođe su utvrdili da

svi sojevi nisu isti producenti biofilma.

Sander Croes et al. (2009) su u svom istraživanju hteli da utvrde sposobnost vrste

Staphyloccocus aureus da formira biofilm. Zasejavali su sojeve ove vrste u TSB-u bez

dodatka glukoze, sa 0.1%, 0.25% i 0.5% glokoze. Na osnovu dobijenih rezultata su

utvrdili da je čak 60% sojeva ove vrste sposobno da formira biofilm pri minimalnoj

koncentraciji šećera od 0.1%. Apsorbance formiranih biofilmova su se kretale u opsegu


29

od 0.4 bez glukoze, do 2.3 sa dodatkom 0.5% glukoze. Ustanovili su da većina sojeva sa

povećanjem koncentracije šećera povećava produkciju biofilma.

U našem istraživanju, utvrđeno je da u svim podlogama postoji varijabilnost

sojeva u produkciji biofilma, ali da je ta produkcija najveća u TSB-u. Pored ovoga,

postoji direktna proporcionalnost između koncentracije šećera i produkovanog biofilma,

što se uočava kao pravilnost u svim podlogama i uklapa se sa prethodnim rezultatima

istraživanja na ovu temu. Referentni soj stafilokoke ATCC 6538 je u TSB pri svim

testiranim koncentracijama pokazao veću sposobnost produkcije biofilmova od kultura u

prethodnim studijama, koje su kao maksimalne vrednosti imale apsorbancu od 2.1 i 2.3

pri najvišim koncentracijama šećera. Zbog svega navedenog, može se zaključiti da je

najbolja podloga za produkciju biofilma vrste Staphylococcus aureus tripton soja bujon

(TSB), koja se i smatra optimalnom za rast stafilokoka. Utvrđeno je da dodavanje šećera

glukoze pospešuje produkciju biofilma kod ove bakterije.


30


vrste Escherichia coli

Proučavanje sposobnosti produkcije biofilma vrste E. coli eksperimentalno je

rađeno na isti način kao kod vrste S. aureus. Korišćene su iste podloge i iste

koncentracije šećera.

Na grafiku 4 predstavljena je sposobnost produkcije biofilma vrste E. coli u tripton

soja bujonu (TSB). Kod soja E1- E. coli (ATCC 8739) i E3- E. coli (izolat iz rane)

uočavamo malu sposobnost formiranja biofilma sa dodatkom šećera. Ostalih šest sojeva

nisu pokazali produktivnost u TSB-u., jer su vrednosti apsorbanci bile jako niske.

Grafik 4. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Escherichia coli pri

različitim koncentracijama šećera u TSB-u. E1- Escherichia coli (ATCC 8739); E2- E. coli

(ATCC 11775); E3- E. coli (izolat iz rane); E4- E. coli (izolat iz hrane); E5- E. coli (ATCC

8739); E6- E. coli (izolat iz fecesa); E7- E. coli (izolat iz urina); E8- E. coli (ATCC 25822).


31

Rezultati u laktoznom bujonu (LB), kao i u prethodnom bujonu, pokazuju da

testirani sojevi E. Coli ne produkuju biofilm, što možemo videti na grafiku 5. Soj E5- E.

coli (ATCC 8739) je imao povećanu apsorbancu u odnosu na ostale sojeve, što se desilo

u bujonu bez dodatka šećera (A595=0.37).


različitim koncentracijama šećera u LB-u. E1- Escherichia coli (ATCC 8739); E2- E. coli (ATCC

11775); E3- E. coli (izolat iz rane); E4- E. coli (izolat iz hrane); E5- E. coli (ATCC 8739); E6- E.

coli (izolat iz fecesa); E7- E. coli (izolat iz urina); E8- E. coli (ATCC 25822).


