size exclusion chromatography: เทคนิคแห …เคร องม อน ว า gel...

98 Naresuan University Journal 2010; 18(3)

Size Exclusion Chromatography: เทคนคแหงการวเคราะห นาหนกโมเลกลของพอลเมอร

เตมสร หวงทวทรพย *

Size Exclusion Chromatography: A technique of molecular weight determination of polymer

Temsiri Wangtaveesab *

ศนยเทคโนโลยโลหะและวสดแหงชาต จ.ปทมธาน 12120 National Metal and Materials Technology Center (MTEC), Pathumthani 12120, Thailand *Corresponding Author. E-mail address: [email protected] Received 16 November 2009; accepted 2 March 2011

บทคดยอ Size Exclusion Chromatography (SEC) เปนเทคนคทรจกกนดวามความสามารถในการวเคราะหนาหนกโมเลกลเฉลยและคาการกระจายตว

ของนาหนกโมเลกลของพอลเมอรทามกลางเทคนคอนทมอยดวยกนหลายวธ ระบบ SEC ในยคเรมตนมสวนตรวจวดหรอดเทคเตอรเปนแบบ ชนดไวตอการเปลยนแปลงความเขมขน ไดแก รแฟลกทฟ อนเดกซ ดเทคเตอร และอลตราไวโอเลต ดเทคเตอร เปนตน ดเทคเตอรประเภทน สามารถตรวจจบโมเลกลของพอลเมอรทไหลออกมาจากคอลมนตามปรมาตรเชงไฮโดรไดนามกของพอลเมอรนนๆ กลาวคอไมสามารถตรวจวด นาหนกโมเลกลออกมาไดโดยตรง จงตองเปรยบเทยบนาหนกโมเลกลกบสารมาตรฐานททราบคานาหนกโมเลกลแนนอน นาหนกโมเลกลทวเคราะห ไดจงเปนนาหนกโมเลกลแบบสมพทธ ในภายหลงมการนาเอาดเทคเตอรทไวตอการเปลยนแปลงนาหนกโมเลกล ไดแก เครองวดการกระเจงแสงหรอ วสโคมเตอร มาตอเขากบระบบ SEC แบบเดม จงทาใหระบบ SEC พฒนาขนจากเดมและสามารถวเคราะหนาหนกโมเลกลทแทจรงไดในทสด ระบบ SEC ในปจจบนจงมบทบาทในงานวจยอยางแพรหลายทงในวงการอตสาหกรรมและแวดวงการศกษา บทความนกลาวถงเรองราวของเทคนค SEC ตงแตประวตความเปนมา หลกการของเทคนค รวมไปถงการพฒนาระบบดเทคเตอร

คาสาคญ: ไซสเอกซคลชนโครมาโตกราฟ นาหนกโมเลกล ดเทคเตอร

Abstract Among various molecular weight determination techniques, Size Exclusion Chromatography (SEC) is well-known as a most

versatile technique for acquiring both molecular weight average and the molecular weight distribution (MWD) of polymer. At the beginning, a concentration-sensitive detector, typically refractive index (RI) or ultraviolet (UV), was widely employed in SEC system. These detectors detect polymer molecules eluting out of column according to their hydrodynamic volume and require a calibration with a number of known molecular weight standards to obtain a relative molecular weight. Later on, a molecular weight- sensitive detector; light scattering or viscometer, was developed to combine with the conventional detection system and that enabled SEC technique to determine an absolute molecular weight. The development of detection system has driven the SEC technique nowadays as a common tool for polymer research within industry and academia. This paper will give an overview of SEC technique, including history, principle of the technique and detector development.

Keywords: Size Exclusion Chromatography, molecular weigh, detector

บทนา

Size Exclusion Chromatography (SEC) หรอทรจก กนในกลมนกพอลเมอรในชอ GPC เปนหนงในวธทาง โครมาโตกราฟสาหรบใชวเคราะหนาหนกโมเลกลเฉลย (average-molecular weight) และคาการกระจายตวของ นาหนกโมเลกล (molecular weight distribution) ของ พอลเมอรหรอสารโมเลกลใหญ (macromolecules) ทาม กลางเทคนคในการวเคราะหคาเฉลยของนาหนกโมเลกล ทมอยดวยกนหลายวธ ไดแก การวเคราะหหมฟงกชนท ปลายโซ (end-group analysis) การเหวยงดวยความเรวสง (ultra-centrifugation) การวดการกระเจงของแสง (light

scattering) และการวดความหนดของสารละลายทความ เขมขนตา (dilute solution viscometry) เปนตน นบวา SEC เปนเทคนคทไดรบความนยมอยางแพรหลายสงสด เพราะนอกจากสามารถใหขอมลทางดานนาหนกโมเลกล แลวยงใหขอมลทางดานการกระจายตวของนาหนกโมเลกล ซงเปนปจจยสาคญอยางยงในขนตอนการผลตผลตภณฑ รวมไปถงการพฒนาสมบตของพอลเมอรใหตรงตามความ ตองการ นอกจากน ยงมความสามารถในการวเคราะหตว อยางไดอยางสะดวกและรวดเรวกวาเทคนคอนๆ ดงกลาว มาขางตน ซงลวนแลวแตตองใชเวลาในการวเคราะหยาว นาน มขอจากดในการวเคราะห หรอไมกมวธการยงยาก ดวยขอดเหลานทาใหเทคนค SEC ยงคงไดรบความนยมมา

Naresuan University Journal 2010; 18(3) 99

ถงปจจบนและกลายมามบทบาทแทนท เทคนคในการ วเคราะหนาหนกโมเลกลอนๆ ทนบวนจะลดบทบาทลงไป ทกท

ประวตความเปนมา

เดมเทคนค SEC เปนเทคนคท ใช ในการแยกสาร สาหรบกลมพอลเมอรทางชวภาพ จนกระทงในชวงกลาง ทศวรรษ 1950 เลทและรทเวน (Lathe & Ruthven, 1955; Lathe & Ruthven, 1956) ไดพฒนาคอลมนททา จากแปงขาวโพดขนมาสาหรบประยกตใชในการวเคราะห นาหนกโมเลกลของโปรตนขนเปนครงแรก แตยงไม สามารถวเคราะหนาหนกโมเลกลไดสงมากนก ตอมาในป ค.ศ.1959 โพราทและฟลอดน (Porath & Flodin, 1959) ผลตคอลมนซ งทาจากเจลพอลเดกซแทรน สาหรบใช วเคราะหตวอยางในกลมโปรตนและพอลเมอรทละลายนาได และมการจดจาหนายภายใตชอ “เซฟาเดกซ (Sephadex )” ซ งนบเปนครงแรกท มการจาหนายคอลมนทางการคา คอลมนนไดรบความนยมในหมนกวทยาศาสตรทางชวภาพ เปนอนมาก จนถงกบตงชอเรยกเปนเทคนคใหมวา Gel Filtration Chromatography (GFC) หลงจากนนในป ค.ศ.1964 จอหน มวร (Moore, 1964) นกวจยของบรษท Dow Chemical ผลตคอลมนสไตราเจล (Styragel ) จาก คลอสลงคพอลสไตรน (crosslinked polystyrene) สาหรบ วเคราะหตวอยางทละลายในตวทาละลายอนทรย และยง เปนคอลมนแรกทสามารถวเคราะหนาหนกโมเลกลของ ตวอยางไดสงถงชวงหลายลานดาลตน พรอมกนนนมวรได รวมมอกบนกวจยอกหลายทานพฒนาอปกรณตรวจวดนาหนก โมเลกลเครองแรกขนมาอยางเปนระบบ ประกอบดวย สวนปม สวนควบคมความรอนของคอลมน และสวนตรวจ วดชนดรแฟลกทฟ อนเดกซ ทาใหเวลาทใชในการวเคราะห นาหนกโมเลกลลดลงเหลอเพยง 1.5 ชม. จากเดมทเทคนค อนตองใชเวลานานถง 3-4 สปดาห พวกเขาไดตงชอเรยก เครองมอนวา Gel Permeation Chromatography (GPC) ตอมาในปทศวรรษ 1970 เทคนค SEC เรมเปนทรจกและ ยอมรบกนในวงการวทยาศาสตรวาเปนเทคนคนองใหมท สะดวกและรวดเรวในการวเคราะหนาหนกโมเลกลของพอลเมอร และโดยเฉพาะคาการกระจายตวของนาหนกโมเลกล ซง เปนคาทหาวธวเคราะหไดยากในสมยนน (Bly, 1970)

