scian, romina mecanismos inmunológicos implicados en la

Scian, Romina

Mecanismos inmunológicos implicados en lapatología osteoarticular por Brucella spp

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Cita recomendada:Scian, R. (2013). Mecanismos inmunológicos implicados en la patología osteoarticular por Brucella spp (Tesisde Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina. Disponible en RIDAA-UNQ RepositorioInstitucional Digital de Acceso Abierto de la Universidad Nacional de Quilmes http://ridaa.unq.edu.ar/handle/20.500.11807/137

Puede encontrar éste y otros documentos en: https://ridaa.unq.edu.ar

Scian, Romina, Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto,

diciembre de 2012, 195 pp. , http://ridaa.unq.edu.ar,

Universidad Nacional de Quilmes, Secretaría de Posgrado, Doctorado en Ciencias Básicas y Aplicadas

Mecanismos inmunológicos implicados en la patología osteoarticular por BRUCELLA SPP

TESIS DOCTORAL

Romina Scian

[email protected]

Resumen La brucelosis osteoarticular es la localización más común de la enfermedad activa en el hombre. Sin

embargo, hasta el momento no habían sido investigados los mecanismos inmunológicos implicados en

esta patología. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue dilucidar cuáles eran los

mediadores responsables del daño osteoarticular por Brucella abortus. La hipótesis central que fue

analizada es que B. abortus puede inducir inflamación y esta respuesta puede ocasionar la destrucción

ósea mediante diversos mecanismos: 1) la producción de metaloproteasas de matriz (MMPs), 2) la

inducción de la formación de osteoclastos (células que degradan matriz ósea) y 3) la alteración en el

número y función de los osteoblastos (células encargadas de producir la matriz ósea).

Nuestros resultados demuestran que B. abortus es capaz de infectar y replicarse intracelularmente en

osteoblastos y fibroblastos sinoviales humanos. Estas células responden a la infección produciendo MMP-

2, y las quemoquinas MCP-1 e IL-8, las cuales inducen la migración de monocitos y neutrófilos,

respectivamente. Los monocitos y neutrófilos atraídos al sitio de infección osteoarticular responden a la

infección con B. abortus y sus lipoproteínas, produciendo MMP-9. Como resultado de las interacciones de

los osteoblastos y los fibroblastos sinoviales con las células inmunes a través de citoquinas y factores de

crecimiento producidos por estos tipos celulares frente a la infección por B. abortus, pudimos demostrar

que TNF-α sería una de las principales citoquinas implicadas en la producción de MMPs.

Nuestros estudios sobre la implicancia de la osteoclastogénesis patológica en el daño óseo mediado por

Brucella, revelaron que la infección por B. abortus, mediante un mecanismo que involucra a sus

lipoproteínas vía TLR-2 y la molécula adaptadora MyD88, induce la diferenciación de osteoclastos a partir

de precursores de médula ósea en presencia de M-CSF. Mediante la utilización de precursores de

osteoclastos deficientes en el receptor de TNFR1 y anticuerpos neutralizantes demostramos que la

inducción de la formación de osteoclastos también está mediada por TNF-α.

La infección por B. abortus es capaz de inducir la apoptosis de los osteoblastos, así como también de

inhibir la diferenciación y función de los mismos como células implicadas en la deposición de matriz

orgánica y mineral. Además, demostramos que los macrófagos infectados contribuyen tanto en la

inducción de la apoptosis, como en la inhibición de la diferenciación y función de los osteoblastos

mediante la producción de TNF-α en respuesta a la infección.

Por otro lado, tanto la infección directa de los osteoblastos como el estímulo con los sobrenadantes de los

macrófagos infectados también inducen un incremento en la expresión de RANKL en la superficie de los

osteoblastos. Esta molécula podría interactuar con RANK presente en la superficie de los precursores de

osteoclastos y de ese modo contribuir a la inducción de osteoclastogénesis patológica.

Nuestros resultados aportan evidencias de que B. abortus y sus lipoproteínas interaccionan con los

osteoblastos y fibroblastos sinoviales atrayendo monocitos y neutrófilos al sitio de infección, los cuales

contribuyen al establecimiento de una respuesta inflamatoria que produce daño osteoarticular, mediante

un mecanismo en el que TNF-α sería la principal citoquina involucrada. Lugar de trabajo: Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU) e Instituto de Inmunología,

Genética y Metabolismo (INIGEM)

Agradecimientos

A mi directora Vic; por haberme guiado durante toda la tesis, por su asesoramiento

científico contínuo, por haberme permitido realizar este trabajo en un marco de confianza y

estímulo constante, y por su humor.

Al Dr. Alberto Fossati; por haberme permitido ingresar al grupo mediante una beca de la

ANPCyT, por sus valiosas y acertadas sugerencias y por contribuir enormemente en las

correcciones de esta tesis.

Al Dr. Pablo Baldi; por estar siempre bien dispuesto a compartir y transmitir sus

conocimientos sobre inmunidad y biología de Brucella.

Al Dr. Guillermo Giambartolomei; por sus valiosas críticas y sugerencias, por fomentar la

discusión científica en forma constante y por las correcciones de la tesis.

A Pau; por su permanente disposición, ayuda y paciencia, especialmente con el citómetro

de flujo.

Al Dr. Gilson Costa Macedo y el Dr. Sergio Costa Oliveira; por aportar los ratones TLR KO

y contribuir con los experimentos.

Al Dr. Diego Comerci; quien nos proporcionó las mutantes virB10.

A la Dra. Silvia Di Genaro; quien nos cedió los ratones TNFRp55 KO.

A mis compañeros y amigos del IDEHU; Cori, Mark, Marian, Sole, Vir, Melu, Pool, Santi,

Eli, Andre y Marilin, por haber compartido éxitos y fracasos, por tantas charlas y after-labs,

y sobre todo por haber hecho el día a día tan divertido.

A mis compañeros del Satz; por haberme recibido con los brazos abiertos, por compartir

inquietudes, por la compañía y diversión en la última parte de mi trabajo.

A mis amigas del alma; que siempre estan en todo lo que hago.

A Carli; por estar, compartir su tiempo y acompañarme en la última etapa.

A mi familia; por acompañarme y apoyarme incondicionalmente.

Parte de los resultados de este trabajo han sido publicados en:

- Prepatellar bursitis due to Brucella abortus: case report and analysis of the local

immune response. Wallach JC, Delpino MV, Scian R, Deodato B, Fossati CA, Baldi

PC. J Med Microbiol. 2010 Dec; 59 (Pt 12):1514-8.

- Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor- and tumor necrosis factor

alpha-mediated matrix metalloproteinase production by human osteoblasts and

monocytes after infection with Brucella abortus. Scian R, Barrionuevo P,

Giambartolomei GH, Fossati CA, Baldi PC, Delpino MV. Infect Immun. 2011 Jan;

79(1):192-202.

- Potential role of fibroblast-like synoviocytes in joint damage induced by Brucella

abortus infection through production and induction of matrix metalloproteinases.

Scian R, Barrionuevo P, Giambartolomei GH, De Simone EA, Vanzulli SI, Fossati

CA, Baldi PC, Delpino MV. Infect Immun. 2011 Sep; 79(9):3619-32.

- Macrophage-elicited osteoclastogenesis in response to Brucella abortus infection

requires TLR2/MyD88-dependent TNF-α production. Delpino MV, Barrionuevo P,

Macedo GC, Oliveira SC, Genaro SD, Scian R, Miraglia MC, Fossati CA, Baldi PC,

Giambartolomei GH. J Leukoc Biol. 2012 Feb; 91(2):285-98.

- Brucella abortus invasion of osteoblasts inhibits bone formation. Scian R,

Barrionuevo P, Fossati CA, Giambartolomei GH, Delpino MV. Infect Immun. 2012

Jul; 80 (7):2333-45.

Índice

ABREVIATURAS

INTRODUCCIÓN GENERAL

BRUCELOSIS Generalidades Historia Etiología

Brucella spp. Composición de la membrana y estructura antigénica Biología de Brucella spp.

Epidemiología Fuentes y vías de infección

Diagnóstico, tratamiento y control Respuesta inmune contra Brucella spp.

Inmunidad innata Componentes celulares de la inmunidad innata Receptores implicados en el reconocimiento de Brucella spp.

Inmunidad adaptativa Células T αβ CD4+ y CD8+ Células T γδ Respuesta humoral

Citoquinas Patogenia

Factores de virulencia Respuesta inflamatoria y patogenia Activadores bacterianos de la respuesta inflamatoria

EL HUESO Composición y dinámica normal del hueso

Los osteoclastos Los osteoblastos Los osteocitos

El hueso en condiciones inflamatorias

BRUCELOSIS OSTEOARTICULAR

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

CAPÍTULO I “Rol de las metaloproteasas de matriz en la patogénesis de la brucelosis osteoarticular”

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS 1. Cultivo de bacterias 2. Cultivo celular 3. Infección celular 4. Zimografía 5. Medición de los niveles de MMP-9 y MMP-2 6. Ensayo de migración

7. Estimulación con medio condicionado 8. Medición de la concentración de citoquinas 9. Neutralización de las citoquinas y bloqueo de sus receptores 10. Actividad gelatinolítica en condiciones nativas. 11. Clonado, expresión y purificación de la proteína recombinante Omp19 de B. abortus 12. Lipoproteínas y LPS 13. Estimulación con los antígenos de B. abortus y los agonistas de los TLRs 14. Bloqueo de los receptores de tipo Toll (TLRs) 15. Evaluación de la reacción inflamatoria articular en el modelo murino 16. Determinación de marcadores inflamatorios en las muestras de líquido sinovial 17. Análisis estadístico

RESULTADOS 1. Osteoblastos

1.1. B. abortus invade y se replica intracelularmente en la línea celular de osteoblastos humanos hFOB 1.2. La infección con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α o IL-1β, en osteoblastos 1.3. B. abortus induce la producción de MMP-2 en osteoblastos a través de la secreción de GM-CSF 1.4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos

2. Osteoblastos y su interacción con monocitos 2.1. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos 2.2. Los sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos debido principalmente a TNF-α 2.3. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los monocitos, y este efecto está mediado principalmente por GM-CSF 2.4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus estimulan la producción de MMP-9 en los monocitos indirectamente a través de la inducción de TNF- α

3. Osteoblastos y su interacción con neutrófilos 3.1. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de neutrófilos 3.2. Los sobrenadantes de neutrófilos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de osteoblastos 3.3. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos

4. Interacción entre B. abortus, los osteoblastos, los monocitos y los neutrófilos como determinantes de patología ósea 5. Fibroblastos sinoviales

5.1. B. abortus invade y se replica en la línea celular de fibroblastos sinoviales humanos SW982 5.2. La infección de los fibroblastos sinoviales con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α e IL-1β 5.3. La infección con B. abortus induce la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales

5.4. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos

6. Fibroblastos sinoviales y su interacción con monocitos y neutrófilos 6.1. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de TNF-α 6.2. Los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-9 por parte de los monocitos a través de GM-CSF. 6.3. Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de TNF-α 6.4. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos a través de IL-6

7. Interacción entre B. abortus, los sinoviocitos, los monocitos y los neutrófilos 8. B. abortus produce un incremento neto en la actividad de las metaloproteasas secretadas por los osteoblastos, monocitos, neutrófilos y fibroblastos sinoviales 9. Componentes estructurales de B. abortus están implicados en la inducción de MMPs por sinoviocitos, monocitos y neutrófilos

9.1. Monocitos 9.1.1. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los monocitos, pero no de MMP-2 por parte de los osteoblastos 9.1.2. La lipoproteína L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos vía TLR2 9.1.3. L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos a través de la inducción de TNF- α

9.2. Neutrófilos 6.2.1. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos

9.3. Fibroblastos sinoviales 9.3.1. B. abortus induce la secreción de MMP-2 y citoquinas en fibroblastos sinoviales humanos, y este efecto está mediado por L-Omp19 a través del reconocimiento de TLR2

10. B. abortus y L-Omp19 inducen una respuesta inflamatoria en la articulación de la rodilla de ratones BALB/c 11. Bursitis prepatelar causada por la infección con B. abortus: producción local de citoquinas proinflamatorias y gelatinasas

DISCUSIÓN Osteoblastos Fibroblastos sinoviales Las lipoproteínas de Brucella en la inducción de MMPs Modelo murino Paciente con bursitis brucelar

CAPÍTULO II “Inducción de la osteoclastogéneis por la infección con B. abortus”

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS 1. Animales 2. Cultivo de bacterias 3. Lipoproteínas y LPS

4. Cultivo celular 5. Infección celular 6. Ensayos de infección o estimulación de los macrófagos/monocitos con B. abortus 7. Ensayo de formación de osteoclastos 8. Análisis de la expresión del receptor de vitronectina 9. Análisis por RT-PCR 10. Medición de citoquinas y RANKL 11. Ensayo de degradación de dentina 12. Evaluación de la formación de osteoclastos en un modelo in vivo 13. Análisis estadístico

RESULTADOS 1. Los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus inducen la diferenciación de los monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos 2. Los macrófagos murinos infectados con B. abortus producen las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-6 e IL-1β, pero no RANKL o TGF-β 3. Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos murinos estimulados con L-Omp19 inducen la diferenciación de los monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos 4. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos murinos infectados o estimulados con L-Omp 19 y la concomitante osteoclastogénesis depende de la presencia de MyD88 y TLR2 5. La formación de osteoclastos inducida por los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 está mediada por TNF-α. 6. Los monocitos humanos se diferencian a osteoclastos en respuesta a la infección con B. abortus a través de la secreción de TNF-α 7. L-Omp19 y B. abortus inducen osteoclastos diferenciados capaces de degradar matriz mineral 8. HKBA y L-Omp19 inducen la formación de osteoclastos en la tibia de ratones mediante un mecanismo dependiente de TLR2 9. Esquema con los resultados mostrados en este capítulo

DISCUSIÓN

CAPÍTULO III “Inhibición de la diferenciación y función de los osteoblastos por la infección con B. abortus”

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS 1. Cultivo de bacterias 2. Cultivo celular 3. Infección celular 4. Estimulación con medio condicionado 5. Zimografía 6. Medición de la concentración de citoquinas 7. Bloqueo de TNF-α 8. Expresión de RANKL 9. Evaluación de la apoptosis 10.Diferenciación de osteoblastos 11.Determinación de la deposición de colágeno mediante tinción con Rojo Sirio

12.Determinación del depósito de osteocalcina 13.Determinación de la deposición de calcio mediante Alizarina Roja 14.Determinación de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL) 15.Análisis estadístico

RESULTADOS 1. B. abortus invade y se multiplica en osteoblastos provenientes de cultivo primario de calvaria murina 2. La infección con B. abortus induce la expresión de KC, MCP-1 y MMPs por parte de los osteoblastos de calvaria 3. La infección con B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos 4. La infección con B. abortus induce la expresión de RANKL en los osteoblastos de calvaria 5. La infección con B. abortus inhibe la diferenciación de los osteoblastos de calvaria 6. B. abortus inhibe la deposición de minerales por parte de los osteoblastos de calvaria 7. B. abortus inhibe la deposición de matriz orgánica 8. TNF-α presente en los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus está involucrado en la inducción de la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos de calvaria 9. TNF-α presente en los sobrenadantes de macrófagos murinos infectados con B. abortus está involucrado en la inducción de apoptosis de los osteoblastos de calvaria 10. Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus inhiben y la deposición de matriz orgánica y mineral por parte de los osteoblastos de calvaria, principalmente a través de TNF-α 11.Esquema con los resultados obtenidos en este capítulo

DISCUSIÓN

DISCUSIÓN GENERAL

CONCLUSIÓN GENERAL

BIBLIOGRAFÍA

Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes

Abreviaturas

ATCC American Type Culture Collection

BCIP-NBT (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato)-(azul de nitro-tetrazolio)

BMP Proteínas morfogenéticas del hueso

BSA Albúmina sérica bovina

cDNA Ácido desoxiribonucleico complementario

Ckb Creatina quinasa b

DC Células dendríticas

DMEM Dulbeco´s Modified Eagle´s Medium

DNA Ácido desoxiribonucleico

ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas

FAL Fosfatasa alcalina

FITC Isotiocianato de fluoresceína

fMLP N-formil-L-metionil-L-Leucil-L-fenilalanina

GM-CSF Factor estimulante de colonias granulocítico-macrofágicas

h/s Hora/s

HKBA Brucella abortus muerta por calor

IFN Interferón

Ig Inmunoglobulina

IGF Factor de crecimiento insulínico

IL Interleuquina

IL-1Ra Antagonista del receptor de IL-1

IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosido

KC Quemoquina derivada de queratinocitos

LPS Lipopolisacárido

MCP-1 Quemoquina quimioatractante de monocitos

M-CSF Factor estimulante de colonias de macrófagos

MHC Complejo mayor de histocompatibilidad

min. Minutos


MMP/s Metaloproteasa/s de matriz

MOI/s Multiplicidad/es de infección

NFκB Nuclear factor kappa B

NK Células citotóxicas naturales

Omp Proteína de la membrana externa

OPG Osteoprotegerina

PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos

PBMCs Células mononucleares derivadas de sangre periférica

PBS Buffer fosfato salino

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PE Ficoeritrina

PFA Paraformaldehído

PrPC Proteína priónica celular

RANKL Ligando del receptor activador de NFκB

RNA Ácido ribonucleico

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SDS Dodecil sulfato de sodio

SFB Suero fetal bovino

SP-1 Esfingosina 1-fosfato

TGF Factor de crecimiento transformante

Th1 T “helper” 1

TIMPs Inhibidores titulares de metaloproteasas

TLR/s Receptor/es tipo TOLL

TNF Factor de necrosis tumoral

TNFRI Receptor de TNF tipo I

TRAP Fosfatasa ácida resistente a tartrato

TSA Agar tripteína de soya

UFC Unidades formadoras de colonias


Introducción general

BRUCELOSIS

Generalidades

La brucelosis es una zoonosis endémica de distribución mundial causada por

bacterias Gram negativas del género Brucella que se comportan como patógenos

intracelulares facultativos. La enfermedad afecta al hombre y a distintas especies animales

tanto domésticas (bovinos, caprinos, porcinos, caninos, ovinos) como salvajes (camellos,

delfines, roedores, etc.). Algunas de estas especies se encuentran muy relacionadas con

la alimentación y la actividad laboral ganadera [1]. La disminución de la capacidad

reproductora y abortos en el ganado, el nacimiento de crías débiles y la contaminación de

lácteos y carne generan un gran impacto económico-social ya que ocasionan pérdidas

tanto en la industria agropecuaria como en la salud pública. En nuestro país se considera

que las pérdidas económicas relacionadas con la enfermedad superan los 300 millones de

pesos anuales [2].

Historia

El primer aislamiento de bacterias del genero Brucella fue realizado en 1887 por el

médico del Ejército británico David Bruce, de los bazos de soldados que morían en la isla

de Malta. La bacteria fue denominada inicialmente Micrococcus melitensis. Recién en 1904

se determinó que la cabra era el reservorio del agente causal, luego de aislarse el

microorganismo de la orina y de la leche. El segundo aislamiento se produjo en 1895 por el

veterinario danés Bang quien describió un organismo causante de abortos en el ganado

vacuno denominándolo Bacillus abortus; el tercero fue cultivado en Estados Unidos en

1914 a partir del feto de un cerdo abortado (Bacillus suis). Alice Evans fue la primera en

sugerir un parentesco entre los tres microorganismos y en 1920 los incluyó en un género

aparte, denominado Brucella [3], en honor a su descubridor.

Etiología Brucella spp.

Las especies del género Brucella pertenecen a la clase α-proteobacteria, orden

Rhizobiales, familia Brucellaceae [4]. Este género está constituido por cocobacilos Gram


negativos pequeños, inmóviles y aerobios estrictos, de crecimiento lento que no poseen

cápsulas ni forman esporas y son muy resistentes a la desecación. Esto contribuye a que

puedan permanecer viables durante largo tiempo en la paja y el polvo de los establos, o en

los alimentos, como leche, manteca y queso. A diferencia de muchas otras bacterias, su

genoma está constituido por dos cromosomas circulares y carece de plásmidos [5]. El

género Brucella es un género en expansión. Hasta el año 2008 constaba de 8 especies

clasificadas de acuerdo a variaciones antigénicas y al hospedador preferencial. Estas eran:

B. melitensis, B. suis, B. abortus, B. pinnipedialis, B. cetaceae, B. neotomae, B. canis y B.

ovis [6]. De estas 8 especies sólo 5 son patógenas para el hombre: B. melitensis, B.

abortus, B. suis, B. canis y B. pinnipedialis. De ellas, las 3 primeras son responsables de la

mayoría de los casos de brucelosis humana [7-9] (Tabla 1). En el 2008 se reportaron 2

nuevas especies: B. microti [10] (aislada a partir de ratones salvajes) cuya secuencia es

muy similar a la de B. suis y B. inopinata [11], aislada en un implante mamario de una

mujer de 71 años con síntomas de brucelosis. B. melitensis, B. abortus y B. suis se

encuentran además subdivididas en distintas biovariedades en base a diferencias en

propiedades serológicas y de cultivo [8]. Recientemente se secuenciaron los genomas de

muchas de las especies de Brucella los cuales proveerán abundante información para

dilucidar los mecanismos de patogenicidad de la bacteria [12].

Tabla 1

Especies Hospedador Patogenicidad en humanos

B. melitensis Caprinos, ovinos, camélidos Elevada

B. suis Porcinos, roedores salvajes Moderada

B. abortus Bovinos, camélidos, búfalos, bisontes Moderada

B. pinnipedae Focas, lobos marinos ModeradaB. cetaceae Cetáceos Desconocida

B. neotomae Roedores DesconocidaB. ovis Ovinos No posee

B. canis Caninos ModeradaEspecies rugosas

Especies lisas

Composición de la membrana y estructura antigénica

La envoltura celular de las bacterias del género Brucella está formada por una

membrana interna, una membrana externa y un espacio periplasmático intermedio. Desde

un punto de vista antigénico, en la membrana externa de Brucella existen dos


componentes fundamentales: el lipopolisacárido (LPS) y las proteínas. El LPS es una

molécula anfipática que consta de una parte exclusivamente polisacarídica dirigida hacia el

exterior, y otra parte glucolipídica (lípido A) inserta en la membrana externa, y por tanto no

expuesta en la superficie (Ilustración 1).

La parte polisacarídica del LPS se divide en dos secciones: un oligosacárido

intermedio, llamado núcleo; y el polisacárido O, también conocido como cadena O que es

la estructura antigénica más expuesta de la bacteria. (Ilustración 1). La longitud de la

cadena O es variable, pudiendo presentar desde 30 a 100 residuos de glucosa [13]. El

lípido A contiene glucosamina y diaminoglucosa. En sus grupos amino e hidroxilos

presenta sustituciones por ácidos grasos de variada longitud de cadena. El lípido A del

LPS de Brucella, a diferencia del lípido A de la mayoría de las enterobacterias, posee una

estructura atípica caracterizada por su alta hidrofobicidad, su bajo grado de sustitución y

por poseer cadenas alifáticas más largas [14]. El núcleo contiene glucosa, manosa y ácido

3, deoxi-D-mano-2 octulosónico y no contiene ni heptosas ni fosfatos. El polisacárido O es

un homopolímero lineal compuesto por n-residuos de N-formil perosamina.

Ilustración 1

Peptidoglicano

Omp10 Omp16Omp 31 Braun Omp19 Omp2b Omp25

Lípido A

Núcleo

Cadena O

LPS (cepas lisas)

LPS (cepas rugosas)

Membrana externa

Espacio periplásmico

Membrana interna

Peptidoglicano

Omp10 Omp16Omp 31 Braun Omp19 Omp2b Omp25

Lípido A

Núcleo

Cadena O

LPS (cepas lisas)

LPS (cepas rugosas)

Membrana externa

Espacio periplásmico

Membrana interna

Las proteínas de la membrana externa (Omps) se asocian estrechamente con el LPS

y muchas de las mismas han sido caracterizadas desde el punto de vista genético,

inmunológico, estructural y funcional [15]. Estas proteínas se clasifican en tres grupos de

acuerdo a sus pesos moleculares, Grupo 1: se relacionan con la biosíntesis de la propia

envoltura celular (89-94 kDa), Grupo 2: equivalentes a las porinas de otras bacterias Gram


negativas (35- 40 kDa) [16-19] y Grupo 3: interaccionan fuertemente con el LPS (25-30

kDa) [15, 20]. Las proteínas de los grupos 2 y 3 se encuentran en mayor cantidad y son

conocidas como Omps “mayores”. Las proteínas del grupo 1 junto con otras con pesos

moleculares entre 10 y 20 kDa, son denominadas Omps “menores”. Estos tres grupos de

proteínas se encuentran expuestos en la membrana externa, y son reconocidos por el

sistema inmune en el curso de la infección [21]. A través de diversos estudios se ha

confirmado la inmunogenicidad de las Omps y su posible utilidad como vacunas [22-26].

En base al aspecto de las colonias obtenidas en medio sólido, las diferentes especies

de Brucella se clasifican habitualmente como lisas o rugosas (Tabla 1). El aspecto que

adquieren las colonias se debe a la composición química del LPS en la superficie

bacteriana, en las cepas rugosas el polisacárido O está ausente (Ilustración 1). Las cepas

de Brucella en fase lisa son las más virulentas para el hombre [27].

Biología de Brucella spp.

Las bacterias de este género son microorganismos intracelulares facultativos

capaces de sobrevivir y multiplicarse dentro de las células del sistema reticuloendotelial y

los tejidos asociados. Son capaces de infectar fagocitos profesionales (macrófagos,

linfocitos B y células dendríticas) y no profesionales , así como también células no

fagocíticas [7, 28-34].

Los mecanismos de ingreso de la bacteria a estas células no han sido

completamente dilucidados, aunque se presume que el LPS y las proteínas de la

membrana externa podrían participar en los mismos, mediante receptores tipo manosa o

integrinas, respectivamente [35, 36]. En fagocitos no profesionales, la internalización

requiere un gasto de energía, y los inhibidores del metabolismo energético y de la

endocitosis mediada por receptor pueden suprimir este proceso. Brucella posee un

sistema de dos componentes llamado BvrS/BvrR, el cual codifica para un sensor de

histidina quinasa y controla la expresión de los determinantes moleculares necesarios para

la invasión celular [37].

Las cepas lisas de Brucella entran a las células macrofágicas a través de sitios en la

membrana celular ricos en colesterol conocidos como “lipid rafts” o macrodominios

lipídicos. Esto no ocurre en el caso de las cepas rugosas. Como las cepas lisas y rugosas

difieren en la composición de su LPS, particularmente de la cadena O polisacarídica, esta

cadena podría ser la responsable de dirigir la entrada a través de los “lipid rafts”. Este

mecanismo de entrada pareciera ser clave para la supervivencia de la bacteria en los

macrófagos infectados, ya que la disrupción farmacológica de los “lipid rafts” lleva a una


fagocitosis independiente de los mismos y a la posterior eliminación de todas las bacterias

fagocitadas [38].

Watarai y col. propusieron que Brucella interactuaría con una proteína priónica

celular (PrPC) de los macrófagos; esta proteína está anclada por una unión

glicosilfosfatidilinositol en los “lipid rafts”. Esta interacción estaría mediada por la presencia

en membrana de la proteína de choque térmico 60 (HSP60) de Brucella. La proteína PrPC

podría ser necesaria para la fagocitosis mediada por “lipid-rafts” y consecuentemente para

permitir la supervivencia intracelular de Brucella [39, 40].

Dentro de las células macrofágicas, estos microorganismos son capaces de inhibir la

fusión del fagosoma al lisosoma [28]. De esta manera, si bien los macrófagos son capaces

de lisar a la mayoría de las bacterias fagocitadas, un bajo porcentaje logra sobrevivir y

replicarse intracelularmente. Experimentos realizados con macrófagos murinos infectados

con B. abortus demostraron que hay una disminución inicial del número de organismos

luego de la fagocitosis. Durante esta etapa hasta un 90-99% de los organismos son

eliminados, mientras que las bacterias que logran sobrevivir se replican posteriormente

[41, 42]. Así, el macrófago se transforma en el nicho replicativo de bacterias viables en las

formas crónicas de la enfermedad. Las cepas rugosas de Brucella también son capaces de

bloquear la fusión fagolisosomal, aunque con menor eficiencia que las cepas lisas [43].

La supervivencia de Brucella dentro de las células se ha asociado con la síntesis de

enzimas antioxidantes [44] y a la producción de guanosina 5´monofosfato y adenina, que

inhiben la fusión fagosoma-lisosoma, la degranulación, la activación del sistema

mieloperoxidasa-haluro y la producción del factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) [45]

Para formar la vacuola replicativa (o brucelosoma) en macrófagos es necesario que

la vacuola interactúe con el retículo endoplasmático. El comienzo de la replicación coincide

con el momento en que se detectan proteínas del retículo endoplasmático en la vacuola

que contiene Brucella. El brucelosoma madura en una vía endocítica por fusión continua

con compartimentos endocíticos tempranos o tardíos. La disminución del pH del

compartimento facilita la expresión de genes que se activan con la acidez del medio y que

son necesarios para la supervivencia y división intracelular de Brucella. El operón más

importante de respuesta a la acidez, es el VirB, que codifica para el sistema de secreción

tipo IV [46]. La replicación de la bacteria tiene lugar dentro del retículo endoplasmático sin

afectar la integridad celular. Recientemente se ha demostrado que luego de la replicación

en el retículo, la vacuola que contiene a Brucella adquiere características de vacuola

autofágica [47].

No se han encontrado dentro del genoma de Brucella los sistemas de secreción tipo

I, II y III ni islas de patogenicidad, tampoco se identificaron factores de virulencia clásicos


como toxinas, fimbrias o cápsula, por lo que estos microorganismos parecieran utilizar

mecanismos únicos para evadir al sistema inmune, penetrar a las células, alterar el tráfico

intracelular, impidiendo su degradación y muerte en los lisosomas, y modular el ambiente

intracelular para permitir su replicación y larga sobrevida en dicho nicho [48, 49].

Epidemiología

La incidencia y prevalencia de la brucelosis varían según el área geográfica. Las

zonas con mayor prevalencia son el Mediterráneo, el oeste de Asia y algunas zonas de

África y Latinoamérica, especialmente países con bajos recursos económicos [50, 51]. A

nivel mundial, la infección en animales con B. abortus es la más frecuente a pesar de la

vacunación masiva; excepto en Europa y en Australia donde ha sido prácticamente

erradicada. En América del Norte, la brucelosis afecta preferencialmente zonas agrícolas

del norte y centro de México [52], aunque en Canadá y Estados Unidos ha disminuido en

los últimos años. Sin embargo, no ha sido completamente erradicada debido

fundamentalmente a la transmisión entre el ganado y animales salvajes que servirían de

reservorio [53, 54]. En América Central todos los países son afectados por B. abortus,

siendo la prevalencia de hasta un 8% [51]. En Sudamérica se encuentra en varios países,

en la mayoría es endémica y representa un problema sanitario importante [50, 55]. En

Chile, sobre todo en las zonas ganaderas y productoras de leche, se encuentra la mayor

concentración de ganado infectado [56].

La incidencia de la brucelosis es más alta en nuestro país, si bien la enfermedad se

encuentra subdiagnosticada y subreportada [57]. El número de personas que adquiere la

infección anualmente oscila entre 10.000 y 20.000 [58]. Datos aportados por el SENASA

en el año 2005 muestran que la prevalencia de la brucelosis en los bovinos fue del 5%

[59]. Sin embargo, una encuesta realizada el mismo año por el INTA Bariloche, la

Dirección de Ganadería de la provincia de Río Negro y el laboratorio de brucelosis de la

Fundación Barrera Patagónica, reveló que la prevalencia de la enfermedad era de 21,4 %

de establecimientos positivos con B. abortus -con un rango de 10% al 40%- y una tasa de

reaccionantes del 3,7% [60]. Las áreas más afectadas son el nordeste, la pre-cordillera de

los Andes, la Mesopotamia y la pampa húmeda, ubicando a la brucelosis en el cuarto lugar

entre las enfermedades transmisibles crónicas de la Argentina, después de la enfermedad

de Chagas, la tuberculosis y la sífilis.

La distribución geográfica de la brucelosis humana está en estrecha relación con la

distribución de la brucelosis animal. La incidencia puede variar desde valores inferiores a

0,01/100.000 habitantes en los países desarrollados hasta cifras superiores a 200/100.000


habitantes en los países menos desarrollados. En la Argentina, donde no sólo hay un

importante consumo de lácteos y carnes, sino que además la producción y elaboración de

estos productos es una de las principales actividades económicas, la incidencia es muy

alta siendo una de las enfermedades laborales más importantes [58, 61].

Fuentes y vías de infección

Si bien en condiciones propicias Brucella puede sobrevivir en el medio ambiente por

períodos relativamente largos, no hay evidencias de que este microorganismo se replique

en un grado significativo en dichas circunstancias. La fuente de infección la constituyen los

animales infectados que excretan gran cantidad de bacterias junto con los tejidos y

productos de abortos, en la leche, y en menor medida en las secreciones genitales. Estos

animales también manifiestan la enfermedad, solo que con diferente sintomatología

dependiendo del hospedador y la especie de Brucella de la que se trate. La entrada de las bacterias en el hombre se puede producir por contacto directo con

material infectado, por aerosoles o alimentos contaminados a través de las vías

conjuntival, inhalatoria, gástrica o dérmica en la piel lesionada. La vía de ingreso más

importante es a través de la mucosa oronasal [62]. La brucelosis presenta dos patrones

epidemiológicos: un patrón urbano-alimentario, por consumo de leche cruda y quesos

contaminados; y un patrón rural-laboral, por exposición profesional al ganado infectado o

sus productos ya sea por contacto o inhalación. Además, la entrada por inoculación

accidental con cepas vacunales es frecuente en peones y veterinarios [63, 64]. Las

infecciones asociadas al trabajo de laboratorio representan el 2% de los casos [65]. Debido

a su potencial epidémico, la ausencia de una vacuna humana, y la eficiencia de la

infección por aerosoles, Brucella es clasificada como un patógeno de nivel de bioseguridad

3 y es considerado un potencial agente bioterrorista [66].

La mínima dosis infectiva capaz de inducir brucelosis activa depende de la especie

de Brucella y de la vía de entrada (Tabla 2) [67]. En países en los que la infección por

Brucella es endémica en la población animal, la infección por Brucella en humanos es

frecuente [68]. Sin embargo, la transmisión persona a persona es extremadamente

inusual.


Tabla 2 [67]

Oral InhalaciónB. melitensis 5000 1300B. abortus 106 <100

B. suis 107 <100

Número de organismosEspecie

Diagnóstico, tratamiento y control

En general el diagnóstico de la enfermedad es difícil debido a que los síntomas que

caracterizan a la enfermedad en la primera etapa no son patognomónicos [37]. Además de

considerar la historia clínica, es recomendable realizar un estudio bacteriológico

complementado con el análisis de los anticuerpos séricos. Si la enfermedad es

diagnosticada tempranamente y se trata en forma adecuada tiene, en general, una

evolución favorable.

Para corroborar el diagnóstico se realizan estudios de laboratorio como detección de

anticuerpos específicos contra Brucella en sangre por seroaglutinación. También se puede

utilizar el diagnóstico por PCR (Polymerase Chain Reaction) el cual es altamente

específico e incluso sirve para distinguir entre las diferentes especies de Brucella, pero su

costo hace que la seroaglutinación siga siendo la técnica más utilizada. Aunque el

diagnóstico de certeza se establece aislando al microorganismo a partir de cultivos de

sangre, médula ósea u otros tejidos; esto solo se logra en un 50% de los casos donde los

métodos serológicos dieron positivos [69].

En las formas agudas de la enfermedad, la administración precoz y prolongada de

una apropiada combinación de antibióticos durante períodos de varias semanas (en

promedio de 6 a 8) provoca la remisión del cuadro clínico en al menos el 90% de los

pacientes. La asociación de doxiciclina y estreptomicina constituye el tratamiento de

elección ya que en estas condiciones se presenta un menor porcentaje de pacientes con

recaídas [70]. La administración de doxiciclina y rifampicina es empleada como tratamiento

alternativo.

En cuanto al control de la enfermedad, dado que no existen hasta el momento

vacunas para humanos, la forma más efectiva de tratar esta zoonosis es evitar que se

infecten los animales. Las vacunas para animales más utilizadas se obtienen a partir de

cepas vivas atenuadas. Actualmente se utilizan dos cepas vacunales lisas: B. abortus cepa


19 (S19) para el ganado vacuno y B. melitensis REV-1 para pequeños rumiantes, y una

cepa atenuada rugosa: B. abortus RB51 para el ganado vacuno [50].

En Argentina la brucelosis humana es una enfermedad que persiste en las regiones

donde la infección animal no está controlada. Algunas medidas de prevención a tener en

cuenta son: programas de saneamiento del ganado, educación para la salud en áreas

endémicas, medidas de higiene y seguridad en el trabajo y control sanitario en las

fronteras.

Respuesta inmune contra Brucella spp.

Inmunidad innata Componentes celulares de la inmunidad innata.

En estadíos tempranos de la infección por Brucella, el rol de la respuesta innata es

reducir el número inicial de bacterias promoviendo un ambiente adecuado para generar

una respuesta Th1 en el hospedador [8]. Los macrófagos, los neutrófilos y el complemento

juegan un rol clave en esta fase temprana de la respuesta a la invasión frente a este

microorganismo [71].

Muchos autores [45, 72, 73] han demostrado que los macrófagos y los neutrófilos

poseen la capacidad de destruir a un alto porcentaje de las bacterias fagocitadas. Se pudo

determinar que la fagocitosis y el estallido respiratorio en macrófagos son dependientes de

la opsonización de las bacterias por Acs y complemento, y también de la activación celular

por el interferón gama (IFN-γ) y el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) que puedan

producir otras células [45, 73]. Todas las especies del género Brucella son sensibles a los

metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, sin embargo son capaces de inhibir la

degranulación de los gránulos primarios y secundarios aumentando su supervivencia

intracelular [45, 74].

Se ha demostrado que Brucella puede sobrevivir dentro de las células dendríticas

(DC) tal como lo hace en otros tipos celulares [75]. Además de las DC “clásicas” (B220-

LY-6C- NK1.1-), en modelos murinos, se han definido recientemente varios subtipos de DC

especializados. Las DC plasmocitoides, que expresan los marcadores B220+ CD11b- LY-

6C+ NK1.1-, se especializan en la producción de IFN-α y respuestas antivirales [76]. Las

NK DC, expresan CD11b- DX5+ NK1.1+ y poseen funciones tanto citotóxicas como de

presentación antigénica [76]. Un estudio reciente ha implicado a las DC B220- CD11b+ LY-

6C+ NK1.1- iNOS+ en la infección con Brucella sugiriendo que las mismas serían los


principales efectores de la respuesta Th1 murina contra bacterias intracelulares y que las

mismas podrían también tener un rol importante en el desarrollo de la respuesta Th1 en

humanos. El mismo trabajo también ha demostrado que la activación de las DC

inflamatorias durante la infección de ratones con Brucella es dependiente de la

señalización a través de Myd88, y que las DC B220- CD11b+ LY-6C+ son reclutadas y

activadas durante la infección y constituyen las principales células productoras de iNOS

[76]. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que B. abortus es capaz de

inducir la maduración de DC e inducir una respuesta Th1 en DC humanas [77]. Por otro

lado, utilizando un modelo de infección en ratón, recientemente se ha demostrado que las

DC, contribuyen no solo como células efectoras sino como reservorios en la patogénesis

de la brucelosis [78]. Sin embargo, cuando el ingreso se produce por vía intranasal

contribuyen a la eliminación de la bacteria en el pulmón [79].

El rol de las células NK en la infección con Brucella no está del todo claro. Estas

células no parecieran prestar una función fundamental en la erradicación de Brucella

durante la infección aguda. Los ratones susceptibles BALB/c y los resistentes C57BL/10

controlan la infección por B. abortus 2308 en ausencia de células NK [80]. En pacientes

con brucelosis, la actividad de las células NK se encuentra aparentemente suprimida [43].

Sin embargo, el co-cultivo de células NK humanas con macrófagos infectados con B. suis,

activa a las NK para producir IFN-γ y TNF-α y destruir a los macrófagos infectados. Los

niveles de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) son

normales en éstas células, de modo similar a lo que ocurre en macrófagos murinos

infectados con B. abortus [81], por lo que la inducción de muerte por las células NK no

ocurriría por este mecanismo. Tampoco está claro, cómo la infección suprime a las células

NK, un mecanismo que parece ser exclusivo de la infección en humanos no

evidenciándose en la infección murina [80].

Receptores implicados en el reconocimiento de Brucella spp.

Los TLRs (Receptores de tipo Toll) juegan un rol importante en el inicio de la

respuesta inmune innata. Estos receptores presentes en células fagocíticas profesionales

reconocen los distintos patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) uniéndose

directamente a ellos, reclutando un grupo de adaptadores intracelulares con dominios TIR

e iniciando así una cascada de activación que va a culminar con la activación de MAP

quinasas y factores de transcripción (como NF-kB) que modulan la producción de

citoquinas, quemoquinas y expresión de moléculas co-estimulatorias. Estos receptores

pueden ser activados por diversos productos microbianos; TLR2 (formando heterodímeros


con TLR1 o TLR6) reconoce productos de la pared celular de bacterias Gram positivas y

lipoproteínas bacterianas; TLR3: dsRNA, TLR4: LPS, TLR5: flagelina, TLR9: motivos CpG

no metilados y TLR7/8: ssRNA [82].

Estudios recientes han revelado las cascadas de señalización intracelulares que

participan en el inicio de la respuesta inmune mediada por TLR en la infección por Brucella

[83]. Los receptores TLR2, TLR4 y TLR9 han sido implicados en las interacciones del

hospedador con Brucella. Las vías de señalizaciones dependientes de MyD88 e

independientes de TRIF participan en la activación de la respuesta innata por parte de

Brucella. Además, se ha demostrado el rol crítico de la molécula MyD88 en la maduración

de las células dendríticas y la producción de Interleuquina (IL)-12 durante la infección por

B. abortus [84]. También hay que destacar la contribución de NOD y los receptores IFN

tipo-I durante la infección por Brucella [85].

Inmunidad adaptativa

Se han identificado 3 mecanismos de la respuesta inmune adaptativa que parecen

tener un rol en el control de la infección por Brucella. Primero, el IFN-γ producido por

células T CD4+, CD8+ y γδ activa las funciones bactericidas del macrófago inhibiendo la

supervivencia intracelular de la bacteria. Segundo, la citotoxicidad T CD8+ y γδ puede

destruir al macrófago infectado. Tercero, los isotipos de anticuerpos de tipo Th1 como

Inmunoglobulina (Ig)G2a e IgG3 opsonizan al patógeno y facilitan la fagocitosis [86, 87].

Células T αβ CD4+ y CD8+

Se ha caracterizado la importancia tanto de las células T CD4+ como CD8+ en la

inmunidad contra Brucella [24, 88] . Estudios de transferencia adoptiva de Winter y col. [87]

han demostrado que la inmunidad protectora contra B. abortus S19 en ratón se debe a un

efecto combinado de células CD4+ (L3t4) y CD8+ (Lyt2). Sin embargo, experimentos en

ratones deficientes en los genes que codifican para moléculas MHC-I o MHC-II

demuestran que los ratones que no tienen células T CD8+ controlan la infección más

lentamente que los ratones de la cepa salvaje. Los ratones deficientes en células T CD4+

controlan la infección en forma similar a los ratones de la cepa salvaje [89]. Por otro lado,

otros autores utilizando B. abortus 2308 sugieren que los ratones deficientes en β2

microglobulina controlan eficazmente la infección y que las células T CD8+ no son

importantes hasta después de la primera semana de infección [81, 90]. Esto último está

demostrado ya que ratones BALB/c con una deleción en el gen de IFN-γ, pueden prevenir


el incremento de unidades formadoras de colonias (UFC) después de la primera semana

posterior a la infección. En este mismo trabajo se demuestra que tanto la neutralización del

TNF-α como la depleción de células T CD8+ producen el aumento de las UFC a las 3

semanas postinfección. Se ha descripto que linfocitos T CD8+ son activados durante la

infección con Brucella [89, 91] y se han caracterizado algunos antígenos que están

involucrados en la inducción de esta respuesta citotóxica [88, 92].

Células T γδ

Se ha descripto que las células T con el receptor T Vγ9Vδ2 está aumentado a nivel

periférico en pacientes agudos infectados con B. melitensis [93]. Estas células activadas

por antígenos no peptídicos controlan el número de bacterias intracelulares porque

secretan TNF-α e IFN-γ activando las funciones bactericidas del macrófago. Estudios in

vitro sugieren que las células T Vγ9Vδ2 también podrían lisar directamente a las células

infectadas [94].

Respuesta humoral

Tempranamente en la infección aparecen anticuerpos que suelen permanecer

detectables en el suero durante años. Estos anticuerpos están dirigidos contra varios

componentes del microorganismo, pero especialmente contra los antígenos superficiales,

particularmente el LPS [95]. Los anticuerpos producidos colaboran en la lucha del

hospedador contra el patógeno pero no son suficientes para evitar la enfermedad,

seguramente debido al estilo de vida intracelular de Brucella spp. Sin embargo, la

detección de anticuerpos dirigidos contra el LPS es útil para el diagnóstico, y seguimiento

de la infección [95].

Citoquinas

Hay varias citoquinas que juegan un rol importante en el control de la infección por

Brucella spp.: IL-12, IFN- y TNF- α .[96, 97].

La IL-12 es la responsable de dirigir la respuesta inmune hacia un perfil de tipo Th1

tanto in vitro como in vivo [98, 99] con producción de IFN-, y es producida por células B,

macrófagos y DC. Si bien se conoce la importancia de esta citoquina en brucelosis [100,

101]; los mecanismos de inducción de IL-12 en estas células no se han esclarecido.


El IFN- permite a la inmunidad enfrentarse a Brucella mediante la activación de las

funciones bactericidas del macrófago, induciendo la apoptosis, aumentando la

diferenciación celular y la producción de citoquinas, induciendo el “switch” de IgG a IgG2a

y aumentando la expresión de moléculas involucradas en la presentación antigénica [37,

45].

La relevancia del IFN- en la resolución de la infección por Brucella se evidencia en

estudios con ratones deficientes en el gen de esta citoquina ya que éstos mueren luego de

6 semanas de la infección con B. abortus [90]. Sin embargo a pesar de ser Brucella un

potente inductor de IFN-, esta bacteria es capaz de sobrevivir y reproducirse durante un

largo período en el bazo de ratones infectados [102]. Otros estudios han sugerido que la

activación con IFN- impide que Brucella establezca su nicho replicativo, y por tanto si ya

se estableció el brucelosoma, el IFN- no tiene efecto alguno [41]. La producción temprana

durante la infección de una citoquina inmunomoduladora como IL-10 podría explicar en

parte este fenómeno [103].

Recientemente, se ha demostrado en el modelo murino que IFN- producido en la

infección por B. melitensis cumple un rol fundamental en el control de la infección. En

contraste, IL-17 parecería no desempeñar una función crucial ni favoreciendo ni

controlando la infección[104].

Estudios conducidos hasta la fecha han revelado que B. abortus puede inducir en

diversos tipos celulares la producción de citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β, IL-6, IL-

12 y TNF-α [13, 32, 77, 96, 101, 105-109].

El IFN- es el componente crucial de la inmunidad que permite la sobrevida del

hospedador, y así el estado crónico de infección. A pesar que las células T CD4+ y CD8+

están claramente involucradas en la producción de interferón, y que las células T CD8

pueden ser citotóxicas, el rol para las células NK y la citotoxicidad no se ha sustentado

experimentalmente [67].

Patogenia

El cuadro clínico y la evolución de la infección varían en función de la especie animal

afectada. La especial afinidad de las bacterias por el endometrio grávido y la placenta fetal

condiciona que la principal manifestación clínica de la infección aguda en los bovinos sea

el aborto durante el último tercio de la gestación, o el nacimiento de animales prematuros

poco viables [110]. Se estima que el 40 al 50% de las vacas afectadas tienen

obstaculizadas su capacidad reproductora, como resultado de la enfermedad [111]. La


enfermedad es generalmente asintomática en las hembras no preñadas. En bovinos

machos provoca alteraciones testiculares y una disminución de la fertilidad, acompañadas

algunas veces por abscesos en testículos y epidídimo [112].

En el hombre presenta una gran tendencia a la cronicidad y se caracteriza por fiebre

y localización de las bacterias en distintos tejidos (articulaciones, hueso, endocardio,

sistema nervioso). La supervivencia intracelular de Brucella condiciona el curso ondulante

de la enfermedad y la tendencia a la recaída y evolución crónica.

Si bien constituye una enfermedad de baja mortalidad, puede dejar secuelas

discapacitantes de magnitud variable. Por otra parte, la brucelosis humana no presenta un

cuadro clínico característico que permita una detección precoz del infectado, lo que

favorece la evolución a la cronicidad, complicando las alternativas terapéuticas y la

curación definitiva. Muchos pacientes padecen infecciones asintomáticas. El período de

incubación varía entre 10 y 20 días, aunque la sintomatología puede aparecer varios

meses después.

