7/29/2019 Saliva Inhibits

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1988, 56(8):2125.Infect. Immun.

K Saito, C Kato and H Teshigawara

polymorphonuclear leukocytes.Staphylococcus epidermidis byresponse, phagocytosis, and killing ofSaliva inhibits the chemiluminescence

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I N F E C T I O N AND I M M U N I T Y , A u g . 1 9 8 8 , p . 2 1 2 5 - 2 1 3 20 0 1 9 - 9 5 6 7 / 8 8 / 0 8 2 1 2 5 - 0 8 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C ) 1 9 8 8 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

S a l i v a I n h i b i t s t h e C h e m i l u m i n e s c e n c e R e s p o n s e , P h a g o c y t o s i s , a n dK i l l i n g o f S t a p h y l o c o c c u s e p i d e r m i d i s b yP o l y m o r p h o n u c l e a r L e u k o c y t e sKAZUKO SAITO,* CHIHOMI KATO, AND HIDESABURO TESHIGAWARA

D e p a r t m e n t o f O r a l M i c r o b i o l o g y , N i p p o n D e n t a l U n i v e r s i t y , N i i g a t a , 1 - 8 H a m a u r a c h o , N i i g a t a 9 5 1 , J a p a nR e c e i v e d 1 5 D e c e m b e r 1 9 8 7 / A c c e p t e d 1 4 A p r i l 1 9 8 8

S a l i v a i n h i b i t e d s e v e r a l f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s ( P M N s ) f r o m m u r i n ep e r i t o n e a l e x u d a t e , n a m e l y , l u m i n o l - m e d i a t e d c h e m i l u m i n e sc e n c e ( C L ) i n d u c e d b y e i t h e r S t a p h y l o c o c c u se p i d e r m i d i s or f o r m y l m e t h i o n y l - l e u c y l - p h e n y l a l a n i n e ( F M L P ) , p h a g o c y t o s i s , a n d k i l l i n g o f b a c t e r i a i n v i t r o .T h e c o n c e n t r a t i o n o f s a l i v a i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e t h a t c a u s e d a c o m p l e t e i n h i b i t i o n o f t h e CL response o fPMNs t o b o t h S . e p i d e r m i d i s a n d FMLP was 2 5 % . H o w e v e r , t h e r e was n o c a t a l a s e or s u p e r o x i d e d i s m u t a s ea c t i v i t y i n s a l i v a t h a t c o u l d i n f l u e n c e t h e CL response o f PMNs. T h e p r o d u c t i o n o f s u p e r o x i d e b y PMNss t i m u l a t e d w i t h S . e p i d e r m i d i s was a s s a y e d i n t h e presence or a b s e n c e o f s a l i v a b y i n h i b i t i o n o f t h e r e d u c t i o no f c y t o c h r o m e c b y s u p e r o x i d e d i s m u t a s e . I n t h e presence o f 50% s a l i v a , 0 2 g e n e r a t i o n b y PMNs wa s o n l y7 . 3 % o f t h a t o b s e r v e d i n t h e a b s e n c e o f s a l i v a . A f t e r g e l f i l t r a t i o n o f s a l i v a r y m a t e r i a l t h r o u g h S e p h a d e x G - 2 5or S e p h a c r y l S - 2 0 0 , s e v e r a l f r a c t i o n s were o b t a i n e d t h a t i n h i b i t e d t h e CL response o f PMNs t o e i t h e r FMLPor S . e p i d e r m i d i s or t o b o t h . Two i n h i b i t o r y f r a c t i o n s were a n a l y z e d . One c o n t a i n e d i m m u n o g l o b u l i n A , a n dt h e o t h e r c o n t a i n e d a p e p t i d e w h i c h wa s c o m p o s e d o f 1 4 d i f f e r e n t a m i n o a c i d s . The t w o f r a c t i o n s o f h i g hm o l e c u l a r w e i g h t i n c l u d e d i n t h e f i r s t p r o t e i n p e a k o f S e p h a c r y l S - 2 0 0 g e l f i l t r a t i o n were a b l e t o i n h i b i t t h e CLresponse t o S . e p i d e r m i d i s a n d t o i n h i b i t p h a g o c y t i c a c t i v i t y , w h i l e f r a c t i o n s o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t ( u n d e r1 2 , 5 0 0 M r ) i n h i b i t e d t h e CL response t o FMLP a n d t o S . e p i d e r m i d i s b u t d i d n o t i n h i b i t p h a g o c y t i c a c t i v i t y .

An a p p r e c i a b l y l a r g e n u m b e r o f l e u k o c y t e s t h a t o r i g i n a t ef r o m t h e b l o o d m i g r a t e i n t o t h e o r a l c a v i t y , t h r o u g h t h ee p i t h e l i a l j u n c t i o n , t o t h e g i n g i v a l c r e v i c e ( 1 0 , 1 6 , 1 7 , 3 1 ) . Ad i f f e r e n t i a l c o u n t h a s e s t a b l i s h e d t h a t 9 8 t o 99% o f s a l i v a r yc e l l u l a r components ar e p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s( P M N s ) ( 9 , 1 0 , 1 5 ) . T h e s e c e l l s may e x e r t a c o n t r o l l i n gi n f l u e n c e on t h e o r a l m i c r o b i a l f l o r a b y p h a g o c y t o s i s , r e l e a s eo f l y s o s o m a l e n z y m e , a n d e m i s s i o n o f s u p e r o x i d e ( 9 , 1 3 , 1 8 ,2 3 , 2 7 - 3 0 ) . I t h a s b e e n s h o w n t h a t s a l i v a r y PMNs h a v ed e f e c t s i n t h e i r p h a g o c y t i c a n d b a c t e r i c i d a l a c t i v i t i e s a n dt h a t t h e a n t i b o d y - d e p e n d e n t c e l l - m e d i a t e d c y t o t o x i c i t y o ft h e s e PMNs i s l o w e r t h a n t h a t i n t h e PMNs o f p e r i p h e r a lb l o o d ( 1 8 , 2 1 ) .T h e a c c u m u l a t i o n o f PMNs i n t h e g i n g i v a l c r e v i c e i sc o n s i d e r e d t o h a v e n o t o n l y a p r o t e c t i v e b u t a l s o a d e l e t e r i -ous e f f e c t on t h e h o s t t i s s u e . S a l i v a a n d c r e v i c u l a r f l u i d ar et h e most i m p o r t a n t f a c t o r s i n f l u e n c i n g t h e o r a l m i l i e u .T h e b a c t e r i c i d a l a c t i v i t i e s o f PMNs c an b e d i v i d e d i n t oo x y g e n - d e p e n d e n t a n d o x y g e n - i n d e p e n d e n t s y s t e m s ( 2 2 ) .A c t i v e l y p h a g o c y t i z i n g PMNs a n d m a c r o p h a g e s e m i t l i g h t asa r e s u l t o f c h e m i l u m i n e s c e n c e ( C L ) , w h i c h i s l i n k e d t o t h eo x i d a t i v e a c t i v i t y o f t h e c e l l s ( 8 ) . T h e l u m i n o l - m e d i a t e d CLresponse d e p e n d s on t h e p r o d u c t i o n a n d r e l e a s e o f HOClr a d i c a l s r a t h e r t h a n on t h e r e l e a s e o f s u p e r o x i d e , w h i c h i s ap a r t o f t h e b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y o f PMNs ( 5 , 1 9 ) . T h emeasurement o f l u m i n o l - m e d i a t e d CL h a s b e e n u s e d as ah e l p f u l t o o l f o r t h e assessment i n v i t r o o f i n t r a c e l l u l a r k i l l i n ga n d t h e o p s o n o p h a g o c y t i c f u n c t i o n o f PMNs.T h e p r e s e n t s t u d y d e a l t w i t h t h e e f f e c t s o f s a l i v a a n d o ff r a c t i o n s o f s a l i v a o b t a i n e d b y g e l f i l t r a t i o n on t h e CLresponse t o e i t h e r S t a p h y l o c o c c u s e p i d e r m i d i s or f o r m y l m e -t h i o n y l - l e u c y l - p h e n y l a l a n i n e ( F M L P ) . I m m u n o g l o b u l i n A( I g A ) a n d a p e p t i d e o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t were f o u n d t o b e

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

i n h i b i t o r y components i n s e v e r a l o f t h e a c t i v e f r a c t i o n s o fs a l i v a .MATERIALS AND METHODS

S a l i v a . U n s t i m u l a t e d w h o l e s a l i v a a n d p a r o t i d s a l i v a sam-p l e s were c o l l e c t e d i n d i v i d u a l l y f r o m a d u l t s w i t h o u t r e g a r dt o sex. P a r o t i d s a l i v a was o b t a i n e d b y c a n n u l a t i o n o f t h ep a r o t i d d u c t . T h e s a l i v a was s t o r e d a t - 2 0 T C u n t i l u s e d . T h ei n s o l u b l e s u b s t a n c e p r o d u c e d upon t h a w i n g was r e m o v e d b yc e n t r i f u g a t i o n a t 8 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n , a n d t h e s u p e r n a t a n twas s t e r i l i z e d t h r o u g h a f i l t e r ( 0 . 4 5 - , u m pore s i z e ; M i l l i p o r eC o r p . , B e d f o r d , M a s s . ) .B a c t e r i a l s t r a i n a n d p r e p a r a t i o n . S . e p i d e r m i d i s 1 o f c l i n -i c a l o r i g i n was u s e d . T h e b a c t e r i a were i n o c u l a t e d i n t o b r a i nh e a r t i n f u s i o n b r o t h ( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ) a n dc u l t u r e d a t 3 7 C f o r 1 8 t o 2 0 h . The b a c t e r i a were t h e nc o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 8 , 0 0 0 x g f o r 5 m i n a n d w a s h e dt w i c e w i t h Hanks b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n s u p p l e m e n t e d w i t h0 . 1 % g e l a t i n (GHBSS) b e f o r e r e s u s p e n s i o n i n GHBSS. T h eb a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n was a d j u s t e d t o a t u r b i d i t y o f 0 . 3 ( 4x 1 0 7 c e l l s per m l ) a t 5 4 0 nm on a S p e c t r o n i c 2 0 s p e c t r o -p h o t o m e t e r ( S h i m a z u , K y o t o , J a p a n ) .P r e p a r a t i o n o f PMNs. M a l e m i c e , 7 t o 9 w e e k s o l d ( S h i -z u o k a L a b o r a t o r y A n i m a l C e n t e r C o . , L t d . , H a m a m a t s u ,J a p a n ) , were u s e d . A 2 - m l p o r t i o n o f 0 . 2 % s o d i u m c a s e i n a t ewas i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y . T h r e e h o u r s a f t e r i n j e c t i o n ,t h e PMNs were o b t a i n e d b y w a s h i n g t h e p er i t o n ea l c a v i t yw i t h 6 m l o f H a n k s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n (HBSS) t h a tc o n t a i n e d 5 U o f h e p a r i n ( N a k a r a i K a g a k u C o . , K y o t o ,J a p a n ) per m l . Th e PMNs were w a s h e d t w i c e w i t h G H B S Sa n d a d j u s t e d t o 2 x 1 0 7 c e l l s p e r m l w i t h GHBSS. D i f f e r e n -t i a l c e l l c o u n t s s h o w e d t h a t more t h a n 85% o f t h e t o t a l c e l l si n s u c h p r e p a r a t i o n s were PMNs. T h i s e n r i c h e d p r e p a r a t i o nwas u s e d as PMNs i n a l l s u b s e q u e n t experiments.Human PMNs were s e p a r a t e d f r o m t h e p e r i p h e r a l b l o o d