ท กลาวมาขางตน คอจดเร มตนของการว เคราะห นาหนกโมเลกลดวยเทคนค SEC และยงเปนทมาของชอ เทคนคในปจจบนทมหลายชอดวยกน GFC จะนยมเรยกกน ในการวเคราะหตวอยางทละลายไดในระบบนา (aqueous solvent) สาหรบชอ GPC นยมใชเรยกกนในกลมการ วเคราะหตวอยางทละลายในตวทาละลายอนทรย (organic solvent) สวนชอ SEC เปนชอทถกตงขนในภายหลงเพอให สอดคลองกบหลกการทางเทคนค ซงจะขอใช SEC แทน ชอเทคนคโดยรวมในบทความตอไป หลกการโดยทวไปของเทคนค SEC

ประกอบดวยการแยกโมเลกลของสารละลายตวอยาง

พอลเมอรทอาจมองคประกอบของสารทมนาหนกโมเลกล หลายชวงผสมกนอย เมอสารละลายตวอยางถกฉดเขาไปใน กระแสของตวทาละลาย โมเลกลของสารละลายจะเคลอนท เขาไปในคอลมนซงบรรจอนภาคขนาดเลกทมรพรน (โดย ทวไปประมาณ 5-10 m) องคประกอบทมขนาดโมเลกล ใหญกวาขนาดของรพรนจะไมสามารถแทรกตวเขาไปในร ได จงออกมาจากคอลมนเรวสด ในขณะทองคประกอบซง มโมเลกลขนาดกลาง อาจมบางสวนผานเขาไปในรได จง ไหลออกจากคอลมนตามมา สาหรบสารทมขนาดโมเลกล เลกมาก เชน มอนอเมอร (monomer) จะสามารถผานเขา ไปในรไดจงใชเวลาอยในคอลมนนานทสดและออกมาจาก คอลมนทหลงสด (รปท 1) จะเหนไดวาหลกการแยกสารน เกดขนภายใตความสมพนธระหวางขนาดของโมเลกลในตว ทาละลายหรอปรมาตรเชงไฮโดรไดนามก (hydrodynamic volume) กบเวลาทโมเลกลใชเคลอนทในคอลมน ซงจาก กลไกการแยกสารตามขนาดดงกลาวนเองททาใหเทคนค SEC สามารถหาคาการกระจายตวของพอลเมอรได

µ

รปท 1 แสดงหลกการแยกสารตามขนาดโมเลกล ภายในคอลมนของเทคนค SEC (ปรบปรงภาพจาก www.sci.sdsu.edu)

สวนประกอบหลกของเทคนค SEC สามารถแบงออกไดเปน 2 สวนหลก ประกอบดวย

สวนแยกสารและสวนวเคราะหสาร

รปท 2 องคประกอบโดยทวไปของเครอง SEC


สวนแยกสาร สวนแยกสารของระบบ SEC (รปท 2) มความคลาย

คลงกบระบบแยกสารของเทคนค HPLC ทวไปแตกตาง กนเฉพาะสวนของคอลมนเทานน กลาวคอ ประกอบดวย ปมซงทาหนาทดดตวทาละลายหรอทเรยกวา “เฟสเคลอนท (mobile phase)” จากภาชนะบรรจ และสงผานเขาไปท คอลมน โดยปมจะทาหนาทควบคมอตราการไหลใหม ความสมาเสมอเพอความแมนยาในการวเคราะหผล สาร ละลายตวอยางจะถกฉดตรงบรเวณสวนฉดสารตวอยาง และสงตอไปยงคอลมน หรอเฟสคงท (stationary phase) โดยกระแสของตวทาละลาย เมอเกดการแยกขนภายใน คอลมน โมเลกลของสารตวอยางจะถกสงตอไปยงสวน วเคราะหผลทประกอบดวยดเทคเตอรอยางนอย 1 ชนด เพอประมวลผลตอไป

งานวจยและพฒนาในชวงแรกของเทคนค SEC หลง จากเรมเปนทไดรบความนยมจนมการผลตเครองมอขาย อยางเปนทางการคา จะเกยวของกบสวนแยกสารนเสยเปน สวนใหญ (Buytenhuys & Van Der Maeden, 1978; Hirayama et al., 1987; Hjert n & Eriksson, 1984; Kirkland, 1976; Yau et al., 1978) งานวจยเหลานมง เนนไปทการพฒนาประสทธภาพของการแยกและพฒนา คอลมนใหสามารถวเคราะหพอลเมอรไดหลากหลายชนด มากขน จวบจนกระทง 2-3 ทศวรรษใหหลงมานทศทาง ของงานวจยหนเหมายงสวนวเคราะหผล เพราะความตอง การในดานความถกตองแมนยาของผลการวเคราะหนาหนก โมเลกลมมากขน

สวนวเคราะหสารหรอดเทคเตอร หล งจากสารเ ก ดการแยกและไหลผ านออกจาก

คอลมนแลว ดเทคเตอรจะทาหนาทตรวจจบสารทไหล ออกมา ในปจจบนมดเทคเตอรอยดวยกนหลายชนด โดย สามารถแบงออกเปน 2 ประเภทคอ ดเทคเตอรชนดไวตอ การเปลยนแปลงความเขมขน (concentration-sensitive detector) และชนดไวตอการเปลยนแปลงนาหนกโมเลกล (molecular weight-sensitive detector) ดเทคเตอร

