La espectrometría de masas permite la identificación de proteínas a través de la interpretación de los espectros de fragmentaciónde péptidos generados a partir de proteólisis (normalmente con tripsina) de proteínas. En la configuración nanoHPLC-ESI la muestra es introducida en el espectrómetro de masas procedente de un cromatógrafo HPLC que funciona con nanoflujos (nanoHPLC). Para mezclas de proteínas poco complejas, hasta 50-60 proteínas, se realiza una cromatografía monodimensional mediante una nanocolumna de fase inversa (C18). Para proteomas y subproteomas complejos, se realiza una cromatografía bidimensional empleando dos nanocolumnas de HPLC: una de intercambio iónico y una de fase inversa. Esto permite la entrada secuencial de péptidos y su aislamiento y fragmentación por el espectrómetro de masas. El resultado es una lista de masas de los péptidos y sus fragmentos de modo que la búsqueda en las bases de datos es dual, por MS y por MS/MS. Así, se obtiene identificaciones inequívocas ya que tenemos información de la secuencia de los péptidos. Este tipo de espectrometría de masas se conoce por el nombre de espectrometría de masas de trampa iónica o “ion trap MS”. La principal ventaja respecto a la identificación de proteínas por huella peptídica o “fingerprint” es su menor dependencia de las bases de datos, ya que requiere menor similitud con las proteínas presentes en estas bases. Otra ventaja importante es que puede analizar mezclas complejas de proteínas sin necesidad de fraccionarlas previamente, por ejemplo, mediante SDS-PAGE mono o bidimensional.

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE nanoHPLC- MS/MS

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE nanoHPLC- MS/MS

TIPOS DE MUESTRAS QUE SE PUEDEN ANALIZARLos tipos de muestras que pueden analizarse incluyend: bandas extraídas de geles monodimensionales teñidos con Coomassie o teñidos con plata; spots extraídos a partir de geles 2D-PAGE teñidos con Coomassie o teñidos con plata; mezclas de proteínas obtenidas por immunoprecipitación u otros métodos de purificación; extractos de proteínas complejos (subproteomas, proteomas totales, etc).CANTIDADES DE MUESTRA NECESARIALa sensibilidad que se alcanza ronda los 100-200 fentomoles de muestra, lo que equivale a 5-10 nanogramos de una proteína de 50 kDa.

CONFIGURACIÓN NANOHPLC-MASAS CONFIGURACIÓN NANOHPLC-MASAS

0 10 20 30 40 50 60 70 Time [min]0

1

2

3

4

5

7x10Intens.

BPC 100-2500 +All MS

Las fuentes de ionización basadas en electronebulización no toleran la presencia de pequeñas cantidades de contaminantes como restos de sales, detergentes o trazas de substancias introducidas durante el proceso de digestión. Por esta razón, y gracias a la facilidad de acoplamiento, el espectrómetro puede ir precedido de un sistema de purificación de la muestra (nanoHPLC). Los péptidos generalmente son inyectados y retenidos en una nanocolumna de fase inversa C18 (75 μm de diámetro interno) en la cromatografía en 1 dimensión, o separados a través de dos nanocolumnas (fase inversa más intercambio iónico) en la cromatografía bidimensional. Los péptidos separados son entonces secuencialmente impulsados e ionizados en el espectrómetro de masas mediante un sistema ESI (ElectroSpray Ionization). El analizador es capaz de ir fragmentándolos de manera automática de modo que podemos identificar la proteína o la mezcla de proteínas inicial.

Cromatograma

Columna c18

Gradiente

Espectro

NanoHPLC

Espectrómetro de masas

El electrospray (ESI) o electronebulización es una técnica de ionización para pequeñas cantidades de moléculas como péptidos, proteínas o polímeros. Las fuentes ESI operan a presión atmosférica. Los analitos en disolución que provienen de la nanocolumna, se hacen pasar a través de una aguja estrecha en cuyo extremo se aplica un potencial eléctrico produciéndose así gotas macroscópicas cargadas en un proceso de nebulización pneumática. El potencial aplicado es suficientemente alto como para dispersar la solución emergente en forma de un spray fino formado por gotas cargadas con la misma polaridad. Mediante un proceso de desolvatación de los disolventes el radio de las gotas cargadas va disminuyendo hasta alcanzar el límite crítico de Rayleigh. Debido a eventos de repulsión coulómbica aumenta la tensión superficial de las gotas y acaban explotando, formándose así una serie de pequeñas gotas cargadas que seguirán sufriendo procesos de evaporación y explosión sucesivos hasta que finalmente se forman iones cargados desnudos. Las cargas se distribuyen a lo largo de las moléculas según los sitios de aceptación disponibles, de modo, que es muy frecuente la formación de iones con múltiples cargas.