La brucelosis puede ser clasificada como aguda, subaguda o crónica en base al

tiempo de evolución de la misma [13, 113]. La virulencia y la tendencia a la cronicidad

varían entre especies de Brucella, siendo B. abortus y B. suis las de mayor tendencia a la

cronicidad. Por el contrario, B. melitensis produce las infecciones más severas, tanto en

humanos como en animales [13]. La etapa aguda se manifiesta con fiebre elevada,

escalofríos, sudoración de olor característico, dolores musculares y articulares [113]. Es

difícil la identificación de la enfermedad en esta etapa, ya que los signos y síntomas

pueden ser comunes a otras enfermedades como la fiebre tifoidea, tuberculosis y

leptospirosis. Debido al empleo de los antibióticos ya no se registra el clásico patrón de

fiebre ondulante. El recuento de células en sangre se caracteriza usualmente por una

leucopenia moderada y una relativa linfocitosis, junto con una leve anemia y

trombocitopenia [37]. La tercera parte de los pacientes presenta tos seca o productiva, el

30% estreñimiento, el 5-10% diarreas. En el 50% de los casos se produce hepatomegalia

(ligera o moderada) y esplenomegalia y en el 25% adenopatías. Más del 5% de los

pacientes presentan lesiones cutáneas: erupciones papulonodulares en el tronco y

extremidades, de las que puede aislarse el microorganismo. Es característico el desarrollo

de localizaciones específicas como la osteoarticular, respiratoria, genitourinaria y nerviosa.

Las recaídas o recidivas se presentan en el 15% de los casos, luego de 2 a 3 meses de la

finalización del tratamiento.

En ambas fases, aguda y crónica, se observa un proceso inflamatorio generalizado.

Los signos clínicos de esa inflamación son: fiebre ondulante, artritis, endocarditis,

meningitis, pleocitosis, infiltración monocitaria de las articulaciones, granulomas, etc. [13].


La presencia de tejido granulomatoso es frecuentemente asociada con la persistencia de

Brucella. La liberación de bacterias de estos granulomas puede favorecer la diseminación

de la bacteria a distintas localizaciones a través de repetidos episodios de bacteremia

[114].

La complicación osteoarticular es la más frecuente de las formas localizadas de la

enfermedad, la cual puede afectar articulaciones periféricas, articulaciones sacroilíacas o

la columna vertebral [115-118]. En las etapas tempranas de la brucelosis humana se

puede presentar una artritis inflamatoria intermitente o crónica, que asemeja otras formas

de artritis inflamatorias humanas [13].

En el hígado, la infección con Brucella induce lesiones hepáticas que pueden ser

tanto granulomatosas como no granulomatosas [7, 119]. Histológicamente, los granulomas

muestran necrosis central, un infiltrado de células polimórficas y fibrosis periférica [120].

En neurobrucelosis, el rasgo característico de la inflamación es la meningoencefalitis,

la cual es ocasionada por la invasión al sistema nervioso central por Brucella [121]. El

examen del líquido cefalorraquídeo en la meningitis ocasionada por Brucella generalmente

revela un elevado contenido de proteínas y pleocitosis linfocítica [121]. Las biopsias

quirúrgicas del cerebro o meninges y el examen postmórtem del tejido nervioso evidencian

infiltrado linfocítico perivascular y formación de granulomas [121].

Factores de virulencia

Brucella presenta varias caraterísticas que la diferencian del resto de las bacterias

respecto a la virulencia; ya que no cuenta con factores clásicos de virulencia como

cápsulas, fimbrias, exotoxinas, exoenzimas incluyendo exoproteasas, citolisinas, formas de

resistencia, variaciones antigénicas, plásmidos y fagos lisogénicos [48, 122, 123]. En

cambio Brucella delega su virulencia en su capacidad de sobrevivir y replicarse en los

compartimentos fagocíticos vacuolares de los macrófagos.

Los macrófagos están altamente adaptados a la destrucción de bacterias, la

modulación de la apoptosis por algunas especies de bacterias es un mecanismo de

virulencia muy importante. Las cepas virulentas lisas como B. abortus 2308, son capaces

de inhibir la muerte celular programada en macrófagos humanos y de ratón [124-126]. La

inhibición de la muerte celular facilita la sobrevida y la replicación de las cepas lisas de

Brucella dentro de los macrófagos.

Respuesta inflamatoria y patogenia


A pesar de la diversidad de signos y síntomas en la brucelosis humana, la

inflamación es un rasgo característico de esta enfermedad presente virtualmente en todos

los órganos afectados. Esta particularidad, junto con la detección de bacterias en los

tejidos inflamados, sugiere que Brucella estimula una robusta respuesta inflamatoria en los

sitios en que se localiza. La infección por B. abortus puede activar poderosamente el

sistema inmune innato y adaptativo, conduciendo a una fuerte respuesta pro-inflamatoria

que favorece un perfil Th1 tanto in vitro como in vivo [71, 99]. Como ya mencionamos, B.

abortus puede inducir en diversos tipos celulares la producción de citoquinas pro-

inflamatorias como IL-1β, IL-6, IL-12 y TNF-α [77, 96, 101, 105-107, 127, 128]. Estas

citoquinas generalmente poseen potentes funciones efectoras que se superponen para dar

lugar a distintos componentes de la inflamación como por ejemplo: necrosis tisular [129],

quimiotaxis de infiltrados celulares, inducir la secreción de colagenasas y prostaglandinas

por los fibroblastos sinoviales y condrocitos [130, 131], reabsorción ósea y destrucción del

cartílago [132], al igual que una plétora de mecanismos microbicidas. Además, se han

reportado niveles aumentados de IFN- en pacientes con brucelosis aguda [99]; y otros

estudios confirmaron que el IFN- y el TNF-α están involucrados en la patofisiología de la

brucelosis y que se encuentran estrechamente relacionados con la activación inflamatoria

de la enfermedad [99]. Sin embargo, los mecanismos por los cuales estas bacterias

desencadenan la respuesta inflamatoria son hasta el momento solo parcialmente

conocidos.

Activadores bacterianos de la respuesta inflamatoria

La mayoría de los rasgos relacionados con la patogenicidad de estas bacterias

parecen estar concentrados en su membrana externa. Dentro de los componentes de la

membrana con posible asociación a la patogenicidad, el LPS de Brucella ha suscitado

especial interés [133, 134], a pesar de que ha sido demostrado que la mayoría de las

características químicas, físicas y biológicas de esta molécula difieren cuantitativamente y

cualitativamente del LPS “clásico” de las enterobacterias [135]. A diferencia de otras

endotoxinas, el LPS de Brucella no es pirogénico, no induce una reacción de Shwartzman

localizada, no aumenta la sensibilidad del hospedador a la histamina, no activa la cascada

del complemento de manera significativa y es un mitógeno muy débil de linfocitos B

murinos y humanos. Comparado con el LPS de las enterobacterias [98, 106, 128], se

requieren concentraciones 100 veces más altas de LPS de Brucella para inducir muerte

por shock endotóxico. En cuanto a la producción de mediadores inflamatorios, se ha


demostrado que la actividad biológica del LPS de Brucella es entre 3 y 4 órdenes de

magnitud menor que el LPS de las enterobacterias. Todas las propiedades biológicas del

LPS dependen del lípido A, cuya estructura está conservada en un gran número de

especies bacterianas [136]. La atenuada actividad biológica del LPS de Brucella parece

estar relacionada con el lípido A de esta molécula y su particular estructura química

mencionada anteriormente [137-139]. El mayor enigma que plantea el estudio de la

patogenicidad en brucelosis es cómo pueden las bacterias del género Brucella

desencadenar una respuesta inflamatoria si la actividad endotóxica de su LPS es

despreciable. En forma alternativa, B. abortus podría utilizar su ADN para provocar una

respuesta proinflamatoria. El ADN bacteriano se encuentra enriquecido en motivos CpG no

metilados los cuales han demostrado activar el sistema inmune innato [140]. Sin embargo,

se ha comprobado que el ADN de B. abortus es relativamente ineficiente en desencadenar

la producción de citoquinas [128]. Se ha demostrado que HKBA induce la producción de

TNF-α a través de una vía dependiente de TLR2; transductor específico de peptidoglicano

y lipoproteínas; e independiente de TLR4 y TLR9 [107]. Dado que el LPS y el ADN

bacteriano utilizan TLR4 y TLR9, respectivamente para estimular la producción de

citoquinas, éste último hallazgo sostiene la noción de que el LPS y el ADN de B. abortus

no están involucrados en desencadenar la respuesta proinflamatoria en brucelosis.

En estudios desarrollados en nuestro laboratorio, así como investigaciones

realizadas por otros grupos de trabajo [141-143], han demostrado que las lipoproteínas

bacterianas, ligandos TLR2 [144], son capaces de estimular la proliferación celular al igual

que la producción de citoquinas proinflamatorias. Este fenómeno está asociado a la

acilación de estas proteínas [141-143]. Además, se ha demostrado que las lipoproteínas

bacterianas también son capaces de inducir la producción de IL-10, una citoquina

antiinflamatoria, en monocitos humanos [145].

La inhibición tanto autócrina como exócrina de la producción de IL-10 da como

resultado un aumento en la producción de las citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-12

[146]. El hecho de que las lipoproteínas puedan inducir no sólo citoquinas inflamatorias,

sino también antiinflamatorias, como IL-10, ha reforzado la idea de que las lipoproteínas

son factores cruciales en la patogénesis de las infecciones bacterianas.

Mediante clonado y secuenciación se ha demostrado que tres genes que codifican

para Omps de B. abortus, Omp10, Omp16 y Omp19, exhiben características estructurales

de precursores de lipoproteínas, es decir que poseen un péptido señal aminoterminal que

conforma la secuencia consenso necesaria para la modificación lipídica y el procesamiento

de las lipoproteínas [147, 148]. El correcto procesamiento de Omp10, Omp16 y Omp19 en

Escherichia coli sugiere que el camino de maduración para las lipoproteínas es


funcionalmente compartido entre Brucella spp. y E. coli [147]. Análisis fisicoquímicos y

funcionales confirmaron que Omp10, Omp16 y Omp19 son lipoproteínas y que se

encuentran expuestas en la superficie de la membrana externa de Brucella [149]. El mismo

trabajo ha demostrado que estas lipoproteínas están presentes en todas las especies del

género Brucella y sus biovares.

EL HUESO

El presente trabajo se enfoca en la patología osteoarticular mediada por Brucella, ya

que si bien las complicaciones osteoarticulares son las más frecuentes en la brucelosis

activa en el hombre los mecanismos inmunes implicados en la patología ósea o articular

por Brucella spp. no habían sido descriptos hasta el momento.

Composición y dinámica normal del hueso

El hueso es un tipo de tejido conectivo especializado el cual provee un sistema de

soporte interno a todos los vertebrados superiores. Además de su función de soporte y

protección, es la principal fuente de iones inorgánicos participando activamente en la

homeostasis de calcio en el cuerpo.

La matriz del hueso esta compuesta en un 50 a 70% por matriz mineral, 20 a 40%

por matriz orgánica, 5 a 10% por agua y < 3% por lípidos [150]. La matriz orgánica esta

compuesta en un 90% por proteínas colágenas, en su mayoría por colágeno tipo I con

trazas de colágeno tipo III y V. El restante 10% esta compuesto por proteoglicanos, como

el condroitín y el queratán-sulfato, por glicoproteínas, como la osteonectina y la

fibronectina, por proteínas con grupos -carboxiglutámicos, como la osteocalcina, y por

citoquinas como el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y las proteínas

morfogenéticas óseas [150]. El contenido mineral del hueso es mayoritariamente

hidroxiapatita en forma de cristales [(Ca10(PO4)6(OH)2], con pequeñas cantidades de

carbonato, magnesio y fosfato ácido [150]. Estos componentes proporcionan rigidez

confiriéndole al hueso su resistencia a las fuerzas de compresión.

Para mantener la integridad estructural, el hueso se encuentra en continuo

remodelado lo cual hace posible reparar microlesiones de fatiga, cuya acumulación

comprometería la resistencia del hueso, y por otro lado permite una cierta adaptación de la

estructura ósea a los requerimientos físicos predominantes. El remodelado del hueso es

un proceso complejo y muy controlado llevado a cabo por dos tipos celulares claves: los

osteoclastos y los osteoblastos. Los osteoclastos son las células encargadas de degradar


la matriz extracelular, mientras que los osteoblastos son las células especializadas en

sintetizar la matriz ósea [151], regular la mineralización y finalmente diferenciarse a

osteocitos o a “células de revestimiento” que tapizan las superficies óseas. Las actividades

de los osteoclastos y los osteoblastos se encuentran acopladas y altamente reguladas por

factores locales y sistémicos para mantener el equilibrio del hueso.

El remodelado del hueso ocurre dentro de las “Unidades Multicelulares Básicas”

[152] (Ilustración 2). El ciclo de remodelado comienza en la fase de iniciación que incluye

el reclutamiento de los precursores de osteoclastos, su diferenciación a osteoclastos

maduros, así como también la activación y el mantenimiento de la degradación del hueso.

Luego, sigue la fase de reversión en la cual la degradación del hueso es inhibida y los

osteoclastos mueren por apoptosis, mientras que los precursores de los osteoblastos son

reclutados y comienzan a diferenciarse. El último paso se denomina fase de terminación e

implica la formación de matriz por parte de los osteoblastos y la posterior mineralización

[153].

Ilustración 2

Unidad Multicelular BásicaUnidad Multicelular BásicaUnidad Multicelular Básica

Dado que el remodelado del hueso es un evento multicelular, la señalización e

interacción entre las células involucradas es importante en el control de este proceso.


Los osteoclastos

Los osteoclastos son células gigantes multinucleadas que se forman a partir de la

fusión de los precursores del linaje monocito/macrófago en un proceso denominado

osteoclastogénesis [154]. Los mismos poseen dos fases funcionales, una fase móvil y una

degradativa [155]. Durante la fase móvil los osteoclastos migran desde la médula ósea al

sitio de degradación mediante la formación de lamelipodios. Durante la fase degradativa

los osteoclastos se polarizan a través de la reorganización de su citoesqueleto, lo cual

resulta en la formación de un borde rugoso con profundos pliegues por donde se secretan

iones H+, y se produce la exocitosis, mediada por vesículas, de las enzimas catepsina K y

metaloproteasas de matriz. Los iones H+ acidifican el medio lo cual disuelve la matriz

mineral mientras que las enzimas secretadas degradan la matriz proteica. El contacto con

la matriz ósea también genera en los osteoclastos la formación de un anillo rico en

filamentos de actina que rodea a la zona rugosa y sella el compartimento acidificado donde

ocurre la degradación, aislándolo del resto de la superficie ósea [156].

La diferenciación de los precursores de los osteoclastos requiere la presencia de dos

factores clave: el factor estimulante de colonias macrofágicas (M-CSF) y el ligando del

receptor activador del factor nuclear κB (RANKL). M-CSF producido por los osteoblastos

se une a su receptor c-fms en los precursores de los osteoclastos promoviendo su

sobrevida y proliferación [157]. RANKL es expresado en la superficie de los osteoblastos o

bien puede ser liberado en forma soluble, aunque también se ha documentado su

expresión por otros tipos celulares como fibroblastos, linfocitos B y T activados [158-160].

Su actividad biológica esta regulada por el inhibidor natural osteoprotegerina (OPG) que

actúa como un receptor soluble de RANKL que inhibe en forma competitiva la unión de

este último a su receptor RANK en la superficie de los precursores de osteoclastos [161]

Además de degradar matriz ósea los osteoclastos también pueden participar en la

regulación de la formación del hueso de diversas formas. A medida que los osteoclastos

degradan el hueso liberan factores inmersos en la matriz los cuales actuarían sobre los

osteoblastos promoviendo la formación del hueso. Ejemplos de estos factores son las

proteínas morfogenéticas óseas, los factores de crecimiento insulínico (IGFs) I y II, y TGF-

β [162-164]. Otro mecanismo por el cual los osteoclastos pueden regular la función de los

osteoblastos es a través del contacto directo célula-célula. Se ha reportado que la

interacción de las proteínas transmembrana ephrinB2 expresada por los osteblastos y

EphB4 expresada por los osteoclastos promueve la diferenciación de osteoblastos e inhibe

la diferenciación de los osteoclastos [165, 166]. La regulación también puede ocurrir a

través de factores liberados por los osteoclastos. Un ejemplo es el factor osteoclastico


esfingosina 1-fosfato (SP-1) el cual ha sido involucrado en el reclutamiento de precursores

de osteoblastos y en el incremento de la producción de RANKL por estas últimas células

[167]. SP-1 también tiene efectos directos sobre los osteoclastos regulando la migración

de sus precursores [168].

Los osteoblastos

Los osteoblastos son las únicas células responsables de la formación del hueso. Se

originan a partir de células madre mesenquimales [169]. En presencia de los estímulos

adecuados estas pueden diferenciarse a preosteoblastos. Los preosteoblastos a su vez

dan lugar a osteoblastos maduros, los cuales residen a lo largo de la superficie del hueso

en los lugares de activa formación ósea. Los osteoblastos maduros secretan colágeno tipo

I y proteínas no colágenas incluyendo osteocalcina, osteopontina, sialoproteína y fosfatasa

alcalina (las cuales ejercen funciones de regulación del recambio óseo y control de la

mineralización) [170]. Los osteoblastos pueden seguir tres destinos diferentes: pueden ser

eliminados por apoptosis, pueden quedar embebidos dentro de la matriz mineralizada y

transformarse en osteocitos o pueden transformarse en células de revestimiento que

tapizan la superficie del hueso [151].

Una de las vías de señalización mas importantes que regulan la formación del hueso

es la vía Wnt/β-catenina [171]. La misma esta involucrada en la estimulación de la

proliferación y diferenciación, y promueve la sobrevida de los osteoblastos y osteocitos.

Otra vía de señalización importante involucrada en la diferenciación de los osteoblastos

incluye la vía de la superfamilia TGF-β, siendo dos miembros clave TGF-β y las proteínas

morfogenéticas óseas [172].

Como ya mencionamos los osteoblastos son capaces de regular la diferenciación de

los osteoclastos a través de la expresión de M-CSF, RANKL y OPG. Por otro lado, los

osteoblastos pueden inducir la migración de los precursores de los osteoclastos a la

superficie ósea a través de la secreción de factores quimioatractantes. Dos de estos

factores los cuales derivan de la matriz ósea son osteocalcina y colágeno tipo I [173].

Estos son producidos por los osteoblastos y son depositados en la matriz durante la

formación del hueso. Cuando los osteoclastos degradan la matriz liberan estos factores

atrayendo así más precursores de osteoclastos. La proteína quimioatractante de

monocitos-1 (MCP-1) producida por los osteoblastos también ha sido involucrada en la

atracción de los precursores de osteoclastos [174].

El proceso de remodelado también se encuentra regulado por factores sistémicos

entre los que se encuentran la hormona paratiroidea, la 1,25-dihidroxi vitamina D, los


glucocorticoides y el estrógeno [175-178], estimulando la degradación o la formación de

hueso.

Los osteocitos

Los osteocitos son osteoblastos totalmente diferenciados que son incorporados

dentro de la matriz ósea mineralizada y constituyen las células mayoritarias del hueso. Los

mismos se encuentran espacialmente aislados unos de otros [179]. Sin embargo, poseen

una gran cantidad de prolongaciones citoplasmáticas que les permiten comunicarse entre

sí, y con los osteoblastos o las células de revestimiento que tapizan las superficies del

hueso [180]. Existen evidencias que sugieren que la principal función de los osteocitos es

la de sensar las fuerzas mecánicas e iniciar el proceso de remodelado del hueso en zonas

específicas. Las micro lesiones generadas en el hueso han sido implicadas en el inicio de

este proceso, aunque no esta muy claro aun cuáles son los mecanismos que disparan el

inicio del remodelado de la matriz ósea. Se ha descripto que los osteocitos próximos a las

microlesiones mueren por apoptosis lo cual ha sido correlacionado con un incremento en

la remodelación ósea, debido a un aumento en la producción de RANKL y un incremento

en la formación de osteoclastos [181]. Un estudio reciente ha demostrado que los mismos

osteocitos son capaces de producir RANKL [182].

El hueso en condiciones inflamatorias

Durante un proceso inflamatorio causado por ejemplo por una infección bacteriana de

los huesos y/o las articulaciones el balance existente entre la formación y la degradación

del hueso puede verse afectado. Las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e Il-6 han

sido implicadas en la progresión de enfermedades inflamatorias crónicas del hueso con un

aumento en la degradación ósea. El daño osteoarticular puede ocurrir a través de distintos

mecanismos:

(1) Producción de metaloproteasas de matriz. Se ha demostrado que los antígenos

bacterianos y las citoquinas proinflamatorias son capaces de inducir la producción

de metaloproteasas de matriz en varios tipos celulares como osteoblastos y

fibroblastos sinoviales [183, 184], presentes en los huesos y articulaciones,

respectivamente. Asimismo, los macrófagos y los neutrófilos atraídos a los tejidos

inflamados también pueden responder a dichos estímulos produciendo MMPs


[185, 186]. Las MMPs han sido implicadas en el daño tisular dado que degradan

componentes de la matriz extracelular.

(2) Inducción de la osteoclastogénesis. Se ha reportado que TNF-α [187, 188] e IL-6

[189], así como también el incremento patológico en la expresión de RANKL por

parte de los osteoblastos [190] son capaces de inducir en forma directa la

diferenciación de los precursores de osteoclastos a osteoclastos maduros.

(3) Apoptosis e inhibición de la función de los osteoblastos. Las citoquinas

proinflamatorias TNF-α e IL-1β [191, 192] como así también distintos antígenos

bacterianos [193, 194] son capaces de inducir la apoptosis o inhibir la

diferenciación y función de los osteoblastos en la deposición de matriz orgánica y

mineral.

Brucelosis osteoarticular

Las complicaciones osteoarticulares son la forma localizada más frecuente de la

brucelosis. La prevalencia reportada de las mismas varía desde un 10% a un 85% [116,

195-198]. Esta variación ha sido atribuida a las diferencias en patogenicidad de la especie

de Brucella involucrada (siendo la infección por B. melitensis la más frecuente y grave de

las complicaciones osteoarticulares [196, 197, 199-202]), y a las diferencias en los

hospedadores y factores ambientales de la población estudiada. Las manifestaciones

clínicas más comunes son: espondilitis, sacroileítis y artritis periférica, afectando

usualmente la cadera, la rodilla, el tobillo y el hombro [115-118]. Menos frecuentemente

Brucella puede afectar otros sitios musculoesqueleticos produciendo tendinitis u

osteomieltis de huesos largos [203] y también se ha descripto infección en la bursa aunque

es inusual [204].

La espondilitis es una de las complicaciones más serias la cual se presenta en las

formas subagudas o crónicas de la enfermedad [37]. Ocurre con mayor frecuencia en las

personas mayores [205], y suele predominar el compromiso lumbar, seguido del cervical y

el dorsal. Con la extensión de la infección pueden aparecer abscesos paravertebrales,

abscesos epidurales espinales y complicaciones neurológicas [201, 202]. Incluso en

algunos casos se requiere tratamiento quirúrgico. Además del dolor lumbar los pacientes

suelen presentar fiebre, pérdida de peso, astenia y depresión. El dolor lumbar puede ser

gradual o súbito, con irradiación a los miembros inferiores con limitación en ocasiones para

la marcha.

La sacroileítis y las artritis periféricas usualmente reflejan las formas agudas de la

enfermedad y se acompañan con síntomas sistémicos. Frecuentemente responden a


regímenes terapéuticos estándares [37]. A diferencia de la espondilitis, estas

complicaciones son reportadas usualmente dentro de las primeras tres décadas de vida

[206].

Como ocurre con otras infecciones articulares, la persistencia de la enfermedad en la

articulación infectada puede resultar en daño tisular. Aunque el cultivo de Brucella a partir

de muestras de fluido resulta dificultoso, el daño en las articulaciones ha sido

frecuentemente asociado con la presencia de Brucella en dichas articulaciones, como se

demostró por el cultivo in vitro de fluido y tejido sinovial [207, 208] demostrando que los

síntomas son causados por una verdadera infección de la articulación. Es importante

destacar que el tejido sinovial revela, característicamente, un infiltrado celular compuesto

principalmente por monocitos y neutrófilos, e hiperplasia de las células sinoviales [208-

211].

Las anormalidades radiográficas se desarrollan tarde en el curso de la brucelosis con

complicaciones osteoarticulares, y son poco frecuentes en artritis periféricas [116, 196,

212]. En la brucelosis vertebral los cambios destructivos debidos a la pérdida de tejido

óseo pueden no hacerse evidentes hasta el tercer mes de la enfermedad, en consecuencia

no se logra un diagnóstico temprano. El uso de la tomografía computada y la resonancia

magnética nuclear aportan una mejor sensibilidad para el diagnóstico temprano que los

estudios radiográficos convencionales. Por otro lado, el centellograma no es muy útil para

determinar el surgimiento de una afectación osteoarticular y para efectuar un seguimiento

ya que la incorporación anormal del material radioactivo puede persistir durante un largo

período [200, 213].

En cuanto al tratamiento terapéutico con antibióticos, se suele utilizar el mismo que

se describió anteriormente, doxiciclina y estreptomicina durante 6 a 8 semanas, aunque en

los casos de espondilitis se recomienda un período de tratamiento más prolongado, de 8

semanas o más [213, 214].

Si bien las complicaciones osteoarticulares son las más frecuentes en la brucelosis

activa en el hombre, no han sido descriptos aún los mecanismos inmunes implicados en la

patología ósea o articular por Brucella spp. Allí radica la importancia del estudio de esta

patología.


Introducción

Hipótesis y objetivos

La brucelosis osteoarticular es la localización más común de la enfermedad activa en

el hombre, sin embargo, los mecanismos inmuno-patogénicos implicados no han sido aún

determinados.

El objetivo general de este trabajo es dilucidar los mecanismos inmunológicos

implicados en la patogénesis osteoarticular de la brucelosis.

La inflamación es un factor clave en la patogénesis de esta enfermedad. Nuestra

hipótesis es que durante la invasión al hueso y las articulaciones por parte de Brucella la

respuesta generada contra este organismo es capaz de producir un microambiente

inflamatorio responsable de la destrucción osteoarticular mediante diversos mecanismos.

Para poner a prueba esta hipótesis se propusieron los siguientes objetivos

específicos:

1) a) Evaluar la producción de metaloproteasas de matriz (MMPs) por parte de los

osteoblastos, fibroblastos sinoviales y de los neutrófilos y los monocitos

/macrófagos en respuesta a la infección por B. abortus.

b) Evaluar la producción de citoquinas, quemoquinas y factores de crecimiento por

parte de los distintos tipos celulares en respuesta a la infección.

c) Estudiar la interacción de los osteoblastos y fibroblastos sinoviales, con las

células inmunes. En particular evaluar si factores producidos por cada tipo celular

en respuesta a la infección induce la producción de MMPs en el otro tipo celular.

2) Investigar la capacidad de B. abortus de inducir la diferenciación de precursores de

osteoclastos a osteoclastos maduros con la capacidad de resorber matriz ósea, y

determinar los factores involucrados en dicho proceso.

3) Investigar si la infección con B. abortus inhibe la diferenciación y función de los

osteoblastos, y evaluar el rol de los macrófagos en dichos procesos.

Una hipótesis secundaria que será examinada es que las lipoproteínas de B. abortus,

y no su LPS, pueden inducir, parcial o totalmente, los efectos inflamatorios producidos por

la bacteria.


CAPÍTULO I “Rol de las metaloproteasas de matriz en la patogénesis de la brucelosis osteoarticular” Introducción

Las metaloproteasas de matriz (MMPs) son una familia de endopeptidasas

dependientes de Zn+2 y Ca+2, que degradan proteínas de la matriz extracelular. Hasta el

momento se conocen al menos 23 MMPs en humanos, las cuales se encuentran

clasificadas según su especificidad de sustrato en colagensas (MMP-1, -8, -13 y -18),

gelatinasas (MMP-2 y MMP-9), estromelicinas (MMP-3, -10, -11 y -17), matrilicinas (MMP-

7 y -26), MMPs de unión a membrana (MT-MMPs, MMP-14, -15, -16, -17, -24 y -25) que

pueden degradar gelatina, fibronectina y laminina, y otras MMPs que no pueden ser

incluidas en ninguna de las clases mencionadas [215-219]. Las MMPs participan en

procesos fisiológicos normales que requieren la remodelación de la matriz extracelular tal

como el desarrollo embrionario, la angiogénesis, cicatrización de heridas, migración

celular, etc. Sin embargo, en condiciones patológicas, han sido asociadas al desarrollo de

enfermedades que involucran la destrucción del tejido conectivo tales como artritis,

invasión tumoral, progresión de varias enfermedades infecciosas y aterosclerosis [215,

220, 221]. Debido a su capacidad destructiva, la actividad de las MMPs se encuentra

estrictamente regulada en diferentes niveles. Su expresión es controlada a nivel

transcripcional por citoquinas, factores de crecimiento y hormonas. Son secretadas como

proenzimas que requieren ser clivadas para su activación y además poseen una marcada

regulación por parte de inhibidores endógenos, los inhibidores tisulares de

metaloproteasas (TIMPs). Los TIMPs son una familia de 4 proteínas secretadas (TIMP-1 a

TIMP-4) que se unen no covalentemente al dominio catalítico de las MMPs inhibiendo su

actividad [222]. Por lo tanto, la capacidad de degradar matriz depende del balance entre

los niveles de MMPs y la disponibilidad de los TIMPs extracelulares [223]. El balance entre

las MMPs y los TIMPs es un determinante crítico de la integridad y función de la matriz

extracelular, alteraciones en la relación MMP/TIMP pueden contribuir al desarrollo de

condiciones patológicas.

En numerosas enfermedades osteoarticulares incluyendo artritis reumatoidea,

osteoartritis y espondiloartritis se han detectado niveles incrementados de MMPs en forma

local [224-227]. También se ha demostrado la contribución de las MMPs en el desarrollo

de varias artritis infecciosas como en la enfermedad de Lyme, en periodontitis causadas

por diferentes bacterias y en artritis causadas por Staphylococcus aureus [228-230].


Las metaloproteasas MMP-2 y MMP-9 son relevantes en las enfermedades

osteoarticulares dado que son capaces de degradar varios tipos de colágeno incluyendo

colágeno tipo IV (presente en la membrana basal), colágeno tipo V (presente en el hueso),

colágeno tipo II (presente en el cartílago) y colágeno fibrilar desnaturalizado (gelatina)

[217, 224]. Los monocitos y neutrófilos activados secretan altas cantidades de MMP-9

frente a diferentes estímulos bacterianos y citoquinas proinflamatorias como TNF-α e IL-1β

[185, 186, 231]. Por otro lado, también se ha demostrado que tanto los osteoblastos

(células del hueso que sintetizan la matriz ósea) como los fibroblastos sinoviales (células

que forman la membrana sinovial de las articulaciones) son capaces de secretar MMP-2

[183, 184].

Como se mencionó anteriormente la complicación osteoarticular es la presentación

más frecuente de las formas localizadas de la brucelosis. La presencia de infiltrado

inflamatorio [209, 210], junto con la detección de la bacteria en el fluido sinovial de

pacientes con brucelosis articular [207, 208], sugiere que Brucella estimula una robusta

respuesta inflamatoria local. Aunque el LPS de Brucella se encuentra desprovisto de

actividad proinflamatoria [98], se ha demostrado que la producción de citoquinas

proinflamatorias por varios tipos celulares se debe principalmente a las lipoproteínas de

Brucella [77, 108, 109, 232, 233]. Esta inflamación excesiva observada en los pacientes

con brucelosis podría causar daño en el hueso y en las articulaciones, en parte debido a

un incremento en los niveles de MMPs.

En este contexto nos propusimos investigar la participación de los osteoblastos y

fibroblastos sinoviales humanos, y su interacción con las células inmunes (monocitos y

neutrófilos) en la inducción de MMPs que podrían ser relevantes en la patogénesis

osteoarticular de la brucelosis. Nos focalizamos en el rol de las citoquinas proinflamatorias

y componentes bacterianos, principalmente las lipoproteínas, como mediadores del daño

óseo y articular a través de la inducción de las MMPs.


Capítulo I

Materiales y métodos

1. Cultivo de bacterias

Brucella abortus S2308 fue crecida durante 18 hs. en 10 ml del medio tripteína de

soja en agitación constante de 150 rpm a 37°C. Las bacterias se centrifugaron por 15 min

a 6000g a 4°C y fueron lavadas dos veces en 10 ml de buffer fosfato salino (PBS). La

concentración de bacterias en cultivo fue estimada comparando la densidad óptica a

600nm con una curva estándar. Para preparar los inóculos, los cultivos fueron diluidos en

PBS a la concentración deseada en base a la densidad óptica medida, pero la

concentración precisa fue determinada por recuento de unidades formadoras de colonia

(UFC) en placas de agar tripteína de soja (TSA). Para obtener B. abortus muerta por calor

(HKBA), las bacterias fueron lavadas 5 veces con PBS por 10 min. cada lavado, fueron

calentadas a 70°C por 20 min., divididas en alícuotas y guardadas a -70°C hasta ser

utilizadas. La ausencia de viabilidad de B. abortus se comprobó mediante la ausencia de

crecimiento bacteriano en placas de agar tripteína de soja. Todas las manipulaciones de

las bacterias viables fueron realizadas en instalaciones con un nivel de bioseguridad 3,

localizados en el Centro Nacional de Referencia del SIDA, Facultad de Medicina,

Universidad de Buenos Aires, gracias a un convenio de colaboración establecido con el Dr.

H. Salomón.

2. Cultivo celular

La línea celular inmortalizada de osteoblastos fetales humanos hFOB 1.19 (en

adelante abreviada hFOB) fue obtenida de American Type Culture Collection (ATCC).

Estas células tienen la capacidad de diferenciarse a osteoblastos maduros que expresan el

fenotipo normal de osteoblastos [234]. La línea celular hFOB fue cultivada como una

monocapa en DMEM/F-12 (Gibco) suplementado con 2 mM de L-glutamina, 10% de suero

fetal bovino (SFB, Gibco), 100 U de penicilina/ml, y 100 µg de streptomicina/ml.

La línea celular monocítica humana THP-1 fue cultivada en RPMI 1640 (Gibco)

suplementado con SFB, aminoácidos y antibióticos como se describió en el párrafo

anterior.

Los neutrófilos humanos fueron aislados de sangre venosa de voluntarios humanos

sanos mediante centrifugación en un gradiente de Ficoll-Paque (GE Healthcare), seguido

de la sedimentación de los eritrocitos en dextran al 6% y una lisis hipotónica con agua

destilada durante 30 segundos. Los neutrófilos fueron recolectados, lavados dos veces con

PBS estéril, y resuspendidos a una concentración de 1x106 células/ml en RPMI 1640


suplementado con 5% de SFB, 1 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de

estreptomicina. La viabilidad celular fue del 98%, determinada por la tinción con Azul

tripán. La pureza de la preparación final de los neutrófilos fue del 95%, evaluada mediante

examen morfológico luego de una tinción con Giemsa y mediante análisis de los patrones

de dispersión de la luz por citometría de flujo.

La línea celular inmortalizada de fibroblastos sinoviales SW982 fue obtenida de

ATCC. El fenotipo de las células SW982 ha sido demostrado por la expresión de

vimentina, un marcador de fibroblastos [235, 236]. Esta línea celular ha sido utilizada para

estudiar la expresión de citoquinas inflamatorias y MMPs por los fibroblastos sinoviales en

respuesta a diferentes estímulos [235, 237, 238]. Las células fueron cultivadas en

monocapa en DMEM (Gibco) suplementado con 2 mM L-glutamina, 10% de SFB, 100 U/ml

de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina.

Todas las líneas celulares fueron cultivadas en una atmósfera de 5% de CO2 a 37ºC.

3. Infección celular

Las células fueron cultivadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5x105

células/ml en medio completo sin el agregado de antibióticos y fueron infectadas con B.

abortus S2308 a las multiplicidades de infección (MOIs) 1, 10, 25, 50 y 100 en el caso de

los monocitos, y 100, 250, 500 y 1000 en el caso de los osteoblastos, fibroblastos

sinoviales y neutrófilos. Luego de haber dispensado la suspensión de bacterias, las placas

fueron centrifugadas durante 10 min. a 1000 X g y luego incubadas por 2 hs. a 37ºC en

una atmósfera con 5% de CO2. Las células fueron lavadas con medio para remover las

bacterias extracelulares y luego incubadas en medio sin SFB y suplementado con

albúmina sérica bovina (BSA) 0,01%, con 100 µg/ml de gentamicina y 50 µg/ml de

estreptomicina para eliminar las bacterias extracelulares (medio completo). Para

monitorear la replicación intracelular de B. abortus, las células infectadas fueron lavadas y

lisadas a varios intervalos p.i. con 0,1% (vol/vol) de Tritón X-100. El número de bacterias

viables intracelulares (UFC/ml) fue determinado mediante el recuento de UFC de

diluciones seriadas al décimo en placas de TSA.

Los sobrenadantes de los cultivos infectados fueron recolectados a las 24 hs.

postinfección (p.i.) para ser utilizados como medio condicionado y a las 24 o 48 hs. p.i.

según el caso, para medir la producción de las MMPs y las citoquinas. Solo en el caso de

los neutrófilos las MMPs se midieron a las 2 hs. p.i.

4. Zimografía


La actividad gelatinolítica fue evaluada mediante el método de Hibbs et. al. [239].

Brevemente, 20l de medio condicionado mezclado con 5 ul de buffer de siembra (0,25 M

Tris [pH 6,8], 50% de glicerol, 5% de dodecil sulfato de sodio [SDS], y Azul de Bromofenol)

fueron sembrados en cada calle de un gel de SDS-PAGE al 10% conteniendo 1 mg de

gelatina (Sigma-Aldrich)/ml. Luego de la electroforesis, los geles fueron lavados con 50

mM Tris-HCl (pH 7,5)- 2,5% Tritón X-100 durante 30 min. y con 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) -

2,5% de Tritón X-100 - 10mM CaCl2 – 200 mM NaCl durante 48 hs. a 37ºC. Este paso de

desnaturalización/renaturalización promueve la actividad de MMP sin el clivaje proteolítico

de la pro-MMPs. La actividad gelatinolítica fue visualizada mediante la tinción de los geles

con Azul de Coomassie. Las bandas sin teñir indicaron la presencia de actividad

gelatinolítica, y su posición determinó el peso molecular de las enzimas involucradas.

La identidad de la MMP candidata fue confirmada mediante un ensayo de ELISA

como se explica más adelante.

5. Medición de los niveles de MMP-9 y MMP-2

MMP-2 y MMP-9 presentes en el medio condicionado fueron cuantificadas mediante

ELISA de sándwich utilizando anticuerpos monoclonales según las instrucciones del

productor (R&D Systems).

6. Ensayo de migración

La migración celular fue evaluada utilizando placas de microquimiotaxis de 96

pocillos con filtros de policarbonato de un diámetro de poro de 5 M (Corning, NY). Los

monocitos (células THP-1) o los neutrófilos fueron depositados en el pocillo superior de las

cámaras (106 células /ml) y los estímulos indicados (diluciones de los sobrenadantes de

cultivo de los osteoblastos hFOB o de los fibroblastos sinoviales SW982 infectados) fueron

depositados en los pocillos inferiores. La migración fue determinada contando el número

de monocitos o neutrófilos que alcanzaron el pocillo inferior luego de 2 hs. La migración

hacia el N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (fMLP, 10-7 M) (Sigma-Aldrich) se utilizó

como control positivo. El número de células que migraron se expresó como el índice

quimiotáctico: el número de células que migraron en presencia del medio condicionado/ el

número de células que migraron en presencia de medio solo.

7. Estimulación con medio condicionado

Los sobrenadantes de cultivo de las células infectadas (MOI 100) fueron recolectados

a las 24 hs. p.i., esterilizados por filtración a través de un filtro de nitrocelulosa con un


tamaño de poro de 0,22 µm, y utilizados para estimular células. Los sobrenadantes fueron

utilizados diluidos 1/2, 1/5 y 1/10 en medio completo. Luego de 48 hs. los sobrenadantes

de los cultivos estimulados fueron recolectados para medir MMPs.

8. Medición de la concentración de citoquinas

Se midieron las citoquinas humanas IL-1β, IL-6, IL-8, MCP-1, TNF-α y el factor

estimulante de colonia de granulocitos y monocitos (GM-CSF) en el sobrenadante de

cultivo mediante ELISA sandwich, usando anticuerpos monoclonales específicos según las

instrucciones del productor (BD Pharmingen).

Las citoquinas de ratón IL-1β, IL-6, MCP-1 (BD Pharmingen) y KC (quemoquina

quimioatractante de neutrófilos) fueron cuantificadas por ELISA (R&D Systems Inc.) en los

sobrenadantes de los homogenados de tejido de las rodillas de los ratones inoculados con

los antígenos de B. abortus.

9. Neutralización de las citoquinas y bloqueo de sus receptores

Los ensayos de neutralización y bloqueo fueron llevados a cabo con un anticuerpo

bloqueante contra el receptor de TNF I humano (anti-TNFRI, clon 16805, R&D Systems) o

su control de isotipo (clon 11711, R&D Systems), un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α

(clon Mab1, BD Biosciences) o su control de isotipo (107.3, BD Biosciences), un anticuerpo

neutralizante anti-GM-CSF (clon BVD2-23B6, BD Biosciences) o su control de isotipo (clon

R65-95, BD Biosciences), un anticuerpo neutralizante anti-IL-6 (clon MQ2-13A5, BD

Biosciences) o su control de isotipo, y el antagonista natural IL-1Ra (R&D Systems).

En los experimentos de bloqueo, las células fueron preincubadas con los anticuerpos

anti-TNFRI (25 ug/ml) o IL-1Ra (1 ug/ml) durante 1 h. a 37ºC antes de la estimulación con

los medios condicionados o con los antígenos de Brucella. En los experimentos en los que

se utilizaron los anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α (20 ug/ml), anti-GM-CSF (0,3 ug/ml;

1, 2 o 4 ug/ml) y anti-IL-6 (5 ng/ml), el medio condicionado fue preincubado con el

correspondiente anticuerpo (o el control de isotipo) durante 1 h. a 37ºC antes de ser

utilizados. En todos los casos se utilizó el control de isotipo correspondiente. Como control

positivo se utilizó TNF-α recombinante humano (TNFrh) (BD Biosciences) a una

concentración de 2 ng/ml.

10. Actividad gelatinolítica en condiciones nativas

La actividad gelatinolítica en los sobrenadantes de cultivo en condiciones nativas fue

medida mediante el kit EnzChek gelatinasa/colagenasa (Invitrogen) según las


instrucciones del fabricante. El kit contiene gelatina DQ, una gelatina conjugada con altas

concentraciones de fluoresceína que determinan que la fluorescencia se encuentre

apagada. Cuando este sustrato es digerido por gelatinasas o colagenasas da como

resultado la aparición de péptidos fluorescentes, y el incremento de la fluorescencia es

proporcional a la actividad proteolítica. La colagenasa purificada de Clostridium

histolyticum que provee el kit, sirvió como una enzima control. Las placas fueron leídas en

un lector de fluorescencia (Victor3; Perkin-Elmer,Waltham, MA).

11. Clonado, expresión y purificación de la proteína recombinante Omp19 de B. abortus

La secuencia completa de la proteína Omp19 fue clonada en el vector pET22b+

(Novagen). Se diseñaron oligonucleótidos específicos conteniendo los sitios de restricción

para las enzimas NdeI y XhoI en el extremo 5’, de acuerdo a las secuencias publicadas

previamente por Tibor y col. [147, 148]. Los oligonucleótidos utilizados fueron los

siguientes:

sentido 5’GTTGCCCATATGGCGTCAAAGAA3’

antisentido 5’AAACTCGAGGCGCGACAGCGTCAC3’

Para obtener la versión no lipidada de la proteína se utilizó un oligonucleótido sentido

que amplifica la región 3’ del gen sin el extremo aminoterminal correspondiente a la

secuencia del péptido señal y la cisteína aminoterminal:

sentido 5’CTGGCCATATGCAGAGCTCCCG3’

En la reacción de PCR se utilizó como templado el ADN genómico de B. abortus 544.

El producto de la reacción de ligación se utilizó para transformar bacterias competentes de

la cepa JM109 y se purificó el ADN plasmídico con un kit comercial (Promega). Las

construcciones así obtenidas (pET/L-Omp19, pET/U-Omp19) conteniendo el gen con el

agregado de una cola de histidina-6X en el extremo carboxiterminal se utilizaron para

transformar bacterias competentes E. coli BL21 (DE3) en las cuales se expresaron las

proteínas recombinantes luego de la inducción con IPTG (1mM). La proteína recombinante

lipidada Omp-19 (L-Omp-19) fue aislada de la membrana bacteriana por extracción

selectiva por separación de fases con Tritón X-114 al 2% [240]. Esta preparación fue

purificada por cromatografía de afinidad con una columna de níquel-agarosa (Ni-NTA)

(Qiagen).

La proteína no lipidada (U-Omp19) fue extraída de la fracción citosólica por

sonicación. Posteriormente, las proteínas recombinantes fueron adsorbidas con

Sepharosa-Polimixina B (Sigma Aldrich) para eliminar la contaminación con LPS de E. coli.

La concentración de LPS en las preparaciones de proteínas recombinantes fue menor a

0,25 unidades de endotoxina por µg de proteína según se determinó por el ensayo de

“Limulus Amebocyte” (Associates of Cape Cod). La concentración proteica se determinó


por el método de ácido bicinconínico (Pierce) utilizando seroalbúmina bovina como

estándar. La proteínas purificadas fueron alicuotadas y conservadas a -70°C hasta el

momento de ser utilizadas. La pureza de las proteínas recombinantes se verificó por SDS-

PAGE seguido de tinción argéntica, el tamaño molecular se corroboró por comparación

con marcadores de peso molecular. La identidad de las proteínas se confirmó por

“Western blot” con un anticuerpo monoclonal anti- Omp19 (5C10A8). Tal como fue

descripto en nuestro laboratorio [109].

12. Lipoproteínas y LPS

El LPS de B. abortus 2308 y el de E. coli O111 K58H2 fueron cedidos gentilmente

por el Dr. I. Moriyón (Universidad de Navarra, Pamplona, España). La calidad y pureza de

estas preparaciones se encuentran descriptas en la literatura [241]. El LPS fue solubilizado

en agua por sonicación en las concentraciones apropiadas y autoclavado previo a su uso.

El lipohexapéptido sintético Pam3Cys [tripalmitoyl-S-glyceryl-Cys-Ser-Lys4-OH] fue

obtenido de Boehringer Mannheim.

13. Estimulación con los antígenos de B. abortus y los agonistas de los TLRs

Las células (5x105 células/pocillo) fueron incubadas con LPS de E. coli (100 ng/ml),

LPS de B. abortus (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml), HKBA (1x106 a 1x109 bacterias/ml),

L-Omp19 (10 a 1000 ng/ml) o S-Omp19 (1000 ng/ml) en un volumen final de 0.5 ml. Los

cultivos fueron incubados durante 24 o 48 hs., y luego se midió la producción de citoquinas

y MMPs en los sobrenadantes.

14. Bloqueo de los receptores de tipo Toll (TLRs)

Las células fueron incubadas con 20 µg/ml de un anticuerpo bloqueante humano anti-

TLR2 (clon TL2.1), anti-TLR4 (clon HTA125), o un control de isotipo IgG2a (eBioscience)

durante 1 h a 37ºC y luego incubadas con LPS de E. coli (100 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml),

HKBA (108 bacterias/ml), o L-Omp19 (1000 ng/ml) en un volumen final de 0,5 ml. Las

células no tratadas fueron incubadas en paralelo con U-Omp19 (1000 ng/ml) y LPS de B.

abortus (1000 ng/ml) como controles. Los cultivos fueron incubados durante 24 hs. y los

sobrenadantes fueron utilizados para evaluar la producción de citoquinas y MMPs.

15. Evaluación de la reacción inflamatoria articular en el modelo murino


Los ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad fueron anestesiados con

clorhidrato de ketamina (150 mg/kg) y xilazina (15 mg/kg), y luego inoculados en forma

intra-articular en las rodillas con 50ul de HKBA (1x106 UFC), L-Omp19 (500ng), LPS de E.

coli (500ng) como control positivo o con el vehículo PBS. Los animales fueron sacrificados

5 días después de la inoculación. Para determinar los niveles de citoquinas y MMPs en las

articulaciones, las rodillas fueron separadas removiendo la piel y cortando justo por encima

y por debajo de la articulación y fueron ubicados inmediatamente en 1 ml de PBS frío. La

extracción de las articulaciones fue realizada utilizando un homogeneizador de tejido. Los

homogenados fueron centrifugados a 2000 x g durante 20 min. a 4ºC, y los sobrenadantes

fueron utilizados para la determinación de citoquinas y MMPs. En otro grupo de ratones las

rodillas fueron fijadas durante 4 días con paraformaldehído 4% y decalcificadas con EDTA

10% en 1mM Tris-HCl (pH 7,4) durante 4 semanas a 4ºC. Los especímenes fueron

incluidos en parafina [242]. Se realizaron cortes para generar secciones de 5 micrómetros

de espesor las cuales fueron teñidas con hematoxilina y eosina.

