Paparan jangka panjang untuk konsentrasi yang relevan lingkungan progesteron dan norgestrel mempengaruhi diferensiasi seks di ikan zebra (Danio rerio)Yan-Qiu Liang, Guo-Yong Huang, Shuang Shuang-Liu, Jian-Liang Zhao, Yuan-Yuan Yang, Xiao-Wen Chen , Fei Tian, Yu-Xia Jiang, Guang-Guo Ying *Negara Kunci Laboratorium Organik Geokimia, CAS Pusat Penelitian Pencemaran Lingkungan dan Pengendalian PRD, Guangzhou Institut Geokimia, Cina Academy of Sciences, Guangzhou 510640, PR Chinaarticleinfosejarah Article: Menerima 5 Desember 2014 Diterima dalam bentuk direvisi 7 Januari 2015 Diterima 8 Januari 2015 Tersedia online 12 Januari 2015Keywords: Seks gangguan diferensiasi endokrin Norgestrel ProgesteronAbstrakTujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh progestin pada diferensiasi kelamin ikan zebra dengan mengukur sex ratio dan transkripsi gen yang terkait dengan diferensiasi seks (AMH, Dmrt1, Figa, Sox9a dan Sox9b gen) serta kadar hormon seks dan profil ekspresi transkripsi sepanjang hipotalamus-hipofisis-gonad (HPG) dan hipotalamus-hipofisis-adrenal (HPA ) sumbu dalam ikan zebra remaja. Pemaparan ikan zebra sampai 4, 33, 63 ng L-1 progesteron (P4) atau 4, 34, 77 ng L-1 norgestrel (NGT) dimulai pada 20 hari pasca fertilisasi (DPF) dan berakhir pada 60 dpf. Hasil penelitian menunjukkan bahwa paparan P4 menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam proporsi perempuan serta down-regulasi yang signifikan dari gen AMH dan up-regulasi Figa pada konsentrasi 63 ng L-1. Namun, pergeseran rasio jenis kelamin laki-laki terhadap diamati paparan berikut untuk 34 dan 77 ng L-1 NGT, yang datang bersama dengan induksi signifikan gen Dmrt1 dan penghambatan gen Figa. Hormon seks pada ikan terkena diukur dengan estrone yang terdeteksi hanya dalam ikan terkena konsentrasi P4 tertinggi; sedangkan estradiol dan androstenedion terdeteksi hanya dalam ikan kontrol dan konsentrasi NGT terendah. Selain itu, peningkatan pada wanita dikaitkan dengan up-regulasi yang signifikan dari beberapa gen kunci mengendalikan sintesis hormon seks (yaitu, Cyp17, Cyp19a1a dan Hsd3b) setelah paparan 63 ng L-1 P4 sedangkan down-regulasi yang signifikan Cyp11a1 , Cyp17, Cyp19a1a dan gen Hsd3b diamati dalam populasi-bias laki-laki disebabkan oleh 34 dan 77 ng L-1 NGT. Hasil keseluruhan menyiratkan bahwa baik P4 dan NGT signifikan dapat mempengaruhi diferensiasi seks di ikan zebra, dan bahwa perubahan dapat tercermin oleh tingkat hormon seks berubah dan profil ekspresi transkripsi gen yang terkait dengan sintesis hormon seks. 2015 Elsevier All rights reserved.Singkatan : NGT, norgestrel; P4, progesteron; AMH, anti-Mullerian hormonal Depdiknas; Dmrt1, doublesex dan mab-3 transkripsi terkait faktor 1; Figa, faktor dalam alpha germline; Sox9a, sry terkait mobilitas tinggi box group-9a; Sox9b, sry- terkait kelompok mobilitas tinggi kotak-9b; PGR, reseptor progesteron; Esr1, reseptor estrogen 1; Vtg1, vitellogenin 1; Ar, androgen reseptor; Mr, reseptor mineralokortikoid; Gr, reseptor glukokortikoid; Star, steroidogenik protein regulator akut; Enzim pembelahan Cyp11a1, sitokrom P450-dimediasi rantai samping, Cyp17, hidroksilase 17-alpha / 17,20-liase; Cyp19a1a, ovarium sitokrom P450 aromatase; Cyp11b, 11-beta-hidroksilase; Hsd3b, hidroksisteroid dehidrogenase 3-beta; Hsd20b, hidroksisteroid dehidrogenase 20-beta; Hsd17b3, hidroksisteroid 17-beta drogenase dehidrasi tipe 3; Hsd11b2, hidroksisteroid 11-beta dehidrogenase 2; Gnrh2, gonadotropin-releasing hormone 2; Gnrh3, gonadotropin-releasing hormone 3; Fshb, hormon perangsang folikel, beta polipeptida; Lhb, luteinizing hormone, beta polipeptida; CRH, kortikotropin releasing hormone; POMC, proopiomelanocortin.*Penulis korespondensi. Tel .: +86 20 85290200; fax: +86 20 85290200. alamat E-mail: guangguo.ying@gmail.com, guang-guo.ying@gig.ac.cn (G.-G. Ying)1..PendahuluanFarmasiManusia hadir dalam lingkungan air telah menarik perhatian luas karena beberapa dari mereka dapat menyebabkan efek merugikan pada organisme akuatik (Corcoran et al, 2010;.. Fent et al, 2006;. Kloas et al, 2009). Steroid alami dan sintetis telah dikenal sebagai salah satu kelas yang paling aktif farmasi, tetapi kebanyakan studi berfokus pada efek samping estrogen dan androgen, misalnya, feminisasi orang bodoh minnow dan pression dukungan dari perilaku seksual di medaka Jepang laki-laki dengan estrogen (Kidd et al, 2007;.. Oshima et al, 2003), dan isasi masculin- ireversibel dalam ikan zebra yang disebabkan oleh androgen (Morthorst et al, 2010.). Namun, sangat sedikit perhatian telah dibayarkan kepada efek ekotoksikologi disebabkan oleh progestin.Progesteron alami (P4) terutama berasal dari ekskresi (feses dan urin) manusia dan hewan, dan itu adalah pentinghttp://dx.doi.org /10.1016/j.aquatox.2015.01.006 0166-445X / 2015 Elsevier All rights reservedjurnal:.homepage www.elsevier.com/locate/aquatoxAquatic Toxicology 160 (2015) 172-179daftar Isi tersedia di ScienceDirectAquatic Toxicology

Y.-Q. Liang et al. / Aquatic Toksikologi 160 (2015) 172-179 173regulator pertumbuhan oosit dan pematangan. P4 juga digunakan dalam terapi pengganti hormonal Depdiknas pada manusia. Progestin sintetis, termasuk norgestrel (NGT), telah digunakan secara luas dalam ceptives lisan kontrasepsi, implan kontrasepsi, intrauterine device, cincin vagina dan juga bahan-bahan farmasi aktif untuk penggunaan klinis pada manusia (Han et al, 2000;. Kejuan et al ., 2007; Qureshi dan Attaran, 1999). Progestin alami dan sintetis terjadi pada lingkungan karena penghapusan lengkap mereka di pabrik pengolahan air limbah dan ekskresi langsung hewan dan debit langsung pemboros (Liu et al., 2012b). P4 dan NGT ditemukan di permukaan air pada konsentrasi hingga 199 ng-L 1 dan 22 ng-L 1, masing-masing (Kolpin et al, 2002;. Liu et al, 2011.). Dalam pengolahan air limbah kota limbah pabrik, P4 dan NGT terdeteksi pada konsentrasi 1 dan 11ngL-1, masing-masing (Liu et al., 2012b). Selain itu, P4 dan NGT terdeteksi di perairan permukaan penerima peternakan babi dengan konsentrasi sampai 30,5 dan 465 ng L-1, masing-masing (Liu et al., 2012c). Selanjutnya, P4 dan NGT juga terdeteksi di perairan siram peternakan babi dan sapi perah dengan konsentrasi yang relatif tinggi hingga 3470-11900 ng-L 