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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS, FÍSICAS, MATEMÁTICAS, FARMACIA E INFORMATICA
PRESENTADO POR:
ROSA MARINA CASAVERDE PUMACAYO JUAN JOEL QUISPE HUISA
ASESORES:
o Q.F. CARLOS ALBERTO MOREYRA PACHASo Blga LUZ MARINA
CUSCO – PERÚ2013
Proyecto de tesis
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA COLINESTERASA
ERITROCITARIA EN TRABAJADORES DE LOS ALRREDEDORES DE
LA CIUDAD DEL CUSCO EXPUESTOS, NO EXPUESTOS A
ORGANOFOSFORADOS
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INDICE
INTRODUCCION
CAPITULO I
1. GENERALIDADES 1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA1.2. FORMULACION DEL PROBLEMA1.3. OBJETIVOS
1.3.1. OBJETIVOS GENERALES1.3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.4. LIMITACIONES DE LA INVESTIGACION1.5. JUSTIFICACION E IMPORTANCIA
1.5.1. JUSTIFICACION TEORICA1.5.2. JUSTIFICACION METODICA1.5.3. JUSTIFICACION PRACTICA1.5.4. JUSTIFICACION LEGAL
1.6. HIPOTESIS
CAPITULO II
2. MARCO TEORICO CONCEPTUAL2.1. VISION HISTORICA2.2. ANTECEDENTES2.3. ESTADO DE LA CUESTION2.4. BASES TEORICO CIENTIFICAS2.5. MARCO CONCEPTUAL O DEFINICION DE TERMINOS BASICOS
CAPITULO III
3. MATERIALES Y METODOS3.1. MATERIALES3.2. DISEÑO METODOLOGICO
3.2.1. NIVEL Y TIPO DE INVESTIGACION3.2.2. DISEÑO DE LA INVESTIGACION3.2.3. VARIABLES3.2.4. POBLACION Y MUESTRA3.2.5. CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION3.2.6. TECNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS3.2.7. TECNICAS PARA EL PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE LA INFORMACION
3.3. PROCEDIMIENTO
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CAPITULO IV
4. RECURSOS4.1. HUMANOS4.2. DE INFRAESTRUCTURA4.3. ECONOMICOS
CAPITULO V
5. PRESUPUESTO
CAPITULO VI
6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
BIBLIOGRAFIA
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INTRODUCCION
Organofosforados y carbamatos son los plaguicidas más utilizados. Sus
principales efectos en la salud son producidos por la inhibición de la
acetilcolinesterasa.
El diagnóstico de intoxicación se realiza comparando el porcentaje de disminución
en relación a la concentración basal.
Los plaguicidas son utilizados en actividades de salud pública, comercio, uso
doméstico y principalmente en la agricultura, con el fin de prevenir, destruir,
repeler o atenuar alguna plaga, que puede ir desde insectos, animales, hierba
mala hasta microorganismos. Debido a su amplio uso, es posible que casi todos
tengamos un antecedente de exposición, pero, probablemente los trabajadores
agrícolas son los más expuestos a los plaguicidas. En el mercado mundial, existen
un gran número de plaguicidas que pueden ser agrupados según su origen
químico como: organofosforados, carbamatos, organoclorados, piretroides, etc. De
estos los organofosforados y los carbamatos son los más utilizados a nivel
mundial y a su vez los más tóxicos. Su toxicidad recae principalmente sobre el
sistema nervioso, inhibiendo la acetilcolinesterasa neuronal, produciendo un
incremento de la acetilcolina en la sinapsis desencadenando un síndrome
colinérgico agudo vía una neurotransmisión continua, que puede llevar a la muerte
si no existe una apropiada y rápida intervención. Los organofosforados
considerados más tóxicos que los carbamatos. Esto se debe a que los
organofosforados inhiben la acetilcolinesterasa de manera irreversible mientras
que los carbamantos lo hacen de manera reversible. Para la aplicación de
plaguicidas se ha reportado que la exposición crónica a organofosforados produce
neurotoxicidad por lo mencionado anteriormente se puede deducir que entre los
trabajadores agrícolas representan un mayor riesgo, este riesgo aumenta cuando
no se tiene el entrenamiento adecuado.
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La evaluación de riesgo de toxicidad hacia plaguicidas organofosforados y
carbamatos involucra la determinación de indicadores biológicos de exposición,
los cuales pueden servir como una alarma previa a la aparición de las
manifestaciones clínicas.
El presente trabajo tiene como objetivo conocer las medidas de proteccion
utilizadas en la manipulacion deplaguicidas anticolinesterasicos asi como la
actividad de la colinesterasa plasmatica.
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CAPÍTULO I
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CAPITULO I
GENERALIDADES
1.1.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:
Los plaguicidas son sustancias químicos que se han venido utilizando en gran
escala en el ámbito mundial. (Blanca de F, R. 1981). Simultáneamente con el
aumento del uso de plaguicidas, crecieron muy significativamente los accidentes y
enfermedades asociadas. Según datos de la OMS, anualmente se intoxican dos
millones de personas por exposición directa o indirecta a plaguicidas. De ese total,
las 3/4 partes de afectados pertenecen a los países subdesarrollados, donde
únicamente se utiliza el 25% de la producción mundial de plaguicidas. (Olivera B. y
Rodríguez D).
La exposición a plaguicidas supone siempre un riesgo para la salud de las
personas, por la posibilidad de que produzcan efectos o acciones perjudiciales.
Eso quiere decir que aunque no todas las personas que están en contacto con
plaguicidas sufren daños en su salud, lo que si tienen son más posibilidades de
llegar a sufrirlos (Montiel, L. 2012.).
El principal efecto tóxico de estos compuestos consiste en la inhibición de las
enzimas con actividad colinesterasa (ChE). (Guilhermino et al., 1998).Esta
enzimatiene la facultad de desactivarla acetilcolina al dividirla en sus dos
componentes: el ácido acético y la colina. Cuando el organismo sufre los efectos
tóxicos de estos pesticidas, esta actividad enzimática, tiende a inhibirse de manera
progresiva. De ahí la importancia de hacer exámenes periódicos de laboratorio,
para determinar la concentración de la colinesterasa en sangre. (Virginia, T. 1992).
La determinación de las colinesterasas ha adquirido gran importancia clínica
debido a la amplia aplicación de plaguicidas organofosforados y carbamatos.
Estos compuestos son potentes inhibidores de ambas enzimas, produciendo
disminuciones de la actividad de la colinesterasa sérica y eritrocítica debido a
inhalación, ingestión a absorción por piel. (Trundle D, Macial G. 1988).
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El método más utilizado para la determinación de colinesterasa es el de Ellman
(Ellman et al., 1961) en sangre entera. Este método detecta la aparición de
tiocolina tras la hidrólisis del sustrato acetiltiocolina (ATCh) por la colinesterasa. La
tiocolina reacciona con el cromóforo, el ácido5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB),
para producir un compuesto de color amarillo, el ácido 5-tio-2-nitrobenzoico, que
puede ser medido espectrofotométricamente a una longitud de onda de 412 nm.
Recientemente se ha recomendado el empleo de dos sustratos, acetiltiocolina y
butiriltiocolina (BTCh), para analizar una misma muestra de sangre entera, ya que
permite la monitorización tanto de AChE como de BChE, y por tanto una detección
más precisa de la exposición a agentes inhibidores de la colinesterasa (Tecles y
Cerón, 2001).
El presente trabajo, es muy importante para evaluar el riesgo sobre la salud (de
los trabajadores agricolas) por la exposición a estos productos inhibidores de la
colinesterasa, considerándose para nuestro estudio la ciudad del Cuso. Dicho
trabajo nos permitirá conocer los niveles de actividad de la colinesterasa sérica en
estos pobladores.
