REKOMBİNANT KOAGÜLAN FAKTÖRLER

BİYOTEKNOLOJİ ve REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ

Biyoteknoloji ; moleküler biyoloji, fizyoloji, biyokimya ve mikrobiyoloji gibi doğa bilimlerinden yararlanarak, genetik ve moleküler DNA teknikleriyle, canlıların genetik haritalarını çıkartmak, çoğaltmak, değiştirmek, geliştirmek, yeni ve az bulunan ürünleri yine canlılara ürettirmek veya bunları daha fazla elde etmek için kullanılan teknolojilerin tümüdür.

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ

Bir genomdaki binlerce gen arasından tek bir genin ayrıştırılmasını, tanımlanmasını ve bu

genin klonlanmış DNA molekülü olarak büyük miktarlarda üretilmesini mümkün kılar.

Doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan, çoğunlukla farklı biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin, genetik

mühendislik teknolojisiyle kesilmesi ve elde edilen farklı DNA parçalarının birleştirilmesi işlemlerini kapsar.

Hedef proteinin üretilebilmesi için onu kodlayacak bir gen, o geni konak hücrenin içerisine sokacak bir

vektör ve de yeterli miktarda ve güvenli şekilde hedef proteini üretebilecek bir hücreye ihtiyaç

vardır

KOAGÜLANT FAKTÖRLER VE HEMOFİLİ

Vücutta pıhtılaşma faktörlerinden FVIII veya FIX’un eksikliği sonucu

eklem ve kas içi kanamalar ile karakterize, genellikle erkeklerde

görülen genetik bir hastalıktır.Bu grup “Kolay Kanayan

Çocuklar” olarak bilinir. Ailede benzer hastalık öyküsü olabileceği

gibi, yeni bir genetik mutasyon sonrası da oluşabilir.

HEMOFİLİ Cinse bağlı, resesif olarak geçen ailevi bir hastalıktır. Hastalık hemofilik erkeğin kızı vasıtasıyla erkek torununa geçer. İki tip hemofili vardır: Faktör VIII eksikliği (antihemofilik globulin) ile Hemofili A (Kral sülalesi

hastalığı, vakaların %85’i)

Faktör IX eksikliği (Christmas faktör) sonucunda ise Hemofili B (%15 oranında) görülür.

Bu iki hastalığın klinik ve genetik özellikleri aynıdır. Hemofilili kişilerde kesiklerden veya diş çekiminden sonra uzun süren kanamalar

görülür. Bu hastalıkta tedavi amacıyla eksik olan faktör hastaya verilir.

REKOMBİNANT ÜRÜNLERİN AVANTAJLARI

ÜRETİM İÇİN SINIRSIZ KAYNAK

GELİŞTİRİLMİŞ GÜVENLİK

VİRAL BULAŞMA RİSKİNİ

DÜŞÜRME

KULLANIM KOLAYLIĞI

FAKTÖR VIII(ANTİHEMOFİLİK FAKTÖR) Karaciğere ek olarak, vasküler, glomerüler ve

tübüler epitel hücrelerinde de sentez edilen, glikoprotein yapısında bir moleküldür.

Koagülasyon mekanizmasında intrensek yolakta görev yapar.

Dolaşımda von Willebrand faktöre bağlı stabil bir kompleks halinde dolaşır.

Yarılanma ömrü 9-18 saat arasında değişir. Trombin tarafından aktive edildiğinde wWF’den

ayrılarak faktör IXa ile etkileşime girerek faktör X’un aktivasyonunda rol oynar.

Faktör Xa ise faktör Va ile birlikte protrombinin trombine dönüşümünü sağlar.

Görüldüğü gibi trombin tarafından aktive edilen faktör VIII, trombin üretimini hızlandırmış olur.

Faktör VIII MOLEKÜLER YAPISI

• Faktör VIII geni X kromozomu üzerinde bilinen en büyük gendir.(xq28)

• Faktör VIII 2351 aminoasitlik tek bir polipeptid zincir olarak sentezlenir.

• Sentezden hemen sonra 19 aa’lik sinyal peptidi bir protez tarafından kesilir.

• Böylece plazmada dolaşan heterodimer yapıdaki Faktör VIII oluşur.

• Faktör VIII plazmada 80kD ağırlığında hafif zincir(A3-C1-C2) , bu zincire bağlı 90-210kD

ağırlığında ağır zincir(A1-A2-B) ve metal iyonlarına bağlı olarak sirküle olur.

• Bu yapı 25 potansiyel glikolizasyon alanı taşır.

REKOMBİNANT FAKTÖR VIIIBİRİNCİ JENERASYON RECOMBİNATE(BAXTER HEALTHCARE) Faktör VIII eksikliğine bağlı hemofili A tedavisinde kullanılmak

üzere üretilmiştir. Kültür ortamı olarak sığır serum albüminin kullanıldığı çin

hamster ovaryum hücrelerinde sentezlenmiştir. Virai inaktivasyon sağlamak için immunoaffinite ve iyon

değiştirme kromotografilerinden yararlanılmıştır. İnsan albümini stabilizer olarak kullanılmıştır.