                                            

IONIZACIÓN DE ANALITOS MEDIANTE ELECTRONEBULIZACIÓNIONIZACIÓN DE ANALITOS MEDIANTE ELECTRONEBULIZACIÓN

900 V - no spray1000 V - Taylor-cone/droplet oscillation, more "drops" than spray1100 V - cone/droplet oscillation. approx 50% spray1200 V - cone/droplet oscillation, on the verge of a stable Taylor cone1300 V - stable cone-jet1400 V - cone-jet on the verge of "jumping", slight instability1550 V - multiple cone-jets

                                            

Los iones generados en la fuente de electrospray son atraídos hacia el capilar debido a la aplicación de un potencial eléctrico y rápidamente enfocados hacia el interior del analizador gracias al campo creado por dos octapolos colocados en tándem.

                                                                                          

FOCALIZACIÓN DE IONES GENERADOS FOCALIZACIÓN DE IONES GENERADOS

Los iones son atrapados en el analizador mediante la aplicación de una serie de voltajes de confinamiento y gracias a la presencia de un gas (He) que disminuye su energía. Posteriormente, mediante la acción del anillo generador de radiofrecuencias (RF), se produce la eyección secuencial de los iones hacia el detector, de modo que primero salen los iones de menor tamaño molecular y por último los más grandes. De esta manera sólo

estamos obteniendo información de las masas moleculares de los iones generados en el intervalo seleccionado.

SEPARACIÓN Y DETECCIÓN DE IONES (método Full Scan) SEPARACIÓN Y DETECCIÓN DE IONES (método Full Scan)

Una vez que tenemos los iones confinados en el interior del analizador, tenemos la posibilidad de seleccionar una sola masa y aislarla mediante la aplicación de determinadas RF en el anillo. Este proceso se realiza con gran eficiencia y la ventana de selección puede ser muy pequeña, de modo que nos aseguramos de que sólo tenemos la presencia de una masa confinada en el interior de la trampa. A continuación, mediante la aplicación de nuevos voltajes con efecto sinérgico, se aumenta la amplitud de la oscilación del ion seleccionado y se induce su fragmentación. Posteriormente se detectan los fragmentos y así se obtiene el correspondiente espectro MS(2)

428.8

472.3 571.3

610.7

672.4

743.4

842.5 897.4 928.9

9. +MS, 22.6-22.8min #(886-898)

0.0

0.5

1.0

1.5

7x10Intens.

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z

AISLAMIENTO Y FRAGMENTACIÓN DE IONES (modo MS/MS) AISLAMIENTO Y FRAGMENTACIÓN DE IONES (modo MS/MS)

                                                                                          

Los iones entran en la trampa y cuando se ha acumulado la cantidad deseada se cierra el paso gracias a un cambio de polaridad en las lentes de entrada. El detector es un dinodo de conversión que envía las señales hacia el multiplicador de electrones para amplificarlas. A la salida de la trampa hay unas lentes de enfoque que permiten la focalización de los iones o de sus fragmentos hacia el detector.

COMPONENTES IMPORTANTES DEL ANALIZADORCOMPONENTES IMPORTANTES DEL ANALIZADOR

Los datos obtenidos mediante espectrometría de masas son los espectros de masas, estos son representaciones de la abundancia de un ión frente a la relación m/z que este ión posee.Puede ser un diagrama de líneas o de picos o simplemente una tabla de valores que recoge laabundancia relativa o intensidad relativa de un pico frente a la relación m/z. Las masas querecoge un espectrómetro de masas son producto de isótopos individuales de un elemento yno de la masa atómica del elemento, es decir que si un elemento genera un ión, la masa queregistramos será la correspondiente al isótopo concreto que contenga ese fragmento delanalito. El espectro de masas contiene las señales másicas correspondientes no solo al ión molecular o progenitor sino también las relativas a los iones procedentes de fragmentación (espectrometría de masa en tándem MS= MS/MS). El más abundante se llama pico base. El carácter específico de las fragmentaciones moleculares se debe a que son características de cada compuesto, por tanto un espectro de masas de un determinado compuesto es como una huella dactilar, no hay dos iguales, aunque sí semejantes.

1. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS1. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Pico base(abundancia máximaDefinida como 100 %)

Ion molecular

Gracias a la correcta interpretación de los espectros de fragmentación se puede llegar a identificar no sólo la secuencia ordenada de los aminoácidos de un péptido, sino que además se pueden caracterizar las posibles modificaciones que lleven los residuos por la variación de su masa molecular.

La estrategia LC-MS permite fraccionar y analizar cientos de péptidos en un solo experimento

EspectrometrÍa de masa en tandem MS= MS/MS

2. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS2. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Búsqueda en base de datos

PATRÓN DE FRAGMENTACIÓN EN UN ESPECTRÓMETRO DE MASASPATRÓN DE FRAGMENTACIÓN EN UN ESPECTRÓMETRO DE MASAS