raport faza 5
TRANSCRIPT
RAPORT ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC – ETAPA 5/2015
Obiectivul etapei
Aplicarea metodei combinate, electroterapie urmată de chimioterapie in vitro, în vederea
obţinerii de plante de viţă-de-vie şi cartof, libere de virusuri.
Rezultate aşteptate
- stabilirea eficienţei electroterapiei în eliminarea virusurilor la viţa-de-vie şi cartof şi elaborarea
tehnologiilor de lucru;
- model experimental de devirozare prin electro-chimioterapie;
- comportarea plantulelor de viţă-de-vie şi cartof la aplicarea succesivă a electroterapiei şi
chimioterapiei in vitro (2 virusuri/specie);
- evoluţia proceselor fiziologice la plantele regenerate sănătoase în urma electroterapiei;
- diseminarea rezultatelor prin publicarea de lucrări ştiinţifice.
Rezumat
Electroterapia în cuva de electroforeză orizontală, ca metodă de eliminare a virusurilor a fost
aplicată la viţa-de-vie şi cartof. Virusul scurtnodării la viţa-de-vie (GFLV) şi al complexului viral
format din virusul fleck (GFkV) şi virusul A (GVA au fost eliminate în cea mai mare proporţie
(aprox. 50%) prin tratamentul apexurilor cu 40 mA timp de 10 minute. O intensitate mai mare a
curentului (100 mA) a condus la eliminarea izolatelor 1 ale virusurilor X şi Y ale cartofului
(PVX1 şi PVY1). În vederea eficientizării metodelor de devirozare s-au aplicat terapii combinate
care au constat în stimularea electrică cu 40 mA – 10 min la viţa-de-vie, 100 mA-10 min. la
cartof, urmată de cultivarea pe medii suplimentate cu 20 mg/L ribavirină + 40 mg/L oseltamivir
la viţa-de-vie şi 40 mg/L ribavirină şi 40 mg/L oseltamivir la cartof. Curentul electric şi
antiviralele au influenţat ratele de regenerare ale vitroplantelor şi ale unor compuşi biochimici
(glucide solubile pigmenţi asimilatori, polifenoli totali, amidon, proteină brută) în timpul
tratamentului, după care au avut efect benefic asupra dezvoltării fiziologice a materialului
regenerat liber de virusuri atât la viţa-de-vie cât şi la cartof.
1. Selectia plantelor de viţă-de-vie liberă de GFLV şi complexul viral GFkV+GVA în urma
electroterapiei - P1
Blocarea multiplicării virale prin utilizarea curentului electric a constituit o alternativă la
regenerarea de plante de viţă-de-vie libere de virus. Gonzáles şi colab. în 2006 au emis ipoteza
că impactul curentului electric asupra ţesuturilor determină comportarea particulelor virale ca
oscilatori armonici într-o baie termală (celula). Sub influenţa temperaturii, nucleoproteinele,
inclusiv cele ale virusului se denaturează, fiind astfel întreruptă calea multiplicării virale. Se
poate spune că are loc o termoterapie la nivel celular.
Electroterapia a fost studiată ca metodă de eliminare virală la diferite plante de cultură
începând cu Quacquerelli şi colab. (1980) care au aplicat curentul electric la copacii de
Cactamicia care prezentau simptome intense de mozaic, cauzate de virus. S-au obţinut mai mult
de 90% plante libere de virus în urma tratamentului cu 500 V timp de 5-10 minute. Utilizarea cuvei de electroforeză orizontală la tratamentul explantelor infectate cu virus a
demarat în 1995 când Hernández şi colab. au tratat usturoiul (Allium sativum L), trestia de zahăr
(Sacharum sp. hibrido L), cartoful (Solanum tuberosum L) pentru eliminarea Potivirusurilor,
Carlavirusurilor şi Luteovirusurilor. În cazul bananului (Musa sp., soiul Bungulan), Hernández şi
colab., 1997 au raportat eliminarea BSF în aproximativ 40-80% din plantele regenerate.
La viţa-de-vie utilizarea curentului electric la blocarea multiplicării virale este legată de
Burger (1989), care a studiat posibilitatea eliminării virusului scurtnodării (GFLV) prin
tratamentele plantelor infectate în câmp electric uniform, rezultatele nefiind încurajatoare.
Cu toate acestea, în scopul lărgirii cunoştinţelor privind eradicarea bolilor virale la viţa-
de-vie, în cadrul acestui proiect ne-am propus experimentarea electroterapiei în cuva de
electroforeză orizontală ca metodă de regenerare de plante libere de virusuri.
Pentru început a fost studiată posibilitatea eradicării virusului fleck (GFkV) şi virusului
asociat răsucirii frunzei serotip 1 (GLRaV-1) la viţa-de-vie. Parametrii de lucru au constat în
graduarea intensităţii curentului electric (40, 50, 100 mA) la timpi crescători de tratament (5, 10,
20 min). După tratamentul electric porţiunile erbacee stimulate au fost fragmentate în apexuri şi
fragmente uninodale şi cultivate pe mediu de cultură steril în vederea regenerării de noi plante.
Eficienţa metodei a fost evaluată în urma analizei serologice a plantelor regenerate prin cultură in
vitro pe variantele experimentale. La genotipul Tămâioasă românească 3-2-2 infectat cu GFkV
cele mai bune rate de eliminare virală au fost obţinute la stimulare electrică cu 40 şi 100 mA
timp de 10 min, în urma cultivării apexurilor intens regenerative (26,3 respectiv 26,6%).
Eliminarea GLRaV-1 la Frâncuşă 15 Od a fost obţinută în proporţie de 33.3% la varianta 50
mA, 10 min, de această dată plantele noi fiind regenerate din fragmente nodale.
Dintre virusurile cu incidenţa cea mai mare în plantaţiile viticole, alături de GFkV şi
GLRaV, GFLV produce modificări nedorite asupra plantelor, care influenţează atât viabilitatea
plantaţiilor cât şi producţia. Din acest motiv a fost studiată posibilitatea eliminării GFLV prin
electroterapie în cuva de electroforeză orizontală, la genotipul Fetească neagră 7 OD, în aceleaşi
condiţii de tratament stabilite pentru celelalte virusuri. Plantele regenerate / explant iniţiat în
urma tratamentului electric au fost testate ELISA şi rezultatele interpretate statistic (programul
SPSS 10), fiecare explant constituind o repetiţie.
Au fost înregistrate rate de eliminare a GFLV cuprinse între 16,65 ± 23,5467 % la V3 (40
mA – 20 min) şi 50 ± 70,7106 % la V2 (40 mA – 10 min) în cazul culturii de apexuri.
Tratamentul electric al fragmentelor nodale a condus la regenerarea de plante de viţă-de-vie în
proporţii cuprinse între 10 ± 22,3607 % la V8 (100 mA – 10 min) şi 44,03 ± 47,0490 % la V5
(50 mA – 10 min) (Fig. 1.1).