16. Determinación de marcadores inflamatorios en las muestras de líquido

sinovial

Se determinó la producción de citoquinas y MMPs en dos muestras de líquido

sinovial provenientes de un paciente con bursitis prepatelar debido a una infección por B.

abortus. Una fue tomada al momento de la presentación de la bursitis y la otra 3 meses

más tarde. Para efectuar una comparación se analizaron también 5 muestras de líquido

sinovial de pacientes con artritis reumatoidea y una muestra de un paciente con artritis

séptica de la rodilla debido a una infección con S. aureus.

Las citoquinas humanas IL-1β, IL-8, MCP-1, TNF-α e INF-γ se midieron mediante

ELISA sandwich, usando anticuerpos monoclonales específicos según las instrucciones

del productor (BD Pharmingen). Las MMPs fueron detectadas por zimografía como se

describió en la sección 4.

17. Análisis estadístico

Los resultados fueron analizados mediante el análisis de varianza de un factor

(ANOVA) seguido del test de Tukey, usando el software GraphPad Prism 4.0. Los datos

están presentados como la media un desvío estándar. Los datos mostrados

corresponden a un experimento representativo de 5 experimentos realizados.


Resultados

La localización osteoarticular es la más común en la brucelosis activa en el hombre.

Nuestra hipótesis es que B. abortus puede causar inflamación osteoarticular causando

destrucción ósea y articular mediante diversos mecanismos. En el presente capítulo se

estudió la producción de las metaloproteasas de matriz (MMPs) por distintos tipos

celulares y su contribución al daño óseo.

1. Osteoblastos

Los osteoblastos son células óseas especializadas encargadas de sintetizar los

componentes minerales y orgánicos de la matriz del hueso, y están implicadas en la

homeostasis ósea. En esta sección se estudió el rol de los osteoblastos en la producción

de MMPs y su interacción con las células inmunes que podrían ser atraídas durante la

infección por Brucella.

1.1. B. abortus invade y se replica intracelularmente en la línea celular de osteoblastos humanos hFOB.

En primer lugar evaluamos la capacidad de B. abortus de invadir y replicarse en la

línea celular de osteoblastos humanos hFOB. Para ello las células fueron infectadas con B.

abortus 2308 tal como se detalla en la sección 3 de materiales y métodos. Las infecciones

se realizaron a distintas MOIs. La magnitud de la infección, determinada mediante el

recuento de las UFC intracelulares, fue directamente proporcional a la MOI utilizada

(Figura 1).


1.2. La infección con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α o IL-1β, en osteoblastos.

Como se muestra en la Figura 2, la infección de los osteoblastos indujo la secreción

significativa de GM-CSF, MCP-1 e IL-8 en forma dependiente de la MOI utilizada (P <

0,05). Por el contrario la infección no indujo niveles detectables en la secreción de TNF-α

ni de IL-1β (no mostrado).

Figura 1. B .abortus infecta y se replica en la línea celular de osteoblastos humanos hFOB.

0 20 40 60 80102

103

104

105

106

MOI 1000MOI 500MOI 250MOI 100

Tiempo (h)

UFC

/ml

Los osteoblastos humanos de la línea celular hFOB fueron infectados con B. abortus a diferentes MOIs y luego de dos horas fueron incubados con antibiótico para eliminar a las bacterias extracelulares. Los lisados celulares obtenidos a diferentes tiempos post-infección fueron plaqueados en TSA para determinar las UFC intracelulares.


1.3. B. abortus induce la producción de MMP-2 en osteoblastos a través de la secreción de GM-CSF.

Para determinar si B. abortus podía inducir la producción de MMPs por parte de los

osteoblastos, se analizó la secreción de MMPs por zimografía en los sobrenadantes de

cultivo de las células infectadas (usando como matriz gelatina) y su presencia fue

confirmada y cuantificada por ELISA. Como se muestra en la Figura 3 A y B, la infección

con B. abortus indujo la secreción de MMP-2 de un modo dependiente de la MOI utilizada

(P < 0,01).

Debido a que ha sido demostrado que las citoquinas proinflamatorias y los factores

de crecimiento pueden estimular la secreción de MMPs por diferentes tipos celulares [183,

185, 231, 243-245], decidimos analizar si GM-CSF producido por los osteoblastos

infectados estaba implicado en la inducción de MMP-2. Para llevar a cabo este objetivo,

los osteoblastos fueron infectados en presencia de un anticuerpo neutralizante anti-GM-

CSF. La neutralización de GM-CSF redujo significativamente la capacidad de B. abortus

de estimular la producción de MMP-2, mientras que el control de isotipo no tuvo ningún

efecto (Figura 3 C).

Figura 2. La infección de los osteoblastos con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8.

GM-CSF, IL-8 y MCP-1 fueron cuantificadas en el sobrenadante de los osteoblastos infectados con B. abortus a diferentes MOIs a las 48 h p.i. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control (sin infectar).

Control 100 250 500 10000

350

700

*

**

******

GM

-CSF

(pg/

ml)

Control 100 250 5000

15000

30000

***

***

***

IL-8

(pg/

ml)

Control 100 250 500 10000

375

750

**

***

******

MC

P-1

(pg/

ml)


En conjunto estos resultados indican que B. abortus es capaz de infectar

osteoblastos humanos e inducir la producción de GM-CSF que actúa sobre las mismas

células induciendo la producción de MMP-2 (Esquema 1).

C

B

Control 100 250 500 1000

Sin

trat

ar

a-G

M-C

SF

Isot

ipo

Sin

trat

ar

a-G

M-C

SF

Isot

ipo

Control MOI 100

Sin

trat

ar

a-G

M-C

SF

Isot

ipo

Sin

trat

ar

a-G

M-C

SF

Isot

ipo

Control MOI 100

La producción de MMP-2 fue determinada por ELISA (A) y por zimografía (B) en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus a las 48 hs. p.i.. **P<0,01 versus el control sin infectar. Inhibición de la secreción de MMP-2 en osteoblastos infectados con B. abortus mediante el agregado de anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF o un control de isotipo. La producción de MMP-2 fue determinada por zimografía (C).

Control 100 250 500 10000

40

80

**

** **

**

MM

P-2

(ng/

ml)

A

Figura 3. B. abortus induce la secreción de MMP-2 por osteoblastos a través de la inducción de GM-CSF.


1.4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos.

Como se mencionó en la sección 1.2. los osteoblastos secretan MCP-1 e IL-8 en

respuesta a la infección con B. abortus. Dado que estas son moléculas quimioatractantes

de monocitos y neutrófilos respectivamente, decidimos evaluar si los sobrenadantes de los

osteoblastos infectados eran capaces de inducir la migración de estas células. Para ello,

realizamos un ensayo de migración en el cual la línea celular de monocitos humanos THP-

1 o neutrófilos purificados de sangre periférica se sembraron en el compartimiento superior

de una placa de quimiotaxis mientras que en el inferior se ubicaron diferentes diluciones de

los sobrenadantes de los osteoblastos previamente infectados con B. abortus o no

infectados como control. La migración fue analizada contando la cantidad de células que

alcanzaron el compartimiento inferior luego de una incubación de 2 hs. Como se observa

en la Figura 4 A y B la migración de los monocitos y neutrófilos en presencia de los

sobrenadantes de los osteoblastos infectados y el control positivo N-formil-L-metionil-L-

leucilfenilalanina (fMLP) fue significativamente superior (P < 0,001) que la migración basal.

Por otro lado, los sobrenadantes de los osteoblastos no infectados no indujeron niveles

significativos de migración respecto del basal. Estos resultados indicarían que las

quemoquinas producidas por los osteoblastos infectados jugarían un rol muy importante en

el reclutamiento de los monocitos y de los neutrófilos al sitio de infección y por lo tanto en

la inflamación local.

Esquema 1. Esquema de la producción de MMP-2 por los osteoblastos durante la infección con B. abortus

B.abortus

GM-CSF

MMP-2

Osteoblasto

B.abortus

GM-CSF

MMP-2

Osteoblasto

La infección de los osteoblastos con B. abortus induce la producción de GM-CSF, y esta citoquina actúa sobre las mismas células induciendo la producción de MMP-2.


2. Osteoblastos y su interacción con monocitos.

2.1. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos.

Debido a la capacidad de los osteoblastos infectados con B. abortus de secretar

MCP-1 que atraería a los monocitos al sitio de infección, decidimos evaluar si la infección

de los monocitos con B. abortus podía inducir la producción de MMPs y de este modo

contribuir al daño óseo. Como se muestra en la Figura 5 A y B la infección de los

monocitos con B. abortus indujo la secreción de altos niveles de MMP-9 dependiendo de la

MOI utilizada (P < 0,01).

Figura 4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados por B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos.

A B

fMLP 1 1/2 1/5 10

7

14

SC-hFOB InfectadosSC

-hFO

BN

o in

fect

ados

***

IQ m

onoc

itos

Se determinó la migración de los monocitos humanos (línea celular THP-1) (A) y de los neutrófilos purificados de sangre periférica (B) estimulados con diferentes cantidades (puro y diluciones 1/2 y 1/5) de los sobrenadantes de cultivo de los osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus o no infectados (puro), en placas de microquimiotaxis. Las células que migraron fueron contadas luego de 2 h. Los resultados están expresados como el índice quimiotáctico (IQ: número de células que migraron al medio condicionado dividido el numero de células que migraron al medio de cultivo). La migración inducida por fMLP se usó como control positivo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control tratado con sobrenadantes de las células sin infectar.

fMLP 1 1/2 1/5 10

4

8

SC-hFOB Infectados

SC-h

FN

o in

fect

ados

***

***

**

IQ n

eutr

ófilo

s


2.2. Los sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos debido principalmente a TNF-α.

Debido a la capacidad de los osteoblastos infectados de producir factores

quimioatractantes que potencialmente podrían atraer a los monocitos al sitio de infección,

decidimos entonces estudiar la interacción entre los osteoblastos y los monocitos frente a

la infección con B. abortus. Para ello analizamos el efecto de las citoquinas secretadas por

los monocitos infectados sobre la producción de MMPs por los osteoblastos y viceversa.

Para cumplir con este objetivo, se recolectaron los sobrenadantes de cultivo de los

osteoblastos y de los monocitos infectados con B. abortus a las 24 hs. p.i., los que

posteriormente se utilizaron para estimular a los monocitos y a los osteoblastos

respectivamente.

El estímulo de los osteoblastos con los sobrenadantes de los monocitos infectados

con B. abortus en diferentes proporciones (1/2, 1/5 y 1/10) indujo la secreción de niveles

significativos de MMP-2 (P < 0,01), en una forma dosis dependiente (Figura 6 A y B). No

se observó ningún efecto cuando estas células se estimularon con los sobrenadantes de

los monocitos no infectados. En estudios previos realizados en nuestro laboratorio fue

demostrado que la infección con B. abortus induce la producción de citoquinas

proinflamatorias en monocitos [101], otros autores demostraron que TNF-α e IL-1β inducen

Figura 5. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de monocitos.

Control 1 10 25 50 1000

150

300

*****

***

***

***

MM

P-9

(ng/

ml)

A

Control 1 10 25 50 100Control 1 10 25 50 100

B

La producción de MMP-9 fue determinada por ELISA en los sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus a las 48 h p.i. (A) y por zimografía (B). **, P<0.01; ***, P<0.001 versus el control (sin infectar).


la producción de MMPs en diferentes tipos celulares [246-248]. Por lo tanto, se midieron

los niveles de estas citoquinas en los sobrenadantes de células THP-1 infectadas con B.

abortus a una MOI de 100 (4500 ± 240 pg/ml para TNF-α y; 72 ± 6 pg/ml para Il-1β). Para

determinar si dichos niveles de TNF-α eran suficientes para estimular la secreción de

MMP-2 por parte de los osteoblastos, estas células fueron estimuladas con los

sobrenadantes de los monocitos infectados preincubados o no durante 1 h. con

anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo. Como se muestra en la

Figura 6 C la neutralización de TNF-α redujo significativamente (P < 0,01) la capacidad de

los sobrenadantes de monocitos infectados de estimular la producción de MMP-2 por parte

de los osteoblastos, mientras que el control de isotipo y los sobrenadantes provenientes de

los monocitos no infectados no tuvieron ningún efecto. En contraste, el bloqueo del

receptor de IL-1β mediante la preincubación de los osteoblastos con el antagonista natural

IL-1Ra no afectó la secreción de MMP-2 inducida por los sobrenadantes (no mostrado).


Estos resultados indican que TNF-α presente en el sobrenadante de los monocitos

infectados con B. abortus está implicado en la inducción de la secreción de MMP-2 por

parte de los osteoblastos (Esquema 2).

Figura 6. Los sobrenadantes de los monocitos infectados por B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos debido

principalmente a TNF-α.

A B

C

La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes de los monocitos (SC-THP-1) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). **P<0,01; ***P<0,001 versus los osteoblastos tratados con SC-THP-1 no infectados. En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los sobrenadantes de monocitos infectados con B. abortus con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo durante 1 h, antes de agregarlos a los osteoblastos (C).

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-THP-1 InfectadosSC

-TH

P-1

No

infe

ctad

os1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-THP-1 InfectadosSC

-TH

P-1

No

infe

ctad

os

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

Fα

a-TN

Fα

Isot

ipo

SC-T

HP-

1 N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol

1/2 1/5

SC-THP-1 Infectados

1/2

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

Fα

a-TN

Fα

Isot

ipo

SC-T

HP-

1 N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol

1/2 1/5

SC-THP-1 Infectados

1/2

1/2 1/5 1/10 1/2 Control0

20

40

SC-THP-1 Infectados

***

**

**

SC-T

HP-

1N

o in

fect

ados

MM

P-2

(ng/

ml)


2.3. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los monocitos, y este efecto está mediado principalmente por GM-CSF.

A continuación decidimos estudiar el proceso inverso, el efecto de los sobrenadantes

de los osteoblastos infectados con B. abortus sobre los monocitos. Demostramos que los

sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción

significativa de MMP-9 por parte de los monocitos, en forma dosis dependiente (Figura 7 A). Los sobrenadantes de los osteoblastos no infectados no tuvieron ningún efecto.

Nosotros hemos demostrado que GM-CSF es producido por los osteoblastos en

respuesta a la infección con B. abortus (Figura 2). Por otro lado, GM-CSF fue el principal

factor involucrado en la inducción de MMP-9 por parte de monocitos en otros modelos

[231, 247]. Por lo tanto, decidimos evaluar si GM-CSF presente en el sobrenadante de los

osteoblastos infectados estaba involucrado en la inducción de la producción de MMP-9 por

parte de los monocitos, para ello estos últimos fueron estimulados con los sobrenadantes

de los osteoblastos infectados en presencia de un anticuerpo monoclonal neutralizante

anti-GM-CSF. Nuestros resultados demostraron que la neutralización de GM-CSF redujo

significativamente (P<0,05) la habilidad de los sobrenadantes de los osteoblastos

infectados de inducir la expresión de MMP-9 en monocitos (Figura 7 B y C). El control de

isotipo no tuvo ningún efecto.

Esquema 2. Esquema de la producción de MMP-2 por osteoblastos durante su interacción con monocitos infectados por Brucella.

Modelo propuesto para la producción de MMP-2 por osteoblastos durante su interacción con monocitos infectados por Brucella. Los osteoblastos producen MMP-2, principalmente en respuesta a TNF-α secretado por monocitos infectados con B. abortus.

TNF-α

Monocito

B. abortus

MMP-2

Osteoblasto

TNF-α

Monocito

B. abortus

MMP-2

Osteoblasto


Figura 7. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados por B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de monocitos, y este efecto está

mediado principalmente por GM-CSF.

1/2 1/5 1/10 1/2 Co

ntro

lSC-hFOB Infectados

SC-h

FOB

No

infe

ctad

os1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-hFOB Infectados

SC-h

FOB

No

infe

ctad

os

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-G

M-C

SF

a-G

M-C

SF

Isot

ipo

SC-h

FOB

No

infe

ctad

os

Sin

trat

ar

Cont

rol

1/2 1/5

SC-hFOB Infectados

1/2

Sin

mue

stra

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-G

M-C

SF

a-G

M-C

SF

Isot

ipo

SC-h

FOB

No

infe

ctad

os

Sin

trat

ar

Cont

rol

1/2 1/5

SC-hFOB Infectados

1/2

Sin

mue

stra

0

55

110Sin tratara-GM-CSFIsotipo

SC-hFOB Infectados

SC-h

FOB

No

infe

ctad

os Cont

rol

1/2 1/5 1/10 1/2

* * *M

MP-

9 (n

g/m

l)

A B

C

La producción de MMP-9 fue determinada en el sobrenadante de los monocitos estimulados con sobrenadantes de osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 y 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por zimografía (A). En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF o un control de isotipo durante 1 h, antes de agregarlos a los monocitos, y se determinó la producción de MMP-9 por ELISA (B) y por zimografía (C). *P<0,05 versus los monocitos estimulados con SC-hFOB infectados sin el tratamiento con anti-GM-CSF (sin tratar).


2.4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus estimulan la producción de MMP-9 en los monocitos indirectamente a través de la inducción de TNF- α

En estudios previos realizados en nuestro laboratorio hemos demostrado que GM-

CSF presente en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados por B. abortus está

implicado en la inducción de la secreción de TNF-α e IL-1β por parte de los monocitos [32].

Debido a que, como mencionamos previamente, estas citoquinas podrían estimular la

secreción de MMP-9 por parte de los monocitos, decidimos evaluar si GM-CSF presente

en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados era el factor responsable de la

inducción de MMP-9 por parte de los monocitos en forma indirecta a través de la inducción

de TNF- y/o IL-1β.

Como los estudios previos fueron realizados utilizando líneas de osteosarcoma

decidimos, en primer lugar, estudiar si las observaciones realizadas podrían extenderse a

los osteoblastos de la línea hFOB. En concordancia demostramos que la estimulación de

los monocito con los sobrenadantes de los osteoblastos (hFOB) infectados con B. abortus

indujeron la producción de TNF- e IL-1β por parte de los monocitos (Figura 8 A y B) (P <

0,01), y que esta inducción se debió principalmente a GM-CSF presente en dichos

sobrenadantes (Figura 8 C y D) (P < 0,01).

Para determinar si GM-CSF presente en los sobrenadantes de los osteoblastos

infectados estaba induciendo la producción de MMP-9 por parte de los monocitos usando

como mediador TNF-α o IL-1β, los monocitos fueron preincubados con anticuerpos

bloqueantes anti- TNFRI, su control de isotipo, o el antagonista natural IL-1Ra durante 1 h.

y luego fueron estimulados durante 48 hs. con los sobrenadantes de los osteoblastos

infectados. Como se muestra en la Figura 9 A y B el bloqueo del receptor de TNF-α redujo

significativamente (P<0,01) la capacidad de los sobrenadantes de los osteoblastos

infectados de inducir la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos. Por otro lado, el

bloqueo del receptor de IL-1β con IL-1Ra no tuvo ningún efecto (no mostrado).


Figura 8. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus estimulan la producción de TNF-α por parte de monocitos y este efecto

esta mediado por GM-CSF.

1/2 1/5 1/10 1/20

200

400

SC-hFOB Infectados Cont

rol

hFO

B In

fect

ados

hFO

BN

o In

fect

ados

SC-h

FOB

no In

fect

ados

***

**

TNF-

(pg/

ml)

0

400

800

1/2 1/5

******

SC-hFOB Infectados

SC-h

FOB

No

infe

ctad

os

Cont

rol1/2

Sin tratara-GM-CSFIsotipo

TNF-

(pg/

ml)

0

750

1500

1/2 1/5

**

***

SC-hFOB Infectados

SC-h

FOB

No

infe

ctad

os Con

trol1/2

IL-1

(pg/

ml)

A B

C D

La producción de TNF-α (A) e IL-1β (B) fue determinada en el sobrenadante de los monocitos estimulados con los sobrenadantes de osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 y 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por ELISA. **P<0,01; ***P<0,001 versus los monocitos estimulados con SC-hFOB sin infectar. En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los SC-hFOB infectados con anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF o un control de isotipo durante 1 h, antes de agregarlos a los monocitos, y se determinó la producción de TNF-α (C) e IL-1β (D). **P<0,01; ***P<0,001 versus los monocitos estimulados con SC-hFOB sin el tratamiento con anti-GMCSF (sin tratar).

1/2 1/5 1/10 1/20

875

1750

SC-hFOB Infectados Cont

rol

hFO

B In

fect

ados

hFO

BN

o in

fect

ados

SC-h

FOB

no In

fect

ados

**

**

IL-1

(pg/

ml)


Estos resultados demuestran que GM-CSF presente en el sobrenadante de los

osteoblastos infectados con B. abortus induce la producción de TNF-α por parte de los

monocitos, el cual actúa sobre estas últimas células para inducir la secreción de MMP-9

(Esquema 3).

Figura 9. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus estimulan la producción de MMP-9 en monocitos indirectamente a través

de la inducción de TNF- α.

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

FR1

a-TN

FR1

Isot

ipo

Sin

trat

ar

1/2 1/5

SC-hFOB Infectados SC-h

FOB

No

infe

ctad

os

Cont

rol1/2

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

FR1

a-TN

FR1

Isot

ipo

Sin

trat

ar

1/2 1/5

SC-hFOB Infectados SC-h

FOB

No

infe

ctad

os

Cont

rol1/2

0

375

750

1/2 1/5 1/10 1/2

SC-hFOB Infectados

SC-h

FOB

No

infe

ctad

os

Sin tratara-TNFRIIsotipo

*** *** **MM

P-9

(ng/

ml)

A

B

Los monocitos fueron preincubados con anticuerpos bloqueantes del receptor de TNF (anti-TNFR1) o con el control de isotipo durante 1 h, y luego estimulados con los sobrenadantes de los osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 y 1/10) o sin infectar (1/2). Luego de 48 h de cultivo se evaluó la expresión de MMP-9 por ELISA (A) y por zimografía (B). **P<0,01; ***P<0,001 versus los monocitos sin pretratar con anti-TNFR1 (sin tratar).


3. Osteoblastos y su interacción con neutrófilos

3.1. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de neutrófilos

La capacidad de los osteoblastos infectados de producir factores quimioatractantes

podría atraer neutrófilos al sitio de infección ósea, por lo tanto decidimos evaluar si la

infección de los neutrófilos con B. abortus inducía la producción de MMPs. Como se

muestra en la Figura 10 A y B la infección de los neutrófilos con B. abortus indujo, la

secreción de niveles significativamente elevados de MMP-9 y de forma MOI dependiente

(P < 0,01).

Esquema 3. Esquema de la producción de MMP-9 por los monocitos durante su interacción con los osteoblastos infectados por Brucella.

GM-CSF secretado por los osteoblastos infectados con Brucella induce la producción de TNF-α por parte de los monocitos, el cual actúa sobre las ultimas células induciendo la producción de MMP-9.

Osteoblasto

B. abortus

TNF-αGM-CSF

Monocito

MMP-9

Osteoblasto

B. abortus

TNF-αGM-CSF

Monocito

MMP-9


3.2. Los sobrenadantes de neutrófilos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de osteoblastos

Decidimos luego estudiar la interacción entre los osteoblastos y los neutrófilos frente

a la infección con B. abortus. Para llevar a cabo este objetivo, se recolectaron los

sobrenadantes de cultivo de los osteoblastos y de los neutrófilos infectados con B. abortus

a las 24 hs. p.i. El estímulo de los osteoblastos con los sobrenadantes de los neutrófilos

infectados con B. abortus en diferentes proporciones (1/2, 1/5 y 1/10) indujo la secreción

de niveles significativos de MMP-2, en una forma dosis dependiente (P < 0,01) (Figura 11 A y B). No se observó la secreción de MMPs cuando estas células se estimularon con los

sobrenadantes de neutrófilos no infectados.

Figura 10. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de neutrófilos.

Control 100 250 500 10000

30

60

**

***

***

***

MM

P-9

(ng/

ml) Control 100 250 500 1000Control 100 250 500 1000

A B

La producción de MMP-9 fue determinada en los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus a las 2 h p.i. por ELISA (A) y por zimografía (B)..**P<0,01; ***P<0,001 versus el control (sin infectar).


Este resultado indica que factores solubles presentes en el sobrenadante de los

neutrófilos infectados con B. abortus inducen la secreción de MMP-2 por parte de los

osteoblastos (Esquema 4).

Figura 11. Los sobrenadantes de los neutrófilos infectados por B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos.

La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes de los neutrófilos (SC-PMN) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por zimografía (A) y por ELISA (B). ***P<0,001 versus los osteoblastos tratados con SC-PMN no infectados.

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-PMN InfectadosSC

-PM

N

No i

nfec

tado

s

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-PMN InfectadosSC

-PM

N

No i

nfec

tado

s

A B

1/2 1/5 1/10 1/2 Control0

60

120

SC-PMN Infectados

SC-P

MN

No

infe

ctad

os

*** ***

***

MM

P-2

(ng/

ml)


3.3. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos


de los osteoblastos infectados con B. abortus sobre los neutrófilos. Demostramos que los

sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus indujeron la producción

significativa de MMP-9 por parte de los neutrófilos, en forma dosis dependiente (Figura 12). Los sobrenadantes de los osteoblastos no infectados no tuvieron ningún efecto.

Esquema 4. Esquema de la producción de MMP-2 por los osteoblastos durante su interacción con los neutrófilos infectados por Brucella.

Neutrófilo Osteoblasto

B. abortus

MMP-2

Los osteoblastos producen MMP-2 en respuesta a factores solubles liberados por los neutrófilos infectados con B. abortus.


Este resultado indica que factores solubles presentes en el sobrenadante de los

osteoblastos infectados con B. abortus inducen la secreción de MMP-9 por parte de los

neutrófilos (Esquema 5).

4. Interacción entre B. abortus, los osteoblastos, los monocitos y los neutrófilos como determinantes de patología ósea

Esquema 5. Esquema de la producción de MMP-9 por los neutrófilos durante su interacción con osteoblastos infectados con B. abortus.

Los neutrófilos producen MMP-9 en respuesta a factores solubles liberados por osteoblastos infectados con B. abortus.

NeutrófiloOsteoblasto

B. abortus

MMP-9

NeutrófiloOsteoblasto

B. abortus

MMP-9

Figura 12. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados por B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos.

1/2 1/5 1/10 1/2

Con

trol

SC-hFOB Infectados

SC-h

Fob

No

infe

ctad

os

1/2 1/5 1/10 1/2

Con

trol

SC-hFOB Infectados

SC-h

Fob

No

infe

ctad

os

La producción de MMP-9 fue determinada por zimografía en el sobrenadante de los neutrófilos estimulados con los sobrenadantes de los osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 30 min.


En el Esquema 6 se muestra un resumen de la interacción entre los osteoblastos y

las células inmunes durante la infección con B. abortus. Los osteoblastos responden a la

infección con B. abortus produciendo MMP-2 a través de la secreción de GM-CSF.

Además, los osteoblastos infectados producen las quemoquinas MCP-1 e IL-8 las cuales

son capaces de inducir la migración de monocitos y neutrófilos, respectivamente. Estas

últimas células también responden a la infección con B. abortus produciendo MMP-9. GM-

CSF secretado por los osteoblastos infectados induce la producción de TNF-α por parte de

los monocitos, el cual actúa sobre las ultimas células induciendo la producción de MMP-9.

Por otro lado, TNF-α liberado por los monocitos infectados induce la producción de MMP-2

por parte de los osteoblastos. Asimismo, factores liberados por los osteoblastos infectados

estimulan la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos, y en el sentido contrario,

factores liberados por los neutrófilos estimulan la producción de MMP-2 por parte de los

osteoblastos.

5. Fibroblastos sinoviales

Los fibroblastos sinoviales son las células que forman la membrana sinovial de las

articulaciones y secretan el liquido sinovial al interior de la cavidad articular, cuya función

principal es la de reducir la fricción entre los cartílagos articulares durante el movimiento.

Esquema 6. Resumen de la interacción entre los osteoblastos y las células inmunes estudiadas.

MMP-9

B. abortus

MMP-9

B. abortus

TNF-α

TNF-α

MCP-1

GM-CSF

IL-8

MMP-2

GM-CSF

B. abortus

Osteoblasto

Monocito

Neutrófilo

MMP-9

B. abortus

MMP-9

B. abortus

TNF-α

TNF-α

MCP-1

GM-CSF

IL-8

MMP-2

GM-CSF

B. abortus

Osteoblasto

Monocito

Neutrófilo


Dado que la brucelosis afecta tanto al hueso como las articulaciones, decidimos estudiar

también el rol de los fibroblastos sinoviales en la producción de MMPs y su interacción con

las células inmunes que podrían ser atraídas durante la infección con Brucella.

5.1. B. abortus invade y se replica en la línea celular de fibroblastos sinoviales humanos SW982

En primer lugar evaluamos la capacidad de B. abortus de infectar y replicarse en la

línea celular de fibroblastos sinoviales humanos SW982. Para ello las células fueron

infectadas con B. abortus. Las infecciones se llevaron a cabo a distintas MOIs (100, 250,

500 y 1000). Los experimentos demostraron que B. abortus fue internalizada por los

fibroblastos sinoviales y que la magnitud de la infección, determinada por el recuento UFC

intracelulares, fue directamente proporcional a la MOI utilizada (Figura 13). El recuento de

UFC a distintos tiempos reveló que B. abortus es capaz de replicarse intracelularmente en

fibroblastos sinoviales. Las UFC intracelulares aumentaron entre 2 y 3 ordenes de

magnitud (dependiendo de la MOI utilizada) durante las primeras 48 hs. p.i.

Figura 13. B. abortus invade y se multiplica en la línea celular de fibroblastos sinoviales humanos SW982.

0 20 40 60 80

102

104

106

MOI 1000MOI 500MOI 250MOI 100

Tiempo (hs)

UFC

/ml

Los fibroblastos sinoviales humanos (línea celular SW982) fueron infectados con B. abortus a diferentes MOI y luego incubados con antibiótico para eliminar a las bacterias extracelulares. Los lisados celulares obtenidos a diferentes tiempos p.i. fueron plaqueados en TSA para determinar las UFC intracelulares.


5.2. La infección de los fibroblastos sinoviales con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α e IL-1β

Como se muestra en la Figura 14, la infección de fibroblastos sinoviales indujo la

secreción de GM-CSF, IL-6, MCP-1 e IL-8 en forma dependiente de la MOI utilizada (P <

0,05). Por el contrario la infección no indujo un incremento significativo en la secreción de

TNF-α ni de IL-1β (no mostrado).

5.3. La infección con B. abortus induce la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales

Figura 14. La infección con B. abortus induce la producción de IL-6, GM-CSF, MCP-1 e IL-8.

IL-6, GM-CSF, IL-8 y MCP-1 fueron cuantificadas en el sobrenadante de fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus a diferentes MOIs a las 48 h p.i. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 versus el control sin infectar.

Control 100 250 500 10000

300

600***

****

*IL-6

(pg/

ml)

Control 100 250 500 10000

250

500******

***

**IL-8

(pg/

ml)

Control 100 250 500 10000

150

300 ***

***

**

GM

-CSF

(pg/

ml)

Control 100 250 500 10000

2000

4000

******

**

MCP

-1 (p

g/m

l)


Para determinar si la infección con B. abortus era capaz de inducir la producción de

MMPs por parte de los fibroblastos sinoviales, la secreción de MMPs fue analizada por

zimografía en los sobrenadantes de cultivo de las células infectadas y su presencia

confirmada y cuantificada por ELISA. Como se muestra en la Figura 15 la infección con B.

abortus indujo la expresión de niveles significativos de MMP-2 (P< 0,001) por parte de los

fibroblastos sinoviales, respecto de las células no infectadas, y mediante un mecanismo

dependiente de la MOI utilizada.

5.4. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos

Dado que hemos demostrado que los fibroblastos sinoviales infectados con B.

abortus secretan las quemoquinas MCP-1 e IL-8 decidimos evaluar si los sobrenadantes

de los fibroblastos sinoviales infectados con Brucella eran capaces de inducir la migración

de monocitos y neutrófilos. Para lograr este objetivo se realizó el mismo procedimiento que

se describió en la sección 1.4 de resultados. Como se muestra en la Figura 16 la

migración tanto de los monocitos como de los neutrófilos en presencia de los

sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados y el control positivo fMLP fue

significativamente superior que la migración basal (P < 0,05). Por otro lado, los

Figura 15. La infección con B. abortus induce la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales.

La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus 48 hs. p.i. por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P<0,001 versus el control sin infectar.

Control 100 250 500 10000

30

60***

***

***

***

MM

P-2

(ng/

ml)

A B

Control 100 250 500 1000Control 100 250 500 1000


sobrenadantes de los osteoblastos no infectados no indujeron niveles significativos de

migración respecto del basal.

6. Fibroblastos sinoviales y su interacción con monocitos y neutrófilos 6.1. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de TNF-α

Los resultados mostrados en la sección anterior sugieren que IL-8 y MCP-1

secretados por los fibroblastos sinoviales infectados con Brucella jugarían un rol

regulatorio importante en la inflamación debido a sus funciones quimioatractantes,

reclutando a las células inflamatorias al sitio de infección. Decidimos entonces estudiar la

interacción entre los fibroblastos sinoviales y los monocitos y neutrófilos frente a la

infección con B. abortus.

Figura 16. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos.

La migración de los monocitos (A) o de los neutrófilos (B) estimulados con diferentes cantidades (puro y diluciones 1/2 y 1/5) de los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales (SC-FS) infectados con B. abortus o no infectados (puro), fue determinada utilizando placas de microquimiotaxis. Las células que migraron fueron contadas luego de 2 h. Los resultados fueron expresados como el índice quimiotáctico (IQ: número de células que migraron al medio condicionado dividido el numero de células que migraron al medio de cultivo). La migración inducida por fMLP fue utilizada como control positivo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus los estimulados con SC-FS no infectados.

fMLP 1 1/2 1/5 10

5

10

15

20

25

*

**

*

SC-FS Infectados SC-FS No Infectados

IQ m

onoc

itos

fMLP 1 1/2 1/5 10

4

8 ***

***

***

**

SC-FS Infectados SC-FS No Infectados

IQ n

eutr

ófilo

s

A B


El estímulo de los fibroblastos sinoviales con los sobrenadantes de los monocitos

infectados con B. abortus en diferentes proporciones (1/2, 1/5 y 1/10) indujo la secreción

de niveles significativos de MMP-2 (P < 0,001), en una forma dosis dependiente (Figura 17 A y B). Por otro lado, no se observó un aumento significativo en los niveles de MMP-2

cuando estas células se estimularon con los sobrenadantes de los monocitos no

infectados.

Como se mencionó en la sección 1.7., se determinó la presencia de niveles

significativos de TNF-α e IL-1β en los sobrenadantes de cultivo de los monocitos

infectadas con B. abortus respecto de los no infectados. Debido a que ha sido descripto

que TNF-α es una de las principales responsables de inducir la producción de MMP-2 en

varios tipos celulares, incluyendo fibroblastos sinoviales [249, 250] decidimos estudiar la

contribución de esta citoquina en la inducción de la expresión de MMP-2 por parte de los

mismos. Para ello los fibroblastos sinoviales fueron estimulados con los sobrenadantes de

los monocitos infectados con B. abortus en presencia de un anticuerpo neutralizante anti-

TNF-α. Como se muestra en la Figura 17 C y D la neutralización de TNF-α redujo

significativamente (P < 0,001) la habilidad de dichos sobrenadantes de inducir la expresión

de MMP-2 en los fibroblastos sinoviales, mientras que el control de isotipo no tuvo ningún

efecto. Comparado con los sobrenadantes sin tratar, la neutralización de TNF-α redujo un

91,1% los niveles de expresión de MMP-2.


Figura 17. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos infectados por B. abortus inducen las producción de MMP-2 por parte de los fibroblastos

sinoviales a través de la inducción de TNF-α. A B

1/2 1/5 1/10 1/2 Control0

20

40

SC-THP-1 Infectados

SC-T

HP-

1N

o In

fect

ados

*** *** ***

MM

P-2

(ng/

ml)

1/2 1/5 1/10 1/2

Con

trol

SC-THP-1 Infectados

SC-T

HP-

1 N

o in

fect

ados

1/2 1/5 1/10 1/2

Con

trol

SC-THP-1 Infectados

SC-T

HP-

1 N

o in

fect

ados

0

40

80

rhTNF2 ng/ml

Sin tratara-TNFIsotipo

SC-THP-1Infectado

*** ***

SC-T

HP-

1N

o In

fect

ado

1/2

Cont

rol

MM

P-2

(ng/

ml)

C D

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

Fα

a-TN

Fα

Isot

ipo

SC-T

HP-

1 N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol

1/2 SC-THP-1 Infectados

1/2

rhTNF2 ng/ml

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

Fα

a-TN

Fα

Isot

ipo

SC-T

HP-

1 N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol

1/2 SC-THP-1 Infectados

1/2

rhTNF2 ng/ml

La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los fibroblastos sinoviales estimulados con los sobrenadantes de los monocitos (SC-THP-1) infectados por B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P<0,001 versus los estimulados con SC-THP-1 no infectados. En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los sobrenadantes con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo durante 1 h antes de agregarlos a los fibroblastos sinoviales, y se determinó la producción de MMP-2 por ELISA (C) y por zimografía. (D). ***P<0,001 versus los estimulados con SC-THP-1 infectados sin tratar con el anticuerpo anti-TNF-α.


Estos resultados indican que los sobrenadantes de cultivo de los monocitos

infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-2 por parte de los fibroblastos

sinoviales, y este efecto estaría mediado principalmente por TNF-α. (Esquema 7).

6.2. Los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-9 por parte de los monocitos a través de GM-CSF


de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus sobre los monocitos. Como se

muestra en la Figura 18 A y B los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados

con B. abortus indujeron la producción significativa de MMP-9 por parte de los monocitos,

en forma dosis dependiente (P < 0,05). Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales

no infectados no tuvieron ningún efecto.

Como se ha mencionado previamente varias citoquinas y factores de crecimiento son

capaces de estimular la producción de MMP-9 por parte de los monocitos incluyendo TNF-

α, IL-1β y GM-CSF [185, 231, 247]. Sin embargo, tal como hemos mencionado en la

sección 2.3 los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus no secretan TNF-α ni IL-

1β. Por el contrario como se mostró en la Figura 14 los fibroblastos sinoviales infectados

secretan GM-CSF. Para evaluar si GM-CSF presente en el sobrenadante de los

fibroblastos infectados estaba involucrado en la inducción de la producción de MMP-9 por

parte monocitos, estos últimos fueron estimulados con los sobrenadantes de los

Esquema 7. Esquema de la producción de MMP-2 con fibroblastos sinoviales durante su interacción con monocitos infectados con Brucella.

Los osteoblastos producen MMP-2 en respuesta a TNF-α secretado por monocitos infectados con B. abortus.

MMP-2

Fibroblasto sinovialMonocito

TNF-α

B. abortus

MMP-2

Fibroblasto sinovialMonocito

TNF-α

B. abortus


fibroblastos sinoviales infectados en presencia de un anticuerpo monoclonal neutralizante

anti-GM-CSF o un control de isotipo. Como se muestra en la Figura 18 C y D la

neutralización de GM-CSF abolió la habilidad de los sobrenadantes de los fibroblastos

sinoviales infectados de estimular la producción de MMP-9 por parte de los monocitos (P <

0,001), mientras el control de isotipo no tuvo ningún efecto.


Figura 18. Los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 en monocitos a

través de GM-CSF.

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-FS Infectados

SC-F

S N

o inf

ecta

dos

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-FS Infectados

SC-F

S N

o inf

ecta

dos

Isot

ipo

a-GM

-CSF

SC-F

S N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol

1/2 SC-FS Infectados

1/2Is

otip

o

a-GM

-CSF

SC-F

S N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol


1/2

A B

C D

1/2 1/5 1/10 1/2 Control0

100

200

300

SC-FS Infectados

SC-F

SN

o In

fect

ados

***

***

*

MM

P-9

(ng/

ml)

0

20

40


***

SC-F

SN

o in

fect

ados

Cont

rol

Isotipoa-GM-CSFSin tratar

MM

P-9

(ng/

ml)

La producción de MMP-9 fue determinada en el sobrenadante de los monocitos estimulados con los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales (SC-FS) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). *P<0,05; ***P<0,001 versus los estimulados con SC-FS no infectados. En otro experimento SC-FC fueron pretratados con anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF o un control de isotipo durante 1 h antes de agregarlos a los monocitos, y se determinó la producción de MMP-9 por ELISA (C) y por zimografía. (D). ***P<0,001 versus los estimulados con SC-FS infectados sin tratar con el anticuerpo anti-GM-CSF (sin tratar).


Estos resultados indican que GM-CSF presente en el sobrenadante de los

fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte

de los monocitos (Esquema 8).

6.3. Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de TNF-α

Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus indujeron la

secreción de niveles significativos de MMP-2 por parte de los fibroblastos sinoviales en

una forma dosis dependiente (1/2, 1/5 y 1/10) (P < 0,001) (Figura 19 A y B). En estudios

previos realizados en nuestro laboratorio demostramos que los neutrófilos infectados con

B. abortus secretan niveles significativamente elevados de TNF-α e IL-1β a las 24 hs. p.i.

[33]. Por lo tanto, decidimos evaluar la contribución de TNF-α en la inducción de la

expresión de MMP-2 por parte de los fibroblastos sinoviales. Como se muestra en la

Figura 19 C el pretratamiento con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α redujo la

habilidad de los sobrenadantes de los neutrófilos infectados con B. abortus de estimular la

secreción de MMP-2 por parte de los fibroblastos sinoviales, mientras que el control de

isotipo no tuvo ningún efecto.

Esquema 8. Esquema de la producción de MMP-9 por monocitos durante la interacción con fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus.

MonocitoFibroblasto sinovial

GM-CSF

B. abortus

MMP-9

MonocitoFibroblasto sinovial

GM-CSF

B. abortus

MMP-9

Fibroblasto sinovial

GM-CSF

B. abortus

MMP-9

Los monocitos producen MMP-9 en respuesta a GM-CSF secretado por los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus.


Estos resultados sugieren que los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos

infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por los fibroblastos sinoviales ,

y este efecto esta mediado principalmente por TNF-α (Esquema 9).

Figura 19. Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-2 por parte de los fibroblastos

sinoviales a través de la inducción de TNF-α. A B

C

1/2 1/10 1/5 1/2 Control0

55

110

SC-PMN Infectados

SC-P

MN

No

Infe

ctad

os

*** *** ***

MM

P-2

(ng/

ml)

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-PMN Infectados

SC-P

MN

N

o in

fect

ados

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-PMN Infectados

SC-P

MN

N

o in

fect

ados

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-PMN Infectados

SC-P

MN

N

o in

fect

ados

Isot

ipo

a-TN

F-α

SC-P

MN

N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol

1/2 SC-PMN Infectados

1/2

Isot

ipo

a-TN

F-α

SC-P

MN

N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol

1/2 SC-PMN Infectados

1/2

La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los fibroblastos sinoviales estimulados con sobrenadantes de neutrófilos (SC-PMN) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P<0,001 versus los estimulados SC-PMN no infectados. En otro experimento los SC-PMN fueron pretratados con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo durante 1h., antes de su agregado a los monocitos, y se determinó la producción de MMP-2 por zimografía (C). ***P<0,001 versus los estimulados con los SC-PMN infectados sin tratar con el anticuerpo anti-TNF-α (sin tratar).


6.4. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos a través de IL-6

El estudio del proceso inverso reveló que los sobrenadantes de cultivo de los

fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus eran capaces de estimular la producción

de niveles significativos de MMP-9 por parte de los neutrófilos (P < 0,001) (Figura 20 A y B). Por el contrario la secreción de MMP-9 no fue inducida por los sobrenadantes de los

fibroblastos sinoviales no infectados con Brucella.

Dado que GM-CSF e IL-6 también han demostrado ser inductores de MMPs en

diferentes tipos celulares [231, 251, 252] y estos factores son producidos por los

fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus decidimos estudiar el rol de estas dos

citoquinas en la inducción de la expresión de MMP-9 por parte de los neutrófilos. Para

llevar a cabo este objetivo los neutrófilos fueron estimulados con los sobrenadantes de

cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus en presencia de un

anticuerpo neutralizante anti-GM-CSF o anti-IL-6, o sus respectivos controles de isotipo.

Como se muestra en la Figura 20 C la neutralización de GM-CSF no inhibió la capacidad

de los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados de inducir la producción de

MMP-9 por los neutrófilos, aún siendo utilizado a 4 ug/ml, una concentración 40 veces más

alta que la sugerida por el fabricante del anticuerpo para neutralizar completamente la

concentración de GM-CSF detectada por ELISA en dichos sobrenadantes. Por el contrario,

Esquema 9. Los fibroblastos sinoviales producen MMP-2 en respuesta a TNF-α secretado por los neutrófilos infectados con B. abortus.

B. abortus

NeutrófiloFibroblasto sinovial

TNF-α

MMP-2

B. abortus

NeutrófiloFibroblasto sinovial

TNF-α

MMP-2

Los fibroblastos sinoviales producen MMP-2 en respuesta a TNF-α secretado por los neutrófilos infectados con B. abortus.


la neutralización de IL-6 inhibió parcialmente la capacidad de los sobrenadantes de inducir

la producción de MMP-9 por los neutrófilos (Figura 20 D).


Figura 20. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 en neutrófilos a través de la

inducción de IL-6. A B

C

1/2 1/5 1/10 1/2 Control0

20

40

60

80

SC-FS Infectados

SC-F

SN

o In

fect

ados

***

***

***

MM

P-9

(pg/

ml)

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-FS Infectados

SC-F

S N

o in

fect

ados

1/2 1/5 1/10 1/2

Cont

rol

SC-FS Infectados

SC-F

S N

o in

fect

ados

Isot

ipo

a-GM-CSF

SC-F

S N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol


1/21 2 4

Isot

ipo

a-GM-CSF

SC-F

S N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol


1/21 2 4

Isot

ipo

a-IL

6

SC-F

S N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol


1/2

Isot

ipo

a-IL

6

SC-F

S N

o in

fect

ados

Sin

trat

ar

Cont

rol


1/2

D

La producción de MMP-9 fue determinada en los sobrenadantes de los neutrófilos estimulados con los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales (SC-FS) infectados por B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 30 min, por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P<0,001 versus los estimulados con SC-FS no infectados. En otro experimento SC-FC fueron pretratados con anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF (1, 2 o 4ug/ml) o IL-6 o un control de isotipo durante 1 h antes de su agregado a los neutrófilos, y se determinó la producción de MMP-9 por zimografía (C) y (D).


Estos resultados sugieren que la citoquina IL-6 presente en los sobrenadantes de los

fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus, esta involucrada en la inducción de la

expresión de MMP-9 por parte de los neutrófilos (Esquema 10).

7. Interacción entre B. abortus, los sinoviocitos, los monocitos y los neutrófilos

En el Esquema 11 se muestra un resumen de la interacción entre los fibroblastos

sinoviales y las células inmunes durante la infección con B. abortus. Los fibroblastos

sinoviales responden a la infección con B. abortus produciendo MMP-2 como así también

las quemoquinas MCP-1 e IL-8 las cuales son capaces de inducir la transmigración de

monocitos y neutrófilos, respectivamente. Estas últimas células también responden a la

infección con B. abortus produciendo MMP-9. GM-CSF secretado por los fibroblastos

sinoviales infectados induce la producción de MMP-9 por parte de los monocitos. Por otro

lado, TNF-α liberado por los monocitos infectados induce la producción de MMP-2 por

parte de los fibroblastos sinoviales. Asimismo, IL-6 liberado por los fibroblastos sinoviales

infectados estimula la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos, y en el sentido

contrario, TNF-α producido por los neutrófilos infectados estimula la producción de MMP-2

por parte de los fibroblastos sinoviales.

Esquema 10. Esquema de la producción de MMP-9 con los neutrófilos durante la interacción con los fibroblastos sinoviales infectados con

Los neutrófilos producen MMP-9 en respuesta a IL-6 secretada por los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus.

Fibroblasto sinovialNeutrófilo

IL-6

B. abortus

MMP-9

Fibroblasto sinovialNeutrófilo

IL-6

B. abortus

MMP-9


8. B. abortus produce un incremento neto en la actividad de las metaloproteasas secretadas por los osteoblastos, monocitos, neutrófilos y fibroblastos sinoviales

La actividad de las MMPs in vivo está altamente regulada y se encuentra

contrarrestada por la actividad de inhibidores tisulares específicos denominados TIMPs.

