Resume Jurnal

“A New Fibrinolytic Enzyme (55 kDa) from Allium tuberosum:

Purification, Characterization, and Comparison”

(enzim Fibrinolisis baru (55kDa) dari Allium tuberosum: pemurnian, karakterisasi, dan

pembandingan)

Akumulasi fibrin berlebih di dalam pembuluh darah biasanya merupakan pemacu

terjadinya infark miocard dan gangguan kardiovasekular lainnya. Fibrin adalah protein

primer yang mempengaruhi pembekuan (penggumpalan) sel darah, fibrin terbentuk dari

fibrinogen yang telah di aktivasi oleh trombin. Fibrin menghancurkan enzym fibrinolysis,

plasmin, yang bertugas untuk mempertahankan laju aliran darah pada sisi pembuluh yang

terluka (agar tidak terjadi pendarahan yang terlalu parah), serta merupakan komponen yang

penting dalam respon homeostatik yang normal.

Umumnya zat trombolisis bekerja dengan 2 cara yaitu : (1)mengaktivasi plasmogenin,

seperti urokinase,streptokinase, yang mengaktivkan plasmogenin menjadi plasmin.

(2)terdapat pula yang bekerja dengan cara “plasmin- like proteins”, seperti nattokinase3 and

lumbrokinase, yang secara langsung menghancurkan fibrin.

Meskipun telah banyak ditemukan zat-zat fibrinolysis namun zat-zat tersebut

memiliki efek samping yang tidak diinginkan, bekerja secara kurang spesifik terhadap fibrin,

dan juga mahal. Sehingga timbul pemikiran dari peneliti untuk menemukan senyawa

fibrinolysis yang jauh menguntungkan.

Baru-baru ini enzim fibrinolysis yang poten telah banyak diisolasi dan dikarakterisasi

dari berbagai spesies, namun yang ditemukan dari tanaman masih jarang. Kebanyakan dari

jamur, cacing, bisa ular, dan produk-produk hasil fermentasi

Pada Jurnal ini dibahas mengenai tanaman lokio (Allium tuberosum) yang ternyata

memiliki aktivitas fibrinolysis, dimana aktivitas fibrinolysis-nya didapat dari enzym , ATFE-I

(90 kDa) dan ATFE-II (55 kDa) yang telah ditemukan di tanaman loiko (allium tuberosum).

Allium tuberosum merupakan tanaman hijau, dikenal dengan nama lokio semacam bawang

putih, telah banyak digunakan baik sebagai bahan makanan maupun obat. ATFE-II di

murnikan/ dipurifikasi dengan menggunakan kromatografi ion exchange dan diikuti dengan

penyaringan dengan gel. Kemudian enzym ATFE-I dan ATFE-II dibandingkan.

Penelitian ini menggunakan bahan-bahan uji: beberapa senyawa dari darah manusia,

yaitu fibrinogen, thrombin, plasmin manusia. Phenylmethylsulfonyl fluoride, leupeptin, 6-

aminocaproic acid, and benzamide hydrochlorid. Subtrat kromogenik yang bervariasi

membran Polyvinylidene difluoride, dan reagen electrophoretik. Dan bahan-bahan kimia

lainnya.

Terdapat beberapa langkah dalam penelitian ini, yaitu:

1. Pemurnian enzim fibrinolitik dari A. tuberosum

2. Penentuan karakteristik enzim ATFE-II , menggunakan:

- Zymogram, untuk mengetahui Bobot molekul

- Gel elektrolisis 2 dimensi, untuk mengetahui nilai pI (Isoelektrik focusing/

Isoelektrik Protein)

- Pengubahan pH dan Suhu, penambahan logam berat (untuk mengetahui Efek pH

dan temperatur, serta penambahan beberapa logam berat terhadap aktivitas enzim)

3. Pengujian enzim,

4. Pengujian amidolytic

5. Pengujian aktivitas fibrinolysis

6. Membandingkan ATFE-I dengan ATFE-II , (BM, nilai pI, pH dan suhu optimal,

tingkat spesifisitas, afinitas fibrinogen, efek dari inhibitor, dan aktivitas amidolycity.