Fig. 1.1 Eficienţa electroterapiei în cuva de electroforeză orizontală pentru eliminarea GFLV
la genotipul Fetească neagră 7Od
0
20
40
60
80
100
120
140
apex axillary bud
Rat
a d
ezi
roza
re %
Tip explant
V1
V2
V3
V4
V5
V6
V7
V8
V9
Deoarece în natură, de cele mai multe ori viţa-de-vie poate fi infectată simultan de mai
multe virusuri, în cadrul proiectului a fost studiată posibilitatea eliminării unui complex viral,
GFkV + GVA la genotipul Burgund 63 Mn prin electroterapie în cuva de electoforeză orizontală,
după aceleaşi variante de tratament. Testarea serologică a plantelor regenerate a condus la
evidenţierea variantei 2 cu rata cea mai mare de devirozare, 50 ± 70,7107 %, valori mai mici
(39,9 ± 24,0047 %) înregistrându-se la creşterea intensităţii curentului la acelaşi timp de
tratament (V5), în cazul culturii de apex. Fragmentele nodale au condus la obţinerea de noi
plante ELISA negative cu rata cea mai mare (49,95 ± 23,5467 %) la V6 (50 mA- 20 min).
Dublarea intensităţii curentului nu a generat creşterea ratei de eliminare virală indifferent de
timpul de expunere (V7, V8, V9) (Fig.1.2).
Dacă luăm în discuţie eliminarea GFkV prin electroterapie în cuva de electroforeză
orizontală se remarcă varianta 2 (40 mA – 10 min) care conduce la regenerarea de plante libere
de GFkV în proporţie de 26% din infecţia simplă şi 50% din complex viral.
Fig. 1.2 Eficienţa electroterapiei în cuva de electroforeză orizontală pentru eliminarea
complexului viral GFkV+GVA la genotipul Burgund 63 Mn
Tabelul 1.1
Parametrii de lucru care au condus la obţinerea celor mai bune rezultate la eliminarea virală
prin electroterapie în cuva de electroforeză orizontală
Virus Parametrii de lucru Tip explant Devirozare %
GFkV 100 mA – 20 min
40 mA – 10 min
apex
apex
100
26
GLRaV 50 mA -10 min
40 mA – 5 min
fragment nodal
fragment nodal
33
25
GFLV 40 mA – 10 min
100 mA -10 min
apex
fragment nodal
50
44
GFkV +GVA 40 mA – 10 min
50 mA - 20 min
apex
fragment nodal
50
50
Rezultatele obţinute la eliminarea virusurilor la viţa-de-vie prin electroterapie au
evidenţiat dependenţa ratei de însănătoşire de tipul virusului, de variantele de tratament şi chiar
de genotipul studiat. Procentul de plante libere de virus nu variază proporţional cu creşterea
0
20
40
60
80
100
120
140
apex axillary bud
Rat
a d
evi
roza
re %
Tip explant
V1
V2
V3
V4
V5
V6
V7
V8
V9
parametrilor de lucru, intensitatea curentului sau timpul de expunere. De asemenea, genotipul îsi
pune amprenta asupra numărului de plante ELISA negative obţinute, atâta vreme cât regenerarea
de noi plante are loc prin micropropagare.
Centralizarea celor mai bune rezultate obţinute la eliminarea virusurilor la viţa-de-vie,
corelate cu parametrii experimentali (Tabelul 1.1) a condus la elaborarea unei tehnologii de
devirozare la viţa-de-vie prin electroterapie în cuva de electroforeză orizontală.
Tehnologie de eliminare a virusurilor la viţa-de-vie prin electroterapie în cuva de electroforeză
orizontală
1. Identificarea infecţiei virale.
2.Tratament electric în cuva de electroforeză orizontală a fragmentelor de lăstari erbacei
prelevaţi de la plantele infectate. Parametrii de lucru se aleg în funcţie de infecţia virală;
tamponul utilizat în cuvă – soluţie salină 1m.
3. Cultivarea in vitro a fragmentelor de lăstari trataţi electric pe mediu de cultură specific viţei-
de-vie (Murashige şi Skoog, 1962; Vişoiu şi Teodorescu, 2001).
4. Aclimatizarea şi fortificarea plantelor regenerate.
5. Analiza virologică a plantelor regenerate în vederea selecţiei plantelor libere de virus.
2. Selectia plantelor de cartof libere de PVX1 şi PVY1 în urma electroterapiei - P2
Scopul acestei activități a fost alcătuirea loturilor de plante de cartof libere de virusuri.
Pentru a realiza selecţia plantelor libere libere de PVY si PVX (obtinute din material
virozat, inoculat cu izolatul 1) s-a estimat iniţial influenţa curentului electric şi eventualele
diferenţe pe variantele experimentale. Explantele au fost multiplicate pe 1-2-3 culturi succesive
(subculturi consecutive S1-24 zile, S2-28 zile, S3-26 zile), fiind utilizat mediul Murashige Skoog
(1962) de fiecare dată. Înainte de primele două subculturi, explantele (cu excepţia cotroalelor
pozitive) au fost tratate cu curent electric conform variantelor de lucru prezentate (Tabel 2.1), iar
în cazul celei de a treia subculturi, explantele au fost transferate pe mediu MS, fără
electroterapie. La a doua şi a treia subcultură s-au folosit doar 2 explante din vârf. Estimarea
efectului antiviral al tratamentelor aplicate s-a făcut prin evaluarea absorbanţelor optice
înregistrate, aplicând tehnica DAS ELISA (Clark şi Adams, 1977), după 3 subculturi consecutive
ale materialului virozat. Pentru aprecierea procentului de regenerare și a celui de devirozare, au
fost folosite rezultatele obţinute după a treia subcultură, înainte de aclimatizarea plantelor. Pentru
fiecare variantă de tratament, experimentul a fost repetat de trei ori.
Tratamentele aplicate materialului testat (RY1, RX1) au condus la obţinerea de plante
neinfectate cu PVY şi PVX în toate variantele de electroterapie, rezultate deosebite fiind obţinute
în cazul celor mai severe condiţii: 100 mA timp de 10-20minute. Procentul de plante devirozate a
crescut o dată cu durata de expunere a explantelor la curent. Au fost selectate pentru o evaluare
ulterioară:
- plante regenerate provenite din material inoculat și infectat cu PVY(izolat 1):
-20 plante provenite din varianta V7
-25 plante provenite din varianta V8
-24 plante provenite din varianta V9
- plante regenerate provenite din material inoculat și infectat cu PVX (izolat 1):
-28 plante provenite din varianta V7
-27 plante provenite din varianta V8
-26 plante provenite din varianta V9
Tabelul 2.1
Efectul tratamentelor prin electroterapie asupra ratei de regenerare pentru PVY şi PVX
(explante infectate soiul Roclas, RX1, RY1).
Variant
a
Tratament
mA/min
Rata regenerare material infectat cu:
PVY (izolat 1) PVX (izolat 1)
Plante
regenerate a
/
Plante tratate b
% ±STDEV
Plante
regenerate a
/
Plante tratate b
% ±STDEV
V0 0/0 5/24 20.8 ±4.194 4/21 19.0 ± 8.3
V1 40/5 37/48 77.1 ±13.38 23/41 c 56.1 ± 11.7
V2 40/10 27/40 67.5 ±15.12 26/38 68.4 ± 17.1
V3 40/20 25/48 52.1 ±13.19 30/48 62.5 ± 5.5
V4 50/5 26/35 74.3 ±9.311 30/40 75.0 ± 12.7
V5 50/10 30/41 73.2 ±12.43 24/35 68.6 ± 12.3
V6 50/20 30/48 62.5 ±2.887 33/51 64.7 ± 7.1
V7 100/5 21/40 52.5 ±1.925 31/42 c 73.8 ± 6.7
V8 100/10 25/42 59.5 ±13.57 27/35 77.2 ± 13.0
V9 100/20 24/48 50.0 ±12.72 26/39 66.7 ± 7.0 a număr plante regenerate (în toate repetiţiile);
b număr explante tratate (în toate repetiţiile);
c în cazul acestor variante, sunt prezentate valorile înregistrate după subculture a doua (S2),
deoarece nu am obţinut microplante în aceste variante după prima subcultură şi a fost necesară
iniţierea de noi plante, pornind de la explante virozate; STDEV= abaterea standard
De remarcat a fost faptul că în cazul expunerii vitroplantelor la curent electric de intensitate
maximă (100mA) timp de 10 minute, respectiv 20 minute, tot materialul testat a fost liber de
PVX, respectiv PVY. Acesta a fost motivul pentru care am păstrat pentru cercetări ulterioare
acest material. Nu am renunțat nici la materialul provenit prin aplicarea timp de 5 minute a
curentului electric (100mA), deși în acest caz au fost identificate probe infectate (1 probă din
materialul virozat inițial cu PVY și 3 probe din materialul inoculat cu PVX).