Por lo tanto, la actividad proteolítica neta, depende del balance entre la actividad de las

MMPs y de las TIMPs [215]. Esta actividad neta podría no ser detectada por zimografía ya

que los complejos MMP-TIMP podrían disociarse durante la electroforesis. Para poner en

evidencia si el entorno de las células infectadas permitía un incremento en la actividad

proteolítica neta, los sobrenadantes de cultivo provenientes de los osteoblastos,

monocitos, neutrófilos o fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus fueron incubados

con un conjugado de gelatina-FITC que no fluoresce cuando la molécula está integra, pero

sí cuando la misma es degradada por la acción de proteasas. Como se muestra en la

Figura 21 la fluorescencia se vio incrementada en forma significativa (P < 0,01) cuando la

gelatina-FITC fue incubada con los sobrenadantes de las células infectadas con B. abortus

y además la intensidad de fluorescencia fue dependiente de la MOI utilizada.

Esquema 11. Resumen de la interacción entre los fibroblastos sinoviales y las células inmunes.

B. abortus

TNF-α

MCP-1

GM-CSF

B. abortusMonocito


MMP-9

Neutrófilo

B. abortus

TNF-αIL-8

IL-6

MMP-9

MMP-2

B. abortus

TNF-α

MCP-1

GM-CSF

B. abortusMonocito


MMP-9

Neutrófilo

B. abortus

TNF-αIL-8

IL-6

MMP-9

MMP-2


Este resultado muestra que la infección con B. abortus produce un incremento neto

en la actividad de las metaloproteasas con actividad gelatinasa secretadas por los

osteoblastos, monocitos, neutrófilos y fibroblastos sinoviales.

9. Componentes estructurales de B. abortus están implicados en la inducción de MMPs por sinoviocitos, monocitos y neutrófilos

Figura 21. B. abortus produce un incremento neto en la actividad de las metaloproteasas secretadas por osteoblastos, monocitos, neutrófilos y

fibrobastos sinoviales.

Control 100 250 500 10000

5

10

15

*** *** *** ***

UF

Osteoblastos Monocitos

Control 100 250 10000

10

20

**

***

***

UF

Fibroblastos sinoviales Neutrófilos

SI 100 250 10000

5

10

******

***

UF

Los sobrenadantes provenientes de los osteoblastos, monocitos, neutrófilos o fibroblastos sinoviales infectados por B. abortus a diferentes MOIs fueron incubados con un conjugado gelatina-FITC que no fluoresce cuando la molécula está integra, pero sí cuando la misma es degradada por la acción de proteasas. Se midió la fluorescencia emitida en un fluorómetro. Los resultados fueron expresados en unidades arbitrarias de fluorescencia (UF). *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 versus los sobrenadantes provenientes de las células no infectadas (control).

Control 10 25 50 1000

5

10

15

****** *** ***

UF


9.1. Monocitos

9.1.1. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los monocitos, pero no de MMP-2 por parte de los osteoblastos

A continuación nos propusimos evaluar si era necesaria la viabilidad de la bacteria

para inducir la producción de MMPs por parte de los monocitos y de los osteoblastos, o si

por el contrario podían ser inducidas por componentes estructurales de B. abortus. Para

lograr este objetivo ambos tipos celulares fueron estimulados con B. abortus muerta por

calor (HKBA). Demostramos que los osteoblastos estimulados con HKBA no secretaron

niveles detectables de MMP-2, aún cuando la concentración de HKBA fue de 109 UFC/ml

(no mostrado) lo que correlaciona con una MOI de 1000 que es mucho más elevada que la

MOI mínima utilizada capaz de inducir niveles detectables de MMP-2, tal como se mostró

en la Figura 3. En contraste, los monocitos respondieron secretando niveles significativos

de MMP-9 luego de ser estimulados con diferentes dosis de HKBA (Figura 22) (P < 0,001).

Este resultado sugiere que algunos componentes estructurales de B. abortus podrían

estimular la producción de MMP-9 por monocitos.

Por otro lado, debido a que las citoquinas proinflamatorias han sido implicadas como

responsables de la producción de MMPs por parte de monocitos [243, 253] y que en

estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostramos que las lipoproteínas de

Brucella (y no su LPS) son las principales responsables de la inducción de citoquinas

proinflamatorias en distintos tipos celulares [109, 232], nos preguntamos si las

lipoproteínas podrían ser los componentes constitutivos de Brucella que estarían

involucrados en la inducción de MMP-9 en monocitos. Para ello se usó como modelo de

lipoproteína Omp19 (L-Omp19). Los monocitos fueron incubados con L-Omp19 y los

sobrenadantes de cultivo fueron recolectados a las 48 hs. para determinar la presencia de

MMP-9 por zimografía y por ELISA. Como se muestra en la Figura 6 A y B, L-Omp19

indujo la expresión de MMP-9 en forma dosis dependiente. Se detectó un aumento

significativo de MMP-9 aun con la concentración de L-Omp19 más baja (10 ng/ml) (P <

0,01). Por otro lado, vimos que este fenómeno dependía de la porción lipídica ya que

Omp19 no lipidada (S-Omp19) no indujo la secreción de MMP-9 (Figura 6 A y B). Dado

que la expresión de MMP-9 también aumentó en monocitos incubados con el

lipohexapéptido sintético (Pam3Cys) conteniendo una secuencia peptídica irrelevante,

podemos concluir que el efecto producido por L-Omp19 se podría extender a todas las

lipoproteínas de B. abortus. Por otro lado, el LPS de B. abortus no fue capaz de inducir la

producción de MMP-9 aún a altas concentraciones (1000 ng/ml), mientras que si lo hizo el

LPS de E. coli a una concentración de 100 ng/ml (Figura 22).


9.1.2. La lipoproteína L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos vía TLR2

En estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostramos que TLR2 media

las respuestas en monocitos frente al estímulo con HKBA y con las lipoproteínas de B.

Figura 22. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de monocitos, pero no de MMP-2 por parte

de osteoblastos.

Contro

l 6

HKBA 107

HKBA 108

HKBA 109

HKBA 10

LPS Ec 100

LPS Ba 100

0

L-Omp1

9 10

L-Omp1

9 100

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 100 Cys

3

Pam

0

50

100

150

200

***

***

***

***

******

******

**MM

P-9

(ng/

ml)

LPS

Ba10

00

LPS

Ec10

0

Cont

rol

109 108 107 106

HKBA

LPS

Ba10

00

LPS

Ec10

0

Cont

rol

109 108 107 106

HKBA

Pam

3cys

S-O

mp1

9

Cont

rol

1000 100 10

L-Omp19

Pam

3cys

S-O

mp1

9

Cont

rol

1000 100 10

L-Omp19

A

B

La producción de MMP-9 fue determinada en los sobrenadantes de monocitos estimulados con HKBA (106 a 109 UFC/ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). **P <0,01; ***P <0,001 versus el control sin estímulo.


abortus [109]. Por lo tanto, decidimos analizar el rol de TLR2 en la producción de MMP-9

inducida por HKBA y L-Omp19. Para llevar a cabo este objetivo las células monocíticas

THP-1 fueron preincubadas durante 1 h. con anticuerpos bloqueantes anti-TLR2, anti-

TLR4 o los correspondientes controles de isotipo, y luego fueron estimuladas con HKBA o

L-Omp19. La preincubación de los monocitos con el anticuerpo anti-TLR2 bloqueó

significativamente (P < 0,001) la inducción de la producción de MMP-9 mediada por L-

Omp19 y HKBA (Figura 23 A y B). Por otro lado, la preincubación con el anticuerpo anti-

TLR4 no modificó significativamente el efecto de L-Omp19 o HKBA sobre la producción de

MMP-9. Los controles de isotipo no tuvieron ningún efecto.

Estos resultados indican que las lipoproteínas de B. abortus serían las principales

responsables de la inducción de MMP-9 por parte de los monocitos vía TLR2.


9.1.3. L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos a través de la inducción de TNF- α.

Figura 23. La lipoproteína L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos vía TLR2.

0

80

160

L-Omp19 Pam3cysHKBA LPS Ec

a-TLR2a-TLR4Isotipo

Sin tratar

Ba L

PS

S-O

mp1

9

*** *** *** ***

Cont

rol

MM

P-9

(pg/

ml)

a-TL

R2

a-TL

R4

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Isot

ipo

Sin

trat

ar

Sin

trat

ar

LPS

Ba

Cont

rol

HKBA LPS Ec

a-TL

R2

a-TL

R4

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Isot

ipo

Sin

trat

ar

Sin

trat

ar

LPS

Ba

Cont

rol

HKBA LPS Ec

a-TL

R2

a-TL

R4

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Isot

ipo

Sin

trat

ar

Sin

trat

ar

S-O

mp1

9

Cont

rol

L-Omp19 Pam3Cys

a-TL

R2

a-TL

R4

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Isot

ipo

Sin

trat

ar

Sin

trat

ar

S-O

mp1

9

Cont

rol

L-Omp19 Pam3Cys

A

B

Los monocitos humanos de la línea THP-1 fueron preincubados con anticuerpos neutralizantes anti-TLR2 o anti-TLR4 o un control de isotipo durante 1 h, y luego estimulados con HKBA (107 UFC /ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), L-Omp19 (100 ng/ml) o Pam3Cys (50 ng/ml). Luego de 48 h de cultivo, se evaluó la expresión de MMP-9 en sobrenadantes por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P <0,001 versus el tratamiento con anti-TLR2 o anti-TLR4 (según corresponda).


En estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostramos que L-Omp19 es

el componente estructural de B. abortus responsable de inducir la producción de TNF-α,

IL-1β e IL-6 por parte de monocitos [109]. Debido a que nosotros utilizamos un medio de

cultivo modificado para poder analizar la producción de MMPs por zimografía, decidimos

analizar en primer lugar si los niveles de citoquinas secretadas por los monocitos

estimulados con HKBA o con L-Omp19 se mantenían en estas nuevas condiciones de

cultivo. Como se muestra en la Figura 24, L-Omp19 indujo un aumento significativo (P <

0,001) en los niveles de TNF-α e IL-1β en forma dosis dependiente y a niveles

comparables a los obtenidos previamente [109]. Como esperábamos, la versión no

lipidada S-Omp19 no tuvo ningún efecto y el LPS de B. abortus no indujo la expresión de

niveles significativos de estas citoquinas.

Debido a que otros autores demostraron que TNF-α e IL-1β pueden inducir la

producción de MMP-9 en varios tipos celulares [246-248], decidimos estudiar la

contribución de estas dos citoquinas en la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos

estimulados con HKBA o L-Omp19. Para llevar a cabo este objetivo, decidimos neutralizar

la acción de estas citoquinas usando un anticuerpo bloqueante del receptor I de TNF-α

Figura 24. La lipoproteína L-Omp19 induce la producción de TNF-α e IL-1β por parte de monocitos.

A Con

trol 6

HKBA 107

HKBA 108

HKBA 10LPS EcLPS Ba

L-Omp1

9 10

L-Omp1

9 100

L-Omp1

9 100

0S-O

mp19

Cys 3

Pam0

1500

3000

IL-1

(pg/

ml)

******

***

***

*** *** *** ***

B

La producción de TNF-α e IL-1β fue determinada en el sobrenadante de cultivo de los monocitos estimulados con HKBA (106 a 108 UFC /ml), LPS de E. coli (50 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) durante 48 h, por ELISA. **P<0,01; ***P <0,001 versus el control sin estímulo.

Contro

l 6

HKBA 107

HKBA 108

HKBA 10LPS EcLPS Ba

L-Omp1

9 10

L-Omp1

9 100

L-Omp1

9 100

0S-O

mp19 Cys

3

Pam

0

3000

6000

TNF-

(pg/

ml)

******

***

***

***

***

*** ***


(TNFRI) o su control de isotipo, y el antagonista natural del receptor de IL-1β (IL-1Ra).

Como se muestra en la Figura 25 el bloqueo de TNFRI redujo significativamente (P <

0,01) la capacidad de L-Omp19 y HKBA de inducir la producción de MMP-9 en monocitos.

Por otro lado, el tratamiento con el antagonista natural IL-1Ra no afectó el nivel de

expresión de MMP-9 inducido por estos estímulos (no mostrado).

Estos resultados junto con los descriptos en las secciones anteriores indican que

Brucella a través de sus lipoproteínas inducen la producción de TNF-α mediante el

reconocimiento de TLR2, y TNF-α actúa sobre las mismas células estimulando la

producción de MMP-9 en los mismos monocitos (Esquema 12).

Figura 25. L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos a través de la inducción de TNF- α.

0

55

110

L-Omp19 Pam3CysHKBA rhTNF-

** *** ** **

Sin tratara-TNFR1Isotipo

LPS

Ba

S-O

mp1

9

Cont

rol

MM

P-9

(ng/

ml)

A

B

Los monocitos fueron preincubados con anticuerpos bloqueantes del receptor de TNF (a-TNFR1) o un control de isotipo durante 1 h, y luego estimulados con HKBA (107 UFC/ml), L-Omp19 (100 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o rhTNF-α (2 ng/ml). Luego de 48 h de cultivo se evaluó la expresión de MMP-9 en el sobrenadante por ELISA (A) y por zimografía (B).**P <0,01; ***P<0,001 versus los monocitos estimulados con el antígeno correspondiente, pero sin pretratar con anti-TNFR1 (sin tratar).

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

FR1

a-TN

FR1

Isot

ipo

S-O

mp1

9

Sin

trat

ar

Cont

rol

L-Omp19 Pam3Cys

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

FR1

a-TN

FR1

Isot

ipo

S-O

mp1

9

Sin

trat

ar

Cont

rol

L-Omp19 Pam3CysHKBA rh TNF-α

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

FR1

a-TN

FR1

Isot

ipo

LPS

Ba

Sin

trat

ar

Con

trol

HKBA rh TNF-α

Sin

trat

ar

Isot

ipo

a-TN

FR1

a-TN

FR1

Isot

ipo

LPS

Ba

Sin

trat

ar

Con

trol


9.2. Neutrófilos.

9.2.1 Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos.

A continuación nos propusimos evaluar si era necesaria la viabilidad de la bacteria

para inducir la producción de MMPs por parte de los neutrófilos, o si por el contrario podían

ser inducidas por componentes estructurales de B. abortus. Para lograr este objetivo las

células fueron estimuladas con B. abortus muerta por calor (HKBA). Los neutrófilos

respondieron secretando altos niveles de MMP-9 luego de ser estimulados con diferentes

dosis de HKBA (P < 0,01) (Figura 26). Este resultado sugiere que algunos componentes

estructurales de B. abortus podrían estimular la producción de MMP-9 por parte de los

monocitos.

Nuevamente nos preguntamos si las lipoproteínas podrían ser los componentes

constitutivos de Brucella que estarían involucrados en la inducción de MMP-9 en

neutrófilos. Los neutrófilos fueron incubados con L-Omp19 y los sobrenadantes de cultivo

fueron recolectados para medir la expresión de MMP-9 por ELISA. Como se muestra en la

Figura 26, L-Omp19 indujo la expresión de MMP-9 en forma dosis dependiente. Se

detectó un aumento significativo de MMP-9 (P < 0,001) aun con la concentración de L-

Omp19 más baja (10 ng/ml). Como esperábamos, vimos que este fenómeno dependía de

la porción lipídica ya que S-Omp19 no indujo la secreción de MMP-9 (Figura 26), mientras

que el lipohexapéptido Pam3Cys indujo un aumento significativo (P < 0,001) en los niveles

L-Omp19 induce la producción de TNF-α a través del reconocimiento de TLR2, y TNF-α actúa sobre las mismas células estimulando la producción de MMP-9.

MMP-9

Monocito

L-Omp19

TLR2

MMP-9

Monocito

L-Omp19

TLR2

Esquema 12. Esquema de la producción de MMP-9 por monocitos durante la infección con B. abortus.


de MMP-9. Por otro lado, el LPS de B. abortus no fue capaz de inducir la producción de

MMP-9 aún a altas concentraciones (1000 ng/ml), mientras que si lo hizo el LPS de E. coli

a una concentración de 100 ng/ml (Figura 26).

9.3. Fibroblastos sinoviales

9.3.1. B. abortus induce la secreción de MMP-2 y citoquinas en fibroblastos sinoviales humanos, y este efecto está mediado por L-Omp19 a través del reconocimiento de TLR2.

A continuación estudiamos el efecto de HKBA y el rol de componentes bacterianos

específicos sobre los fibroblastos sinoviales. Como se muestra en la Figura 27 A los

fibroblastos sinoviales estimulados con HKBA produjeron niveles elevados de GM-CSF, IL-

6, IL-8, MCP-1 y MMP-2 en una forma dosis dependiente (P < 0,05), indicando que la

secreción de estos factores puede ser estimulada por un componente estructural de B.

abortus. Dado que está descripto y hemos comprobado previamente en este trabajo que

las lipoproteínas son capaces de inducir la secreción de citoquinas, quemoquinas y MMPs

Figura 26. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos.

La producción de MMP-9 fue determinada en el sobrenadante de cultivo de los neutrófilos estimulados con HKBA (106 a 108 UFC /ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) durante 30 min, por ELISA. **, P<0.01; ***, P<0.001 versus el control sin estímulo.

Contro

l 6

HKBA 107

HKBA 108

HKBA 10LPS Ec

LPS Ba

L-Omp1

9 10

L-Omp19

100

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 100

0

Cys 50

3

Pamp

0

35

70

***

******

***

***

**

***

***

MM

P-9

(ng/

ml)


en diferentes tipos celulares [77, 108, 109, 232, 254], nos planteamos como hipótesis que

las lipoproteínas podrían también mediar esos efectos en los fibroblastos sinoviales. Los

fibroblastos sinoviales fueron estimulados con L-Omp19 y los sobrenadantes se

recolectaron 48 hs. después para medir la secreción de citoquinas, quemoquinas y MMP-2

por ELISA. Como se muestra en la Figura 27 L-Omp19 indujo la secreción de GM-CSF,

IL-6, IL-8, MCP-1 y MMP-2 en una forma dosis dependiente, y una expresión significativa

de todos estos factores fue detectada incluso con la concentración más baja de L-Omp19,

10 ng/ml (P < 0,05). En todos los casos la inducción fue dependiente de la porción lipídica

ya que S-Omp19 no fue capaz de inducir la producción de los factores analizados, aún

siendo utilizado a una concentración elevada de 1000 ng/ml. Como esperábamos el LPS

de B. abortus no indujo la producción de ninguno de los factores analizados aún siendo

utilizado a una concentración elevada de 1000 ng/ml, mientras que 100 ng/ml de LPS de

E. coli indujo la secreción de altos niveles de todos los factores.

En resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio y en la sección 1.5. de este

trabajo fue demostrado que TLR2 media las respuestas frente al estímulo con HKBA y las

lipoproteínas de B. abortus en diferentes tipos celulares [77, 109]. En consecuencia

analizamos el rol de TLR2 en la inducción de citoquinas, quemoquinas y MMP-2 por parte

de los fibroblastos sinoviales en respuesta a HKBA y L-Omp19. Los fibroblastos sinoviales

fueron preincubados con anticuerpos bloqueantes anti-TLR2 o anti-TLR4 o sus respectivos

controles de isotipo y luego estimulados con HKBA y L-Omp19 durante 48 hs. El LPS de E.

coli y Pam3Cys fueron utilizados como agonistas controles de TLR4 y TLR2

respectivamente. La producción de citoquinas, quemoquinas y MMP-2 fue evaluada en el

sobrenadante de cultivo por ELISA y zimografía respectivamente. Como se muestra en la

Figura 28 la preincubación de los fibroblastos sinoviales con un anticuerpo anti-TLR4 no

tuvo ningún efecto en la producción de GM-CSF, IL-6, IL-8, MCP-1 o MMP-2 en respuesta

a HKBA o L-Omp19, pero como esperábamos bloqueó significativamente la producción de

estos factores en respuesta al LPS de E. coli (P < 0,001). Por el contrario, la preincubación

con un anticuerpo anti-TLR2 inhibió significativamente la producción de todos los factores

analizados en respuesta a Pam3Cys, L-Omp19 y HKBA (P < 0,001). Los controles de

isotipo no tuvieron efecto en ninguna de las respuestas investigadas.


Figura 27. B. abortus induce la secreción de MMP-2 y citoquinas por parte de los fibroblastos sinoviales.

Contro

l 7

HKBA 108

HKBA 10

9

HKBA 10L-O

mp19 1

0

L-Omp1

9 100

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 100

0Cys

3

Pam LPS BaLPS Ec

0

500

1000

******

***

***

***

***

***

***IL

-6 (p

g/m

l)Con

trol 7

HKBA 108

HKBA 10

9

HKBA 10L-O

mp19 10

L-Omp1

9 100

L-Omp1

9 100

0

S-Omp19

1000 Cys

3

Pam LPS BaLPS Ec

0

40

80 **

*****

****

*

MCP

-1 (n

g/m

l)

Contro

l 7

HKBA 108

HKBA 10

9

HKBA 10L-O

mp19 10

L-Omp19

100

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 1000 Cys

3

Pam LPS BaLPS Ec

0

125

250*** *** ***

********* ******

GM

-CSF

(pg/

ml)

Contro

l 7

HKBA 108

HKBA 10

9

HKBA 10L-O

mp19 1

0L-O

mp19 1

00

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 100

0Cys

3

Pam LPS BaLPS Ec

0

600

1200

***

*****

*** ***

***

******

IL-8

(pg/

ml)

La producción de GM-CSF, MCP-1, IL-8, IL-6 y MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los fibroblastos sinoviales estimulados con HKBA (107 a 109 bacterias /ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) durante 48 h por ELISA . *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control (sin estímulo). Con

trol 8

HKBA 10LPS Ec 1

00LPS Ba 1

000

L-Omp1

9 100

S-Omp1

9 100

0Cys

503

Pam

0

50

100 *** *** *** ***

MM

P-2

(ng/

ml)


Figura 28. B. abortus induce la secreción de MMP-2 y citoquinas por parte de los fibroblastos sinoviales, y este efecto está mediado por L-

Omp19 a través del reconocimiento de TLR2.

HKBA LPS Ec

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Sin

trat

ar

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Sin

trat

ar

LPS

Ba

Cont

rol

HKBA LPS Ec

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Sin

trat

ar

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Sin

trat

ar

LPS

Ba

Cont

rol

L-OMP19 Pam3Cys

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Sin

trat

ar

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Sin

trat

ar

Cont

rol

L-OMP19 Pam3Cys

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Sin

trat

ar

a-TL

R4

a-TL

R2

Isot

ipo

Sin

trat

ar

Cont

rol

Los fibroblastos sinoviales fueron preincubados con anticuerpos bloqueantes anti-TLR2 o anti-TLR4 o un control de isotipo durante 1 h, y luego estimulados con HKBA (107 UFC /ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), L-Omp19 (100ng/ml) o Pam3Cys (50 ng/ml). Luego de 48 hs. de cultivo se evaluó la producción de citoquinas por ELISA y de MMP-2 por zimografía. ***P<0,001 versus el tratamiento con anti-TLR2 o anti-TLR4 (según cada caso).

0

750

1500

HKBA LPS Ec L-Omp19 Pam3Cys

*** *** *** ***

Cont

rol

LPS

Ba

IL-6

(pg/

ml)

B

0

750

1500


*** *** *** ***

Con

trol

LPS

Ba

IL-8

(pg/

ml)

0

200

400

HKBA LPS Ec L-OMP19 Pam3Cys

*** ******

***

Sin tratara-TLR2a-TLR4Isotipo

Cont

rol

LPS

Ba

GM

-CSF

(pg/

ml)

0

300

600


*** ***

******

Cont

rol

LPS

Ba

MCP

-1 (p

g/m

l)


Estos resultados indican que la secreción de citoquinas, quemoquinas y MMP-2 por

parte de los fibroblastos sinoviales en respuesta a HKBA depende del reconocimiento de

ligandos vía TLR2. Además estos resultados sugieren fuertemente que los ligandos TLR2

son las lipoproteínas de Brucella. Por el contrario el LPS de B. abortus, no esta involucrado

en la producción de citoquinas, quemoquinas o MMP-2 por parte de los fibroblastos

sinoviales en respuesta a HKBA.

10. B. abortus y L-Omp19 inducen una respuesta inflamatoria en la articulación de la rodilla de ratones BALB/c.

Para determinar la relevancia in vivo de nuestra hipótesis, utilizamos el modelo

murino. Ratones BALB/c fueron inoculados con HKBA, L-Omp19 y S-Omp19 en la

articulación de la rodilla de los miembros posteriores. Luego de 5 días los animales fueron

sacrificados. Las rodillas fueron separadas para preparar un homogenado de tejido y medir

la producción de citoquinas por ELISA y la expresión de MMPs por zimografía, o fijadas y

embebidas en parafina para realizar cortes histológicos que fueron teñidos con eosina-

hematoxilina. Como se muestra en la Figura 29 A los niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-

1 e IL-8 aumentaron significativamente (P < 0,01) en las rodillas de los ratones inoculados

con HKBA, L-Omp19 o con el LPS de E. coli (control positivo), comparado con las rodillas

inoculadas con PBS (control negativo). Por el contrario, los niveles de las citoquinas no se

vieron incrementados en las rodillas de los ratones inoculados con S-Omp19. Los niveles

de expresión de MMP-2 y MMP-9 se incrementaron en las rodillas inoculadas con HKBA,

L-Omp19 o LPS de E. coli comparado con las rodillas inoculadas con el vehículo en el que

están disueltos los antígenos (PBS), y permanecieron sin modificarse en las rodillas

inoculadas con S-Omp19 (Figura 29 B).

Como se muestra en la Figura 30 los cortes histológicos teñidos con eosina-

hematoxilina de las rodillas inoculadas con HKBA, L-Omp19 o LPS de E. coli exhibieron un

infiltrado inflamatorio (neutrófilos y monocitos), vasodilatación, estasis, edema e

hiperplasia sinovial, mientras que aquellas inoculadas con S-Omp19 o PBS solo mostraron

una extravasación de glóbulos rojos debido al procedimiento de inyección aplicado. No se

observó reclutamiento de ningún leucocito en la articulación contralateral de los animales

inoculados con los antígenos (no mostrado) o de la articulación de los animales inoculados

con PBS.


Figura 29. B. abortus y L-Omp19 inducen una respuesta inflamatoria en la articulación de la rodilla de ratones BALB/c.

6

HKBA 10L-O

mp19S-O

mp19

Ec LPS

Contro

l

0

2500

5000

**

***

**

MCP

-1 (p

g/m

l)

6

HKBA 10L-O

mp19

S-Omp1

9

Ec LPS

Contro

l

0

90

180***

*** ***

TNF-

a (p

g/m

l)

6

HKBA 10L-O

mp19S-O

mp19

Ec LPS

Contro

l

0

75

150***

*****

IL-1

b (p

g/m

l)

6

HKBA 10L-O

mp19

S-Omp1

9

Ec LPS

Contro

l

0

400

800 ***

******IL

-6 (p

g/m

l)

6

HKBA 10L-O

mp19

S-Omp1

9

Ec LPS

Contro

l

0

20

40***

***

***

IL-8

(ng/

ml)

A

Cont

rol

HKBA 10

6

L-Omp1

9 S-

Omp19

EcLP

S

Cont

rol

HKBA 10

6

L-Omp1

9 S-

Omp19

EcLP

S B

MMP-9

MMP-2

Ratones Balb/c fueron inyectados con HKBA (106 bacterias/ml), L-Omp19 (100 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), LPS de E. coli (100 ng/ml) o PBS (control) en las articulaciones de las rodillas y luego de 5 días los animales fueron sacrificados. Se separó la rodilla para preparar homogenados de tejido o para una evaluación histopatológica. Los extractos de tejido se utilizaron para medir la producción de citoquinas por ELISA (A) y la expresión de MMP por zimografía (B). **P<0,01; ***P<0,001 versus el control.


Estos resultados indican que la presencia de B. abortus dentro de la articulación

puede inducir una respuesta inflamatoria que conlleva a un infiltrado de monocitos y

neutrófilos.

11. Bursitis prepatelar causada por la infección con B. abortus: producción local de citoquinas proinflamatorias y gelatinasas

Por otro lado, pudimos corroborar que muchos de los mediadores de inflamación

estudiados en los modelos de infección con B. abortus desarrollados en nuestro laboratorio

estaban presentes en el líquido sinovial de un paciente con brucelosis prepatelar.

Determinamos la producción de varias citoquinas, quemoquinas y MMPs en dos muestras

de fluido sinovial de un paciente con bursitis prepatellar debida a una infección con B.

abortus. Una muestra fue tomada al inicio de la presentación de la bursitis y otra muestra 3

meses después.

Figura 30. B. abortus y L-Omp19 inducen una respuesta inflamatoria en la articulación de la rodilla de ratones BALB/c.

HKBA 106 L-Omp19 S-Omp19 Ec LPS Control HKBA 106 L-Omp19 S-Omp19 Ec LPS Control

Ratones Balb/c fueron inyectados con HKBA (106 UFC/ml), L-Omp19 (100 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), LPS de E. coli (100 ng/ml) o PBS (control) en las articulaciones de las rodillas y luego de 5 días los animales fueron sacrificados. Se realizó un examen histopatológico de las articulaciones representativas. Los paneles superiores muestran las imágenes tomadas en la magnitud original (100x), y los paneles inferiores muestran en detalle las áreas perisinoviales seleccionadas para documentar la presencia o ausencia de infiltrado leucocitario (magnitud 400x).


Los niveles de TNF-α, IL-1β, IL-8, MCP-1 e IFN- fueron determinados por ELISA.

Con el objetivo de realizar una comparación también se analizaron cinco muestras de

fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoidea y una muestra proveniente de un

paciente con artritis séptica de rodilla debido a una infección con S. aureus.

Tabla 1. Bursitis prepatelar debida a la infección por B. abortus: producción local de citoquinas.

Muestra TNF-α IL-1β IFN- IL-8 MCP-1

Bursitis 1 34.36 (32.24–36.47)

7.51 (7.12–7.90)

14.57 (10.13–19.00)

9.53 (9.30–9.75)

11.81 (0.72)

Bursitis 2 79.73 (76.34–83.12)

16.62 (15.08–18.16)

22.45 (20.04–24.87)

25.55 (25.23–25.89)

16.35 (1.23)

Artritis séptica

3.95 (3.90–4.00)

9.75 (9.50–10.01)

7.30 (7.00–7.60)

4.75 (4.50–5.00)

3.41 (3.40–3.42)

RA 1 4.68 (4.67–4.70)

3.32 (3.20–3.45)

10.50 (10.05–11.00)

3.62 (3.50–3.73)

2.10 (2.00–2.21)

RA 2 5.99 (5.98–6.00)

3.55 (3.50–3.60)

15.55 (15.10–16.00)

3.25 (3.20–3.30)

1.57 (1.53–1.60)

RA 3 3.37 (3.30–3.45)

2.77 (2.75–2.80)

8.05 (8.00–8.10)

4.05 (4.00–4.10)

1.15 (1.00–1.29)

RA 4 13.67 (13.60–13.74)

10.50 (10.00–11.00)

8.95 (8.90–9.00)

4.17 (4.14–4.20)

0.85 (0.84–0.85)

RA 5 8.11 (8.00–8.23)

9.73 (9.67–9.80)

12.15 (12.00–12.30)

4.14 (4.00–4.28)

2.27 (2.19–2.34)

La producción de citoquinas fue determinada por ELISA en el líquido sinovial de un paciente con bursitis brucelar (Bursitis 1, muestra tomada al momento de la presentación de la bursitis; Bursitis 2, muestra tomada 3 semanas más tarde); de 5 pacientes con artritis reumatoidea (RA 1-5) y de un paciente con artritis séptica. Los resultados estan expresados en ng/ml.


Como se muestra en la Tabla 1, los niveles de TNF-α, IL-8 y MCP-1 fueron elevados

en las dos muestras de fluido sinovial provenientes del paciente con bursitis, comparado

con las muestras provenientes de los pacientes con artritis reumatoidea y artritis séptica

Los niveles de IL-1β e IFN- de la muestra proveniente del paciente con bursitis en su

presentación inicial fueron similares a los detectados en las muestras de pacientes con

artritis reumatoidea y con artritis séptica, sin embargo los niveles en la muestra del

paciente con bursitis obtenida 3 meses después de la presentación se incrementaron

notablemente. Puede concluirse que los niveles de todos los factores analizados

aumentaron entre la muestra tomada durante la presentación inicial de la bursitis y la

tomada 3 meses después lo que evidencia la presencia de un proceso inflamatorio en

curso.

La presencia de MMPs fue analizada en las mismas muestras mencionadas en el

párrafo anterior mediante zimografía. La presencia de MMP-9 (90 kDa) fue detectada en

las dos muestras provenientes del paciente con bursitis, en dos de las muestras de los

pacientes con artritis reumatoidea y en la proveniente del paciente con artritis séptica

(Figura 31). También se detectó la presencia de MMP-2 (60 kDa) con menor actividad

gelatinasa en todas las muestras analizadas excepto en la proveniente del paciente con

artritis séptica. Estos resultados aportan una evidencia del rol de las MMPs in vivo en el

daño osteoarticular durante la infección por Brucella en el hombre.

Figura 31. Bursitis prepatelar debida a la infección por B. abortus: producción local de gelatinasas.

1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8

La producción de MMPs con actividad gelatinasa fue determinada por zimografía en el líquido sinovial de un paciente con bursitis brucelar (calle 1, muestra tomada al momento de la presentación de la bursitis; calle 2, muestra tomada 3 semanas mas tarde); Calles 3-7, muestras de 5 pacientes con artritis reumatoidea, y Calle 8, muestra de un paciente con artritis séptica. La actividad gelatinasa en las regiones de peso molecular 90 y 60 kDa esta indicada por una flecha superior y otra inferior, respectivamente.


Capítulo I Discusión

En la mayoría de los casos de artritis séptica y osteomielitis, el daño en el hueso y en

las articulaciones resulta a partir de una reacción inflamatoria producida por la infección.

Esta inflamación incluye también un aumento en la actividad de las MMPs. En artritis

asociadas con la enfermedad de Lyme [228], en periodontitis causadas por diferentes

bacterias [229], y en artritis séptica causada por la infección con S. aureus [230] se ha

demostrado la presencia de niveles elevados de MMPs. En estos procesos patológicos las

fuentes de MMPs pueden ser las células residentes tales como osteoblastos, osteoclastos,

fibroblastos sinoviales o condrocitos, así como también fagocitos atraídos al foco

inflamatorio. La potencial contribución de las MMPs al daño tisular en la brucelosis

osteoarticular no había sido evaluada hasta el momento.

Osteoblastos

Los osteoblastos pueden producir varias MMPs en respuesta a diferentes estímulos,

entre las cuales MMP-2 es particularmente importante debido a que además de degradar

colágeno desnaturalizado, también degrada colágeno tipo I presente en el hueso, colágeno

tipo II presente en el cartílago y colágeno tipo IV de la membrana basal. [217, 255]. En el

presente trabajo se detectó un incremento en la actividad de MMP-2 en los sobrenadantes

de los osteoblastos humanos (línea celular hFOB) infectados con B. abortus. En estudios

previos se ha demostrado que la producción de MMPs puede ser estimulada por GM-CSF

en varias líneas celulares [231, 244]. Debido a que este factor es producido por los

osteoblastos infectados con B. abortus, evaluamos si GM-CSF podía inducir la producción

de MMP-2 por parte de estas mismas células. Nuestros resultados demostraron que GM-

CSF es el principal mediador en la producción de MMP-2 por osteoblastos infectados con

B. abortus. Aunque otras citoquinas tales como TNF-α e IL-1β han sido involucradas en la

inducción de MMP-2 en osteoblastos [256, 257], solo estudiamos el rol de GM-CSF dado

que los osteoblastos infectados con B. abortus no producen niveles detectables de

ninguna de las dos citoquinas.

Como se mencionó, los fagocitos atraídos al sitio de infección también pueden

producir MMPs. En concordancia con estudios previos realizados en nuestro laboratorio en

células de osteosarcoma [32], en este trabajo demostramos que los osteoblastos de la

línea hFOB responden a la infección con B. abortus con una producción significativa de

MCP-1 e IL-8, quimioatractantes de monocitos y neutrófilos, respectivamente.

Notablemente, se ha observado un infiltrado inflamatorio en la membrana sinovial y en el


hueso de pacientes con artritis brucelar y osteomielitis respectivamente [258]. Por lo tanto,

los osteoblastos infectados no solo estarían involucrados en la degradación de la matriz

mediante la secreción de MMP-2 sino también por su habilidad de reclutar monocitos y

neutrófilos al foco de infección. Estas últimas células responden a la infección con B.

abortus produciendo MMP-9, la cual degrada colágeno tipo V presente en el hueso y

colágeno tipo IV presente en la membrana basal [217, 253, 259, 260]. Los monocitos

infectados con B. abortus secretan citoquinas proinflamatorias como TNF-α e Il-1β. Se ha

reportado que ambas citoquinas inducen la expresión de MMPs en osteoblastos,

condrocitos, fibroblastos sinoviales, y monocitos, entre otros tipos celulares [243, 253, 261-

264]. Nuestros resultados demuestran que los sobrenadantes de los monocitos infectados

con B. abortus estimulan la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos y que

TNF-α es el principal mediador de este efecto. De acuerdo con estudios previos, Il-1β no

está involucrado en la inducción de MMP-2 [257, 265]. Por otro lado, los sobrenadantes de

los neutrófilos infectados también indujeron un incremento en la producción de MMP-2 por

parte de los osteoblastos.

Además nuestra hipótesis es que factores producidos por los osteoblastos podrían

influenciar la producción de MMPs por parte de los monocitos y neutrófilos. De hecho,

demostramos que los sobrenadantes de cultivo de los osteoblastos infectados indujeron la

producción de MMP-9 por parte de los monocitos mediante un mecanismo que depende

de GM-CSF, el cual también ha sido implicado en la producción de MMPs en otros

modelos [231, 247]. Esta citoquina también media la producción de TNF-α e IL-1β por

parte de los monocitos, como se demostró en este trabajo y en resultados previos

obtenidos en nuestro laboratorio [32]. Por lo tanto, evaluamos si el efecto estimulatorio de

GM-CSF derivado de los osteoblastos infectados estaba mediado por estas citoquinas.

Nuestros resultados demostraron que el efecto de GM-CSF fue indirecto, ya que este

factor indujo la secreción de TNF-α por parte de los monocitos, el cual a su vez fue el

principal responsable de estimular la secreción de MMP-9 por estas últimas células.

Por otro lado, también demostramos que los sobrenadantes de los osteoblastos

infectados inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos.

Fibroblastos sinoviales

Los fibroblastos sinoviales han sido reconocidos como mediadores del daño articular

en enfermedades inflamatorias tanto de origen infeccioso como no infeccioso. Además de

su rol patogénico directo debido a la producción de MMPs que degradan colágeno, los

fibroblastos sinoviales también pueden producir citoquinas, quemoquinas y factores de

crecimiento que, al igual que describimos para los osteoblastos, pueden mediar el

reclutamiento de leucocitos al sitio de infección osteoarticular. En concordancia con este

rol propuesto para los fibroblastos sinoviales en las artritis, en el presente trabajo


demostramos que B. abortus puede invadir y replicarse intracelularmente en los

fibroblastos sinoviales humanos y que dicha infección induce la producción de MMP-2 y

mediadores proinflamatorias por parte de estas células, así como también quemoquinas

MCP-1 e Il-8, que atraerían monocitos y neutrófilos al sitio de infección. Estas últimas

células podrían contribuir al daño tisular fagocitando a las bacterias en el foco de infección

y produciendo citoquinas proinflamatorias las cuales podrían inducir la secreción de más

MMPs por parte de los fibroblastos sinoviales. Además, los sobrenadantes de cultivo de

los monocitos y neutrófilos infectados con B. abortus indujeron la producción de MMP-2

por parte de los fibroblastos sinoviales. Nuestros resultados demuestran que TNF-α

desempeño un rol preponderante en la inducción de MMP-2 por parte de los fibroblastos

sinoviales. El rol de TNF-α como inductor de MMPs en fibroblastos sinoviales coincide con

resultados obtenidos en varios estudios previos [184, 249, 266] y con nuestros resultados

obtenidos en la interacción de osteoblastos y monocitos frente a la infección por Brucella

descritos previamente. Estudios realizados por otros autores revelaron que TNF-α se

encuentra incrementado en las articulaciones de los ratones con artritis causada por S.

aureus y que la secreción local de TNF-α en la cavidad articular puede correlacionarse con

el del daño articular [267]. Como ya mencionamos, en este trabajo demostramos que los

monocitos y los neutrófilos producen MMP-9 en respuesta a la infección por B. abortus y

también en respuesta a factores solubles liberados por los fibroblastos sinoviales

infectados, mediante un mecanismo mediado casi exclusivamente por GM-CSF en

monocitos y al menos parcialmente por IL-6 en neutrófilos.

La actividad de las MMPs se encuentra contrarrestada in vivo por la actividad de

inhibidores específicos, incluyendo TIMPs [215]. En las infecciones osteoarticulares

frecuentemente sucede que los TIMPs no se incrementan en la misma proporción que lo

hacen las MMPs, resultando en un incremento de la relación MMP/TIMP, lo cual agrava la

degradación del cartílago y del hueso promoviendo la destrucción de las articulaciones

[268, 269]. De acuerdo con estas observaciones, demostramos que los sobrenadantes de

los osteoblastos, fibroblastos sinoviales, monocitos o neutrófilos infectados con B. abortus

indujeron la degradación de gelatina en fase fluida bajo condiciones nativas en las cuales

los complejos MMP-TIMP no se encuentran disociados.

Las lipoproteínas de Brucella en la inducción de MMPs

La secreción de MMP-9 por parte de los monocitos y los neutrófilos fue también

producida por HKBA, indicando la presencia de uno o más componentes estructurales

involucrados. Dado que las lipoproteínas de Brucella son las responsables de muchos de

los fenómenos inducidos por la infección por Brucella en varios tipos celulares [108, 109,

232], nustra hipótesis es que dichas lipoproteínas también podrían mediar la inducción de


MMP-9 en los monocitos y en los neutrófilos. Demostramos que L-Omp 19, pero no su

forma no lipidada, indujo la producción de MMP-9 en estas células. El mismo efecto fue

observado para Pam3Cys, un lipohexapéptido sintético que imita la estructura lipídica de

las lipoproteínas bacterianas. En contraste, el LPS de B. abortus no fue capaz de inducir

estas respuestas.

Las lipoproteínas de Brucella inducen la producción de citoquinas proinflamatorias en

monocitos, como se demuestra en este trabajo y en estudios previos realizados en nuestro

laboratorio [109]. Nuestros resultados revelan que la producción de MMP-9 por parte de

monocitos está mediada por TNF-α. Por otro lado en nuestro laboratorio demostramos que

la producción de distintos mediadores por parte de los monocitos y de otros tipos celulares

en respuesta a HKBA y las lipoproteínas estaba mediada por TLR2 [108, 109, 232]. En

concordancia, observamos que la producción de MMP-9 por los monocitos dependía de

TLR2. Como el genoma de Brucella contiene al menos 80 genes putativos que codifican

para lipoproteínas, varias de las cuales son expresadas en la membrana externa, la

concentración de las lipoproteínas de Brucella en el foco de infección dentro del hueso

serían suficientes para ejercer los efectos biológicos ya descriptos.

Los fibroblastos sinoviales expresan TLRs, incluyendo TLR2 [270] y por lo tanto

también pueden producir citoquinas y MMPs no solo en respuesta a la infección sino que

también en respuesta a antígenos bacterianos [271, 272]. De acuerdo con esta última

observación demostramos que HKBA y L-Omp19 también fueron capaces de estimular la

producción de MMP-2 por parte de los fibroblastos sinoviales, y esto dependió del

reconocimiento por TLR2. En contraste, si bien los osteoblastos expresan algunos TLRs,

tales como TLR4 [273], TLR5 [274] y TLR9 [275], no ha sido descripto la expresión de

TLR2 por parte de estas células. Esto explicaría por que los osteoblastos no son capaces

de responder frente a los estímulos de HKBA o L-Omp19.

Modelo murino

Se utilizó un modelo murino de inoculación intraarticular para determinar si el

incremento de los mediadores proinflamatorias y MMPs en respuesta a los antígenos

bacterianos observados in vitro también ocurría in vivo. Notablemente, los niveles de TNF-

α, IL-1β, IL-6, MCP-1, IL-8, MMP-2 y MMP-9 se incrementaron en forma significativa en las

articulaciones de los ratones inoculados con HKBA y L-Omp19 (pero no en ratones

inoculados con S-Omp19) demostrando que la presencia de los antígenos de Brucella en

los tejidos articulares inducen la producción local de mediadores inflamatorios y MMPs.

Estos resultados coinciden con resultados previos en modelos murinos de artritis séptica

por staphylococci, streptococci y Borrelia burgdorferi [267, 276, 277].


Paciente con bursitis brucelar

En dos muestras de líquido sinovial provenientes de un paciente con bursitis

prepatelar ocasionada por la infección por B. abortus demostramos la presencia de altos

niveles de TNF-α e Il-1β junto con niveles incrementados de las quemoquinas (MCP-1 e

IL-8), así como también de IFN- y MMP-9. Los niveles de TNF-α, Il-8 y MCP-1 en las dos

muestras provenientes de la bursitis fueron más altos que los detectados en las muestras

de artritis reumatoidea y artritis séptica, y lo mismo se observó para Il-1β e IFN- en la

muestra de fluido sinovial tomada tres meses después de la presentación de la bursitis.

Los niveles de todos los marcadores inflamatorios evaluados se incrementaron en la

segunda muestra comparada con la inicial. Notablemente observamos que la actividad

gelatinasa fue más evidente en las muestras provenientes del caso de la bursitis y de los

casos de las artritis sépticas y artritis reumatoidea, los cuales exhibieron los niveles más

altos de TNF-α o IL-1β. Estos resultados aportan una evidencia in vivo del rol de las MMPs

en la patología osteoarticular por Brucella y el rol de las citoquinas proinflamatorias en la

producción de las mismas.

En resumen, demostramos que B. abortus es capaz de infectar y replicarse en

osteoblastos y fibroblastos sinoviales e inducir en estas células la producción de MMP-2,

citoquinas proinflamatorias y quemoquinas. Las quemoquinas derivadas de estos dos tipos

celulares pueden mediar la migración de monocitos y neutrófilos, los cuales responden a la

infección produciendo MMP-9. Por otro lado, puede establecerse una red de

estimulaciones recíprocas mediada por citoquinas entre las células residentes y las células

fagocíticas en respuesta a la infección con B. abortus aumentando aún mas la producción

de MMP-2 y MMP-9. La producción de MMPs y citoquinas por parte de los fibroblastos

sinoviales y los fagocitos atraídos puede producirse también en respuesta a antígenos de

B. abortus, en particular a sus lipoproteínas. Un aumento en la producción de mediadores

inflamatorios, entre ellos las MMPs, en respuesta a las lipoproteínas de Brucella pudo

demostrarse in vivo usando el modelo murino. En concordancia con estos resultados, la

presencia de los mediadores inflamatorios también fue determinada en el fluido sinovial de

un paciente con bursitis debido a una infección por B. abortus, aportando una evidencia del

rol de las MMPs in vivo en el daño osteoarticular durante la infección por Brucella en el

hombre.


CAPÍTULO II “Inducción de la osteoclastogéneis por la infección con B. abortus” Introducción

Como se mencionó en la introducción general el metabolismo del hueso es un

proceso complejo y muy controlado. En los individuos sanos existe un balance continuo

entre la degradación y la formación de hueso nuevo. Los osteoclastos son las únicas

células encargadas de degradar la matriz del hueso. Los mismos se originan a partir de la

fusión de precursores pertenecientes al linaje monocito/macrófago, lo cual resulta en la

generación de células multinucleadas gigantes con la capacidad de resorber hueso,

mediante la secreción de protones (disolución de matriz mineral) y de enzimas proteolíticas

(degradación de matriz orgánica). La degradación de la matriz orgánica involucra

principalmente dos clases de enzimas: las cisteína proteasas lisosomales como la

catepsina K [278], y las MMPs incluyendo principalmente MMP-9 [279].

La diferenciación de los osteoclastos requiere la presencia de dos factores críticos: el

factor estimulante de colonias macrofágicas (M-CSF) y el ligando del receptor activador de

NF-κB (RANKL). RANKL es expresado en la superficie de los osteoblastos o bien puede

ser liberado en forma soluble, aunque también se ha documentado su expresión por otros

tipos celulares como fibroblastos, linfocitos B y T activados [158, 159, 280]. Su actividad

biológica esta regulada por el inhibidor natural osteoprotegerina (OPG) que actúa como un

receptor soluble de RANKL que inhibe en forma competitiva la unión de este último a su

receptor RANK en la superficie de los precursores de osteoclastos [161].

Tanto la forma transmembrana como la soluble de RANKL inducen la formación de

osteoclastos in vitro cuando los precursores de estas células son cultivados con el factor

estimulante de colonias macrofágicas (M-CSF) [281]. Sin embargo, la diferenciación de los

osteoclastos también puede ocurrir por un proceso independiente de la interacción

RANKL-RANK. Se ha reportado que TNF-α [187, 188] e IL-6 [189] también son capaces de

inducir en forma directa la formación de osteoclastos in vitro, en presencia de M-CSF. Esto

sugiere que ambas citoquinas proinflamatorias juegan un rol importante en la

osteoclastogenesis.