32

Jako zanimljivi rezultati prikazani na grafiku 6 dobijeni su u hranljivom bujonu

(HB). Kod sojeva E2, E3, E4 i E5 javila se produkcija biofilma u bujonu bez dodatka

šećera, gde su se vrednosti kretale od 0.41 kod soja E4, do 0.67 kod soja E2. U ovom

bujonu, soj E8 je produkovao biofilm pri koncentraciji dodatog šećera od 0.5% i

vrednošću apsorbance od 1.20. Soj E1 i E7 nisu pokazali sposobnost da produkuju biofilm

u HB-u.


različitim koncentracijama šećera u HB-u. E1- Escherichia coli (ATCC 8739); E2- E. coli (ATCC

11775); E3- E. coli (izolat iz rane); E4- E. coli (izolat iz hrane); E5- E. coli (ATCC 8739); E6- E.

coli (izolat iz fecesa); E7- E. coli (izolat iz urina); E8- E. coli (ATCC 25822).

Demba W. Jockson i saradnici (2002) su hteli da utvrde sposobnost E. coli da

formira biofilm sa i bez dodatka 0.2% glukoze. Testirani su klinički izolati ove bakterije.

Eksperiment je rađen na mikrotitar pločama, u LB medijumu, a ćelije biofilma su bojene

kristal violetom. Rezultati su pokazali da je dodavanje glukoze dovelo do smanjenja


33

produkcije biofilma, sa maksimalnim vrednostima od 0.6 bez šećera, i manjim od 0.1 sa

dodatkom 0.2% glukoze.

Moreira et al. (2013) su u svom istraživanju ispitivali sposobnost produkcije

biofilma vrste Escherichia coli sa dodatkom 0.25% i 1% glukoze u TSB medijumu. Rast

biofilma je praćen u vremenskom intervalu od 60 h (inkubacioni period). Najviše

vrednosti su izmerene nakon 24 h, gde je ukupan prosek apsorbanci sa dodatkom 0.25%

glukoze iznosio 0.14, a 0.26 sa 1% šećera. Nakon tog perioda vrednosti su lagano padale.

Za razliku od stafilokoka, ova vrsta pokazuje znatno manju sposobnost formiranja

biofilma, a mnoge sojeve ne možemo smatrati producentima biofilma. Vrednosti

apsorbance bile su u proseku 10 i više puta niže od onih koje su izmerene kod

stafilokoka. Utvrđeno je da glukoza nema značajan efekat na formiranje biofilma kod

svih sojeva i u svim podlogama. Jedini izuzetak od navedenog su pet sojeva u hranljivom

bujonu koji su najveću apsorbancu imali nakon inkubacije u bujonu bez dodatog šećera.


34


vrste Candida albicans

Sposobnost produkcije biofilma kod kvasaca je eksperimentalno rađena na isti

način kao i kod bakterija. Razlika je bila jedino u tome što je inkubacija kod kvasaca

trajala 48 h. Bujoni korišćeni kod kvasca bili su RPMI 1640 i Sabouraud dekstrozni

bujon (SDB).

Sposobnost formiranja biofilma sojeva vrste Candida albicans u RPMI 1640 je

prikazana na grafiku 7. Prema dobijenim rezultatima najbolju produkciju biofilma imali

su sojevi C7 i C9 sa dodatkom šećera glukoze, dok je najmanja produktivnost zabeležena

kod sojeva C2 i C5. Ukupan opseg apsorbanci u ovom bujonu iznosio je 0.09 – 2.27, pri

čemu je najveća vrednost zabeležena kod soja C7 sa 1% glukozom, a najmanja kod soja

C5 sa 0.5% glukozom. Kod sojeva ove vrste produkcija biofilma nije bila direktno

proporcionalna sa koncentracijom šećera, jer je uočeno da povećanje koncentracije šećera

nije u svim slučajevima dovelo do povećanja apsorbance (produkcije većeg biofilma).

Grafik 7. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Candida spp. pri

različitim koncentracijama šećera u RPMI 1640. C1- Candida albicans (izolat iz krvi); C2- C.


35

albicans (izolat iz krvi); C3- C. albicans (izolat iz krvi); C4- C. albicans (izolat iz krvi); C5- C.


albicans (ATCC 24433); C9- C. albicans (izolat iz krvi); C10- C. albicans (izolat iz krvi).

Na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da vrsta Candida albicans ne

produkuje biofilm u Sabouraud dekstroznom bujonu (SDB), kao što se vidi na grafiku 8.