Procesul de aclimatizare a plantelor a fost iniţiat la variantele V7, V8 și V9. Intre variantele
experimentale s-au putut observa diferente semnificative privind dezvoltarea plantelor
aclimatizate. Probabil că şi severitatea tratamentului cu electroşocuri aplicate materialului
biologic iniţial a contribuit la dezvoltarea diferenţiată a plantelor aclimatizate. Primele observaţii
au evidenţiat efectul accentuat pe care l-au avut în special intensitatea curentului, respectiv
durata expunerii plantulelor la tratamentele electroterapice.
Centralizarea rezultatelor obţinute la aplicarea curentului electric în cuva de electroforeză
orizontală în vederea regenerării de plante de cartof libere de PVX şi PVY a condus la elaborarea
metodologiei de lucru.
Tehnologie de devirozare a vitroplantelor de cartof prin electroterapie
1. Tratare vitroplante (respectiv internoduri dacă se doreşte devirozare la plante de cartof) în
cuva de electroforeză, mediu soluţie clorura de sodiu concentraţie 1%, curent electric 100 mA
timp de 10 sau 20 minute.
2. Spălare apă distilată.
3. Dezinfectare 1 minut in alcool 96o (pentru probe prelevate din plante de cartof internoduri).
4. Spălare apă distilată de 2 ori.
5. Prelevare internoduri (pentru vitro plante).
6. Transfer pe mediu MS (2 subculturi în tuburi de creştere).
7. Fragmentele uninodale sunt inoculate în ultima subcultură în recipiente care conţin un mediu
MS agarizat, suplimentat cu ANA (0,5 mg), concentraţia zahărului 3%, pH-ul ajustat la 5,6-5,8
(înaintea sterilizării mediului de cultură în autoclav, la o temperatură de 1210C, timp de 20 min).
8. Vasele de cultură conţinând câte 15 microbutaşi/vas, transferate în camera la creştere
(fotoperioada fiind de 16 h, iar temperatura de 200C).
9. Transfer în sere insect proof, aclimatizare iniţială pe mediu cu adaus de perlit sau obţinere de
microtuberculi.
10. Obţinere microtuberculi. După transformarea microbutaşilor în plantule dezvoltate (3-4
săptămâni) se aplică mediul lichid, specific de microtuberizare, la care se adaugă zahăr în
concentraţie mai ridicată (8%) iar ca regulatori de creştere – cumarina şi kinetina; pH-ul e ajustat
la 5,8. După aplicarea mediului lichid, vasele de cultură sunt incubate într-o cameră specifică de
microtuberizare, la întuneric (pentru o perioadă de 8-10 săptămâni). Microtuberculii sunt apoi
plantaţi în sere insect proof în vederea obţinerii de minituberculi.
3. Stabilirea parametrilor de lucru pentru aplicarea succesiva a metodelor de devirozare,
electroterapie urmata de chimioterapie in vitro – CO
Deoarece metodele de devirozare aplicate pentru eliminarea virusurilor la diverse specii
de plante au arătat dependenţă de tipul virusului, de metoda folosită şi chiar de genotip,
obiectivul proiectului a fost de a eficientiza şi chiar uniformiza parametrii de lucru în vederea
îmbunătăţirii ratelor de eliminare virală. Rezultatele obţinute până în prezent la aplicarea
chimioterapiei in vitro şi electroterapiei pentru eliminarea virusurilor la viţa-de-vie şi cartof nu
au condus la atingerea acestui scop, fiecare din virusurile speciilor abordate eliminându-se în
proporţii diferite la parametrii experimentali diferiţi. Din aceată cauză proiectul şi-a propus şi
abordarea terapiilor combinate, în caul de faţă electroterapie urmată de chimioterapie in vitro.
Există exemple în literatura de specialitate de utilizare a terapiilor combinate în vederea
eliminării virusurilor la plante. Awan şi colab. în 2007 au încercat eliminarea virusului răsucirii
frunzei la cartof (PLRV) prin cultivarea explantelor infectate pe medii cu antivirale şi creşterea
lor la 370C timp de 30 de zile (termoterapie in vitro), cu rezultate mult mai bune comparativ cu
regenerarea de noi plante sănătoase numai prin chimioterapie. Virusul Y al cartofului (PVY) a
fost eliminat în proporţie de 90-96% prin combinarea culturii de meristem, chimioterapiei şi
termoterapiei in vitro (Nasir şi colab., 2010). În ceea ce priveşte eliminarea virusurilor specifice
la viţa-de-vie au fost aplicate metode ca chimioterapia in vitro, electroterapia, termoterapia cu
rate de eliminare virală diferite.
În scopul eficientizării eliminării virusurilor la viţa-de-vie şi cartof am propus utilizarea
succesivă a electroterapiei şi chimioterapiei in vitro, având în vedere că efectul curentului
electric asupra plantelor este de termoterapie la nivel celular, care conduce la denaturarea
proteinelor înclusiv a celor virale, metodă numită electro-chimioterapie. Parametrii de lucru au
fost aleşi în funcţie de rezultatele cele mai bune obţinute la experimentarea singulară a celor
două terapii.
În cadrul proiectului de faţă a fost experimentată utilizarea chimioterapicelor ribvirină şi
oseltamivir în eliminarea GFLV, GLRaV-1 şi GFkV la viţa-de-vie, rezultatele fiind diferite şi
dependente de parametrii experimentali (Tabelul 2.1).
Tabelul 2.1
Corelarea parametrilor experimentali cu cele mai bune rezultate obţinute la eliminarea virusurilor
la viţa-de-vie prin chimioterapie in vitro
Virus Parametrii de lucru Devirozare %
GFkV toţi 100
GLRaV 40 mg/L R + 40 mg/L O – 2 S
20mg/L R + 40 mg/L O – 1S
13,3
6,6
GFLV 20mg/L R + 40 mg/L O – 1S 6,8
R= ribavirină, O = oseltamivir, S = subculturi
Pentru uniformizarea condiţiilor de lucru au fost aleşi parametrii care au condus la cele
mai bune rezultate pentru toate virusurile, în condiţii de fitotoxicitate minimă a antiviralelor
asupra explantelor şi bineînţeles eficienţă economică: 20 mg/L ribavirină + 40 mg/L oseltamivir,
timp de o subcultură.
În ceea ce priveşte electroterapia aplicată fragmentelor erbacee provenite de la plante de
viţă-de-vie infectate cu virusuri, cele mai bune rezultate privind rata de eliminare virală corelată
cu parametrii de lucru au condus la alegerea variantei de lucru: 40 mA timp de 10 min.