İnsan plazma faktör vııı ile aynı yapılara sahiptir yani ağır ve hafif zinciri de içerir.

Steril enjeksiyonluk su ile sulandırılarak kullanılan liyofilize toz halinde bir üründür. 5mL’lik sulandırılmış hacim; 25mg/mL albümin(insan), 0.40mg/mL kalsiyum, 3mg/ml polietilen glikol, 360mE/L sodyum, 110mM Histidin, 1.5 µg/Faktör VIII IU

Polisorbat-80 Stabil olarak durması için von Willebrand faktörü ile birlike bulunur.

Ürün koruyucu içermez. 2-8 °C sıcaklıkta ya da liyofilize toz halinde ise oda sıcaklığında 3 ay biyolojik

aktivitesini kaybetmeden saklanabilir.

İKİNCİ JENERASYON ÜRÜNLER(KOGENATE FS,HELİXATE FS- Bayer Healthcare)

Recombinate FS den farklı olarak bebek hamster böbrek hücrelerinde sentez

edilmişlerdir. Viral inaktivasyon sağlamak için

immunoaffinite ve iyon değiştirme kromotografisine ek olarak

ultrafiltrasyon ve solvent deterjan kullanılmıştır.

Stabilizör olarak albümin yerine sukroz kullanılmıştır.

Ağır ve hafif zinciri recombinate gibi yapılarında bulundururlar.

Üretim aşamasında kullanılan albümin son üründe bulunmamaktadır.

ADVATE ( Baxter Healthcare )

Ne üretimde ne de son üründe albumin bulunmaz.

Viral inaktivasyon metodu olarak solvent deterjan ve kromotografik

metodlar kullanılmıştır. Stabilizör olarak trehaloz

kullanılmıştır.

Xyntha (PHIZER

Diğer rekombinant ürünlerden farklı olarak ağır zincirdeki B bölgesi

silinmiştir.(B bölgesinin aktiviteye doğrudan katkısı yoktur)

Stabilizör olarak sukroz kullanılmıştır. Viral inaktivasyon metodu olarak nanofiltrasyon , solvent deterjan ve

polisorbat 80 kullanılır.

Rekombinant faktör VIIIRecombinate(Baxter healthcare)• Birinci jenerasyon ilaçtır. Çin hamster ovaryum hücreleri

kullanılarak üretilmiştir.• İnsan serum albümini stabilizer olarak kullanılmıştır.

Kogenate FS(Bayer healthcare)• İkinci jenerasyon ilaçtır. Bebek hamster böbrek hücreleri

kullanılarak üretilmiştir.• Stabilizer olarak sukroz kullanılmıştır ve final formulasyonunda

insan albümini içerir.

Xyntha(Pfizer)• B bölgesi silinerek üretilmiştir. Üretiminde çin hamster

ovaryum hücreleri kullanılmıştır.• Stabilizer olarak sukroz kullanılmıştır.

FAKTÖR VII VE REKOMBİNANT FAKTÖR VIIA

FACTOR VIII

YAPISI

Faktör VII dört ayrı bölgeden oluşur: γ-karboksiglutamik

asit (Gla) içeren bölge, 2 adet epidermal büyüme faktörü benzeri bölge ve son olarak

serin proteaz bölgesi.

Bu bölgelerin her biri değişik derecelerde olsa da doku faktörü ile (DF)

en ideal etkileşimin sağlanmasında işlev

görmektedir

İnsan faktör VII 406 amino asit

artığından oluşan, serin proteazdır.

Vitamin K’ya bağımlı

pıhtılaşma glikoproteinleri arasında yer almaktadır.

İnsanlarda FVII’nin birincil sentez yeri karaciğerdir.

Faktör VII’nin Gla bölgesi aynı zamanda faktör X ve diğer

makromoleküler substratların aktivasyonunda görev almaktadır. Faktör VII’nin faktör VIIa’ya dönüşümü için Arg152 ile Ile153 arasındaki tek bir peptid bağının hidrolizi gerekmektedir. Bunun sonucunda iki zincirli molekül oluşur. Zincirlerden biri hafif

zincirdir, 152 aminoasitten oluşur; ağır zincir ise 254 aminoasitten

oluşur. Bu iki zincir tek bir disülfit bağı ile bağlanmaktadır.

Rekombinant DNA teknolojisi ile rFVIIa üretimi İnsan plazmasından üretilen faktör VIIa’nın üretiminin kısıtlı olması ve

olası viral bulaşma tehlikesi nedeni ile rFVIIa üretimi ön plana çıkmıştır. İZOLASYON

İlk olarak faktör VII’nin sekiz eksondan (kodlanan alanlar) oluşan insan geni, karaciğer gen kütüphanesinden izole edilmiştir.

ÇOĞALTMA VE TRANSFER

Standart çoğaltma işlemleriyle hFVII geninin birçok kopyaları üretilmiştir. Üretilen bu genler bebek hamsterin böbrek hücre dizisine transfekte edilmiştir.