(dimana aktivitas dan karakteristik enzym ATFE-I telah diteliti pada penelitian

sebelumnya))

Pemurnian enzim fibrinolitik dari A. tuberosum

Tahapan pertama adalah memurnikan enzim fibrinolitik (ATFE-II)dari A. tuberosum.

Dilakukan dengan cara 1 kg A. tuberosum diaduk dengan sejumlah air, kemudian campuran

tersebut disentrifugasi pada 600 g selama 30 menit pada suhu 48 =C, dan dinginkan pada suhu

(-20 = C), dan etanol ditambahkan sambil diaduk konstan selam 1 jam. Endapan protein

dihilangkan dengan sentrifugasi pada 600 g selama 30 menit pada suhu 4 =C. substrat-substrat

yang terlarut dalam etanol didapat, kemudian bagian pelet disuspensikan dalam 20 mM

buffer na.acetat (pH 5,2).

Bahan kemudian diaplikasikan pada DEAE-Toyopearl®, dan di eluasi dengan 300mL

0.4 M NaCl. Bagian / fraksi yang aktiv dikumpulkan dan digaramkan dengan amicon

ultrafree-CL dan dipekatkan dengan freeze-drying. Sample dilarutkan dalam sedikit

Na.bikarbonat 20mM(pH 9,3) dan didialisis dengan buffer selama 24 jam pada 4= C dengan

tiga perubahan buffer. Enzym yang telah didialisis diaplikasikan pada kolom Q-sepharose

(2.5_16 cm) dan dieluasi dengan 200-mL Na.Cl 0,4 M. Kemudian fraksi yang aktif

dikumpulkan dengan amicon ultrafree-CL dan dipekatkan dengan freeze drying. Untuk

purifikasi lebih jauh , gel filtration dilakukan dengan sephadex, kolom G-100 (1.5_100 cm).

Hasil proses pemurnian dirangkum dalam Tabel 1.

Penentuan karakteristik enzim ATFE-II

Zymogram

Setelah dilakukan pemurnian/ penarikan enzim ATFE-II dari A.tuberosume, langkah

selanjutnya adalah membuat zymografi fibrin. Larutan gel pemisah (12%), ditambahi

fibrinogen (0.12%), dan 100 mL thrombin (mngandung 10 IU=mL). Setelah di-elektroforesis

pada suhu 4 C, gel kemudian diinkubasi 30 menit pada suhu kamar dalam pembawa berupa

campuran 50mM Tris-HCl (pH 7.4) dengan 2.5% (vol=vol) Triton X-100. Kemudian gel

dicuci dengan air suling selama 30 menit dan kemudian diinkubasi dalam buffer reagen

zymogram buffer (30mM Tris-HCl dan 0.02% [wt=vol] NaN3, pH 7.4) pada suhu 37 = C

selama 12 jam. Dan akhirnya diperoleh noda yang ditampakkan oleh Coomassie Brilliant

Blue.

Hasil dari analysis Gel zymogram atas

A. tuberosum Menghasilkan bahwa terdapat 2

pita aktif (90 dan 55 kDa). ATFE-II dari A.

tuberosum dimurnikan menggunakan DEAE-

Toyopearl, Q-Sepharose, dan gel filtrasi pada

Colum G-100 Sephadex. protein bermigrasi

sebagai pita tunggal dengan massa molekul sebesar 55 kDa pada gel SDS dan zymogram

fibrin (Gambar 1).

Keterangan:

Gel elektroforesis dari Na. dodecyl sulfate-polyacrylamide dan zymografi fibrin dari ATFE-I dan

ATFE-II termurnikan.

Gambar A : Na. dodecyl sulfate-polyacrylamide (12% [wt=vol] polyacrylamide)

Gambar B : fibrin zymography

Gambar C : bobot molekuler dari ATFE-II menggunakan gel filtrasi dengan Sephadex G-100.

Standartnya dieluasi melalui kolom Sephadex G-100.