Aşadar, la viţa-de-vie, electro-chimioterapia se va desfăşura prin stimularea electrică a
fragmentelor de plantă în cuva de electroforeză orizontală cu 40 mA intensitate curent electric
timp de 10 minute, urmată de cultivarea pe medii de cultură aseptice îmbogăţite cu 20 mg/L
ribavirină + 40 mg/L oseltamivir, timp de o subcultură.
Chimioterapicele ribavirină + oseltamivir prezente în mediul de cultură au condus la
eliminarea virusurilor X şi Y ale cartofului cu o eficienţă (calculată conform Lozoya-Saldana,
1996) de 53,3 la PVX 1, 66,7 la PVX 2 şi 64,5 la PVY 1, la concentraţii de 40 mg/L ribavirină +
40 mg/L oseltamivir, timp de 3 subculturi succesive.
Aplicarea în cuva de electroforeză orizontală asupra materialului biologic infectat de
cartof a unui curent electric a condus la regenerarea unui număr cât mai mare de plante libere de
virus odată cu creşterea intensităţii curentului electric (40, 50, 100 mA) şi a timpului de
tratament (5, 10, 20 minute). Dar, odată cu intensificarea severităţii tratamentelor, care a condus
la creşterea ratei de eliminare a virusurilor, a scăzut rata de regenerare a plantelor. Drept urmare,
evaluarea indicelui de eficienţă terapică a pus în evidenţă varianta de stimulare electrică cu 100
mA timp de 10 min cu valori de 52,4 pentru PVY 2 şi 74,3 pentru PVX 2. În mod similar s-a
remarcat aceeaşi variantă experimentală şi pentru eliminarea PVY1 şi PVX1.
Aşadar la cartof, electro-chimioterapia se va desfăşura la următorii parametrii
experimentali: stimulare electrică cu 100 mA 10 min, urmată de cultură pe mediu suplimentat cu
40 mg/L ribavirină + 40 mg/L oseltamivir timp de 3 subculturi.
Bibliografie
Awan A. R., Mughal S.M., Iftikhar Y, Khan H.Z., 2007 – In vitro elimination of Potato Leaf
Roll Polerovirus from potato varieties. European Journal of Scientific Research 18 (1),
155 - 164.
Nasir I.A., Tabassum B., Latif Z., Javed M.A., Haider M. S., Javed M.A., Husnain T., 2010 –
Strategies to control Potato virus Y under in vitro condition. Pak. J. Phytopathol., 22(1),
63-70.
4. Initierea culturilor pentru regenerarea de viţă-de-vie liberă de virusurile GFLV şi
GLRaV-1 prin electro-chimioterapie - P1
Electro-chimioterapia la viţa-de-vie s-a desfăşurat în următoarele etape:
- recoltarea porţiunilor terminale ale lăstarilor de la plante mamă infectate cu virusuri: Fetească
neagră 7 Od înfectată cu GFLV şi Frâncuşă 15 Od infectată cu GLRaV-1;
- spălare şi hidratare pronunţată cu jet continuu de apă timp de 60 minute;
- stimulare electrică în cuva de electroforeză orizontală a lăstarilor, în tampon soluţie NaCl 1 m;
- sterilizarea materialului biologic cu hipoclorit de calciu 6 % timp de 7 min urmată de spălări
repetate cu apă distilată sterilă;
- porţionarea minilăstarilor şi inocularea explantelor la hota cu flux de aer laminar, pe mediu de
cultură specific (Vişoiu şi colab. 2002) suplimentat cu amestecul de chimioterapice ribavirină 20
mg/L şi oseltamivir 40 mg/L;
- creşterea explantelor în condiţii controlate, 25 10C temperatură, 16 ore lumină
fotoperioadă şi 3000-3500 lx intensitate luminoasă.
Timp de o subcultură (aprox. 30 zile) explantele au stat în contact cu viricidele (timp în
care a avut loc denaturarea componentelor virale şi blocarea multiplicării virusurilor), după care
au fost transferate pe mediu de cultură obişnuit unde procesele de proliferare de muguri adventivi
s-au intensificat. Lăstarii nou formaţi au fost transferaţi pe mediu de înrădăcinare, după care,
microplantele au parcurs etapele aclimatizării în vederea regenerării de plante noi de viţă-de-vie.
Defazajul creat între multiplicarea virusului afectată atât de tratamentul electric cât şi de
prezenţa chimioterapicelor şi multiplicarea celulei vegetale sperăm să fi condus la regenerarea de
noi plante libere de virus.
Bibliografie
Vişoiu E., Dumitriu I.C., Tiţa I., Popa C., Buciumeanu E., Bejan C., Alecu D., Smaranda Gh.,
Stănescu Gr., Popescu C.F., Cujbescu I., Tămagă A., Teodorescu A., 2002 – Viticultura
cu bazele producerii materialului săditor de valoare biologică ridicată. Ed. Phoenix,
Braşov.
5. Initierea culturilor pentru regenerarea de cartof liber de virusurile PVX1 şi PVY1 prin
electro-chimioterapie - P2
Materialul supus experimentării a fost prelevat din partea aeriană a plantelor infectate
obţinute în aceleași condiții ca în etapa precedentă (activitatea 4 din etapa IV) aflate în faza de
vegetaţie, plante inoculate cu izolatul 1 de la fiecare virus şi diagnosticate ca fiind virozate.
Infectorii folositi pentru inoculare au fost
- pentru virusul Y al cartofului:
- plante din soiul Record (infecţie secundară) IZOLAT 1 (PVYO)
- pentru virusul X al cartofului:
- plante din soiul Ostara (infecţie secundară) IZOLAT 1
În funcţie de sursa de virus şi de soi, pentru identificarea materialului biologic şi a
variantei experimentale s-au folosit următoarele abrevieri:
- RX1 = soiulRoclas, virusul X, izolatul 1
- RY1 = soiulRoclas, virusul Y, izolatul 1
După îndepărtarea frunzelor, materialul biologic recoltat a fost supus următoarele etape:
sterilizarea materialului vegetativ – acesta presupune spălarea câteva minute sub jet de apă,
dimensionarea explantelor. Pentru varianta martor materialul biologic a fost sterilizat 3 minute
în alcool 960, apoi 10 minute în soluţie Domestos 20%, după care explantele au fost trecute sub
hota cu flux laminar, în trei vase cu apă bidistilată 5, 10 şi 5 minute. La celelalte variante (V7-
V9) după ce s-a efectuat spălarea materialului vegetativ şi dimensionarea explantelor, înainte de
sterilizare, explantele au fost introduse în soluţia NaCl 1M din cuva aparatului pentru
electroforeză; au fost expuse la 100 mA, trei durate de timp (5, 10, 20 min) apoi trecute printr-un
vas cu apă distilată şi sterilizate (urmând etapele specificate anterior).
Camera pentru inocularea explantelor este sterilizată, cu hotă cu flux laminar de aer steril;
sterilizarea eprubetelor se efectuează în etuvă, la 180oC, iar mediul de cultură, în care sunt
inoculate explantele, se sterilizează în autoclav, la 1200C.
După inocularea explantelor în eprubete, conţinând mediu de multiplicare Murashige-
Skoog și mediu MS cu conținut de viricide (Oseltamivir 40mg/L și Ribavirin 40mg/L), acestea
au fost plasate în camera de creştere la 200C, cu o fotoperioadă de 16 ore lumină şi 8 ore
întuneric.