1.2.- FORMULACION DEL PROBLEMA:
¿Cómo influirá los compuestos organofosforados en la actividad de la
colinesterasa eritrocitaria en trabajadores expuestos, en comparación con
personas no expuestos y consumidores de coca en la ciudad de cusco?
1.3.- OBJETIVOS
1.3.1.- OBJETIVO GENERAL:
Determinar la actividad de la colinesterasa eritrocitaria en los trabajadores
agrícolas de la ciudad de cusco expuestos, no expuestos a
organofosforados y consumidores de coca
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1.3.2.- OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Determinar los niveles de actividad de la enzima colinesterasa sérica en
muestras de sangre tomadas a un grupo de trabajadores expuestos a
plaguicidas que contienen compuestos que inhiben esta enzima y a un
grupo de control no expuesto a estos plaguicidas.
Evaluar los parámetros hematológicos en trabajadores expuestos a
Organofosforados.
Informar a la Dirección Regional de Salud (DIRESA) sobre los estudios
realizados.
1.4.- JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION:
JUSTIFICACION TEORICA
La finalidad de este estudio será informar a los trabajadores y a las
autoridades encargadas, como el SENASA (Servicio Nacional de
Saneamiento Ambiental), ministerio de agricultura y afines, los resultados
finales obtenidos y de los riesgos que implican su uso, así como los
perjuicio que traen estos sobre la salud de público consumidor y poder de
este modo controlar con mayor eficacia la utilización de estos insecticidas
organofosforados.
JUSTIFICACION PRACTICA
Los resultados obtenidos aportarían nuevas alternativas para mejorar el uso
de insecticidas y evitar intoxicaciones crónicas
Dar a conocer los efectos sobre la salud de estos productos
organofosforados en personas que expenden dichos productos.
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La investigación será útil para que se tomen medidas de seguridad para
reducir la exposición a estos productos.
JUSTIFICACIÓN LEGAL
A las personas que son objeto de investigación se les informa debidamente
de lo que vamos ha hacer según lo indica la ley de salud en su titulo I en el
numero 3 de los deberes y responsabilidades concernientes a la salud
individual ya que necesitamos de estas su consentimiento como
brindándoles atención medica caso que ocurra algún accidente ysobre todo
información adecuada con practicas de salud e higiene
1.5.- LIMITACIONES
Se limita solo a una pequeña población a los trabajadores agrícolas de los
alrededores de a la ciudad del cusco
Se limita solo a la evaluación de los niveles de colinesterasa eritrocitara
mas no al tratamiento
1.6 HIPOTESIS
La exposición a organofosforados influye en la actividad de enzima
colinesaterasa eritrositaria en los trabajadores expuestos en comparacion a
los no expuestos causando intoxicacion crónica que puede afectar la salud
de los pobladores
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CAPÍTULO II
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CAPITULO II
MARCO TEORICO
2.1.- VISION HISTORICA:
Comienzos de la Utilización de Plaguicidas en la Historia. Existe evidencia
histórica que la primera civilización en utilizar plaguicidas, fueron los egipcios a
orillas del Río Nilo. Existen papiros que detallan el uso de soluciones de cobre
para el control de hongos en cebada y el uso de soluciones acuosas de
compuestos arsenicales para el control de la langosta. (Agriculture, history of --
www. Enciclopedia Britannica.com).
Desde épocas remotas el hombre a combatido a las plagas y , por lo tanto, a
utilizado plaguicidas .la primera etapa de la historia de los plaguicidas abarco
desde antes de cristo hasta mediados del siglo XIX y se le suele llamar “era de los
productos naturales” homero escribió acerca de las propiedades purificadoras del
azufre, pues se sabia que esta sustancia atacaba a los mohos otros datos son que
el uso de las flores de piretro como insecticidas se remonta a los tiempos de jerjes,
rey de Persia y que los chinos utilizaron los arsenitos para el control de roedores y
otras plagas desde el año 900 de nuestra era durante los dos últimos siglos de
esta etapa se utilizaron como plaguicidas sustancias mas complejas, como el
jabón, pero que seguían siendo naturales.(Lilia A ,Albert1997)
Los plaguicidas organofosforados se desarrollaron en Alemania, a partir de las
investigaciones sobre gases neurotóxicos que se llevaron a cabo en ese país para
usar dichos gases como armas químicas. Los plaguicidas que derivan de esteres
carbamicos,también conocidos como “carbamatos”,se descubrieron en 1947. (Lilia
A,Albert 1997)
Los insecticidas organofosforados son sustancias biodegradables en la naturaleza
sin tendencia a acumularse en las grasas del organismo,que forman parte del
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grupo de insecticidas llamados “de contacto”,porabsorberse por intermedio de los
lípidos del caparazón de los insectos. Son muy activos contra un gran numero de
especies de insectos,todo lo cual hace de ellos los insecticidas mas ampliamente
extendidos en la actualidad. Desde 1942 se ha sintetizado mas de 50000
derivados organofosforados,algunos de los cuales fueron con fines bélicos (gas
GB, gas nervino, trilones, sarín, tabun); no menos de 50 derivados han sido
comercializados como insecticidas (Gisbert J.A)
Los insecticidas organofosforados (OP) son muy tóxicos y liposolubles y su
fórmula general deriva del ácido fosfórico, como se aprecia en la estructura
química del paratión. Pertenecen a diferentes familias: fosfatos, fosfonatos,
fosforoamidotioatos, fosforodiamidatos, varias de ellas azufradas. (Ferrer A 2003)
2.2.- ANTECEDENTES
Nacionales
Niveles de colinesterasa sérica en agricultores de la localidad de Carapongo
(Perú) y determinación de residuos de plagicidas inhibidores de la
Acetilcolinesterasa en frutas y hortalizas cultivadas. Milla Cotos, Oscar
Manuel; Palomino Horna, William Rodolfo
Se realizó la determinación de la actividad de la colinesterasa sérica en 134
muestras biológicas (109 muestras de agricultores que trabajan con pesticidas
inhibidores de la colinesterasa y 25 de un grupo de control (grupo no expuesto a
los pesticidas)) y el análisis toxicológico en 300 muestras de productos vegetales
[coliflor (Brassicaoleraceavar. botrytis), tomate (Lycopersiconesculentum), apio
(Apiumgraveolens), lechuga (Lactuca sativa L.), maracuyá (Passifloraedulis)]
procedentes de la localidad de Carapongo, distrito de Lurigancho - Chosica, Lima -
Perú.
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La cuantificación de la actividad de la colinesterasa sérica se realizó empleando la
técnica de Ellman modificada mediante espectrofotometría de luz ultra violeta. El
análisis de plaguicidas se realizó por cromatografía en capa fina (CCF).
El valor promedio de actividad de la colinesterasa sérica en los agricultores que
trabajan con los pesticidas fue de 1827,18 mU/mL D.E. +/- 269,99 (valor máximo:
2540,09 mU/mL; valor mínimo: 1294,54 mU/mL) y en el grupo control fue de
2263,92 mU/mL D.E. +/- 216,40 (valor máximo: 2771,01 mU/mL; valor mínimo:
1959,30 mU/mL); Valor normal de actividad de la colinesterasa sérica: 1800 - 3600
mU/mL. 55,05 % de los agricultores que trabajan con los pesticidas presentaron
valores por debajo de los niveles normales de actividad de la colinesterasa sérica
(58,89 % de los varones y el 36,84 % de las mujeres). El grupo de agricultores
cuyos tiempos de trabajo es superior a los 40 años era el que tenía el nivel
promedio de actividad de colinesterasa sérica más bajo (1596,99 mU/mL).