1 dan 10800-6460 ng-L 1, masing-masing, karena bahan kimia ini sering digunakan untuk mengontrol preg - nancy waktu hewan di industri peternakan (Liu et al, 2012a, c.). Residu Lingkungan P4 dan NGT dapat menimbulkan potensi risiko untuk organisme air dalam lingkungan air menerima2013a;...Sampai saat ini, beberapa studi telah melaporkan efek reproduksi P4 (Blthgen et al, DeQuattro et al, 2012; Murack et al. 2011) dan sintetis progestin (Han et al, 2014;. Paulos et al, 2010;.. Runnalls et al, 2013; Zeilinger et al, 2009) pada ikan pada konsentrasi rendah.. Namun, efek progestin seks entiation berbeda dalam ikan masih belum jelas. Dalam mengembangkan ikan, keseimbangan antara estrogen dan androgen berperan penting dalam perjalanan diferensiasi seks. Misalnya, paparan estrogen atau androgen selama pengembangan awal ikan zebra mengakibatkan perubahan rasio jenis kelamin terhadap perempuan atau laki-laki, masing-masing (Baumann et al, 2013;. Holbech et al, 2006.). The pro sintetis gestin levonorgestrel telah dilaporkan kimia androgenik kuat dalam stickleback tiga spined, termasuk induksi biasanya laki-laki tertentu spiggin protein lem dan penindasan vitellogenin hati pada wanita (Svensson et al., 2013), dan disrup - (. Svensson et al, 2014) tion dari siklus reproduksi yang tergantung androgen pada laki-laki. Dalam uji in vitro berbasis Yeast lanjut menunjukkan beberapa progestin sintetis (misalnya, levonorgestrel, norethindrone, Gestodene, drospirenone, desogestrel dan medroksiprogesteron asetat) menunjukkan aktivitas androgenik (Runnalls et al., 2013). NGT adalah campuran rasemat dari dua isomer optik yang disebut enansiomer, yaitu, levonorgestrel dan dextronorgestrel. Selain itu, levonorgestrel adalah satu-satunya isomer bioaktif dalam campuran rasemat NGT. Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa NGT juga kimia dengan aktivitas androgenik, mirip dengan levonorgestrel. P4 juga memiliki aktivitas androgenik yang lemah karena lemah berikatan dengan reseptor androgen (Ellestad et al., 2014). Selain itu, pengobatan P4 diubah ekspresi transkripsi gen yang terlibat dalam kegiatan steroid hormon reseptor, ritme sirkadian, siklus sel, hipertrofi jantung dan reproduksi (Zucchi et al., 2012, 2013). Namun, sejauh ini, efek dari P4 dan NGT pada diferensiasi seks yang sebagian besar tidak diketahui. Oleh karena itu, perlu untuk menilai dan memahami efek samping dari P4 dan NGT pada diferensiasi seks pada ikan.Sebagai ikan protogynic, ikan zebra adalah model vertebrata penting untuk meneliti efek kimia pada diferensiasi seks. Sekitar 10 hari pasca fertilisasi (DPF) diferensiasi gonad dimulai dan ikan zebra mengembangkan gonad ovarium seperti, terlepas dari latar belakang kromosom. Sekitar 20 DPF, sekitar 50% ovarium akan berubah menjadi testis bersamaan dengan apoptosis ovarium. Pada periode pembangunan sebagai berikut, pengembangan ovarium dan pematangan ikan terus (von Hofsten dan Olsson, 2005). Pengembangan gonad selesai pada kira-kira 60 DPF bawah kontrol hormon. Beberapa penelitian melaporkan bahwapaparan dari ikan zebra menjadi estrogen atau androgen dalam fase sensitif transformasi gonad menyebabkan perubahan dari rasio jenis kelamin (Holbech et al, 2006;. Orn et al, 2003.). Oleh karena itu, rasio jenis kelamin digunakan sebagai titik akhir yang penting untuk evaluasi seks diferensiasi berikut paparan progestin 20 sampai 60 dpf.Diferensiasi seks ikan zebra berbeda dari mamalia, karena tidak ada kromosom seks dan gen penentuan jenis kelamin telah iDEN- tified dalam ikan zebra sampai sekarang. Namun, beberapa gen, seperti AMH, Dmrt1, Figa, Sox9a dan Sox9b, telah dikaitkan dengan pro- cess diferensiasi seks di ikan zebra. Pada mamalia, anti-Mullerian hormone (AMH), yang diproduksi oleh sel Sertoli, memulai degenerasi saluran Mullerian dan menghambat enzim aromatase yang con- verts androgen menjadi estrogen dalam gonad (von Hofsten dan Olsson, 2005). Meskipun ikan zebra tidak memiliki saluran Mullerian, fungsi AMH lain mungkin penting untuk diferensiasi laki-laki. Jenis kelamin menentukan gen DMY (juga disebut sebagai Dmrt1y) terletak pada kromosom Y dalam medaka Jepang dan berasal dari duplikasi Dmrt1, yang menunjukkan bahwa gen Dmrt1 juga penting untuk pengembangan testis (Jorgensen et al., 2008). Selanjutnya, AMH dan Dmrt1 disajikan pada tingkat tinggi selama diferensiasi testis dan diekspresikan pada tingkat rendah atau tidak diungkapkan atau bawah-diatur selama diferensiasi ovarium pada ikan zebra (Jorgensen et al, 2008;. Schulz et al, 2007;. Von Hofsten dan Olsson 2005). Figa memainkan peran penting dalam pembentukan folikel ovarium dan merupakan gen efisien stabil dan terdistribusikan dinyatakan secara khusus dalam germline perempuan ikan zebra, dan dengan demikian hal ini berguna untuk penilaian pengembangan perempuan (Jorgensen et al, 2008;. Onichtchouk et al ., 2003). Sox9 The (Sry- terkait kelompok mobilitas tinggi kotak-9) keluarga gen mengkode beragam regulator perkembangan yang terlibat dalam diferensiasi seks, yang ditandai dengan adanya kelompok mobilitas tinggi DNA-binding (HMG) domain dengan setidaknya 50% kesamaan dengan yang Sry, jenis kelamin faktor penentu pada kromosom Y (Jorgensen et al, 2008;. Wegner, 1999). Dalam ikan zebra dewasa, Sox9a transkrip diamati pada testis sedangkan ekspresi Sox9b berlimpah terlihat dalam ovarium. Pola ekspresi yang berbeda dari dua gen Sox9 menyarankan mereka memiliki fungsi yang unik selama diferensiasi seks (Chiang et al, 2001;.. Jorgensen et al, 2008). Sejak AMH, Dmrt1, Figa, Sox9a dan Sox9bare terlibat dalam diferensiasi seks, tingkat ekspresi transkripsi dari lima gen diselidiki dalam penelitian ini. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai efek dari terpajan yakin ikan zebra remaja ke tingkat lingkungan P4 atau NGT pada diferensiasi seks. Rasio jenis kelamin dan ekspresi transkripsi gen yang terkait dengan diferensiasi seks digunakan sebagai titik akhir untuk evaluasi diferensiasi seks. Selain itu, konsentrasi yang hormon seks dan profil ekspresi transkripsi gen target sepanjang hipotalamus-hipofisis-gonad (HPG) dan hipotalamus-hipofisis-adrenal (HPA) kapak ikan zebra juga diukur untuk mengidentifikasi mode potensi tindakan P4 dan NGT pada diferensiasi seks.2. Bahan dan metode2.1. KimiaKimia progesteron standar (P4, CAS 57-83-0, kemurnian 98%) dibeli dari Tokyo Chemical Industry (Shanghai, Cina). Norgestrel (NGT, CAS 6533-00-2, kemurnian 100%) diperoleh dari US Pharmacopeia (Rockville, MD). Larutan stok (1 mg mL-1) untuk masing-masing senyawa yang dilarutkan dalam 100% etanol dan kemudian disimpan pada -20 C dalam gelap.2.2. Spesies uji dan desain eksperimentalikan zebra Juvenile (Danio rerio) diperoleh dari pemijahan dewasa ditempatkan dalam kelompok 6 laki-laki dan 3 perempuan. Telur dibuahi baru dikumpulkan dan dipindahkan ke dalam cawan petri, dan disimpan pada