En las enfermedades inflamatorias crónicas del hueso, se ha demostrado que tanto

RANKL como las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 son importantes en la

progresión de la enfermedad y destrucción ósea [282, 283]. Es importante destacar que los

macrófagos en los tejidos inflamados no solo tienen la capacidad de diferenciarse a

osteoclastos [284], sino que pueden acelerar la degradación del hueso a través de la

producción de citoquinas proinflamatorias [285].


En el capítulo I describimos un mecanismo por el cual B. abortus podría inducir daño

osteoarticular, mediante la producción de MMPs. Para establecer otra conexión entre la

infección por B. abortus y la pérdida de hueso, y teniendo en cuenta que la infección por

Brucella produce una potente respuesta inflamatoria local, nuestra hipótesis es que la

infección podría crear un microambiente que también promovería la generación de

osteoclastos, las únicas células capaces de degradar el hueso en forma eficiente. Por tal

motivo, evaluamos la capacidad de B. abortus de inducir la formación de osteoclastos, y

estudiamos los mecanismos inmunes y los determinantes bacterianos involucrados en

dicho proceso.


Capítulo II Materiales y métodos 1. Animales

Los ratones hembra de la cepa salvaje C57BL/6J, y MyD88 [84], TLR2 , TLR4 [286] y

TNFRp55 [287] KO de 6 a 8 semanas de edad fueron cedidos por la Universidad Federal

de Mina Gerais (Belo Horizonte, Brasil) o la Universidad de La Plata (Argentina). Los

animales fueron alojados en condiciones controladas de temperatura (22°C ± 2°C) y luz

artificial bajo ciclos de 12 h en un ambiente libre de patógenos en un gabinete de presión

positiva, y fueron provistos de comida y agua ad libitum.

2. Cultivo de bacterias

El cultivo de bacterias fue realizado tal como fue descripto en la sección 1 de

Materiales y Métodos del Capítulo I.

3. Lipoproteínas y LPS

Las lipoproteínas, el LPS de B. abortus y el LPS de E. coli fueron obtenidos como se

describió en las secciones 11 y 12 de Materiales y Métodos del Capítulo I.

4. Cultivo celular

Todos los experimentos fueron realizados en una atmósfera de 5% de CO2 a 37ºC en

medio de cultivo α-MEM, suplementado con 2mM de L-glutamina, 10% de SFB (Gibco, Life

Technologies), 100 U de penicilina/ml y 100 µg de estreptomicina/ml (medio completo). Los

macrófagos peritoneales inducidos mediante la inoculación de tioglicolato fueron aislados

como se describió previamente [109] a partir de los ratones C57BL/6J WT, MyD88, TLR2 o

TLR4 KO.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas fueron aisladas

de la sangre de donantes sanos de acuerdo a los lineamientos del Comité de Etica del

instituto IDEHU. Un consentimiento escrito fue obtenido de todos los donantes. Las células

fueron obtenidas mediante la centrifugación en un gradiente de Ficoll-Hypaque (GE

Healthcare Bio-Sciences) de sangre humana obtenida de individuos adultos sanos. Los

monocitos fueron aislados luego de centrifugar los PBMCs en un gradiente de Percoll (GE


Healthcare Bio-sciences) y fueron resuspendidos en medio completo. La viabilidad de las

células fue de > 95% en todos lo experimentos, según el test de exclusión de Azul Tripán.


Los macrófagos peritoneales murinos y los monocitos humanos fueron cultivados en

placas de 24 pocillos a una densidad de 5x105 células /ml en medio completo sin el

agregado de antibióticos. Las células fueron infectadas tal como fue descripto en la

sección 3 de Materiales y Métodos del Capítulo I.

El número de bacterias internalizadas por los macrófagos peritoneales luego de 24

hs. de infección fue la siguiente: MOI 25 (6.533 611,01 bacterias), MOI 50 (15.200

1.014,88 bacterias) y MOI 100 (27.466 3.946 bacterias).

6. Ensayos de infección o estimulación de los macrófagos/monocitos con B. abortus

Los macrófagos peritoneales de ratones C57BL/6J WT, MyD88, TLR2 o TLR4 KO, o

los monocitos humanos fueron infectados con B. abortus a diferentes MOIs o estimulados

durante 24 hs. con diferentes concentraciones de HKBA, L-Omp19, U-Omp19 (1000

ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), LPS de E. coli (100 ng/ml) y Pam3Cys (50 ng/ml).

Los medios condicionados fueron recolectados, esterilizados por filtración a través de un

filtro de nitrocelulosa con un poro de 0,22 µm, y guardados a -70ºC hasta su utilización

para la determinación de citoquinas por ELISA o los ensayos de diferenciación de

osteoclastos.

7. Ensayo de formación de osteoclastos

Los monocitos derivados de médula ósea fueron inducidos a diferenciarse a

osteoclastos como se ha descripto previamente [288]. En resumen, los precursores de

médula ósea de ratones C57BL/6J WT o TNFRp55 KO fueron cultivados en medio

completo conteniendo 5 ng/ml de rM-CSF murino (R&D Systems) durante 12 hs. en placas

de 24 pocillos. Las células no adherentes fueron recolectadas, cultivadas con 30 ng/ml de

M-CSF en placas de 24 pocillos durante otras 24 hs. y fueron utilizadas como monocitos

derivados de médula ósea, los cuales fueron sembrados en cubreobjetos de vidrio dentro

de placas de 24 pocillos (5x104 células/0,5 ml/pocillo) y cultivados durante 6 días en medio

completo conteniendo 30 ng/ml M-CSF y 0,2 ml del medio condicionado de los macrófagos

peritoneales infectados con B. abortus o estimulados con antígenos de Brucella. También

se determinó la capacidad de la infección directa de B. abortus (MOI 100) de estimular la


formación de osteoclastos. Como control positivo de la formación de osteoclastos los

monocitos derivados de médula ósea fueron estimulados con 50 ng/ml de TNF-α murino o

RANKL humano. Para identificar los osteoclastos las células fueron fijadas en

paraformaldehído 4% y teñidas para revelar la presencia de fosfatasa ácida resistente a

tartrato (TRAP) (Sigma-Aldrich). Las células multinucleadas (más de tres núcleos) TRAP

positivas fueron definidas como osteoclastos, y el número de osteoclastos fue determinado

por recuento al microscopio. Para obtener osteoclastos humanos a partir de monocitos

humanos, se llevó a cabo el mismo procedimiento utilizando citoquinas recombinantes y

factores de crecimiento de origen humano. En los ensayos de neutralización de TNF-α, los

sobrenadantes de los monocitos humanos infectados o estimulados como se describió

previamente fueron tratados con 20 g/ml de anticuerpo neutralizante anti-TNF-α (clon

Mab1, BD Biosciences) o su control de isotipo (clon 107.3, BD Biosciences).

8. Análisis de la expresión del receptor de vitronectina

La expresión del receptor de vitronectina (CD51) fue determinada por microscopía de

fluorescencia usando un anticuerpo anti-CD51 de ratón marcado con ficoeritrina (PE) (clon

RMV-7, BioLegend). Las células multinucleadas (más de tres núcleos) CD51 positivas

fueron definidas como osteoclastos.

9. Análisis por RT-PCR

El RNA total fue extraído con Trizol (Invitrogen) y el cDNA fue obtenido mediante

transcripción inversa, según las instrucciones del productor. Las secuencias de los

cebadores para RANK, catepsina K y Ckb utilizadas fueron las publicadas por otros

autores [289-291]. Se realizaron 30 ciclos (RANK), 35 ciclos (Ckb), o 20 ciclos (catepsina k

y β-actina) de desnaturalización (94ºC), hibridación (58ºC) y elongación (72ºC). Los

mismos fueron realizados en un termociclador MJ Mini (Bio-Rad). En cada ensayo se

incluyeron los correspondientes controles positivos y negativos para confirmar que solo

eran detectados los cDNA producto de la reacción de PCR y que ninguno de los reactivos

se encontraba contaminado con cDNA o DNA.

10. Medición de citoquinas y RANKL

Las concentraciones de IL-1β, IL-6, TNF-α (BD PharMingen), RANKL (R&D

Systems), y TGF-β (eBioscience) en los medios condicionados fue determinada mediante

kits de ELISA comerciales, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.


11. Ensayo de degradación de dentina

Los monocitos derivados de médula ósea de los ratones C57BL/6J WT o TNFRp55

KO, o los monocitos humanos fueron sembrados en discos de dentina (BD BioCoat

Osteologic, BD Biosciences) en placas de 96 pocillos (2x104 células/0,25 ml/pocillo): Los

mismos fueron cultivados en medio completo conteniendo 100 µl de medio condicionado

de monocitos humanos o macrófagos peritoneales de ratones WT infectados con B.

abortus o estimulados con L-Omp19 o S-Omp19, en presencia de M-CSF (30 ng/ml)

durante 6 días.

El medio y los reactivos fueron renovados todos los días para evitar la acidificación

del medio. Luego del cultivo con las células los discos de dentina fueron lavados con

NH4OH 1M para remover las células adherentes. Luego de un lavado con agua los discos

fueron visualizados por microscopía de luz para determinar y enumerar los focos de

degradación.

12. Evaluación de la formación de osteoclastos en un modelo in vivo

Los ratones C57BL/6J WT o TLR2 KO de 6 a 8 semanas de edad fueron inoculados

en forma intra-articular en las rodillas con 50 µl de HKBA (1x106 bacterias), L-Omp19 (500

ng), S-Omp19 (500 ng), LPS de E. coli (500 ng), Pam3Cys (50 ng) y el vehículo PBS, tal

como se describió en la sección 15 de materiales y métodos del Capítulo I. Los cortes

histológicos de la tibia proximal (7 µm) fueron teñidos para revelar la presencia de TRAP.

Las células multinucleadas (más de tres núcleos) TRAP positivas fueron definidas como

osteoclastos.


El analisis estadístico se realizó tal como fue descripto en la sección 17 de Materiales

y Métodos del Capítulo I.


Capítulo II RESULTADOS 1. Los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus inducen la diferenciación de los monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos

Los osteoclastos juegan un rol importante en la degradación del hueso y se originan

a partir de la fusión de precursores del linaje monocito/macrófago [292, 293]. Este proceso

podría involucrar mediadores solubles provenientes de células inflamatorias como pueden

ser los macrófagos infectados con B. abortus, junto con la presencia de M-CSF. [288].

Para determinar si factores solubles secretados por los macrófagos infectados con B.

abortus podían inducir la formación de osteoclastos a partir de los precursores de médula

ósea, estas últimas células fueron incubadas con M-CSF junto con sobrenadantes de

cultivo de macrófagos peritoneales murinos infectados con B. abortus. La generación de

osteoclastos fue determinada mediante la detección de células multinucleadas que

expresan fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y el receptor de vitronectina. Para

confirmar la presencia de osteoclastos maduros se determinó también, la expresión de tres

genes involucrados en el proceso de diferenciación, como RANK, catepsina K y creatina

quinasa b (Ckb) por RT-PCR. TNF-α y RANKL fueron usados como controles positivos.

Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus indujeron la formación de

células que expresaban TRAP (Figura 32 A y C), el receptor de vitronectina (Figura 32 B)

y los tres genes involucrados en la diferenciación de osteoclastos (Figura 32 D), mientras

que los sobrenadantes provenientes de macrófagos no infectados no tuvieron ningún

efecto. La magnitud de la osteoclastogénesis fue dependiente de la MOI utilizada para

infectar los macrófagos (P < 0,01). Como esperábamos, RANKL y TNF-α indujeron la

diferenciación de osteoclastos. El efecto directo de la bacteria en la osteoclastogénesis

también fue examinado. La infección con B. abortus de los monocitos derivados de médula

ósea no indujo osteoclastogénesis (datos no mostrados), por lo tanto podemos afirmar que

la bacteria sola no induce la diferenciación de osteoclastos. Estos resultados indican que

los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos peritoneales promueven la formación de

osteoclastos funcionales a partir de monocitos derivados de médula ósea.


Con

trol

MO

I 25

MO

I 50

MO

I 100

TN

F-

0

1250

2500

******

***

# cé

lula

s TR

AP

(+) /

wel

l

A

C D

B Control MOI 25 MOI 50 MOI 100 TNF-αControl MOI 25 MOI 50 MOI 100 TNF-α

Control MOI 25 MOI 50 MOI 100 TNF-α RANKLControl MOI 25 MOI 50 MOI 100 TNF-α RANKL

Figura 32. Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos infectados con B. abortus inducen la diferenciación de monocitos derivados de médula

ósea a osteoclastos.

Los monocitos derivados de la médula ósea fueron estimulados con los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos peritoneales infectados con B. abortus o no infectados (control), durante 24 h junto con M-CSF. RANKL (50 ng/ml) y TNF (50 ng/ml) se usaron como control positivo. Luego de 5 días se determinó la osteoclastogenesis mediante la detección de células multinucleadas TRAP-positivas (A y C) y que expresan el receptor de vitronectina (B). Se tomaron las imágenes representativas por miscroscopía de luz blanca (A) y microscopía de fluorescencia (B). Las células TRAP-positivas fueron identificadas y contabilizadas (C). Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados. **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin infectar. La upregulación de la expresión de tres genes involucrados en la diferenciación de osteoclastos-RANK, catepsina K y CkB- se determinó por RT-PCR (D).

Catepsina-K

Rank

β-actina

Ckb

Cont

rol

MO

I 100

MO

I 50

MO

I 25

TNF-

αCatepsina-K

Rank

β-actina

Ckb

Cont

rol

MO

I 100

MO

I 50

MO

I 25

TNF-

α

β-actina

Ckb

Cont

rol

MO

I 100

MO

I 50

MO

I 25

TNF-

α


2. Los macrófagos murinos infectados con B. abortus producen las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-6 e IL-1β, pero no RANKL o TGF-β

La habilidad de B. abortus de inducir la secreción de citoquinas proinflamatorias ha

sido reportada previamente en macrófagos y en diferentes tipos celulares [77, 96, 101,

106, 108, 109, 232, 233] sin embargo, hasta el momento no había sido determinado el rol

de las citoquinas en la inducción de la osteoclastogénesis durante la infección con

Brucella. En consecuencia, se determinó la producción de TNF-α, IL-1β, IL-6 y RANKL

soluble en los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos peritoneales infectados con B.

abortus. La infección indujo la secreción de niveles significativos de IL-6, IL-1β y TNF-α en

una forma MOI dependiente (P < 0,05) (Figura 33 A). Sin embargo, no fue detectada la

producción de RANKL por parte de los macrófagos infectados.

Para determinar si era necesaria la bacteria viva para producir una respuesta

proinflamatoria, los macrófagos fueron estimulados con HKBA. La producción de IL-6, IL-

1β y TNF-α se incrementó significativamente (P < 0,05) en los sobrenadantes de los

macrófagos estimulados con HKBA comparado con las células no estimuladas (Figura 33 A). En cambio, la estimulación con HKBA no indujo la secreción de RANKL. Dado que ha

sido demostrado que TGF-β puede inducir la osteoclastogénesis [285], decidimos medir

también los niveles de este factor. Los niveles de TGF-β en el sobrenadante de las células

infectadas con B. abortus o estimuladas con HKBA fueron similares a los de las células no

estimuladas (no mostrado).

Estos resultados indican que los macrófagos infectados con B. abortus secretan

citoquinas proinflamatorias pero no producen RANKL soluble o TGF-β. También sugiere

que la respuesta proinflamatoria puede ser inducida por componentes estructurales de B.

abortus.


A B Con

trol

MOI 25

MOI 50

MOI 100

6

HKBA 10

7

HKBA 10

8

HKBA 10

9

HKBA 10

0

2500

5000

*

**

**

*

**

****

TNF-

(pg/

ml)

Contro

l LPS Ec 1

0LPS Ba 1

000

Cys 50

3

Pam L-Omp19

10L-O

mp19 1

00L-O

mp19 1

000

S-Omp1

9 100

0

0

3500

7000

****

***

**

TNF-

(pg/

ml)

Contro

lMOI 2

5MOI 5

0MOI 1

00

6

HKBA 10

7

HKBA 10

8

HKBA 10

9

HKBA 10

0

550

1100**

*** ***

** **

*

IL-6

(pg/

ml)

Contro

lLPS Ec 1

0LPS Ba 1

000

Cys 50

3

Pam L-Omp1

9 10

L-Omp1

9 100

L-Omp1

9 100

0S-O

mp19 1

000

0

450

900

****

**

***IL

-6 (p

g/m

l)

Contro

lMOI 2

5MOI 5

0MOI 1

00

6

HKBA 10

7

HKBA 10

8

HKBA 10

9

HKBA 10

0

35

70

IL-1

(pg/

ml)

Contro

lLPS Ec 1

0LPS Ba 1

000

Cys 50

3

Pam L-Omp19

10L-O

mp19 1

00L-O

mp19 1

000

S-Omp19

1000

0

350

700 ***

IL-1

(pg/

ml)

Figura 33. Los macrófagos murinos infectados con B. abortus producen las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-6 e IL-1β, pero no RANKL o

TGF-β.

Los macrófagos peritoneales se infectaron con B. abortus a diferentes MOIs (25, 50, 100) o se estimularon con HKBA (106-109 bacterias/ml, A) y con LPS de E. coli (10 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 y 1000 ng/ml), U-Omp19 (1000 ng/ml), o Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) (B). La presencia de TNF-α, IL-6 e IL-1β se determinó en los sobrenadantes por ELISA.*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin infectar.


3. Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos murinos estimulados con L-Omp19 inducen la diferenciación de los monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos

Debido a que como ya se mencionó las lipoproteínas de Brucella (y no su LPS) son

las principales responsables de la inducción de citoquinas proinflamatorias en diferentes

tipos celulares, decidimos evaluar la contribución de las lipoproteínas en la producción de

los mediadores inflamatorios, y en la inducción de la osteoclastogénesis. Para ello, los

monocitos derivados de médula ósea fueron estimulados con los sobrenadantes de cultivo

de los macrófagos estimulados con L-Omp19, en presencia de M-CSF, y se evaluó la

formación de osteoclastos. La producción de TNF-α, IL-1β, IL-6 y RANKL en el

sobrenadante de cultivo de los macrófagos estimulados fue determinada por ELISA. Como

control positivo se usó TNF-α recombinante y el sobrenadante de cultivo de macrófagos

estimulados con LPS de E. coli. Demostramos que los sobrenadantes de cultivo de los

macrófagos estimulados con L-Omp19 indujeron la formación de osteoclastos a partir de

monocitos derivados de médula ósea, demostrado por la presencia de células

multinucleadas que expresan TRAP (P < 0,05), Ckb, RANK y catepsina K (Figura 34).

Asimismo, los macrófagos estimulados con L-Omp19 produjeron niveles significativos de

TNF-α, IL-1β e IL-6 en forma dosis dependiente (P < 0,01), pero no de RANKL (Figura 33 B). La secreción de citoquinas y la inducción de la formación de osteoclastos dependieron

de la lipidación de L-Omp19 ya que la versión no lipidada S-Omp19 fue incapaz de

producir estos fenómenos. El lipohexapeptido sintético Pam3Cys también indujo la

producción de los mediadores inflamatorios y la concomitante formación de osteoclastos,

lo cual confirma el requerimiento de la lipidación de L-Omp19 para inducir estos

fenómenos (Figura 33 B y 34). Por otro lado, no hubo un aumento significativo de los

niveles de las citoquinas en los sobrenadantes de macrófagos estimulados con el LPS de

B. abortus, y los mismos no fueron capaces de inducir la formación de osteoclastos

(Figura 43 B y 34). Como esperábamos TNF-α o el sobrenadante de cultivo de

macrófagos estimulados con LPS de E. coli indujeron la formación de osteoclastos (Figura 34).


A

Contro

lMOI 1

006

HKBA 10

7

HKBA 10LPS Ec 1

0

LPS Ba 100

0L-O

mp19 10

L-Omp19

100

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 1000

Cys 50

3

Pam

TNF-

0

750

1500 **

**

**** ** *

**

# d

e cé

lula

sTRA

P (+

)/wel

lB

C

Control LPS Ec 10LPS Ba 1000

L-Omp19 1000L-Omp19 100L-Omp19 10 S-Omp19 1000 Pam3Cys 50

HKBA 107HKBA 106

TNF-α

MOI 100Control LPS Ec 10LPS Ba 1000


HKBA 107HKBA 106

TNF-α

MOI 100

L-O

mp1

9 10

00

Cathepsin-K

Rank

Con

trol

LPS

Ba10

00

LPS

Ec10

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0

S-O

mp1

9 10

00

Pam

3Cys

50

MO

I 100

MO

I 25

HK

BA 1

06

HK

BA 1

07

TNF-

α

β-actin

Ckb

L-O

mp1

9 10

00

Cathepsin-K

Rank

Con

trol

LPS

Ba10

00

LPS

Ec10

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0

S-O

mp1

9 10

00

Pam

3Cys

50

MO

I 100

MO

I 25

HK

BA 1

06

HK

BA 1

07

TNF-

α

β-actin

Ckb

Cathepsin-K

Rank

Con

trol

LPS

Ba10

00

LPS

Ec10

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0

S-O

mp1

9 10

00

Pam

3Cys

50

MO

I 100

MO

I 25

HK

BA 1

06

HK

BA 1

07

TNF-

α

β-actin

Ckb

Figura 34. Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos murinos estimulados con L-Omp19 inducen la diferenciación de los monocitos

derivados de médula ósea a osteoclastos.

Los monocitos derivados de médula ósea fueron estimulados con sobrenadantes de los macrófagos peritoneales infectados con B. abortus o estimulados con HKBA (106y 107 bacterias/ml), LPS de E. Coli (10 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 y 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), o Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control), durante 24hs junto con M-CSF. TNF-α se utilizó como control positivo. Luego de 5 días, se determinó la osteoclastogénesis mediante la generación de células multinucleadas, TRAP-positivas. Se tomaron imágenes representativas por microscopía (A). Las células TRAP-positivas fueron contabilizadas (B). Los resultados fueron expresados como la media ± SEM., a partir de duplicados.*P<0,05; **P<0,01 versus el control. El aumento de la expresión de RANK, catepsina K y CkB se determinó por RT-PCR (C).


4. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos murinos infectados o estimulados con L-Omp 19 y la concomitante osteoclastogénesis depende de la presencia de MyD88 y TLR2

Tal como mencionamos en el capitulo I la señalización a través de TLR2 es crucial en

las respuestas inflamatorias inducidas por B. abortus y L-Omp19 [77, 109, 233]. Para

evaluar el rol de TLR2 en la producción de citoquinas proinflamatorias, los macrófagos

peritoneales de ratones C57BL/6J WT o de MyD88 KO, TLR2 KO y TLR4 KO fueron

infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 y la producción de citoquinas fue

analizada en los sobrenadantes de cultivo por ELISA. Los macrófagos provenientes de

ratones WT secretaron IL-6 y TNF-α cuando fueron infectados con B. abortus o

estimulados con L-Omp19. Por otro lado, la infección con B. abortus o la estimulación con

L-Omp19 no indujo la secreción de ninguna de las dos citoquinas en ratones MyD88 KO

(Figura 35). Estos resultados indican que la secreción de IL-6 y TNF-α inducida por B.

abortus o sus lipoproteínas es dependiente de MyD88, lo cual sugiere la participación de

un TLR. La producción de TNF-α e IL-6 por parte de los macrófagos provenientes de

ratones TLR2 KO disminuyó en forma significativa comparado con los ratones WT en

respuesta a la infección por B. abortus o la estimulación con L-Omp19. Por otro lado, los

macrófagos de los ratones TLR4 KO produjeron niveles de TNF-α e IL-6 similares a los

provenientes de los ratones WT (Figura 35). Como esperábamos los macrófagos de los

ratones TLR2 KO y TLR4 KO no produjeron citoquinas proinflamatorias en respuesta a sus

ligandos agonistas (Pam3Cys y LPS de E. coli, respectivamente), mientras que los

macrófagos de ratones WT respondieron a ambos antígenos (Figura 35).

Para verificar el rol de TLR en la inducción de la osteoclastogénesis, los

sobrenadantes de cultivo de los macrófagos de ratones C57BL/6J WT, MyD88 KO, TLR2

KO y TLR4 KO infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19, fueron utilizados

para estimular los monocitos derivados de médula ósea en presencia de M-CSF.

La formación de osteoclastos solo fue inducida por los sobrenadantes de cultivo de

los macrófagos de ratones WT o TLR4 KO, tanto infectados con B. abortus como también

estimulados con L-Omp19. Los sobrenadantes de los macrófagos de ratones MyD88 KO o

TLR2 KO infectados o estimulados con L-Omp19 no fueron capaces de inducir

osteoclastogénesis (Figura 36). Los sobrenadantes de los macrófagos estimulados con S-

Omp19 no indujeron la formación de osteoclastos en ningún caso. Como esperábamos, los

sobrenadantes de los macrófagos de ratones TLR2 KO o TLR4 KO estimulados con

Pam3Cys o LPS de E. coli respectivamente, no indujeron la formación de osteoclastos

(Figura 36).


En conjunto estos resultados indican que la señalización vía TLR2 esta involucrada

en la producción de citoquinas en respuesta a B. abortus o sus lipoproteínas, y estas

respuestas determinan la concomitante osteoclastogénesis.


Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0L-

Om

p19

1000

S-O

mp1

9 10

00Cy

s 50

3Pa

m LPS

Ec 1

00

3500

7000

TNF-

(pg/

ml)

Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0L-

Om

p19

1000

S-O

mp1

9 10

00Cy

s 50

3Pa

m LPS

Ec 1

00

3500

7000

**

**** **

TNF-

(pg/

ml)

Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0L-

Om

p19

1000

S-O

mp1

9 10

00Pa

m3C

ys 5

0LP

S Ec

100

600

1200 ***

*******

*

IL-6

(pg/

ml)

Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0L-

Om

p19

1000

S-O

mp1

9 10

00Pa

m3C

ys 5

0LP

S Ec

100

600

1200

IL-6

(pg/

ml)

A

B

Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0L-

Om

p19

1000

S-O

mp1

9 10

00Cy

s 50

3Pa

m LPS

Ec 1

00

3500

7000 ***

TNF-

(pg/

ml)

Con

trol

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0L-

Om

p19

1000

S-O

mp1

9 10

00Cy

s 50

3Pa

m LPS

Ec 1

00

3500

7000

**

**

**

***

**

TNF-

(pg/

ml)

WT MyD88 KO

TLR4 KO TLR2 KO

WT MyD88 KO TLR2 KO

Figura 35. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos murinos infectados o estimulados con L-Omp 19 depende de la

presencia de MyD88 y TLR2.

TLR4 KO

Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0L-

Om

p19

1000

S-O

mp1

9 10

00Pa

m3C

ys 5

0LP

S Ec

100

600

1200***

IL-6

(pg/

ml)

Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0

L-O

mp1

9 10

00

S-O

mp1

9 10

00

Pam

3Cys

50

LPS

Ec 1

00

600

1200***

****

*

IL-6

(pg/

ml)

Los macrófagos peritoneales de los ratones Wt, MyD88, TLR2 y TLR4 KO fueron infectados con B. abortus a MOI 100 o estimulados con L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o LPS de E. Coli (10 ng/ml) o no estimulados (control). Se determinó la producción de TNF-α e IL-6 en sobrenadantes por ELISA (A y B). *P<0,05; **P<0,01;***P<0,001 versus el control .


Contro

lLP

S Ec 10

L-Omp19

1000

L-Omp19 1

00

L-Omp1

9 10

S-Omp19

1000

Pam3C

ys50

MOI 100

WT MyD88 KO TLR2 KO TLR4 KO

Contro

lLP

S Ec 10

L-Omp19

1000

L-Omp19 1

00

L-Omp1

9 10

S-Omp19

1000

Pam3C

ys50

MOI 100

WT MyD88 KO TLR2 KO TLR4 KOWT

MyD88 KO

TLR2 KO

TLR4 KO

B A

Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp

19 1

0L-

Om

p 19

100

L-O

mp

19 1

000

S-O

mp

19 1

000

Cys

503

Pam

LPS

Ec0

600

1200***

***

****** ***

*

# de

célu

las

TRA

P (+

) /w

ell

Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp

19 1

0L-

Om

p 19

100

L-O

mp

19 1

000

S-O

mp

19 1

000

Cys

3Pa

m LPS

Ec0

600

1200

# de

célu

las

TRA

P (+

) /w

ell

Cont

rol

MO

I 100

L-O

mp

19 1

0L-

Om

p 19

100

L-O

mp

19 1

000

S-O

mp

19 1

000

Cys

3Pa

m LPS

Ec0

600

1200

***

# de

célu

las T

RAP

(+)/w

ell

Con

trol

MO

I 100

L-O

mp

19 1

0L-

Om

p 19

100

L-O

mp

19 1

000

S-O

mp

19 1

000

Cys

3Pa

mp LP

S Ec

0

600

1200 ***

******

****

# de

célu

las T

RAP

(+)/w

ell

Figura 36. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos murinos infectados o estimulados con L-Omp19 y la concomitante

osteoclastogénesis depende de la presencia de MyD88 y TLR2.

Los monocitos derivados de la médula ósea de los ratones WT fueron estimulados con sobrenadantes de macrófagos peritoneales provenientes de ratones WT, MyD88, TLR2 y TLR4 KO que fueron infectados con B. abortus a MOI 100 o estimulados con L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o LPS de E. Coli (10 ng/ml) o no estimulados (control). Luego de 5 días, se determinó la osteoclastogénesis mediante la generación de células multinucleadas, TRAP-positivas. Se tomaron imágenes representativas por microscopía (A). Las células TRAP-positivas fueron identificadas y contabilizadas (B). Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados. *P<0,05; ***P<0,001.


5. La formación de osteoclastos inducida por los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 está mediada por TNF-α

Como se mencionó anteriormente TNF-α es una citoquina clave que puede estar

involucrada en la diferenciación de monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos

[187, 188]. Para evaluar el rol de TNF-α en la formación de osteoclastos inducida por B.

abortus o L-Omp19, los monocitos derivados de médula ósea de ratones TNFRp55 KO

fueron estimulados con sobrenadantes de cultivo de macrófagos peritoneales de ratones

C57BL/6J WT, infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 y se evaluó la

osteoclastogénesis mediante la detección de células multinucleadas que expresan TRAP.

Como control se utilizaron precursores de médula ósea de los ratones WT. Los

sobrenadantes de cultivo de macrófagos infectados con B. abortus o estimulados con L-

Omp19 no fueron capaces de inducir la diferenciación a osteoclastos a partir de los

monocitos derivados de la médula ósea provenientes de los ratones TNFRp55 KO (Figura 37 A y B). Por otro lado, ambos sobrenadantes sí fueron capaces de inducir

osteoclastogénesis de los monocitos derivados de médula ósea provenientes de los

ratones WT. Los sobrenadantes de los macrófagos estimulados con S-Omp19 no

indujeron la diferenciación a osteoclastos de los monocitos provenientes de ninguna de las

dos cepas de ratones (Figura 37 A y B). Como esperábamos TNF-α no indujo la

diferenciación a osteoclastos de los monocitos derivados de medula ósea de ratones

TNFRp55 KO, pero si indujo la diferenciación a osteoclastos de los provenientes de los

ratones WT. Por otro lado, RANKL indujo la osteoclastogénesis de los monocitos

derivados de medula ósea provenientes de ambas cepas de ratones. Estos resultados

indican que TNF-α secretado por los macrófagos peritoneales infectados con B. abortus o

estimulados con L-Omp19 determina la osteoclastogénesis actuando a través de TNFRI.


Cont

rol

TNF-

RAN

KL

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0

L-O

mp1

9 10

00

S-O

mp1

9 10

00

Cys

50

3Pa

m

0

1250

2500

# de

célu

las T

RAP

(+) /

wel

l

******

******

*****

***

WT

A

B p55TNF- -/-

Control MOI 100TNF-α RANKL

p55TNF- -/-

p55TNF- -/-

WT

WT


Control MOI 100TNF-α RANKL

p55TNF- -/-

p55TNF- -/-

WT

WT


Cont

rol

TNF-

RAN

KL

MO

I 100

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0

L-O

mp1

9 10

00

S-O

mp1

9 10

00

Cys5

0 3

Pam

0

1250

2500

***

# de

célu

las T

RAP

(+) /

wel

l

Figura 37. La formación de osteoclastos inducida por los sobrenadantes de macrófagos murinos infectados por B.abortus o estimulados con L-Omp19

está mediada por TNF-α.

Monocitos derivados de médula ósea de ratones TNFRp55 -/- o WT fueron estimulados con sobrenadantes de macrófagos peritoneales provenientes de ratones WT los cuales fueron infectados previamente con B. abortus a una MOI 100 o estimulados con L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control). Luego de 5 días, se determinó la osteoclastogénesis mediante la detección de células multinucleadas, TRAP-positivas. Se tomaron imágenes representativas por microscopía (A). Las células TRAP-positivas fueron identificadas y contabilizadas (B). Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados.**P<0,01; ***P< 0,001.


6. Los monocitos humanos se diferencian a osteoclastos en respuesta a la infección con B. abortus a través de la secreción de TNF-α

Como mencionamos, la brucelosis osteoarticular es la forma localizada más común

de la brucelosis activa en el hombre. Por lo tanto, decidimos estudiar si el efecto de B.

abortus y L-Omp19 en la osteoclastogénesis podía extenderse a los monocitos humanos,

ya que ha sido demostrado que los monocitos humanos de sangre periférica tienen la

capacidad de diferenciarse a osteoclastos [294, 295]. Para lograr este objetivo, los

monocitos humanos obtenidos de sangre periférica fueron estimulados con sobrenadantes

de cultivo de monocitos infectados con B. abortus o estimulados con HKBA, L-Omp19 o S-

Omp19, en presencia de M-CSF, y la formación de osteoclastos fue determinada por la

presencia de células multinucleadas que expresan TRAP. Los sobrenadantes de cultivo de

los monocitos infectados con B. abortus o estimulados con HKBA o L-Omp19 indujeron la

formación de osteoclastos. Por otro lado, los sobrenadante de los monocitos estimulados

con S-Omp19 no tuvieron ningún efecto.

A continuación nos preguntamos si TNF-α estaba involucrado en la inducción de la

osteoclastogénesis. Los monocitos fueron estimulados con sobrenadantes de monocitos

infectados o estimulados con los diferentes antígenos, en presencia de M-CSF y de un

anticuerpo neutralizante anti-TNF-α. Como se observa en la Figura 38 la presencia del

anticuerpo redujo casi completamente la osteoclastogenesis inducida por los

sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus o estimulados con HKBA o L-

Omp19, mientras que el control de isotipo no tuvo ningún efecto (P<0,001) (Figura 38).

Estos resultados indican que TNF-α secretado por los monocitos en respuesta a B. abortus

o sus lipoproteínas estaría involucrado en la inducción de la osteoclastogénesis y por lo

tanto en el daño observado en la focalización osteoarticular de la brucelosis humana.


Cont

rol

MO

I 25

MO

I 50

MO

I 100 6

HK

BA 1

0 7H

KBA

10

LPS

Ec 1

0

LPS

Ba 1

000

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0

L-O

mp1

9 10

00

S-O

mp1

9 10

00

Cys 5

03

Pam

TN

F-

RAN

KL0

700

1400 ***************

***

**

******

******

**

# de

célu

las T

RAP

(+) /

wel

l

Cont

rol

MO

I 25

MO

I 50

MO

I 100

HK

BA 1

06

HK

BA 1

07

LPS

Ec 1

0

LPS

Ba 1

000

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0

L-O

mp1

9 10

00

S-O

mp1

9 10

00

Cys 5

03

Pam

TN

F-

RAN

KL0

700

1400 ***

# de

célu

las T

RAP

(+)/w

ell

Cont

rol

MO

I 25

MO

I 50

MO

I 100

HK

BA 1

06

HK

BA 1

07

LPS

Ec 1

0

LPS

Ba 1

000

L-O

mp1

9 10

L-O

mp1

9 10

0

L-O

mp1

9 10

00

U-O

mp1

9 10

00

Pam

3Cys

50

TNF-

RAN

KL0

700

1400 *** ************

***

**

******

******

**

# de

célu

las T

RAP

(+) /

wel

l

A

B

C

Figura 38. Los monocitos humanos se diferencian a osteoclastos en respuesta a la infección por B. abortus a través de la secreción de TNF-α.

Los monocitos humanos de sangre periférica fueron estimulados con sobrenadantes de cultivo de otros monocitos humanos de sangre periférica previamente infectados con B. abortus a diferentes MOIs o estimulados con HKBA (106 y107 UFC/ml), LPS de E. coli (10 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), U-Omp19 (1000 ng/ml) o Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control), durante 24hs junto con M-CSF. TNF-α (50 ng/ml) fue utilizado como control positivo. Luego de 5 días, se determinó la osteoclastogénesis mediante la detección de células multinucleadas TRAP-positivas (A), en presencia de anticuerpos anti-TNF-α (B) o un control de isotipo (C). Las células multinucleadas TRAP-positivas fueron identificadas y contabilizadas. Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados. **P<0,01; ***P<0,001 versus el control .


7. L-Omp19 y B. abortus inducen osteoclastos diferenciados capaces de degradar matriz mineral

Nuestra hipótesis se basa en que la infección con B. abortus podría crear un

microambiente que promovería la generación de osteoclastos provocando pérdida de

hueso. En consecuencia, evaluamos la actividad funcional de los osteoclastos formados en

respuesta a la infección por B. abortus mediante su habilidad para degradar dentina.

Para llevar a cabo este objetivo, se realizaron los ensayos de diferenciación sobre

una matriz de dentina. Los osteoclastos diferenciados a partir del tratamiento con los

sobrenadantes de cultivo de monocitos humanos o macrófagos peritoneales murinos

infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 indujeron la degradación de dentina

en forma dosis dependiente por parte de monocitos humanos o monocitos derivados de

medula ósea, respectivamente (Figura 39). Por otro lado, los sobrenadantes de cultivo de

las células estimuladas con S-Omp19 o no estimuladas no tuvieron ningún efecto. En los

experimentos realizados con células humanas la degradación de dentina fue bloqueada

mediante la presencia de un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α pero no lo hizo el control

de isotipo (Figura 39 C y D). Asimismo, los monocitos derivados de médula ósea

provenientes de ratones TNFRp55 KO fueron incapaces de degradar dentina frente a

todos los estímulos (Figura 39 A y B).

Estos resultados indican que los sobrenadantes de cultivo de los monocitos humanos

o macrófagos murinos infectados con B. abortus promueven la formación de osteoclastos

funcionales a partir de monocitos humanos o monocitos derivados de médula ósea, a

través de TNF-α.


Contro

lMOI 2

5MOI 5

0MOI 1

00L-O

mp19 10

L-Omp1

9 100

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 100

0

TNF-

0

50

100

150

# fo

cos d

e de

grad

ació

n/ w

ell

Contro

lMOI 2

5MOI 5

0MOI 1

00L-O

mp19 10

L-Omp1

9 100

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 100

0

TNF-

0

50

100

150***

******

****

# fo

cos d

e de

grad

ació

n/ w

ell

Contro

lMOI 2

5MOI 5

0MOI 1

00L-O

mp19 1

0L-O

mp19 10

0

L-Omp1

9 100

0

S-Omp19

1000

TNF-

0

50

100

150

# fo

cos d

e de

grad

ació

n/ w

ell

A

B

D Sin tratar anti-TNF-α Isotipo

TNFRp55KO WT

MOI 100 TNF-α

TNFRp55 KO

WT

Control L-Omp19 1000L-Omp19 100L-Omp19 10 S-Omp19 MOI 50MOI 25 MOI 100 TNF-α

TNFRp55 KO

WT

Control L-Omp19 1000L-Omp19 100L-Omp19 10 S-Omp19 MOI 50MOI 25

Contro

lMOI 2

5MOI 5

0MOI 1

00L-O

mp19 1

0L-O

mp19 1

00

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 100

0

TNF-

0

50

100

150***

******

****

# fo

cos d

e de

grad

ació

n/ w

ell

Figura 39. L-Omp19 y B. abortus inducen osteoclastos diferenciados capaces de degradar matriz mineral.

La actividad funcional de los osteoclastos inducidos por B. abortus y L-Omp19 fue determinada mediante la habilidad de degradar dentina. Los monocitos derivados de médula ósea de los ratones WT o TNFRp55 -/- (A y B) o los monocitos humanos periféricos (C y D) fueron cultivados en discos de dentina bajo las mismas condiciones ya descriptas. Luego de 5 días, las células fueron removidas, y se evaluó la degradación de la dentina por microscopía (A y C), y se cuantificó el número de focos de resorción (B y D). Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados.. **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin tratamiento.

C

Contro

lMOI 2

5MOI 5

0MOI 1

00L-O

mp19 10

L-Omp1

9 100

L-Omp1

9 100

0

S-Omp1

9 100

0

TNF-

0

50

100

150***

******

****

# fo

cos

de d

egra

daci

ón/ w

ell


8. HKBA y L-Omp19 inducen la formación de osteoclastos en la tibia de ratones mediante un mecanismo dependiente de TLR2

Para determinar la relevancia de nuestra hipótesis in vivo, ratones C57BL/6J WT o

TLR2 KO fueron inoculados con HKBA, L-Omp19 y S-Omp19 en las rodillas. Como

controles positivos se usaron LPS de E. coli y Pam3Cys y como control negativo el

vehículo en el que están disueltos los antígenos (PBS). Luego de 5 días los animales

fueron sacrificados, las rodillas fueron removidas, y se hicieron cortes histológicos de la

tibia proximal los cuales fueron teñidos para revelar la actividad de TRAP. Se observó una

extensa osteoclastogénesis, determinada por la presencia de células multinucleadas que

expresan TRAP, en las tibias de todos los ratones WT inoculados con HKBA, L-Omp19 y

LPS de E. coli, mientras que en los ratones inoculados con S-Omp19 o PBS no se observó

la formación de osteoclastos. Por otro lado, solo el LPS de E. coli fue capaz de inducir la

formación de células multinucledas que expresan TRAP en los ratones TLR2 KO (Figura 40). Estos resultados indican que la presencia de B. abortus y L-Omp19 dentro del tejido

óseo es capaz de promover una respuesta inflamatoria que provoca la formación de

osteoclastos, y que este fenómeno esta mediado por TLR2.

Control LPS Ec 500L-Omp19 500 S-Omp19 500HKBA 106 Pam3Cys

WT

TLR2-/-

Control LPS Ec 500L-Omp19 500 S-Omp19 500HKBA 106 Pam3Cys

WT

TLR2-/-

Figura 40. HKBA y L-Omp19 inducen la formación de osteoclastos en la tibia de ratones en una forma dependiente de TLR2.

La capacidad de HKBA y de L-Omp19 de inducir osteoclastogénesis fue determinada in vivo en ratones WT y TLR2 KO. Los ratones fueron inoculados en la región articular de los miembros posteriores y a los 5 días post inoculación se removieron las tibias, se realizaron cortes histológicos y se tiñeron para TRAP. Las células multinucleadas TRAP positivas fueron observadas (flechas rojas) en las tibias de todos los animales inyectados con HKBA, L-Omp19, Pam3Cys o LPS de E. coli en ratones WT, o con LPS de E. coli en ratones TLR2 KO.


9. Esquema con los resultados mostrados en este capítulo.

Esquema 13.

Monocito/Macrófago

B. abortus

L-Omp19

TLR2

MyD88

Precursor de osteoclasto

(Monocito /Macrófago)

TNF-α

Osteoclastomaduro

Degradación de matriz

Diferenciación

Monocito/Macrófago

B. abortus

L-Omp19

TLR2

MyD88

Precursor de osteoclasto

(Monocito /Macrófago)

TNF-α

Osteoclastomaduro

Degradación de matriz

Diferenciación


Capítulo II DISCUSIÓN

En este capítulo describimos otro mecanismo inmune implicado en la degradación

inflamatoria del hueso que ocurre en respuesta a la infección por B. abortus.

Aunque en varios trabajos se ha documentado el papel que desempeñan las células

T y B en la degradación del hueso [296-299], se ha demostrado que los macrófagos son

también células inmunes importantes en este fenómeno [288]. Nuestros resultados ponen

en evidencia la contribución de los macrófagos en la respuesta a la infección por B.

abortus y la consecuente inducción de osteoclastogénesis. Demostramos que los

macrófagos infectados con B. abortus secretan mediadores inflamatorios capaces de

inducir la formación de osteoclastos a partir de células no diferenciadas provenientes de la

médula ósea. La generación de osteoclastos fue determinada fenotípicamente mediante la

formación de células multinucleadas TRAP positivas, que expresan el receptor de

vitronectina, e incrementan la expresión de tres genes involucrados en la diferenciación de

los osteoclastos, tales como RANK, catepsina K y Ckb; y funcionalmente por la habilidad

de estas células de inducir la degradación de dentina. Además, la presencia de B. abortus

o L-Omp19 en la tibia de ratones indujo la formación de células multinucleadas TRAP

positivas. La inducción de la osteoclastogénesis no fue un fenómeno particular de las

células de ratón. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos humanos infectados con

B. abortus también indujeron la osteoclastogénesis de monocitos humanos provenientes

de donantes sanos. Por lo tanto, el paralelismo entre los ratones y los humanos, pone

nuevamente en evidencia la utilidad del modelo murino desarrollado en esta investigación

para estudios futuros de los mecanismos inmunes que podrían estar implicados en la

patogénesis osteoarticular de la brucelosis humana.

En las enfermedades inflamatorias crónicas del hueso como la artritis reumatoidea,

se ha demostrado que las citoquinas proinflamatorias TNF-α, Il-1β e IL-6, así como

también RANKL y TGF-β, son importantes en la progresión de la enfermedad y en la

inducción patológica de osteoclastogénesis [282, 283, 285, 288, 300, 301]. Por otro lado,

ha sido demostrado que TNF-α estimula la osteoclastogénesis mediante un mecanismo

independiente de RANKL [187, 188]. La infección de los macrófagos murinos con B.

abortus indujo la secreción de TNF-α, Il-1β e IL-6 pero no de RANKL. El hecho de que la

osteoclastogénesis pueda ser inducida por los sobrenadantes de cultivo conteniendo estas

citoquinas sugiere que, al igual que ocurre en la degradación del hueso en respuesta a la

infección con Porphyromonas gingivalis [288], RANKL no estaría involucrado en la

degradación del hueso inducida por B. abortus. Kim et al. [302] han demostrado que TGF-

β juega un rol importante en la osteoclastogénesis inducida por TNF-α. Dado que TGF-β


está presente en el SFB, no podemos descartar en forma definitiva el rol de TGF-β en la

osteoclastogénesis inducida por B. abortus.

La producción de citoquinas por los macrófagos murinos y la concomitante inducción

de la osteoclastogénesis en respuesta a la infección con B. abortus no dependieron de la

viabilidad de la bacteria, ya que ambos fenómenos fueron también inducidos en respuesta

a la estimulación con HKBA. En particular demostramos que la lipoproteína L-Omp19

reprodujo los cambios fenotípicos y funcionales inducidos por la infección con B. abortus,

estimulando la activación de los osteoclastos. Por el contrario, S-Omp19 fue incapaz de

inducir estos cambios, confirmando que la porción lipídica es necesaria para inducir la

producción de los mediadores inflamatorios y en consecuencia estimular la activación de

los osteoclastos, como ha sido demostrado en el capítulo I de la presente tesis y en

trabajos previos [77, 108, 109, 233].

Los TLRs reconocen diversos patrones moleculares de los patógenos e inician las

reacciones inflamatorias en las células de la inmunidad innata [82]. Nuestros resultados

obtenidos utilizando ratones deficientes en la expresión de MyD88 indican que la

producción de mediadores inflamatorios en respuesta a la infección por B. abortus y la

estimulación con L-Omp19, que genera un aumento de la osteoclastogénesis, depende de

la molécula adaptadora MyD88, iniciador de la vía de señalización intracelular de los TLRs.

Estos resultados concuerdan con los obtenidos por otros investigadores [107]. Además,

demostramos que ambos fenómenos están mediados por TLR2 y no por TLR4,

confirmando que las lipoproteínas serían los ligandos TLR2 utilizados por la bacteria para

inducir la producción de los mediadores inflamatorios que inducen la osteoclastogénesis.

La incapacidad de B. abortus y de L-Omp19 de inducir la formación de células

multinucleadas TRAP positivas en la tibia de ratones deficientes en TLR2 enfatiza la

relevancia de la respuesta inflamatoria mediada por TLR2 en la osteoclastogénesis

inducida por B. abortus.

TNF-α regula varias funciones celulares, tales como la proliferación, la diferenciación,

el mantenimiento de un fenotipo diferenciado, y la apoptosis en varios tipos celulares [303].