Los plaguicidas detectados en las muestras de productos vegetales antes de la
cosecha fueron: metamidofos (24,67 %), clorpirifos (15,33 %), metomilo (14,67 %)
y dimetoato (8,67 %), también se encontraron las combinaciones:
metamidofos/metomilo (11,33 %) dimetoato/metomilo (6,67 %),
metamidofos/clorpirifos (11,99 %), metamidofos/dimetoato (6,67 %).
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtual/tesis/salud/milla_c_o/resumen.htm
Internacionales
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Determinación de niveles basales de colinesterasa en jornaleros agrícolas
Organofosforados y carbamatos son los plaguicidas más utilizados. Sus
principales efectos en la salud
Son producidos por la inhibición de la acetilcolinesterasa. El diagnóstico de
intoxicación se realiza comparando el porcentaje de disminución en relación a la
concentración basal. No obstante, ésta muy rara vez es realizada. Materialy
métodos: Se llevó a cabo un estudio transversal con 463 trabajadores de una
compañía agrícola en Sinaloa, México. Se aplicó un cuestionario y la
concentración de colinesterasa
fue determinada con el método Magnotti. Los criterios de exclusión fueron,
exposición a plaguicidas y/o hemorragia de tracto digestivo en los últimos dos y
seis meses respectivamente. Se utilizó prueba “T” para diferencia de medias entre
dos grupos, análisis de varianza para diversos grupos y prueba de Tukey para
comparaciones múltiples. Resultados: El nivel promedio de colinesterasa fue de
4.22 U/mL ±.77; de hemoglobina, 12.9 g/dL ± 1.82, y colinesterasa ajustada 33.1
U/g ± 6.79. Colinesterasa y hemoglobina fueron
más altas en hombres que en mujeres, p = 0.000; colinesterasa ajustada fue más
alta en mujeres p = 0.005. Se detectó anemia en 55% de mujeres, 51% de niños y
15% de hombres. Hubo diferencias significativas según edad, p = 0.03 y lugar de
origen de los trabajadores p = 0.001. Conclusiones: Los niveles basales de
colinesterasa fueron más altos que los reportados por el método Magnotti. La alta
prevalencia de anemia indica que es indispensable que todas las mediciones de
colinesterasa incluyan el ajuste de acuerdo con el
nivel de hemoglobina. Dada la frecuente imposibilidad de llevar a cabo
determinaciones basales, este estudio podría ser utilizado como un referente.
AUTORES
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Martha Edilia Palacios Nava,1 Guadalupe Silvia García de la Torre,1 María del
Pilar Paz Román1
1Departamento de Salud Pública, Facultad de Medicina, UNAM
Rev Medigraphic Artemisa Vol. 52 No. 2 Marzo-Abril, 2009
Valores de referencia de actividad colinesterásica sanguínea en Población
laboral activa no expuesta a plaguicidas inhibidores de colinesterasa
El uso extendido de plaguicidas inhibidores de colinesterasas obliga a disponer de
valores de referencia en personas sanas para la correcta toma de decisiones
clínicas y epidemiológicas. En Colombia se carece de estos valores y por ello se
decidió realizar este estudio. Se diseñaron estadísticamente dos muestras
representativas de las poblaciones laborales activas, afiliadas al Seguro Social,
residentes en el Valle de Aburrá o en el cercano Oriente antioqueño. Se midió la
actividad colinesterasa por seis técnicas diferentes y aquí se informan los
resultados con la técnica Lovibond, que usa sangre total. Se estudiaron 827
personas, 415 en Aburrá y 412 en Oriente, tanto hombres como mujeres, con
edad entre 18 y 75 años, pero sólo para los menores de 50 años se logró reunir la
cantidad de personas exigidas por el diseño. El promedio de enzima es mayor en
Aburrá que en Oriente, pero sin diferencia estadísticamente significativa (d.e.s: p <
0.05): 92,55 y
91,72%, en su orden (F = 0,946; p = 0,3415). En ambas regiones la actividad
enzimática masculina es superior a la femenina: en Aburrá 93,95 y 91,15%; en
Oriente 94,15 y
89,31%; hay d.e.s. entre ellas en ambas zonas. En los menores de 50 años, la
variable edad no tiene efecto en el comportamiento del Lovibond. No hay d.e.s.
entre nuestro promedio y los del fabricante ni en hombres ni en mujeres. Los
estándares extranjeros del Lovibond concuerdan con los hallados por Henao y
colaboradores en niños trabajadores de Antioquia y con los nuestros.
AUTORES
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Jaime Carmona-Fonseca / Samuel Henao H. / Rocío Garcés M.
Revista de la Facultad Nacional de Salud Pública, año/vol. 18, número 002
Universidad de Antioquia
Medellín, Colombia
Diferencias en la ejecución cognitiva y actividades colinesterasa en
adolescentes con exposición ambiental a plaguicidas en Jujuy (Argentina)
Algunos estudios indican que los plaguicidas afectan la función neurológic, aunque
existen datos contradictorios. El objetivo de esta investigación fue medir
diferencias en la ejecución motora y en actividad colinesterasa en adolescentes
según la exposición a plaguicidas. La hipótesis es encontrar funciones motoras
disminuidas en la población más expuesta a esta contaminación ambiental. En
este trabajo se han estudiado adolescentes procedentes de tres zonas con
diferente grado de exposición ambiental a plaguicidas. Se realizaron pruebas
neuronconductuales para evaluar la ejecución cognitiva y pruebas bioquímicas
para cuantificar los niveles de Acetilcolinesterasa eritrocitaria y plasmática. La
evaluación conductual se llevó a cabo mediante una Historia clínica neurológica
estándar; la prueba de Dígitos (evalúa memoria a corto plazo) y la prueba de
Dígitos y Símbolos de la Escala Wechsler de Inteligencia para Niños, (evalúa
codificación de las percepciones visuales y la prueba de Vigilancia de Dígitos de
Lewis (evalúa atención sostenida).
Tanto en la prueba que medía memoria a corto plazo (dígitos), como la que medía
codificación de las percepciones visuales (dígitos-símbolos), los adolescentes de
la zona de mayor exposición mostraron una peor ejecución que los alumnos de las
localidades con menor exposición. Los niveles de colinesterasa plasmática
(indicador de intoxicación aguda) fueron similares en las tres poblaciones y en
todas ellas se encontraba dentro del rango de normalidad. Por otra parte, la
colinesterasaeritrocitaria (indicador de intoxicación crónica) se encontraba por
debajo del límite inferior de normalidad los adolescentes de las localidades con
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mayor exposición en comparación a los de menor exposición, cuya
colinesterasaeritrocitaria se encontraba dentro del rango de normalidad. Estos
resultados parecen corroborar la hipótesis de partida ya que la población más
expuesta es la que peor rendimiento tuvo mientras que la menos expuesta
presentó mejores puntuaciones. En conclusión, las diferencias observadas en la
memoria a corto plazo y en la codificación de las percepciones visuales podría
deberse a un efecto precoz del plaguicida sobre el cerebro aún inmaduro de los
adolescentes.
AUTORES
A. J. Martos Mula, E. N. Figueroa, M. A. Ruggeri, S. A. Giunta, N. R. Wierna, M.
Bonillo, M. G. Bovi
http://ojs.easyapps.es/index.php/revtoxicol/article/view/142
Actividad de las colinesterasas sanguíneas en una población de referencia
costarricense
Se determina la actividad de las colinesterasas sanguíneas, en una población
costarricense de 50 hombres y 50 mujeres, no expuesta a plaguicidas, utilizando
el método electrométrico de Michel.