174 Y.-Q. Liang et al. / Aquatic Toksikologi 160 (2015) 172-17926 1 C dengan penyinaran dari 14 jam: 10 jam terang: gelap. Embrio biasanya menetas sekitar 3 hari setelah pembuahan (DPF) tapi tidak perlu diberi makan sampai 4 DPF. Pada saat itu, larva diberi makan dengan solusi ent nutrisi yang dua kali sehari sampai 18 dpf mana makanan diganti dengan yang baru menetas bayi udang air garam (Tianjin, Cina). Solusi ent nutrisi yang dibuat dengan homogenat jaringan udang air garam danpenyaringan.Pemaparan ikan zebra terhadap bahan kimia tesDimulai pada 20 dpf dan berakhir pada 60 dpf. Untuk setiap meniru, 20 ikan secara acak ditempatkan dalam tangki kaca 5L mengandung 1-2L disaring dan soda air keran (1 L antara 20 sampai 40 DPF, 2 L dari 40 DPF 60 DPF). Empat tank mereplikasi dimasukkan untuk setiap perlakuan. Ikan zebra yang terkena P4 atau NGT pada konsentrasi nominal 0, 5, 50 dan 100 ng-L 1 (0, 15,9, 159, 318 pmol L-1 P4, atau 0, 16, 160, 320 pmol L-1 NGT). Etanol digunakan sebagai pelarut untuk bahan kimia tes pada konsentrasi 0,001%, sehingga kontrol dan paparan kelompok pelarut menerima 0.001% (v / v) etanol saja. Percobaan dilakukan dalam sistem semi-statis di 26 1 C dengan 14h a: light 10h / siklus gelap. Air pengobatan tangki diperbaharui setiap hari. Konduktivitas (146-164uscm-1), pH (6,84-7,26) dan konsentrasi oksigen (75%) tercatat setiap lima hari untuk memastikan kualitas air eksposur. Mati ikan di semua tangki pengobatan dicatat dan dihapus setiap hari selama fase eksposur. Pada 60 DPF, 12 ikan untuk setiap ulangan (n = 4) secara acak diambil dan dibius dengan 0,01% tricaine sulfonate methane- (MS-222, Sigma-Aldrich). Total panjang tubuh (cm) dan berat basah (g) segera diukur untuk menghitung faktor kondisi (K-factor = (basah berat / total length3 tubuh) 100). Kemudian, 5 ikan per mereplikasi disimpan pada -80 C untuk pengujian hormon seks dan 4 ekor per ulangan yang homogen dengan menggunakan ulekan dalam nitrogen cair untuk ekstraksi RNA berikutnya, dan 3 ikan lainnya per mereplikasi juga disimpan pada -80 C untuk cadangan. Meskipun diferensiasi seksual remaja pada dasarnya lengkap pada 60 dpf, rasio jenis kelamin akhir ditentukan sampai ikan zebra mencapai tahap dewasa mereka di 140 DPF untuk melihat efek dari paparan progestin pada tahap remaja. Jadi setelah 60 DPF, sisa ikan dipindahkan ke air bersih dan dipelihara dalam kondisi yang sama hingga 140DPF. Pada saat itu, ikan zebra dewasa dibius dan dibedah untuk penyelidikan rasio jenis kelamin. Rasio jenis kelamin ditentukan secara morfologis menurut metode sebelumnya oleh Brion et al. (2004). Ovarium adalah struktur bilobed yang tergantung di rongga tubuh oleh mesovarium vascularized dalam ikan betina, dan testis yang panjang, sementara, organ dipasangkan yang melekat pada dinding tubuh dorsal dalam ikan jantan (Gupta dan Mullins, 2010 ).2.3. Transkripsi analisis ekspresiRNA isolasi, cDNA sintesis dan kuantitatif real-time poli rantai merase reaksi (QRT-PCR) dilakukan sesuai dengan metode kami sebelumnya (Liang et al., 2015a). Secara singkat, RNA total diekstraksi dari 4 ikan dari masing-masing tangki menggunakan Trizol reagen (Invitro- gen) seperti yang dijelaskan oleh produsen. Kualitas RNA total ditentukan dengan menggunakan elektroforesis pada gel agarosa diwarnai dengan gelred (Biotium, USA). Konsentrasi RNA ditentukan pada 260 nm dengan menggunakan SmartSpecTM Ditambah Spektrofotometer (Bio-Rad USA), dan kemurnian dianalisis dari absorbansi pada 260 nm dan 280 nm (satu 260/280 rasio 1.83~ 2.03 untuk semua sampel RNA). Semua sampel RNA diencerkan dengan air nuklease bebas sampai 80 g mL-1 untuk sintesis DNA komplementer (cDNA). Sekitar 500ng dari RNA total terbalik ditranskrip ke cDNA menggunakan ReverTra Ace qPCR RT Guru Mix dengan gDNA Remover (Toyobo) dalam total sukarela ume dari 50 L sesuai dengan instruksi pabrik. Pertama untai cDNA terdilusi menjadi volume akhir 200 L dengan menambahkan 150 L nuklease bebas air, dan disimpan pada suhu -20 C untuk selanjutnya QRT-PCR.Reaksi Semua QRT-PCR dianalisis pada Biosys- Terapan tems ViiATM 7 Dx (ABI) menggunakan THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo) dalam volume akhir 20 L, yang berisi 10 L dari THUN- DERBIRD SYBR qPCR Mix 0,4 L dari masing-masing maju dan mundur primer (10 M), 2.5 L sampel cDNA dan 6,7 L nuklease bebas air. Tabel 1 terdaftar urutan primer target dan rumah tangga menjaga gen. Semua primer dirancang dengan menggunakan program Primer Premier 5.0 dan disintesis oleh Invitrogen (Cina). Efisiensi tion amplifica- semua primer adalah antara 95% dan 107%.Tabel1 Primer untuk kuantitatif real-time PCR ikan zebra(5-3).Gene Rasa primer (5 -3) Antisense primer Nomor GenBankAMH TTCCTCCACGCCGACTGTAT CCTGCCTCCTGCTGTTTGAC NM 001.007.779,1 Dmrt1 TTTACCAGCCCACTCCATACTC AGGCGGCCATTTCCACTAG AF439562.1 Figa CGACACGGAGGACCGAGATA GGCACAATACGCCGAAGATAC NM 198.919,2 Sox9a GCCAGGCAAAGCGGATCT GCGGGAGGTATTGGTCAAACT NM 131.643,1 Sox9b CGAGAAGCGTCCGTTTGTG CCGTCTGGGCTGGTATTTGTA NM 131.644,1 PGR AGGCTTCTGGTTGTCATTATGG TCCGGCGCACAGGTAGTTA NM 001.166.335,1 Esr1 ACTCTCACCCATGTACCCTAAGG CGGGTAGTATCCCACTGAAGC NM 152.959,1 Vtg1 CCTTGGAGAAAATTGAGGCTATC CTGAATGAACTCGGGAGTGGTA NM 001.044.897,2 Ar CCACGAACCCCCGTTTATCT TCCATCCATTCGCCCATCT NM 001.083.123,1 Mr ATCGGCTTGGATGCTATGG TGGCTCGGTCTTAATGTGAGTTA EF567113.1 Gr TCACCACTTCAAGCGGACAG GCTCCTGCTCCAACCATCTC EF567112.1 Bintang GCCTGAGCAGAAGGGATTTG CCACCTGGGTTTGTGAAAGTAC NM 131.663,1 Cyp11a1 GAGGGGTGGACTCGGTTACTT GCAATACGAGCGGCTGAGAT AF527755.1 Cyp17 CTGCTCTGTTTAAGCCTGTTCTC GCTGGCACAAATCCATTCATC AY281362.1 Cyp19a1a CGGGACTGCCAGCAACTACT TGAAGCCCTGGACCTGTGAG NM 131.154,2 Cyp11b CTGGGCCACACATCGAGAG AGCGAACGGCAGAAATCC DQ650710.1 Hsd3b AGCCCATTCTGCCCATCTT TGCCTCCTCCCAGTCATACC AY279108.1 Hsd20b TGGAGAACAGGCTGAGGTGAC CGTAGTATCGGCAGAAGAGCAT AF298898.1 Hsd17b3 ACATTCACGGCTGAGGAGTTT ATGCTGCCATACGTTTGGTC AY551081.1 Hsd11b2 CAACCCCAGGTGCGATACTAC GCACGAGGCATCACTTTCTTCT NM 212.720,2 Gnrh2 GGTCTCACGGCTGGTATCCT TGCCTCGCAGAGCTTCACT NM 181.439,4 Gnrh3 TGGTCCAGTTGTTGCTGTTAGTT CCTGAATGTTGCCTCCATTTC NM 182.887,2 Fshb GCAGGACTATGCTGGACAATG CCACGGGGTACACGAAGACT NM 205.624,1 Lhb GGCTGGAAATGGTGTCTTCTT GGAAAACGGGCTCTTGTAAAC NM 205.622,2 CRH GTCTGTTGGAGGGGAAAGTTG CATTTTGCGGTTGCTGTGAG BC085458.1 POMC GAGGGGAGTGAGGATGTTGTGT TCGGAGGGAGGCTGTAGATG AY158003.1 -actin TCTGGCATCACACCTTCTACAAT TGTTGGCTTTGGGATTCAGG AF057040.1 RpL13 CCCTTCCCGTGGATCATATC TTTGCGTGTGGGTTTCAGAC NM 212.784,1 EF1- GAGGAAATCACCAAGGAAGTCA AATCTTCCATCCCTTGAACCAG BC064291.1

