SIÇANLARDA SKLEROZAN ENKAPSÜLE PERİTONİT MODELİNDE PİRFENİDONUN PERİTON FİBROZİSİNİ

TEDAVİ EDİCİ ETKİSİNİN İNCELENMESİ

Şermin Çoban1, Serkan Yıldız2, Evrim Bozkaya3, Zahide Çavdar4, Mehtat Ünlü5, Cemre Ural4, Meryem Çalışır6, Osman Yılmaz6, Taner Çamsarı2

1Menemen Devlet Hastanesi, Nefroloji Bölümü, İzmir, Türkiye2Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Nefroloji Bilim Dalı, İzmir, Türkiye3Denizli Devlet Hastanesi, Nefroloji Bölümü, Denizli, Türkiye4Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Tıp Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye5Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Patoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye6Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Laboratuvar Hayvanları Bilimi Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye

GİRİŞ

• İlk kez 1980 yılında Gandhi ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir.

• Periton diyalizi (PD) tedavisi uygulanan hastalarda karşılaşılabilen en ciddi komplikasyonlarından biridir.

• Uzun süre PD yapan hastalarda daha sık görülür.

• PD tedavisine son verildikten sonra da geliştiği gözlenmektedir.

• PD sonrası böbrek nakli yapılan hastalarda da bildirilmektedir.

Gandhi VC, Humayun HM, Ing TS, et al. Sclerotic thickening of the peritoneal membranein maintenance peritoneal dialysis patients. Arch Intern Med 1980; 140: 1201-3.

Sklerozan Enkapsüle Peritonit (SEP)

SEP gelişmesinde (patogenezinde) rol oynayan başlıca faktörler;

1) uzun PD süresi

2) peritonit atakları

3) biyouyumsuz glukoz içerikli PD solüsyonları

4) üremik ortam

5) glukoz yıkım ürünleri

6) asidik pH

7) sitokinler ve büyüme faktörleri

- transforme edici büyüme faktörü beta (TGF-β)

- trombosit kökenli büyüme faktörü (PDGF)

- vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)

- plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1)

- matriks metalloproteazlar (MMP)

- MMP doku inhibitörleri (TIMP)

Sklerozan Enkapsüle Peritonit (SEP)

Aguilera A, Yáñez-Mo M, Selgas R, et al. Epithelial to mesenchymal transition as atriggering factor of peritoneal membrane fibrosis and angiogenesis in peritonealdialysis patients. Curr Opin Investig Drugs 2005; 6(3): 262-8.

Histopatolojik değişiklikler;

- peritondaki mezotelyal hücrelerin ve fibroblastların aşırı üretimi

- epitelyal mezenkimal dönüşüm (mezotel hücrelerinin epitel fenotiplerini

kaybederek myofibroblast özelliği kazanması)

- hücre dışı matriks birikimi (kollajenler, fibronektin, laminin vb.)

- interstisyel fibrozis

- yeni damar oluşumu (neovaskülarizasyon)

- mononükleer hücre infiltrasyonu

- parietal ve visseral peritonda kalınlaşma

Sklerozan Enkapsüle Peritonit (SEP)

Flood TA, Veinot JP. Test and teach. Diagnosis: Sclerosingencapsulating peritonitis. Pathology 2008; 40(6): 629-31.

Tedavi;

1) İlaç tedavisi

- kortikosteroidler

- tamoksifen => TGF-β ↓

- azatiopürin

- mTOR

- CNİ

- mikofenolat mofetil

2) Cerrahi tedavi

- peritonektomi

- enterolizis

3) Destek tedavisi

- total parenteral beslenme

Sklerozan Enkapsüle Peritonit (SEP)

Lo WK, Kawanishi H. Encapsulating peritoneal sclerosis--medical andsurgical treatment. Perit Dial Int 2009 ; 29 Suppl 2: S211-4.

Pirfenidon

• Pirfenidon başlangıçta bir anti-helmintik ve ateş düşürücü ajan olarak geliştirilmiştir.

• Basit bir kimyasal yapısı olan piridindir [5-metil-1-fenil-2-(1 H)-piridon].

• Anti-inflamatuar, anti-fibrotik ve anti-oksidan etkileri olduğu saptanmıştır.

Kreuter M. Pirfenidone: an update on clinical trial data and insightsfrom everyday practice. Eur Respir Rev 2014; 23(131): 111-7.