Gel elektroporesis 2 dimensi

Isoelectric focusing (IEF) ditentukan menggunakan 7 cm IPG gel (fase diam) dengan

rentang pH 3.0–10.0. IEF ditentukan menggunakan IPGphor_ (Bio-Rad) IEF

system ,dengan tegangan 4,000V – jam pada suhu 20 C, dimana tegangan akan meningkat

secara linear dari 250-4000V. Setelah IEF, potongan diseimbangkan dengan sodium dodecyl

sulfate (SDS) Buffer penyeimbang (62.5mM Tris-HCl [pH 6.8], 2.3% [wt=vol] SDS, 30%

[vol=vol] glycerol, dan 0.05% [wt=vol] bromophenol.

Hasil dari Gel elektroporesis 2 dimensi adalah bahwa enzim termurnikan mempunyai titik

isoelektrik protein (pI) adalah 4,0 (Gbr. 2).

Gambar 2

Keterangan:

Gel na.dodecyl sulfat 2 dimensi dan zymografi fibrin 2 dimensi dengan purified ATFE-I dan

ATFE-II (5 mg). Dimensi pertama adalah isoelectric focusing(pH 3.0–10.0) dan dimensi kedua adalah

(A) 10% (wt=vol) polyacrylamide) sodium dodecyl sulfate gel dan (B) gel fibrin zymogram

Karakterisasi lainnya dari ATFE-II (Efek pH , temperatur dan logam berat terhadap aktivitas

enzim)

Efek dari pH dan temperatur terhadap aktivitas ATFE-II ditentukan dengan

melarutkannya dalam buffer berbagai pH,Setelah diinkubasi enzym berada dalam lingkungan

dengan variasi pH 2,0 – 10,0. Selama 2 jam pada suhu 37 C, aktivitas residual enzym yang

akan diukur. Buffer yang digunakan 0.1 M buffer acetate (pH 2.0–5.0), buffer Na. phosphate

(pH 6.0–7.0), buffer Tris-HCl (pH 8.0–9.0), dan buffer glycine-NaOH (pH 10.0). kemudian

untuk mengukur efek suhu terhadap aktivitas, enzym akan diukur aktivitasnya pada berbagai

temperatur didalam buffer acetate 50mM (pH4.0) setelah diinkubasi dengan berbagai suhu

selama masing-masing 30 menit. Dicari suhu yang menghasilkan aktivitas 100%.

Hasil menunjukkan bahwa ATFE-II akan menjadi sangat aktif pada pH 7,0, seperti

yang tercantum pada gambar 3A. Pengaruh suhu terhadap aktivitas fibrinolysis dari enzym

ditentukan pada keadaan pH nya 7. Suhu yang menunjukkan aktivitas maximal dari enzim

adalah suhu 45C seperti yang tercantum pada gambar 3B.

ATFE-II dihambat dengan 88.9 ± 0.9% 1mM leupeptin tapi tidak dihambat dengan EDTA,

EGTA, phenylmethylsulfonyl fluoride, 6-aminocaproic acid, atau benzamide hydrochloride

pada konsentrasi yang sama. ATFE-II dihambat dengan 87,9 ± 0.7% dengan 1mM ion Fe 2+

namun tidak dengan ion Mg2+, Zn2+, Co2+, Cu2+,Ca2+, atau Ni2+ pada konsentrasi yang sama

seperti yang ditunjukkan pada tabel 2.

Pengujian enzym

Aktivitas enzim ditentukan dengan metode cawan fibrin. fibrinogen yang dilarutkan

dalam Buffer Na.fosfat 50mM (pH 7.4), menghasilkan larutan fibrinogen dengan kadar

0.6%, diambil 5mL dicampur dengan larutan agarosa 2% (volume sama) dan 0,1 mL

thrombin (10 IU=mL) dalam sebuah petri dish. Larutan dibiarkan selama 1 jam pada suhu

ruangan agar terbentuk lapisan bekuan fibrin. Sample (3 mg dalam 20mL) kemudian

dimasukkan kedalam lubang yang dibuat di tengah petri disc (diameter 55 mm), kemudian

cawan petri diinkubasi pada suhu 37 = C selama 12 jam. Sejumlah larutan plasmin (1 IU=mL)

juga diinkubasi sebagai kontrol. Aktivitas enzim diukur dengan cara mengukur diameter dari

wilayah yang bersih.