2 1 2 5

V o l . 5 6 , N o . 8

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2 1 2 6 SAITO ET A L .b y a m o n o - p o l y r e s o l v i n g medium ( F l o w L a b o r a t o r i e s , I n c . ,T o k y o , J a p a n ) . F r e s h h e p a r i n i z e d human w h o l e b l o o d ( 3 . 5m l ) l a y e r e d o n t o 3 m l o f m o n o - p o l y r e s o l v i n g m e d i u m w a sp l a c e d i n a s t e r i l e c e n t r i f u g e t u b e . T h e t u b e w a s c e n t r i f u g e da t 3 0 0 x g f o r 3 0 m i n i n a s w i n g i n g b u c k e t r o t o r a t r o o mt e m p e r a t u r e . T h e s e c o n d l a y e r o f c e l l s ( P M N s ) w a s t r a n s -f e r r e d t o a n o t h e r c e n t r i f u g e t u b e a n d w a s h e d t w i c e w i t hHBSS, a n d t h e c e l l s w e r e a d j u s t e d t o 1 0 7 c e l l s p e r m l w i t hGHBSS.S t i m u l a t i o n o f PMNs. An S . e p i d e r m i d i s s u s p e n s i o n ( t u r -b i d i t y , 0 . 3 ) a n d FMLP (LABO S c i e n c e C o . , T o k y o , J a p a n )a t a c o n c e n t r a t i o n o f 3 x 1 0 - 6 M w e r e u s e d t o s t i m u l a t e CLo f PMNs.M e a s u r e m e n t o f C L . A s o l u t i o n o f l u m i n o l ( 1 0 - 3 M )( L u m i l i g h t ) w a s p u r c h a s e d f r o m A n a l y t i c a l L u m i n e s c e n c eL a b o r a t o r y I n c . ( S a n D i e g o , C a l i f . ) . T h e s o l u t i o n w a s d i -l u t e d f i v e f o l d w i t h G H B S S i m m e d i a t e l y b e f o r e u s e . T h ea s s a y w a s p e r f o r m e d i n a t o t a l v o l u m e o f 6 5 0 R I . T h er e a c t i o n m i x t u r e f o r m e a s u r e m e n t o f t h e CL r e s p o n s e c o n -s i s t e d o f 1 0 0 , u l o f t h e e n r i c h e d s u s p e n s i o n o f PMNs, 3 0 0 p u lo f GHBSS, 5 0 , u l o f 1 0 - f o l d - d i l u t e d g u i n e a p i g s e r u m ( l y o p h -i l i z e d c o m p l e m e n t ; D e n k a S e i k e n C o . , L t d . , T o k y o , J a p a n ) ,a n d 1 0 0 , u 1 o f f i v e f o l d - d i l u t e d l u m i n o l s o l u t i o n . T h e c o m p l e -m e n t w a s o m i t t e d w h e n FMLP w a s u s e d a s t h e s t i m u l a t o r o fC L . T o o b s e r v e t h e e f f e c t o f s a l i v a o n t h e CL r e s p o n s e o fPMNs, we r e p l a c e d t h e f i r s t t w o c o m p o n e n t s o f t h e r e a c t i o nm i x t u r e ( t o t a l , 4 0 0 , u l ) w i t h a s u s p e n s i o n o f PMNs t h a tc o n t a i n e d v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f s a l i v a . T h e c u v e t t e f i l l e dw i t h r e a c t i o n m i x t u r e w a s t h en p l a c ed i n s i d e t h e d e t e c t o rc h a m b e r o f a L u m i p h o t o m e t e r TD 4 0 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r(LABO S c i e n c e C o . ) m a i n t a i n e d a t 3 7 C . A f t e r t h e r e a d i n g ss t a b i l i z e d ( a b o u t 5 m i n ) , e i t h e r 1 0 0 p u l o f a s u s p e n s i o n o fb a c t e r i a l c e l l s ( c o r r e s p o n d i n g t o 4 x 1 0 6 S . e p i d e r m i d i s c e l l s )o r FMLP i n s o l u t i o n ( 3 x 1 0 - ' M ) w a s i n j e c t e d t h r o u g h ar u b b e r s e p t u m i n t o t h e c u v e t t e . T h e i n t e n s i t y o f l i g h t e m i t t e di n t h e c u v e t t e w a s r e c o r d e d a u t o m a t i c a l l y .T r e a t m e n t o f PMNs w i t h s a l i v a . T h e e f f e c t o f s a l i v a o n t h eCL r e s p o n s e o f PMNs w a s m e a s u r e d w i t h a n d w i t h o u tp r e i n c u b a t i o n . T h e c o n c e n t r a t i o n o f s a l i v a r e f e r r e d t o a sp e r c e n t i n t h e r e s u l t s r e f e r s t o t h e c o n c e n t r a t i o n i n t h es u s p e n s i o n o f c e l l s t h a t was p u t i n t o t h e c u v e t t e .E s t i m a t i o n o f p h a g o c y t i c a n d b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y o f PMNs.A f t e r s t i m u l a t i o n b y t h e a d d i t i o n o f b a c t e r i a , t h e s t a n d a r dr e a c t i o n m i x t u r e i n t h e c u v e t t e u s e d t o a s s a y t h e CL r e a c t i o nw a s m o d i f i e d t o t i t r a t e t h e p h a g o c y t i c a n d b a c t e r i c i d a le f f e c t s o f PMNs a t a p p r o p r i a t e t i m e i n t e r v a l s . A p o r t i o n o ft h e s a m p l e i n t h e c u v e t t e w a s a d d e d t o 9 v o l u m e s o fs t e r i l i z e d d i s t i l l e d w a t e r i n a t e s t t u b e , a n d t h e n u m b e r o fb a c t e r i a w a s e s t i m a t e d b y p l a t e c o u n t a f t e r a p p r o p r i a t ed i l u t i o n s . T h e s u r v i v o r s a r e g i v e n a s t h e r a t i o , i n p e r c e n t , o ft h e n u m b e r o f CFU a t t h e t i m e o f s a m p l i n g t o t h e n u m b e r o fCFU a t t h e s t a r t o f t h e e x p e r i m e n t . A n o t h e r p o r t i o n o f t h es a m p l e was p l a c e d o n a g l a s s m i c r o s c o p e s l i d e , a i r d r i e d , a n ds t a i n e d w i t h Gram s o l u t i o n a f t e r f i x a t i o n w i t h m e t h a n o l . T h ep h a g o c y t i c i n d e x i s g i v e n a s t h e r a t i o , i n p e r c e n t , o f t h en u m b e r o f PMNs t h a t p h a g o c y t i z e d b a c t e r i a t o t h e n u m b e ro f PMNs c o u n t e d . T h e t o t a l n u m b e r o f b a c t e r i a i n 1 0 0 PMNsw a s c o u n t e d i n t h e s a m e s p e c i m e n u n d e r a m i c r o s c o p e . D a t aa r e p r e s e n t e d a s t h e a v e r a g e o f r e s u l t s f r o m more t h a n 3 0 0c e l l s o b s e r v e d i n t h r e e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s .A s s a y o f p r o d u c t i o n o f s u p e r o x i d e a n i o n b y r e d u c t i o n o fc y t o c h r o m e c . P r o d u c t i o n o f s u p e r o x i d e a n i o n was m e a s u r e db y a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o f M a r k e t e t a l . ( 1 1 ) . A0 . 5 - m l s a m p l e o f t h e p r e p a r a t i o n o f PMNs ( 5 x 1 0 5 c e l l s ) wasp l a c e d i n e a c h o f t h r e e s e p a r a t e s i l i c o n i z e d t e s t t u b e s . I n on et e s t t u b e , t h e PMNs w e r e s u s p e n d e d i n s a l i v a , a n d i n t h e