S-au realizat 1-2-3 subculturi consecutive pe mediu MS (S1, S2, S3). Fiecare subcultură a
fost evaluată individual, rezultatele privind absorbanţele optice înregistrate fiind obținute
aplicând tehnica DAS ELISA (Clark si Adams, 1977).
6. Regenerarea de plante de viţă-de-vie libere de GFLV şi GLRaV-1 prin electro-
chimioterapie - P1
Fragmentele de lăstari de 2-3 internodii ce provin din regiunile apicale ale plantelor de
viţă-de-vie infectate cu virusuri nu au suferit modificări vizibile în timpul tratamentului electric,
exprimate prin necroze la nivelul ţesuturilor superficiale. Etapa de steririlzare cu hipoclorit de
calciu s-a desfăşurat de asemenea în condiţii optime. Lăstarii au fost porţionaţi în apexuri şi
fragmente uninodale care au fost cultivate pe mediu de cultură steril, specific viţei-de-vie,
suplimentat cu 20 mg/L ribavirină şi 40 mg/L oseltamivir.
Procesele regenerative au demarat încă de la prima subcultură, chiar sub influenţa
chimioterapeuticelor, cu rate de multiplicare la ambele infecţii virale sensibil mai mici
comparativ cu martorul (explante iniţiate direct în cultură in vitro fără electro-chimioterapie).
După 30 de zile de tratament pe mediu cu antivirale (subcultura 1) explantele au fost subcultivate
pe mediu obişnuit timp de 2 subculturi (2 şi 3). Pe parcursul acestora procesele regenerative s-au
intensificat (apariţia numeroşilor muguri adventivi) şi au început să se diferenţieze minilăstari
(Tabelul 6.1 şi Fig. 6.1).
Tabelul 6.1
Evoluţia ratelor de multiplicare în cadrul experimentului de regenerare de plante de viţă-de-vie
liberă de virusuri prin electrochimioterapie
Genotip/infecţie virală Subcultura 1 Subcultura 2 Subcultura 3
Fetească neagră 7 Od/GFLV 2,50 ± 0,3747 3,33 ± 1,4539 5,16 ± 2,1532
Fetească neagră 7 Od / martor 3,25 ± 1,3245 3,66 ± 2,1536 4,66 ± 1,5689
Frâncuşă 15 Od / GLRaV-1 2,33 ± 1,5177 3,00 ± 2,0532 4,66 ± 1,2643
Frâncuşă 15 Od / martor 2,16 ± 1,5873 3,66 ± 1,5687 4, 50 ± 2,2536
Valorile sunt medii pe repetiţii ± d.std.
Minilăstarii cu dimensiuni de 2-3 cm au fost apoi subcultivaţi pe mediu de înrădăcinare în
vederea obţinerii vitroplantelor ce vor fi ulterior aclimatizate la condiţii ex vitro şi testate
serologic pentru evaluarea eficienţei metodei de devirozare aplicate. Aplicarea electro-
chimioterapiei a condus la diferenţierea şi elongarea unui număr mai mare de lăstari comparativ
cu martorul la ambele genotipuri testate (Fig. 6.2). Probabil tratamentele aplicate au determinat
blocarea multiplicării virusului şi regenerarea de neoplantule sănătoase.
Fig. 6.1 Evoluţia subculturilor la genotipul Fetească neagră 7 Od supus electro-chimioterapiei
(de la stânga la dreapta): iniţiere pe mediu cu viricide, subcultura 1 şi 2 pe mediu obişnuit
Fig 6.2 a - Influenţa electro-chimioterapiei (E-C) asupra numărului de minilăstari obţinuţi,
comparativ cu martorul (C); valorile sunt medii, barele reprezintă deviaţiile standard. b -
Minilăstari cultivaţi pe mediu de înrădăcinare aparţinând genotipului Fetească neagră 7 Od.
7. Evaluarea acţiunii combinate a curentului electric şi chimioterapicelor asupra
dezvoltării plantulelor de viţă-de-vie pe parcursul subculturilor, prin măsurători
biometrice şi cuantificarea unor compuşi biochimici - P1
Electro-chimioterapia, ca metodă de blocare a multiplicării virale a constat din acţiunea
combinată a curentului electric asupra fragmentelor de plantă infectată şi a chimioterapeuticelor,
la cultivarea acestora pe mediu de cultură, în condiţii sterile, în vederea regenerării de noi plante
de viţă-de-vie liberă de virusuri. Aşa cum am menţionat şi cu alte ocazii, principiul devirozării
constă în crearea unui blocaj în multiplicarea virusului, sub acţiunea unor factori fizici, care de
altfel afectează şi multiplicarea celulei vegetale. Componenţa mediului de cultură şi a balanţei
hormonale determină reluarea proceselor regenerative cu generarea de formaţiuni alcătuite din
muguri adventivi şi plantule diferenţiate din mugurii adventivi. Biometrizarea acestor formaţiuni
20
1614,8313,5
0
5
10
15
20
25
30
Fetească neagră 7 Od Frâncuşă 15 Od
nr.
lăstar
i
E-C
C
a b
poate da informaţii asupra efectului combinat al celor doi factori de inhibiţie a multiplicării
virale: temperatura intracelulară determinată de curentul electric şi prezenţa chimioterapeuticelor
în mediul de cultură.
Măsurătorile au fost efectuate după prima subcultură, la transferul explantelor pe mediu
obişnuit, după ce fragmentele vegetale stimulate electric au stat în contact cu antiviralele timp de
aproximativ 30 de zile. Fiecare explant tratat electric şi cultivat pe mediu a constituit o repetiţie.
Din datele prezentate în tabelul 7.1 se poate observa că tratamentele au condus la valori
mai mici la toţi parametrii măsuraţi ai formaţiunilor de multiplicare, comparativ cu martorul
netratat. Cu toate acestea, factorii de tratament nu au fost atât de agresivi ca să determine necroze
ale explantelor soldate cu pierderea viabilităţii lor.
Desfăşurarea procesului de fotosinteză a fost apreciată prin cuantificarea unor compuşi
biochimici ca hidraţi de carbon solubili (Pánczél şi Eifert, 1960), polifenoli totali (Singleton şi
Rossi, 1965), pigmenţi clorofilieni (Holm, 1954). Monitorizarea a fost efectuată atât după prima
subcultură timp în care explantele au fost sub influenţa viricidelor, cât şi după încă două
subculturi pe mediu fără antivirale, necesare elongării minilăstarilor diferenţiaţi.
Impactul viricidelor asupra plantulelor cultivate pe mediu steril a fost exprimat prin valori
mai mici ale compuşilor biochimici studiaţi, înregistrate după prima subcultură şi creşterea
progresivă a acestor parametrii la subcultivarea pe mediu de cultură fără antivirale, la ambele
genotipuri studiate (Fig. 7.1 şi 7.2).
Tabelul 7.1
Măsurători biometrice asupra plantulelor cultivate in vitro aparţinând genotipurilor
Fetească neagră 7 Od şi Frâncuşă 15 Od supuse electro-chimioterapiei
Genotip/infecţie
virală
Varianta Muguri
adventivi
nr.
Plantule
diferenţiate
nr.
Lungimea
plantulelor
diferenţiate
cm.