Y.-Q. Liang et al. / Aquatic Toksikologi 160 (2015) 172-179 175100(A)Laki-laki Perempuan(B)Laki-lakiPerempuan%%

N = 23N = 20N = 27 N = 22 N = 23 Kontrol 4 33 63konsentrasi progesteron(*

100**** 808060604040202000Kontrol N = 234 N = 27 N = 25 34 77 ng-L1)konsentrasi Norgestrel (ng-L 1)Gambar. 1. Rasio jenis kelamin ikan zebra setelah terpapar progesteron (A) atau norgestrel (B) 20 sampai 60 hari pasca fertilisasi. Rasio jenis kelamin diukur dengan identifikasi seks gonad pada ikan 140-hari-tua. N menunjukkan jumlah total ikan dari empat tangki mereplikasi dalam setiap kelompok perlakuan. Dibandingkan dengan kontrol pelarut, perbedaan yang signifikan secara statistik ditandai dengan tanda bintang (* p 0,05, ** p 0,01, dan *** p 0.001).QRT-PCR amplifikasi dilakukan selama 1 menit pada 95 C, diikuti 40 siklus 15 dan 60 s pada 95 C dan 60 C, masing-masing. Meleleh ing analisis kurva dari 60 C sampai 95 C dilakukan untuk memastikan kekhususan masing-masing amplikon. The -actin, RpL13 dan EF1- dipilih sebagai gen acuan untuk normalisasi karena ekspresi mereka sta- ble antara kontrol dan kelompok perlakuan pelarut (ANOVA, p> 0,05). Selain itu, normalisasi oleh beberapa gen reference diperlukan untuk mengukur tingkat transkripsi akurat (Vandesompele et al., 2002). Oleh karena itu, rata-rata nilai Ct (threshold siklus) dari -actin, RpL13 dan EF1- dipekerjakan sebagai acuan untuk menormalkan ekspresi mRNA dari gen target. Tingkat ekspresi transkripsi relatif setiap gen untuk sol kontrol ventilasi dianalisis menggunakan metode 2- Ct (Livak dan Schmittgen, 2001).2.4. Assay hormon seksLima individu ikan dari masing-masing ulangan yang homogen dan diekstraksi dengan metanol 15ml / 0,1 M larutan asam asetat-natrium asetat penyangga (1: 1, v / v) dengan ultrasonikasi selama 10 menit dan kemudian disentrifugasi pada 9391 g selama 10 menit pada 4 C. The supernatan dipindahkan ke labu alas bulat 250 mL. Sampel ikan diambil lagi dan supernatan dari dua ekstraksi digabungkan. Ekstrak dalam labu alas bulat dari per mereplikasi terdilusi menjadi volume akhir 200ml dengan Milli-Q air untuk menjaga konsentrasi metanol dalam larutan di bawah 5%. Solusi berair sampel ekstrak ikan dianalisis menurut metode kami sebelumnya (Liu et al., 2011). Secara singkat, solusi berair sampel ekstrak ikan diperkaya melalui ekstraksi fase padat menggunakan kartrid HLB (6 mL, 500 mg). Kartrid kemudian dikeringkan di bawah air selama sekitar 2 jam sebelum elusi dengan 10 mL etil asetat. Solusi yang dielusi dikeringkan di bawah aliran lembut nitrogen dan kembali dilarutkan dalam 0,4 mL metanol untuk analisis instrumental. Konsentrasi androstenedion dan testosteron diukur dengan cepat solusi atau keinginan pencadangan cair kromatografi-electrospray ionisasi tandem spektrometri massa (RRLC-MS / MS) (Agilent 1200 LC-Agilent 6460QQQ, USA). Untuk meningkatkan sensitivitas, metode naik derivatisasi pentafluorobenzoyl chlo- diaplikasikan pada kuantifikasi estrone dan estradiol dalam ekstrak sebelum analisis dengan spektrometri massa kromatografi gas dengan bahan kimia negatif ion- isasi (GC-NCI-MS) (Agilent 6890N / 5975B, USA) seperti yang dijelaskan oleh Zhao et al. (2009). Batas deteksi (LOD) dari androstene- dion, testosteron, estrone dan estradiol dalam sampel ikan 0,10 ng g-1, 0.10ngg-1,-0.20ngg 1 dan 0,20 ng-g 1, masing-masing. Perolehan kembali dicapai untuk androstenedion, testosteron, estrone dan estradiol dalam sampel biota berduri (50 ng g-1) adalah 103%, 86%, 116% dan 88%, masing-masing.2.5. Pengukuran P4 dan NGT konsentrasi dalam solusi paparanSejak solusi paparan yang diperbarui setiap hari, sampel air (500 ml, n = 4 tank mereplikasi) secara acak dikumpulkan sekali pada 50 dpf dari semua kelompok perlakuan pada awal paparan (0 h) dan sebelum pembaharuan air (24 jam). Tank 1 dan 2 dicampur bersama-sama sebagai sampel komposit pertama di setiap titik waktu. Demikian pula, tank 3 dan 4 juga dicampur bersama-sama sebagai komposit kedua sam ple. Senyawa sasaran P4 dan NGT diekstraksi dari sampel air dengan menggunakan ekstraksi fase padat (SPE) dan kemudian dianalisis dengan RRLC-MS / MS (Liu et al., 2011). Para LODs untuk P4 dan NGT adalah 0,05 ng-L 1 dan 0,04 ng-L 1, masing-masing (Liu et al., 2011). Para Eries lihan ditentukan oleh spiking air permukaan dengan jumlah yang telah diketahui P4 dan NGT (5 dan 100 ng-L 1), adalah 92,4-102% dan 87,5-96,8%, masing-masing (Liu et al., 2011).2.6. Analisis statistikstatistik SPSS software (versi 13.0) digunakan untuk semua statistik yang analisis vertikal. Kolmogorov-Simirnov dan tes Levene digunakan untuk menguji normalitas dan homogenitas varians, masing-masing. Jika perlu, data mentah ditransformasikan untuk memenuhi asumsi analisis satu arah varians (ANOVA). Signifikansi perbedaan-perbedaan dalam ekspresi mRNA relatif dan produksi hormon seksTabel 2 Konsentrasi nominal dan diukur dari dua progestin dalam percobaan eksposur.Waktu Compound Exposure (h) konsentrasi Nominal (ng-L 1)0 5 50 100 Progesteron 0 0 5.27 43,34 0,30 0.03b 82,53 0,06 24 0 3,68 0,36 21,71 1,46 43,90 7,50 Rata-rata 0 4,48 0,20 32,53 0,88 63,22 3,78 Norgestrel 0 0 4,42 0,20 34,76 0,71 78,36 4,43 24 0 4.00 0,06 32,66 0,71 76,18 2.81 Rata-rata 0 4,21 0,13 33,71 0,71 77,27 3.62waktu pajanan (0 h dan 24 h). b konsentrasi Terukur diberikan sebagai rata-rata SD (n = 2 ulangan).