ดเทคเตอรชนดไวตอการเปลยนแปลงความเขมขน เปนดเทคเตอร ทใช กนในยคแรกของ SEC ไดแก

รแฟลกทฟ อนเดกซ ดเทคเตอร (refractive index detector , RI) และอลตราไวโอเลต ดเทคเตอร (ultra-violet detector, UV) เปนตน ดเทคเตอรประเภทนทาหนาท เพยงตรวจจบสารทไหลออกจากคอลมนเทานน กลาวคอ ไมสามารถวเคราะหนาหนกโมเลกลออกมาไดโดยตรง ดงนน จงตองมการเปรยบเทยบนาหนกโมเลกลของสาร ตวอยางกบสารมาตรฐานททราบคานาหนกโมเลกลแนนอน (calibration)

รแฟลกทฟ อนเดกซ ดเทคเตอร (RI) เรยกอกชอหนงวา รแฟลกโตมเตอร (refractometer)

เปนอปกรณสาหรบตรวจวดการหกเหของแสงเมอแสงเคลอน ทผานตวกลางหนงไปสอกตวกลางหนง ดงนนจงอาศยการ วดความแตกตางของคาดชนหกเหของแสงระหวางสารละลาย

é

พอลเมอรกบตวทาละลายในการตรวจวดสารละลายตวอยาง ทไหลออกมาจากคอลมน หลกการทางานของดเทคเตอร ชนดน ขนอยกบความเขมขนของสารละลาย จงทาใหเปน ดเทคเตอรทไวตอการเปลยนแปลงความเขมขน ดเทคเตอร ประเภทนมขอด คอ สามารถใหสญญาณตอบรบไดกบ ตวอยางพอลเมอรแทบทกชนด มความแมนยา และงายตอ การใชงานจงเปนดเทคเตอรทนยมใชกบระบบ SEC มาก ทสด

อลตราไวโอเลต ดเทคเตอร (UV) ดเทคเตอรประเภทนวดคาการดดกลนแสงยวของสาร

ทไหลออกมาจากคอลมน ดงนนจงอาศยการตรวจวดการ เปลยนแปลงการดดกลนแสงยวของสารตวอยาง โดยคา การดดกลนแสงของสารละลายจะแปรผนตรงกบความเขม ขนตามกฎของเบยรและแลมเบรต (Beer and Lambert’s law) ดงสมการ 1) จงทาใหเปนดเทคเตอรทไวตอการ เปลยนแปลงความเขมขน

A = abc ...1) เมอ A = คาการดดกลนแสงของสาร

a = แอบซอรพตวต (absorptivity) หรอคาคงทของ การดดกลนแสงของสาร

b = ระยะทางทแสงสองผานสารตวอยาง c = ความเขมขน

ดเทคเตอรประเภทนมขอด คอมความไว (sensitivity) สงในการวเคราะห แตกมขอจากดคอจะสามารถตรวจวด ไดกบสารทมโครงสรางโมเลกลทสามารถดดกลนแสงยว ไดเทานน

ความถกตองในการวเคราะหผลของดเทคเตอร ท ง สองชนดน ขนอยกบการเลอกใชสารมาตรฐานใหมโครง สรางโมเลกลเหมอนหรอคลายกนกบสารตวอยางมากทสด เนองจากกลไกการแยกสารภายในคอลมนขนอยกบขนาด ของโมเลกลในตวทาละลายไมใชนาหนกโมเลกล โดยทวไป สายโซพอลเมอร ทละลายอย ในตวทาละลายจะมขนาด โมเลกลเฉพาะตามแตชนดของพอลเมอรในตวทาละลาย ใดๆ นนหมายความวาแมจะเปนพอลเมอรชนดเดยวกน แต ถาละลายในตวทาละลายตางชนดกอาจมขนาดโมเลกล แตกตางกน หรอกลาวอกนยหนง ถาเปนพอลเมอรคนละ ชนดกน ถงแมจะมนาหนกโมเลกลเทากนกอาจมขนาด โมเลกลแตกตางกนได ดงน นในการวเคราะหนาหนก โมเลกลจงจาเปนตองสรางกราฟความสมพนธระหวาง ปรมาตรเชงไฮโดรไดนามกกบนาหนกโมเลกล หรอทเรยก วา คอนเวนชนนอล คาลเบรชน (conventional calibration) โดยใชสารมาตรฐานททราบคานาหนกโมเลกลทแนนอน และใชกราฟนในการเปรยบเทยบหานาหนกโมเลกลของ สารทตองการวเคราะห ดงนนนาหนกโมเลกลทวเคราะห ดวยวธนจงเปนนาหนกโมเลกลในเชงเปรยบเทยบไมใช นาหนกโมเลกลทแทจรง มหลายงานวจย (Christensen et al., 2001; Huang et al., 2004; Poch et al., 1998) แสดงการศกษาเปรยบเทยบนาหนกโมเลกลของพอลเมอร ทวดจากระบบ SEC นกบเทคนคในการวดนาหนกโมเลกล อน พบวา หากใชสารมาตรฐานทมโครงสรางโมเลกลแตก

é


ตางจากสารทตองการวเคราะห นาหนกโมเลกลทวเคราะห ไดจะคลาดเคลอนจากคาทแทจรง อาจตาหรอสงกวาขน อยกบปรมาตรเชงไฮโดรไดนามกของพอลเมอรนนๆ เมอ เทยบกบสารมาตรฐาน ด งน นในการรายงานผลการ วเคราะหตองอางองถงชนดของสารมาตรฐานทใชนาหนก โมเลกลทวเคราะหไดจงเปนแบบ “นาหนกโมเลกลสมพทธ (relative molecular weight)”

จากท กล าวมาข างต นจ งกลายเป นจ ดอ อนของ ดเทคเตอรประเภทน เนองจากสารมาตรฐานทขายกนอย ตามทองตลาดมเพยงไมกชนด จงไมครอบคลมตอการ วเคราะหพอลเมอรทกประเภทได จากขอจากดขางตน ดงกลาว จงมการพฒนาระบบดเทคเตอรขนมาในภายหลง โดยนาเอาเทคนคในการวเคราะหนาหนกโมเลกลอนๆ มา ประยกต เขากบระบบ SEC เดม ไดแก วสโคมเตอร (viscometer, VIS) และเครองวดการกระเจงของแสง (light scattering, LS) ซงดเทคเตอรทงสองชนดจดวาเปน ดเทคเตอร ชนดไวตอการเปลยนแปลงนาหนกโมเลกล และสามารถวเคราะหคานาหนกโมเลกลออกมาไดโดยตรง นาหนกโมเลกลทวเคราะหไดจงเปนนาหนกโมเลกลทแทจรง (absolute molecular weight)

ดเทคเตอรชนดไวตอการเปลยนแปลงนาหนกโมเลกล วสโคมเตอร (VIS) บนอยส และคณะ (Grubisic et al., 1967) คนพบวา

V h α [η]M

η

การแยกสารของโมเลกลพอลเมอรภายในคอลมนขนอยกบ ปรมาตรเชงไฮโดรไดนามก (Vh) ของพอลเมอรทละลาย อยในตวทาละลายใดๆ ซงปรมาตรเชงไฮโดรไดนามกม ความสมพนธกบความหนดแทจรง (intrinsic viscosity, [ ]) และนาหนกโมเลกลตามสมการความหนดของสาร ละลายของไอนสไตน (Einstein’s viscosity equation) ดง สมการท 2) (Young & Lovell, 1991)