En el microambiente del hueso, TNF-α puede estimular a las células óseas induciendo

varias respuestas [304]. Enfermedades como la artritis reumatoidea, la necrósis aséptica

del hueso y las enfermedades periodontales han sido asociadas con la acumulación de

TNF-α y/ u otras citoquinas proinflamatorias, las cuales probablemente medien la

destrucción local del hueso estimulando la actividad de los osteoclastos [283, 300, 305,

306]. TNF-α es un potente inductor de la degradación del hueso a través de la activación

de los osteoclastos maduros [307-309] o mediante la estimulación de la proliferación y

diferenciación de los precursores de los osteoclastos [187, 310]. La señalización de TNF-α

vía el receptor p55 (TNFR tipo I) pareciera ser el único determinante de la

osteoclastogénesis inducida por B. abortus y sus lipoproteínas ya que la formación de


células multinucleadas con la capacidad de resorber dentina fue completamente inhibida

en los monocitos derivados de médula ósea provenientes de ratones TNFRp55-/-. Aunque

los progenitores de los osteoclastos expresan TNFRp55 y –p75 [187], se ha descripto que

la mayoría de las actividades biológicas de TNF-α son iniciadas por TNFRp55 en estas

células. Mediante la utilización de monocitos derivados de médula ósea provenientes de

ratones deficientes en el TNFR (p55-/-, p75-/- y ambos), Abu-Amer et al. [311] demostraron

que la osteoclastogénesis inducida por el LPS estaba mediada por TNF-α y mediante un

mecanismo dependiente de la presencia de un receptor p55 funcional pero no del receptor

p75. Además, usando anticuerpos bloqueantes anti-p55 y -p75, Azuma et al. [187]

demostraron que la inducción de células multinucleadas TRAP positivas en respuesta a

TNF-α fue inhibida completamente en presencia de los anticuerpos anti-p55. Nuestros

experimentos también demostraron que los anticuerpos anti-TNF-α inhiben la formación de

osteoclastos y la degradación de dentina en las células humanas. Por lo tanto, nuestros

resultados nos permiten concluir que TNF-α es la principal citoquina involucrada en la

osteoclastogénesis inducida por B. abortus y la consecuente degradación del hueso

observada en la brucelosis humana.


CAPÍTULO III “Inhibición de la diferenciación y función de los osteoblastos por la infección con B. abortus” Introducción

Los osteoblastos son células óseas especializadas en producir los componentes de

la matriz del hueso y se originan a partir de células mesenquimales pluripotenciales de la

médula ósea [169]. La vida de un osteoblasto consiste en múltiples pasos de

diferenciación (osteoblastogénesis). En primer lugar ocurre la diferenciación de las células

mesenquimales al linaje osteogénico, llamadas células osteoprogenitoras. Luego, estas

últimas proliferan y se diferencian a pre-osteoblastos. En esta etapa los pre-osteoblastos

comienzan a producir los componentes orgánicos de la matriz ósea, principalmente

colágeno tipo I y se diferencian a osteoblastos maduros, los cuales continúan sintetizando

proteínas de la matriz extracelular hasta que en última instancia inician la mineralización

de la misma a través de la deposición de cristales de hidroxiapatita (fosfato de calcio

cristalino con la fórmula (Ca10(PO4)6(OH)2). Finalmente, una fracción de los osteoblastos

maduros queda embebida por la matriz mineralizada y se convierte en osteocitos, mientras

que la otra fracción permanece tapizando la superficie del hueso o muere por apoptosis.

Cada uno de los múltiples pasos de la osteoblastogenesis se encuentra regulado por

hormonas, factores de crecimiento, citoquinas y proteínas de la matriz extracelular [170].

Estas señales exógenas inician cascadas de señalización y activan factores de

transcripción que median y controlan la osteoblastogenesis.

Los osteoblastos totalmente diferenciados se caracterizan por la expresión de

fosfatasa alcalina y colágeno tipo I, ambos importantes para la síntesis de la matriz ósea y

la posterior mineralización [312]. Los osteoblastos maduros también secretan factores

reguladores de la mineralización como osteocalcina y osteopontina, cuya máxima

expresión es detectada en el inicio de la etapa de mineralización [313, 314].

Dado que los osteoblastos son las células especializadas en la formación de la matriz

ósea la inhibición de la diferenciación y actividad de los mismos provocaría una alteración

del balance óseo disminuyendo así la densidad del hueso.

Existen evidencias que demuestran que las citoquinas proinflamatorias TNF-α e IL-1β

[191, 192] como así también distintos antígenos bacterianos [193, 194] son capaces de

inhibir la diferenciación y mineralización de los osteoblastos. Esto sugiere que los procesos

inflamatorios juegan un rol importante en la disminución de la formación del hueso.


Por lo tanto, en este capítulo evaluamos si la infección por B. abortus es capaz de

inhibir la diferenciación y función de los osteoblastos contribuyendo a la pérdida de hueso.

Además, considerando la relevancia de los macrófagos en la supervivencia intracelular de

Brucella, y en la producción de citoquinas proinflamatorias en respuesta a la infección,

también investigamos el rol de estas células como moduladores de la diferenciación y

función de los osteoblastos.


Capítulo III Materiales y métodos 1. Cultivo de bacterias

El cultivo de B. abortus S2308, su mutante isogénica en el sistema de secreción de

tipo IV, virB10 polar (cedida por el Dr. Diego Comerci) y S. aureus fue realizado tal como

fue descripto en la sección 1 de Materiales y Métodos del Capítulo I.

2. Cultivo celular

Los osteoblastos de cultivo primario fueron aislados de la calvaria de ratones

neonatos utilizando el método descripto por Wong and Cohn [315]. En resumen, las

calvarias fueron sometidas a digestiones secuenciales de 15 min. a 37ºC en una mezcla

enzimática conteniendo 0,05% de tripsina y 0,1% de colagenasa tipo IV (Gibco). Las

fracciones celulares 3 a 5 fueron juntadas y resuspendidas en DMEM conteniendo 10% de

SFB, 100 U/ml de penicilina y 100 µg de estreptomicina/ml (medio completo). Las células

fueron cultivadas en frascos de cultivo estándar en medio completo. El medio fue renovado

cada 3 o 4 días, y al llegar a confluencia, las células fueron recolectadas utilizando tripsina

y resuspendidas en medio completo.

Para los experimentos de diferenciación y función, las células fueron sembradas a

una densidad de 5x105 células/pocillo, y el medio fue renovado a las 24 hs. Para inducir la

diferenciación de los osteoblastos se utilizó el medio α-MEM conteniendo SFB 10%, 50

mg/ml de ácido ascórbico y 4mM β-gliceraldehído fosfato (medio de diferenciación) y el

medio fue renovado todos los días, hasta la finalización del cultivo. La línea celular de

macrófagos murinos J774.A1 (ATCC) fue crecida en DMEM conteniendo 10% de SFB, 100

U/ml de penicilina y 100 µg de estreptomicina/ml (medio completo).


Los osteoblastos fueron infectados con B abortus a diferentes MOIs, y los

macrófagos J774.A1 a una MOI de 100, tal como fue descripto en la sección 3 de

Materiales y Métodos del Capítulo I.

4. Estimulación con medio condicionado


Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos J774.A1 infectados con B. abortus a

una MOI de 100 fueron recolectados a las 24 hs. p.i. esterilizados por filtración a través de

un filtro de nitrocelulosa con un poro de 0,22 µm y utilizados para estimular los

osteoblastos no infectados. Los sobrenadantes fueron utilizados diluidos 1/2, 1/5 y 1/10 en

medio completo. Luego de 24 hs., los osteoblastos fueron recolectados para determinar la

apoptosis o analizados a los 7, 14 y 30 días para medir osteocalcina, colágeno, depósitos

de calcio y la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL)

5. Zimografía

La actividad gelatinolítica fue analizada por el método de Hibbs et al. [239] tal como

se describió en la sección 4 de Materiales y Métodos del Capítulo I.

6. Medición de la concentración de citoquinas

Se cuantificó la secreción de IL-1β, IL-6, TNF-α y MCP-1 en los sobrenadantes

mediante un kit de ELISA de BD. La quemoquina quimioatractante de neutrófilos (KC) y

RANKL fueron cuantificadas por ELISA (R&D Systems).

7. Bloqueo de TNF-α

Los experimentos de neutralización fueron llevados a cabo con un anticuerpo

neutralizante anti-TNF-α (clon Mab1, BD Biosciences, 20 ug/ml) o su control de isotipo

(clon 107.3, BD Biosciences). Los sobrenadantes de cultivo fueron pretratados con el

anticuerpo durante 1h. antes de agregarlos al cultivo de los osteoblastos.

8. Expresión de RANKL

Los osteoblastos fueron infectados con B. abortus a distintas MOI o estimulados con

los sobrenadantes de los macrófagos J774.A1 infectados, durante 24 hs. Como control

positivo las células fueron infectadas con S. aureus a una MOI de 100. Al final del cultivo

las células fueron lavadas y lisadas en buffer de lisis frío que consiste en 20 mM de

HEPES pH 8,5, 5 mM de EDTA, 0,4% de Tritón X-100, y un cóctel de inhibidores de

proteasas (Sigma-Aldrich). El extracto fue recolectado y centrifugado a 10.000x g por 10


min. RANKL fue detectado en los sobrenadantes de cultivo y en los lisados mediante un kit

de ELISA (R&D Systems) según las instrucciones del productor.

9. Evaluación de la apoptosis

Los osteoblastos fueron infectados con B. abortus o su mutante isogénica polar

virB10. Luego de 24 hs. las células fueron lavadas y el porcentaje de células apoptóticas

fue evaluada mediante la tinción con anexina V-FITC (isotiocianato de fluoresceína, Sigma

Aldrich) y posterior análisis por citometría de flujo. La apoptosis también fue analizada por

citometría de flujo utilizando la técnica de TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase-

mediated dUTP-biotin nick end labeling) con el kit fluorescein-FragEL DNA fragmentation

detection kit (Calbiochem). El porcentaje de células apoptóticas fue determinado por

microscopía de fluorescencia luego de marcar las células con la técnica de TUNEL o con

el colorante nuclear Hoechst 33342. Como control positivo de apoptosis se utilizó

paraformaldehído al 4% (PFA). Para bloquear la actividad de las caspasas los

osteoblastos sembrados en las placas de 24 pocillos fueron tratados con o sin 50 µM del

inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK (carbobenzoxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-

fluorometilcetona; R&D Systems) durante 2 hs. y luego fueron infectados con B. abortus a

una MOI de 100 o tratados con 4% PFA o medio durante 24 hs. La apoptosis fue

determinada por microscopía de fluorescencia luego de teñir los núcleos con Hoechst

33342.

10. Diferenciación de osteoblastos

Los osteoblastos fueron sembrados en cubreobjetos de vidrio y fueron infectados con

B. abortus a una MOI de 100 o fueron estimulados con los sobrenadantes de los

macrófagos infectados con B. abortus, en medio de diferenciación (ver sección 2 de

materiales y métodos). Luego de 7, 14 y 30 días de diferenciación se determinó la

actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL), el depósito de calcio, colágeno y

osteocalcina.

11. Determinación de la deposición de colágeno mediante tinción con Rojo Sirio

El depósito de colágeno fue cuantificado mediante tinción con Rojo Sirio, un

colorante aniónico que se une fuertemente a las moléculas de colágeno [316]. El colorante

fue disuelto en ácido pícrico acuoso saturado a una concentración de 0,1%. El fijador de


Bouin (para la fijación celular) fue preparado mezclando 15 ml de ácido pícrico acuoso

saturado con 5 ml de formaldehído al 35% y 1 ml ácido acético glacial. La monocapa

celular fue lavada con PBS previamente a ser fijada con 1 ml del fijador de Bouin por

pocillo durante 1 h. El fijador fue removido y las células fueron lavadas con agua

desionizada 3 veces. Las células fueron teñidas con 1 ml de Rojo Sirius por pocillo durante

18 hs. en agitación suave.

Las células teñidas fueron lavadas con 0,01 N de ácido clorhídrico para remover el

colorante no unido. Los cubreobjetos fueron montados en PBS-glicerina (9:1 [vol/vol]) y

fueron analizados por microscopía de luz blanca. Para un análisis cuantitativo el colorante

unido fue disuelto en 0,2 ml de hidróxido de sodio 0,1 N en agitación suave durante 30

min. La solución fue transferida a placas de microtitulación y se midió la densidad óptica

(DO) con un lector de placas (Metertech) a 550 nm contra el blanco hidróxido de sodio 0,1

N.

12. Determinación del depósito de osteocalcina

Para determinar el depósito de osteocalcina extracelular los osteoblastos fueron

sembrados a una densidad de 1x104 células/pocillo en placas de 24 pocillos. A los 7, 14 y

30 días las células fueron fijadas con formaldehido al 4%, y posteriormente lavadas 3

veces con PBS durante 5 min. cada lavado. Las células fueron marcadas con un

anticuerpo anti-osteocalcina (sc-7449; Santa Cruz Biotechnology), seguido de un

anticuerpo IgG de cabra anti-conejo conjugado con FITC a una dilución 1:200 en 0,5%

PBS-BSA (Invitrogen).

13. Determinación de la deposición de calcio mediante Alizarina Roja

Los osteoblastos fueron fijados en PFA 4% durante 10 min a temperatura ambiente.

Las células fueron lavadas con agua desionizada, teñidas con Alizarina Roja 2% y fueron

visualizadas por microscopía de luz. Para realizar un análisis cuantitativo el colorante fue

disuelto según las instrucciones del productor. En resumen, las células fueron incubadas

con ácido acético al 10% durante 30 min en agitación. Se levantaron las células, se

calentaron a 85 °C durante 10 min y se centrifugaron a 20000 xg por 15 min. Se tomó el

sobrenadante y se neutralizó el pH con hidróxido de amonio 10%. La solución fue

transferida a placas de microtitulación para medir la DO a 405 nm.

14. Determinación de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL)


La actividad de FAL se puso en evidencia utilizando la solución BCIP (5-bromo-4-

cloro-3-indolilfosfato)-NBT (azul de nitro-tetrazolio) (Sigma-Aldrich) según las instrucciones

del fabricante. Se midió la DO a 420 nm.


El analisis estadístico se realizó tal como fue descripto en la sección 17 de Materiales

y Métodos del Capítulo I.


Capítulo III Resultados

Los osteoblastos son las células responsables de la deposición de la matriz ósea y

también facilitan la calcificación y mineralización de la misma. Dado que la función de los

osteoblastos puede ser alterada en condiciones patológicas tanto infecciosas como no

[317, 318], nos propusimos estudiar si la infección con B. abortus era capaz de inhibir la

diferenciación y función de los osteoblastos contribuyendo a la pérdida del hueso.

1. B. abortus invade y se multiplica en osteoblastos provenientes de cultivo primario de calvaria murina

Como mostramos en la figura 1 del capítulo I del presente trabajo y en trabajos

previos realizados en nuestro laboratorio [32], B. abortus puede invadir y replicarse en

líneas celulares de osteoblastos humanos. Dado que las células inmortalizadas pueden

tener modificaciones fenotípicas respecto de las células normales decidimos extender

estos resultados a un cultivo primario. Para cumplir con este objetivo, los osteoblastos

provenientes de un cultivo primario de la calvaria de ratones neonatos de la cepa BALB/c

fueron infectados con B. abortus. Los experimentos demostraron que B. abortus invade y

se replica en los osteoblastos del cultivo primario (Figura 41). Estos resultados indican que

la habilidad de B. abortus de infectar el cultivo primario de osteoblastos murinos fue similar

a la obtenida previamente para las líneas celulares humanas.


2. La infección con B. abortus induce la expresión de KC, MCP-1 y MMPs por parte de los osteoblastos de calvaria

A continuación decidimos investigar la habilidad de los osteoblastos murinos de

secretar quemoquinas y MMPs en respuesta a la infección con B. abortus. En

concordancia con los resultados obtenidos con las células humanas, los osteoblastos

murinos provenientes del cultivo primario de calvaria secretaron a las 48 hs. p.i. MCP-1 y

KC (33,66 ± 2,45 ng/ml para MCP-1 y; 70,16 ± 15,38 ng/ml para KC) cuando fueron

infectados a una MOI de 100. Los osteoblastos también secretaron MMPs en respuesta a

la infección con B. abortus (Figura 42).

Figura 41. B. abortus invade y se multiplica en un cultivo primario de osteoblastos murinos de calvaria.

0 20 40 60 80102

103

104

105

Tiempo (hs)

UFC

/ml

Los osteoblastos murinos obtenidos de un cultivo primario de calvaria fueron infectados con B. abortus a MOI 100 y luego de dos horas fueron incubados con medio con antibiótico para eliminar a las bacterias extracelulares. Los lisados celulares obtenidos a diferentes tiempos post-infección fueron plaqueados en TSA para determinar las UFC intracelulares.


3. La infección con B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos

La apoptosis de los osteoblastos induce pérdida ósea por resultar en la eliminación

de las células responsables de la deposición de matriz [319, 320]. Por lo tanto, decidimos

investigar si B. abortus era capaz de inducir apoptosis en los osteoblastos provenientes del

cultivo primario de calvaria murina. Los osteoblastos fueron infectados con B. abortus, y

luego de 24 hs. las células fueron teñidas con Anexina V/IP y analizadas por citometría de

flujo. Como control positivo se utilizó PFA 4%. La infección con B. abortus indujo apoptosis

de los osteoblastos en una forma MOI dependiente (Figura 43 A). La presencia de

apoptosis fue confirmada mediante la técnica de TUNEL (Figura 43 B y D) y por

morfología nuclear mediante la tinción con Hoechst 33342 (P<0,01) (Figura 43 C y E). La

apoptosis dependió de la expresión de un sistema de secreción tipo IV funcional, ya que el

porcentaje de células apoptóticas no se modificó en forma significativa entre los

osteoblastos infectados con la cepa mutante polar virB10 de B. abortus y los osteoblastos

no infectados (P<0,01) (Figura 44 A).

La apoptosis mediada por B. abortus ha sido descripta en varios tipos celulares

incluyendo astrocitos, hepatocitos y linfocitos T [33, 108, 321]. Por otro lado, ha sido

demostrado que la apoptosis de los astrocitos inducida por B. abortus involucra la

activación de caspasas [108]. Para determinar el rol de las caspasas en la apoptosis de los

osteoblastos en respuesta a la infección con B. abortus, estas células fueron tratadas con

un inhibidor general de caspasas (Z-VAD-FMK) y luego fueron infectadas con B. abortus a

una MOI de 100. La apoptosis fue determinada mediante la tinción de los núcleos con

Hoechst 33342 y luego fueron analizadas por microscopía de fluorescencia. Z-VAD-FMK

Figura 42. La infección con B. abortus induce la expresión de MMPs por parte de los osteoblastos de calvaria.

Control 50 100 250 500 1000Control 50 100 250 500 1000

Producción de MMP-2 y MMP-9 por parte de los osteoblastos primarios infectados con B. abortus a diferentes MOIs (50 a 1000) o no infectados (control).

MMP-9

MMP-2


inhibió en forma significativa (P<0,01) la apoptosis de los osteoblastos inducida por la

infección (Figura 44 B).

En conjunto estos resultados indican que la infección con B. abortus induce la

apoptosis de los osteoblastos, a través de la activación de caspasas mediante un

mecanismo dependiente de la presencia de una sistema de secreción de tipo IV funcional.


Figura 43. B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos.

100

250 500

PFA1000

Control 100

250 500

PFA1000

Control

Control

100250

500

1000

Control

100250

500

1000

Cont

rol

100

250

500

1000

PFA

0

25

50

**

*****

***

***

% d

e cé

lula

s apo

ptót

icas

Cont

rol

100

250

500

1000

PFA

0

25

50

****

***

******

% d

e cé

lula

s apo

ptót

icas

100

250 500

PFA1000

Control 100

250 500

PFA1000

Control

A

B C

D E

Los osteoblastos fueron infectados con B. abortus a diferentes MOIs (100 a 1000) o fueron tratados con paraformaldehído (PFA) 4% como control positivo. La apoptosis fue determinada por Anexina V, TUNEL y Hoechst 33342. Análisis por citometría de flujo de las células apoptóticas mediante la tinción con Anexina V-FITC (A). Análisis por microscopía de fluorescencia de las células apoptóticas mediante TUNEL (B y D) y tinción con Hoechst 33342 (C y E). **P<0,01;***P<0,001 versus el control (sin infectar).


4. La infección con B. abortus induce la expresión de RANKL en los osteoblastos de calvaria

Como mencionamos, RANKL es una molécula implicada en el remodelado óseo

normal. Los osteoblastos que expresan RANKL constituyen las principales células

implicadas en la inducción de la osteoclastogénesis [322]. Por lo tanto, un incremento en la

expresión de RANKL induciría un aumento patológico de la resorción ósea.

Consecuentemente, investigamos si la infección con B. abortus aumentaba la expresión de

RANKL por parte de los osteoblastos. Para llevar a cabo este objetivo, se evaluó mediante

la técnica de ELISA la presencia de RANKL en los lisados celulares y en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus. Demostramos que RANKL

aumenta significativamente y en forma dependiente de la MOI utilizada en los lisados

celulares de los osteoblastos (P<0,01) (Figura 45). Como esperábamos la infección con S.

Figura 44. B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos en una forma dependiente de caspasas y de un sistema de secreción de tipo IV

funcional.

Cont

rol

Sin

trat

ar

Z-VA

D-F

MK

PFA

0

25

50

**

MOI 100%

célu

las a

popt

ótic

as

Cont

rol

WT

VirB

10

PFA

0

25

50

**

MOI 100

% d

e cé

lula

s apo

ptót

icas

Análisis por microscopía de fluorescencia de las células apoptóticas teñidas con Hoechst 33342. Los osteoblastos fueron infectados a una MOI 100 con B. abortus wild type (WT) o una mutante isogenica virB10 (VirB10) (A). **P<0,01 versus los osteoblastos infectados con la bacteria WT. En otro experimento los osteoblastos fueron tratados con un inhibidor general de caspasas y dos horas después fueron infectados por B. abortus (B). **P<0,01 versus los osteoblastos infectados sin tratar con el inhibidor.

A B


aureus también indujo un aumento de la expresión de RANKL (Figura 45). Por el contrario,

no se detectó un aumento de RANKL en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados

respecto del control sin infectar (no mostrado). Estos resultados indican que la expresión

de RANKL por parte de los osteoblastos infectados con B. abortus podría contribuir a la

destrucción ósea a través de la activación de los osteoclastos.

5. La infección con B. abortus inhibe la diferenciación de los osteoblastos de calvaria

La enzima FAL es un marcador fenotípico de los osteoblastos y es esencial para el

proceso de mineralización [323]. Además, la expresión de FAL se encuentra asociada a la

diferenciación de osteoblastos [324]. Por lo tanto, evaluamos el efecto de la infección con

B. abortus en la diferenciación de los osteoblastos mediante la medición de la actividad de

FAL. Como se muestra en la Figura 46 la infección redujo significativamente la actividad

de FAL por parte de los osteoblastos en una forma dependiente de la MOI utilizada y este

efecto inhibitorio se mantuvo incluso a tiempos tan largos como 30 días post infección

(P<0,001). Estos resultados indican que la infección con B. abortus inhibe la actividad de

FAL y por lo tanto interfiere con la función de los osteoblastos.

Figura 45. B. abortus induce la expresión de RANKL en los osteoblastos de calvaria.

Cont

rol

100

250

500

1000

S.au

reus

0

125

250

****

***

RAN

KL

(pg/

ml)

La producción de RANKL fue determinada por ELISA en los lisados de los osteoblastos de calvaria infectados con B. abortus a diferentes MOIs a las 24 hs. p.i. Como control positivo se infectaron osteoblastos con Staphylococcus aureus a MOI 100. **P<0,01; ***P<0,001.


6. B. abortus inhibe la deposición de minerales por parte de los osteoblastos de calvaria

La diferenciación de los osteoblastos in vivo e in vitro también puede ser

caracterizada por su capacidad para depositar y mineralizar matriz lo que aumenta la

rigidez del sistema óseo [325, 326]. La mineralización se inicia entre los días 7 a 10 y

puede ser detectada mediante la tinción de los depósitos minerales en el cultivo de los

osteoblastos. Por lo tanto, investigamos el efecto de la infección con B. abortus en el

Figura 46. La infección por B. abortus inhibe la diferenciación de osteoblastos de calvaria.

100 Control

7 días

14 días

30 días

100 Control100 Control

7 días

14 días

30 días

Cont

rol

100

250

500

1000

0

7

14

***

*** *** ***

Activ

idad

rel

ativ

a de

FAL

Cont

rol

100

250

500

1000

0

7

14

***

*** *** ***Activ

idad

rel

ativ

a de

FAL

7 días

14 días

30 días

A B

Cont

rol

100

250

500

1000

0

7

14

***

***

******

Activ

idad

rel

ativ

a de

FALEfecto de la infección con B. abortus en la

diferenciación de los osteoblastos de calvaria. La actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL) fue determinada mediante el agregado de la solución BCIP-NBT. Se tomaron las imágenes representativas por microscopía de luz blanca (A) y se cuantificó la actividad enzimática por espectrofotometría (B). ***P<0,001 versus el control sin infectar.


proceso de mineralización por parte de los osteoblastos, mediante la tinción de los

depósitos ricos en calcio con el colorante Alizarina Roja. Los osteoblastos de calvaria tanto

infectados como no infectados, depositaron progresivamente mayor cantidad de mineral

con el tiempo. Sin embargo, aquellas células infectadas produjeron significativamente

menos mineral y en forma MOI dependiente, respecto de las no infectadas en los días 7,

14 y 30 (P<0,05) (Figura 47). Estos resultados indican que la infección con B. abortus

inhibe capacidad de depositar matriz mineral por parte de los osteoblastos.

Figura 47. B. abortus inhibe la capacidad de depositar matriz mineral por parte de los osteoblastos de calvaria.

Efecto de la infección con B. abortus en la deposición de matriz mineral por parte de los osteoblastos de calvaria. El depósito de calcio fue revelado mediante la tinción con Alizarina Roja. Se tomaron las imágenes representativas por microscopía de luz (A) y se cuantificó la Alizarina Roja mediante espectrofotometría (405 nm) (B).*P<0,05 ; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin infectar.

A B

7 días

14 días

30 días

100 Control

7 días

14 días

30 días

100 Control

7 días

14 días Co

ntro

l

100

250

500

1000

0

60

120

**

*

Aliz

arin

a Ro

ja u

M

30 días

Cont

rol

100

250

500

1000

0

150

300

******

******

Aliz

arin

a Ro

ja u

M

Cont

rol

100

250

500

1000

0

400

800

***

****** ***Al

izar

ina

Roja

uM


7. B. abortus inhibe la deposición de matriz orgánica

El colágeno representa el 85-90 % de toda la matriz orgánica del hueso [327]. El

hueso muestra varias organizaciones estructurales que están relacionadas con el balance

entre la cantidad de colágeno y de minerales [328]. No solo la deposición de matriz mineral

es esencial para asegurar un hueso saludable, aportando fuerza y rigidez al sistema

esquelético, sino que también la deposición adecuada de matriz orgánica contribuye a la

estructura de este sistema. Por lo tanto, nos preguntamos también si B. abortus era capaz

de inhibir la deposición orgánica por parte de los osteoblastos. El colágeno fue detectado

mediante tinción con Rojo Sirio, un colorante aniónico que se une fuertemente a las

moléculas de colágeno. Los osteoblastos provenientes del cultivo primario, infectados y no

infectados, depositaron progresivamente mayor cantidad de colágeno con el tiempo. Sin

embargo, aquellos infectados produjeron significativamente menos colágeno en forma MOI

dependiente, respecto de las no infectadas en los días 7, 14 y 30 (P<0,05) (Figura 48 A y C). Estos resultados indican que la infección con B. abortus inhibe el depósito de colágeno

por parte de los osteoblastos.

Para determinar si estos resultados podían ser extendidos a otra proteína que forma

parte de la matriz orgánica del hueso, estudiamos el efecto de la infección con B. abortus

en la deposición de osteocalcina. La osteocalcina es una proteína de secreción no

colágena y altamente conservada la cual esta asociada a la matriz mineralizada del hueso

[326]. Mediante la utilización de un anticuerpo anti-osteocalcina marcado con FITC

demostramos que la infección con B. abortus también inhibe la deposición de osteocalcina

en una forma MOI dependiente (Figura 48 B).


8. TNF-α presente en los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus está involucrado en la inducción de la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos de calvaria

Figura 48. La infección con B. abortus inhibe la deposición de matriz orgánica de osteoblastos de calvaria.

A B

C

7 días

14 días

30 días

100 Control 100 Control

7 días

14 días

30 días

100 Control 100 Control

Cont

rol

100

250

500

1000

0.0

0.6

1.2

***

******

***

DO

(550

nm

)

7 días 14 días 30 días

Cont

rol

100

250

500

1000

0.0

0.6

1.2

*

****

***

DO

(550

nm

)

Con

trol

100

250

500

1000

0.0

0.6

1.2

******

******

DO

(550

nm

)

Efecto de la infección con B. abortus sobre la deposición de matriz orgánica por parte de los osteoblastos. El depósito de colágeno fue revelado mediante la tinción con Rojo Sirio (A). El depósito de osteocalcina fue revelado por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico marcado con FITC (B). Se tomaron las imágenes representativas por microscopía de luz blanca y de fluorescencia (A y B, respectivamente) y se cuantificó el Rojo Sirio mediante espectrofotometría (C). *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin infectar.


Teniendo en cuenta la capacidad de los osteoblastos infectados con B. abortus de

secretar la quemoquina MCP-1 (Figura 42), nuestra hipótesis es que los macrófagos

podrían ser atraídos al sitio de infección. Por lo tanto, decidimos investigar el efecto de las

citoquinas presentes en los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus en

la producción de RANKL por parte de los osteoblastos. Para lograr este objetivo los

sobrenadantes de la línea celular de macrófagos murinos J774.E1 infectados con B.

abortus fueron utilizados para estimular a los osteoblastos. El agregado de los

sobrenadantes de los macrófagos infectados en diferentes proporciones (1/2 a 1/10) indujo

una aumento en la expresión de RANKL en una forma dosis dependiente, comparado con

los osteoblastos no estimulados o los estimulados con los sobrenadantes de macrófagos

no infectados (proporción 1/2) (P<0,05) (Figura 49 A). TNF-α puede inducir la expresión

de RANKL en varios tipos celulares [329-331]. Para verificar que los niveles de TNF-α

presentes en los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus podían

estimular la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos, estas últimas células

fueron estimuladas con los sobrenadantes de los macrófagos infectados preincubados

durante 1 h. con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α o un control de isotipo. Como se

muestra en la Figura 49 B la neutralización de TNF-α redujo significativamente (P<0,001)

la habilidad de los sobrenadantes de estimular la expresión de RANKL por parte de los

osteoblastos. El control de isotipo no tuvo ningún efecto. Estos resultados indican que la

infección de los macrófagos con B. abortus podría alterar la homeostasis ósea mediante la

inducción de la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos, a través de la

secreción de TNF-α.


9. TNF-α presente en los sobrenadantes de macrófagos murinos infectados con B. abortus está involucrado en la inducción de apoptosis de los osteoblastos de calvaria

Los macrófagos pueden mediar el daño al tejido en diferentes órganos incluyendo el

hueso, a través de la secreción de citoquinas proinflamatorias [332]. Para analizar si los

factores secretados por los macrófagos infectados con B. abortus podían inducir daño en

los osteoblastos estudiamos el efecto del medio condicionado de los macrófagos

infectados sobre los osteoblastos. Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B.

abortus agregados en diferentes diluciones (1/2 a 1/10) indujeron la apoptosis de los

Figura 49. TNF-α presente en los sobrenadantes de macrófagos murinos

infectados por B. abortus está involucrado en la inducción de la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos de calvaria.

A B 1/

2

1/5

1/10 1/2

Cont

rol

0

70

140

SC-J774 Infectados

SC-J

774

No

infe

ctad

os

RAN

KL

(pg/

ml)

***

***

*

Cont

rol

Sin

trat

ar a-

TNF-

Isot

ipo

0

40

80

***

RAN

KL

(pg/

ml)

La producción de RANKL fue determinada por ELISA en los lisados de los osteoblastos de calvaria estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos J774 (SC-J774) infectados (adicionados en las proporciones 1/2 a 1/10) o no infectados (A). *P<0,05; ***P<0,001 versus los osteoblastos tratados con los sobrenadantes sin infectar. En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo durante 1h, antes de agregarlos a los osteoblastos, y se determinó la producción de RANKL por ELISA (B). ***P<0,001 versus los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes infectados sin el tratamiento con anti-TNF-α.


osteoblastos en una forma dosis dependiente (P < 0,01) (Figura 50 A). Por el contrario, los

niveles de apoptosis de los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes de los

macrófagos no infectados fueron similares al de las células sin estimular.

TNF-α es una citoquina proinflamatoria que puede inducir apoptosis en varios tipos

celulares, incluyendo los osteoblastos [332, 333]. Para evaluar si TNF-α era la citoquinas

responsable de la inducción de la apoptosis de los osteoblastos, estimulamos a estos

últimos con los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus pretratados

con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α o un control de isotipo. Como se muestra en la

Figura 50 B la neutralización de TNF-α inhibió parcialmente la habilidad de los

sobrenadantes de inducir apoptosis (P<0,05), mientras que el control de isotipo no tuvo

ningún efecto.

La señalización de TNF-α vía TNFR1 induce apoptosis a través del acoplamiento de

caspasa-8 con TRADD (dominios de muerte asociados a TNFRSF1A), el cual a su vez

activa caspasa-3 [334]. Para determinar si las caspasas estaban involucradas en la

apoptosis inducida por los sobrenadantes de los macrófagos infectados, los osteoblastos

fueron pretratados con un inhibidor general de caspasas (Z-VAD-FMK) y luego

estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus. La

apoptosis fue determinada mediante la tinción con Hoechst 33342 y luego fue analizada

por microscopía de fluorescencia. El inhibidor general de caspsas, Z-VAD-FMK inhibió la

apoptosis de los osteoblastos inducida por los sobrenadantes de los macrófagos

infectados (P < 0,05) (Figura 50 B). En conjunto, estos resultados indican que los

sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus inducen apoptosis de los

osteoblastos a través de TNF-α, y mediante un mecanismo que involucra la activación de

caspasas.


10. Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus inhiben y la deposición de matriz orgánica y mineral por parte de los osteoblastos de calvaria, principalmente a través de TNF-α

Otro mecanismo por el cual los macrófagos podrían mediar daño óseo es mediante la

inhibición de la diferenciación de los osteoblastos. Para comprobar esta hipótesis los

osteoblastos fueron estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos infectados. Los

sobrenadantes de los macrófagos infectados agregados en diferentes diluciones (1/2 a

1/10) inhibieron en forma significativa la capacidad de los osteoblastos de secretar matriz

orgánica y mineral, en forma dosis dependiente, comparado con los osteoblastos

estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos no infectados o los osteoblastos sin

estimular, ambos crecidos en medio de diferenciación (no mostrado).

Figura 50. La infección con B. abortus está involucrado en la inducción de la apoptosis de los osteoblastos.

A B 1/

2

1/5

1/10 1/

2

Cont

rol

PFA

0

25

50 ***

***

**

***

SC-J774 Infectados

SC-J

774

No

Infe

ctad

os

% d

e cé

lula

s ap

optó

ticas

Cont

rol

Sin

trat

ar a-

TNF-

Isot

ipo

Z-VA

D-F

MK

PFA

0

22

44

* *

% d

e cé

lula

s apo

ptót

icas

Los osteoblastos de calvaria fueron estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos (SC-J774) infectados con B. abortus o no infectados. La apoptosis fue analizada por microscopía de fluorescencia mediante la tinción con Hoechst 33342 (A). **P<0,01; ***P<0,001 versus los osteoblastos estimulados con los SC-J774 sin infectar. En otro experimento, los sobrenadantes de los macrófagos infectados fueron preincubados durante 1 h. con un anticuerpo anti-TNF-α antes de ser agregados a los osteoblastos, o los osteoblastos fueron preincubados con un inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK antes de ser estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos infectados. *P<0,05 versus los osteoblastos estimulados con SC-J774 infectados sin tratamiento (Sin tratar).


TNF-α podría desempeñar un rol importante en la inhibición de la diferenciación de

los osteoblastos [335]. Para evaluar si los niveles de TNF-α presentes en los

sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus podía inhibir la diferenciación

de los osteoblastos, estas últimas células fueron estimuladas con los sobrenadantes de los

macrófagos infectados preincubados o no durante 1 h. con un anticuerpo neutralizante

anti-TNF-α o un control de isotipo. Como se muestra en la Figura 51 la neutralización de

TNF-α redujo la habilidad de los sobrenadantes de inhibir la diferenciación de los

osteoblastos (P<0,05), mientras que el control de isotipo no tuvo ningún efecto. Estos

resultados indican que TNF-α juega un rol clave en la inhibición de la diferenciación de los

osteoblastos contribuyendo de esta forma a la perdida de matriz ósea.


Figura 51. Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus

inhiben la deposición de matriz orgánica y mineral por parte de los osteoblastos de calvaria, principalmente a través de TNF-α.

Cont

rol

Sin

trat

ar a-

TNF-

Isot

ipo

0

6

12

*

Activ

idad

rela

tiva

de F

AL

A B C D

E F G

Sin tratar

a-TNF-α

Isotipo

Control

Sin tratar

a-TNF-α

Isotipo

Control

Los sobrenadantes de los macrófagos infectados fueron pretratados con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α antes de ser agregados sobre los osteoblastos. Se determinó la deposición de matriz orgánica y mineral a diferentes días. Tinción con Alizarina Roja (A), actividad de FAL revelada con BCIP/NBT (B), tinción con Rojo Sirio (C), y deposición de osteocalcina determinada por inmunofluorescencia (D). Análisis cuantitativo de Alizarina Roja (E), de la actividad relativa de FAL (F) y de Rojo Sirio (G).*P<0,05 versus los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes infectados sin tratamiento (sin tratar).

Cont

rol

Sin

trat

ar a-

TNF-

Isot

ipo

0.00

0.75

1.50

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jo S

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s (O

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Cont

rol

Sin

trat

ar a-

TNF-

Isot

ipo0

90

180

*

Aliz

arin

a Ro

ja u

M


11. Esquema con los resultados obtenidos en este capítulo

Pre-Osteoblasto

B. abortus

RANKL

Monocito

B. abortus

TNF-α

Osteoblasto maduro

Apoptosis

Producción de matriz orgánica

y mineral

Diferenciación

Pre-Osteoblasto

B. abortus

RANKL

Monocito

B. abortus

TNF-α

Osteoblasto maduro

Apoptosis

Producción de matriz orgánica

y mineral

Diferenciación

Esquema 14.


Capítulo III Discusión

En este capítulo describimos las modificaciones que ocurren en el metabolismo de

los osteoblastos cuando estas células son infectadas con B. abortus, y cómo esta

respuesta inhibe la diferenciación y función de los osteoblastos provocando la pérdida del

hueso. En primer lugar, demostramos que B. abortus es capaz de invadir y replicarse en

osteoblastos murinos obtenidos a partir de un cultivo primario de calvaria, del mismo modo

que lo hacen en osteoblastos humanos (línea hFOB) tal como fue descripto en este

trabajo, y en las líneas de osteosarcoma como fue demostrado en trabajos previos de

nuestro laboratorio [32]. La infección por B. abortus también indujo la producción de las

quemoquinas MCP-1 y KC, así como también la secreción de MMP-2 y MMP-9 por parte

de los osteoblastos de calvaria murina. Nuevamente esta correlación entre los resultados

obtenidos utilizando líneas celulares humanas y las células de cultivo primario murino,

avalan el uso de este modelo en los estudios de la patología osteoarticular desencadenada

por la infección por Brucella.

La brucelosis osteoarticular, incluyendo la espondilitis y la artritis, puede ser

destructiva y estar asociada a la presencia de osteopenia y daño en el cartílago [336].

Dicho daño tisular podría ser causado además de por los mecanismos ya descriptos en el

presente trabajo, por una alteración en el número, diferenciación y función de los

osteoblastos. En primer lugar, demostramos que la infección con B. abortus induce la

apoptosis de los osteoblastos. Si la apoptosis inducida por un patógeno es perjudicial o

beneficiosa para el hospedador ha sido una fuente de debate por varios autores [337, 338].

En este sentido, la apoptosis de los osteoblastos podría ser responsable, en parte, del

daño óseo, ya que provocaría una reducción en el número de los osteoblastos en el hueso

capaces de producir matriz ósea. Por otro lado, puede resultar contradictorio que B.

abortus sea capaz de inducir la apoptosis de los osteoblastos cuando ha sido reportado

que inhibe la apoptosis en los macrófagos [125, 339]. Sin embargo, estos resultados no

resultan sorprendentes teniendo en cuenta que Brucella spp. se encuentra particularmente

adaptada para establecer una infección crónica en los macrófagos [340]. Nuestros

resultados sugieren que los osteoblastos no constituyen un nicho en el cual Brucella podría

sobrevivir y permanecer por un largo período de tiempo durante las localizaciones

osteoarticulares, lo cual concuerda con el hecho de que Brucella es capaz de inducir

apoptosis en otras células diferentes a los macrófagos [33, 108]. En contraste, los

osteoblastos secretan la quemoquina MCP-1 en respuesta a la infección con B. abortus, la


cual atrae nuevos monocitos/macrófagos al sitio de infección, incrementando así las

posibilidades de que la bacteria encuentre un nicho replicativo en el cual permanecer.

La mineralización es un proceso en el cual se produce la deposición de fosfatos y

calcio en el hueso, y junto con la deposición adecuada de matriz orgánica contribuyen a la

arquitectura del hueso [341]. Nosotros demostramos que la infección por B. abortus inhibió

la diferenciación de los osteoblastos y disminuyó la actividad de FAL, un marcador

específico de diferenciación involucrado en la mineralización del hueso. Además, se

observó una disminución en la deposición de matriz orgánica y mineral, lo cual contribuiría

a la pérdida de hueso observada en la patología osteoarticular ocasionada por Brucella. En

conjunto, estos resultados indican que B. abortus puede afectar la formación del hueso, al

menos a través de dos mecanismos, limitando la diferenciación de los osteoblastos y por lo

tanto disminuyendo su capacidad de depositar matriz y/o induciendo la apoptosis de estas

células. Otro mecanismo de destrucción ósea ya descripto en el capítulo II del presente

trabajo, es la inducción patológica de la osteoclastogénesis. En este proceso RANKL

expresado en la membrana de los osteoblastos o secretado en forma soluble juega un rol

clave en la inducción de la diferenciación de los osteoclastos y por lo tanto en la

degradación del hueso [322]. Como ocurre en otras infecciones osteoarticulares [193, 342,

343], la infección con B. abortus indujo un aumento en la expresión de RANKL por parte de

los osteoblastos. El aumento en la expresión de RANKL probablemente estimule la

degradación del hueso a través de la formación de osteoclastos, y por lo tanto constituya

un mecanismo más que permite explicar porque los pacientes con osteomielitis brucelar

muestran pérdida ósea [258, 336, 344-346].

Los macrófagos también pueden contribuir a los mecanismos de daño ya descriptos.

Nosotros demostramos que estas células indujeron la apoptosis de los osteoblastos a

través de la secreción de TNF-α. Esta citoquina presente en los sobrenadantes de los

macrófagos infectados con B. abortus parece ser la única citoquina involucrada en la

apoptosis de los osteoblastos, ya que dicho proceso fue inhibido cuando los

sobrenadantes fueron incubados con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α. La inhibición

de la apoptosis por un inhibidor general de caspasas constituye una evidencia más de la

relevancia de TNF-α en este fenómeno, ya que se ha reportado que las caspasas están

involucradas en la inducción de la apoptosis mediada por TNF-α [334]. Además, TNF-α

presente en los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus es la citoquina

responsable de inhibir la deposición de matriz orgánica y mineral, ya que cuando los

sobrenadantes fueron pretratados con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α la inhibición

fue revertida. Estos resultados concuerdan con resultados obtenidos por otros autores que

demuestran que TNF-α modula la mineralización del hueso [263]. Si bien demostramos

que la infección por B. abortus induce un incremento en la expresión de RANKL por parte


de los osteoblastos, los macrófagos también pueden contribuir en este proceso, ya que

demostramos que factores solubles producidos por los macrófagos infectados inducen un

aumento en la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos. Mediante el

pretratamiento con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α demostramos que este

fenómeno también dependía de la presencia de TNF-α en los sobrenadantes de los

macrófagos infectados con B. abortus.

En resumen demostramos que B. abortus infecta los osteoblastos inhibiendo su

diferenciación y función. Los osteoblastos infectados también aumentan la expresión de

RANKL, la principal citoquina involucrada en la diferenciación de los osteoclastos

interactuando con el receptor RANK en la superficie de los precursores de estas últimas

células, contribuyendo a la degradación patológica del hueso. Los osteoblastos infectados

secretan la quemoquina MCP-1, la cual atrae macrófagos al sitio de infección. En la

situación in vivo, los macrófagos residentes y aquellos atraídos al sitio de infección podrían

responder a la infección con B. abortus produciendo citoquinas proinflamatorias. En este

sentido, TNF-α es la principal citoquina involucrada en la alteración de la función de los

osteoblastos ya que está implicada en el aumento en la expresión de RANKL por parte de

los osteoblastos, así como también en la inducción de apoptosis e inhibición de la

diferenciación y función de los osteoblastos.

En este contexto, hipotetizamos que B. abortus puede dañar la función de los

osteoblastos directa e indirectamente, constituyendo un mecanismo más que contribuye la

destrucción del hueso y de las articulaciones que se observa en los pacientes con

complicaciones osteoarticulares por brucelosis.


Discusión general

La brucelosis es un problema sanitario de gran importancia para Argentina y para

otros países, especialmente los subdesarrollados. La falta de una terapia apropiada

durante la etapa aguda de la enfermedad puede resultar en la localización de la bacteria

en varios tejidos llevando a una enfermedad crónica que puede presentar severas

manifestaciones clínicas [9]. Estas bacterias invaden las células del sistema retículo-

endotelial y son secuestradas dentro de los macrófagos localizados en órganos tales como

el bazo, el cerebro, el corazón, el hígado y las articulaciones. La brucelosis es una

enfermedad con un gran componente inflamatorio. Los signos clínicos de esa inflamación

son: artritis, osteomielitis, endocarditis, meningitis, pleocitosis, infiltración monocitaria de

las articulaciones, granuloma hepático, etc.[13].

Si bien las complicaciones osteoarticulares son las más frecuentes en la brucelosis

activa en el hombre, los mecanismos inmunes implicados en la patología ósea o articular

por Brucella spp. no han sido descriptos aún. Por lo tanto, en este trabajo nos focalizamos

en dilucidar los mecanismos inmunes involucrados en la degradación del hueso y en el

daño articular que tiene lugar en respuesta a la infección con B. abortus.

En este sentido, demostramos que B. abortus es capaz de infectar y replicarse en

osteoblastos y fibroblastos sinoviales humanos. La capacidad de B. abortus de invadir,

sobrevivir y replicar dentro de estas células concuerda con su capacidad de replicar en

otras células no fagocíticas, incluyendo las células epiteliales, endoteliales, los astrocitos y

los hepatocitos [33, 34, 108, 254]. Hasta el momento no se ha documentado la habilidad

de Brucella de infectar osteoblastos así como fibroblastos sinoviales in vivo. Esto podría

ser explicado en parte en función de restricciones éticas, dado que una biopsia del hueso o

de la articulación afectada solo sería justificada en situaciones excepcionales. Sin

embargo, en algunos estudios realizados en perros en los cuales se tomaron muestras de

tejido óseo pudo aislarse la bacteria a partir de dichas muestras [347, 348]. Además, se

han encontrado bacterias intracelulares en las epífisis y metáfisis de articulaciones

periféricas, así como también en la región subcondral de las vértebras durante una

infección experimental llevada a cabo en ratones [349]. Por otro lado, Brucella también se

ha aislado en cultivos de muestras de membrana sinovial, en los cuales el cultivo de fluido

sinovial fue negativo, sugiriendo que la bacteria estaba localizada intracelularmente en la

membrana sinovial [207, 350]. Estas evidencias dan relevancia a nuestros resultados in

vitro en los cuales Brucella puede invadir y replicarse en osteoblastos y fibroblastos

sinoviales humanos.

En artritis asociadas con la enfermedad de Lyme [228], en periodontitis causadas por

diferentes bacterias [229], y en las artritis séptica causada por la infección con S. aureus


[230] se ha demostrado la presencia de niveles elevados de MMPs. En estos procesos

patológicos las fuentes de MMPs pueden ser células residentes o fagocitos atraídos al foco

inflamatorio. Nosotros demostramos que los osteoblastos y los fibroblastos sinoviales

responden a la infección con B. abortus con la producción de MMP-2, una MMP

particularmente importante ya que es capaz de degradar componentes constitutivos del

hueso y del cartílago.