Se encuentra que hay relación entre la actividad de las colinesterasas plasmáticas
y el sexo.
Se estiman límites de confianza al 95 por ciento para la actividad de las
colinesterasas plasmáticas y de glóbulos rojos.
La dispersión relativa (coeficiente de variación) de los valores obtenidos en esta
investigación, están en el ámbito de los resultados encontrados en trabajos
semejantes, e incluso en algunos casos, la diferencia entre dichos coeficientes no
llega al 2 por ciento.
[Rev. Cost. Cienc. Méd. 1984; 5(2):158-169].
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Autores
Sileny Vega S. *, Irma M. Maroto J. *, Claudia M. Zúñiga V. *
Femando Ramírez H. *
Niveles de colinesterasa en manipuladores de plaguicidas de las Guaranas
(San Francisco deMacorís) y Colonia Kennedy (Constanza)
La colinesterasa son enzimas utilizados para medir los niveles de plaguicidas
mediante la catalización de la hidrólisis de la acetilcolina en ácido acético y colina.
Paratales fines fue llevado a cabo un estudio descriptivo y prospectivo con el
propósito de determinar dichos niveles en 105 manipuladores de plaguicidas
mediante el métodoLobivandR de los parajes Las Guáranas (San Francisco de
Macorls) y Colonia Kennedy (Constanza) durante el periodo Julio-Agosto del 2002.
Encontrándose que 6 manipuladores (5.7%) tenlan niveles de colinesterasa entre
50-25%, compatible con intoxicación por plaguicidas; 4 (66.7%) correspondieron al
sexo masculino; 3 (50%) estaban comprendidos entre los 20-29 ar'los; 2 (33.3%);
tenlan un nivel primario, 2 más (33.3%) un nivel secundario y 3 (50%) laboraban
como almacenistas.
Autores
YokastaMaria Delgado Nuñez*, Rafel Reynoso*, Cruz Altagracia Robles Marrero*,
Cecilia Miranda*, Ramon Emilio Diaz*
Validación de la determinación de acetilcolinesterasa eritrocítica humana a
340 nm.
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Introducción. Se presenta la validación de un método de monitoreo continuo para
la cuantificación de acetilcolinesterasa eritrocítica humana (EC. 3.1.1.7)
empleando ácido 6-6‘- ditiodinicotínico (DTNA) como indicador.
Materiales y métodos. Se emplearon muestras de sangre total recogida con
EDTA como anticoagulante. En este método la tiocolina liberada de la
acetiltiocolina por la colinesterasa, reacciona con el DTNA liberando ácido
tionicotínico y el aumento de absorbancia a 340 nM es proporcional a la actividad
de la enzima. La interferencia debida a colinesterasa plasmática se elimina
mediante el empleo de quinidina.
Resultados. Las precisiones día a día para muestras con valores de colinesterasa
bajos y altos mostraron coeficientes de variación de 3,2 y 5,7 por ciento y en un
mismo día de 2,9 y 1,5 por ciento respectivamente. La bilirrubina y la hemoglobina
no presentan interferencia. El reactivo de DTNA almacenado en botella ámbar es
estable por al menos 6 meses a 4-8ºC. Al comparar los resultados con métodos
comerciales basados en la reacción de Ellman se obtuvo una ecuación de
regresión lineal de Y = 0,987(X) + 222, con un coeficiente de correlación (r) de
0,958 y una desviación estándar sobre la línea de regresión (Sy/x) de 359 U/L.
Discusión. El método evaluado constituye una alternativa precisa, sensible y
conveniente para la determinación de acetilcolinesterasa humana.
Además posee la gran ventaja sobre los métodos con DTNB, de no sufrir
interferencia por hemoglobina. Los datos obtenidos indican que el método es lineal
y reproducible dentro del intervalo en el que se espera encontrar los valores de las
muestras. El estudio comparativo con métodos comerciales mostró una buena
correlación.
(Rev Biomed 2000; 11:161-168)
2.3.- ESTADO DE LA CUESTION
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El uso indiscriminado de los plaguicidas y el escaso conocimiento de sus efectos
cronicos en las personas expuestas a sido motivo de numerosas investigaciones,
una de las tecnicas mas utilizadas para medir el grado de afeccion en la salud es
la medicion de los niveñes de colinesterasa en sangre.
Uno de los propositos de este trabajo es el de evaluar nosotros mismos la
importancia que pueda tener las alteraciones de la colinestersasaserica en
trabajadores expuestos a organofosforados
Se sabe a travez de la literatura mundial y de trabajos de investigacion que en
algunos centros hospitalarios preferentemente quirurgicos han adoptado la
conducta rutinaria de incluir la determinacio de colinesterasa serica como prueva
preoperatoria, el otro proposito es el de cerciorarnos de la valida que en otros
sitios se les da
2.4.- BASES TEORICO CIENTIFICAS
PLAGUICIDAS
El uso de los plaguicidas quimicos, con sus beneficios y sus efectos colaterales
adversos, se ha convertido en un problema tanto emotivo como tecnico en todo el
mundo. El gran numero de compuestos que se utilizan actualmente, la falta de
control y registro adecuados, y la poca comprension de sus efectos colaterales,
refleja el echo de que los productos agroquimicos, al igual que otras sustancias
quimicas de origen industrial, se han usado en cantidades elevadas con base en
las necesidaddes economicas de los paises, incluyendo en estas, la produccion de
alimentos, fibras y materiales para la construccion destinados al consumo nacional
y/o a la exportacion. (Arata A.)
La Food and Agriculture Organization (FAO) de las Naciones Unidas establece
que un plaguicida es la sustancia o mezcla de ellas, destinada a prevenir, destruir
o controlar plagas, incluyendo los vectores de enfermedad humana o animal.
(Ramírez, J. A. y Lacasaña, M. 2001)
ORGANOFOSFORADOS
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Los insecticidas organofosforados son sustancias biodegradables en la naturaleza,
sin tendencia a acumularseen las grasas del organismoo, que forman parte del
grupo de insecticidas llamados de contacto, por absorverse por intermedio de los
lipidos del caparazon de los insectos; son muy activos contra gran numero de de
species de insectos. Todos ellos derivan de la molecula de acido fosforico.
(Gisbert C)
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS.
Son ésteres del ácido fosfórico, cuyo núcleo químico es:
Existe una gran variedad de productos diferentes, debido a los diferentes radicales
que se pueden presentar en las fórmulas base.
En general son fácilmente degradables a productos hidrosolubles, por lo que son
fácilmente eliminados del organismo de los diferentes animales. Produciendo
menos acumulación de residuos que los organoclorados, por lo que su uso se ha
extendido mucho. En cuanto al poder de disolución, los hay de diferentes clases:
(Junta de Andalucía, España, 2005)
Muy solubles en agua e insolubles en lípidos, resultan en productos de
acción directa.
Muy solubles en lípidos y poco solubles en agua, son productos que
penetran bien en los tejidos pero no son transportados por vía sistémica.
Muy solubles en agua y solubilidad media en lípidos, son los que se
difunden mejor por vía sistémica.