o t h e r t w o , t h e PMNs were s u s p e n d e d i n GHBSS. A 1 0 - , u ls a m p l e o f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( S O D ) ( 3 m g / m l ) f r o mb o v i n e e r y t h r o c y t e s ( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . )was a d d e d t o o n e o f t h e t e s t t u b e s w h i c h c o n t a i n e d PMNs i nG H B S S , a n d t h e same v o l u m e o f G H B S S was a d d e d t o t h eo t h e r t u b e s . A f t e r i n c u b a t i o n a t 3 7 C f o r 2 m i n , 0 . 1 m l o f3 0 - m g / m l c y t o c h r o m e c ( t y p e I V ; S i g m a ) was a d d e d t o e a c ht e s t t u b e , f o l l o w e d d i r e c t l y b y 0 . 2 m l o f t h e s u s p e n s i o n o f S .e p i d e r m i d i s ( 4 x 1 0 7 c e l l s p e r m l ) p r e w a r m e d w i t h c o m p l e -m e n t . A f t e r i n c u b a t i o n a t 3 7 C f o r 1 5 m i n , t h e r e a c t i o n wass t o p p e d b y p l a c i n g t h e t u b e i n m e l t i n g i c e a n d t h e c e l l s werer e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 , 5 0 0 x g f o r 5 m i n a t 4 C .F i n a l l y , r e d u ct i o n o f c y t o c h r o m e c was m e a s u r e d i n as p e c t r o p h o t o m e t e r a t 5 5 0 n m , w i t h t h e d i s m u t a s e - f r e e s u p e r -n a t a n t a s t h e s a m p l e a n d t h e d i s m u t a s e - c o n t a i n i n g s u p e r n a -t a n t a s t h e r e f e r e n c e . T h e amount o f 0 2 g e n e r a t e d i n 1 m lo f r e a c t i o n m i x t u r e c a n b e c a l c u l a t e d f r o m t h e f o r m u l a : 0 2( n a n o m o l e s ) = 4 7 . 7 x A s u p e r o x i d e w h e r e A i s a b s o r b a n c e .M e a s u r e m e n t o f SOD a c t i v i t y i n s a l i v a . SOD a c t i v i t y wa sm e a s u r e d b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d d e s c r i b e d b yB e a u c h a m p a n d F r i d o v i c h ( 1 ) , w h i c h i s b a s e d o n t h e f a c tt h a t , i n a n a e r o b i c x a n t h i n e o x i d a s e s y s t e m , t h e r e d u c t i o n o ft e t r a z o l i u m s a l t s i s i n h i b i t e d b y S O D . T h e c u v e t t e c o n t a i n e d2 . 5 x 1 0 - 5 M 3 - ( 4 , 5 - d i m e t h y l - 2 - t h i a z o l y l ) - 2 , 5 - d i p h e n y l - 2 H -t e t r a z o l i u m b r o m i d e ( M T T ; Wako P u r e C h e m i c a l I n d u s t r i e s ,L t d . , O s a k a , J a p a n ) , 1 x 1 0 - ' M x a n t h i n e ( g r a d e V ; S i g m a ) ,3 . 3 x 1 0 - 9 M EDTA, 0 . 0 5 M s o d i u m c a r b o n a t e , a n d v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s o f SOD o r s a l i v a i n a t o t a l o f 3 m l . T h ei n h i b i t i o n o f x an t h i n e o x i d a s e a c t i v i t y b y SOD was d e t e r -m i n e d f r o m t h e i n c r e a s e d a b s o r p t i o n o f t h e r e a c t i o n m i x t u r ea t 5 6 0 n m a t 2 5 C , w h i c h was c a u s e d b y t h e r e d u c t i o n o fMTT ( M T T - f o r m a z a n ) .A s s a y o f c a t a l a s e a c t i v i t y i n s a l i v a . C a t a l a s e a c t i v i t y i ns a l i v a was e s t i m a t e d f r o m t h e r a t e o f b r e a k d o w n o f H 2 0 2 ( 7 ) .A 2 - m l p o r t i o n o f 0 . 0 2 N H 2 0 2 a n d 1 0 m l o f 0 . 3 3 Mp h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) were m i x e d i n a f l a s k , a n d 5 m l o fs a l i v a was a d d e d t o t h e f l a s k a s t h e s o u r c e o f c a t a l a s e . T h em i x t u r e was i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 5 m i n . T h e r e a c t i o n wa ss t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 m l o f 2 N H 2 S O 4 , a n d t h e n t h er e s i d u a l H 2 0 2 was t i t r a t e d w i t h 0 . 0 2 N KMnO4 s o l u t i o n . T h eamount o f c a t a l a s e ( W ) was c a l c u l a t e d f r o m t h e f o l l o w i n gf o r m u l a : K = l i t ( l n S / S - x ) , w h e r e S = t h e c o n c e n t r a t i o no f H 2 0 2 b e f o r e t h e r e a c t i o n , a n d S - x = t h e c o n c e n t r a t i o no f H 2 0 2 a f t e r t h e r e a c t i o n . T h e n , K a t f = K I W , w h e r e W i st h e w e i g h t ( i n g r a m s ) o f c a t a l a s e i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e , K a tf ( c a t a l a s e f a c t o r ) = 1 2 5 , 0 0 0 , a n d K i s t h e r e a c t i o n v e l o c i t yc o n s t a n t . C a t a l a s e f r o m b o v i n e l i v e r ( S i g m a ) wa s u s e d as as t a n d a r d f o r t h e measurement o f c a t a l a s e i n s a l i v a .F r a c t i o n a t i o n o f s a l i v a . S a l i v a wa s d i v i d e d i n t o two p o r -t i o n s b y p a s s i n g i t t h r o u g h a c o l l o d i o n b a g ( 1 2 , 5 0 0 - d a l t o nc u t o f f ; S a r t o r i u s G m b H , G o t t i n g e n , F e d e r a l R e p u b l i c o fG e r m a n y ) . B o t h f r a c t i o n s were l y o p h i l i z e d , a n d 1 0 m g f r o me a c h f r a c t i o n wa s d i s s o l v e d i n 0 . 5 m l o f d i s t i l l e d w a t e r a n da p p l i e d t o a c o l u m n ( 1 0 b y 9 0 0 m m ) o f e i t h e r S e p h a d e x G - 2 5o r S e p h a c r y l S - 2 0 0 ( P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s , P h a r m a c i aJ a p a n , T o k y o , J a p a n ) w h i c h wa s e q u i l i b r a t e d w i t h s a l i n e ( p H7 . 2 ) . E a c h f r a c t i o n o f 3 m l e l u t e d w i t h 0 . 8 5 % N a C l wasc o l l e c t e d on a f r a c t i o n c o l l e c t o r . T h e s e f r a c t i o n s were ex -a m i n e d f o r t h e p r e s e n c e o f t h e i n h i b i t o r s o f l e u k o c y t ef u n c t i o n s b y t h e a d d i t i o n o f 0 . 2 m l o f e a c h f r a c t i o n t o t h er e a c t i o n m i x t u r e . T h e p e p t i d e f r a c t i o n e l u t e d l a s t f r o mS e p h a d e x G - 2 5 wa s l y o p h i l i z e d a n d r e c h r o m a t o g r a p h e d onB i o - G e l P - 4 ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s J a p a n , T o k y o , J a p a n )a n d t h e n s u b j e c t e d t o r e v e r s e d - p h a s e h i g h - p r e s s u r e l i q u i dc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ; HPLC m o d e l 6 5 5 A ; H i t a -c h i C o . , L t d . , T o k y o , J a p a n ) . A 1 0 - , u l s a m p l e f r o m t h e P - 4

I N F E C T . IMMUN.

7/29/2019 Saliva Inhibits

4/9

SUPPRESSION OF LEUKOCYTE FUNCTION B Y SALIVA 2 1 2 7

0 2- J0

-0

C )

C 0-iC)aa .

0- Ja

. CcC

0

0 1 0 20 30 40 5 0T i m e s a f t e r s t i m u l a t i o n ( m i n )

F I G . 1 . T i m e c o u r s e o f t h e l u m i n o l - m e d i a t e d CL r e s p o n s e o fm u r i n e PMNs ( 2 x 1 0 6 c e l l s ) t o S . e p i d e r m i d i s o r FMLP. PMNs i nt h e r e a c t i o n m i x t u r e w e r e p l a c e d i n s i d e a L u m i p h o t o m e t e r a n ds t i m u l a t e d w i t h e i t h e r 0 . 1 m l o f s u s p e n s i o n o f S . e p i d e r m i d i s ( 4 x1 0 6 CFU) ( 0 ) o r 0 . 1 m l o f FMLP ( 3 x 1 0 - ' M) ( 0 ) . T h e e m i s s i o nf r o m s t i m u l a t e d PMNs w a s m e a s u r e d a u t o m a t i c a l l y , a n d t h e v a l u e i si n d i c a t e d a s c o un t s p e r m i n u t e .f r a c t i o n was i n j e c t e d i n t o a r e v e r s e d - p h a s e 3 0 6 3 p a c k i n gc o l u m n ( 4 b y 1 5 0 m m ) w h i c h h a d b e e n e q u i l i b r a t e d w i t hs o l v e n t A ( 0 . 1 % t r i f l u o r o a c e t i c a c i d ) a n d run w i t h s o l v e n t B( 0 . 1 % t r i f l u o r o a c e t i c a c i d , 19% H 2 0 , 80% CH3CN) f o r 3 0m i n w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f CH3CN f r o m 0 t o 80% a n d af l o w r a t e o f 1 . 0 m l / m i n a t room t e m p e r a t u r e . F r a c t i o n s o fe l u a t e ( 5 0 0 p d ) were c o l l e c t e d w i t h a u t o m a t i c measurementof A 2 2 0 .A s a m p l e o f t h e e l u a t e f r o m t h e P - 4 c o l u m n was l y o p h i -l i z e d a t r e d u c e d pressure a n d d i s s o l v e d i n 1 m l o f 0 . 02 NH C l . A 1 0 0 - , u l s a m p l e o f t h i s s o l u t i o n was a p p l i e d t o ana m i n o a c i d a n a l y z e r ( m o d e l L - 8 5 0 0 ; H i t a c h i ) . D a t a ar es h o w n as n a n o m o l e s a n d as n a n ogra ms p e r 1 0 0 p d l o f s a m p l e .A s s a y o f I g A . T h e c o n c e n t r a t i o n o f I g A i n t h e a c t i v ef r a c t i o n was e s t i m a t e d b y u s i n g an i m m u n o d i f f u s i o n p l a t e f o rt h e q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n ( L o orNor P a r t i g e n ; H o e c h s t J a p a n C o . , L t d . , T o k y o , J a p a n ) .A b s o r p t i o n o f I g A . A n I g A - r i c h f r a c t i o n o f s a l i v a ru nt h r o u g h 1 m l o f S e p h a c r y l S - 2 0 0 was t r e a t e d w i t h 1 0 mg o fr a b b i t a n t i - h u m a n c o l o s t r u m I g A I m m u n o - b e a d s ( B i o - R a dL a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C a l i f . ) f o r 1 h a t 4 C . A f t e r c e n-t r i f u g a t i o n a t 6 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n , t h e s u p e r n a t a n t was u s e df o r t h e t e s t .

RESULTSD i f f e r e n c e b e t w e e n t h e CL r e s po n s e o f PMNs t o FMLP a n dS . e p i d e r m i d i s . Two r e p r e s e n t a t i v e t y p e s o f PMN r e s po n s e ,

t o a s o l u b l e s t i m u l a n t (FMLP) a n d t o a p a r t i c u l a t e s t i m u l a n t( S . e p i d e r m i d i s ) , ar e s h o w n i n F i g . 1 , w h i c h s h o w s ac o n t i n u o u s r e co r d o f CL a f t e r s t i m u l a t i o n . L i g h t e m i s s i o n b yPMNs i n r e s p o n s e t o FMLP i n c r e a s ed w i t h i n 2 m i n a f t e rs t i m u l a t i o n a n d t h e n d e c r e a s e d i m m e d i a t e l y , w h e r e a s t h eresponse t o S . e p i d e r m i d i s was g r a d u a l a n d more t h a n 5 0 m i nwas r e q u i r e d b e f o r e t h e p e a k o f e m i s si o n was r e a c h e d .E f f e c t o f s a l i v a on CL r e s po n s e o f PMNs t o S . e p i d e r m i d i sa n d FMLP. A d o s e - d e p e n d e n t i n h i b i t i o n o f t h e CL r e s p o n s et o b o t h s t i m u l a n t s was o b s e r v e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f v a r i o u s

a b

0 1 2 , 5 2 5 50 0 1 2 . 5 2 5 S 0C o n c e n t r a l i o n o f s a l i v a ( %)