Fetească neagră
7 Od/ GFLV
Electro-chimioterapie 2,4 ± 2,5689 2,0 ± 1,4398 0,45 ± 1, 2452
Martor 2,5 ± 1,4832 2,4 ± 2,1356 0,50 ± 0,9536
Frâncuşă
15 Od/GLRaV-1
Electro-chimioterapie 2,2 ± 1,2543 1,8 ± 1,2589 0,40 ± 0,2531
Martor 2,6 ± 1,2356 2,0 ± 2, 1365 0,45 ± 1,1243
Valorile sunt medii ± d.std
Fig. 7.1 Concentraţia hidraţilor de carbon solubili şi a polifenolilor totali la genotipurile
Fetească neagră 7 Od (stânga) şi Frâncuşă 15 Od (dreapta) supuse electro-chimioterapiei.
Valorile sunt medii, barele indică deviaţia standard a mediei.
4,38 4,265,06
4,64
5,58 5,52
0
1
2
3
4
5
6
Carbohidrati solubili Polifenoli totali
mg
% s
.u.
S1
S2
S3
4,26 4,414,88
4,46
5,264,88
0
1
2
3
4
5
6
Carbohidrati solubili Polifenoli totali
mg/
g s.
u.
S1
S2
S3
Fig. 7.2 Nivelul pigmenţilor asimilatori în materialul biologic supus electro-chimioterapiei
aparţinând genotipurilor Fetească neagră 7 Od (stânga) şi Frâncuşă 15 Od (dreapta) .
Valoriile sunt medii, barele indică deviaţia standard a mediei.
Bibliografie
Holm G.,1954 – Chlorophyll mutation in barley. Acta Agric. Scand. 4: 457-471
Pánczél M., Eifert J., 1960 – Die Bestimung des Zuckerund Stärkegehaltes der Weinrebe mittels
Anthronreagens. Mitt. Klosterneuburg 10: 102–110.
Singleton VL, Rossi JA (1965) - Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-
phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic 16 (3):144-158.
8. Regenerarea de plante de cartof libere de PVX1 şi PVY1 prin electro-chimioterapie- P2
Această activitate a vizat obținerea de plante de cartof sănătoase prin aplicarea succesivă a
electroterapiei şi chimioterapiei in vitro materialului biologic infectat inițial cu PVX1 şi PVY1.
Deoarece in etapele anterioare cele mai promițătoare rezultate au fost obtinute in cazul utilizării
- chimioterapicelor adăugate la mediul MS (varianta Oseltamivir 40mg/l +Ribavirin 40mg/l)
- electroterapiei aplicate in variantele V7, V8, V9 (notate astfel conform activităţii IV.6,
etapa IV, adică materialul tratat cu ajutorul curentului electric intensitate 100mA timp de
5,10,respectiv 20minute)
am ales pentru regenerarea in vitro doar aceste variante, iar pentru compararea rezultatelor am
folosit și controale pozitive (plante infectate si netratate, multiplicate doar pe mediu MS) cât și plante sănătoase (neinfectate, netratate, doar multiplicate pe mediu MS). Pentru a evalua
influenţa curentului electric, a chimioterapicelor precum și a tratamentelor combinate
(electroterapie și chimioterapice) precum şi eventualele diferenţe pe variantele experimentale,
explantele au fost multiplicate pe 1-2-3 culturi succesive (subculturi consecutive S1-24 zile, S2-
26 zile, S3-28 zile), fiind utilizat mediul Murashige Skoog (1962) cu adaos de chimioterapice
(Oseltamivir 40mg/l +Ribavirin 40mg/l) la prima subcultură (S1) și mediu MS la următoarele 2
subculturi (S2 și S3). Înainte de primele două subculturi, explantele (cu excepţia controalelor
pozitive și negative și a variantei V2) au fost tratate cu curent electric, iar în cazul celei de a treia
subculturi, explantele au fost transferate pe mediu MS, fără electroterapie. Procesul de
aclimatizare a plantelor a fost iniţiat în toate variantele (RY1, RX1). La a doua şi a treia
subcultură s-au folosit doar 2 explante din vârf. Pentru fiecare variantă de tratament,
experimentul a fost repetat de trei ori.
0,5480,654 0,597
0,2260,246 0,258
0,364
0,432 0,453
0
0,5
1
1,5
S1 S2 S3
mg/
g s.
v.
Carot.
Cl.b
Cl.a 0,5370,636
0,563
0,2280,231 0,264
0,359
0,453 0,462
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
S1 S2 S3
mg/
g s.
v.
Carot.
Cl.b
Cl.a
Efectul fitotoxic generat de utilizarea curentului electric (diferite intensităţi, diverse durate) si
a mediului cu adaos de viricide a fost estimat cu ajutorul ratei de multiplicare exprimate prin
numărul de minibutaşi (fragmente uninodale) rezultate din propagul iniţiat (Fig. 8.1).
După a treia subcultură (S3), rata medie de regenerare (estimată ca fiind procentul de plante
regenerate din totalul plantelor cultivate) a fost cuprinsă în intervalul 47,8-52,4% pentru
materialul infectat cu PVY şi tratat, respectiv între 60,0- 77,8% pentru explantele infectate cu
PVX la care s-au aplicat diverse variante de tratamente combinate (electroterapie și chimioterapice). În cazul materialului infectat cu PVY (RY1), utilizând trei durate ale curentului
electric (5, 10, 20 minute), au fost obţinute următoarele valori pentru rata de regenerare medie:
52,4%, 65,0% şi 47,8% (Tabel 8.1). Materialul infectat cu PVX (RX1) s-a comportat diferit, rata
de regenerare medie (media valorilor pentru toate duratele de tratament la aceeaşi intensitate)
înregistrând diferite valori o dată cu mărirea perioadei de timp în care a fost aplicat curentul
electric. Astfel, în cazul materialului infectat inițial cu PVX (RX1), utilizând trei durate ale
curentului electric (5, 10, 20minute), au fost obţinute următoarele valori pentru rata de regenerare
medie: 68,2%, 77,8% şi 60,0% (Tabel 8.1). Valorile obţinute pentru rata de regenerare în cazul
materialului infectat cu virusul X al cartofului au fost mai ridicate decât cele specificate în unele
surse bibliografice (Lozoya-Saldaña et al. 1996). După cum este subliniat în aceeași lucrare, rata
de regenerare depinde de materialul genetic folosit în lucrările experimentale, dar și de tulpinile
virale ale patogenului inoculat.
Tabel 8.1
Efectul tratamentelor prin electroterapie asupra ratei de regenerare pentru PVY şi PVX (explante
infectate soiul Roclas, RX1, RY1). Valorile din tabel reprezintă mediile a 3 repetiţii. Rezultatele
au fost înregistrate după 3 subculturi consecutive: 2 subculturi S1, S2 explante tratate prin
electroterapie şi o subcultură S3 explante netratate transferate pe mediuMS).
Varianta
Trata
ment
mA/mi
n
Rata regenerare material infectat cu:
PVY (izolat 1) PVX (izolat 1)
Plante
regenerate a
/
Plante tratate b
% ±STDEV
Plante
regenerate a
/
Plante tratate b
% ±STDEV
V0
Control pozitiv 0/0 4/28. 14,3 ±3.221 6/28 21,4 ± 6.475
V1
Control negativ 0/0 9/12 75 ±5.124 10/14 71.4 ± 3.578
V2 RB+OS 40/5 30/42 71,4 ±10.831 21/40 52.5 ±12.276
V7 + RB+OS 100/5 22/42 52.4 ±1.452 30/44 68.2 ± 7.157
V8+ RB+OS 100/10 26/40 65.0 ±12.7 56 28/36 77.8 ± 9.810
V9+ RB+OS 100/20 22/46 47.8 ±10.892 26/40 60.0 ± 5.084 a număr plante regenerate (în toate repetiţiile);
b număr explante tratate (în toate repetiţiile);
c în cazul acestor variante, sunt prezentate valorile înregistrate după subculture a doua (S2),
deoarece nu am obţinut microplante în aceste variante după prima subcultură şi a fost necesară
iniţierea de noi plante, pornind de la explante virozate; STDEV= abaterea standard
Fig. 8.1. Vitroplante regenerate prin electro-chimioterapie (multiplicare în cutii).