176 Y.-Q. Liang et al. / Aquatic Toksikologi 160 (2015) 172-179Tabel 3 Perubahan konsentrasi hormon seks berikut paparan progesteron atau norgestrel 20 sampai 60 hari pasca fertilisasi. Data direpresentasikan sebagai mean SEM lima ikan zebra individu remaja per mereplikasi (n = 4 ulangan).Hormon steroid (ng-g 1) konsentrasi progesteron (ng-L 1) konsentrasi Norgestrel (ng-L 1)0 4 33 63 0 4 34 77estrone Nda NDND 6.05 0.53 NDNDNDND Estradiol 0.49 0.10 0.52 0.10 0.40 0.06 0.40 0.07 0.49 0.10 0.52 0.06 NDND Androstenedione 5.18 0.39 4.67 0.29 4.74 0.16 4.54 0.37 5.18 0,39 4,71 0,56 NDND Testosteron 3.19 0.25 2.61 0.28 2.41 0.07 3.87 0.47 3.19 0,25 3,29 0,21 2,85 0,29 2,52 0,27a ND -. tidak terdeteksidianalisis dengan ANOVA dilanjutkan dengan Tukey tes beberapa perbandingan. Uji chi-square digunakan untuk menguji perbedaan yang signifikan dalam rasio jenis kelamin antara kontrol dan paparan kelompok pelarut. Ketika nilai-nilai yang diharapkan dalam salah satu sel dari tabel Kabupaten kontingen di bawah 5, uji eksak Fisher digunakan sebagai pengganti uji chi-square. Sebuah p 0.05 dianggap perbedaan yang signifikan secara statistik dibandingkan dengan kontrol pelarut.3. Hasil3.1. Konsentrasi yang diukur dari P4 dan NGTkonsentrasi yang diukur dari P4 dan NGT pada awal paparan (0h) dan sebelum pembaharuan air (24h) diberikan dalam Tabel 2. konsentrasi yang diukur dari NGT stabil dur- ing periode paparan dan rata-rata Konsentrasi adalah 4, 34 dan 77ngL-1 di tiga solusi paparan masing-masing. Konsentrasi yang diukur dari P4 pada T0proporsi perempuan pada konsentrasi 63 ng L-1. Namun, pengobatan NGT memiliki efek yang sangat kuat pada diferensiasi seks dengan rasio pergeseran seks terhadap laki-laki, dan tidak ada betina dapat diidentifikasi pada konsentrasi 34 dan 77 ng L-1.3.4. Konsentrasi hormon seks setelah terpapar P4 atau NGTTabel 3 menunjukkan konsentrasi hormon seks di seluruh ikan dikumpulkan di penghentian percobaan eksposur. Untuk KASIH P4 mengobati, estrone hanya terdeteksi pada konsentrasi 6.05 ng g-1 di ikan terkena 63ngL-1. Estradiol dan androstenedion terdeteksi pada semua kelompok P4-terbuka dan tetap tidak terpengaruh dibandingkan dengan kontrol pelarut (p> 0,05). Namun, untuk NGT perawatan, estradiol dan androstenedion hanya terdeteksi dalam pengobatan konsentrasi terendah (4 ng L-1) dan juga menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam tingkat mereka bila dibandingkan dengan kontrol ventilasi sol (p> 0,05). Tapi tidak ada estradiol dan androstenedion yang ditemukan sangat dekat denganterdeteksi pada ikan berikut paparan tengah dan konsentrasi nominal tertinggi tetapi lebih jauh menurun selama 24 jamdari konsentrasi NGT. Tidak ada perubahan signifikan untuk periode produksi, dengan konsentrasi rata-rata 4, 33 dan 63 ng L-1 untuktion testosteron diamati paparan berikut untuk P4 atau NGT tiga konsentrasi nominal masing-masing. Selain itu, P4 atau NGT(p> 0,05). tidak terdeteksi dalam kontrol pelarut. Semua paparan konsentrasi Data tion disajikan dalam konsentrasi terukur rata-rata akhirat.3.5. Gen profil ekspresi transkripsi setelah terpapar P4 atau NGT3.2. Kelangsungan hidup dan pertumbuhan ikan setelah terpapar P4 atau NGTGambar. 2 menunjukkan gen profil ekspresi transkripsi yang terlibat dalam diferensiasi seks. Paparan P4 signifikan Paparan P4 atau NGT tidak memiliki efek yang signifikan pada kelangsungan hidup ikanmenurunkan transkrip gen AMH tetapi meningkatkan expression dan tingkat kelangsungan hidup di semua perlakuan lebih besar dari 85%(sion dataFiga mRNA dalam 63 ng L- 1 kelompok (Gambar. 2A). yang penting tidak ditampilkan). Tidak ada perubahan signifikan dalam total tubuhup-regulasi Dmrt1 transkripsi dan down-regulasi panjang Figa, berat basah dan K-faktor dalam ikan antara kontrolpelaruttranskripsiyang diamati pada 34 dan 77 ng-L 1 NGT terpajan dan kelompok paparan (P4 atau NGT) (data tidak ditampilkan).kelompok (Gambar. 2B).Gene profil ekspresi transkripsi sepanjang 3,3. Rasio jenis kelamin setelah terpapar P4 atau NGThipotalamus-hipofisis-gonad (HPG) dan hipotalamus-hipofisis-adrenal (HPA) sumbu ditunjukkan pada Gambar. 3. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1, P4 dan NGT memiliki efek yang berbeda padaUntuk jalur sinyal reseptor, paparan 63 ng L-1 P4 dan seks rasio. Paparan P4 menghasilkan peningkatan yang signifikan dalam77 ng-L 1 NGT signifikan mempengaruhi tingkat ekspresi PGR5 4(A) ProgesteronPengendalian6(B) Norgestrel 4 ng-L 1*AMH Dmrt1 Figa Sox9a Sox9b-10AMH Dmrt1 Figa ***Sox9a Sox9b GeneGambar. 2. Gene profil ekspresi transkripsi yang terlibat dalam diferensiasi seks di ikan zebra remaja setelah terpapar progesteron (A) atau norgestrel (B) 20 sampai 60 hari pasca fertilisasi. Hasilnya direpresentasikan sebagai rata-rata SEM (n = 4 ulangan). Dibandingkan dengan kontrol pelarut, perbedaan yang signifikan secara statistik ditandai dengan tanda bintang (* p 0,05, ** p 0,01, p *** 0.001).Kontrol 4 ng L-1 33 ng L-134 ng-L 1 63 ng L-177 ng L-1***Gene4 3 2 12**** 00 -1-2 -4-2 -3-6 -8***-4

3(C) Progesteron3( F) Norgestrel22*1100-1-1-2Gene-2Gnrh2Gnrh3Fshb GeneLhb CRH POMCGambar. 3. Gene profil ekspresi transkripsi sepanjang hipotalamus-hipofisis-gonad (HPG) dan hipotalamus-hipofisis-adrenal (HPA) kapak ikan zebra remaja setelah terpapar progesteron (A-C) atau norgestrel (D-F) 20 sampai 60 hari pasca fertilisasi. Hasilnya direpresentasikan sebagai rata-rata SEM (n = 4 ulangan). Compared to the solvent control, statistically significant differences are marked with asterisks (*p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001).mRNA (Fig. 3A and D). In addition, P4 exposure had no significant effects on the expression of Vtg1 mRNA (Fig. 3A), while 77 ng L1 NGT significantly up-regulated the transcription of Vtg1 gene (Fig. 3D). For the steroidogenic pathway, the expression levels of Cyp11a1 mRNA remained unaffected by P4 (Fig. 3B), while NGT at all exposure concentrations significantly suppressed Cyp11a1 mRNA expression (Fig. 3E). Transcripts of Cyp17, Cyp19a1a and Hsd3b were all significantly up-regulated following exposure to 63 ng L1 P4 (Fig. 3B), while they were significantly down-regulated by NGT at 34 and 77 ng L1 (Fig. 3E). The expression levels ofCyp11b mRNA were significantly decreased by 33 and 63ngL1 P4, and 4 ng L1 NGT (Fig. 3B and E). Significant down-regulation of Hsd20b mRNA was also observed in the 33ngL1 P4 and 77ngL1 NGT groups (Fig. 3B and E). In addition, the transcription of Hsd17b3 gene was significantly suppressed following exposure to 34 and 77 