F I G . 2 . I n h i b i t o r y e f f e c t o f s a l i v a o n t h e CL r e s p o n s e o f PMNss t i m u l a t e d w i t h e i t h e r S . e p i d e r m i d i s ( a ) o r FMLP ( b ) . E a c h b a r i nt h e f i g u r e i n d i c a t e s t h e a v e r a g e p e r ce n t i n h i b i t i o n m e a s u r e d i n f i v es e p a r a t e e x p e r i m e n t s i n w h i c h t h e p e a k v a lu e o f CL a t t h e i n d i c a t e dc o n c e n t r a t i o n o f s a l i v a was c o m p a r e d w i t h t h e v a l u e i n t h e a b s e n c eo f s a l i v a . V e r t i c a l l i n e s r e p r e s e n t S EM o f mean p e r c e n t i n h i b i t i o nf r o m s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . * , R e s u l t s f r o m PMNs w h i c h w e r ei n c u b a t e d w i t h s a l i v a a t t h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n a t 3 7 C f o r 1 ha f t e r w h i c h t h e s a l i v a was r e m o v e d .c o n c e n t r a t i o n s o f s a l i v a t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e ( F i g . 2 ) . As a l i v a c o n c e n t r a t i o n o f 25% c o m p l e t e l y i n h i b i t e d t h e CLr e s p o n s e t o S . e p i d e r m i d i s . L o s s o f r e a c t i v i t y o f PMNsc a u s e d b y s a l i v a d i d n o t mean d a m a g e t o t h e PMNs b e c a u s et h e PMNs w e r e a b l e t o r e s p o n d r a p i d l y t o t h e s t i m u l u s whent h e s a l i v a w a s r e m o v e d f r o m t h e r e a c t i o n m i x t u r e , e v e n a f t e ri n c u b a t i o n w i t h 50% s a l i v a f o r 1 h a t 3 7 C ( F i g . 2 a ) .T h e r e s p o n s e o f PMNs t o FMLP ( F i g . 2 b ) was i n h i b i t e dn e a r l y c o m p l e t e l y b y 25% s a l i v a . A t r y p a n b l u e e xc l us i o nt e s t p r o v e d t h a t l e s s t h a n 2% o f t h e c e l l s w e r e s t a i n e d a s w e l la f t e r 1 h o f i n c u b a t i o n w i t h 1 0 0 % s a l i v a a s w i t h o u t s a l i v a .E f f e c t o f p a r o t i d s a l i v a o n CL r e s p o n s e o f PMNs t o S .e p i d e r m i d i s . I n d i v i d u a l s a m p l e s o f p a r o t i d s a l i v a w e r e c o l -l e c t e d , a n d t h e i n h i b i t i o n o f t h e CL r e s p o n s e o f PMNs t o S .e p i d e r m i d i s was e x a m i n e d . F i g u r e 3 s h o w s t h e mean a n ds t a n d a r d e r r o r o f t h e mean ( S E M ) e v e r y 1 0 m i n a f t e rs t i m u l a t i o n f o r f i v e d i f f e r e n t s a m p l e s i n t h e p r e s e n c e o f 5 0 o r1 0 0 % p a r o t i d s a l i v a a n d i n d i v i d u a l s a m p l e s o f 50% w h o l es a l i v a . B o t h t y p e s o f s a l i v a i n h i b i t e d t h e CL r e s p o n s e o fPMNs t o S . e p i d e r m i d i s .E f f e c t o f s a l i v a o n p h a g o c y t o s i s a n d k i l l i n g o f S . e p i d e r m i d i s .T h e p h a g o c y t i c r a t i o o f PMNs w a s d e t e r m i n e d m i c r o s c o p i -c a l l y f r o m s p e c i m e n s p r e p a r e d a t 2 , 3 0 , a n d 6 0 m i n f r o m t h et i m e w h e n t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s p l a c e d a t 3 7 C . I n t h ep r e s e n c e o f 50% s a l i v a , t h e p h a g o c y t i c r a t i o d i d n o t e x c e e d50% o f t h e r a t i o o f t h e c o n t r o l p r e p a r a t i o n i n w h i c h p h a g o -c y t o s i s o c c u r r e d i n t h e a b s e n c e o f s a l i v a . I n t h e p r e s e n c e o f1 0 0 % s a l i v a , t h e r a t i o w a s l e s s t h a n 10% o f t h e c o n t r o l r a t i o( F i g . 4 ) . T h e e f f e c t o f s a l i v a o n b a c t e r i a l k i l l i n g w a s e s t i -m a t e d f r o m t h e p l a t e c o u n t o f s a m p l e s t a k e n a t t h e a b o v et i m e s f r o m t h e r e a c t i o n m i x t u r e a s c o m p a r e d w i t h t h e p l a t ec o u n t f r o m c o n t r o l s w h i c h c o n t a i n e d n o s a l i v a . R e p r e -s e n t a t i v e r e s u l t s a r e g i v e n i n F i g . 4 . I n t h e a b s e n c e o f s a l i v a ,a h i g h r a t e o f k i l l i n g was o b s e r v e d d u r i n g t h e f i r s t 3 0 m i n o fi n c u b a t i o n a n d t h e c o u n t o f v i a b l e b a c t e r i a r e m a i n e d u n -c h a n g e d i n t h e s e c o n d 3 0 m i n o f i n c u b a t i o n . H o w e v e r , t h er a t e o f k i l l i n g o f b a c t e r i a b y PMNs p r o v e d t o b e l o w e r i n t h ep r e s e n c e o f 50% s a l i v a t h a n i n i t s a b s e n c e . T h e a b i l i t y o f

V O L . 5 6 , 1 9 8 8

1

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5/9

2 1 2 8 SAITO ET A L .

EL 1 . o0

0

10 20 30 4 0 50 60M i n u t e s a f t e r s t i m u L a t i o n

F I G . 3 . E f f e c t o f w h o l e a n d p a r o t i d s a l i v a on CL r e s p o n s e o fPMNs t o S . e p i d e r m i d i s . S a m p l e s o f b o t h t y p e s o f s a l i v a werec o l l e c t e d i n d i v i d u a l l y . T h e d a t a s h o w t h e r e s u l t s f r o m f i v e s a l i v as a m p l e s f r o m d i f f e r e n t p e r so n s ( m e a n SEM [ v e r t i c a l b a r ] ) . T h ec o n c e n t r a t i o n o f s a l i v a u s e d was as f o l l o w s : A, 50% w h o l e s a l i v a ;0, 50 % p a r o t i d s a l i v a ; A , 100% p a r o t i d s a l i v a ; 0, c o n t r o l .

100

0

50

0oC H L C H L

F I G . 5 . E f f e c t o f HMF a n d LMF on t h e CL r e s p o n s e t o b a c t e r i aa n d FMLP. F i l t e r a b l e a n d n o n f i l t e r a b l e f r a c t i o n s ( c u t o f f s i z e , 1 2 , 5 0 0d a l t o n s ) were t e s t e d f o r t h e i r e f f e c t on t h e CL r e s po n s e a t ac o n c e n t r at i o n o f 50 % o f e a c h f r a c t i o n . T h e CL i n t e n s i t y g i v e n i s anaverage o f t h e maximum i n t e n s i t y m e a s u r e d i n t h r e e d i f f e r e n te x p e r i m e n t s , a n d t h e v e r t i c a l l i n e s r e p r e s e n t t h e SEM. C , W i t h o u ts a l i v a r y f r a c t i o n ; H , HMF; L , LMF.

PMNs t o k i l l as w e l l as t o p h a g o c y t o s e b a c t e r i a was a l m o s ta b o l i s h e d i n 1 0 0 % s a l i v a . T h e p e r c e n t a g e o f b a c t e r i a l s u r v i -vors i n 5 0 a n d 1 0 0 % s a l i v a was 7 0 a n d 1 1 0 %, r e s p e c t i v e l y ,w h e r e a s t h e s u r v i v a l r a t e i n t h e a b s e n c e o f s a l i v a was 2 0 % .E f f e c t o f s a l i v a r y c a t a l a s e a n d S OD a c t i v i t i e s on CL r e -sponse. C a t a l a s e a c t i v i t y i n s a l i v a was d e t e r m i n e d b y t h es p e e d o f b r e a k d o w n o f H202 b y a d d e d s a l i v a as t h e source o f

~ 0E 1 0 O0._

0

50a0-

0a

00~

0 30

100

v '50 . 0

c. 20-

0 s00.

60I n c u b a t i o n t i m e ( m i n )

F I G . 4 . E f f e c t o f s a l i v a on p h a g o c y t i c a n d b a c t e r i c i d a l a c t i v i t i e so f PMNs. Th e p h a g o c y t i c r a t i o was c a l c u l a t e d as d e s c r i b e d i n t h et e x t . Numbers i n t h e f i g u r e i n d i c a t e t h e c o n ce n t r a t i o n s ( p e r c e n t -a g e s ) o f s a l i v a u s e d .

e n z y m e . From t h e f o r m u l a d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n dM e t h o d s , t h e K v a l u e w a s c a l c u l a t e d a s 0 . 2 4 8 . T h e d o s e o fc a t a l a s e i n 1 m l o f s a l i v a w a s r o u g h l y e s t i m a t e d t o b e 0 . 3 8 n g ,i f i t i s a s s u m e d t h a t t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f c a t a l a s e( 2 2 5 , 0 0 0 ) i s c o n s t a n t i n a l l m a m m a l i a n s p e c i e s . T a b l e 1s h o w s t h e e f f e c t o n t h e CL r e s p o n s e o f PMNs when v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s o f c o m m e r c i a l c a t a l a s e w e r e a d d e d t o t h er e a c t i o n m i x t u r e . D e s p i t e t h e a d d i t i o n o f 1 0 0 t i m e s m o r ec a t a l a s e t h a n i s p r e s e n t i n 50% s a l i v a , CL w a s n o t i n h i b i t e d .SOD a c t i v i t y i n s a l i v a w a s a s s a y e d b y t h e i n h i b i t i o n o fx a n t h i n e o x i d a s e a c t i v i t y . D o s e - d e p e n d e n t i n h i b i t i o n o f x a n -t h i n e o x i d a s e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d u p o n t h e a d d i t i o n o fc o m m e r c i a l l y o b t a i n e d SOD. H o w e v e r , t h e a c t i v i t y o f t h ee n z y m e w a s u n c h a n g e d b y t h e a d d i t i o n o f s a l i v a t o t h er e a c t i o n m i x t u r e .O u t p u t o f 2 - . G e n e r a t i o n o f s u p e r o x i d e b y PMNs w h i c hw e r e s t i m u l a t e d w i t h S . e p i d e r m i d i s w a s d e t e r m i n e d b y t h eS O D - i n h i b i t a b l e r e d u c t i o n o f c y t o c h r o m e c i n t h e p r e s e n c eo r a b s e n c e o f s a l i v a . T h e a m o u n t o f 0 2 p r o d u c t i o n was0 . 1 2 5 + 0 . 0 3 5 n m o l / m i n p e r 5 x 1 0 6 c e l l s i n t h e p r e s e n c e o f5 0 % s a l i v a a n d 1 . 7 6 0 . 1 7 n m o l / m i n p e r 5 x 1 0 6 c e l l s i n t h ea b s e n c e o f s a l i v a . T h e a m o u n t o f 0 2 - p r o d u c e d b y PMNsw i t h b a c t e r i a a n d w i t h o u t c o m p l e m e n t a n d s a l i v a was 1 . 1 4 0 . 1 5 n m o l / m i n p e r 5 x 1 0 6 PMNs.

TA BLE 1 . E f f e c t o f c a t a l a s e o n CL r e s p o n s e o f PMNsC a t a l a s e d o s e ( ~ L g ) ( U ) P e a k v a l u e o f % I n h i b i t i o n50% s a l i v a ( c a . 0 . 0 0 7 ) 0 . 8 8 0 . 5 5 9 2 . 32 ( 8 ) 1 1 . 6 0 . 5 5 07 ( 2 8 ) 1 1 . 2 0 . 4 6 22 1 ( 8 4 ) 9 . 7 + 0 . 3 7 1 5 . 17 0 ( 2 8 0 ) 8 . 8 0 . 8 3 2 32 1 5 ( 8 4 0 ) 7 . 9 0 . 1 7 3 1C o n t r o l 0 1 1 . 4 + 0 . 3 9 0

a Mean S EM o f t h r e e e x p e r i m e n t s .