PRINCIPALES ORGANOFOSFORADOS QUE AFECTAN AL HOMBRE Y
OTROS SERES VIVOS
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Paratión
Fenitrotión
Diacinón
Dimetoato
Fentión
Diclorvós
Malatión
Demetón
MECANISMO DE TOXICIDAD DE LOS ORGANOFOSFORADOS
Los agentes organofosforados actúan al inhibir la acción de la acetilcolinesterasa
sobre la sinapsis hística (muscarinicas y nicotínicas), por deposito de un grupo
fosforil en el centro de actividad de la enzima. Esta inhibición favorece la
acumulación excesiva de ACh y por ende, la sobreestimulación de los receptores
colinérgicos (Cabrera A. y Varela W. 2009)
MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Síntomas y signos incluyen salivación excesiva y lacrimación, fasciculaciones y
debilidad muscular, miosis, así como un olor característico atribuido a los
solventes hidrocarburos del pesticida. El paciente puede presentar
frecuentemente, depresión del estado de la conciencia e incluso convulsiones
(Tabla 1). Otras manifestaciones de la inhibición de la acetilcolinesterasa en el
cerebro incluyen insomnio, cefalea, mareos y confusión. La intoxicación severa
con OP se asocia con disartria, coma y depresión respiratoria. Se describe
clásicamente la bradicardia como una manifestación típica, pero algunos pacientes
presentan taquicardia, atribuido a la estimulación de receptores nicotínicos
preganglionares, sumado a un aumento de la secreción de adrenalina y
noradrenalina de las glándulas suprarrenales. Otro factor que puede contribuir con
24
la taquicardia es la hipoxia por insuficiencia respiratoria.(Cabrera A. y Varela W.
2009)
Fuente: REVISTA MEDICA DE COSTA RICA Y CENTROAMERICA LXVI (588)
161-167; 2009 Cabrera A. y Varela W. 2009
FUENTES Y PATRONES DE EXPOSICIÓN
El medio ambiente es una fuente primordial de exposición a plaguicidas, a partir
de la actividad agrícola. Aproximadamente el 47% del producto aplicado se
deposita en suelos y aguas colindantes o se dispersa en la atmósfera. Esta
situación depende de condiciones climáticas como la lluvia y la dirección e
intensidad del viento, de características geológicas como el tipo de suelo y la
presencia de corrientes de agua, y de otros factores como la fórmula y la
presentación del producto (líquido, polvo, gel, gas, etc.), así como de la técnica de
aplicación (aérea, terrestre, etc.). Los vientos fuertes, las temperaturas altas y los
25
terrenos poco estables favorecen el arrastre del producto, así como las
presentaciones en polvo, aerosoles o humo y, por supuesto, las aplicaciones
aéreas. (Ramírez, J. A. y Lacasaña, M.2001)
VÍAS DE ENTRADA
Las vías de entrada de los tóxicos más frecuentes son la cutánea, incluida la
exposición a la ropa de trabajo, y la respiratoria (entre ambas el 77% de los casos)
y la digestiva (14%). La vía digestiva está muy asociada a comer, beber o fumar
en el trabajo. (Cabanillas J. L. y Fernández M. 1999)
DIAGNÓSTICO
El diagnóstico de envenenamiento por organofosforado es primordialmente clínico,
aunque idealmente podría ser confirmado con la medición de la actividad de la
butirilcolinesterasa plasmática o acetilcolinesterasa de los glóbulos rojos.6,14 La
actividad de butirilcolinesterasa (pseudocolinesterasa) no está relacionada con la
severidad del cuadro clínico, pero es un marcador de la exposición a agentes
organofosforados u otros inhibidores de colinesterasas y también es útil para
medir la eliminación corporal del pesticida. Cuando la actividad de las
colinesterasas es menor del 80% del rango menor de referencia, es muy sugestivo
de exposición significativa a un organofosforado. Algunos estudios sugieren que la
actividad de la acetilcolinesterasa de los hematíes es un buen marcador de la
función sináptica y las necesidades de atropina en un paciente intoxicado, y
probablemente un marcador de severidad. Los pacientes con una actividad de
acetilcolinesterasa mayor del 30% mantienen una función muscular normal y no
requieren de la atropina. Cuando la actividad enzimática desciende por debajo de
10% la actividad muscular empeora y requiere el uso de altas dosis de atropina.
La actividad enzimática entre 10 y 30% se caracterizan por manifestaciones
26
musculares moderadas y menor necesidad de atropina. (Cabrera A. y Varela W.
2009)
TRATAMIENTO
ELIMINACIÓN DEL TÓXICO
Es necesario eliminar la mayor cantidad posible del tóxico para evitar su absorción
y contaminación de personal sanitario.
Vía de entrada respiratoria: retirar al paciente de la zona contaminada
Vía de entrada cutáneo-mucosa: Hay que desechar la ropa del paciente y
lavar con abundante agua y jabón. Se recomienda que el personal que lo
realice utilice sistemas de protección: guantes, mascarillas y gafas, así
como una zona bien ventilada y rotación del personal.
Vía de entrada digestiva: realizar lavado gástrico y administrar carbón
activado a dosis de 1g/Kg. La eficacia es mayor si se inicia durante la
primera hora tras la Ingestión (mejor 30 minutos). En medio
extrahospitalario se puede inducir el vómito si se va a demorar mucho la
asistencia hospitalaria. Nunca administrar leche o aceite ya que al ser
liposoluble aumenta su absorción. (Pino A. y Brezmes M. 2012)
MEDICACIÓN
Atropina: Revierte los síntomas colinérgicos y mejora la función cardiaca y
respiratoria. Cruza la barrera hematoencefálica por lo que al contrarrestar los
efectos de Acetilcolina en SNC controla las convulsiones
Oximas(Pralidoxima): El uso de las oximas va dirigido a reactivar las
colinesterasas inhibidas por el organofosforado. Eficaz para los síntomas
nicotínicos. Su administración debe ser precoz en las primeras 6-24 h, siempre
tras atropinización.
27
Benzodiacepinas: Se utilizan para el tratamiento de la agitación y
lasconvulsiones.
Bicarbonato sódico 1M: En caso de intoxicaciones graves que cursen con
acidosis.
Sulfato de Magnesio: Disminuye la toxicidad de los organofosforados al
controlarla Hipertensión y taquicardia ventricular (torsaides) y corregir
lahipomagnesemia (resistencia a atropina). (Pino A. y Brezmes M. 2012)
ENZIMA COLINESTERASA
La acetilcolinesterasa (AChE) es la enzima que termina el efecto neurotransmisor
de la acetilcolina y junto con la butirilcolinesterasa (BChE) pertenece al grupo de
enzimas denominadas colinesterasas (ChEs), (Sánchez G. y Salceda R. 2008)
La acetilcolinesterasa es una esterasa que hidroliza a la acetilcolina,
neurotransmisor en muchas sinapsis, especialmente en las placas neuromotoras.
Analicemos, en primer lugar, de qué manera la enzima acetilcolinesterasa actúa
sobre la acetilcolina, para luego estudiar la forma como los organofosforados y los
carbamatos afectan la actividad de la colinesterasa, alterando de esta manera, la
función de la acetilcolina en la transmisión de los impulsos nerviosos.
La acetilcolinesterasa es una enzima situada en las hendiduras sinápticas y allí va
a hidrolizar a la acetilcolina, después de que ésta haya realizado su función
mediante la unión a sus receptores, permitiendo así que las sinapsis colinérgicas
transmitan los impulsos nerviosos. La reacción catalizada es la hidrólisis de la
acetilcolina hasta colina y acetato:
28
La acetilcolinesterasa es una esterasa tipo B y tiene un resto de SER en el centro
activo y cursa con un mecanismo de acción catalítica del tipo "catálisis covalente",
con la generación de un intermediario covalente. (VIDAL C. J.)