9. Evaluarea acţiunii combinate a curentului electric şi chimioterapicelor asupra
dezvoltării plantulelor de cartof pe parcursul subculturilor, prin măsurători biometrice şi
cuantificarea unor compuşi biochimici - P2
Cuantificarea unor compuşi biochimici și măsurătorile biometrice la plantulele de cartof
supuse electro-chimioterapiei au avut ca scop estimarea efectului tratamentului combinat curent
electric (variantele mai severe: 100mA/5-10-20minute) + viricide (Ribavirin 40mg/l+Oseltamivir
40mg/l) asupra dezvoltării explantelor, în vederea alegerii variantei optime, care să permită nu
numai eliminarea infecţiei virale, dar şi evolutia optimă a materialului în vegetaţie,
supravieţuirea plantelor.
Pentru dozarea amidonului din plantulele de cartof supuse electroterapiei s-a folosit o
metodă spectrofotometrică (Pena Valdivia, 1991). Extractul supus testelor s-a obţinut din câte 1
gram material vegetal (prelevat de la trei frunze ale aceleiaşi plante) mărunţit şi omogenizat în
10ml etanol 80% (v/v). Rezultatele testelor au evidenţiat o dependenţă direct proporţională a
concentraţiilor acestor compuşi biochimici, cu intensitatea curentului electric şi implicit durata
de expunere la curent, pentru ambele tipuri de materiale virozate (RX1, RY1), chiar dacă în
mediul de inoculare s-au introdus viricidele menționate anterior. Ca și în cazul tratamentelor
elctroterapice (rezultate prezentate în etapa IV), comparativ cu martorul netratat, valorile medii
ale concentraţiilor acestor compuşi au crescut în toate variantele experimentale, în special în
cazul plantelor infectate cu virusul Y al cartofului. Interesant a fost faptul că în cazul electro-
chimioterapiei, conținutul de amidon a crescut semnificativ comparativ cu cel înregistrat la
materialul tratat doar prin electroterapie.
La materialul experimentat în prezenta etapă, după trei subculturi consecutive, s-a
observat o scădere a conţinutului de proteină brută, în special în cazul variantei mai severe (V9)
şi mai ales la materialul infectat cu virusul Y. Probabil, intensitatea ridicată a curentului a
denaturat o parte din proteinele plantei (Tabelul 9.1. şi 9.2)
În cazul ambelor tipuri de material infectat şi tratat prin electroterapie, vitroplantele
provenite din subcultura a treia (S3) s-au remarcat prin valori semnificativ ridicate ale
conţinutului de amidon (% SU) comparativ cu martorul netratat, odată cu intensificarea
condiţiilor tratamentelor aplicate, în timp ce conţinutul de proteină (% SU) a scăzut (tabel 10.1.
şi 10.2.). Diferenţe mai mari faţă de martorul netratat au fost înregistrate mai ales la vitroplantele
obţinute din materialul iniţial inoculat cu PVY (izolatul 1).
Măsurători biometrice au urmărit estimarea efectului tratamentelor electroterapice asupra
numărului de frunze /plantula și a lungimii tijei plantulelor. Determinările au fost efectuate pe
parcursul subculturilor, doar la vitroplantele care au constituit punctul de plecare pentru viitoarea
subcultură. S-au ales de fiecare dată din fiecare variantă plantulele care s-au dezvoltat cel mai
bine.
Tabelul 9.1
Influenţa tratamentelor electroterapice asupra conţinutului mediu de amidon* şi proteină* brută
la plantulele de cartof infectate cu PVY (RY1) si tratate pe parcursul subculturilor S1, S2, S3
(mediul S 1 cu adaus Ribavirin 40mg/l și Oseltamivir 40mg/l).
Variant
a
Tratam
ent
mA/min
Conţinut mediu amidon (% SU) Conţinut mediu proteină brută (%SU)
S1 S2 S3 S1 S2 S3
V0 0/0 4,067±0,416
(e)*
6,800±0,608
(cd)
4,933±0,404
(e)
47,433±0,416
(b)
48,433±0,51
3 (a)
46,367±0,404
(bc)
V7
+virici
de
100/5 6,833±0,126
(cd)
7,633±0,723
(bcd)
6,633±0,351
(cd)
46,533±0,351
(bc)
43,833±0,64
3 (d)
47,700±0,173
(b)
V8
+virici
de
100/10 7,833±0,566
(bc)
8,533±0,351
(a)
8,367±0,306
(ab)
42,967±0,513
(e)
42,167±0,40
4 (e)
45,400±0,529
(c)
V9
+virici
de
100/20 8,067±0,108
(a)
8,267±0,306
(ab)
8,467±0,416
(a)
32,600±0,458
(f)
30,120±0,36
1 (g)
32,833±0,306
(f)
Tabelul 9.2
Influenţa tratamentelor electroterapice asupra conţinutului mediu de amidon* şi proteină* brută
la plantulele de cartof infectate cu PVX (RX1) si tratate pe parcursul subculturilor S1, S2, S3
(mediul S1 cu adaus de Ribavirin 40mg/l și Oseltamivir 40mg/l).
Varianta Tratament
mA/min
Conţinut amidon % SU Conţinut proteină brută %SU
S1 S2 S3 S1 S2 S3
V0 0/0 4,678±0,158
(e)
4,110±0,62
8 (f)
4,127±0,561
(f)
50,127±1,015
(b)
56,500±1,49
6 (a)
56,353±2,43
3 (a)
V7
+virici
de
100/5 6,040±0,500
(cd)
6,67±1,052
(bc)
6,090±0,265
(cd)
45,335±0,913
(c)
43,167±1,15
0 (d)
45,133±1,95
5 (c)
V8
+virici
de
100/10 7,167±0,902
(abc)
7,567±0,04
3 (ab)
7,338±0,451
(ab)
41,363±1,236
(e)
40,060±0,69
5 (f)
40,233±0,57
1 (f)
V9
+virici
de
100/20 7,433±0,757
(ab)
7,400±0,55
5 (ab)
8,910±0,780
(a)
40,850±1,530
(ef)
39,100±1,61
5 (g)
39,200±1,85
9 (g)
*Valorile din tabel reprezintă media ± abaterea standard, iar literele din paranteză indică
diferenţe semnificative pentru pragul de semnificaţie p<0,05
În figurile 9.1 şi 9.2 sunt prezentate sintetic rezultatele obținute privind măsurătorile
biometrice efectuate. Acestea evidenţiază efectul puternic pe care l-au avut tratamentele
combinate electro- si chimioterapice asupra numărului de frunze şi lungimii tijei la toate
plantulele măsurate comparativ cu martorul infectat netratat (control pozitiv care nu a beneficiat
de electro- și chimioterapie). Cu excepția martorului, în toate variantele s-au înregistrat valori
semnificativ mai ridicate în special în cazul subculturii S3 atât la materialul infectat inițial cu
PVX cât și la cel inoculat inițial cu PVY. Pentru ambele tipuri de virusuri, cele mai mari
diferenţe faţă de martorul netratat s-au înregistrat în cazul variantelor de tratament
(electroterapie) mai severe, atât pentru numărul mediu de frunze/plantulă, cât şi pentru valorile
medii ale tijei vitroplantelor. Am folosit pentru toate variantele aceeași compoziție pentru mediul
de multiplicare a materialului (adausul de viricide a fost același: Ribavirin 40mg/l și Oseltamivir
40mg/l). În concluzie, tratamentele combinate aplicate materialului infectat cu PVX și PVY
(izolatul 1) au avut efect benefic și asupra dezvoltării fiziologice a materialului regenerat,
precum și asupra concentrației unor compuși chimici (amidon, proteine).