Pirfenidon

Farmakodinamik/kinetik;

- dağılım hacmi: 59- 71 litre

- proteine bağlanma: % 58 (albumin)

- metabolizma: karaciğer

(CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1)

- ana inaktif metaboliti (5-karboksi-pirfenidon)

- yarılanma ömrü: ~ 3 saat

- atılımı: idrar (~ % 80, > % 99 metabolit olarak)

Pirfenidon

• TGF- β inhibitörü => anti-fibrotik

• Anti- TNF etki => anti-inflamatuar

• Deneysel hayvan çalışmaları;

- diyabetik modellerinde renal ve kardiyak fibrozis- bleomisin ilişkili pulmoner fibrozis- kalsinörin inhibitörü toksisitesi- 5/6 nefrektomi sonrası KBY ilerleyişi- tek taraflı üreter tıkanıklığı sonrası böbrek işlevi ve fibrozis- barsakta iskemi reperfüzyon modeli

• Klinik çalışmalar;

- hipertrofik kardiyomiyopati- idiyopatik pulmoner fibrozis- FSGS- diyabetik nefropati

Schaefer CJ, Ruhrmund DW, Pan L, Seiwert SD, Kossen K. Antifibrotic activitiesof pirfenidone in animal models. Eur Respir Rev 2011; 20(120): 85-97.

2014

AMAÇ

Bu çalışmada sıçanlarda SEP modelinde pirfenidonun ağızdan ve intraperitoneal uygulanması sonrası periton fibrozisini tedavi edici etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır.

GEREÇ-YÖNTEM

• Bu çalışmada Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Laboratuvarı’ndan temin edilen olan Wistar-Albino türü erişkin erkek sıçanlar (200-250 gr) kullanıldı.

• Herhangi bir nedenle deneye devam edemeyecek ya da deneyler bitmeden yaşamı sonlanan sıçanlar, deney ve istatistik kapsamından çıkarıldı.

Sıçanlar rastgele seçilerek altı (6) çalışma grubu oluşturuldu.

1) Grup K (n=7):

Bu gruptaki sıçanlara 21 gün intraperitoneal izotonik NaCl verildi.

2) Grup KH (n=7):

Bu gruptaki sıçanlara 21 gün intraperitoneal etil alkol-klorheksidinçözeltisi verildi.

3) Grup D (n=7):

Bu gruptaki sıçanlara 21 gün intraperitoneal etil alkol-klorheksidinçözeltisi verildi, sonrasında 21 gün periton dinlendirildi.

GEREÇ-YÖNTEM

GEREÇ-YÖNTEM

4) Grup P-1 (n=7):

Bu gruptaki sıçanlara 21 gün intraperitoneal etil alkol-klorheksidinçözeltisi verildi, sonrasında 21 gün ağızdan pirfenidon (350 mg/kg/gün)verildi

5) Grup P-2 (n=7):

Bu gruptaki sıçanlara 21 gün intraperitoneal etil alkol-klorheksidinçözeltisi verildi, sonrasında 21 gün intraperitoneal pirfenidon (350 mg/kg/gün) uygulandı.

6) Grup P-3 (n=7):

Bu gruptaki sıçanlara 21 gün intraperitoneal pirfenidon (350 mg/kg/gün) uygulandı.

6 Çalışma Grubu

n = 42

21 gün i.p.

izotonik NaCl

n = 7

21 gün i.p. KH

n = 7

21 gün i.p. KH

21 gün dinlendirme

n = 7

21 gün i.p. KH

21 gün p.o pirfenidon

n = 7

21 gün i.p. KH

21 gün i.p. pirfenidon

n = 7

21 gün i.p. pirfenidon

n = 7

GRUP K GRUP KH GRUP D GRUP P-1 GRUP P-2 GRUP P-3

GEREÇ-YÖNTEM

• Çalışma sonunda sıçanlar inhalasyon yolu ile eter anestezi uygulandıktan sonra sakrifiye edildi.

• Sıçanlardan sakrifikasyon sonrası parietal ve visseral periton doku örnekleri alındı.

• Alınan periton doku örnekleri histopatolojik değerlendirme ve biyokimyasal incelemeler için % 10 formaldehit solüsyonu içerisinde ilgili laboratuvarlara ulaştırıldı.

Histopatolojik Değerlendirme;

* Işık mikroskobik doku takip protokolü

* Hematoksilen - Eozin (HE) boyaması

* Masson - Trikrom (MT) boyaması

* Periton dokusunda;

- kalınlık ölçümü (µm)

- fibrozis skorlaması (MT ile boyalı alan yüzdesi)

- vasküler yoğunluk ölçümü (mm3 deki damar sayısı)

- inflamasyon skorlaması (mm2 deki mononükleer hücre sayısı = infiltrasyonu)

- immünhistokimyasal olarak TGF-β1 ekspresyonu

Biyokimyasal İncelemeler:

* Periton dokusunda;

- PDGF (sandviç ELISA yöntemi)

- TGF-β1 (sandviç ELISA yöntemi)

- TIMP-1 (sandviç ELISA yöntemi)

Verilerin Değerlendirilmesi:

• Araştırma sonuçlarının istatistik analizi SPSS 22.0 istatistik programı kullanılarak yapıldı.