...2)

จากการคนพบดงกล าวพวกเขาจงลองสรางกราฟ มาตรฐานระหวาง log [ ]M กบเวลาทสารถกชะออก จากคอลมน ซงพบวาพอลเมอรทมโครงสรางโมเลกลตาง กนลวนอยบนเสนกราฟเดยวกน (รปท 3) กราฟนจงได ชอวา ยนเวอรซอล คาลเบรชน (Universal calibration) จากความสมพนธดงกลาวทาใหการวเคราะหนาหนกโมเลกล ดวยวธน สามารถตดปญหาเรองขนาดหรอปรมาตรเชง ไฮโดรไดนามกทไมเทากนของพอลเมอรตางชนดในตวทา ละลายใดๆ ลงได นาหนกโมเลกลทวเคราะหไดจงเปน นาหนกโมเลกลทแทจรง อยางไรกตาม ระบบนยงคงตอง ใชรวมกบรแฟลกทฟ อนเดกซ ดเทคเตอร และตองใชสาร มาตรฐานททราบนาหนกโมเลกลในการสรางยนเวอรซอล คาลเบรชน (universal calibration) เพอการวเคราะหผล

รปท 3 กราฟมาตรฐานยนเวอรซอล (ทมา: Wu, 1995)

นอกจากน ความหนดแทจรงยงมความสมพนธกบ น าหน กโมเลกลด งสมการของมารค-ฮ วค (Mark- Houwick) ดงสมการท 3) (Sperling, 1992)

...3) เมอ K และ a คอคาสมประสทธของฮวค (Mark-Houwink constants) ซงขนอยกบชนดของพอลเมอร ตวทาละลาย และอณหภม

จากสมการ 3) สามารถทานายคอนฟอรเมชนของ โมเลกลพอลเมอรหรอรปแบบการจดเรยงของสายโซพอลเมอร ในตวทาละลายใดๆ (polymer chain conformation) โดย ดไดจากคา a ถาคา a อยระหวาง 0.5-0.8 แสดงวา

[η] = KM a

พอลเมอรนนมการจดเรยงตวของโมเลกลเปนแบบ random coil และถาคา a เขาใกล 0, 1 และ 2 แสดงวาพอลเมอร นนมคอนฟอรเมชนเปนแบบ hard sphere, semicoil และ rigid rod ตามลาดบ และยงสามารถใชศกษาอนตรกรยา ทเกดขนระหวางพอลเมอรกบตวทาละลาย (polymer- solvent interaction) เชน ถาคา a เขาใกล 0.8 แสดงวา พอล เมอรละลายอย ในตวทาละลายทด ทาใหสายโซ พอลเมอรแผขยายตวอยในตวทาละลายนน

นอกจากน วสโคมเตอรยงสามารถใหขอมลทางดาน รศมไฮโดรไดนามก (hydrodynamic radius, R h ) ปรมาณ โซ กง และสามารถทานายโครงสราง (structure) ของ

η


พอลเมอรวามโครงสรางเปนแบบเสนตรง (linear) หรอโซ กง (branch) ไดอกดวย

เครองวดการกระเจงของแสง (LS) เดมเปนเทคนคทอาศยขอมลของการกระเจงแสงจาก

สารละลายพอลเมอร ในการวเคราะหนาหนกโมเลกลทแท จรงของพอลเมอรมากอนหนาทเทคนค SEC จะถอกาเนด ขน นอกจากนยงเปนเทคนคทสามารถใหขอมลทางดาน การเกดอนตรกรยา (interaction) ระหวางพอลเมอรกบตว ทาละลายและคารศมไจเรชน (radius of gyration) ของ โมเลกลพอลเมอรในตวทาละลายไดอกดวย แตเนองจาก เปนเทคนคทมความยงยากในวธการวเคราะห เพราะจะ ตองเตรยมตวอยางหลายความเขมขน และตวอยางจะตอง สะอาดปราศจากอนภาคของสารปนเปอน จงทาใหเทคนค นไมไดรบความนยมในการตรวจวดนาหนกโมเลกลแบบ ลกษณะงานประจาเทาใดนก จนกระทงในชวงทศวรรษ 1970 (Wu, 1995) จงเรมมการนาเอาเทคนควดการ กระเจงแสงมาใชเปนดเทคเตอรรวมกบระบบ SEC-RI การรวมกนของทงสองเทคนคชวยทาใหขอจากดของทงสอง เทคนคหมดไป กลาวคอเทคนค SEC สามารถวเคราะห นาหนกโมเลกลไดโดยไมจาเปนตองใชสารมาตรฐานในการ เปรยบเทยบ ในขณะเดยวกนกชวยลดขนตอนการเตรยม ตวอยางและเวลาทใชในการวเคราะหของเทคนควดการ กระเจงแสงแบบเดมลงเพราะสารละลายตวอยางทผาน ออกจากคอลมน จะถกตรวจวดความเขมขนของสารละลาย ณ เวลาหรอปรมาตรใดๆ ตลอดชวงของการวเคราะหโดย RI ดเทคเตอร ขอมลทไดจงเปรยบเสมอนกบการเตรยมตว อยางหลายๆ ความเขมขนนนเอง ทฤษฎและหลกการของ SEC-LS

การวเคราะหนาหนกโมเลกลโดยการใชเครองวดการ กระเจงของแสงเปนดเทคเตอร จะอาศยการวดความเขม แสงทกระเจงออกจากสารละลายพอลเมอร เพ อหาคา Rayleigh scattering factor (R ) ณ มมทแสงเกดการ กระเจง ณ ปรมาตรใดๆ ทสารละลายถกชะออกมาจาก คอลมน ซงมความสมพนธกบนาหนกโมเลกลเฉลยดง สมการท 4) (Young & Lovell, 1991)

...4)

โดยท

และ เมอ K คอ คาคงทเชงแสง (optical constant) ซงจะม

คาคงทสาหรบตวทาละลายพอลเมอร และความยาว คลนของแสงชนดหนงๆ

C คอ ความเขมขน ณ ปรมาตรใดๆ ของสารละลาย ทถกชะออกมา (เปนคาทไดจากดเทคเตอรชนด ไวตอความเขมขน ไดแก รแฟลกทฟ อนเดกซ ดเทคเตอร เปนตน) คอ มมใดๆ ทแสงเกดการกระเจง

A 2 คอ virial coefficient อนดบท 2 เปนคาทบอก

θ

KC R θ

= 1 M w P(θ)

+ 2A 2 C + ...