Vrednosti kod svih sojeva u ovom bujonu se kreću od 0.08 – 0.16, što je veoma slično

vrednostima koje su izmerene u kontrolnim bunarićima u kojima nije bilo bakterija ni

kvasca.

Grafik 8. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Candida albicas pri

različitim koncentracijama šećera u SDB-u. C1- Candida albicans (izolat iz krvi); C2- C.



albicans (ATCC 24433); C9- C. albicans (izolat iz krvi); C10- C. albicans (izolat iz krvi).


36

Tomas H. i saradnici (2004) su ispitivali sposobnost produkcije biofilma kod vrste

Candida albicans u RPMI 1640 sa dodatkom 1% glukoze tokom vremenskog perioda od

3 do 48 h. Srednja vrednost apsorbanci nakon 3 h je iznosila 0.7, nakon 24 h je bila 2.4, a

nakon 48 h je pala na 1.3.

Rezultati našeg istraživanja su potvrdili opravdanost upotrebe podloge RPMI 1640

za produkciju biofilma vrste Candida albicans, jer se pokazala kao značajno bolja u

poređenju sa SDB podlogom. Opšta preporuka i zaključak bili bi da se u slučaju vrste C.

albicans preporučuje preliminarno testiranje koja koncentracija dodate glukoze najviše

doprinosi produkciji biofilma konkretnog soja, a tek onda treba pristupiti daljim

istraživanjima na biofilmu tog soja.


37

5. ZAKLJUČAK

Na osnovu rezultata prezentovanih u ovom radu mogu se doneti sledeći zaključci:

1. Najveću sposobnost produkcije biofilma od ispitanih vrsta je pokazala bakterija

Staphyloccocus aureus. Podloga u kojoj su sojevi ove vrste najviše produkovali

biofilm je tripton soja bujon (TSB). Kod ove vrste je potvrđeno da dodavanje

glukoze pospešuje produkciju biofilma.

2. Sojevi vrste Escherichia coli nisu pokazali sposobnost produkcije biofilma u

ispitivanim podlogama. Dodavanje šećera nije uticalo na produkciju biofilma kod

ove vrste.

3. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma kod vrste Candida albicans je pokazalo

da je za ovu svrhu podloga RPMI 1640 bolja od SDB. Sposobnost produkcije

biofilma kod kvasca nije bila proporcionalna količini dodate glukoze.

4. Za kultivaciju biofilma stafilokoke preporučuje se dodavanje glukoze i korišćenje

TSB kao podloge, dok se za kvasce preporučuje upotreba RPMI 1640 i

preliminarno ispitivanje optimalnih koncentracija šećera za pojedinačne sojeve (sa

kojima se u datom trenutku radi produkcija biofilma).


38

6. LITERATURA

Beech, I.B., Sunner, J.A., Arciola, C.R., Cristiani, P., 2004: Microbially-influenced

corrosion: damage to prostheses, delight for bacteria. -Int J Artif Organs 29: 443-52.

Costerton, J.W., Lewandowski, Z., Caldwell, D.E., Korber, D.R., Lappin-Scott,

H.M., 1995: Microbial biofilms.- Annual Review of Microbiology 49: 711–745.

Costerton, J.W., Stewart, P.S., Greenberg, E.P., 1999: Bacterial biofilms: a common

cause of persistent infections. – Science 1999 284: 318-322.

Costerton, J.W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G., 2003: The

application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections.

-J Clin Invest 112: 1466-77.

Debra, W. J., Jerry, W. S., Tony, R., 2002: Catabolite Repression of Escherichia

coli Biofilm Formation. -Journal of Bacteriology 12: 3406-3410.

Donlan, R. M., 2008: "Biofilms on central venous catheters: is eradication possible?"

- Current Topics in Microbiology and Immunology 322: 133-161.

Donlan, R.M., 2001: Biofilms and device associated infections. - Emerging Infectious

Diseases journal 7 :2777–2781.

Donlan, R.M., 2001: Biofilms microbial life on surfaces. -Emerging Infectious

Diseases journal 8: 881–890.


39

Donlan, R.M., 2002: Biofilms: Microbial Life on Surfaces. -Emerg Infect Dis 8(9):

881-90.