Pengujian amidolitik

Aktivitas amidolitik diukur secara colorimetri dengan spektrofotometer dengan

menggunakan berbagai substrat kromogenik. Tes dilakukan dengan mencampurkan 50mM

buffer asetat (pH 4.0), 0.2mL 0.5mMsubstrate, dan enzim terpurifikasi (0,3 mg = 0,2 ml).

Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada 37C selama 10 menit, dan reaksi dihentikan

dengan menambahkan asam asetat 0.1ml 50%.Aktivitas ditentukan dari perubahan absorbansi

padapanjang gelombang 405nm karena pembentukan p-nitroanilin nm. Satu unit adalah

didefinisikan sebagai jumlah enzim yang melepaskan 1 mmol substrat =menit.

HASIL:

ATFE-II hanya terhidrolisis dengan MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-p-nitroaniline (S-2586), sebuah

substrat kromogenik untuk kimotrypsin.

Pengujian aktivitas fibrinolysis

Aktivitas Fibrinolysis diuji dengan menginkubasi 0.1ml larutan fibrinogen manusia

0,2%, dan 0.05mL larutan enzim (mengandung 0,1 mg enzim) dalam 50mM buffer asetat (pH

4,0) pada 37 C. Penginkubasian dilakukan dengan lama waktu yang berbeda – beda ( antara

0-60 menit), 0.15mL sampel denaturing buffer SDS (0.125mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1%

SDS, dan 1%[b-mercaptoethanol) ditambahkan, dan campuran dipanaskan pada 95 =C selama

4 menit. Untuk setiap sampel, 25 mL mengandung sekitar 15 mg fibrinogen dianalisis dengan

SDS-poliakrilamida gel elektroforesis.

Keterangan:

Fibrinogen terdiri dari ketiga ikatan polipeptida tersebut: Aα (66,000), Bẞ (54,000), dan Ɣ (48,000).

15 mikrogram fibrinogen diinkubasi dengan enzym (0-10 menit) di ukur dengan elektrophoresis

menggunakan 10% gel polyacrylamide.

Ditunjukkan bahwa ATFE-II memiliki aktivitas fibrinogenolitik yang tinggi dapat

mendegradasi secara cepat dalam waktu kurang dari 10 menit, hanya merusak ikatan Aα

fibrinogen manusia, namun tidak menghidrolisis ikatan Bẞ atau ikatan ɣ, hal ini

mengindikasikan bahwa enzym ini merupakan α-fibrinogenase, dengan kata lain memiliki

khasiat sebagai fibrinolysis yang spesifik

Membandingkan ATFE-I dengan ATFE-II

ATFE-I adalah serin, merupakan jenis asam chymotrypsin-seperti fibrinogenase, sedangkan

ATFE-II adalah novel sistein-tipe dasar chymotrypsin seperti fibrinogenase.

Kesimpulan

Kondisi optimal dari ATFE-II adalah pada keadaan pH 7.0 dan suhu 45 =C. ATFE-II merusak

ikatan Aα fibrinogen manusia, namun tidak menghidrolisis ikatan Bẞ atau ikatan ɣ, hal ini

mengindikasikan bahwa enzym ini merupakan α-fibrinogenase, dengan kata lain memiliki

khasiat sebagai fibrinolysis yang spesifik

Aktivitas proteolitik dari ATFE-II secara sempurna dihambat dengan 1mM Fe 2 + . ATFE-II

memperlihatkan spesifisitas yang tinggi terhadap MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-p-nitroaniline (S-

2586), yang merupakan kromgenic sintetis bagian dari kromotripsin. Dengan demikian

enzym dari A. Tuberosum memiliki kemungkinan untuk dikembangkan sebagai zat

trombolytik.

Alamat Jurnal:

http://www.liebertonline.com/doi/pdf/10.1089/jmf.2010.1144

“A New Fibrinolytic Enzyme (55 kDa) from Allium tuberosum:

Purification, Characterization, and Comparison”

Resume Jurnal

diajukan guna memenuhi tugas mata kuliah Uji Bioaktivitas Bahan Alam

Oleh:

Santy Yulia Subekti 082210101072

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JEMBER

2011