I N F E C T . IMMUN.

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6/9

SUPPRESSION OF LEUKOCYTE FUNCTION B Y SALIVA 2 1 2 9

1 0 20 30 4 0 50F r a c t i o n N o .

F I G . 6 . F r a c t i o n a t i o n o f LMF a n d e f f e c t o f e a c h f r a c t i o n on t h eCL r e s po n s e o f PMNs. T h e s a m p l e ( 1 0 mg o f l y o p h i l i z e d s a m p l e )was a p p l i e d t o a S e p h a d e x G - 2 5 c o l u m n ( 1 0 b y 9 0 m m ) a n d e l u t e dw i t h s a l i n e . F r a c t i o n s o f 3 m l were c o l l e c t e d . T o p : P r o t e i n p r o f i l e o fe l u a t e s . M i d d l e : I n t e n s i t y o f CL response t o FMLP i n t h e presenceo f e a c h a l t e r n a t e f r a c t i o n . B o t t o m : I n h i b i t i o n ( % ) b y e a c h a l t e r n a t ef r a c t i o n o f t h e CL response o f PMNs t o S . e p i d e r m i d i s . T h e s h a d e darea i n d i c a t e s t h e range o f CL o b t a i n e d f r o m exposure o f PMNs t oFMLP w i t h o u t an y a d d e d s a l i v a r y f r a c t i o n . O D 2 3 0 , O p t i c a l d e n s i t ya t 2 3 0 nm.

E f f e c t o f HMF a n d LMF on CL response o f PMNs. S a l i v awas d i v i d e d i n t o two p o r t i o n s w i t h a c o l l o d i o n b a g w h i c h h a da p e r m e a b i l i t y l i m i t o f 1 2 , 5 0 0 d a l t o n s . The m a t e r i a l r e m a i n -i n g i n t h e b a g was d i s s o l v e d b y t h e a d d i t i o n o f s a l i n e t o g i v esame v o l u m e as was p r e s e n t b e f o r e f i l t r a t i o n . The responset h a t was c a u s e d b y S . e p i d e r m i d i s b u t n o t t h a t c a u s e d b yFMLP was s u p p r e s s e d b y t h e h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t f r a c -t i o n o f s a l i v a (HMF) ( F i g . 5 ) . However i n t h e prese nce o f t h el o w - m o l e c u l a r - w e i g h t f r a c t i o n o f s a l i v a ( L M F ) , t h e responsewas i n h i b i t e d i r r e s p e c t i v e o f t h e n a t u r e o f t h e s t i m u l i .F r a c t i o n a t i o n o f LMF a n d e f f e c t o f v a r i o u s f r a c t i o n s on CLresponse. A l y o p h i l i z e d s a m p l e o f LMF ( 1 0 m g ) was d i s -s o l v e d i n 0 . 3 m l o f d i s t i l l e d w a t e r a n d a p p l i e d t o a S e p h a d e xG - 2 5 c o l u m n t o f r a c t i o n a t e t h e i n h i b i t o r o f t h e CL response.The r e s u l t i n g p r o f i l e o f p r o t e i n s ( t o p ) a n d t h e e f f e c t o f e a c hf r a c t i o n on t h e r e s p o n s e o f PMNs t o FMLP ( m i d d l e ) a n d t oS . e p i d e r m i d i s ( b o t t o m ) ar e s h o w n i n F i g . 6 . A 0 . 2 - ml p o r t i o no f e a c h f r a c t i o n was a d d e d t o t h e r e a ct i o n m i x t u r e t oe st i m a t e t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f t h a t f r a c t i o n ; 0 . 2 m l o fGHBSS was o m i t t e d f r o m t h e r e a c t i o n m i x t u r e i n s u c hcases. T h e r e were f o u r d i f f e r e n t f r a c t i o n s t h a t i n h i b i t e d e a c ht y p e o f s t i m u l a n t . The s l o w e s t - e l u t i n g i n h i b i t o r y f r a c t i o n

. 0 0 . 2 5 6 40ti10~ ~ ~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~1 0 20 30

T i m e ( m i n u t e s )F I G . 7 . R e v e r s e d - p h a s e HPLC o f t h e i n h i b i t o r y s u b s t a n c e a f t e rp u r i f i c a t i o n on a B i o - G e l P A c o l u m n o f t h e f i n a l f r a c t i o n f r o m t h eS e p h a d e x G - 2 5 c o l u m n . Th e c o l u m n was e q u i l i b r a t e d i n s o l v e n t A( 0 . 1 % t r i f l u o r o a c e t i c a c i d , H 2 0 ) a n d e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o fs o l v e n t B ( 0 . 1 % t r i f l u o r o a c e t i c a c i d , 1 9 . 9 % o H 2 0 , 80o CH3CN) o v er3 0 m i n ( 2 0 t o 100% s o l v e n t B ) a n d a f l o w r a t e o f 1 . 0 m l / m i n .

w h i c h c o i n c i d e d w i t h a p e a k o f p r o t e i n was f u r t h e r p u r i f i e db y f i l t r a t i o n on B i o - G e l P - 4 a n d r e v e r s e d - p h a s e HPLC. T h i sp u r i f i e d f r a c t i o n showed a s i n g l e p e a k o f a b s o r p t i o n a t 2 2 0nm ( F i g . 7 ) . The a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e p e p t i d ee l u t e d l a s t f r o m t h e S e p h a d e x G - 2 5 column a f t e r r e c h r o m a -t o g r a p h y w i t h B i o - G e l P - 4 i s shown i n T a b l e 2 . The amounto f t h i s p e p t i d e r e q ui r e d t o i n h i b i t t h e response b y 50% was3 5 , u g i n t h e s t a n d a r d r e a c t i o n m i x t u r e .F r a c t i o n a t i o n o f HMF f r o m s a l i v a a n d e f f e c t o f v a r i o u sf r a c t i o n s on CL response. F i g u r e 8 shows t h e p r o f i l e o f

TA BLE 2 . A m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e l a s t p e p t i d e e l u t e df r o m t h e S e p h a d e x G - 2 5 c o l u m n a f t e r r e c h r o m a t o g r a p h y w i t hB i o - G e l p - 4 aA m i n o a c i d n m o l n g

A s p 0 . 4 7 6 6 1 . 0T h r 0 . 2 2 6 2 6 . 8S e r 0 . 4 9 9 5 2 . 5G l u 0 . 4 8 8 7 1 . 9G l y 0 . 7 2 5 5 4 . 4A l a 0 . 5 3 0 4 7 . 2C y s 0 . 0 7 7 1 5 . 5V a l 0 . 2 3 1 2 7 . 1I l e 0 . 1 0 9 1 4 . 3Leu 0 . 2 4 9 3 2 . 7T y r 0 . 1 0 7 1 9 . 4P h e 0 . 2 0 7 3 4 . 2L y s 0 . 1 8 1 2 6 . 5A r g 0 . 2 0 7 3 6 . 1

a D a t a a r e s h o w n a s t h e a m o u n t i n 1 0 0 R I o f s am p l e .

V O L . 5 6 , 1 9 8 8

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7/9

2 1 3 0 S A I T O ET AL.

0C %00.5

o o1d1 FMLPE

l S .ep.d.FIG.8.r a c t i o n a t i o n o f HMF t h r o u g h a c o l u m n o f S e p h a c r y l ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~S - 2 0 0an d the e f f e c t of e ac h a l t e r n a t e f r a c t i o n onhe.L.response. of

Fraction No.FIG. 8. Fractionation ofHMFthrough acolumn of Sephacryl

S-200 and the effect ofeach alternate fractionontheCLresponse ofPMNs. T h e s a m p l e ( 1 0 mg o f l y o p h i l i z e d s a m p l e ) was a p p l i e d t o aS e p h a c r y l S - 20 0 c o l u m n , a n d 3 - m l f r a c t i o n s were c o l l e c t e d . T h ep r e s e n t a t i o n o f t h e f i g u r e i s t h e same as i n F i g . 6 .

p r o t e i n s o b t a i n e d a f t e r f r a c t i o n a t i o n o f HMF t h r o u g h S e p h -a c r y l S - 2 0 0 ( t o p ) a n d t h e e f f e c t o f e a c h f r a c t i o n on t h e CLresponse t o FMLP ( m i d d l e ) a n d t o S . e p i d e r m i d i s ( b o t t o m ) .T h e r e were two d i f f e r e n t f r a c t i o n s w h i c h were a b l e t o i n h i b i tCL s t i m u l a t e d b y S . e p i d e r m i d i s , w h e r e a s n o f r a c t i o n i n h i b -i t e d CL s t i m u l a t e d b y FMLP. T h e s e c o n d i n h i b i t o r y f r a c -t i o n , a r o u n d t h e 2 0 t h t u b e , c o n t a i n e d 0 . 0 8 9 mg o f I g A i n 0 . 2m l o f e l u a t e , b u t no o t h e r i m m u n o g l o b u l i n was d e t e c t a b l e .T h e CL response i n h i b i t o r f o u n d i n f r a c t i o n 2 0 was i n c r e a s e db y p r e i n c u b a t i o n o f t h i s f r a c t i o n w i t h PMNs f o r 1 h a t 3 7 C( T a b l e 3 ) . T h e p e r c e n t a g e o f i n h i b i t i o n o f t h e CL responsewas i n c r e a s e d f r o m 4 4 . 2 t o 9 0 . 5 % b y p r e i n c u b a t i o n . T h ei n h i b i t o r y a c t i v i t y o f t h i s f r a c t i o n was l o s t b y t h e a b s o r p t i o n

TA BLE 3 . E f f e c t o f I g A - c o n t a i n i n g f r a c t i o n on CL responseSource of IgA Preincubation R e l a t i v e i n t e n s i t yo f CL response (%)

F r a c t i o n 2 0 a 5 5 . 8F r a c t i o n 2 0 a + 9 . 5F r a c t i o n 2 0 b + 8 1 . 2W i t h o u t f r a c t i o n - 1 0 0C o l o s t r u m c 4 6 . 3C o l o s t r u m c + 1 4 . 6a F r ac t i o n 2 0 f r o m t h e S e p h a c r y l S - 2 0 0 c o l u m n c o n t a i n e d 0 . 0 8 9 mg o f I g A

p er 0 . 2 m l .b I g A - r i c h f r a c t i o n 2 0 was a b s o r b e d w i t h a n t i - h u m a n I g A I m m u n o - b e a d s .c C o l o s t r u m c o n t a i n e d 0 . 06 5 mg o f I g A i n a t o t a l volume o f 0 . 6 5 m l .