K = 2π 2 n 0 2 (dn/dc) 2 /N A λ 4

R θ = k (I θ /I 0 )

1/P(θ) = 1+(16π 2 n 0 2 sin 2 (θ/2)/3λ 2 )<s 2 >

θ

อนตรกรยาระหวางพอลเมอรและตวทาละลาย P( ) คอ คา particle scattering factor แสดง

พฤตกรรมการกระเจงแสงของตวอยาง เมอมมของ การกระเจงเทากบ 0 องศา คานจะเขาใกล 1 เนอง จากไมเกดการแทรกสอด (interference) ของแสง ทกระเจงออกมาจากพอลเมอรโมเลกลเดยวกน

M w คอ นาหนกโมเลกล ณ ปรมาตรใดๆ ของสารละลาย พอลเมอรทถกชะออกมา

n 0 คอ คาการหกเหแสงของตวกลางหรอตวทาละลาย ทใชละลายพอลเมอร

dn/dc คอ คาการเปลยนแปลงของดชนการหกเหของ แสงตอความเขมขน

N A คอ เลขอโวกาโดร (6.023X10 23 ) คอ ความยาวคลนของแสงเลเซอร ซงวดในระบบ สญญากาศ

k คอ คาคงทของเครองมอวเคราะห I คอ ความเขมแสงทกระเจงออกจากสารละลาย

พอลเมอรทมมใด ๆ I 0 คอ ความเขมแสงของเลเซอร <s 2 > คอ คาเฉลยความเบยงเบนกาลงสองของรศม

ไจเรชนของอนภาค โดยท วไปการเตรยมสารละลายต วอย างสาหรบ

วเคราะหดวยเทคนค SEC จะใชความเขมขนเจอจางมาก และเมอความเขมขนของสารละลายเขาใกล 0 พจน 2A 2 C จงสามารถละทงได ดงสมการ 5)

...5)

θ

λ

θ

KC R θ

= 1 M w P(θ)

รปท 4 แสดงผลของความแตกตางของขนาดโมเลกลทมตอ ความเขมของแสงกระเจงทมมตางๆ (ทมา: Young & Lovell, 1991)

จากรปท 4 ความเขมแสงทกระเจงจะขนกบขนาด โมเลกล สาหรบสารโมเลกลเลก แสงทกระเจงออกจาก โมเลกลเดยวกนจะไมเกดปรากฏการณการแทรกสอด P( ) จงเทากบ 1 เสมอไมวาจะวดทมมใดๆ แตสาหรบ พอลเมอรซงเปนสารโมเลกลใหญ ความเขมแสงทกระเจง จากมมตางๆ มคาไมเทากน เนองจากอาจเกดการแทรก สอดของแสงทกระเจงออกมาจากพอลเมอรโมเลกลเดยว กน อยางไรกตาม เมอมมของการกระเจงแสงเขาใกลศนย ( 0) เทอม P( ) จะเทากบ 1 ซง ณ มม 0 องศานจะไม

θ

θ→ θ


เกดการแทรกสอดของแสงทกระเจงออกมาจากโมเลกล เดยวกน ดงนน หากวดคาความเขมแสงของสารละลาย พอลเมอรเจอจางทมมเขาใกล 0 จะสามารถหาคานาหนก โมเลกลไดดงสมการ 6)

...6)

แตเน องจากในทางปฏบตไมสามารถวดความเขม แสงทกระเจงจากมมเขาใกล 0 ได เพราะเปนมมเดยวกบ แสงจากแหลงกาเนด ความเขมของแสงจะแรงมากจน สามารถทาลายโฟโตไดโอดได จงมความพยายามคดคน เทคนคตางๆ จนพฒนามาเปนดเทคเตอรชนดวดการ กระเจงแสงหลายชนดไดแก

ด เทคเตอร ชนดวดการกระเจงแสงแบบหลายมม (multi angle laser light scattering, MALLS)

0 c

KC = 1 M w

R 0

รปท 5 แสดงการวเคราะหนาหนกโมเลกลโดยการทา Zimm plot ซงจดทบแทนคาทไดจากการทดลอง จดโปรงแทนคาท ไดจากการ extrapolate (ทมา: Young & Lovell, 1991)

จดทมความเขมขนและมมเทากบ 0 จะสามารถหาคา นาหนกโมเลกลไดจากจดตดแกน y (รปท 5) เรยกวธการ น วา “ซมมพลอต (zimm plot)” และจากกราฟน ยง สามารถหาคารศมไจเรชน (R g ) ไดจากความชนของเสน กราฟความเขมขนของสารละลายเทากบศนย และคา A 2 ไดจากความชนของเสนกราฟของมมท 0 องศา (Zimm, 1948)

ดเทคเตอรชนดวดการกระเจงแสงทมมตา (low angle laser light scattering, LALLS)

เปนดเทคเตอรทวดการกระเจงแสงเพยงมมเดยว โดย อาศยมลเหตขางตนทวาไมสามารถวดความเขมแสงกระเจง ทมม 0 องศา เนองจากความเขมแสงจะแรงมากจนสามารถ ทาลายโฟโตไดโอดได ดงนนจงมผผลตบางรายออกแบบ ดเทคเตอรใหสามารถตรวจวดความเขมแสงทมมตาในชวงมม 3-7 องศา ซง ณ มมดงกลาว คา P( ) จะเขาใกล 1 อยาง ไรกตามดเทคเตอรชนดนมขอจากดคอไมสามารถวดคา R g ได เพราะ R g เปนคาทไดจากขอมลของการวดหลายๆ มม

ด เทคเตอรชนดวดการกระเจงแสงทมม 90 o (right angle laser light scattering, RALLS)

ใชการวางโฟโตไดโอดในมม 90 o ซงเปนมมทมสญญาณ รบกวนเนองจากอนภาคฝนและอนๆ นอยทสดหลกการ นใชไดดกบการวดสารโมเลกลขนาดเลก (small molecule dimension) ทมขนาดนอยกวา 10 นาโนเมตร เนองจาก ความเขมของแสงจะกระเจงเทากนในทกๆ มม ดเทคเตอร ชนดนมขอจากดเหมอนกบ LALLS คอ ใหขอมลเฉพาะ นาหนกโมเลกล แตไมสามารถใหขอมลของ R g ได

ดเทคเตอรชนดวดการกระเจงแสงสองมม (two-angle laser light scattering, TALLS)

เปนดเทคเตอรทใชขอมลจากการวดมม 2 มม ซงอาจ เปนการนาดเทคเตอรชนด LALLS มาตอรวมเขากบ RALLS (หรอบางผผลตอาจใชมม 15 o และ 90 o ) ทาให ผลตรวจวดมความแมนยามากขน และจากการรวมขอมล จาก 2 มม ทาใหดเทคเตอรชนดนสามารถวดคา R g ได

อาศยการสรางกราฟความสมพนธระหวาง KC/R กบ (ตามสมการ 4) แลววดความเขมของแสงกระเจงของ

สารละลายพอลเมอรเจอจางหลายความเขมขน ทมมตางๆ จากนนประมาณคาความเขมแสงออกนอกชวงกราฟไปยง

θ θ

θ

ตารางท 1 แสดงขอมลเปรยบเทยบของดเทคเตอรชนดการกระเจงแสงทง 4 ชนด

หมายเหต. * คอ สามารถวเคราะหได

พารามเตอร LALLS MALLS RALLS TALLS มมในการวเคราะห มมเดยว

(ระหวางมม 3-7 o ) หลายมม มมเดยว

(มม 90 o ) สองมม

(มม 3-7 o กบ 90 o

และมม 15 o กบ 90 o ) นาหนกโมเลกล * * * * 2 nd virial coefficient (A 2 ) * * * * รศมไจเรชน (R g ) * * บรษทผผลต Viscotek Corp. Brookhaven

Instruments Corp. Wyatt Technology Corp.