Un elevado número de esteres son hidrolizados por enzimas, genéricamente
denominados esterasas. La definición y posterior clasificación de las
colinesterasas tuvo su origen en el descubrimiento hechopor Galehr y Plattner
(1927) de la distinta especificidad de sustrato que poseían las esterasas de sangre
completa y de suero. Posteriormente, Stedman y Easson (1932) prepararon un
enzima de suero de caballo que se consideró específico para hidrolizar esteres de
colina y se encontró que este enzima era capaz de hidrolizar a la butirilcolina más
rápidamente que a la acetilcolina. (VIDAL MORENO J.C.)
VIDAL MORENO J.C.
CENTRO ACTIVO Y MECANISMO DE ACCIÓN DE COLINESTERASAS
Las colinesterasas son serín-hidrolasas con ciertas propiedades catalíticas
parecidas a esterasas y peptidasas. El enzima cataliza la reacción que se expresa
en la figura (VIDAL MORENO J.C.)
29
VARIACIONES EN LA ACTIVIDAD DE LAS COLINESTERASAS
Se ha encontrado que éstas pueden variar en una persona en intervalos de tiempo
y existen también variaciones según el sexo; las colinesterasas eritrocíticas y las
plasmáticas varían independientemente, aún en ausencia de inhibitorios
exógenos.
Las colinesterasas plasmáticas disminuyen en los períodos menstruales, en
hepatitis, desnutrición, enfermedades crónicas debilitantes, en las deficiencias de
tiamina y de proteínas. No parecen existir variaciones en los casos de ictericias
obstructivas no complicadas, en miastenia gravis, hipertiroidismo, asma,
hipertensión arterial, epilepsia, diabetes mellitus.(Córdoba D. y Cadavid S.)
VARIACIÓN EN LA INHIBICIÓN ENZIMÁTICA SEGÚN LOS COMPUESTOS
Estudios de varios autores muestran que existe diferencia en cuanto a la inhibición
de la actividad de las colinesterasas plasmáticas y eritrocíticas según la naturaleza
del compuesto inhibidor: así por ejemplo, inhiben más las colinesterasas
eritrocíticas compuestos como el parathión, diclorvós, dimefox, metilparathión,
schradán, malathión y en cambio, inhiben las plasmáticas con mayor intensidad, el
diazinón, mipafox y bromofox. (Córdoba D. y Cadavid S.)
DETERMINACION DE LA COLINESTERASA PLASMATICA
La actividad de la colinesterasa plasmática se determina
espectrofotométricamente según el método de Ellman y col, utilizando yoduro
acetiltiocolina, como sustrato, 50μL de plasma a 3 mL de una solución de
ditiobismitrobenzoico. (Córdoba D. y Cadavid S.). Además existen otros métodos:
30
MÉTODOS BASADOS EN LA DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO ACÉTICO
PRODUCIDO EN LA REACCIÓN
Estos métodos caen en dos categorías. En la primera se deja actuar al enzima
sobre el sustrato, en un medio convenientemente tamponado, durante un tiempo
suficientemente largo (1-2 horas) para que exista una variación apreciable de pH.
La variación del pH (ApH/h) desde el principio al final del período de incubación
proporciona una medida de la actividad enzimática (Michel, 1949). Los
inconvenientes de este método son su larga duración y el efecto que la creciente
acidez del medio tiene sobre la actividad del enzima. Las ventajas son su
simplicidad, tanto por el instrumental (pH-metro) como por el grado depreparación
necesario para interpretar los resultados. Corrigiendo los resultados mediante
tablas la variación de actividad con el pH del medio, el método se utiliza
ampliamente en centros sanitarios como técnica rutinaria para la determinación de
colinesterasa en eritrocitos y suero. Un segundo método, más sofisticado que el
anterior, consiste en la valoración continua del ácido liberado en la hidrólisis del
colínéster con una disolución alcalina estándar, de forma que a lo largo de todo el
tiempo de reacción el pH se mantiene constante (Wilson, 1954). (VIDAL MORENO
J.C.)
Para esta .técnica se requiere un instrumental costoso (valorador automático
Radiometer, autobureta automática y accesorios de valoración), y si bien se utiliza
frecuentemente para trabajos de investigación dada su precisión y
reproducibilidad, no se utiliza como método rutinario.
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
De entre los que utilizan esta técnica, el más utilizado es el de Ellman (1961).
Empleando como sustrato acetiltiocolina, se produce un mercaptano tras la
hidrólisis enzimática, el cual reacciona con el ácido 5,5'-ditiobis-nitrobenzoico,
desdoblándolo en dos productos, uno de los cuales, el ácido 5-tio-2-nitrobenzoico,
absorbe a 412 nm. La reacción que tiene lugar es
31
Este método se ha aplicado ampliamente en la determinación de colinesterasa de
cualquier tejido y de plasma y es muy adaptable para análisis de rutina mediante
procedimientos automatizados. (VIDAL MORENO J.C.)
MÉTODOS RADIOMÉTRICOS
Se basan en el empleo de un sustrato marcado (acetil-1-C-colina o butiril-1-C-
colina), de suerte que el ácido producido durante la hidrólisis enzimática puede ser
"evaluado mediante un contador de radiactividad (Siakotos, 1969). Estas técnicas
son muy caras, y naturalmente muy sensibles. Se reservan, por lo tanto, para
microdeterminaciones de actividad en casos muy particulares.
2.5.- MARCO CONCEPTUAL ODEFINICION DE TERMINOS BASICOS
Agroquímicos: son sustancias químicas muy utilizadas en la agricultura,
cuyo objetivo principal es mantener y conservar los cultivos
Aerosol: Suspensión de partículas muy finas de un líquido o un sólido en un
medio gaseoso
Efecto colateral: Parámetro distinto del efecto primario que se deriva de la
acción farmacológica primaria de un medicamento, o sea, aquella que
produce su efecto terapéutico.
Extrahospitalario: Referido a algo que no pertenece a un hospital o
nosocomio
32
Hendiduras sinápticas: El pequeño espacio entre dos células nerviosas a
través del cual los neurotransmisores acetilcolina se difunde.
FAO: La Food and Agriculture Organization
Biodegradables: Sustancia que puede ser descompuesta con cierta rapidez
por organismos vivientes, los más importantes de los cuales son bacterias
aerobias. Sustancia que se descompone o desintegra con relativa rapidez
en compuestos simples por alguna forma de vida como: bacterias, hongos,
gusanos e insectos.
Funcion sináptica: Es la relación funcional de contacto entre las
terminaciones de las células nerviosas
Muscarinicas: Que caracteriza los efectos colinérgicos posganglionares de
muscarina en impulsos nerviosos parasimpáticos.
Nicotínicos: Que caracteriza el efecto de la nicotina y otras drogas en la
estimulación inicialmente y posteriormente, en altas dosis, la inhibición de
impulsos neuronales en los ganglios autónomos y la unión neuromuscular.
Bradicardia: disminución del número de contracciones cardíacas inferior a
60 por minuto. Pulso anormalmente lento.
Taquicardia: Aumento del ritmo de los latidos del corazón. Puede
producirse como un proceso puramente fisiológico durante un esfuerzo
físico intenso, o por causas patológicas, como en la enfermedad de
Basedow* o en algunas insuficiencias cardíacas
Hipoxia: Disminución del aporte o contenido de oxígeno en el organismo.
Es un estado que surge al no corresponderse la necesidad de oxígeno de la
célula con el suministro del mismo a ésta.
33
CAPÍTULO III
CAPITULO III
MATERIALES Y METODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. MATERIAL DE LABORATORIO
34
Agujas descartables de # 20 x 1 ½.
Baño Maria.
Beaker de 10 mL, marca PYREX.
Botella de vidrio 200 mL con tapón atornillable.
Caja Tecnopor.