T A BLE 4 . E f f e c t o f m a j o r p r o t e i n f r a c t i o n s o f s a l i v a a f t e r g e lf i l t r a t i o n o n p h a g o c y t o s i s aF r a c t i o n n o . P h a g o c y t i c r a t i o T o t a l n o . o f b a c t e r i aLMF2 0 2 6 . 2 5 . 9 1 3 3 3 32 6 2 3 . 7 1 . 8 1 2 4 . 7 1 3 . 9

3 2 3 9 . 6 + 2 . 5 * * * 1 7 2 . 0 4 83 8 2 5 . 6 1 . 9 1 3 2 . 2 2 65 2 3 2 . 6 1 . 5 1 4 5 . 0 8 . 0C o n t r o l 2 6 . 2 + 6 . 1 1 3 9 . 0 3 8 . 7HMF1 3 2 5 . 5 2 . 1 1 8 0 . 0 3 81 5 6 . 0 3 . 8 * 1 8 . 6 8 . 8 * *1 7 1 3 . 8 2 . 4 5 6 . 2 1 1 . 71 9 1 7 . 2 1 . 7 9 4 . 0 1 82 1 9 . 3 3 . 5 * 4 5 . 5 1 0 * * *2 1 a b s . b 3 4 . 7 5 . 2 1 3 1 . 0 1 7 . 12 3 2 6 . 0 4 . 2 1 1 5 . 0 2 42 5 3 1 . 5 7 1 5 4 . 0 3 1C o n t r o l 2 7 . 6 4 . 6 1 2 8 . 4 4 . 1a D a t a i n d i c a t e t h e m e a n a n d S EM o f t h r e e t o s e v e n s e p a r a t e e x p e r i m e n t s .b a b s . , F r a c t i o n 2 1 a b s o r b ed w i t h a n t i - h u m a n I g A I m m un o - b e a d s.P < 0 . 0 0 5 .,P < 0 . 0 1 .,P < 0 . 0 5 .

o f t h e f r a c t i o n w i t h 1 0 m g o f r a b b i t a n t i - h u m a n I g A I m m u n o -b e a d s . I g A f r o m c o l o s t r u m w a s u s e d a r e f er e n c e s t a n d a r d f o rt h e I g A - c o n t a i n i n g f r a c t i o n , a n d t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f I g Aw a s c o n f i r m e d ( T a b l e 3 ) .E f f e c t o f m a j o r p r o t e i n s f r o m s a l i v a o n p h a g o c y t o s i s . T h ep h a g o c y t i c a c t i v i t y o f PMNs was a s s e s s e d f r o m t h e p h a g o -c y t i c r a t i o a n d t h e t o t a l n u m b e r o f b a c t e r i a i n 1 0 0 PMNs w i t ho r w i t h o u t a d d e d f r a c t i o n s o f s a l i v a . T h e m o s t p r o m i n e n tp r o t e i n s w e r e c h o s e n f r o m t h e f r a c t i o n s o f HMF a n d LMF.T h e r e w a s n o f r a c t i o n w h i c h i n h i b i t e d p h a g o c y t i c a c t i v i t yamong t h e f r a c t i o n s f r o m t h e S e p h a d e x G - 2 5 c o l u m n , w h i l eamong t h e f r a c t i o n s f r o m t h e S e p h a c r y l S - 2 0 0 c o l u m n , t h e r ew e r e t w o f r a c t i o n s , a r o u n d f r a c t i o n s 1 5 a n d 2 0 , t h a t r e d u c e dt h e p h a g o c y t i c a c t i v i t y o f PMNs, a s d e m o n s t r a t e d b yc h a n g e s i n t h e t w o p a r a m e t e r s m e n t i o n e d a b o v e . T h e s ei n h i b i t o r y f r a c t i o n s w e r e c o i n c i d e n t w i t h t h e f r a c t i o n s t h a ti n h i b i t e d t h e CL r e s p o n s e o f PMNs t o S . e p i d e r m i d i s ( T a b l e4 ) . T h e i n h i b i t o r y a c t i v i t y o f t h e I g A - r i c h f r a c t i o n wasr e d u c e d b y t r e a t m e n t o f t h i s f r a c t i o n w i t h a n t i - h u m a n I g AI m m u n o - b e a d s .E f f e c t o f s a l i v a o n CL r e s p o n s e o f human PMNs t o S .e p i d e r m i d i s . T h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f s a l i v a o n human PMNswas e x a m i n e d b y u s i n g human p e r i p h e r a l b l o o d PMNs. T h ep e a k v a l u e o f t h e CL r e s p o n s e was ( 2 . 4 6 0 . 4 4 ) x 1 0 7 c p m /1 0 6 c e l l s i n t h e a b s e n c e o f s a l i v a . T h e i n h i b i t o r y e f f e c t o fs a l i v a o n t h e CL r e s p o n s e o f human PMNs was l e s s t h a n t h a to n m u r i n e PMNs ( F i g . 9 ) . C o m p l e t e i n h i b i t i o n o f t h e r e -s p o n s e was o b s e r v e d a f t e r 1 h o f i n c u b a t i o n o f PMNs w i t h1 0 0 % s a l i v a a t 3 7 C . T h e v i a b i l i t y o f PMNs d e t e r m i n e d b yt h e t r y p a n b l u e e x c l u s i o n t e s t was 9 9 . 6 0 . 6 % , a n d t h er e m o v a l o f s a l i v a f r o m t h e s u s p e n s i o n o f PMNs w h i c hc o n t a i n e d 1 0 0 % s a l i v a r e s t o r e d t h e r e s p o n s e o f PMNs t o S .e p i d e r m i d i s .

DISCUSSIONA l t h o u g h PMNs a r e t h e p r e d o m i n a n t c e l l s i n b o t h t h eg i n g i v a l f l u i d a n d s a l i v a , t h e s i g n i f i c a n c e o f s a l i v a r y PMNss o a k e d i n s a l i v a f o r o r a l h e a l t h a n d d i s e a s e i s s t i l l n o tu n d e r s t o o d . T h e s e c e l l s may e x e r t a c o n t r o l l i n g i n f l u e n c e on

I N F E C T . IMMUN.

7/29/2019 Saliva Inhibits

8/9

SUPPRESSION OF LEUKOCYTE FUNCTION B Y S ALI VA 2 1 3 1

1005050 ~006

-J

5Q0C0

.0~~~~~~~~J0 2550100 10O' 50 100

C o n c e n t r a t i o n o f s a t i v a (%)F I G . 9 . E f f e c t o f s a l i v a on CL response o f human PMNs t oS . e p i d e r m i d i s . Human PMNs ( 1 0 6 ) were s u s p e n d e d i n v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s o f s a l i v a w h i c h was d i l u t e d w i t h GHBSS. T h e CL

r e s p o n s e o f PMNs was m e a s u r e d w i t h ( b ) or w i t h o u t ( a ) p r e i n c u b a -t i o n o f t h e s u s p e n s i o n a t 3 7 C f o r 1 h . * , CL r e s p o n s e o f PMNsw h i c h h a d b e e n i n c u b a t e d w i t h 100% s a l i v a a n d t h e n f r e e d f r o ms a l i v a b y c e n t r i f u g a t i o n a t 3 0 0 x g f o r 6 m i n .t h e o r a l m i c r o f l o r a b y p h a g o c y t o s i s , k i l l i n g o f b a c t e r i a , orr e l e a s e o f enzymes.The f u n c t i o n o f PMNs i n t h e o r a l m i l i e u , e s p e c i a l l ys u l c u l a r PMNs, was e x a m i n e d b y W i l t o n e t a l . ( 2 9 ) , wh of o u n d t h a t s u l c u l a r PMNs p h a g o c y t i z e d f e w e r l a t e x b e a d s orspores o f C a n d i d a a l b i c a n s t h a n d i d PMNs f r o m b l o o d .H o w e v e r , t h e k i l l i n g c a p a c i t i e s o f t h e two p o p u l a t i o n s weret h e s a m e . F u r t h e r m o r e , t h e d e f i c i e n t p h a g o c y t o s i s o f c r e v i c -u l a r PMNs was d u e t o f u n c t i o n a l b l o c k i n g o f t h e C3 br e c e p t o r on t h e PMNs, a n d a s i m i l a r d e f e c t c o u l d b e d e m -o n s t r a t e d w i t h t h e PMNs f r o m b l o o d b y p r e i n c u b a t i o n o ft h e s e i n b o t h c r e v i c u l a r f l u i d a n d s a l i v a .CL r e s u l t s f r o m t h e l i g h t energy p r o d u c e d b y t h e PMNsd u r i n g t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h t h e b a c t e r i a or o t h e r s t i m u l a n t s ,a n d t h e CL response b y PMNs h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t oc o r r e l a t e w e l l w i t h t h e i n t e g r i t y o f a n t i b a c t e r i a l p r o p e r t i e s .Iwase e t a l . ( 7 ) c o m p a r e d human p e r i p h e r a l PMNs i n t h eprese nce or a b s e n c e o f s a l i v a a n d d e m o n s t r a t e d a d e c r e a s eo f b o t h C3 b r e c e p t o r a n d F c r o s e t t e f o r m a t i o n o f PMNs b yi n c u b a t i o n w i t h s h e e p b l o o d c e l l s c o a t e d w i t h I g G a n dc o m p l e m e n t , as w e l l as a d e c r e a s e o f t h e CL r e s p o n s e o fPMNs i n t h e p r e s e n c e o f s a l i v a . They s u g g e s t e d t h a t d y s -f u n c t i o n o f PMNs was c a u s e d b y t h e t o x i c a c t i v i t y o f s a l i v a .I t s e e m s t h a t t h e c y t o t o x i c e f f e c t o f s a l i v a d e p e n d s on t h eh y p o t o n i c i t y . T h e r e f o r e , when t h e s a l i v a was i s o t o n i c , wed i d n o t o b s e r v e t r y p a n b l u e - s t a i n i n g c e l l s a f t e r i n c u b a t i o nt h e PMNs i n 100% s a l i v a f o r 1 h .I n t h i s r e p o r t , we d e s c r i b e d t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f s a l i v aon t h e CL r e s p o n s e o f m u r i n e PMNs. I n h i b i t i o n o f t h e CLresponse o f PMNs was o b s e r v e d i n t h e presence o f b o t hs t i m u l i ( p a r t i c u l a t e , S . e p i d e r m i d i s ; s o l u b l e , FMLP). Thei n h i b i t o r y e f f e c t o f s a l i v a was a l s o o b s e r v e d i n t h e samee x p e r i m e n t w i t h human PMNs. I n d i v i d u a l l y c o l l e c t e d sam-p l e s o f p a r o t i d s a l i v a a n d w h o l e s a l i v a were i n h i b i t o r y .F u r t h e r m o r e , a r e d u c t i o n o f t h e c a p a c i t y o f m u r i n e PMNs t oengage i n p h a g o c y t o s i s a n d k i l l i n g o f b a c t e r i a was o b s e r v e di n t h e p r e s e n c e o f s a l i v a . I n a s t u d y o f PMNs f r o m s y n o v i a lf l u i d f r o m a p a t i e n t w i t h r h e u m a t o i d a r t h r i t i s , a d e f e c t i np h a g o c y t o s i s o f b a k e r s ' y e a s t , as compared w i t h p h a g o c y -