ng L1 NGT, but not for P4 (Fig. 3B and E). For the hypothalamic and pituitary hormones, P4 treatment had no significant effectson the expression levels of Gnrh2, Gnrh3, Fshb, Lhb, Crh and Pomc mRNAs, and only the transcription of Pomc gene was significantly increased by NGT at 77 ng L1 (Fig. 3C and F).4. DiscussionThe present study demonstrated that exposure to environmen- tally relevant concentrations of P4 and NGT could affect the sex differentiation of zebrafish. Previous studies showed that sex ratio could be an effective biomarker for the assessment of endocrine disrupting chemicals (EDCs) (Baumann et al., 2013; Holbech et al., 2006); therefore, it was used in the present study to evaluate the effects of progestins on sex differentiation. Exposure of juvenile zebrafish to P4 from 20 to 60 dpf led to a significant shift in sex ratio toward females in the 63 ng L1 group, which is consistent with the significant inhibition of Amh gene (related to male differentiation) and induction of Figa gene (related to female differentiation). A3(A) ProgesteroneControl2***4 ng L-1 33 ng L-1 63 ng L-110-14Gene32** 1 0 -1 -2**-3Y.-Q. Liang et al. / Aquatic Toxicology 160 (2015) 172179 177Pgr Esr1 Vtg1 Ar Mr Gr3(D) Norgestrel**GeneSControl 4 ng L-1 234 ng L-1 77 ng L-110-1Pgr Esr1 Vtg1 Ar Mr Gr(B) Progesterone6(E) Norgestrel**Gene4 2 **0**-2 -4** ******************-6***-8************taC ryp11a1Cyp C 1y 7p19a1a Cyp11bHsd3b Hsd20 H bsd17b H 3sd11b2-10StaC ryp11a1Cyp C 1y 7p19a1a C Geneyp11bHsd3b Hsd20 H bsd17b H 3sd11b2Gnrh2Gnrh3Fshb Lhb Crh Pomc

178 Y.-Q. Liang et al. / Aquatic Toxicology 160 (2015) 172179change in sex ratio after P4 exposure is supported by a previous study, which has shown that P4 during the critical time for sex determination could cause biased sex ratio toward females in birds (Correa et al., 2005).As for NGT, the present study found that it caused a very strong effect on sex differentiation, leading to the shift of sex ratio toward males. At the same time, the transcriptional expression of key genes involved in sex determination and differentiation were also altered, with a significant up-regulation for Dmrt1 gene and down-regulation for Figa gene. The previous reports showed that levonorgestrel (or l-norgestrel) showed strong androgenic effects in three-spined sticklebacks, including induction of male specific glue protein spiggin and suppression of liver vitellogenin in females, and disruption of androgen-dependent reproductive cycle in males (Svensson et al., 2013, 2014), and also in fathead minnows causing masculinization of females (Zeilinger et al., 2009). Furthermore, levonorgestrel proved to be a strong agonist of andro- gen receptor (Ellestad et al., 2014). Taken together, these results suggest that NGT (or d,l-norgestrel) is a chemical with potent androgenic activity by binding to androgen receptor, which could account for the observed male-biased population. We previously demonstrated that the transcriptional expression of Ar gene var- ied during different developmental stages of zebrafish (Liang et al., 2015b). Therefore, the present study found Ar remained unaffected by NGT, which may not contradict the fact that NGT can alter sex ratio through an androgen receptor-mediated pathway. It is known that the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish is mediated through apopto- sis (von Hofsten and Olsson, 2005). Furthermore, previous studies (Meresman et al., 2002; Rodriguez et al., 2002) provided evidences that progestins could induce apoptosis in the macaque ovarian epithelium and human eutopic endometrium. Consequently, the present study possibly implies that NGT could induce oocyte apo- ptosis and accelerate the formation of testicular tissues, and finally resulting in a male-biased sex ratio.It is known that sex hormones regulate normal sex differen- tiation of zebrafish (Baumann et al., 2013; Holbech et al., 2006). For the first time, we demonstrated that P4 and NGT could alter the sex ratio of the fish population and transcriptional expression of key genes involved in sex differentiation. Furthermore, expo- sure to P4 or NGT could regulate sex hormone levels in juvenile zebrafish. In the present study, estrone could be only measured in the highest concentrations of P4, which is concomitant with more females compared with the solvent control. It is interesting that P4 had no significant effects on the levels of estradiol, androstenedione and testosterone, compared with sex ratio showing a female-biased pattern in the 63 ng L1 group. Therefore, the present results possi- bly suggest that the balance of sex hormones was disrupted by P4, which may account for the observed female-biased population. In contrast, estradiol could not be detected after exposure to 34 and 77 ng L1 NGT, which is consistent with a change of sex ratio toward to males. However, androstenedione and testosterone levels were not increased by NGT. It is more likely to imply that the disruption of the balance of estrogens and androgens could be a major factor contributing to the observed change in sex ratio toward males fol- lowing exposure to NGT. The findings of sex hormone assay provide evidence that P4 and NGT may alter the balance of sex hormones in juvenile zebrafish at low concentrations as measured in the aquatic environment, thereby leading to disruption of sex differentiation in zebrafish.As is known, the reproductive and adrenal endocrine sys- tems are primarily controlled by HPG and HPA axes, respectively. Progestins have been reported to modulate HPG and HPA axes (Blthgen et al., 2013b; Han et al., 2014; Overturf et al., 2014). In humans and fish, progestins could activate progesterone recep- tors (Pgr) to elicit their specific physiological responses (Africanderet al., 2011). In the present study, the significant transcriptional induction ofPgrgene clearly reflects the progestogenic activity of P4 in juvenile zebrafish, which was also found in zebrafish eleuthero- embryos (Zucchi et al., 2012). The significant up-regulation of Cyp17, Cyp19a1a and Hsd3b genes was observed in the 63 ng L1 P4 group, which may provide a plausible mechanism for the observed change in sex ratio toward females. For the NGT exposure, trans- cripts of Cyp11a1, Cyp17, Cyp19a1a and Hsd3b genes were strongly inhibited in the 34 and 77ngL1 groups; at the same time, no females observed. Alterations of these genes may also contribute to male differentiation following exposure to NGT. The effects of P4 and NGT on transcriptional expression