Viscotek Corp. Precision Detectors,Inc. Viscotek Corp.

เอกสารอางอง 1. Christensen et al., 2001 2. Dayal & Mehta, 1994 3. Takagi, 1990 4. Wittgren & Porsch, 2002 5. Wu, 1995 6. Wyatt, 1993

1. Christensen et al., 2001 2. Dayal & Mehta, 1994 3. Wittgren & Porsch, 2002 4. Wu, 1995 5. Wyatt, 1993

1. Christensen et al., 2001

2. Wu, 1995

1. Mourey & Coll, 2003

2. Wu, 1995


จากทกลาวมาทงสน สามารถสรปภาพรวมเปรยบเทยบ ความแตกตางของดเทคเตอรชนดไวตอการเปลยนแปลง

ความเขมขนและดเทคเตอรชนดไวตอการเปลยนแปลง นาหนกโมเลกลไดดงตารางท 2

ตารางท 2 แสดงการเปรยบเทยบดเทคเตอรชนดไวตอการเปลยนแปลงความเขมขนและนาหนกโมเลกล

ตวแปร ดเทคเตอรชนดไวตอ การเปลยนแปลงความเขมขน

ดเทคเตอรชนดไวตอ การเปลยนแปลงนาหนกโมเลกล

ดเทคเตอร รแฟลกทฟ อนเดกซ ดเทคเตอร (RI), อลตราไวโอเลต ดเทคเตอร (UV) เปนตน

วสโคมเตอร (VIS) และเครองวดการกระเจงของแสง (LS)

การเปรยบเทยบนาหนก โมเลกลกบสารมาตรฐาน

ตองการ ตองการ (สาหรบ VIS) ไมตองการ (สาหรบ LS)

นาหนกโมเลกลทวเคราะหได นาหนกโมเลกลแบบสมพทธ นาหนกโมเลกลทแทจรง

ระบบ SEC ในปจจบน หล งจากด เทคเตอร ชน ดไวต อการเปล ยนแปลง

นาหนกโมเลกลถกพฒนาขน ระบบ SEC ทใชกนอยใน ปจจบนจงมความหลากหลายขนอยกบชนดของดเทคเตอร ทตอเขากบระบบ ทพบเหนโดยทวไป ไดแก

ระบบ SEC ทตอเขากบดเทคเตอรชนดไวตอการ เปลยนแปลงความเขมขน ไดแก ระบบ SEC-RI และ SEC-UV

ระบบ SEC ทตอเขากบดเทคเตอรชนดไวตอการ เปลยนแปลงความเขมขนและนาหนกโมเลกล ไดแก ระบบ SEC-VIS-RI ระบบ SEC-LS-RI และระบบ SEC- VIS-LS-RI เปนตน

มงานวจยศกษาเปรยบเทยบความแมนยาของผลการ วเคราะหนาหนกโมเลกลทไดจากระบบ SEC หลายชนด

ดายลและเมหทา (Dayal & Mehta, 1994) ทาการ ทดลองเปรยบเทยบผลการวเคราะหนาหนกโมเลกลทได จากเครองวดการกระเจงแสงกบผลทไดจากระบบ SEC ท ตอเขากบดเทคเตอรชนดตางๆ ไดแก ระบบ SEC-RI ระบบ SEC-VIS-RI และระบบ SEC-LS-RI (ทงระบบ SEC-MALLS-RI และ SEC-LALLS-RI) โดยใช พอลสไตรนเปนสารตวอยาง ซงพบวา การวเคราะหดวย เทคนค SEC ใหผลแมนยาเทยบเทากบผลทไดจากเทคนค การกระเจงแสง โดยระบบ SEC ทใชดเทคเตอรชนดไวตอ การเปลยนแปลงนาหนกโมเลกลทงระบบ SEC-VIS-RI และระบบ SEC-LS-RI ใหผลการว เคราะหนาหนก โมเลกลทใกลเคยงกบคาทวดไดจากเครองวดการกระเจง แสงโดยตรง และเมอทาการศกษานาหนกโมเลกลของ พอลสไตรนดวยระบบ SEC-RI (โดยใชพอลสไตรนเปน สารมาตรฐาน) พบวาคานาหนกโมเลกลทไดมคาใกลเคยง กบระบบ SEC-VIS-RI และระบบ SEC-LS-RI แสดง ถงความแมนยาของขอมลจากการใชดเทคเตอรชนดไวตอ การเปลยนแปลงความเขมขน ซงยนยนไดวาหากใชสาร มาตรฐานเปนชนดเดยวกนกบสารตวอยาง คานาหนก โมเลกลทวเคราะหไดจะใกลเคยงกบคาทแทจรง และยง พบวาการใช LS ตางชนด ไดแก MALLS และ LALLS ของระบบ SEC-LS-RI ตางกใหคานาหนกโมเลกลทใกล เคยงกนอกดวย

•

•

แวน ดจกและสมธ (Van Dijk & Smit, 2000) ใช ระบบ SEC-MALLS-UV-RI ศกษาผลของความแรง ไอออน (ionic strength) ของตวทาละลายทมตอการ วเคราะหนาหนกโมเลกลของโปรตน โดยทวไปโมเลกลของ โปรตนเปนโมเลกลทมประจ ดงนนการปรบเปลยนพเอช (pH) และความแรงไอออนของตวทาละลาย จงมผลตอ ขนาดโมเลกลของโปรตนในตวทาละลาย มงานวจยกอน หนาน (Potschka, 1988; Wen et al., 1996) พบวา ความแรงไอออนของตวทาละลายมผลตอการวเคราะห นาหนกโมเลกลของโปรตนดวยระบบ SEC-RI/UV เพราะขนาดโมเลกลทแตกตางกนจะสงผลใหโมเลกลของ โปรตนไหลออกจากคอลมนชาหรอเรวกวาทควรจะเปน ซง ในงานวจยของดจกและสมธ พบวา การใชดเทคเตอรท สามารถวดนาหนกโมเลกลทแทจรง (MALLS) ทาให สามารถหลกเลยงปญหาดงกลาวได ดงจะเหนไดจากผล วเคราะหของการวดนาหนกโมเลกลของสารละลายโปรตน (เบตา-แลคโตโกลบลน) ทใกลเคยงกน แมวาจะวเคราะห ทสภาวะพเอชแตกตางกนคอ 5.2 และ 7.0 โดยพบวา นาหนกโมเลกลมคาเทากบ 39,300 800 และ 40,500

1,100 กรม/โมล ตามลาดบ นอกจากน พวกเขายงคน พบวาดเทคเตอรชนด MALLS มความสามารถในการ ตรวจจบการเกดการตกตะกอนของโปรตน ซงไมสามารถ ตรวจพบไดดวยอลตราไวโอเลตดเทคเตอร