Celdas de plástico cuadradas de 10mm de longitud de paso de luz
(ancho), Glass Quartz, marca Cole Parmer, capacidad 3,5 mL.
Cronómetro.
Erlenmeyer de 10 y 200 mL, marca PYREX.
Etanol 98°.
Fiolas de 10, 100, 200 mL, marca PYREX.
Gradillas para tubos de ensayo.
Micropipetas automáticas de 20 y 50 mL.
Ligaduras de goma
Papel absorbente.
Pipetas de 5 mL.
Puntas amarillas para micropipetas.
Termómetro.
Tubos de ensayo, marca PYREX.
Viales aproximadamente de 5 mL.
3.1.2. EQUIPOS
Balanza analítica digital
Centrifuga
Espectrofotómetro
Refrigerador.
35
3.1.3 REACTIVOS
Ácido ditiobisnitrobenzoico DTNB 0,25 mM, pH final 7,7. (5,5 Dithiobis (2
- Nitrobenzoil acid)) SIGMA, lote 29H0951, fw. 396,3.
Ioduro de acetiltiocolina 0,075 M, SIGMA, lote 1941067, fw. 286,2.
Na2HPO4. 2 H2O al 99,5%, M=177,99 g/mol., Merck,
KH2PO4 al 99,7%, Fisher Chemicals.
Estable 1 mes a 4 °C.
3.2. DISEÑO METODOLOGICO
3.2.1 NIVEL Y TIPO DE INVESTIGACIÓN
NIVEL.- Se realizara un estudio no experimental porque no se
manipulara variables
TIPO.- Estudio transversal, porque se recolectara datos en un solo
momento, en un tiempo único..
3.2.2. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
Se forman 3 grupos experimentales cada uno conformado por 20 para la
determinación de la actividad de la colinesterasa eritrocitaria en trabajadores de la
ciudad de los cuscos expuestos, no expuestos a organofosforados.
3.2.3. VARIABLES
VARIABLES DEPENDIENTES
Determinación de colinesterasa eritrocitaria
VARIABLES INDEPENDIENTES
36
Nivel de la actividad de la colinesterasa eritrocitaria
VARIABLES INTERVINIENTES
Edad
DETERMINACIÓN DE COLINESTERASA ERITROCITARIA
Definición Conceptual: Examen o prueba de laboratorio que determina el
nivel de la actividad de la colinesterasa eritrocitaria en personas expuestas
a plaguicidas.(VIDAL MORENO C .J.)
Definición Operacional: Esta variable se determina mediante técnicas
laboratoriales. Usando el método de Ellman modificado y posterior lectura a
través de un espectrofotómetro
Naturaleza de la Variable: Cuantitativa
Medición: indirecta
Escala: Ordinal
Instrumento: Espectrofotómetro. Se tomará, las muestras de sangre y se
cuantificará usando el método de Ellman modificado.
Expresión Final: mU/mL
NIVEL DE LA ACTIVIDAD DE LA COLINESTERASA ERITROCITARIA
Definición conceptual: concentración de colinesterasa eritrocitaria que
cumple función de hidrolizar la acetilcolina en el organismo
Definición operacional: Se realizará a través del cálculo de la cantidad de
colinesterasa mediante la siguiente formula.
37
Donde:
U: Representa la cantidad de enzima que convierte un micromol de sustrato
por minuto en condiciones estándares.
ε: Absortividad milimolar del 5 – tio – 2 – nitrobenzoato. Factor calculado
para cubetas de sección cuadrada de un cm de paso de luz y cuyo valor a
405 nm es de 13,162.
103: Factor de corrección para pasar de milimol a micromol.
|VT: Volumen total de la reacción en mL.
VM: Volumen de muestra sin diluir en mL.
LCO: Longitud de camino óptico (1 cm).
.
Naturaleza de la variable: Cuantitativa
Medición: indirecta
Escala: ordinal
Instrumento: espectrofotómetro
Expresión final: mU/mL
EDAD
Definición Conceptual: Tiempo transcurrido en años, desde el nacimiento
hasta la extracción sanguínea para el examen de colinesterasa
Definición Operacional: Se determina haciendo interrogaciones a la
persona.
Naturaleza de la Variable: Cuantitativa
Medición: Directa
Escala: Numeral
Instrumento: En forma interrogativa, preguntas y cuestionario
Expresión Final: En Años:
18 - 29 años
38
30 - 41 años 42 - 53 años 54 - 65 años
3.2.4 POBLACION Y MUESTRA
3.2.4.1. POBLACION
La parte experimental de la presente investigación se realizara en la
ciudad del Cusco a individuos, todos ellos dedicados a la agricultura y de un
bajo nivel socio – cultural y con pocos recursos económicos, lo cual se pudo
constatar por observación y previa encuesta a los agricultores incluidos en
el estudio.
Entre los indicadores observados en los agricultores y sus familias se
pueden mencionar:
El bajo nivel cultural de los pobladores, quienes se ven obligados a trabajar
a temprana edad descuidando su educación. La mayoría de ellos sólo tiene
estudios primarios.
Precariedad de las viviendas en las que viven que apenas cuentan con
servicio de luz en algunos casos, no existiendo servicios de agua y
desagüe.
3.2.4.2 MUESTRA
Suero o plasma de personas expuesta, no expuestas y consumidores de
coca; 20 individuos por grupo.
3.2.5 CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION
3.2.5.1.- CRITERIOS DE INCLUSION:
Individuos mayores de 18 y 65 años que declararen haber trabajado
con plaguicidas en un periodo no mayor de 14 días antes de la toma
de la muestra.
39
Personas que firmen el consentimiento de participación voluntaria en
el presente estudio
Sexo: ambos.
Personas nacidas y residentes del Cusco.
3.2.5.2.- CRITERIOS DE EXCLUSIÓN:
Personas menores de 18 años y mayores de 65 años de edad.
No se considera mujeres gestantes o en periodo menstrual ni
individuos que seguían algún tratamiento farmacológico.
Personas que no acepten participar en el estudio.
Personas que no firmen el consentimiento de participación voluntaria
en el presente estudio.
Personas no nacidas ni residentes del Cusco.
3.2.6.- TECNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS
INSTRUMENTO
Se utilizaron fichas de investigación
o Formulario de consentimiento para su participación voluntaria.
o Ficha de investigación para datos generales y variables de
estudio
Extracción de sangre venosa.
Para la cuantificación de las muestras se utilizó el espectrofotómetro, para el
método analítico colorimétrico, y el cromatografo de gases. ANEXO(6)
TECNICA DE RECOLECCIÓN DE DATOS
40
La captación de sujetos de estudio en el presente trabajo de
investigación se realizó mediante charlas informativas sobre métodos
para la determinación de colinesterasa eritrocitaria. Se dio conocer
el trabajo de investigación y se consiguió en consentimiento de las
personas voluntarias para participar en el estudio, durante este
proceso todas las personas fueron informadas del objetivo del
estudio.
Se realizó una explicación oral y se absolvieron todas las inquietudes
que tuvieron los sujetos de estudio
Para la obtención de datos personales se utilizó la técnica de
entrevista y como instrumento una ficha estructurada, así se obtuvo:
consumo de medicamentos, edad, talla, peso, etc
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE LA MUESTRA BIOLOGICA
(SANGRE)
Para la toma de muestra se utiliza como técnica la venopunción.
Para la recolección de la sangre previamente se realiza la
desinfección de la piel. Para esto se utilizó algodón impregnado con
alcohol.