of genes involved in the hypothalamic and pituitary hormones were relatively low. There- fore, we believe a direct P4 or NGT action on steroidogenic genes, not an indirect effect via changing the production of hypothalamic and pituitary hormones (Baron et al., 2005; Laughlin et al., 2010; Weltzien et al., 2004). The overall results from the transcriptional data in the present study showed that P4 and NGT could mainly alter transcripts of steroidogenic genes, and may finally translate to the observed disruption in sex differentiation.5. ConclusionsThe results from this study have showed that P4 and NGT could cause a disruption of sex differentiation at environmen- tally relevant concentrations based on the skewed sex ratio in the subsequent adult population. P4 and NGT were demonstrated to significantly induce more females and more males, respectively, which were accompanied with the regulation of the transcriptional levels of several genes (ie, Amh, Dmrt1 and Figa) related to sex dif- ferentiation. In addition, the balance of estrogens and androgens in fish might be altered following exposure to the two chemicals. Meanwhile, P4 and NGT could mainly mediate the transcriptional expression of steroidogenic genes. The modulating hormones and genes associated with steroid synthesis could contribute to disrup- tion of sex differentiation in zebrafish.AcknowledgementsThe authors would like to acknowledge the financial support from the National Natural Science Foundation of China (41273119, U1133005, 41201522, and 41121063). Thanks to the two anony- mous reviewers for their useful comments.Appendix A. Supplementary dataSupplementary data associated with this article can be found, in the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.aquatox. 2015.01.006.ReferencesAfricander, D., Verhoog, N., Hapgood, JP, 2011. Molecular mechanisms of steroidreceptor-mediated actions by synthetic progestins used in HRT and contraception. Steroids 76, 636652. Baron, D., Fostier, A., Breton, B., Guiguen, Y., 2005. Androgen and estrogentreatments alter steady state messengers RNA (mRNA) levels of testicular steroidogenic enzymes in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Mol. Reprod. Dev. 71, 471479. Baumann, L., Holbech, H., Keiter, S., Kinnberg, KL, Knoerr, S., Nagel, T., Braunbeck,T., 2013. The maturity index as a tool to facilitate the interpretation of changes in vitellogenin production and sex ratio in the fish sexual development test. Aquat. Toxicol. 128, 3442. Blthgen, N., Castiglioni, S., Sumpter, JP, Fent, K., 2013a. Effects of lowconcentrations of the antiprogestin mifepristone (RU486) in adults and embryos of zebrafish (Danio rerio): 1. Reproductive and early developmental effects. Aquat. Toxicol. 144, 8395. Blthgen, N., Sumpter, JP, Odermatt, A., Fent, K., 2013b. Effects of lowconcentrations of the antiprogestin mifepristone (RU486) in adults and

Y.-Q. Liang et al. / Aquatic Toxicology 160 (2015) 172179 179embryos of zebrafish (Danio rerio): 2. Gene expression analysis and in vitro activity. Aquat. Toxicol. 144, 96104. Brion, F., Tyler, C., Palazzi, X., Laillet, B., Porcher, J., Garric, J., Flammarion, P., 2004. Impacts of 17 -estradiol, including environmentally relevant concentrations, on reproduction after exposure during embryo-larval-, juvenile-and adult-life stages in zebrafish (Danio rerio). Aquat. Toxicol. 68, 193217. Chiang, EF-L., Pai, Wyatt, C.-I., Yan, M., Postlethwait, Y.-L., Chung, J., B.-c, J., 2001.Two sox9 genes on duplicated zebrafish chromosomes: expression of similar transcription activators in distinct sites. Dev. Biol. 231, 149163. Corcoran, J., Winter, MJ, Tyler, CR, 2010. Pharmaceuticals in the aquaticenvironment: a critical review of the evidence for health effects in fish. Crit. Pdt Toxicol. 40, 287304. Correa, SM, Adkins-Regan, E., Johnson, PA, 2005. High progesterone during avianmeiosis biases sex ratios toward females. Biol. Lett. 1, 215218. DeQuattro, ZA, Peissig, EJ, Antkiewicz, DS, Lundgren, EJ, Hedman, CJ,Hemming, JD, Barry, TP, 2012. Effects of progesterone on reproduction and embryonic development in the fathead minnow (Pimephales promelas). Lingkungan. Toxicol. Chem. 31, 851856. Ellestad, LE, Cardon, M., Chambers, IG, Farmer, JL, Hartig, P., Stevens, K.,Villeneuve, DL, Wilson, V., Orlando, EF, 2014. Environmental gestagens activate fathead minnow (Pimephales promelas) nuclear progesterone and androgen receptors in vitro. Lingkungan. Sci. Technol. 48, 81798187. Fent, K., Weston, AA, Caminada, D., 2006. Ecotoxicology of humanpharmaceuticals. Aquat. Toxicol. 76, 122159. Gupta, T., Mullins, MC, 2010. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. JoVE:Journal of Visualized Experiments. Han, G.-D., Ma, Z.-Y., Dai, Y.-Y., 2000. Development of total synthesis ofcontraceptive steroid drugs in China. Chin. J. Pharm. 31, 231236 [Chinese]. Han, J., Wang, Q., Wang, X., Li, Y., Wen, S., Liu, S., Ying, G., Guo, Y., Zhou, B., 2014.The synthetic progestin megestrol acetate adversely affects zebrafish reproduction. Aquat. Toxicol. 150, 6672. Holbech, H., Kinnberg, K., Petersen, GI, Jackson, P., Hylland, K., Norrgren, L.,Bjerregaard, P., 2006. Detection of endocrine disrupters: evaluation of a fish sexual development test (FSDT). Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 144, 5766. Jorgensen, A., Morthorst, JE, Andersen, O., Rasmussen, LJ, Bjerregaard, P., 2008.Expression profiles for six zebrafish genes during gonadal sex differentiation. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 25. Kejuan, F., Meirik, O., Yongang, D., Yan, C., Weijin, Z., Fajans, P., 2007.Once-a-month contraceptive pills in China: a review of available evidence. Contraception 75, 337343. Kidd, KA, Blanchfield, PJ, Mills, KH, Palace, VP, Evans, RE, Lazorchak, JM, Flick, RW, 2007. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Nat. Acad. Sci. 104, 88978901. Kloas, W., Urbatzka, R., Opitz, R., Wuertz, S., Behrends, T., Hermelink, B., Hofmann,F., Jagnytsch, O., Kroupova, H., Lorenz, C., Neumann, N., Pietsch, C., Trubiroha, A., Van Ballegooy, C., Wiedemann, C., Lutz, I., 2009. Endocrine disruption in aquatic vertebrates. In: Vaudry, H., Roubos, EW, Coast, GM, Vallarino, M. (Eds.), Trends in Comparative Endocrinology and Neurobiology. , pp. 187200. Kolpin, DW, Furlong, ET, Meyer, MT, Thurman, EM, Zaugg, SD, Barber, LB,Buxton, HT, 2002. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams: 19992000: a national reconnaissance. Lingkungan. Sci. Technol. 