คนลและคณะ (Chenal et al., 2009) ศกษาการ เปลยนแปลงคอนฟอรเมชนของพอลเปปไทด เมอมการ ตดแคลเซยมลงบนโมเลกลโดยใชระบบ SEC-VIS-LS- RI เปรยบเทยบกบ SEC-RI พบวา พอลเปปไทดทมการ ตดแคลเซยมลงบนโมเลกลมการเปลยนแปลงคอนฟอรเมชน ไปจากเดมทาใหปรมาตรเชงไฮโดรไดนามกของพอลเปปไทด ทมการตดแคลเซยม แตกตางจากพอลเปปไทดทไมได ตดแคลเซยม แตคานาหนกโมเลกลของตวอยางทงค ท วเคราะหดวยระบบ SEC-VIS-LS-RI ยงคงเทาเดม ซง เมอเทยบกบผลการวเคราะหดวยระบบ SEC-RI แลวพบ วา ปรมาตรเชงไฮโดรไดนามกทไมเทากนของทงสอง ตวอยางสงผลใหพคออกทเวลาตางกน โดยนาหนกโมเลกล เฉลยของตวอยางทตดและไมตดแคลเซยมเทากบ 73 และ 600 กโลดาลตน ตามลาดบ (ดงตารางท 3) จากผลการ

± ±


ทดลองของคนล และคณะ สามารถสรปไดวา ระบบ SEC ทตอเขากบดเทคเตอรชนดไวตอการเปลยนแปลงนาหนก โมเลกล มประสทธภาพในการศกษาการเปลยนแปลง คอนฟอรเมชนและปรมาตรเชงไฮโดรไดนามกของตวอยาง พอลเมอร ซงระบบ SEC-RI กลไกการแยกจะขนอยกบ

ปรมาตรเชงไฮโดรไดนามกเพยงอยางเดยว จงไมสามารถ แยกความแตกตางของการเปลยนแปลงคอนฟอรเมชนได ทาใหผลการวเคราะหนาหนกโมเลกลดวยระบบ SEC-RI อาจเกดความผดพลาดได

ตารางท 3 ผลการวเคราะหดวยเทคนค SEC จากงานวจยของคนล และคณะ พารามเตอร หนวย apo-RD 1 holo-RD 2

ปรมาตรทสารถกชะออกจากคอลมน มล. 10.4 13.8 คาการเปลยนแปลงของดชนการหกเหของแสงตอความเขมขน (dn/dc) ลบ.ซม./กรม 0.184 0.184 คาความหนดทแทจรง ([η]) เดซลตร/กรม 0.35 0.055 นาหนกโมเลกลเฉลย (ไดจากระบบ SEC-VIS-LS-RI) กก./โมล 73.6 73.2 นาหนกโมเลกลเฉลย (ไดจากระบบ SEC-RI) กก./โมล 600 73

หมายเหต. 1 คอ พอลเปปไทดทไมไดตดแคลเซยมลงบนโมเลกล 2 คอ พอลเปปไทดทมการตดแคลเซยมลงบนโมเลกล

ทมา: Chenal et al., 2009

จากตวอยางงานวจยขางตน ถงแมวา ดเทคเตอรชนดไว ตอการเปลยนแปลงความเขมขนจะมขอจากดในดานการ ศกษาคอนฟอรเมชน ซ งอาจมผลตอความถกตองของ นาหนกโมเลกล อกทงการวเคราะหนาหนกโมเลกลจะถก ตองคอมคาเขาใกลคาทแทจรงกตอเมอใชสารมาตรฐานเปน ชนดเดยวกนกบสารตวอยาง อยางไรกตาม ดเทคเตอร ชนดไวตอการเปลยนแปลงความเขมขนกมขอดในดาน สามารถวเคราะหผลไดงาย รวดเรว มความแมนยา และมวธ การไมยงยากในการวเคราะห และทสาคญเหตผลในดาน

ราคาทตากวาดเทคเตอรชนดไวตอการเปลยนแปลงนาหนก โมเลกลหลายเทาตว จงทาใหยงคงได รบความนยมใช วเคราะหนาหนกโมเลกลแบบสมพทธ กบงานประเภท ตรวจสอบคณภาพทตองวเคราะหเปนประจาและมปรมาณ มากๆ ดงนน การเลอกใชดเทคเตอรประเภทใดนนจงขน อย กบลกษณะขอมลทตองการวเคราะหเปนสาคญและ สามารถแสดงขอมลทไดจากดเทคเตอรชนดตางๆ เปรยบ เทยบกบการวเคราะหนาหนกโมเลกลดวยเครองวดการ กระเจงแสงและวสโคมเตอรดงตารางท 4

ตารางท 4 แสดงขดความสามารถของเทคนค SEC ทตอเขากบดเทคเตอรชนดตางๆ เปรยบเทยบกบเครองวดการกระเจงแสงและ วสโคมเตอร

ขอมล SEC-RI SEC-VIS-RI SEC-LS-RI SEC-VIS-LS-RI LS Viscometer • นาหนกโมเลกลเฉลย

โดยจานวน (M n ) * * * *

• นาหนกโมเลกลเฉลย โดยนาหนก (M w )

* * * * *

• นาหนกโมเลกลเฉลย โดยความหนด (M v )

* * *

•คาการกระจายนาห นก โมเลกล (MWD)

* * * *

•รศมไจเรชน (R g ) * * * •รศมไฮโดรไดนามก (R h ) * * * * •virial coefficient (A 2 ) * * * •การทานายโครงสร าง

จาก Mark-Houwink parameters (K and a)

* * *

•ความหนดแทจรง ([η]) * * * •การว เคราะห โซกง * * * • นาหนกโมเลกลแบบ

สมพทธ *

• นาหนกโมเลกลท แทจรง

* * * * *

เอกสารอางอง 1. Dayal & Mehta, 1994

2. Huang et al., 20 04

1. Dayal & Mehta, 19 94

2. Huang et al., 2004

1. Christensen et al., 2001 2. Day al & M ehta, 1994 3. Huang et al. , 2004 4. Laguna et al., 2001 5. Oliva et al., 2009

1. Beer et al., 1999 2. Coelho et al., 2006 3. Huang et al., 2004 4. Keary, 2001 5. Liu et al. , 20 06

1. Christensen et al., 2001

2. Wyatt, 1993

1 . Christensen et al., 2001

หมายเหต. * คอ สามารถวเคราะหได


บทสรป

เปนเวลากวา 5 ทศวรรษแลวทเทคนค SEC ยงคงไดรบ ความไววางใจในการวเคราะหนาหนกโมเลกลของพอลเมอร ซงปฏเสธไมไดวา เปนผลสบเนองมาจากการพฒนาอยาง ตอเนองของเทคนค SEC นนเอง เทคนค SEC-RI โดด เดนในแงของความสะดวกและรวดเรวในการวเคราะห อก ทงความสามารถในการหาคาการกระจายตวของนาหนก โมเลกล ซงสามารถวเคราะหไดอยางงายดายภายในเทคนค เดยว อยางไรกตาม SEC-RI ยงมขอดอยในดานไมสามารถ วเคราะหคานาหนกโมเลกลทแทจรงใหกบพอลเมอรทก ประเภทได ซ งต อมาในภายหล งมการพฒนาระบบ ดเทคเตอรชนดไวตอการเปลยนแปลงนาหนกโมเลกลขน ทาใหระบบ SEC สามารถวเคราะหนาหนกโมเลกลทแท จรงได และยงสามารถใหขอมลทางดานการจดเรยงตว ของสายโซพอลเมอรในตวทาละลายใดๆ รวมไปถงขอมล ของอนตรกรยาทเกดขนระหวางพอลเมอรกบตวทาละลาย ไดอกดวย ระบบ SEC ในปจจบนจงสามารถใหขอมลท มากไปกวานาหนกโมเลกล ซงผใชงานสามารถเลอกใช ดเทคเตอรใหเหมาะสมกบลกษณะงานหรอขอมลทตองการ