Respecto de la atracción de células inmunes al foco inflamatorio, nosotros

demostramos que los osteoblastos y los fibroblastos sinoviales producen las quemoquinas

(IL-8 y MCP-1) en respuesta a la infección por B. abortus. Por otro lado, los niveles de

quemoquinas secretados fueron capaces de inducir la migración de monocitos y

neutrófilos. Además, tanto los monocitos como los neutrófilos están implicados en la

reacción inflamatoria durante la artritis brucelar [258, 351, 352]. El estudio de un caso de

infección natural por Brucella indicaría que nuestros resultados son congruentes con estas

observaciones ya que, en dos muestras de líquido sinovial de un paciente con bursitis que

fue analizada en nuestro laboratorio, demostramos la presencia de IL-8 y MCP-1 así como

también de infiltrado leucocitario, incluyendo la presencia de monocitos y células

dendríticas. En la situación in vivo, los monocitos y los neutrófilos reclutados podrían

contribuir al daño osteoarticular mediante la producción de MMP-9 en respuesta a la

infección con B. abortus y también mediante la secreción de citoquinas proinflamatorias

que pueden inducir la producción de MMPs en otras células. Nosotros demostramos que

los sobrenadantes de cultivo de los monocitos y los neutrófilos infectados con B. abortus

son capaces de inducir la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos y los

fibroblastos sinoviales, y que en ambos casos la principal citoquina involucrada es TNF-α.

Por otro lado, factores producidos por los osteoblastos y fibroblastos sinoviales infectados

inducen la producción de MMPs por parte de los monocitos y neutrófilos. Demostramos de

GM-CSF secretado por los osteoblastos y fibroblastos sinoviales infectados está

involucrado en la inducción de MMP-9 por parte de los monocitos y neutrófilos. Además,

IL-6 derivada de los fibroblastos sinoviales infectados participa al menos parcialmente en

la inducción de la secreción de MMP-9 por parte de los neutrófilos. Estos resultados

sugieren que existe una red de interacciones mediada por citoquinas entre las células

residentes y las células inmunes atraídas en respuesta a la infección, resultando en un

incremento en la producción de MMP-2 y MMP-9, las cuales contribuyen a la destrucción

del hueso y las articulaciones.

El hecho de que HKBA también sea capaz de inducir la producción de MMP-9 por

parte de monocitos, neutrófilos y sinoviocitos demuestra que por lo menos uno de los

ligandos celulares estimulatorios es un componente estructural de la bacteria. Los estudios

previos realizados en nuestro laboratorio indicarían que el LPS de B. abortus no sería una


de las principales moléculas implicadas en dichos fenómenos. L-Omp19 utilizada como

modelo de lipoproteína mimetiza el efecto inductor de MMP-9 observado para HKBA. Dado

que la actividad de las lipoproteínas reside en el dominio lipídico y que este dominio es

probablemente compartido por todas las lipoproteínas bacterianas, el efecto observado por

L-Omp19 podría extenderse a todas las lipoproteínas de Brucella. En el caso de los

monocitos demostramos que la secreción de MMP-9 por L-Omp19 involucra el

reconocimiento de TLR2, y que esta mediada indirectamente por la producción de TNF-α.

Los fibroblastos sinoviales también expresan TLRs, incluyendo TLR2 [270]. En

concordancia con esta última observación demostramos que L-Omp19 también es capaz

de estimular la producción de MMP-2 por parte de estas células, y esto depende del

reconocimiento por dicho receptor.

Otro mecanismo de daño descripto en enfermedades inflamatorias crónicas del

hueso es la inducción patológica de osteoclastogénesis. En este contexto ha sido

demostrado que las citoquinas proinflamatorias TNF-α, Il-1β e IL-6, así como también

RANKL y TGF-β, son importantes en la progresión de la enfermedad y en el aumento de la

osteoclastogénesis [282, 283, 285, 288, 300, 301, 353]. Es importante destacar que los

monocitos/ macrófagos residentes o aquellos atraídos no solo son capaces de producir

mediadores inflamatorios sino que también tienen la capacidad de diferenciarse a

osteoclastos [284]. En este trabajo demostramos que las citoquinas proinflamatorias

producidas por monocitos/macrógafos, tanto de origen murino como humano, infectados

con B. abortus son capaces de inducir la formación de osteoclastos a partir de células no

diferenciadas, mediante un mecanismo en el cual TNF-α es la principal citoquina

implicada. L-Omp19 utilizada como modelo de lipoproteína también es capaz de inducir la

producción de citoquinas proinflamatorias y la concomitante osteoclastogénesis a través

del reconocimiento de TLR2.

Los osteoblastos son las células del hueso responsables de depositar los

componentes de la matriz ósea tanto orgánica como mineral por lo tanto, la reducción en el

número de los mismos o la alteración de su función provocan una disminución en la

deposición de matriz, contribuyendo al desbalance óseo. En este trabajo demostramos que

la infección con B. abortus induce la apoptosis de los osteoblastos, así como también la

inhibición de su diferenciación y de la deposición de matriz orgánica y mineral. Los

osteoblastos infectados también aumentan la expresión de RANKL, considerada la

principal citoquina involucrada en la regulación de la diferenciación de los osteoclastos

interactuando con RANK en la superficie de los precursores de los osteoclastos. Como ya

mencionamos, los monocitos/macrófagos atraídos pueden responder a la infección con B.

abortus produciendo citoquinas proinflamatorias. Dentro de estas últimas TNF-α es la

principal citoquina involucrada en el aumento de la expresión de RANKL por parte de los


osteoblastos, en la inducción de la apoptosis de los mismos, así como también en la

inhibición de su función y diferenciación.

En resumen, en una situación de infección con Brucella in vivo nosotros proponemos

el siguiente escenario basado en nuestros resultados y en las evidencias acumuladas

hasta el momento. Una vez que Brucella alcanza el sitio de localización osteoarticular, la

bacteria puede infectar y replicarse en osteoblastos y fibroblastos sinoviales. Estas células

responden a la infección produciendo MMP-2 y las quemoquinas MCP-1 e IL-8 las cuales

atraen monocitos y neutrófilos al sitio de infección. Estas células fagocíticas en el foco

inflamatorio responderían a la infección con B. abortus y sus lipoproteínas, y a factores

liberados por los osteoblastos y fibroblastos sinoviales infectados, produciendo MMP-9.

Además, la infección por B. abortus y sus lipoproteínas pueden inducir la producción de

citoquinas proinflamatorias por parte de los monocitos/macrófagos y neutrófilos. En este

sentido, TNF-α juega un papel importante en los distintos mecanismos involucrados en el

incremento patológico de la osteoclastogénesis, inhibición de la diferenciación y función de

los osteoblastos así como también en la inducción de la secreción de MMPs. Además, la

producción local de TNF-α es capaz de provocar un aumento en la producción de MCP-1

por parte de los osteoblastos [32], atrayendo de esta manera más monocitos al sitio de

infección, aumentando la inflamación local e incrementando así las posibilidades de que la

bacteria encuentre un nicho replicativo en el cual permanecer. De esta forma se genera un

círculo vicioso patológico que determinaría el destino de la brucelosis osteoarticular.

Los resultados de esta tesis sustentan un modelo en el cual por lo menos tres

mecanismos estarían involucrados en el desarrollo de la patología osteoarticular de la

brucelosis humana: la producción de MMP-2 y MMP-9, la inducción de la

osteoclastogénesis y una alteración en el número y función de los osteoblastos. En este

contexto las células inmunes atraídas al foco de infección jugarían un rol fundamental en el

desarrollo de una respuesta inflamatoria que favorece el desarrollo de estos mecanismos

de daño osteoarticular.


Conclusión general

1. Producción de metaloproteasas de matriz

Osteoblastos. B. abortus es capaz de infectar y replicarse en la línea celular de

osteoblastos humanos hFOB. Dicha infección induce la producción de GM-

CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α o IL-1β en estas células. B. abortus induce la producción de MMP-2 en osteoblastos a través de la

secreción de GM-CSF. Los osteoblastos infectados con B. abortus, secretan MCP-1 e IL-8. Los

sobrenadantes de cultivo de los osteoblastos infectados inducen la

migración de monocitos y neutrófilos in vitro. Interacción de los osteoblastos con los monocitos.

B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos. Los sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus inducen la

producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos mediante un

mecanismo dependiente principalmente de la presencia de TNF-α. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen

la producción de MMP-9 por parte de los monocitos. Este efecto está

mediado principalmente por GM-CSF, que media la producción de TNF-α

por parte de monocitos que a su vez induce la producción de MMP-9.

Interacción de los osteoblastos con los neutrófilos. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de los neutrófilos. Los sobrenadantes de los neutrófilos infectados con B. abortus inducen la

producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen

la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos. Fibroblastos sinoviales.

B. abortus invade y se replica en la línea celular de fibroblastos sinoviales

humanos SW982. La infección de los fibroblastos sinoviales con B. abortus induce la


producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α e IL-1β. La infección con B. abortus induce la producción de MMP-2 en fibroblastos

sinoviales. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus

inducen la migración de monocitos y neutrófilos.

Interacción de los fibroblastos sinoviales con los monocitos. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos infectados con B. abortus

inducen las producción de MMP-2 por parte de sinoviocitos a través de

TNF-α. Los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con

B. abortus inducen las producción de MMP-9 por parte de los monocitos a

través de GM-CSF. Interacción de los fibroblastos sinoviales con los neutrófilos.

Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus

inducen la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de

TNF-α. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus

inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos a través de IL-

6. Determinación de la actividad gelatinolítica neta.

La infección por B. abortus produce un incremento neto en la actividad

gelatinasa de las metaloproteasas secretadas por los osteoblastos,

monocitos, neutrófilos y fibroblastos sinoviales. Las lipoproteínas de Brucella en la inducción de metaloproteasas.

HKBA y la lipoproteína L-Omp19 inducen la producción de MMP-9 por

parte de los monocitos vía TLR2 y a través de la inducción de TNF-α. En

contraste, los osteoblastos no son capaces de producir MMP-9 en

respuesta a dichos estímulos. HKBA y L-Omp19 inducen la producción de MMP-9 por parte de


neutrófilos. HKBA induce la secreción de MMP-2 y citoquinas en fibroblastos sinoviales

humanos, y este efecto está mediado por L-Omp19 a través del

reconocimiento de TLR2. Modelo murino.

HKBA y L-Omp19 inducen la producción de citoquinas proinflamatorias,

quemoquinas y MMP-2 y-9 cuando son inoculados en la articulación de la

rodilla de ratones BALB/c. Paciente con bursitis brucelar.

Se detectó la presencia de TNF-α, IL-1β, IL-8, MCP-1 e IFN-, así como

también la producción de MMP-9 en dos muestras de fluido sinovial

obtenidas de un paciente con bursitis prepatelar debido a una infección con

B. abortus. Una de las muestras fue tomada al momento de la presentación

y la otra 3 meses después. Los niveles de todas las citoquinas se

incrementaron en la segunda muestra respecto de la tomada al inicio de la

presentación.

2. Inducción de la osteoclastogénesis

Los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus o

estimulados con L-Omp19 inducen la diferenciación de los monocitos

derivados de médula ósea a osteoclastos.

Los macrófagos murinos infectados con B. abortus o estimulados con L-

Omp19 producen las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-6 e IL-1β, pero

no RANKL ni TGF-β. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos

murinos infectados o estimulados con L-Omp19 y la concomitante

osteoclastogénesis depende de la presencia de MyD88 y TLR2. La formación de osteoclastos inducida por sobrenadantes de macrófagos

murinos infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 está

mediada principalmente por TNF-α. Los monocitos humanos se diferencian a osteoclastos en respuesta a la


infección con B. abortus a través de la secreción de TNF-α. B. abortus y L-Omp19 inducen osteoclastos diferenciados capaces de

degradar matriz mineral. HKBA y L-Omp19 inducen la formación de osteoclastos cuando son

inoculados en la tibia de ratones mediante un mecanismo dependiente de

TLR2.

3. Inhibición de la diferenciación y función de los osteoblastos

B. abortus invade y se multiplica en osteoblastos provenientes de un cultivo

primario de calvaria murina. La infección con B. abortus induce la expresión de KC, MCP-1 y MMP-2 y -

9 por parte de los osteoblastos de calvaria. La infección con B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos y estimula

la expresión de RANKL por parte de estas células. Además, la infección

inhibe la diferenciación de los osteoblastos, así como también la

mineralización y la deposición de matriz orgánica. TNF-α presente en los sobrenadantes de macrófagos murinos infectados

con B. abortus está involucrado en la estimulación de la expresión de

RANKL por parte de los osteoblastos, la inducción de la apoptosis y la

inhibición de la mineralización y deposición de matriz orgánica por parte de

los mismos.

En el Esquema 15 se presenta un resumen de las interacciones celulares y los

mecanismos inmunomoleculares de la brucelosis osteoarticular descriptos en esta tésis


Esquema 15.


Bibliografía

1. Fao-Who. 1986. Joint Expert Committee on Brucellosis. Sixth Report.Technical Report Series. World Health Organization, Geneva.

2. Samartino, L. E. 2002. Brucellosis in Argentina. Vet Microbiol. 90:71-80.

3. Rivero Puente, E. M.-P., M. Burusco Y R Díaz. 1978. Brucelosis.

4. Velasco, J., Romero, C., Lopez-Goni, I., Leiva, J., Diaz, R., and Moriyon, I. 1998. Evaluation of the relatedness of Brucella spp. and Ochrobactrum anthropi and description of Ochrobactrum intermedium sp. nov., a new species with a closer relationship to Brucella spp. Int J Syst Bacteriol. 48 Pt 3:759-768.

5. Michaux-Charachon, S., Bourg, G., Jumas-Bilak, E., Guigue-Talet, P., Allardet-Servent, A., O'callaghan, D., and Ramuz, M. 1997. Genome structure and phylogeny in the genus Brucella. J Bacteriol. 179:3244-3249.

6. Cloeckaert, A., Verger, J. M., Grayon, M., Paquet, J. Y., Garin-Bastuji, B., Foster, G., and Godfroid, J. 2001. Classification of Brucella spp. isolated from marine mammals by DNA polymorphism at the omp2 locus. Microbes Infect. 3:729-738.

7. Young, E. J. 1995. An overview of human brucellosis. Clin Infect Dis. 21:283-289; quiz 290.

8. Ko, J., and Splitter, G. A. 2003. Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans. Clin Microbiol Rev. 16:65-78.

9. Mantur, B. G., Amarnath, S. K., and Shinde, R. S. 2007. Review of clinical and laboratory features of human brucellosis. Indian J Med Microbiol. 25:188-202.

10. Audic, S., Lescot, M., Claverie, J. M., and Scholz, H. C. 2009. Brucella microti: the genome sequence of an emerging pathogen. BMC Genomics. 10:352.

11. Scholz, H. C., Nockler, K., Gollner, C., Bahn, P., Vergnaud, G., Tomaso, H., Al Dahouk, S., Kampfer, P., Cloeckaert, A., Maquart, M., Zygmunt, M. S., Whatmore, A. M., Pfeffer, M., Huber, B., Busse, H. J., and De, B. K. 2010. Brucella inopinata sp. nov., isolated from a breast implant infection. Int J Syst Evol Microbiol. 60:801-808.

12. O'callaghan, D., and Whatmore, A. M. 2011. Brucella genomics as we enter the multi-genome era. Brief Funct Genomics. 10:334-341.

13. Serre, A. 1989. Immunology and pathophysiology of human brucellosis. In: Brucellosis Clinical and Laboratory Aspects, E. J. C. Young, M. J. (ed.). CRC Press. p. 85.

14. Moriyon, I., and Lopez-Goni, I. 1998. Structure and properties of the outer membranes of Brucella abortus and Brucella melitensis. Int Microbiol. 1:19-26.


15. Cloeckaert, A., Vizcaino, N., Paquet, J. Y., Bowden, R. A., and Elzer, P. H. 2002. Major outer membrane proteins of Brucella spp.: past, present and future. Vet Microbiol. 90:229-247.

16. Douglas, J. T., Rosenberg, E. Y., Nikaido, H., Verstreate, D. R., and Winter, A. J. 1984. Porins of Brucella species. Infect Immun. 44:16-21.

17. Mobasheri, H., Ficht, T. A., Marquis, H., Lea, E. J., and Lakey, J. H. 1997. Brucella Omp2a and Omp2b porins: single channel measurements and topology prediction. FEMS Microbiol Lett. 155:23-30.

18. Marquis, H., and Ficht, T. A. 1993. The omp2 gene locus of Brucella abortus encodes two homologous outer membrane proteins with properties characteristic of bacterial porins. Infect Immun. 61:3785-3790.

19. Cloeckaert, A., Verger, J. M., Grayon, M., and Vizcaino, N. 1996. Molecular and immunological characterization of the major outer membrane proteins of Brucella. FEMS Microbiol Lett. 145:1-8.

20. Salhi, I., Boigegrain, R. A., Machold, J., Weise, C., Cloeckaert, A., and Rouot, B. 2003. Characterization of new members of the group 3 outer membrane protein family of Brucella spp. Infect Immun. 71:4326-4332.

21. Bae, J. E., Schurig, G. G., and Toth, T. E. 2002. Mice immune responses to Brucella abortus heat shock proteins. Use of baculovirus recombinant-expressing whole insect cells, purified Brucella abortus recombinant proteins, and a vaccinia virus recombinant as immunogens. Vet Microbiol. 88:189-202.

22. Winter, A. J., Verstreate, D. R., Hall, C. E., Jacobson, R. H., Castleman, W. L., Meredith, M. P., and Mclaughlin, C. A. 1983. Immune response to porin in cattle immunized with whole cell, outer membrane, and outer membrane protein antigens of Brucella abortus combined with trehalose dimycolate and muramyl dipeptide adjuvants. Infect Immun. 42:1159-1167.

23. Bowden, R. A., Cloeckaert, A., Zygmunt, M. S., and Dubray, G. 1998. Evaluation of immunogenicity and protective activity in BALB/c mice of the 25-kDa major outer-membrane protein of Brucella melitensis (Omp25) expressed in Escherichia coli. J Med Microbiol. 47:39-48.

24. Pasquevich, K. A., Estein, S. M., Garcia Samartino, C., Zwerdling, A., Coria, L. M., Barrionuevo, P., Fossati, C. A., Giambartolomei, G. H., and Cassataro, J. 2009. Immunization with recombinant Brucella species outer membrane protein Omp16 or Omp19 in adjuvant induces specific CD4+ and CD8+ T cells as well as systemic and oral protection against Brucella abortus infection. Infect Immun. 77:436-445.

25. Pasquevich, K. A., Garcia Samartino, C., Coria, L. M., Estein, S. M., Zwerdling, A., Ibanez, A. E., Barrionuevo, P., Oliveira, F. S., Carvalho, N. B., Borkowski, J., Oliveira, S. C., Warzecha, H., Giambartolomei, G. H., and Cassataro, J. 2010. The protein moiety of Brucella abortus outer membrane protein 16 is a new bacterial pathogen-associated molecular pattern that activates dendritic cells in vivo, induces a Th1 immune response, and is a promising self-adjuvanting vaccine against systemic and oral acquired brucellosis. J Immunol. 184:5200-5212.


26. Pasquevich, K. A., Ibanez, A. E., Coria, L. M., Garcia Samartino, C., Estein, S. M., Zwerdling, A., Barrionuevo, P., Oliveira, F. S., Seither, C., Warzecha, H., Oliveira, S. C., Giambartolomei, G. H., and Cassataro, J. 2011. An oral vaccine based on U-Omp19 induces protection against B. abortus mucosal challenge by inducing an adaptive IL-17 immune response in mice. PLoS One. 6:e16203.

27. Ariza Cardenal, J. 1995. Brucelosis. In: Farreras-Rozman Medicina Interna (13ra

Edición). Barcelona. Mosby-Doyma Libros S. A. p. 2312.

28. Porte, F., Liautard, J. P., and Kohler, S. 1999. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67:4041-4047.

29. Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., and Cheville, N. F. 1990. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27:317-328.

30. Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., and Cheville, N. F. 1990. Penetration and intracellular growth of Brucella abortus in nonphagocytic cells in vitro. Infect Immun. 58:2320-2328.

31. Castaneda-Roldan, E. I., Avelino-Flores, F., Dall'agnol, M., Freer, E., Cedillo, L., Dornand, J., and Giron, J. A. 2004. Adherence of Brucella to human epithelial cells and macrophages is mediated by sialic acid residues. Cell Microbiol. 6:435-445.

32. Delpino, M. V., Fossati, C. A., and Baldi, P. C. 2009. Proinflammatory response of human osteoblastic cell lines and osteoblast-monocyte interaction upon infection with Brucella spp. Infect Immun. 77:984-995.

33. Delpino, M. V., Barrionuevo, P., Scian, R., Fossati, C. A., and Baldi, P. C. 2010. Brucella-infected hepatocytes mediate potentially tissue-damaging immune responses. J Hepatol. 53:145-154.

34. Ferrero, M. C., Fossati, C. A., and Baldi, P. C. 2009. Smooth Brucella strains invade and replicate in human lung epithelial cells without inducing cell death. Microbes Infect. 11:476-483.

35. Pontow, S. E., Kery, V., and Stahl, P. D. 1992. Mannose receptor. Int Rev Cytol. 137B:221-244.

36. Aréstegui, M. B., Gualtieri, C. S., Domínguez, J. And Scharovsky, G. 2001. El género Brucella y su interacción con el sistema mononuclear fagocítico. Vet Mex. 32:131.

37. Pappas, G., Akritidis, N., Bosilkovski, M., and Tsianos, E. 2005. Brucellosis. N Engl J Med. 352:2325-2336.

38. Watarai, M., Makino, S., Michikawa, M., Yanagisawa, K., Murakami, S., and Shirahata, T. 2002. Macrophage plasma membrane cholesterol contributes to Brucella abortus infection of mice. Infect Immun. 70:4818-4825.

39. Watarai, M. 2004. Interaction between Brucella abortus and cellular prion protein in lipid raft microdomains. Microbes Infect. 6:93-100.


40. Watarai, M., Kim, S., Erdenebaatar, J., Makino, S., Horiuchi, M., Shirahata, T., Sakaguchi, S., and Katamine, S. 2003. Cellular prion protein promotes Brucella infection into macrophages. J Exp Med. 198:5-17.

41. Jiang, X., and Baldwin, C. L. 1993. Effects of cytokines on intracellular growth of Brucella abortus. Infect Immun. 61:124-134.

42. Jiang, X., Leonard, B., Benson, R., and Baldwin, C. L. 1993. Macrophage control of Brucella abortus: role of reactive oxygen intermediates and nitric oxide. Cell Immunol. 151:309-319.

43. Baldwin, C. L., and Goenka, R. 2006. Host immune responses to the intracellular bacteria Brucella: does the bacteria instruct the host to facilitate chronic infection? Crit Rev Immunol. 26:407-442.

44. Teixeira-Gomes, A. P., Cloeckaert, A., and Zygmunt, M. S. 2000. Characterization of heat, oxidative, and acid stress responses in Brucella melitensis. Infect Immun. 68:2954-2961.

45. Canning, P. C. 1990. Phagocyte function in resistance to brucellosis. In: Advances in brucellosis research, L. G. Adams (ed.). Texas A&M University Press, College Station. p. 151.

46. Boschiroli, M. L., Ouahrani-Bettache, S., Foulongne, V., Michaux-Charachon, S., Bourg, G., Allardet-Servent, A., Cazevieille, C., Liautard, J. P., Ramuz, M., and O'callaghan, D. 2002. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:1544-1549.

47. Starr, T., Child, R., Wehrly, T. D., Hansen, B., Hwang, S., Lopez-Otin, C., Virgin, H. W., and Celli, J. 2012. Selective subversion of autophagy complexes facilitates completion of the Brucella intracellular cycle. Cell Host Microbe. 11:33-45.

48. Seleem, M. N., Boyle, S. M. And Sriranganathan, N. 2008. Brucella: a pathogen without classic virulence genes. Vet Microbiol. 129:1.

49. Franco, M. P., Mulder, M., Gilman, R. H., and Smits, H. L. 2007. Human brucellosis. Lancet Infect Dis. 7:775-786.

50. Corbel, M. J. 1997. Brucellosis: an overview. Emerg Infect Dis. 3:213-221.

51. Moreno, E. 2002. Brucellosis in Central America. Vet Microbiol. 90:31-38.

52. Gandara, B., Merino, A. L., Rogel, M. A., and Martinez-Romero, E. 2001. Limited genetic diversity of Brucella spp. J Clin Microbiol. 39:235-240.

53. Higgins, J., Stuber, T., Quance, C., Edwards, W. H., Tiller, R. V., Linfield, T., Rhyan, J., Berte, A., and Harris, B. 2012. Molecular epidemiology of Brucella abortus isolates from cattle, elk, and bison in the United States, 1998 to 2011. Appl Environ Microbiol. 78:3674-3684.

54. Havas, K. A., Ramishvili, M., Navdarashvili, A., Imnadze, P., and Salman, M. 2012. The human-animal interface of domestic livestock management and production and its relationship to brucellosis in the country of Georgia 2010: a rapid assessment analysis. Prev Vet Med. 105:10-16.


55. Lucero, N. E., Foglia, L., Ayala, S. M., Gall, D., and Nielsen, K. 1999. Competitive enzyme immunoassay for diagnosis of human brucellosis. J Clin Microbiol. 37:3245-3248.

56. Rivera, S. A., Ramirez, M. C., and Lopetegui, I. P. 2002. Eradication of bovine brucellosis in the 10th Region de Los Lagos, Chile. Vet Microbiol. 90:45-53.

57. Godfroid, J., Cloeckaert, A., Liautard, J. P., Kohler, S., Fretin, D., Walravens, K., Garin-Bastuji, B., and Letesson, J. J. 2005. From the discovery of the Malta fever's agent to the discovery of a marine mammal reservoir, brucellosis has continuously been a re-emerging zoonosis. Vet Res. 36:313-326.

58. Garcia-Carrillo, C. 1987. La brucelosis de los animales en América y su relación con la infección humana. In. OIE. p. 303. París.

59. 2005. http://www.senasa.gov.ar/indexhtml.php. SENASA: Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria. SENASA Argentina.

60. 2005. http://www.inta.gov.ar/actual/ant/2005/may18.htm. INTA: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria.

61. Aznar, M. N., Samartino, L. E., Humblet, M. F., and Saegerman, C. 2012. Bovine Brucellosis in Argentina and Bordering Countries: Update. Transbound Emerg Dis.

62. Rodríguez, A., Orduña, A., Ariza, X., Moriyon, I., Díaz, R., Blasco, J., Almaraz, A., Martínez, F., Ruiz, C. And Abad, R. 2001. Manual de Brucelosis. Ed. Junta de Castilla y León.

63. Wallach Jc, Ferrero Mc, Victoria Delpino M, Fossati Ca, Baldi Pc. 2008. Occupational infection due to Brucella abortus S19 among workers involved in vaccine production in Argentina. Clin Microbiol Infect. 14:805-807.

64. Serre, A., Bascoul, S., Vendrell, J. P., and Cannat, A. 1987. Human immune response to Brucella infection. Ann Inst Pasteur Microbiol. 138:113-117.

65. Fiori, P. L., Mastrandrea, S., Rappelli, P., and Cappuccinelli, P. 2000. Brucella abortus infection acquired in microbiology laboratories. J Clin Microbiol. 38:2005-2006.

66. Kaufmann, A. F., Meltzer, M. I., and Schmid, G. P. 1997. The economic impact of a bioterrorist attack: are prevention and postattack intervention programs justifiable? Emerg Infect Dis. 3:83-94.

67. Madkour, M. M. 2001. Brucellosis: Overview. In: Brucellosis. (2° Edition). Springer. p. 1.

68. Yagupsky, P. 1999. Detection of Brucellae in blood cultures. J Clin Microbiol. 37:3437-3442.

69. Memish, Z., Mah, M. W., Al Mahmoud, S., Al Shaalan, M., and Khan, M. Y. 2000. Brucella bacteraemia: clinical and laboratory observations in 160 patients. J Infect. 40:59-63.


70. Montejo, J. M., Alberola, I., Glez-Zarate, P., Alvarez, A., Alonso, J., Canovas, A., and Aguirre, C. 1993. Open, randomized therapeutic trial of six antimicrobial regimens in the treatment of human brucellosis. Clin Infect Dis. 16:671-676.

71. Golding, B., Scott, D. E., Scharf, O., Huang, L. Y., Zaitseva, M., Lapham, C., Eller, N., and Golding, H. 2001. Immunity and protection against Brucella abortus. Microbes Infect. 3:43-48.

72. Spector, W. G., Reichhold, N., and Ryan, G. B. 1970. Degradation of granuloma-inducing micro-organisms by macrophages. J Pathol. 101:339-354.

73. Eze, M. O., Yuan, L., Crawford, R. M., Paranavitana, C. M., Hadfield, T. L., Bhattacharjee, A. K., Warren, R. L., and Hoover, D. L. 2000. Effects of opsonization and gamma interferon on growth of Brucella melitensis 16M in mouse peritoneal macrophages in vitro. Infect Immun. 68:257-263.

74. Frenchick, P. J., Markham, R. J., and Cochrane, A. H. 1985. Inhibition of phagosome-lysosome fusion in macrophages by soluble extracts of virulent Brucella abortus. Am J Vet Res. 46:332-335.

75. Billard, E., Cazevieille, C., Dornand, J., and Gross, A. 2005. High susceptibility of human dendritic cells to invasion by the intracellular pathogens Brucella suis, B. abortus, and B. melitensis. Infect Immun. 73:8418-8424.

76. Copin, R., De Baetselier, P., Carlier, Y., Letesson, J. J., and Muraille, E. 2007. MyD88-dependent activation of B220-CD11b+LY-6C+ dendritic cells during Brucella melitensis infection. J Immunol. 178:5182-5191.

77. Zwerdling, A., Delpino, M. V., Barrionuevo, P., Cassataro, J., Pasquevich, K. A., Garcia Samartino, C., Fossati, C. A., and Giambartolomei, G. H. 2008. Brucella lipoproteins mimic dendritic cell maturation induced by Brucella abortus. Microbes Infect. 10:1346-1354.

78. Copin, R., Vitry, M. A., Hanot Mambres, D., Machelart, A., De Trez, C., Vanderwinden, J. M., Magez, S., Akira, S., Ryffel, B., Carlier, Y., Letesson, J. J., and Muraille, E. 2012. In situ microscopy analysis reveals local innate immune response developed around Brucella infected cells in resistant and susceptible mice. PLoS Pathog. 8:e1002575.

79. Surendran, N., Hiltbold, E. M., Heid, B., Akira, S., Standiford, T. J., Sriranganathan, N., Boyle, S. M., Zimmerman, K. L., Makris, M. R., and Witonsky, S. G. 2012. Role of TLRs in Brucella mediated murine DC activation in vitro and clearance of pulmonary infection in vivo. Vaccine. 30:1502-1512.

80. Fernandes, D. M., Benson, R., and Baldwin, C. L. 1995. Lack of a role for natural killer cells in early control of Brucella abortus 2308 infections in mice. Infect Immun. 63:4029-4033.

81. Murphy, E. A., Parent, M., Sathiyaseelan, J., Jiang, X., and Baldwin, C. L. 2001. Immune control of Brucella abortus 2308 infections in BALB/c mice. FEMS Immunol Med Microbiol. 32:85-88.

82. Takeda, K., Kaisho, T., and Akira, S. 2003. Toll-like receptors. Annu Rev Immunol. 21:335-376.


83. Oliveira, S. C., De Almeida, L. A., Carvalho, N. B., Oliveira, F. S., and Lacerda, T. L. 2012. Update on the role of innate immune receptors during Brucella abortus infection. Vet Immunol Immunopathol. 148:129-135.

84. Macedo, G. C., Magnani, D. M., Carvalho, N. B., Bruna-Romero, O., Gazzinelli, R. T., and Oliveira, S. C. 2008. Central role of MyD88-dependent dendritic cell maturation and proinflammatory cytokine production to control Brucella abortus infection. J Immunol. 180:1080-1087.

85. Oliveira, S. C., De Oliveira, F. S., Macedo, G. C., De Almeida, L. A., and Carvalho, N. B. 2008. The role of innate immune receptors in the control of Brucella abortus infection: toll-like receptors and beyond. Microbes Infect. 10:1005-1009.

86. Elzer, P. H., Jacobson, R. H., Jones, S. M., Nielsen, K. H., Douglas, J. T., and Winter, A. J. 1994. Antibody-mediated protection against Brucella abortus in BALB/c mice at successive periods after infection: variation between virulent strain 2308 and attenuated vaccine strain 19. Immunology. 82:651-658.

87. Winter, A. J., Duncan, J. R., Santisteban, C. G., Douglas, J. T., and Adams, L. G. 1989. Capacity of passively administered antibody to prevent establishment of Brucella abortus infection in mice. Infect Immun. 57:3438-3444.

88. Cassataro, J., Velikovsky, C. A., De La Barrera, S., Estein, S. M., Bruno, L., Bowden, R., Pasquevich, K. A., Fossati, C. A., and Giambartolomei, G. H. 2005. A DNA vaccine coding for the Brucella outer membrane protein 31 confers protection against B. melitensis and B. ovis infection by eliciting a specific cytotoxic response. Infect Immun. 73:6537-6546.

89. Oliveira, S. C., and Splitter, G. A. 1995. CD8+ type 1 CD44hi CD45 RBlo T lymphocytes control intracellular Brucella abortus infection as demonstrated in major histocompatibility complex class I- and class II-deficient mice. Eur J Immunol. 25:2551-2557.

90. Murphy, E. A., Sathiyaseelan, J., Parent, M. A., Zou, B., and Baldwin, C. L. 2001. Interferon-gamma is crucial for surviving a Brucella abortus infection in both resistant C57BL/6 and susceptible BALB/c mice. Immunology. 103:511-518.

91. Kunkle, R. A., Steadham, E. M., and Cheville, N. F. 1995. Morphometric analysis of CD4+, CD8+, and gamma/delta+ T-lymphocytes in lymph nodes of cattle vaccinated with Brucella abortus strains RB51 and 19. Vet Immunol Immunopathol. 49:271-279.

92. Munoz-Montesino, C., Andrews, E., Rivers, R., Gonzalez-Smith, A., Moraga-Cid, G., Folch, H., Cespedes, S., and Onate, A. A. 2004. Intraspleen delivery of a DNA vaccine coding for superoxide dismutase (SOD) of Brucella abortus induces SOD-specific CD4+ and CD8+ T cells. Infect Immun. 72:2081-2087.

93. Bertotto, A., Gerli, R., Spinozzi, F., Muscat, C., Scalise, F., Castellucci, G., Sposito, M., Candio, F., and Vaccaro, R. 1993. Lymphocytes bearing the gamma delta T cell receptor in acute Brucella melitensis infection. Eur J Immunol. 23:1177-1180.

94. Ottones, F., Dornand, J., Naroeni, A., Liautard, J. P., and Favero, J. 2000. V gamma 9V delta 2 T cells impair intracellular multiplication of Brucella suis in


autologous monocytes through soluble factor release and contact-dependent cytotoxic effect. J Immunol. 165:7133-7139.

95. Gamazo, C., Winter, A. J., Moriyon, I., Riezu-Boj, J. I., Blasco, J. M., and Diaz, R. 1989. Comparative analyses of proteins extracted by hot saline or released spontaneously into outer membrane blebs from field strains of Brucella ovis and Brucella melitensis. Infect Immun. 57:1419-1426.

96. Zhan, Y., Kelso, A., and Cheers, C. 1993. Cytokine production in the murine response to Brucella infection or immunization with antigenic extracts. Immunology. 80:458-464.

97. Zhan, Y., Liu, Z., and Cheers, C. 1996. Tumor necrosis factor alpha and interleukin-12 contribute to resistance to the intracellular bacterium Brucella abortus by different mechanisms. Infect Immun. 64:2782-2786.

98. Goldstein, J., Hoffman, T., Frasch, C., Lizzio, E. F., Beining, P. R., Hochstein, D., Lee, Y. L., Angus, R. D., and Golding, B. 1992. Lipopolysaccharide (LPS) from Brucella abortus is less toxic than that from Escherichia coli, suggesting the possible use of B. abortus or LPS from B. abortus as a carrier in vaccines. Infect Immun. 60:1385-1389.

99. Demirdag, K., Ozden, M., Kalkan, A., Godekmerdan, A., and Sirri Kilic, S. 2003. Serum cytokine levels in patients with acute brucellosis and their relation to the traditional inflammatory markers. FEMS Immunol Med Microbiol. 39:149-153.

100. Ko, J., Gendron-Fitzpatrick, A., and Splitter, G. A. 2002. Susceptibility of IFN regulatory factor-1 and IFN consensus sequence binding protein-deficient mice to brucellosis. J Immunol. 168:2433-2440.

101. Zhan, Y., and Cheers, C. 1995. Differential induction of macrophage-derived cytokines by live and dead intracellular bacteria in vitro. Infect Immun. 63:720-723.

102. Ho, M., and Cheers, C. 1982. Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection. IV. Genetic and cellular basis of resistance to chronic infection with Brucella abortus. J Infect Dis. 146:381-387.

103. Fernandes, D. M., and Baldwin, C. L. 1995. Interleukin-10 downregulates protective immunity to Brucella abortus. Infect Immun. 63:1130-1133.

104. Vitry, M. A., De Trez, C., Goriely, S., Dumoutier, L., Akira, S., Ryffel, B., Carlier, Y., Letesson, J. J., and Muraille, E. 2012. Crucial role of IFN-gamma-producing CD4+ Th1 cells but dispensable function of CD8+ T cell, B cell, Th2 and Th17 responses in the control of Brucella melitensis infection in mice. Infect Immun.

105. Stevens, M. G., and Olsen, S. C. 1994. In vitro effects of live and killed Brucella abortus on bovine cytokine and prostaglandin E2 production. Vet Immunol Immunopathol. 40:149-161.

106. Zaitseva, M., Golding, H., Manischewitz, J., Webb, D., and Golding, B. 1996. Brucella abortus as a potential vaccine candidate: induction of interleukin-12 secretion and enhanced B7.1 and B7.2 and intercellular adhesion molecule 1


surface expression in elutriated human monocytes stimulated by heat-inactivated B. abortus. Infect Immun. 64:3109-3117.

107. Huang, L. Y., Aliberti, J., Leifer, C. A., Segal, D. M., Sher, A., Golenbock, D. T., and Golding, B. 2003. Heat-killed Brucella abortus induces TNF and IL-12p40 by distinct MyD88-dependent pathways: TNF, unlike IL-12p40 secretion, is Toll-like receptor 2 dependent. J Immunol. 171:1441-1446.

108. Garcia Samartino, C., Delpino, M. V., Pott Godoy, C., Di Genaro, M. S., Pasquevich, K. A., Zwerdling, A., Barrionuevo, P., Mathieu, P., Cassataro, J., Pitossi, F., and Giambartolomei, G. H. 2010. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. Am J Pathol. 176:1323-1338.

109. Giambartolomei, G. H., Zwerdling, A., Cassataro, J., Bruno, L., Fossati, C. A., and Philipp, M. T. 2004. Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus. J Immunol. 173:4635-4642.

110. Ficht, T. A. 2003. Intracellular survival of Brucella: defining the link with persistence. Vet Microbiol. 92:213-223.

111. Runnells, R., Monlux, W. And Monlux, A. 1980. Brucelosis. In: Principios de Patología Veterinaria: Anatomía Patológica. Editorial Continental, S.A.(1ra Edición en Español, Novena reimpresión). p. 645.

112. Hausler, W. And Koontz, F. 1974. Manual of Clinical Microbiology. , 2nd ed. American Society of Microbiology. Lennette,E., Spaulding, E., Truant, J.(eds).

113. Lulu, A. R., Araj, G. F., Khateeb, M. I., Mustafa, M. Y., Yusuf, A. R., and Fenech, F. F. 1988. Human brucellosis in Kuwait: a prospective study of 400 cases. Q J Med. 66:39-54.

114. Madkour Mm, Al-Moutaery Kr, Al-Deeb S. 2001. Neurobrucellosis. In: Madkour MM, ed. Madkour’s Brucellosis, 2nd ed. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag. p. 166–178.

115. Chevrel, J., Riojas, A., Lafargues, J. P., Sarlangue, J., and Barbier, R. 2001. [Osteoarticular brucellosis and signs of autoimmunity]. Arch Pediatr. 8:834-837.

116. Colmenero, J. D., Reguera, J. M., Fernandez-Nebro, A., and Cabrera-Franquelo, F. 1991. Osteoarticular complications of brucellosis. Ann Rheum Dis. 50:23-26.

117. Kubler, P. A., and Klestov, A. C. 2001. Osteoarticular brucellosis with long latent period. Clin Rheumatol. 20:444-446.

118. Priest, J. R., Low, D., Wang, C., and Bush, T. 2008. Brucellosis and sacroiliitis: a common presentation of an uncommon pathogen. J Am Board Fam Med. 21:158-161.

119. Jordans, H. G., and Debruin, K. D. 1980. Granulomas in Brucella melitensis infection. Ann Intern Med. 92:264-265.


120. Colmenero Jde, D., Queipo-Ortuno, M. I., Maria Reguera, J., Angel Suarez-Munoz, M., Martin-Carballino, S., and Morata, P. 2002. Chronic hepatosplenic abscesses in Brucellosis. Clinico-therapeutic features and molecular diagnostic approach. Diagn Microbiol Infect Dis. 42:159-167.

121. Bouza, E., Garcia De La Torre, M., Parras, F., Guerrero, A., Rodriguez-Creixems, M., and Gobernado, J. 1987. Brucellar meningitis. Rev Infect Dis. 9:810-822.

122. Letesson, J. J., Lestrate, P., Delrue, R. M., Danese, I., Bellefontaine, F., Fretin, D., Taminiau, B., Tibor, A., Dricot, A., Deschamps, C., Haine, V., Leonard, S., Laurent, T., Mertens, P., Vandenhaute, J., and De Bolle, X. 2002. Fun stories about Brucella: the "furtive nasty bug". Vet Microbiol. 90:317-328.

123. Roop, R. M., 2nd, Gee, J. M., Robertson, G. T., Richardson, J. M., Ng, W. L., and Winkler, M. E. 2003. Brucella stationary-phase gene expression and virulence. Annu Rev Microbiol. 57:57-76.

124. Tolomeo, M., Di Carlo, P., Abbadessa, V., Titone, L., Miceli, S., Barbusca, E., Cannizzo, G., Mancuso, S., Arista, S., and Scarlata, F. 2003. Monocyte and lymphocyte apoptosis resistance in acute and chronic brucellosis and its possible implications in clinical management. Clin Infect Dis. 36:1533-1538.

125. Gross, A., Terraza, A., Ouahrani-Bettache, S., Liautard, J. P., and Dornand, J. 2000. In vitro Brucella suis infection prevents the programmed cell death of human monocytic cells. Infect Immun. 68:342-351.

126. He, Y., Reichow, S., Ramamoorthy, S., Ding, X., Lathigra, R., Craig, J. C., Sobral, B. W., Schurig, G. G., Sriranganathan, N., and Boyle, S. M. 2006. Brucella melitensis triggers time-dependent modulation of apoptosis and down-regulation of mitochondrion-associated gene expression in mouse macrophages. Infect Immun. 74:5035-5046.

127. Campos, M. A., Rosinha, G. M., Almeida, I. C., Salgueiro, X. S., Jarvis, B. W., Splitter, G. A., Qureshi, N., Bruna-Romero, O., Gazzinelli, R. T., and Oliveira, S. C. 2004. Role of Toll-like receptor 4 in induction of cell-mediated immunity and resistance to Brucella abortus infection in mice. Infect Immun. 72:176-186.

128. Huang, L., Krieg, A. M., Eller, N., and Scott, D. E. 1999. Induction and regulation of Th1-inducing cytokines by bacterial DNA, lipopolysaccharide, and heat-inactivated bacteria. Infect Immun. 67:6257-6263.

129. Waage a, Halstensen a, Espevik T. 1987. Association between tumour necrosis factor in serum and fatal outcome in patients with meningococcal disease. Lancet. 1:355-357.

130. Dayer, J. M., De Rochemonteix, B., Burrus, B., Demczuk, S., and Dinarello, C. A. 1986. Human recombinant interleukin 1 stimulates collagenase and prostaglandin E2 production by human synovial cells. J Clin Invest. 77:645-648.

131. Evequoz, V., Bettens, F., Kristensen, F., Trechsel, U., Stadler, B. M., Dayer, J. M., De Weck, A. L., and Fleisch, H. 1984. Interleukin 2-independent stimulation of rabbit chondrocyte collagenase and prostaglandin E2 production by an interleukin 1-like factor. Eur J Immunol. 14:490-495.


132. Vassalli, P. 1992. The pathophysiology of tumor necrosis factors. Annu Rev Immunol. 10:411-452.

133. Kreutzer, D. L., and Robertson, D. C. 1979. Surface macromolecules and virulence in intracellular parasitism: comparison of cell envelope components of smooth and rough strains of Brucella abortus. Infect Immun. 23:819-828.

134. Young, E. J., Borchert, M., Kretzer, F. L., and Musher, D. M. 1985. Phagocytosis and killing of Brucella by human polymorphonuclear leukocytes. J Infect Dis. 151:682-690.

135. Moreno, E., Berman, D. T., and Boettcher, L. A. 1981. Biological activities of Brucella abortus lipopolysaccharides. Infect Immun. 31:362-370.

136. Ulevitch, R. J., and Tobias, P. S. 1995. Receptor-dependent mechanisms of cell stimulation by bacterial endotoxin. Annu Rev Immunol. 13:437-457.

137. Berman, D. T., and Kurtz, R. S. 1987. Relationship of biological activities to structures of Brucella abortus endotoxin and LPS. Ann Inst Pasteur Microbiol. 138:98-101.

138. Netea, M. G., Van Deuren, M., Kullberg, B. J., Cavaillon, J. M., and Van Der Meer, J. W. 2002. Does the shape of lipid A determine the interaction of LPS with Toll-like receptors? Trends Immunol. 23:135-139.

139. Qureshi N, Takayama K, Seydel U, Wang R, Cotter J, Agrawall Pk, Bush Ca, Kurtz R, Berman Dt. 1994. Structural analysis of lipid A derived from lipopolyssacharide of Brucella abortus. J. Endotoxin Res. 1:137.

140. Am, Krieg. 2002. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annu Rev Immunol. 20:709-760.

141. Giambartolomei, G. H., Dennis, V. A., Lasater, B. L., and Philipp, M. T. 1999. Induction of pro- and anti-inflammatory cytokines by Borrelia burgdorferi lipoproteins in monocytes is mediated by CD14. Infect Immun. 67:140-147.

142. Ma, Y., and Weis, J. J. 1993. Borrelia burgdorferi outer surface lipoproteins OspA and OspB possess B-cell mitogenic and cytokine-stimulatory properties. Infect Immun. 61:3843-3853.

143. Radolf, J. D., Arndt, L. L., Akins, D. R., Curetty, L. L., Levi, M. E., Shen, Y., Davis, L. S., and Norgard, M. V. 1995. Treponema pallidum and Borrelia burgdorferi lipoproteins and synthetic lipopeptides activate monocytes/macrophages. J Immunol. 154:2866-2877.

144. Aliprantis, A. O., Yang, R. B., Mark, M. R., Suggett, S., Devaux, B., Radolf, J. D., Klimpel, G. R., Godowski, P., and Zychlinsky, A. 1999. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285:736-739.

145. Giambartolomei, G. H., Dennis, V. A., and Philipp, M. T. 1998. Borrelia burgdorferi stimulates the production of interleukin-10 in peripheral blood mononuclear cells from uninfected humans and rhesus monkeys. Infect Immun. 66:2691-2697.


146. Giambartolomei, G. H., Dennis, V. A., Lasater, B. L., Murthy, P. K., and Philipp, M. T. 2002. Autocrine and exocrine regulation of interleukin-10 production in THP-1 cells stimulated with Borrelia burgdorferi lipoproteins. Infect Immun. 70:1881-1888.

147. Tibor, A., Saman, E., De Wergifosse, P., Cloeckaert, A., Limet, J. N., and Letesson, J. J. 1996. Molecular characterization, occurrence, and immunogenicity in infected sheep and cattle of two minor outer membrane proteins of Brucella abortus. Infect Immun. 64:100-107.

148. Tibor, A., Weynants, V., Denoel, P., Lichtfouse, B., De Bolle, X., Saman, E., Limet, J. N., and Letesson, J. J. 1994. Molecular cloning, nucleotide sequence, and occurrence of a 16.5-kilodalton outer membrane protein of Brucella abortus with similarity to pal lipoproteins. Infect Immun. 62:3633-3639.

149. Tibor, A., Decelle, B., and Letesson, J. J. 1999. Outer membrane proteins Omp10, Omp16, and Omp19 of Brucella spp. are lipoproteins. Infect Immun. 67:4960-4962.

150. Clarke, B. 2008. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3 Suppl 3:S131-139.

151. Eriksen, E. F. 2010. Cellular mechanisms of bone remodeling. Rev Endocr Metab Disord. 11:219-227.

152. Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., and Xu, J. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clin Biochem. 45:863-873.

153. Raggatt, L. J., and Partridge, N. C. 2010. Cellular and molecular mechanisms of bone remodeling. J Biol Chem. 285:25103-25108.

154. Teitelbaum, S. L. 2000. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289:1504-1508.

155. Li, Z., Kong, K., and Qi, W. 2006. Osteoclast and its roles in calcium metabolism and bone development and remodeling. Biochem Biophys Res Commun. 343:345-350.