SAFLAŞTIRMA

Bu şekilde kültür medyasında tek zincirli FVII üreten hücre dizileri ile hücre bankası oluşturulmuştur. Son aşamalarda kromatografik ayrıştırma işlemi sırasında, otokatalizle aktive iki-zincirli forma (rFVIIa) proteolitik dönüşüm olmaktadır.

Bu ayrıştırma işlemi sırasında ekzojen virüslerin de uzaklaştırıldığı saptanmıştır. rFVIIa üretimi sırasında başka bir protein veya insan serumu kullanılmamaktadır

REKOMBİNANT FAKTÖR VIIA ETKİ MEKANİZMASI

İnsan aktive-faktör VII (hFVIIa) veya rekombinant aktive-

faktör VII (rFVIIa) pıhtılaşma sürecinde doğal bir hemostaz

başlatıcıdır. Doğal bir şekilde kan

damarının hasarlı bölümünde DF ile birleşir.

Bu da trombin üretimini uyarıp, fibrin pıhtısı oluşumuna

izin vererek kanamayı durdurur.

RECOMBİNANT FAKTÖR VIIA ‘NIN AVANTAJLARI

rFVIIa protein yapısı, saflaştırılmış insan faktör

VIIa ile aynıdır; karbonhidrat yapısındaki

ufak değişiklikler haricinde, yapı ve etkinlik

olarak plazmadan elde edilen faktör VIIa’dan farkı

yoktur.

Üretim aşamasında albümin ya da başka bir

insan proteini kullanılmamaktadır. Bu da insan virüsleri veya prionlar ile enfeksiyon

riski olmadığını göstermektedir.

Fermantasyon aşaması ve bunu takip eden detaylı saflaştırma

işlemlerinde katı kalite kontrol standartları uygulanmaktadır.

Rekombinant FVIIa imal edilmiş bir üründür ve

insan plazması içermemektedir.

Dolayısıyla viral bulaşma riski yoktur.

Genetik rekombinasyon verici ihtiyacını ortadan

kaldırmakta ve ilacın limitsiz olarak üretimini

sağlamaktadır.

KLİNİKTE KULLANIMI Doğuştan hemofili A ve B hastalarının kanama olaylarında kullanılır. FaktörVIIa eksikliği olan ve hemofili A ve B hastalarında cerrahi

operasyon öncesi profilaksi amaçla kullanır. Glanzman Trombastenisinin kontrolünde kullanılır GLANZMAN

TROMBASTENİSİ •Trombosit sayısı ve görünümüne rağmen, trombositlerin kümeleşmemesi ile karakterizedir.• Trombosit Glikoprotein IIb-IIIa eksikliği veya bozukluğuna bağlı meydana gelir.

NOVO SEVEN (Novo Nordisk- Danimark)

2001 yılından beri Türkiyede ruhsatlıdır.Stabilizör olarak mannitol kullanılmakta olup herhangi bir plazma ürünü içermez.Saflaştırma işlemi olarak kromatografi uygulanmaktadır.

FAKTÖR XIII (FİBRİN STABİLİZAN FAKTÖR)

İnaktive FXIII, plazmada tetramer (FXIII-A2 B2 ) yapıda, molekül ağırlığı 320 kDa ve normal hemostaz için yaşamsal önemi olan bir pıhtılaşma proteinidir.

İki adet katalitik özelliği olan A alt birimi (FXIII-A2 ) ve iki adet taşıyıcı-koruyucu görevi olan, B alt biriminden (FXIII-B2 ) oluşmakta, bu tetramerik yapının sağlamlığı non-kovalent bağlarla sağlanmaktadır.

A alt birimi kemik iliği kökenli hücrelerden yapılırken, B alt birimi ise, hepatositler tarafından yapılmaktadır. Alt birimler plazmada birleşerek tetramer özellik kazanır.

FXIII-A2 kemik iliği hücrelerden köken aldığı için trombositler, monosit-makrofajlar ve diğer öncül hücrelerde bulunabilir

FXIII B2 alt birimi plazmada fazla miktarda bulunduğundan, molekülün %50’lik kısmı plazmada serbest olarak dolaşır.

AKTİVASYONU ve KOAGÜLASYONDAKİ ROLÜ Kalsiyum iyonundan zengin

ortamda A ve B alt birimi hızla birbirinden ayrılır ve trombin tarafından A alt birimi parçalanarak aktive edilir.

Aktive FXIII (FXIIIa; aktive transglutamaz) fibrinojen zincirleri arasında (α-lizin ve γ-glutamil arasında amino grubu taşınması) çapraz bağ oluşturarak fibrin polimerlerini akış stresine ve fibrinolitik enzimlere karşı korur

Rekombinant-FXIII-A alt birimi

Saccharomyces cerevisiae adlı bir mayadan elde edilen ve endojen insan FXIII’ü ile tam homolojide olan biyolojik bir üründür.

rFXIII’ün yarılanma ömrü endojen FXIII’e benzer olup, infüzyon sonrası plazmada FXIII-B alt birimine bağlanır.

Faz III koruma (profilaksi) çalışmasında etkili ve güvenli bulunmuştur.

Ancak daha hiçbir ülkede ruhsat almamıştır.