regolazione splicing lsd1
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RUOLO DI ELEMENTI IN CIS NELLA REGOLAZIONE DELLO
SPLICING DI LSD1
Alessandro MADAIOMatricola: 749969
Relatrice: Elena BATTAGLIOLICorrelatrice: Leda PAGANINI
ANNO ACCADEMICO 2011/12
Lysine Specific Demethylases 1 (LSD1) demetila in modo specifico la Lisina 4 mono- o di-metilata dell’istone H3 (H3K4), agendo da
repressore trascrizionale
UBIQUITARIE
NEURONALI
Grado di conservazione dell’esone 8a nei mammiferi
788 bp
Sequenza complementare invertita: è conservata in tutti i mammiferi
D T V K
5’ – TTAAAAGGACACTGTCAAGGTATTTT…………TCCCTCTAACCTTGACAGTGTCCCTTTAA - 3’
Palindrome
SCOPO del LAVORO
• Determinare il ruolo della sequenza complementare invertita all’esone alternativo 8a nell’inclusione di quest’ultimo nel trascritto maturo di LSD1.
LA STRUTTURA SECONDARIA DELL’RNA INFLUENZA LO SPLICING
LSD1 wtΔG= -94.69 kcal/mol
LSD1 DeletoΔG= -70.27 kcal/mol
Palindrome
LA STRUTTURA SECONDARIA DELL’RNA INFLUENZA LO SPLICING
5’
5’
5’
3’
3’
3’
SCHEMA PER LA DELEZIONE
PRIMA PARTE
UP DOWN
SECONDA PARTE
VETTOREpBSplicing
DTVKE8 E9
Hind III Hind III
DIGESTIONE di CONTROLLO con HindIII
4550 bp
1200 bp1000 bp
470 bp400 bp
(*): sono presenti due bande sovrapposte da 1270 e1200 bp
**
PALINDROMEMG wt
MG Deleto
ANALISI TRASCRITTI
% inclusione E8a = X 100
Vettore pBSplicing MG wt MG deleto
-20%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0%
13%
87%
Hela
Vettore pBSplicing MG wt MG deleto
-20%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0% 0% 0%
HelaSY-5Y
CONCLUSIONI1. Il MG utilizzato è un ottimo sistema per lo studio dello splicing in vitro.2. Il frammento di LSD1 clonato contiene gli elementi in cis necessari a dirigere
in processamento in modo neuro-specifico.3. La palindrome svolge un importante ruolo di modulatore negativo per lo
splicing alternativo di LSD1, però la sua delezione non è sufficiente a garantire l’inclusione in cellule non neuronali come le Hela.
% in
clus
ione
E8a
SCOPO del LAVORO
• Determinare il ruolo della sequenza complementare invertita all’esone alternativo E8a nell’inclusione di quest’ultimo nel trascritto maturo di LSD1.
• Determinare l’azione del fattore di Splicing NOVA-1 in funzione della sequenza complementare ed invertita all’esone E8a.
0X 1X 2X 3X0%
5%
10%
15%
20%
25%
Nova vector : MG
perc
enta
ge o
f exo
n E8
a in
clusio
n in
MG
vect
or
EFFETTO POSITIVO DOSE DIPENDENTE DI NOVA-1
SY-5Y
AZIONE POSITIVA DI NOVA-1 è MEDIATA DALLA PRESENZA DELLA PALINDROME
Hela
+ NOVA-1 + NOVA-1+ NOVA-1+ NOVA-1
MG wt MG wtMG Deleto MG Deleto
% in
clus
ione
E8a
**
PROSPETTIVE FUTURE
• CREAZIONE DI UN COSTRUTTO IN CUI SIANO MUTATI CONTEMPORANEAMENTE PIU’ SITI DI LEGAME PER IL FATTORE DI SPLICING NOVA-1.
• INDIVIDUAZIONE DEL FATTORE DI SPLICING NECESSARIO E SUFFICIENTE A PERMETTERE L’INCLUSIONE DELL’ ESONE E8a ANCHE IN CELLULE NON NEURONALI.
Grazie per l’attenzione