เอกสารอางอง

Beer, M. U., Wood, P. J., & Weisz, J. (1999). A simple and rapid method for evaluation of Mark- Houwink-Sakurada constants of linear random coil polysaccharides using molecular weight and intrinsic viscosity determined by high performance size exclusion chromatography: application to guar galactomannan. Carbohydrate Polymers, 39, 377-380.

Bly, D. (1970). Gel permeation chromatography. Science, 168, 527-533.

Buytenhuys, F. A., & Van Der Maeden, F. P. B. (1978). Gel permeation chromatography on unmodified silica using aqueous solvents. Journal of Chromatography A, 149, 489-500.

Christensen, B. E., Ulset, A. S., Beer, M. U., Knuckles , B. E., Williams, D. L., Fishman, M. L., et al. (2001). Macromolecular characterization of three barley -glucan standards by size-exc lusion chromatography combined with light scattering and viscometry: An inter-laboratory study. Carbohydrate Polymers, 45, 11-22.

Coelho, F. J., Gon alves, M. F. O., Miranda, D., & Gil, M. H. (2006). Characterization of suspension poly(vinyl chloride) resins and narrow polystyrene

β

Ç

standards by size exclusion chromatography with multiple detectors: Online right angle laser-light scattering and differential viscometric detectors. European Polymer Journal, 42, 751-763.

Dayal, U., & Mehta, S. K. (1994). Studies on molecular weight determination using refractive index and multi-angle laser light scattering detectors in size exclusion chromatography. Journal of Liquid Chromatography, 17, 303-316.

Grubisic, Z., Rempp, P., & Benoit, H. (1967). A universal calibration for gel permeation chromatography. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Letters, 5, 753-759.

Hirayama, C., Ihara, H., Shiba, M., Nakamura, M., Motozato, Y., & Kunitake, T. (1987). Macroporous glucomannan spheres for the size-exclusion separation of aqueous macromolecules. Journal of Chromatography A, 409, 175-181.

Hjert n, S., & Eriksson, K. (1984). High-performance molecular sieve chromatography of proteins on agarose columns: The relation between concentration and porosity of the gel. Analytical Biochemistry, 137, 313-317.

Huang, Y., Peng, H., Lam, W. Y., Xu, Z., Leung, S. M., Mays, W., et al. (2004). Linear or branched structure? Probing molecular architectures of fullerene- styrene copolymers by size exclusion chromatographs with online right-angle laser-light scattering and differential viscometric detectors. Polymer, 45, 4811- 4817.

Keary, C. M. (2001). Characterization of METHOCEL cellulose ethers by aqueous SEC with multiple detectors. Carbohydrate Polymers, 45, 293- 303.

Kirkland, J. J. (1976). Porous silica microspheres for high-performance size exclusion chromatography. Journal of Chromatography A, 125, 231-250.

Laguna, M. T. R., Medrano, R., Plana, M. P., & Tarazona, M. P. (2001). Polymer characterization by size-exclusion chromatography with multiple detection. Journal of Chromatography A, 919, 13- 19.

é


Lathe, G. H., & Ruthven, C. R. (1955). The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water. Biochemical Journal, 60, xxxiv.

Lathe, G. H., & Ruthven, C. R. (1956). The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water. Biochemical Journal, 62, 665-674.

Liu, X. M., Gao, W., Maziarz, E. P., Salamone, J. C. , Duex, J., & Xia, E. (2006). Detailed characterization of cationic hydroxyethylcellulose derivatives using aqueous size-exclusion chromatography with on-line triple detection. Journal of Chromatography A, 1104, 145-153.

Moore, J. C. (1964). Gel permeation chromatography. I. A new method for molecular weight distribution of high polymers. Journal of Polymer Science Part A, 2, 835-843.

Mourey, T. H., & Coll, H. (2003). Size-exclusion chromatography with two-angle laser light-scattering (SEC-TALLS) of high molecular weight and branched polymers. Journal of Applied Polymer Science, 56, 65- 72.

Oliva, A., Llabr s, M., & Fari a, J. B. (2009). Estimation of uncertainty in size-exc lusion chromatography with a double detection system (light- scattering and refractive index). Talanta, 78, 781- 789.

Poch , D. S., Ribes, AI. J., & Tipton, D. L. (1998). Characterization of Methocel TM : Correlation of static light-scattering data to GPC molar mass data based on pullulan standards. Journal of Applied Polymer Science, 70, 2197-2210.

Porath, J., & Flodin, P. (1959). Gel filtration: A method for desalting and group separation. Nature, 183, 1657-1659.

Potschka, M. (1988). Size-exclusion chromatography of polyelectrolytes: Experimental evidence for a general mechanism. Journal of Chromatography A, 441, 239- 260.

é

é

Sperling, L. H. (1992). Introduction to physical polymer science (2 nd ed.). New York: John Wiley & Sons.

Takagi, T. (1990). Application of low-angle laser light scattering detection in the field of biochemistry. Journal of Chromatography, 506, 409-416.

Van Dijk, J. A. P. P., & Smit, J. A. M. (2000). Size-exclusion chromatography-multiangle laser light scattering analysis of -lactoglobulin and bovine serum albumin in aqueous solution with added salt. Journal of Chromatography A, 867, 105-112.

Wen, J., Arakawa, T., & Philo, J. S. (1996). Size- exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Analytical Biochemistry, 240, 155-166.

Wittgren, B., & Porsch, B. (2002). Molar mass distribution of hydroxypropyl cellulose by size exclusion chromatography with dual light scattering and refractometric detection. Carbohydrate Polymers, 49, 457-469.

Wu, C. H. (Eds.). (1995). Handbook of size exclusion chromatography (2 nd ed.). New York: Marcel Dekker. Wyatt, P. J. (1993). Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Analytica Chimica Acta, 272, 1-40.

Yau, W. W., Ginnard, C. R., & Kirkland, J. J. (1978). Broad-range linear calibration in high-performance size exclusion chromatography using column packings with bimodal pores. Journal of Chromatography A, 149, 465-487.

Young, R. J. & Lovell, P. A. (1991). Introduction to polymer (2 nd ed.). London: Chapman & Hall.

Zimm, B. H. (1948). The scattering of light and the radical distribution function of high polymer solutions. The Journal of Chemical Physics, 16, 1093-1099.

β

size exclusion chromatography: เทคนิคแห …เคร องม อน ว า gel...

Documents