t o s i s b y b l o o d PMNs, w a s d e m o n s t r a t e d , a n d s y n o v i a l f l u i df r o m a p a t i e n t w i t h n o n i n f l a m m a t o r y o s t e o a r t h r i t i s i n h i b i t e dt h e k i l l i n g o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s b y PMNs ( 2 0 ) .I t i s k n o w n t h a t PMNs e x p l o i t t w o b a c t e r i c i d a l m e c h a -n i s m s , w h i c h a r e o x y g e n d e p e n d e n t a n d o x y g e n i n d e p e n -d e n t , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , t h e b a c t e r i c i d a l e f f e c t i sl a r g e l y a c c o m p l i s h e d b y m e a n s o f a n o x y g e n - d e p e n d e n tm i c r o b i c i d a l s y s t e m w h i c h e m p l o y s a g r o u p o f l e t h a l o x i -d a s e s a s a n t i m i c r o b i a l a g e n t s , a n d t h e PMNs g e n e r a t e t h o s eo x i d a s e s when t h e y a r e s t i m u l a t e d . T h e p r e c u r s o r o f t h el e t h a l o x i d a n t s i s s u p e r o x i d e . T h e CL r e s p o n s e o f PMNs t oFMLP r e a c h e d a maximum 3 o r 4 m i n a f t e r s t i m u l a t i o n ,w h e r e a s t h e CL r e s p o n s e t o S . e p i d e r m i d i s r e a c h e d amaximum a f t e r m o r e t h a n 5 0 m i n . T h e r e f o r e , i t s e e m s t h a tt h e l a t t e r r e s p o n s e r e f l e c t s a n o x i d a t i v e m e t a b o l i c r e s p o n s eo f t h e s e c e l l s a f t e r t h e p h a g o c y t o s i s o f t h e b a c t e r i a .I n h i b i t i o n o f S O D - i n h i b i t a b l e r e d u c t i o n o f c y t o c h r o m e co c c u r r e d i n PMNs s t i m u l a t e d w i t h S . e p i d e r m i d i s i n t h ep r e s e n c e o f 50% s a l i v a , i n d i c a t i n g a s u p p r e s s i v e e f f e c t o fs a l i v a o n t h e g e n e r a t i o n o f s u p e r o x i d e b y PMNs. Manys t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t SOD a n d c a t a l a s e , w h i c h may b ei n c l u d e d i n t h e s a l i v a r y c o m p o n e n t s a n d w h i c h c a n a c t a ss c a v e n g e r s o f s u p e r o x i d e , c a n a l s o i n h i b i t t h e CL r e s p o n s ea n d b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y o f PMNs ( 1 , 1 4 , 2 6 ) . H o w e v e r , t h ep o s s i b i l i t y t h a t t h e s e e n z y m e s i n h i b i t t h e f u n c t i o n s o f PMNsmay n o t b e v a l i d b e c a u s e o f t h e s m a l l a m o u n t o f s u c ha c t i v i t i e s i n t h e s a l i v a .S a l i v a w a s s e p a r a t e d i n t o HMF a n d LMF b y u s i n g ac o l l o d i o n b a g w i t h a m o l e c u l a r s i z e c u t o f f o f 1 2 , 5 0 0 d a l t o n s .T h e HMF i n h i b i t e d t h e CL r e s p o n s e t o S . e p i d e r m i d i s a n dt h e p h a g o c y t i c a c t i v i t y o f PMNs, b u t n o t t h e r e s p o n s e t oFMLP. T h e LMF i n h i b i t e d t h e CL r e s p o n s e t o b o t h t h eb a c t e r i a a n d FMLP, w h e r e a s t h e r e w a s n o i n h i b i t i o n o fp h a g o c y t i c a c t i v i t y o f PMNs. T h e LMF a n d HMF w e r ea p p l i e d t o S e p h a d e x G - 2 5 a n d S e p h a c r y l S - 2 0 0 c o l u m n s ,r e s p e c t i v e l y . G e l f i l t r a t i o n o f HMF y i e l d e d t w o a c t i v e f r a c -t i o n s , a n d o n e o f t h e f r a c t i o n s c o n t a i n e d 0 . 0 8 9 m g o f I g A p e r0 . 2 m l . U s i n g c o m m e r c i a l I g A f r o m human c o l o s t r u m , wec o n f i r m e d t h e i n h i b i t o r y a c t i v i t y o f I g A a g a i n s t t h e CLr e s p o n s e a n d p h a g o c y t o s i s a t a c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 mg o fI g A p e r m l . Among t h e f r a c t i o n s o f LMF o b t a i n e d a f t e r g e lf i l t r a t i o n o n S e p h a d e x G - 2 5 , t h e r e w e r e f o u r f r a c t i o n s w h i c hi n h i b i t e d t h e CL r e s p o n s e t o e i t h e r S . e p i d e r m i d i s o r FMLP.H o w e v e r , e x c e p t f o r t h e l a s t p e p t i d e f r a c t i o n e l u t e d , t h e r ew a s n o c o i n c i d e n c e b e t w e e n t h e A 2 3 0 o r A 2 8 0 a n d t h ei n t e n s i t y o f a n y s u p p r e s s i v e e f f e c t o n t h e CL r e s p o n s e ,i n d i c a t i n g t h e p o s s i b l e p r e s e n c e o f a c t i v e s u b s t a n c e s w h i c ha r e n o t p r o t e i n s . T h e p u r i t y o f t h e p e p t i d e w a s e s t i m a t e d b yc h r o m a t o g r a p h y o n B i o - G e l P - 4 a n d r e v e r s e d - p h a s e HPLC.I n e a c h c a s e , a s i n g l e p e a k w a s o b t a i n e d . T h e p e p t i d ec o n t a i n e d 1 4 d i f f e r e n t a m i n o a c i d s . A l t h o u g h f r o m t h e m o l a rw e i g h t c o m p o s i t i o n i t a p p e a r e d t h a t t h e p e p t i d e w a s c o m -p o s e d o f 5 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s , t h e e l u t i o n o f t h e p e p t i d e o nS e p h a d e x G - 2 5 a n d B i o - G e l P - 4 a n d t h e l o s s o f A 2 3 0 a f t e rd i a l y s i s o f t h e m a t e r i a l a g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r i n c e l l u l o s et u b i n g w i t h a m o l e c u l a r s i z e c u t o f f o f 2 , 0 00 d a l t o n s s u g g e s t e dt h a t t h e m a t e r i a l i s a m i x t u r e o f a f e w s h o r t p e p t i d e s w i t hs i m i l a r c h r o m a t o g r a p h i c p r o p e r t i e s . A l t e r n a t i v e l y , t h e m a t e -r i a l may b e v e r y u n s t a b l e i n w a t e r .T h e r e a r e i n h i b i t o r s o f t h e r e s p o n s e o f PMNs, s u c h a shuman s e r u m a l b u m i n ( 2 ) a n d t h e l i p i d - s o l u b l e f r a c t i o n ( 6 ) , i nn o r m a l t i s s u e . T h e l e v e l s o f s e r u m a l b u m i n ( 0 . 0 0 2 m g / m l )a n d t h e l i p i d - s o l u b l e f r a c t i o n , s u c h a s f a t t y a c i d s ( 0 . 0 1 m g / m la s w h o l e f a t t y a c i d s ) , i n w h o l e s a l i v a a r e t o o l o w t o i n h i b i tt h e f u n c t i o n o f PMNs.T h e r e a r e s o m e r e p o r t s o f t h e a b i l i t y o f I g A t o r e d u c e t h e

V O L . 5 6 , 1 9 8 8

7/29/2019 Saliva Inhibits

9/9

2 1 3 2 SAITO ET A L .b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y o f I g G ( 4 , 1 2 , 1 4 , 2 5 ) . T h e s u p p r e s s i o n o fp h a g o c y t o s i s a p p e a r e d t o o c c u r v i a b l o c k a d e o f t h e r e c e p t o rf o r F c r o n t h e s u r f a c e o f PMNs b y p a r t o f t h e I g A m o l e c u l e( 2 4 , 2 8 ) . I n a n o t h e r s t u d y , I g A was s h o w n t o d e c r e a s e t h ep h a g o c y t i c a c t i v i t y o f I g G - c o a t e d b a c t e r i a ( 3 ) .O u r r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t a n I g A - r i c h f r a c t i o n h a d a ni n h i b i t o r y e f f e c t o n b o t h p h ag o c y t o s i s a n d CL o f m u r i n ePMNs i n r e s p o n s e t o S . e p i d e r m i d i s . I t i s n o t c l e a r howm u r i n e PMNs i n t e r a c t w i t h human I g A , b u t t h e a c t i v ef r a c t i o n o f s a l i v a w h i c h c o n t a i n e d I g A l o s t i t s a b i l i t y t oi n h i b i t t h e f u n c t i o n s o f PMNs a f t e r a b s o r p t i o n w i t h a n t i -h u m a n I g A a n t i b o d y - c o n j u g a t e d b e a d s . T h e r e a r e r e a s o n swhy we u s e d m u r i n e PMNs; m u r i n e PMNs w e r e e a s y t o g e t ,t h e i r CL v a l u e s w e r e r e l a t i v e l y c o n s t a n t a m o n g m i c e , a n dt h e y r e m a i n e d v i a b l e f o r l o n g t i m e s ( m o r e t h a n 7 h f o rm u r i n e PMNs a s o p p o s e d t o 3 h f o r h u m a n P M N s ) . I n t h ep r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t , m u r i n e PMNs t r e a t e d w i t h e i t h e rI g A o r w h o l e s a l i v a w e r e s t a i n e d w i t h f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y -a n a t e - c o n j u g a t e d a n t i - h u m a n I g A a n t i b o d y a t a r a t e o f 3 4 t o3 8 % . T h i s s u g g e s t s t h e p r e s e n c e o f a common r e c e p t o r f o rh u m a n I g A o n b o t h PMNs. P u r i f i c a t i o n o f u n k n o w n s u b -s t a n c e s i n s a l i v a a p d e l u c i d a t i o n o f t h e i r i n h i b i t o r y m e c h a -n i s m s w i l l b e r e q ui r e d b e f o r e t h e s e e f f e c t s c a n b e f u l l ye x p l a i n e d .

