southern blot exposé1
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SOUTHERN BLOT
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Présenté par:
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La technique de Southern blot est une méthode d’hybridation moléculaire.
Baptisée du nom de son inventeur, le biologiste britannique Edwin Southern.
Permet de visualiser n’importe quelle fraction du génome à condition d’avoir une sonde «séquence » hybridant spécifiquement avec la séquence à analyser.
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OBJECTIF
Visualiser un fragment du génome (ADN) dont on possède une sonde.
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PRINCIPE DE LA TECHNIQUE
1-Préparation de l'ADN à étudier - Digestion ou fragmentation de l’ADN. - Séparation des fragments. - Dénaturation et neutralisation de l'ADN - Transfert de l'ADN sur une membrane
- Fixation covalente de l'ADN sur la membrane
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2- Préhybridation 3- Hybridation 4- Lavages 5- Autoradiographie
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1- Digestion ou fragmentation de l’ADNDigestion ou fragmentation de l’ADN Couper l'ADN en fragments de différents
tailles enzymes de restrictions environ 106
fragments Ceci facilite l’identification des séquences
spécifiques Les fragments sont maintenant facilement
séparés par l'électrophorèse sur gel.
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2-Séparation des fragments par 2-Séparation des fragments par électrophorèse sur gelélectrophorèse sur gel
Agarose ou polyacrylamide Séparation des fragments en fonction de
leur tailles La coloration au B.E.T permet - contrôler la qualité de l’ADN - contrôler la migration - contrôler la digestion enzymatique Visualisation sous UV.
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2-Séparation des fragments par électrophorèse sur 2-Séparation des fragments par électrophorèse sur gelgel
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3-Dénaturation et neutralisation de l'ADN3-Dénaturation et neutralisation de l'ADN1- Dénaturation Le gel d‘électrophorèse est trempé dans une
solution alcaline (NaOH) permettre la dénaturation de l’ADN bicaténaire.
2- Neutralisation Le gel est immergé dans une solution
neutralisante empêcher la renaturation de l’ADN avant
d’ajouter la sonde.
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4-Transfert de l'ADN sur une membrane4-Transfert de l'ADN sur une membrane Une feuille de membrane en nitrocellulose (ou en
nylon) est placée sur le gel. Une pression est appliquée au gel (une pile de
serviettes de papier et par un poids) permettre le déplacement de l'ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarité
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TRANSFERT DE L'ADN SUR UNE TRANSFERT DE L'ADN SUR UNE MEMBRANEMEMBRANE
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PRÉPARATION DE L'ADN À ÉTUDIER
5- Fixation covalente de l'ADN sur la 5- Fixation covalente de l'ADN sur la membranemembrane
fixation de l'ADN sur la membrane par : - Cuisson ou chauffage à 80°C (mb. nitrocellulose).
- Exposition au UV (mb. nylon) fixer de manière permanente l'ADN sur la
membrane.
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2- PRÉHYBRIDATION
Saturer les sites de fixation de la membrane restées libres.
- Pré incuber la membrane avec un ADN hétérologue ( ADN de sperme de saumon).
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3- HYBRIDATION
La membrane est mise en contact avec une sonde spécifique de la séquence d'ADN recherchée.
La sonde doit être marquée (incorporation de radio-isotopes, par "étiquetage" de la molécule avec un fluorophore ) et dénaturée.
La température d'hybridation soit ~65°C.
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4- LAVAGES
la sonde en excès est éliminée de la membrane par une série lavages.
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5- AUTORADIOGRAPHIE
L'hybridation est visualisée sur un film autoradiographique.
Après développement, il y aura les taches foncées sur le film partout où la sonde liée.
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5- AUTORADIOGRAPHIE
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Schéma général de la technique
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UTILISATIONS DU SOUTHERN BLOT
Identification des mutation, délétions, et réarrangements des gènes.
Prévision de certains cancers. Diagnostic de HIV-1 et des maladies
infectieuses Tests paternité et en médecine légale.
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RÉFÉRENCES
http://www.univ-rouen.fr/ABISS/L1/WEB/empreinte/southernblot.html
http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/BGbioch/POLY.Chp.9.9.html
http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio_g.swf::Southern%20Blot
Biochimie génétique, biologie moléculaireBiochimie génétique, biologie moléculaire
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Merci pour votre attention