36, 12021211. Laughlin, A., Welsh Jr., T., Love, C., Varner, D., Parrish, A., Forrest, D., Ing, N., 2010.In vitro culture of precision-cut testicular tissue as a novel tool for the study of responses to LH. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46, 4553. Liang, Y.-Q., Huang, G.-Y., Ying, G.-G., Liu, S.-S., Jiang, Y.-X., Liu, S., 2015a.Progesterone and norgestrel alter transcriptional expression of genes along the hypothalamicpituitarythyroid axis in zebrafish embryos-larvae. Comp. Biochem. Physiol. Part C: Toxicol. Pharmacol. 167, 101107. Liang, Y.-Q., Huang, G.-Y., Ying, G.-G., Liu, S.-S., Jiang, Y.-X., Liu, S., Peng, F.-J., 2015b.A time-course transcriptional kinetics of the hypothalamic-pituitary-gonadal and hypothalamic-pituitary-adrenal axes in zebrafish eleutheroembryos after exposure to norgestrel. Lingkungan. Toxicol. Chem. 34, 112119. Liu, S., Ying, G.-G., Zhao, J.-L., Chen, F., Yang, B., Zhou, L.-J., Lai, H.-J., 2011. Trace analysis of 28 steroids in surface water, wastewater and sludge samples by rapid resolution liquid chromatographyelectrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 1218, 13671378. Liu, S., Ying, G.-G., Zhang, R.-Q., Zhou, L.-J., Lai, H.-J., Chen, Z.-F., 2012a. Fate andoccurrence of steroids in swine and dairy cattle farms with different farming scales and wastes disposal systems. Lingkungan. Pollut. 170, 190201. Liu, S., Ying, G.-G., Zhao, J.-L., Zhou, L.-J., Yang, B., Chen, Z.-F., Lai, H.-J., 2012b.Occurrence and fate of androgens, estrogens, glucocorticoids and progestagens in two different types of municipal wastewater treatment plants. J. Lingkungan. Monit. 14, 482491. Liu, S., Ying, G.-G., Zhou, L.-J., Zhang, R.-Q., Chen, Z.-F., Lai, H.-J., 2012c. Steroids in atypical swine farm and their release into the environment. Water Res. 46, 37543768.Livak, KJ, Schmittgen, TD, 2001. Analysis of relative gene expression data usingreal-time quantitative PCR and the 2 Ct method. Methods 25, 402408. Meresman, GF, Aug, L., Bara nao, RI, Lombardi, E., Tesone, M., Sueldo, C., 2002. Oral contraceptives suppress cell proliferation and enhance apoptosis of eutopic endometrial tissue from patients with endometriosis. Fertil. Steril. 77, 11411147. Morthorst, JE, Holbech, H., Bjerregaard, P., 2010. Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations. Aquat. Toxicol. 98, 336343. Murack, PJ, Parrish, J., Barry, TP, 2011. Effects of progesterone on sperm motilityin fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 104, 121125. Onichtchouk, D., Aduroja, K., Belting, HG, Gngge, L., Driever, W., 2003. Transgene driving GFP expression from the promoter of the zona pellucida gene zpc is expressed in oocytes and provides an early marker for gonad differentiation in zebrafish. Dev. Dyn. 228, 393404. Orn, S., Holbech, H., Madsen, TH, Norrgren, L., Petersen, GI, 2003. Gonaddevelopment and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone. Aquat. Toxicol. 65, 397411. Oshima, Y., Kang, IJ, Kobayashi, M., Nakayama, K., Imada, N., Honjo, T., 2003. Suppression of sexual behavior in male Japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to 17 beta-estradiol. Chemosphere 50, 429436. Overturf, MD, Overturf, CL, Carty, DR, Hala, D., Huggett, DB, 2014.Levonorgestrel exposure to fathead minnows (Pimephales promelas) alters survival, growth, steroidogenic gene expression and hormone production. Aquat. Toxicol. 148, 152161. Paulos, P., Runnalls, TJ, Nallani, G., La Point, T., Scott, AP, Sumpter, JP, Huggett, DB, 2010. Reproductive responses in fathead minnow and Japanese medaka following exposure to a synthetic progestin, norethindrone. Aquat. Toxicol. 99, 256262. Qureshi, M., Attaran, M., 1999. Review of newer contraceptive agents. Cleve. Clin. J.Med. 66, 358366. Rodriguez, GC, Nagarsheth, NP, Lee, KL, Bentley, RC, Walmer, DK, Cline, M.,Whitaker, RS, Isner, P., Berchuck, A., Dodge, RK, Hughes, CL, 2002. Progestin-induced apoptosis in the macaque ovarian epithelium: differential regulation of transforming growth factor- . J. Nat. Cancer Inst. 94, 5060. Runnalls, TJ, Beresford, N., Losty, E., Scott, AP, Sumpter, JP, 2013. Severalsynthetic progestins with different potencies adversely affect reproduction of fish. Lingkungan. Sci. Technol. 47, 20772084. Schulz, RW, Bogerd, J., Male, R., Ball, J., Fenske, M., Olsen, LC, Tyler, CR, 2007.Estrogen-induced alterations in amh and dmrt1 expression signal for disruption in male sexual development in the zebrafish. Lingkungan. Sci. Technol. 41, 63056310. Svensson, J., Fick, J., Brandt, I., Brunstrom, B., 2013. The synthetic progestin levonorgestrel is a potent androgen in the three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus). Lingkungan. Sci. Technol. 47, 20432051. Svensson, J., Fick, J., Brandt, I., Brunstrom, B., 2014. Environmental concentrationsof an androgenic progestin disrupts the seasonal breeding cycle in male three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus). Aquat. Toxicol. 147, 8491. Vandesompele, J., De Preter, K., Pattyn, F., Poppe, B., Van Roy, N., De Paepe, A.,Speleman, F., 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3, research0034.0031 research0034.0011. von Hofsten, J., Olsson, PE, 2005. Zebrafish sex determination and differentiation:involvement of FTZ-F1 genes. Reprod. Biol. Endocrinol. 3, 63. Wegner, M., 1999. From head to toes: the multiple facets of Sox proteins. NucleicAcids Res. 27, 14091420. Weltzien, F.-A., Andersson, E., Andersen, ., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B., 2004. The brainpituitarygonad axis in male teleosts: with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 137, 447477. Zeilinger, J., Steger-Hartmann, T., Maser, E., Goller, S., Vonk, R., Laenge, R., 2009.Effects of synthetic gestagens on fish reproduction. Lingkungan. Toxicol. Chem. 28, 26632670. Zhao, J.-L., Ying, G.-G., Wang, L., Yang, J.-F., Yang, X.-B., Yang, L.-H., Li, X., 2009. Determination of phenolic endocrine disrupting chemicals and acidic pharmaceuticals in surface water of the Pearl Rivers in South China by gas chromatographynegative chemical ionizationmass spectrometry. Sci. Total Environ. 407, 962974. Zucchi, S., Castiglioni, S., Fent, K., 2012. Progestins and antiprogestins affect geneexpression in early development in zebrafish (Danio rerio) at environmental concentrations. Lingkungan. Sci. Technol. 46, 51835192. Zucchi, S., Castiglioni, S., Fent, K., 2013. Progesterone alters global transcriptionprofiles at environmental concentrations in brain and ovary of female zebrafish (Danio rerio). Lingkungan. Sci. Technol. 47, 1254812556.