LITERATURE CITED1 . B e a u c h a m p , C . , a n d I . F r i d o v i c h . 1 9 7 1 . S u p e r o x i d e d i s m u t a s e :i m p r o v e d a s s a y s a n d a n a s s a y a p p l i c a b l e t o a c r y l a m i d g e l s .A n a l . B i o c h e m . 4 4 : 2 7 6 - 2 8 7 .2 . B r i h e i m , G . , 0 . S t e n d a h l , a n d C . D a h l g r e n . 1 9 8 4 . I n t r a - a n de x t r a c e l l u l a r l e u k o c y t e s . I n f e c t . I m m u n . 4 5 : 1 - 5 .3 . F a n g e r , M. W . , S . N . G o l d s t e i n , a n d L . S h e n . 1 9 8 3 . T h e p r o t e i n sa n d r o l e o f r e c e p t o r s f o r I g A o n h u m a n l e u k o c y t e s . A n n . N . Y .A c a d . S c i . 4 0 9 : 5 5 2 - 5 6 3 .4 . G r i f f i s s , J . M . , a n d M. A . B e r t r a m . 1 9 7 7 . I m m u n o e p i d e m i o l o g yo f m e n i n g o c o c c a l d i s e a s e i n m i l i t a r y r e c r u i t s . I I . B l o c k i n g o fs e r u n m b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y b y c i r c u l a t i n g I g A e a r l y i n t h e c o u r s eo f i n v a s i v e d i s e a s e . J . I n f e c t . D i s . 1 3 6 : 7 3 3 - 7 3 9 .5 . I H a r r i s o n , J . E . , a n d J . S c h u l t s . 1 9 7 6 . S t u d i e s o n t h e c h l o r i n a t i n g

a c t i v i t y o f m y e l o p e r o x i d a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 1 : 1 3 7 1 - 1 3 7 4 .6 . H u n g , T . - S . , R . E . H u r d , I . J . C h o p p a , P . S t e v e n s , D . H .S o l o m o n , a n d L . S . Y o u n g . 1 9 8 4 . I n h i b i t i o n o f p h a g o c y t o s i s a n dc h e m i l u m i n e s c e n c e i n human l e u k o c y t e s b y l i p i d - s o l u b l e f a c t o ri n n o r m a l t i s s u e . I n f e c t . I m m u n . 4 6 : 5 4 4 - 5 5 1 .7 . I w a s e , M . , T . K i m u r a , M. N a g a e , S . I t o , S . S a k u r a d a , a n d M.N a g u m o . 1 9 8 5 . T h e f u n c t i o n o f s a l i v a r y n e u t r o p h i l . J p n . J .P e r i o d o n t o l . 2 7 : 3 8 8 - 3 9 3 .8 . K l e b a n o f f , S . J . , a n d R . A . C l a r k . 1 9 7 8 . T h e n e u t r o p h i l f u n c t i o na n d c l i n i c a l d i s o r d e r s . E l s ev i e r / No r t h - Ho l l an d B i o m ed i c a lP r e s s , A m s t e r d a m .9 . K o w a s h i , Y . , F . J a c c a r d , a n d G . G i m a s o n i . 1 9 8 0 . S u l c u l a r PMNl e u k o c y t e s a n d g i n g i v a l e x u d a t e d u r i n g e x p e r i m e n t a l g i n g i v i t i si n m a n . J . P e r i o d o n t a l R e s . 1 5 : 1 5 1 - 1 5 8 .1 0 . L a n t z m a n , E . , a n d J . M i c h m a n . 1 9 7 0 . L e u k o c y t e c o u n t i n t h es a l i v a o f a d u l t s b e f o r e a n d a f t e r e x t r a c t i o n o f t e e t h . O r a l S u r g .O r a l M e d . O r a l P a t h o l . 3 0 : 7 7 3 - 7 7 6 .1 1 . M a r k e t , M . , P . C . A n d r e w s , a n d B . M. B a b i o r . 1 9 8 4 . O x y g e nr a d i c a l s i n b i o l o g i c a l s y s t e m s . M e a s u r e m e n t o f 0 2 - p r o d u c t i o nb y h u m a n n e u t r o p h i l s . T h e p r e p a r a t i o n a n d a s s a y o f NADPHo x i d a s e - c o n t a i n i n g p a r t i c l e s f r o m h u m a n n e u t r o p h i l s . M e t h o d sE n z y m o l . 1 0 5 : 3 5 8 - 3 6 3 .1 2 . M u s h e i , P . M . , A . G o r e e , R . E . B a u g h n , a n d H . H . B i r d s a l l .

1 9 8 4 . I m m u n o g l o b u l i n A f r o m b r o n c h o p u l m o n a r y s e c r e t i o n sb l o c k s b a c t e r i c i d a l a n d o p s o n i z i n g e f f e c t s o f a nt i b o d y t on o n t y p a b l e H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e . I n f e c t . I m m u n . 4 5 : 3 6 - 4 0 .1 3 . P a t r i c i a , A . , A . M u r r y , a n d M. R . P a t t e r s . 1 9 8 0 . G i n g i v a lc r e v i c e n e u t r o p h i l f u n c t i o n i n p e r i d o n t a l l e s i o n s . J . P e r i o d o n t a lR e s . 1 5 : 4 6 3 - 4 6 9 .1 4 . R e p i n e , J . E . , K . S . J o h a n s e n , a n d E . M. B e r g e r . 1 9 8 4 . H y d r o x y lr a d i c a l s c a v e n g e r s p r o d u c e s i m i l a r d e c r e a s e s i n t h e c h e m i l u m i -n e s c e n c e r e s p o n s e a n d b a c t e r i c i d a l a c t i v i t i e s o f n e u t r o p h i l s .I n f e c t . I m m u n . 4 3 : 4 3 5 - 4 3 7 .1 5 . R o b e l s t a d , G . H . 1 9 6 4 . S a l i v a r y c o r p u s c l e a c t i v i t y . J . Am . D e n t .A s s o c . 6 8 : 3 6 4 - 3 7 3 .1 6 . S a r r y , J . J . , a n d B . K r a s s e . 1 9 6 0 . O b s e r v a t i o n o n t h e o r i g i n o fs a l i v a r y l e u k o c y t e s . A c t a O do n t o l . S c a nd . 1 8 : 3 4 7 - 3 5 8 .1 7 . S c h i o t t , C . R . , a n d H . L o e . 1 9 7 0 . T h e o r i g i n a n d v a r i a t i o n i nn u m b e r o f l e u k o c y t e s i n t h e h u m a n s a l i v a . J . P e r i o d o n t a l R e s . 5 :3 6 - 4 1 .1 8 . S c u l l y , C . 1 9 8 2 . P h a g o c y t i c a n d k i l l i n g a c t i v i t y b y human b l o o d ,g i n g i v a l , c r e v i c u l a r , a n d s a l i v a r y p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o -c y t e s f o r o r a l s t r e p t o c o c c i . J . D en t . R es . 6 1 : 6 3 6 - 6 3 9 .1 9 . S e i t z , W. R . 1 9 7 5 . C h e m i l u m i n e s c e n c e f r o m r e a c t i o n b e t w e e nh y p o c h l o r i d e a n d l u m i n o l . J . P h y s . C h e m . 7 9 : 1 0 1 - 1 0 6 .2 0 . S i m o n , G . L . , H . G . M i l l e r , a n d D . G . B o r e n s t e i n . 1 9 8 3 . S y n o v i a lf l u i d i n h i b i t s k i l l i n g o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s b y n e u t r o p h i l s .I n f e c t . I m m u n . 4 0 : 1 0 0 4 - 1 0 1 0 .

2 1 . S o n i s , S . T . , D . M i r a n d o , P . S t e l a s , a n d L . B . L a m s t e r . 1 9 7 9 .C a p a c i t y o f human o r a l l e u k o c y t e s t o m e d i a t e a n t i b o d y - d e p e n -d e n t c e l l - m e d i a t e d c y t o t o x i c i t y . A r c h . O r a l B i o l . 2 4 : 2 3 5 - 2 3 7 .2 2 . S p i t z n a g e l , J . K . 1 9 7 8 . A n t i b a c t e r i a l m e c h a n i s m o f p o l y m o r p h o -n u c l e a r l e u k o c y t e s , p . 3 9 1 - 4 1 1 . I n I . K l e i n b e r g , S . A . E l l i s o n ,a n d I . D . M a n d e l ( e d . ) , S a l i v a a n d d e n t a l c a r i e s . I n f o r m a t i o nR e t r i e v a l , I n c . , Ne w Y o r k .2 3 . T a i c h m a n , N . S . , C . T s a i , P . C . B a e h n i , N . S t o l l e r , a n d W. P .M c A r t h u r . 1 9 7 7 . I n t e r a c t i o n o f i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d o r a lm i c r o o r g a n i s m s . I V . I n v i t r o r e l e a s e o f l y s o s o m a l c o n s t i t u e n t sf r o m p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s e x p o s e d t o s u p r a g i n g i v a la n d s u b g i n g i v a l p l a q u e . I n f e c t . I m m u n . 1 6 : 1 0 1 3 - 1 0 2 3 .2 4 . Van E p p s , D . E . , a n d R . C . W i l l i a m s . 1 9 7 6 . S u p p r e s s i o n o fl e u k o c y t e c h e m o t a x i s b y h u m a n I g A m y e l o m a l c o m p o n e n t s . J .E x p . M e d . 1 4 4 : 1 2 2 7 - 1 2 4 0 .2 5 . Van E p p s , D . E . , K . R e e d , a n d R . C . W i l l i a m s , J r . 1 9 7 8 .S u p p r e s s i o n o f human PMN b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y b y human I g Ap a r a p r o t e i n . C e l l . I m m u n o l . 3 6 : 3 6 3 - 3 7 6 .2 6 . W e b b , I . S . , B . B . K e e l e , J r . , a n d B . B . J o h n s t o n . 1 9 7 4 .I n h i b i t i o n o f p h a g o c y t o s i s - a s s o c i a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e b ys u p e r o x i d e d i s m u t a s e . I n f e c t . I m m u n . 9 : 1 0 5 1 - 1 0 5 6 .2 7 . W e i s m a n n , C . , R . B . Z u r i e r , P . J . S p i e l e r , a n d I . M. G o l d s t e i n .1 9 7 1 . M e c h a n i s m s o f l y s o s o m a l e n z y m e r e l e a s e f r o m l e u k o -c y t e s e x p o s e d t o i m m u n e c o m p l e x e s a n d o t h e r p a r t i c l e s . J . E x p .M e d . 1 3 4 : 1 4 9 S - 1 6 5 S .2 8 . W i l t o n , J . M. A . 1 9 7 8 . S u p p r e s s i o n b y I g A o f I g G - m e d i a t e dp h a g o c y t o s i s b y human p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s . C l i n .E x p . I m m u n o l . 3 4 : 4 2 3 - 4 2 8 .2 9 . W i l t o n , J . M. A . , H . H . R e n g g l i , a n d T . L e h n e r . 1 9 7 7 . Af u n c t i o n a l c o m p a r i s o n o f b l o o d a n d g i n g i v a l i n f l a m m a t o r y p o l y -m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s i n m a n . C l i n . E x p . I m m u n o l . 2 7 : 1 5 2 -1 5 8 .3 0 . W i l t o n , J . M. A . , H . H . R e n g g l i , a n d T . L e h n e r . 1 9 7 7 . T h e r o l eo f F c a n d C 3 b r e c e p t o r s i n p h a g o c y t o s i s b y i n f l a m m a t o r yp o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s i n m a n . I m m u n o l o g y 3 2 : 9 5 5 -9 6 1 .3 1 . W o o l w e v e r , D . A . , G . G . K o c h , J . J . C r a w f o r d , a n d R . L .L u n d b l a d . 1 9 7 2 . R e l a t i o n o f o r o g r a n u l o c y t i c m i g r a t i o n r a t e t op e r i o d o n t a l d i s e a s e a n d b l o o d l e u k o c y t e s c o u n t . A c l i n i c a ls t u d y . J . D e n t . R e s . 5 1 : 9 2 9 - 9 3 9 .

I N F E C T . I M M U N .