Donlan, RM., Costerton, J.W., 2002: Biofilms: survival mechanisms of clinically

relevant microorganisms. - Clin Microbial Rev 15: 167-93.

Durack, D.T., 1975: Experimental bacterial endocarditis. - IV Structure and evolution

of very early lesions. J Pathol 115: 81–89.

Flemming, H.C., 1991: Biofilms as particular forms of microbial life. -Biofouling and

Biocorrosion in Industrial water Systems (Eds: Flemming HC, Geesey GG),

Springer, Heidelber: 5-11.

Gotz, F., 2002: Staphylococcus and biofilms. -Mol Microbiol 43(6): 1367-78.

Greenberg, EP., 2003: Bacterial communication and group behavior. -J Clin Invest

112: 1288-90.

Hall-Stoodley, L., Costerton, J.W. and Stoodley, P., 2004: "Bacterial biofilms: from

the natural environment to infectious diseases. -Nature Reviews Microbiology 2: 95-

108.

Hentzer, M., Givskov, M., 2003: Pharmacological inhibition of quorum sensing for

the treatment of chronic bacterial infections. - J Clin Invest 112: 1300-7.

Joana, M., Luciana, G., Joan, M., Luis, F.M., 2013: The effect of glucose

concentration and shaking conditions on Escherichia coli biofilm formation in

microtiter plates. – Chemical enginnering science 94: 192-199.


40

Karakačević, B., 1987: Mikrobiologija i parazitologija.- Medicinska knjiga, str. 767-

780, Beograd-Zagreb.

Kostakioti, M., Hadjifrangiskou, M., Hultgren, S.J., 2013: Bacteriali biofilm:

development, dispersal and therapeutic stratedies in the dawn of the postantibiotic

era. –Cold Spring Harb Perspect Med. 2013.

Lappin- Scott H. M., and J. W. Costerton., 1992: Ultramicrobacterial and their

biotehnological applications. – Curr. Onin. Biotechnol. 3: 283-285.

Mah, T.F., O'Toole, G.A., 2001: Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial

agents. -Trends Microbiol 9: 34-9.

Maira-Litran, T., Allison, D.G., and Gilbert, P., 2000: An evolution of potential role

of multiple antibiotic resistance operon (mar) and multi-drug efflux pump acrAB in

the resistance of E.coli biofilms towards ciprofloxacin. -J Antimicrob Chemother

45:789-795.

Morris, A., J.D. Kellner., and D.E. Low., 1998: The superbugs: evolution,

dissemination and fitness. -Curr Opin Microbiol 1(5): 524-9.

O’Toole, G., Kaplan, H.B., Kolter, R., 2000: Biofilm formation as microbial

development. Annual Review of Microbiology 54: 49-79.

Prakash, B., Veeregowda, B.M., Krishnappa, G., 2003: Biofilms: a survival strategy

of bacteria. -Curr Sci 85: 1299-307.

Ramage, G., Vande-Walle, K., Wickes, B.L., Lopez-Ribot, J.L., 2001: Standardized

method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. -

Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45: 2475–2479.


41

Ramage, G., Vande-Walle, K., Wickes, B.L., Lopez-Ribot, J.L., 2001: Characteristics

of biofilm formation by Candida albicans. - Annual Review of Microbiology 18:

163–170.

Sarah, E. C., Christiane, G., Norbert, F. S., Wright, W. N., Friedrich, G., 1999: The

Intercellular Adhesion (ica) Locus Is Present in Staphylococcus aureus and Is

Required for Biofilm Formation. – Infection and Immunity: 5427-5433.

Sarden, C., Ruud, H. D., Marie-Louise, L. B., Patrick, S. B., Cees, N., Ellen, E. S.,

2009: Staphylococcus aureus biofilm formation at the physiologic glucose

concentration depends on the S. aureus lineage. – BMC Microbiology 9: 229.

Schwermer, C.U., Lavik, G., Abed, R.M., et al., 2008: "Impact of nitrate on the

structure and function of bacterial biofilm communities in pipelines used for injection

of seawater into oil fields". -Applied and Environmental Microbiology 74 (9): 2841–

51.