TÉCNICA PARA LA OBTENCIÓN DE DATOS DE NIVEL DE
COLINESTERASA
Para la obtención de los datos de utilizaron como instrumentos el
Espectrofotómetro
3.2.7.- TECNICAS PARA EL PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE LA
INFORMACION
41
Previo al análisis y procesamiento de la información obtenida se efectúa la revisión
de los datos contenidos en el instrumento, así también, se pasa al vaciado de la
información SOFTWARE SPSS 11 para los análisis respectivos.
3.3. PROCEDIMIENTO
Determinación cuantitativa de la actividad de la colinesterasa sérica -
método espectrofotométrico (técnica de Ellman modificado).
Fundamento
La enzima colinesterasa cataliza la hidrólisis de ésteres de colina, tal como la s-
butiltiocolina, con máxima actividad a pH 7,7. (GOODMAN y GILMAN): Las bases
farmacológicas de la terapéuticaComo sustrato se emplea el yoduro de
acetiltiocolina que es escindido muy fácilmente por acción de la colinesterasa del
plasma a tiocolina. La tiocolina liberada reacciona con el ácido 5,5 ditiobis - 2 -
nitrobenzoico (DTNB) produciendo un compuesto de color amarillo, el
ditiobisnitrobenzoato, el cual en medio alcalino genera compuestos resonantes de
color amarillo (FIGURA).
Hay que señalar que la acetilcolinesterasa de los eritrocitos, que es liberada ya en
una hemólisis ligera, en este caso no interfiere.
La velocidad de aparición de la coloración es proporcional a la actividad
enzimática y se mide a 405 nm a una temperatura fija de 25 °C.
42
IOVINE, Enrique.: El laboratorio en la clínica. Buenos Aires. Editorial médica. 1998, pp. 1353 - 1354.PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
a. Buffer fosfato 0.1 M. pH 8.0:
Tomar 55,85 mL de solución Na2HPO4. 2 H2O (17.800 g ‰ p/v en
agua).
Tomar 44,15 mL de solución KH2PO4 (9.073 g ‰ p/v en agua).
Mezclar ambas soluciones.
b. Buffer fosfato 0.1 M. pH 7.0:
Tomar 61,2 mL de solución Na2HPO4.2 H2O (17.800 g ‰ p/v en
agua).
Tomar 38,8 mL de solución KH2PO4 (9.073 g ‰ p/v en agua).
Mezclar ambas soluciones.
c. Sustrato yoduro de acetiltiocolina 0,075 M:
Yoduro de acetiltiocolina 217 mg.
Agua destilada 10 mL.
Estable a 4 °C durante 15 días.
d. Solución madre de DTNB 10 mM:}
43
Ácido ditiobisnitrobenzoico (DTNB) 39,6 mg.
Buffer fosfato 0,1 M. pH 7,0 10 mL.
Bicarbonato de sodio 15 mg.
Estable 1 mes a 4 °C.
e. Solución hija de DTNB 0,25 mM:
Por dilución de la anterior en buffer fosfatos 0,1 M. pH 8,0:
Solución madre de DTNB 0,2 mL.
Buffer fosfatos 0,1 M. pH 8,0 c.s.p. 8,0 mL.
TÉCNICA OPERATORIA
Se procede en 2 tubos de ensayo, uno para la muestra y otro para el
blanco, sometidos a baño María para mantener la temperatura a 25 °C:
PRUEBA BLANCO
Reactivo DTNB (reactivo
e)
3 mL 3 mL
Suero 50μ ----
Sustrato (reactivo c) 20μ 20μ
Se ajusta la absorbancia del espectrofotómetro a cero (automático).
Se mezcla bien por inversión el contenido de los tubos de ensayo.
Se determina la absorbancia a 405 nm cada minuto durante 3 minutos.
Se calcula el promedio de los cambios de absorbancia por minuto de la
muestra (DApm), es decir hallamos el promedio de las diferencias entre la
segunda y primera lectura, y la tercera y segunda lectura, previa corrección
de estas (restar la absorbancia de la muestra de la del blanco).
Cálculos
Tenemos:
Acm = (Am – Ab)
44
DApm = Promedio de los cambios de absorbancia por minuto (promedio de
las diferencias de Acm).
Donde:
Am: Absorbancia de muestra.
Ab: Absorbancia del blanco.
Acm: Absorbancia corregida de la muestra.
Además la formula para el cálculo de la actividad de la colinesterasa sérica
en
miliunidades por mililitro de muestra (ActCoSe (mU/mL)) es:
Donde:
U: Representa la cantidad de enzima que convierte un micromol de sustrato
por minuto en condiciones estándares.
ε: Absortividad milimolar del 5 – tio – 2 – nitrobenzoato. Factor calculado
para cubetas de sección cuadrada de un cm de paso de luz y cuyo valor a
405 nm es de 13,162.
103: Factor de corrección para pasar de milimol a micromol.
|VT: Volumen total de la reacción en mL.
VM: Volumen de muestra sin diluir en mL.
LCO: Longitud de camino óptico (1 cm).
45
VALORES DEREFERENCIA
FLOJUGRAMA DEL PROCEDIMIENTO
46
Personas que cumplieran con los criterios de inclusión
Sujetos voluntarios, consentimiento informado se mide peso talla edad
Toma de muestra
1° Muestra sanguínea 5 mL
Resultados por espectrofotometria
ANÁLISIS DE LOS DATOS
Baño María
2° Muestra suero 50 μL
Centrifugar
47
CAPITULO IV
4.- RECURSOS
4.1.- HUMANOS
ASESORES DEL PROYECTO
Carlos Moreira Pachas: Docente principal del area de toxicologia
del departamento de farmacia y bioquímica. UNSAAC
Luz Marina : Docente principal del area de hematología y serología
de la facultad de biologia. UNSAAC
INVESTIGADORES
ROSA MARINA CASAVERDE PUMACAYO
JUAN JOEL QUISPE HUISA
4.2.- INFRAESTRUCTURA
Laboratorio de toxicología de la carrera profesional de farmacia y
bioquímica de la universidad nacional san Antonio abad del cusco
Laboratorio de serología y hematología de la universidad nacional
san Antonio abad del cusco
4.3.- ECONOMICOS
Presupuesto propio de los tesistas
48
CAPITULO V
PRESUPUESTO
Actividades Costos
Elaboración del proyecto
Revisión bibliográfica :internet
Impresión y fotocopia de revisión bibliografica
Impresión y fotocopia del proyecto
Tramite documentario
100.00
100.00
30.00
100.00
Movilidad 100.00
Determinación de pruebas preliminares
Compra de materiales de vidrio 200.00
Realización del diseño metodológico y experimetal
compra de materiales quirúrgicos
materiales de escritorio
guada polvos
compra de reactivos
compra de golosinas a base de nuez y otros
100.00
50.00
60.00
800.00
100.00
Análisis y conclusión del proyecto
Impresiones y fotocopia de tesis concluida 100.00
Tramite documentario 70.00
Costo total del proyecto 1910.00
FUENTE: elaboración propia
49
CAPITULO VI
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
actividades
Año
2012
Año
2013
setiemb
re
octubre Noviem
bre
diciemb
re
enero febrero marzo abril mayo
Revisión
bibliografica y
ampliacion
del marco
teorico
XXXX XXXX XXXX XXXX XXXX XXXX XXXX
Elaboracion
aprovacion
del proyecto
XXXX XXX
Realización
de charlas
para captar
voluntarios
XXXX XXXX XXXX XXXX XXX
Realización
del proyecto
XXXX XXX
X
Observacion
y analisis
XX XX
Determinaicio
n de los
valores de
colinesterasa
XX XX
Analisis y
discusion de
XX
50
resultados
Redaccion y
presentacion
del informe
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FUENTE: elaboración propia
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