• Gruplara ait ortalama değerler Mann-Whitney U ve Kruskal-Wallis testleri kullanılarak karşılaştırıldı.

• p<0.05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Veriler ortalama ±standart hata biçiminde verildi.

BULGULAR

Periton Kalınlığı- µm -

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Grup K Grup KH Grup D Grup P-1 Grup P-2 Grup P-3

*

*

* p<0.05

*

po

ip

*

Fibrozis Skorlaması- Masson Trikrom ile boyalı alan yüzdesi (%) -

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Grup K Grup KH Grup D Grup P-1 Grup P-2 Grup P-3

*

po

ip

*

* p<0.05

*

Vasküler Yoğunluk Ölçümü- mm3 deki damar sayısı -

0

10

20

30

40

50

60

Grup K Grup KH Grup D Grup P-1 Grup P-2 Grup P-3

*

*

*

po

ip

* p<0.05

İnflamasyon Skorlaması- mm2 deki mononükleer hücre sayısı (infiltrasyonu) -

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Grup K Grup KH Grup D Grup P-1 Grup P-2 Grup P-3

* p<0.05

*

*

po

ip

*

İmmünhistokimya - TGF-β1 Ekspresyonu- Boyama (%) yok: 0, 0-10: 1, 10-50: 2, 50 üzeri: 3 -

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Grup K Grup KH Grup D Grup P-1 Grup P-2 Grup P-3

*

*

po

ip* p<0.05

*

Doku PDGF Analizi- pg/mg protein -

0

5

10

15

20

25

Grup K Grup KH Grup D Grup P-1 Grup P-2 Grup P-3

* p<0.05

*

*

*

po

ip

Doku TGF-β1 Analizi- pg/mg protein -

0

50

100

150

200

250

300

350

Grup K Grup KH Grup D Grup P-1 Grup P-2 Grup P-3

* p<0.05

*

*

*

po ip

Doku TIMP-1 Analizi- pg/mg protein -

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Grup K Grup KH Grup D Grup P-1 Grup P-2 Grup P-3

* p<0.05

*

*

*

po ip

TARTIŞMA-SONUÇ

• Literatürde pirfenidonun karaciğer, akciğer ve böbrek dokularında oluşturulan fibrozis modellerinde anti-inflamatuvar, anti-fibrotik ve anti-oksidan etkilerinin gösterildiği birçok deneysel çalışma bulunmaktadır.

• Ancak, deneysel SEP modelinde pirfenidonun ağızdan ve intraperitoneal uygulamasını karşılaştıran, periton fibrozisinitedavi edici etkisinin incelendiği bir çalışma bulunmamaktadır.

TARTIŞMA-SONUÇ

• Çalışmamızda, sıçanlarda SEP modelinde ağızdan pirfenidonverilmesi sonrası;

- periton kalınlığında

- peritoneal fibrozis skorlamasında

- vaskülarizasyonda

- inflamasyon skorlamasında

- periton dokusu TGF-β1 ekspresyonunda

- periton dokusu TIMP-1, TGF-β1 ve PDGF düzeylerinde

anlamlı oranda azalma saptanmıştır (p<0.05).

TARTIŞMA-SONUÇ

• Çalışmamızda, sıçanlarda SEP modelinde intraperitonealpirfenidon verilmesi sonrası;

- periton kalınlığında

- vaskülarizasyonda

- periton dokusu TIMP-1, TGF-β1 ve PDGF düzeylerinde

anlamlı oranda azalma saptanmıştır (p<0.05).

• Ancak, peritoneal fibrozis skorlamasında, inflamasyonskorlamasında ve periton dokusu TGF-β1 ekspresyonunda anlamlı oranda azalma saptanmamıştır (p>0.05).

TARTIŞMA-SONUÇ

• Çalışmamızda, sadece intraperitoneal pirfenidon verilen P-3 grubundaki sıçanlarda;

- periton kalınlığında

- peritoneal fibrozis skorlamasında

- inflamasyon skorlamasında

- periton dokusu TGF-β1 ekspresyonunda

kontrol grubuna göre anlamlı düzeyde artış dikkati çekmiştir.

• Ancak, bu gruptaki periton dokusu TIMP-1, TGF-β1 ve PDGF düzeyleri kontrol grubu ile benzerdir.

TARTIŞMA-SONUÇ

• Çalışmamızda deneysel SEP modelinde ağızdan verilen pirfenidonun periton dokusunda fibrozisi tedavi edici ve periton dokusundaki büyüme faktörlerini baskılayıcı etkisi gösterilmiştir.

• Bu çalışmanın sonuçlarının PD hastalarında gelişen SEP tedavisine katkı sağlayabileceği düşüncesindeyiz.

İLGİNİZ İÇİN

TEŞEKKÜRLER