Spoering, A.L., Lewis, K., 2001: Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas

aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials -Journal of

Bacteriology 183: 6746-51.

Stewart, P.S., Costerton, J.W., 2001: Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. -

Lancet 358:135-8.

Suci, P.A., Mittelman, M.W., Yu, F.P., and Geesey, G.G., 1994: Investigation of

ciprofloxacin penetration into Pseudomonas aeruginosa biofilms. -Antimicrob Agents

Chemothe 38: 2125–2133.

Sutherland, I.W., 2001: Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework.

–Microbiology 147: 3–9.


42

Tolker-Nielsen, T., Brinch, U.C., Ragas, P.C., Andersen, J.B., Jacobsen, C.S., Molin,

S., 2000: Development and dynamics of Pseudomonas sp. biofilms. -J Bacteriol 182:

6482–6489.

Tunney, M.M., Jones, D.S., Gorman, S.P., 1999: Biofilm and biofilm-related

encrustations of urinary tract devices. In: Doyle RJ, editor. Methods in enzymology,

vol. 310. Biofilms. -San Diego: Academic Press: 558–566.

Yong, L., Malabendu, J., Thang, T. L., Chia, Y. L., 2003: Control of Glucose- and

NaCl-Induced Biofilm Formation by rbf in Staphylococcus aureus. - Journal of

bacteriology 186: 722-729.

http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xsa/xsa01.jpg

https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm

https://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans

https://www.studyblue.com/notes/note/n/bio222-lab-study-guide-2012-

13brofife/deck/9714210

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Никола Младеновић

Ментор, МН: Зорица Стојановић Радић

Наслов рада, НР: Способност продукције биофилма од стране одабраних сојева

микроорганизама

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2015.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

42 страна, 2 табелe, 6 слика, 8 графика

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Микробиологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: биофилм, глукоза, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans

УДК 579.222

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Циљ мастер рада је био да се испита способност продукције биофилма

одабраних сојева микроорганизама у односу на тип подлоге и

концентрацију додатог шећера глукозе. Тестирани сојеви су део колекције

Микробиолошке лабораторије Природно-математичког факултета, при

чему је тестирано више сојева неколико врста патогених микроорганизама

и то: Staphylococcus aureus, Esherichia coli i Candida albicans.

Концентрације шећера коришћене у експерименту износиле су 0%, 0.25%,

0.5% i 1%.

Датум прихватања теме, ДП: 23.09.2015.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: др Татјана Михаjилов-Крстев, ванредни професор ПМФ-а у Нишу

Члан: др Наташа Јоковић, доцент ПМФ-а у Нишу

Члан, ментор: др Зорица Стојановић-Радић, доцент ПМФ-а у Нишу

Образац Q4.09.13 – Издање 1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: Textual/graphic

Contents code, CC: Master thesis

Author, AU: Nikola Mladenović

Mentor, MN: Zorica Stojanović Radić

Title, TI: Biofilm-forming ability of selected microbial strains

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: Engish

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2015.

Publisher, PB: Autor’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

42 pages, 2 tables, 6 pictures, 8 graph

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Microbiology

Subject/Key words, S/KW: biofilm, glucose, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans

UC 579.222

Holding data, HD: Library

Note, N:

Abstract, AB: The aim of the master thesis was to examine the ability of the selected

strains of microorganisms to produce the biofilm in relation to the type of

substrate and concentration of added glucose. The tested strains are part of

a collection of the Laboratory of Microbiology of the Faculty of Sciences and

Mathematics in Niš, where multiple strains of several species of pathogenic

microorganisms were tested: Staphylococcus aureus, Escherichia coli and

Candida albicans. The concentrations of the glucose used in the experiment

were 0%, 0.25%. 0.5% and 1%.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 23.09.2015.

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President: PhD Tatjana Mihajilov-Krstev, Associate Professor, Faculty of Science in Nis

Member: PhD Nataša Joković, Assistant Professor of Science in Nis

Member, Mentor: PhD Zorica Stojanović-Radić, Assistant Professor of Science in Nis

Образац Q4.09.13 - Издање 1

sposobnost produkcije biofilma od strane odabranih … · zavisno od vrste mikroorganizama,...

Documents