156. Vaananen, H. K., and Horton, M. 1995. The osteoclast clear zone is a specialized cell-extracellular matrix adhesion structure. J Cell Sci. 108 ( Pt 8):2729-2732.

157. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., and Nicholson, G. C. 2007. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. J Cell Biochem. 102:759-768.

158. Horwood, N. J., Kartsogiannis, V., Quinn, J. M., Romas, E., Martin, T. J., and Gillespie, M. T. 1999. Activated T lymphocytes support osteoclast formation in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 265:144-150.

159. Takayanagi, H., Iizuka, H., Juji, T., Nakagawa, T., Yamamoto, A., Miyazaki, T., Koshihara, Y., Oda, H., Nakamura, K., and Tanaka, S. 2000. Involvement of receptor activator of nuclear factor kappaB ligand/osteoclast differentiation factor in osteoclastogenesis from synoviocytes in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43:259-269.


160. Kawai, T., Matsuyama, T., Hosokawa, Y., Makihira, S., Seki, M., Karimbux, N. Y., Goncalves, R. B., Valverde, P., Dibart, S., Li, Y. P., Miranda, L. A., Ernst, C. W., Izumi, Y., and Taubman, M. A. 2006. B and T lymphocytes are the primary sources of RANKL in the bone resorptive lesion of periodontal disease. Am J Pathol. 169:987-998.

161. Yasuda, H., Shima, N., Nakagawa, N., Mochizuki, S. I., Yano, K., Fujise, N., Sato, Y., Goto, M., Yamaguchi, K., Kuriyama, M., Kanno, T., Murakami, A., Tsuda, E., Morinaga, T., and Higashio, K. 1998. Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro. Endocrinology. 139:1329-1337.

162. Centrella, M., Mccarthy, T. L., and Canalis, E. 1991. Transforming growth factor-beta and remodeling of bone. J Bone Joint Surg Am. 73:1418-1428.

163. Hayden, J. M., Mohan, S., and Baylink, D. J. 1995. The insulin-like growth factor system and the coupling of formation to resorption. Bone. 17:93S-98S.

164. Wozney, J. M., Rosen, V., Celeste, A. J., Mitsock, L. M., Whitters, M. J., Kriz, R. W., Hewick, R. M., and Wang, E. A. 1988. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242:1528-1534.

165. Martin, T. J., Allan, E. H., Ho, P. W., Gooi, J. H., Quinn, J. M., Gillespie, M. T., Krasnoperov, V., and Sims, N. A. 2010. Communication between ephrinB2 and EphB4 within the osteoblast lineage. Adv Exp Med Biol. 658:51-60.

166. Zhao, C., Irie, N., Takada, Y., Shimoda, K., Miyamoto, T., Nishiwaki, T., Suda, T., and Matsuo, K. 2006. Bidirectional ephrinB2-EphB4 signaling controls bone homeostasis. Cell Metab. 4:111-121.

167. Ryu, J., Kim, H. J., Chang, E. J., Huang, H., Banno, Y., and Kim, H. H. 2006. Sphingosine 1-phosphate as a regulator of osteoclast differentiation and osteoclast-osteoblast coupling. Embo J. 25:5840-5851.

168. Ishii, M., Egen, J. G., Klauschen, F., Meier-Schellersheim, M., Saeki, Y., Vacher, J., Proia, R. L., and Germain, R. N. 2009. Sphingosine-1-phosphate mobilizes osteoclast precursors and regulates bone homeostasis. Nature. 458:524-528.

169. Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S., and Marshak, D. R. 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284:143-147.

170. Neve, A., Corrado, A., and Cantatore, F. P. 2011. Osteoblast physiology in normal and pathological conditions. Cell Tissue Res. 343:289-302.

171. Hu, H., Hilton, M. J., Tu, X., Yu, K., Ornitz, D. M., and Long, F. 2005. Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development. Development. 132:49-60.

172. Chen, G., Deng, C., and Li, Y. P. 2012. TGF-beta and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation. Int J Biol Sci. 8:272-288.


173. Malone, J. D., Teitelbaum, S. L., Griffin, G. L., Senior, R. M., and Kahn, A. J. 1982. Recruitment of osteoclast precursors by purified bone matrix constituents. J Cell Biol. 92:227-230.

174. Li, X., Qin, L., Bergenstock, M., Bevelock, L. M., Novack, D. V., and Partridge, N. C. 2007. Parathyroid hormone stimulates osteoblastic expression of MCP-1 to recruit and increase the fusion of pre/osteoclasts. J Biol Chem. 282:33098-33106.

175. Anderson, P. H., Atkins, G. J., Turner, A. G., Kogawa, M., Findlay, D. M., and Morris, H. A. 2011. Vitamin D metabolism within bone cells: effects on bone structure and strength. Mol Cell Endocrinol. 347:42-47.

176. Lombardi, G., Di Somma, C., Rubino, M., Faggiano, A., Vuolo, L., Guerra, E., Contaldi, P., Savastano, S., and Colao, A. 2011. The roles of parathyroid hormone in bone remodeling: prospects for novel therapeutics. J Endocrinol Invest. 34:18-22.

177. Advani, S., Lafrancis, D., Bogdanovic, E., Taxel, P., Raisz, L. G., and Kream, B. E. 1997. Dexamethasone suppresses in vivo levels of bone collagen synthesis in neonatal mice. Bone. 20:41-46.

178. Pacifici, R. 1998. Cytokines, estrogen, and postmenopausal osteoporosis--the second decade. Endocrinology. 139:2659-2661.

179. Bonewald, L. F. 2011. The amazing osteocyte. J Bone Miner Res. 26:229-238.

180. Tanaka-Kamioka, K., Kamioka, H., Ris, H., and Lim, S. S. 1998. Osteocyte shape is dependent on actin filaments and osteocyte processes are unique actin-rich projections. J Bone Miner Res. 13:1555-1568.

181. Tatsumi, S., Ishii, K., Amizuka, N., Li, M., Kobayashi, T., Kohno, K., Ito, M., Takeshita, S., and Ikeda, K. 2007. Targeted ablation of osteocytes induces osteoporosis with defective mechanotransduction. Cell Metab. 5:464-475.

182. Nakashima, T., Hayashi, M., Fukunaga, T., Kurata, K., Oh-Hora, M., Feng, J. Q., Bonewald, L. F., Kodama, T., Wutz, A., Wagner, E. F., Penninger, J. M., and Takayanagi, H. 2011. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nat Med. 17:1231-1234.

183. Rifas, L., Fausto, A., Scott, M. J., Avioli, L. V., and Welgus, H. G. 1994. Expression of metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human osteoblast-like cells: differentiation is associated with repression of metalloproteinase biosynthesis. Endocrinology. 134:213-221.

184. Mor, A., Abramson, S. B., and Pillinger, M. H. 2005. The fibroblast-like synovial cell in rheumatoid arthritis: a key player in inflammation and joint destruction. Clin Immunol. 115:118-128.

185. Heidinger, M., Kolb, H., Krell, H. W., Jochum, M., and Ries, C. 2006. Modulation of autocrine TNF-alpha-stimulated matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) expression by mitogen-activated protein kinases in THP-1 monocytic cells. Biol Chem. 387:69-78.


186. Chakrabarti, S., and Patel, K. D. 2005. Regulation of matrix metalloproteinase-9 release from IL-8-stimulated human neutrophils. J Leukoc Biol. 78:279-288.

187. Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., and Kudo, A. 2000. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. J Biol Chem. 275:4858-4864.

188. Kobayashi, K., Takahashi, N., Jimi, E., Udagawa, N., Takami, M., Kotake, S., Nakagawa, N., Kinosaki, M., Yamaguchi, K., Shima, N., Yasuda, H., Morinaga, T., Higashio, K., Martin, T. J., and Suda, T. 2000. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. J Exp Med. 191:275-286.

189. Kudo, O., Sabokbar, A., Pocock, A., Itonaga, I., Fujikawa, Y., and Athanasou, N. A. 2003. Interleukin-6 and interleukin-11 support human osteoclast formation by a RANKL-independent mechanism. Bone. 32:1-7.

190. Nakashima, T., Kobayashi, Y., Yamasaki, S., Kawakami, A., Eguchi, K., Sasaki, H., and Sakai, H. 2000. Protein expression and functional difference of membrane-bound and soluble receptor activator of NF-kappaB ligand: modulation of the expression by osteotropic factors and cytokines. Biochem Biophys Res Commun. 275:768-775.

191. Tomomatsu, N., Aoki, K., Alles, N., Soysa, N. S., Hussain, A., Nakachi, H., Kita, S., Shimokawa, H., Ohya, K., and Amagasa, T. 2009. LPS-induced inhibition of osteogenesis is TNF-alpha dependent in a murine tooth extraction model. J Bone Miner Res. 24:1770-1781.

192. Lacey, D. C., Simmons, P. J., Graves, S. E., and Hamilton, J. A. 2009. Proinflammatory cytokines inhibit osteogenic differentiation from stem cells: implications for bone repair during inflammation. Osteoarthritis Cartilage. 17:735-742.

193. Claro, T., Widaa, A., O'seaghdha, M., Miajlovic, H., Foster, T. J., O'brien, F. J., and Kerrigan, S. W. 2011. Staphylococcus aureus protein A binds to osteoblasts and triggers signals that weaken bone in osteomyelitis. PLoS One. 6:e18748.

194. Kadono, H., Kido, J., Kataoka, M., Yamauchi, N., and Nagata, T. 1999. Inhibition of osteoblastic cell differentiation by lipopolysaccharide extract from Porphyromonas gingivalis. Infect Immun. 67:2841-2846.

195. Doganay M, Aygen B. 2003. Human brucellosis: an overview. Int J Infect Dis. 7:173—182.

196. Mousa, A. R., Muhtaseb, S. A., Almudallal, D. S., Khodeir, S. M., and Marafie, A. A. 1987. Osteoarticular complications of brucellosis: a study of 169 cases. Rev Infect Dis. 9:531-543.

197. Tasova, Y., Saltoglu, N., Sahin, G., and Aksu, H. S. 1999. Osteoarthricular involvement of brucellosis in Turkey. Clin Rheumatol. 18:214-219.

198. Pourbagher, A., Pourbagher, M. A., Savas, L., Turunc, T., Demiroglu, Y. Z., Erol, I., and Yalcintas, D. 2006. Epidemiologic, clinical, and imaging findings in brucellosis patients with osteoarticular involvement. AJR Am J Roentgenol. 187:873-880.


199. Trujillo, I. Z., Zavala, A. N., Caceres, J. G., and Miranda, C. Q. 1994. Brucellosis. Infect Dis Clin North Am. 8:225-241.

200. Ariza, J., Pujol, M., Valverde, J., Nolla, J. M., Rufi, G., Viladrich, P. F., Corredoira, J. M., and Gudiol, F. 1993. Brucellar sacroiliitis: findings in 63 episodes and current relevance. Clin Infect Dis. 16:761-765.

201. Tekkok, I. H., Berker, M., Ozcan, O. E., Ozgen, T., and Akalin, E. 1993. Brucellosis of the spine. Neurosurgery. 33:838-844.

202. Solera, J., Lozano, E., Martinez-Alfaro, E., Espinosa, A., Castillejos, M. L., and Abad, L. 1999. Brucellar spondylitis: review of 35 cases and literature survey. Clin Infect Dis. 29:1440-1449.

203. Alarcon, G. S., Bocanegra, T. S., Gotuzzo, E., and Espinoza, L. R. 1987. The arthritis of brucellosis: a perspective one hundred years after Bruce's discovery. J Rheumatol. 14:1083-1085.

204. Johnson, E. W., Jr., and Weed, L. A. 1954. Brucellar bursitis. J Bone Joint Surg Am. 36-A:133-139.

205. Chelli Bouaziz, M., Ladeb, M. F., Chakroun, M., and Chaabane, S. 2008. Spinal brucellosis: a review. Skeletal Radiol. 37:785-790.

206. Geyik, M. F., Gur, A., Nas, K., Cevik, R., Sarac, J., Dikici, B., and Ayaz, C. 2002. Musculoskeletal involvement of brucellosis in different age groups: a study of 195 cases. Swiss Med Wkly. 132:98-105.

207. Kelly, P. J., Martin, W. J., Schirger, A., and Weed, L. A. 1960. Brucellosis of the bones and joints. Experience with thirty-six patients. Jama. 174:347-353.

208. Ibero, I., Vela, P., and Pascual, E. 1997. Arthritis of shoulder and spinal cord compression due to Brucella disc infection. Br J Rheumatol. 36:377-381.

209. Gotuzzo, E., Alarcon, G. S., Bocanegra, T. S., Carrillo, C., Guerra, J. C., Rolando, I., and Espinoza, L. R. 1982. Articular involvement in human brucellosis: a retrospective analysis of 304 cases. Semin Arthritis Rheum. 12:245-255.

210. Kasim, R. A., Araj, G. F., Afeiche, N. E., and Tabbarah, Z. A. 2004. Brucella infection in total hip replacement: case report and review of the literature. Scand J Infect Dis. 36:65-67.

211. Press, J., Peled, N., Buskila, D., and Yagupsky, P. 2002. Leukocyte count in the synovial fluid of children with culture-proven Brucellar arthritis. Clin Rheumatol. 21:191-193.

212. Glasgow, M. M. 1976. Brucellosis of the spine. Br J Surg. 63:283-288.

213. Ariza, J., Gudiol, F., Valverde, J., Pallares, R., Fernandez-Viladrich, P., Rufi, G., Espadaler, L., and Fernandez-Nogues, F. 1985. Brucellar spondylitis: a detailed analysis based on current findings. Rev Infect Dis. 7:656-664.

214. Corbel Mj, Alton Gg, Ariza J, Banai M, Cosivi O, Diaz R, Et Al. 2006. Brucellosis in humans and animals. World Health Organization.WHO/CDS/EPR/2006.7., Geneva.


215. Brinckerhoff, C. E., and Matrisian, L. M. 2002. Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince. Nat Rev Mol Cell Biol. 3:207-214.

216. Nagase, H., Visse, R., and Murphy, G. 2006. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovasc Res. 69:562-573.

217. Visse, R., and Nagase, H. 2003. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res. 92:827-839.

218. Peng, W. J., Yan, J. W., Wan, Y. N., Wang, B. X., Tao, J. H., Yang, G. J., Pan, H. F., and Wang, J. 2012. Matrix Metalloproteinases: A Review of Their Structure and Role in Systemic Sclerosis. J Clin Immunol.

219. Sbardella, D., Fasciglione, G. F., Gioia, M., Ciaccio, C., Tundo, G. R., Marini, S., and Coletta, M. 2012. Human matrix metalloproteinases: an ubiquitarian class of enzymes involved in several pathological processes. Mol Aspects Med. 33:119-208.

220. Okamoto, T., Akuta, T., Tamura, F., Van Der Vliet, A., and Akaike, T. 2004. Molecular mechanism for activation and regulation of matrix metalloproteinases during bacterial infections and respiratory inflammation. Biol Chem. 385:997-1006.

221. Shapiro, S. D. 1999. Diverse roles of macrophage matrix metalloproteinases in tissue destruction and tumor growth. Thromb Haemost. 82:846-849.

222. Brew, K., Dinakarpandian, D., and Nagase, H. 2000. Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochim Biophys Acta. 1477:267-283.

223. Gomez, D. E., Alonso, D. F., Yoshiji, H., and Thorgeirsson, U. P. 1997. Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions. Eur J Cell Biol. 74:111-122.

224. Rengel, Y., Ospelt, C., and Gay, S. 2007. Proteinases in the joint: clinical relevance of proteinases in joint destruction. Arthritis Res Ther. 9:221.

225. Vandooren, B., Kruithof, E., Yu, D. T., Rihl, M., Gu, J., De Rycke, L., Van Den Bosch, F., Veys, E. M., De Keyser, F., and Baeten, D. 2004. Involvement of matrix metalloproteinases and their inhibitors in peripheral synovitis and down-regulation by tumor necrosis factor alpha blockade in spondylarthropathy. Arthritis Rheum. 50:2942-2953.

226. Cawston, T. E., Mercer, E., De Silva, M., and Hazleman, B. L. 1984. Metalloproteinases and collagenase inhibitors in rheumatoid synovial fluid. Arthritis Rheum. 27:285-290.

227. Gravallese, E. M., Darling, J. M., Ladd, A. L., Katz, J. N., and Glimcher, L. H. 1991. In situ hybridization studies of stromelysin and collagenase messenger RNA expression in rheumatoid synovium. Arthritis Rheum. 34:1076-1084.

228. Behera, A. K., Hildebrand, E., Scagliotti, J., Steere, A. C., and Hu, L. T. 2005. Induction of host matrix metalloproteinases by Borrelia burgdorferi differs in human and murine lyme arthritis. Infect Immun. 73:126-134.


229. Soder, B., Airila Mansson, S., Soder, P. O., Kari, K., and Meurman, J. 2006. Levels of matrix metalloproteinases-8 and -9 with simultaneous presence of periodontal pathogens in gingival crevicular fluid as well as matrix metalloproteinase-9 and cholesterol in blood. J Periodontal Res. 41:411-417.

230. Gjertsson, I., Innocenti, M., Matrisian, L. M., and Tarkowski, A. 2005. Metalloproteinase-7 contributes to joint destruction in Staphylococcus aureus induced arthritis. Microb Pathog. 38:97-105.

231. Kohno, Y., Tanimoto, A., Cirathaworn, C., Shimajiri, S., Tawara, A., and Sasaguri, Y. 2004. GM-CSF activates RhoA, integrin and MMP expression in human monocytic cells. Pathol Int. 54:693-702.

232. Zwerdling, A., Delpino, M. V., Pasquevich, K. A., Barrionuevo, P., Cassataro, J., Garcia Samartino, C., and Giambartolomei, G. H. 2009. Brucella abortus activates human neutrophils. Microbes Infect. 11:689-697.

233. Barrionuevo, P., Cassataro, J., Delpino, M. V., Zwerdling, A., Pasquevich, K. A., Garcia Samartino, C., Wallach, J. C., Fossati, C. A., and Giambartolomei, G. H. 2008. Brucella abortus inhibits major histocompatibility complex class II expression and antigen processing through interleukin-6 secretion via Toll-like receptor 2. Infect Immun. 76:250-262.

234. Harris, S. A., Enger, R. J., Riggs, B. L., and Spelsberg, T. C. 1995. Development and characterization of a conditionally immortalized human fetal osteoblastic cell line. J Bone Miner Res. 10:178-186.

235. Mcnearney, T. A., Ma, Y., Chen, Y., Taglialatela, G., Yin, H., Zhang, W. R., and Westlund, K. N. 2010. A peripheral neuroimmune link: glutamate agonists upregulate NMDA NR1 receptor mRNA and protein, vimentin, TNF-alpha, and RANTES in cultured human synoviocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298:R584-598.

236. Varani, K., De Mattei, M., Vincenzi, F., Tosi, A., Targa, M., Masieri, F. F., Pellati, A., Massari, L., and Borea, P. A. 2010. P2X(1) and P2X(3) purinergic receptors differentially modulate the inflammatory response in human osteoarthritic synovial fibroblasts. Cell Physiol Biochem. 25:325-336.

237. Suzuki, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Shiina, M., and Mihara, M. 2010. IL-6 and IL-1 synergistically enhanced the production of MMPs from synovial cells by up-regulating IL-6 production and IL-1 receptor I expression. Cytokine. 51:178-183.

238. Yamazaki, T., Yokoyama, T., Akatsu, H., Tukiyama, T., and Tokiwa, T. 2003. Phenotypic characterization of a human synovial sarcoma cell line, SW982, and its response to dexamethasone. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39:337-339.

239. Hibbs, M. S., Hasty, K. A., Seyer, J. M., Kang, A. H., and Mainardi, C. L. 1985. Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human neutrophil gelatinase. J Biol Chem. 260:2493-2500.

240. Radolf, J. D., Chamberlain, N. R., Clausell, A., and Norgard, M. V. 1988. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent triton X-114. Infect Immun. 56:490-498.


241. Velasco, J., Bengoechea, J. A., Brandenburg, K., Lindner, B., Seydel, U., Gonzalez, D., Zahringer, U., Moreno, E., and Moriyon, I. 2000. Brucella abortus and its closest phylogenetic relative, Ochrobactrum spp., differ in outer membrane permeability and cationic peptide resistance. Infect Immun. 68:3210-3218.

242. Lubberts, E., Joosten, L. A., Chabaud, M., Van Den Bersselaar, L., Oppers, B., Coenen-De Roo, C. J., Richards, C. D., Miossec, P., and Van Den Berg, W. B. 2000. IL-4 gene therapy for collagen arthritis suppresses synovial IL-17 and osteoprotegerin ligand and prevents bone erosion. J Clin Invest. 105:1697-1710.

243. Harris, J. E., Fernandez-Vilaseca, M., Elkington, P. T., Horncastle, D. E., Graeber, M. B., and Friedland, J. S. 2007. IFNgamma synergizes with IL-1beta to up-regulate MMP-9 secretion in a cellular model of central nervous system tuberculosis. Faseb J. 21:356-365.

244. Krubasik, D., Eisenach, P. A., Kunz-Schughart, L. A., Murphy, G., and English, W. R. 2008. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor induces endothelial capillary formation through induction of membrane-type 1 matrix metalloproteinase expression in vitro. Int J Cancer. 122:1261-1272.

245. Arechavaleta-Velasco, F., Ogando, D., Parry, S., and Vadillo-Ortega, F. 2002. Production of matrix metalloproteinase-9 in lipopolysaccharide-stimulated human amnion occurs through an autocrine and paracrine proinflammatory cytokine-dependent system. Biol Reprod. 67:1952-1958.

246. Saren, P., Welgus, H. G., and Kovanen, P. T. 1996. TNF-alpha and IL-1beta selectively induce expression of 92-kDa gelatinase by human macrophages. J Immunol. 157:4159-4165.

247. Zhang, Y., Mccluskey, K., Fujii, K., and Wahl, L. M. 1998. Differential regulation of monocyte matrix metalloproteinase and TIMP-1 production by TNF-alpha, granulocyte-macrophage CSF, and IL-1 beta through prostaglandin-dependent and -independent mechanisms. J Immunol. 161:3071-3076.

248. Lee, C. W., Lin, C. C., Lin, W. N., Liang, K. C., Luo, S. F., Wu, C. B., Wang, S. W., and Yang, C. M. 2007. TNF-alpha induces MMP-9 expression via activation of Src/EGFR, PDGFR/PI3K/Akt cascade and promotion of NF-kappaB/p300 binding in human tracheal smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292:L799-812.

249. Migita, K., Eguchi, K., Kawabe, Y., Ichinose, Y., Tsukada, T., Aoyagi, T., Nakamura, H., and Nagataki, S. 1996. TNF-alpha-mediated expression of membrane-type matrix metalloproteinase in rheumatoid synovial fibroblasts. Immunology. 89:553-557.

250. Wang, Y., Yang, L., Zhang, J., Xue, R., Tang, Z., Huang, W., Jiang, D., Tang, X., Chen, P., and Sung, K. L. 2010. Differential MMP-2 activity induced by mechanical compression and inflammatory factors in human synoviocytes. Mol Cell Biomech. 7:105-114.

251. Dasu, M. R., Barrow, R. E., Spies, M., and Herndon, D. N. 2003. Matrix metalloproteinase expression in cytokine stimulated human dermal fibroblasts. Burns. 29:527-531.


252. Sundararaj, K. P., Samuvel, D. J., Li, Y., Sanders, J. J., Lopes-Virella, M. F., and Huang, Y. 2009. Interleukin-6 released from fibroblasts is essential for up-regulation of matrix metalloproteinase-1 expression by U937 macrophages in coculture: cross-talking between fibroblasts and U937 macrophages exposed to high glucose. J Biol Chem. 284:13714-13724.

253. Wright, K. M., and Friedland, J. S. 2004. Regulation of monocyte chemokine and MMP-9 secretion by proinflammatory cytokines in tuberculous osteomyelitis. J Leukoc Biol. 75:1086-1092.

254. Ferrero, M. C., Bregante, J., Delpino, M. V., Barrionuevo, P., Fossati, C. A., Giambartolomei, G. H., and Baldi, P. C. 2011. Proinflammatory response of human endothelial cells to Brucella infection. Microbes Infect. 13:852-861.

255. Burrage, P. S., Mix, K. S., and Brinckerhoff, C. E. 2006. Matrix metalloproteinases: role in arthritis. Front Biosci. 11:529-543.

256. Meikle, M. C., Bord, S., Hembry, R. M., Compston, J., Croucher, P. I., and Reynolds, J. J. 1992. Human osteoblasts in culture synthesize collagenase and other matrix metalloproteinases in response to osteotropic hormones and cytokines. J Cell Sci. 103 ( Pt 4):1093-1099.

257. Rifas, L., Halstead, L. R., Peck, W. A., Avioli, L. V., and Welgus, H. G. 1989. Human osteoblasts in vitro secrete tissue inhibitor of metalloproteinases and gelatinase but not interstitial collagenase as major cellular products. J Clin Invest. 84:686-694.

258. Madkour, M. M. 2001. Osteoarticular brucellosis. In: Madkour´s brucellosis, M. M. Madkour (ed.). Springer-Verlag. p. 74-84. Berlin, Alemania.

259. Burrage, P. S., and Brinckerhoff, C. E. 2007. Molecular targets in osteoarthritis: metalloproteinases and their inhibitors. Curr Drug Targets. 8:293-303.

260. Martel-Pelletier, J., Welsch, D. J., and Pelletier, J. P. 2001. Metalloproteases and inhibitors in arthritic diseases. Best Pract Res Clin Rheumatol. 15:805-829.

261. Alsalameh, S., Amin, R. J., Kunisch, E., Jasin, H. E., and Kinne, R. W. 2003. Preferential induction of prodestructive matrix metalloproteinase-1 and proinflammatory interleukin 6 and prostaglandin E2 in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts via tumor necrosis factor receptor-55. J Rheumatol. 30:1680-1690.

262. Nagase, H., and Brew, K. 2003. Designing TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinases) variants that are selective metalloproteinase inhibitors. Biochem Soc Symp.201-212.

263. Panagakos, F. S., and Kumar, S. 1994. Modulation of proteases and their inhibitors in immortal human osteoblast-like cells by tumor necrosis factor-alpha in vitro. Inflammation. 18:243-265.

264. Uchida, M., Shima, M., Shimoaka, T., Fujieda, A., Obara, K., Suzuki, H., Nagai, Y., Ikeda, T., Yamato, H., and Kawaguchi, H. 2000. Regulation of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) by bone resorptive factors in osteoblastic cells. J Cell Physiol. 185:207-214.


265. Gowen, M., Wood, D. D., Ihrie, E. J., Meats, J. E., and Russell, R. G. 1984. Stimulation by human interleukin 1 of cartilage breakdown and production of collagenase and proteoglycanase by human chondrocytes but not by human osteoblasts in vitro. Biochim Biophys Acta. 797:186-193.

266. Fuchs, S., Skwara, A., Bloch, M., and Dankbar, B. 2004. Differential induction and regulation of matrix metalloproteinases in osteoarthritic tissue and fluid synovial fibroblasts. Osteoarthritis Cartilage. 12:409-418.

267. Zhao, Y. X., Ljungdahl, A., Olsson, T., and Tarkowski, A. 1996. In situ hybridization analysis of synovial and systemic cytokine messenger RNA expression in superantigen-mediated Staphylococcus aureus arthritis. Arthritis Rheum. 39:959-967.

268. Kevorkian, L., Young, D. A., Darrah, C., Donell, S. T., Shepstone, L., Porter, S., Brockbank, S. M., Edwards, D. R., Parker, A. E., and Clark, I. M. 2004. Expression profiling of metalloproteinases and their inhibitors in cartilage. Arthritis Rheum. 50:131-141.

269. Malemud, C. J., Islam, N., and Haqqi, T. M. 2003. Pathophysiological mechanisms in osteoarthritis lead to novel therapeutic strategies. Cells Tissues Organs. 174:34-48.

270. Seibl, R., Birchler, T., Loeliger, S., Hossle, J. P., Gay, R. E., Saurenmann, T., Michel, B. A., Seger, R. A., Gay, S., and Lauener, R. P. 2003. Expression and regulation of Toll-like receptor 2 in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 162:1221-1227.

271. Kanangat, S., Postlethwaite, A., Hasty, K., Kang, A., Smeltzer, M., Appling, W., and Schaberg, D. 2006. Induction of multiple matrix metalloproteinases in human dermal and synovial fibroblasts by Staphylococcus aureus: implications in the pathogenesis of septic arthritis and other soft tissue infections. Arthritis Res Ther. 8:R176.

272. Kyburz, D., Rethage, J., Seibl, R., Lauener, R., Gay, R. E., Carson, D. A., and Gay, S. 2003. Bacterial peptidoglycans but not CpG oligodeoxynucleotides activate synovial fibroblasts by toll-like receptor signaling. Arthritis Rheum. 48:642-650.

273. Gasper, N. A., Petty, C. C., Schrum, L. W., Marriott, I., and Bost, K. L. 2002. Bacterium-induced CXCL10 secretion by osteoblasts can be mediated in part through toll-like receptor 4. Infect Immun. 70:4075-4082.

274. Madrazo, D. R., Tranguch, S. L., and Marriott, I. 2003. Signaling via Toll-like receptor 5 can initiate inflammatory mediator production by murine osteoblasts. Infect Immun. 71:5418-5421.

275. Zou, W., Amcheslavsky, A., and Bar-Shavit, Z. 2003. CpG oligodeoxynucleotides modulate the osteoclastogenic activity of osteoblasts via Toll-like receptor 9. J Biol Chem. 278:16732-16740.

276. Crandall, H., Dunn, D. M., Ma, Y., Wooten, R. M., Zachary, J. F., Weis, J. H., Weiss, R. B., and Weis, J. J. 2006. Gene expression profiling reveals unique pathways associated with differential severity of lyme arthritis. J Immunol. 177:7930-7942.


277. Tissi, L., Puliti, M., Barluzzi, R., Orefici, G., Von Hunolstein, C., and Bistoni, F. 1999. Role of tumor necrosis factor alpha, interleukin-1beta, and interleukin-6 in a mouse model of group B streptococcal arthritis. Infect Immun. 67:4545-4550.

278. Drake, F. H., Dodds, R. A., James, I. E., Connor, J. R., Debouck, C., Richardson, S., Lee-Rykaczewski, E., Coleman, L., Rieman, D., Barthlow, R., Hastings, G., and Gowen, M. 1996. Cathepsin K, but not cathepsins B, L, or S, is abundantly expressed in human osteoclasts. J Biol Chem. 271:12511-12516.

279. Wucherpfennig, A. L., Li, Y. P., Stetler-Stevenson, W. G., Rosenberg, A. E., and Stashenko, P. 1994. Expression of 92 kD type IV collagenase/gelatinase B in human osteoclasts. J Bone Miner Res. 9:549-556.

280. Yeo, L., Toellner, K. M., Salmon, M., Filer, A., Buckley, C. D., Raza, K., and Scheel-Toellner, D. 2011. Cytokine mRNA profiling identifies B cells as a major source of RANKL in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 70:2022-2028.

281. Quinn, J. M., Elliott, J., Gillespie, M. T., and Martin, T. J. 1998. A combination of osteoclast differentiation factor and macrophage-colony stimulating factor is sufficient for both human and mouse osteoclast formation in vitro. Endocrinology. 139:4424-4427.

282. Haynes, D. R. 2004. Bone lysis and inflammation. Inflamm Res. 53:596-600.

283. Nair, S. P., Meghji, S., Wilson, M., Reddi, K., White, P., and Henderson, B. 1996. Bacterially induced bone destruction: mechanisms and misconceptions. Infect Immun. 64:2371-2380.

284. Adamopoulos, I. E., Sabokbar, A., Wordsworth, B. P., Carr, A., Ferguson, D. J., and Athanasou, N. A. 2006. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. J Pathol. 208:35-43.

285. Chu, C. Q., Field, M., Allard, S., Abney, E., Feldmann, M., and Maini, R. N. 1992. Detection of cytokines at the cartilage/pannus junction in patients with rheumatoid arthritis: implications for the role of cytokines in cartilage destruction and repair. Br J Rheumatol. 31:653-661.

286. Arko-Mensah, J., Julian, E., Singh, M., and Fernandez, C. 2007. TLR2 but not TLR4 signalling is critically involved in the inhibition of IFN-gamma-induced killing of mycobacteria by murine macrophages. Scand J Immunol. 65:148-157.

287. Pfeffer, K., Matsuyama, T., Kundig, T. M., Wakeham, A., Kishihara, K., Shahinian, A., Wiegmann, K., Ohashi, P. S., Kronke, M., and Mak, T. W. 1993. Mice deficient for the 55 kd tumor necrosis factor receptor are resistant to endotoxic shock, yet succumb to L. monocytogenes infection. Cell. 73:457-467.

288. Ukai, T., Yumoto, H., Gibson, F. C., 3rd, and Genco, C. A. 2008. Macrophage-elicited osteoclastogenesis in response to bacterial stimulation requires Toll-like receptor 2-dependent tumor necrosis factor-alpha production. Infect Immun. 76:812-819.

289. Zhuang, L., Jung, J. Y., Wang, E. W., Houlihan, P., Ramos, L., Pashia, M., and Chole, R. A. 2007. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide induces


osteoclastogenesis through a toll-like receptor 4 mediated pathway in vitro and in vivo. Laryngoscope. 117:841-847.

290. Kukita, T., Wada, N., Kukita, A., Kakimoto, T., Sandra, F., Toh, K., Nagata, K., Iijima, T., Horiuchi, M., Matsusaki, H., Hieshima, K., Yoshie, O., and Nomiyama, H. 2004. RANKL-induced DC-STAMP is essential for osteoclastogenesis. J Exp Med. 200:941-946.

291. Chang, E. J., Ha, J., Oerlemans, F., Lee, Y. J., Lee, S. W., Ryu, J., Kim, H. J., Lee, Y., Kim, H. M., Choi, J. Y., Kim, J. Y., Shin, C. S., Pak, Y. K., Tanaka, S., Wieringa, B., Lee, Z. H., and Kim, H. H. 2008. Brain-type creatine kinase has a crucial role in osteoclast-mediated bone resorption. Nat Med. 14:966-972.

292. Scheven, B. A., Visser, J. W., and Nijweide, P. J. 1986. In vitro osteoclast generation from different bone marrow fractions, including a highly enriched haematopoietic stem cell population. Nature. 321:79-81.

293. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., Mcmanus, L. M., and Mundy, G. R. 1984. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99:471-480.

294. Yago, T., Nanke, Y., Ichikawa, N., Kobashigawa, T., Mogi, M., Kamatani, N., and Kotake, S. 2009. IL-17 induces osteoclastogenesis from human monocytes alone in the absence of osteoblasts, which is potently inhibited by anti-TNF-alpha antibody: a novel mechanism of osteoclastogenesis by IL-17. J Cell Biochem. 108:947-955.

295. Kotake, S., Udagawa, N., Hakoda, M., Mogi, M., Yano, K., Tsuda, E., Takahashi, K., Furuya, T., Ishiyama, S., Kim, K. J., Saito, S., Nishikawa, T., Takahashi, N., Togari, A., Tomatsu, T., Suda, T., and Kamatani, N. 2001. Activated human T cells directly induce osteoclastogenesis from human monocytes: possible role of T cells in bone destruction in rheumatoid arthritis patients. Arthritis Rheum. 44:1003-1012.

296. Baker, P. J., Dixon, M., Evans, R. T., Dufour, L., Johnson, E., and Roopenian, D. C. 1999. CD4(+) T cells and the proinflammatory cytokines gamma interferon and interleukin-6 contribute to alveolar bone loss in mice. Infect Immun. 67:2804-2809.

297. Han, X., Kawai, T., Eastcott, J. W., and Taubman, M. A. 2006. Bacterial-responsive B lymphocytes induce periodontal bone resorption. J Immunol. 176:625-631.

298. Kozuka, Y., Ozaki, Y., Ukai, T., Kaneko, T., and Hara, Y. 2006. B cells play an important role in lipopolysaccharide-induced bone resorption. Calcif Tissue Int. 78:125-132.

299. Teng, Y. T., Nguyen, H., Gao, X., Kong, Y. Y., Gorczynski, R. M., Singh, B., Ellen, R. P., and Penninger, J. M. 2000. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. J Clin Invest. 106:R59-67.


300. Merkel, K. D., Erdmann, J. M., Mchugh, K. P., Abu-Amer, Y., Ross, F. P., and Teitelbaum, S. L. 1999. Tumor necrosis factor-alpha mediates orthopedic implant osteolysis. Am J Pathol. 154:203-210.

301. Kotake, S., Sato, K., Kim, K. J., Takahashi, N., Udagawa, N., Nakamura, I., Amaguchi, A., Ishimoto, T., Uda, T., and Ashiwazaki, S. 1996. Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors in the synovial fluids from rheumatoid arthritis patients are responsible for osteoclast-like cell formation. J Bone Miner Res American Society for Bone and Mineral Research. 11:88-95.

302. Kim, N., Kadono, Y., Takami, M., Lee, J., Lee, S. H., Okada, F., Kim, J. H., Kobayashi, T., Odgren, P. R., Nakano, H., Yeh, W. C., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., and Choi, Y. 2005. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. J Exp Med. 202:589-595.

303. Old, L. J. 1990. Tumor Necrosis Factor: Structure, Mechanism of Action, Role in Disease and Therapy, B. Bonavida, G. Granger ed. Karger, Basel.

304. Mundy, G. R., Roodman, G. D., Bonewald, L. F., Yoneda, T., and Sabatini, M. 1992. Effects of TNF and lymphotoxin on bone cells. Immunol Ser. 56:483-498.

305. Saxne, T., Palladino, M. A., Jr., Heinegard, D., Talal, N., and Wollheim, F. A. 1988. Detection of tumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum. Arthritis Rheum. 31:1041-1045.

306. Xu, J. W., Konttinen, Y. T., Lassus, J., Natah, S., Ceponis, A., Solovieva, S., Aspenberg, P., and Santavirta, S. 1996. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) in loosening of total hip replacement (THR). Clin Exp Rheumatol. 14:643-648.

307. Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., and Pacifici, R. 1994. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. J Clin Invest. 94:2397-2406.

308. Lerner, U. H., and Ohlin, A. 1993. Tumor necrosis factors alpha and beta can stimulate bone resorption in cultured mouse calvariae by a prostaglandin-independent mechanism. J Bone Miner Res. 8:147-155.

309. Thomson, B. M., Mundy, G. R., and Chambers, T. J. 1987. Tumor necrosis factors alpha and beta induce osteoblastic cells to stimulate osteoclastic bone resorption. J Immunol. 138:775-779.

310. Van Der Pluijm, G., Most, W., Van Der Wee-Pals, L., De Groot, H., Papapoulos, S., and Lowik, C. 1991. Two distinct effects of recombinant human tumor necrosis factor-alpha on osteoclast development and subsequent resorption of mineralized matrix. Endocrinology. 129:1596-1604.

311. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., and Teitelbaum, S. L. 1997. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. J Clin Invest. 100:1557-1565.

312. Murshed, M., Harmey, D., Millan, J. L., Mckee, M. D., and Karsenty, G. 2005. Unique coexpression in osteoblasts of broadly expressed genes accounts for


the spatial restriction of ECM mineralization to bone. Genes Dev. 19:1093-1104.

313. Yamate, T., Mocharla, H., Taguchi, Y., Igietseme, J. U., Manolagas, S. C., and Abe, E. 1997. Osteopontin expression by osteoclast and osteoblast progenitors in the murine bone marrow: demonstration of its requirement for osteoclastogenesis and its increase after ovariectomy. Endocrinology. 138:3047-3055.

314. Hauschka, P. V., Lian, J. B., Cole, D. E., and Gundberg, C. M. 1989. Osteocalcin and matrix Gla protein: vitamin K-dependent proteins in bone. Physiol Rev. 69:990-1047.

315. Wong, G. L., and Cohn, D. V. 1975. Target cells in bone for parathormone and calcitonin are different: enrichment for each cell type by sequential digestion of mouse calvaria and selective adhesion to polymeric surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 72:3167-3171.

316. Tullberg-Reinert, H., and Jundt, G. 1999. In situ measurement of collagen synthesis by human bone cells with a sirius red-based colorimetric microassay: effects of transforming growth factor beta2 and ascorbic acid 2-phosphate. Histochem Cell Biol. 112:271-276.

317. Zhang, W., Swearingen, E. B., Ju, J., Rigney, T., and Tribble, G. D. 2010. Porphyromonas gingivalis invades osteoblasts and inhibits bone formation. Microbes Infect. 12:838-845.

318. Walsh, N. C., Reinwald, S., Manning, C. A., Condon, K. W., Iwata, K., Burr, D. B., and Gravallese, E. M. 2009. Osteoblast function is compromised at sites of focal bone erosion in inflammatory arthritis. J Bone Miner Res. 24:1572-1585.

319. Hughes, D. E., and Boyce, B. F. 1997. Apoptosis in bone physiology and disease. Mol Pathol. 50:132-137.

320. Ning, R. D., Zhang, X. L., Li, Q. T., and Guo, X. K. 2011. The effect of Staphylococcus aureus on apoptosis of cultured human osteoblasts. Orthop Surg. 3:199-204.

321. Velasquez, L. N., Delpino, M. V., Ibanez, A. E., Coria, L. M., Miraglia, M. C., Scian, R., Cassataro, J., Giambartolomei, G. H., and Barrionuevo, P. 2012. Brucella abortus induces apoptosis of human T lymphocytes. Microbes Infect. 14:639-650.

322. Takayanagi, H. 2010. The unexpected link between osteoclasts and the immune system. Adv Exp Med Biol. 658:61-68.

323. Bellows, C. G., Aubin, J. E., and Heersche, J. N. 1991. Initiation and progression of mineralization of bone nodules formed in vitro: the role of alkaline phosphatase and organic phosphate. Bone Miner. 14:27-40.

324. Kim, C. H., Kang, B. S., Lee, T. K., Park, W. H., Kim, J. K., Park, Y. G., Kim, H. M., and Lee, Y. C. 2002. IL-1beta regulates cellular proliferation, prostaglandin E2 synthesis, plasminogen activator activity, osteocalcin production, and bone resorptive activity of the mouse calvarial bone cells. Immunopharmacol Immunotoxicol. 24:395-407.


325. Buckwalter, J. A., and Cooper, R. R. 1987. Bone structure and function. Instr Course Lect. 36:27-48.

326. Lian, J. B., and Stein, G. S. 1995. Development of the osteoblast phenotype: molecular mechanisms mediating osteoblast growth and differentiation. Iowa Orthop J. 15:118-140.

327. Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., and Bilezikian, J. P. 2011. Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis. Nat Rev Rheumatol. 7:447-456.

328. Landis, W. J. 1995. The strength of a calcified tissue depends in part on the molecular structure and organization of its constituent mineral crystals in their organic matrix. Bone. 16:533-544.

329. Goto, H., Hozumi, A., Osaki, M., Fukushima, T., Sakamoto, K., Yonekura, A., Tomita, M., Furukawa, K., Shindo, H., and Baba, H. 2011. Primary human bone marrow adipocytes support TNF-alpha-induced osteoclast differentiation and function through RANKL expression. Cytokine. 56:662-668.

330. Redlich, K., Hayer, S., Maier, A., Dunstan, C. R., Tohidast-Akrad, M., Lang, S., Turk, B., Pietschmann, P., Woloszczuk, W., Haralambous, S., Kollias, G., Steiner, G., Smolen, J. S., and Schett, G. 2002. Tumor necrosis factor alpha-mediated joint destruction is inhibited by targeting osteoclasts with osteoprotegerin. Arthritis Rheum. 46:785-792.

331. Wu, L., Lin, J. H., Bao, K., Li, P. F., and Zhang, W. G. 2009. In vitro effects of erythromycin on RANKL and nuclear factor-kappa B by human TNF-alpha stimulated Jurkat cells. Int Immunopharmacol. 9:1105-1109.

332. Thammasitboon, K., Goldring, S. R., and Boch, J. A. 2006. Role of macrophages in LPS-induced osteoblast and PDL cell apoptosis. Bone. 38:845-852.

333. Chua, C. C., Chua, B. H., Chen, Z., Landy, C., and Hamdy, R. C. 2002. TGF-beta1 inhibits multiple caspases induced by TNF-alpha in murine osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochim Biophys Acta. 1593:1-8.

334. Chen, G., and Goeddel, D. V. 2002. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. Science. 296:1634-1635.

335. Li, W., Yu, B., Li, M., Sun, D., Hu, Y., Zhao, M., Cui, C. B., and Hou, S. 2010. NEMO-binding domain peptide promotes osteoblast differentiation impaired by tumor necrosis factor alpha. Biochem Biophys Res Commun. 391:1228-1233.

336. Colmenero, J. D., Ruiz-Mesa, J. D., Plata, A., Bermudez, P., Martin-Rico, P., Queipo-Ortuno, M. I., and Reguera, J. M. 2008. Clinical findings, therapeutic approach, and outcome of Brucellar vertebral osteomyelitis. Clin Infect Dis. 46:426-433.

337. Kunes, P., Krejsek, J., Brtko, M., Mandak, J., Kolackova, M., Trojackova Kudlova, M., and Andrys, C. 2009. Neutrophil apoptosis by Fas/FasL: harmful or advantageous in cardiac surgery? Thorac Cardiovasc Surg. 57:1-6.


338. Yamashita, N., Tajima, M., Nakano, J., Arioka, H., Arai, H., Miyasaka, T., Kubota, S., Kawashima, R., and Ohta, K. 2000. Induction of apoptosis in bronchial eosinophils: beneficial or harmful? Int Arch Allergy Immunol. 122 Suppl 1:40-43.

339. Fernandez-Prada, C. M., Zelazowska, E. B., Nikolich, M., Hadfield, T. L., Roop, R. M., 2nd, Robertson, G. L., and Hoover, D. L. 2003. Interactions between Brucella melitensis and human phagocytes: bacterial surface O-Polysaccharide inhibits phagocytosis, bacterial killing, and subsequent host cell apoptosis. Infect Immun. 71:2110-2119.

340. Celli, J. 2006. Surviving inside a macrophage: the many ways of Brucella. Res Microbiol. 157:93-98.

341. Hill, P. A. 1998. Bone remodelling. Br J Orthod. 25:101-107.

342. Somayaji, S. N., Ritchie, S., Sahraei, M., Marriott, I., and Hudson, M. C. 2008. Staphylococcus aureus induces expression of receptor activator of NF-kappaB ligand and prostaglandin E2 in infected murine osteoblasts. Infect Immun. 76:5120-5126.

343. Tang, Y., Sun, F., Li, X., Zhou, Y., Yin, S., and Zhou, X. 2011. Porphyromonas endodontalis lipopolysaccharides induce RANKL by mouse osteoblast in a way different from that of Escherichia coli lipopolysaccharide. J Endod. 37:1653-1658.

344. Aydin, M., Fuat Yapar, A., Savas, L., Reyhan, M., Pourbagher, A., Turunc, T. Y., Ziya Demiroglu, Y., Yologlu, N. A., and Aktas, A. 2005. Scintigraphic findings in osteoarticular brucellosis. Nucl Med Commun. 26:639-647.

345. Rajapakse, C. N. 1995. Bacterial infections: osteoarticular brucellosis. Baillieres Clin Rheumatol. 9:161-177.

346. Young, Ej. 1989. Clinical manifestations of human brucellosis. In: Brucellosis: clinical and laboratory aspects, C. M. Young EJ. (ed.). CRC Press, Boca Raton, FL.

347. Kerwin, S. C., Lewis, D. D., Hribernik, T. N., Partington, B., Hosgood, G., and Eilts, B. E. 1992. Diskospondylitis associated with Brucella canis infection in dogs: 14 cases (1980-1991). J Am Vet Med Assoc. 201:1253-1257.

348. Smeak, D. D., Olmstead, M. L., and Hohn, R. B. 1987. Brucella canis osteomyelitis in two dogs with total hip replacements. J Am Vet Med Assoc. 191:986-990.

349. Lyons E, Magnani D, Forde Toni S, Splitter G, Adarichev Vyacheslav A. 2011. Brucellosis-induced murine arthritis and spondylolisthesis. Arthritis Rheum. 63(Suppl 10):2096.

350. Coventry, M. B., Ivins, J. C., and Et Al. 1949. Infection of the hip by Brucella suis. J Am Med Assoc. 141:320-325.

351. Khateeb, M. I., Araj, G. F., Majeed, S. A., and Lulu, A. R. 1990. Brucella arthritis: a study of 96 cases in Kuwait. Ann Rheum Dis. 49:994-998.

352. Seal, P. V., and Morris, C. A. 1974. Brucellosis of the carpus. Report of a case. J Bone Joint Surg Br. 56:327-330.


353. Wei, S., Kitaura, H., Zhou, P., Ross, F. P., and Teitelbaum, S. L. 2005. IL-1 mediates TNF-induced osteoclastogenesis. J Clin Invest. 115:282-290.

scian, romina mecanismos inmunológicos implicados en la

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