Fig. 9. 1 Evaluarea acţiunii combinate (curentul electric+viricide) asupra dezvoltării plantulelor
de cartof pe parcursul subculturilor S1, S2, S3 prin măsurători biometrice. Influenţa
tratamentelor electroterapice aplicate plantulelor de cartof infectate initial cu PVY (izolatul1) şi
tratate in diferite variante asupra lungimii medii a tijei vitroplantelor şi asupra numărului mediu
de frunze/plantula.* viricidele utilizate ca adaos in mediul MS de la subcultura S1 au fost
Ribavirin 40mg/l și Oseltamivir 40mg/l. Experimentele au fost efectuate în trei repetiții.
Fig. 9.2 Evaluarea acţiunii combinate (curentul electric+viricide) asupra dezvoltării plantulelor
de cartof pe parcursul subculturilor S1, S2, S3 prin măsurători biometrice. Influenţa
tratamentelor electroterapice aplicate plantulelor de cartof infectate initial cu PVX (izolatul1) si
tratate in diferite variante asupra lungimii medii a tijei vitroplantelor şi asupra numărului mediu
de frunze/plantula.* viricidele utilizate ca adaos in mediul MS de la subcultura S1 au fost
Ribavirin 40mg/l și Oseltamivir 40mg/l. Experimentele au fost efectuate în trei repetiții.
Bibliografie
Pena Valdivia, C. B., Ortega-Delgado, M. L.: Non structural carbohydrate partiining in
Phaseolus vulgaris after vegetative growth. Journal of the Science and Food and
Agriculture, (1991) 55, p. 563-57
10. Monitorizarea plantelor de viţă-de-vie şi cartof regenerate sănătoase prin
electroterapie, privind desfasurarea proceselor fiziologice – CO
Stresul biotic, în cazul nostru infecţia virală poate provoca modificări fiziologice nedorite
la plantele infectate. Bolile produse de virusuri ridică probleme mult mai mari deoarece ele nu
pot fi combătute cu tratamente fitosanitare. Studiile au arătat că viţa-de-vie infectată cu virusuri
prezintă alterări ale diverselor procese metabolice, ca respiraţia, activitatea unor enzime,
transportul asimilatelor, balanţa hormonală şi fotosinteza (Pozsar şi colab., 1969; Walter, 1988
citaţi de Sampol şi colab., 2003). Cercetările au avut în vedere reacţiile primare care se
desfăşoară în procesul de fotosinteză, deoarece proteina capsidală a virusului pare să se
acumuleze în membranele cloroplastelor şi tilacoidelor plantelor infectate (Zaitlin, 1987; Reinero
şi Beachy, 1989; Rahoutei şi colab., 2000 citaţi de Sampol şi colab., 2003).
Plantele de viţă-de-vie regenerate libere de GFkV şi GLRaV-1 prin electroterapie
cultivate la ghivece nutritive în sera depozitar au fost evaluate din punct de vedere al desfăşurării
proceselor de fotosinteză prin cuantificarea unor indicatori: hidraţi de carbon solubili (Pánczél şi
Eifert, 1960), polifenoli totali (Singleton şi Rossi, 1965), pigmenţi clorofilieni (Holm, 1954). Au
fost monitorizate plante sănătoase indiferent de varianta de electroterapie aplicată, comparativ cu
plante infectate regenerate prin cultură in vitro fără electroterapie. Fiecare plantă a constituit o
repetiţie. Rezultatele au pus în evidenţă diferenţe privind concentraţia compuşilor studiaţi, la
plantele regenerate libere de virus înregistrându-se valori mai mari comparativ cu plantele
infectate, la ambele genotipuri studiate (Tabelul 10.1). A fost confirmat şi de această dată faptul
că infecţia virală produce modificări în sensul că pigmenţii carotenoizi şi clorofilieni au valori
reduse la plantele infectate aşa cum au descris Abrasheva şi Slavcheva, 1974; Balachandran şi
colab, 1994; González şi colab.,1997; Rahoutei şi colab, 2000 citaţi de Sampol şi colab., 2003.
Tabelul 10.1
Evaluarea unor indicatori biochimici la plante de viţă-de-vie regenerate libere de GFLV şi
GLRaV-1 prin electroterapie, comparativ cu plante infectate Indicator biochimic Tămâioasă românească 3-2-2 Frâncuşă 15 Od
Plante libere
de GFkV
Plante infectate cu
GFkV
Plante libere
de GLRaV-1
Plante infectate
cu GLRaV-1
Substanţa uscată
% 29,42 ± 0,5942 31,26 ± 0,9144 28,54 ± 0,7364 28, 86 ± 0,7563
Carbohidraţi solubili
% s.u. 2,616 ± 0,1245 2,413 ±0,2154 2,354 ± 0,7835 2,109 ± 0,5783
Polifenoli totali
% s.u. 7,950 ± 0,1654 7,899 ± 1,0253 8, 179 ± 1,1324 8,056 ± 0,9852
Clorofila a
mg/g s.v. 0,5362 ± 0,0045 0,5263 ± 0,0021 0,4986 ± 0,0046 0,4553 ± 0,0023
Clorofila b
mg/g s.v. 0,4263 ± 0,0041 0,4112 ± 0,0054 0,4723 ± 0,0085 0,4598 ± 0,0044
Pigmenţi carotenoizi
mg/g s.v. 0, 4973 ± 0,0021 0,4632 ± 0,0057 0,4684 ± 0,0047 0,4578 ± 0,0028
Valorile sunt medii ± d.std.
Dacă am comparat între ele valorile obţinute la dozarea carbohidraţilor solubili din
frunzele plantelor libere de GFkV aparţinând genotipului Tămâioasă românească 3-2-2 pe toate
variantele de tratament (13 plante regenerate pe 9 variante experimentale) nu au fost evidenţiate
diferenţe între parametrii de lucru. Putem spune că acţiunea curentului electric în cuva de
electroforeză orizontală asupra fragmentelor de plantă infectată nu a influenţat procesele
fiziologice la plantele regenerate sănătoase indiferent de intensitatea curentului şi a timpului de
expunere. (Fig. 10.1).
Fig. 10.1 Concentraţia hidraţilor
de carbon la plante regenerate
libere de GFkV aparţinând
genotipului Tămâioasă
românească, prin electroterapie în
cuva de electroforeză orizontală
Materialul biologic ales pentru monitorizarea plantelor de cartof sănătoase prin
electroterapie a provenit din vitroplante (soiul Roclas) infectate cu virusurile PVX si PVY
(izolatul 1) (RX1 şi RY1) devirozate în urma tratamentelor electroterapice aplicate în variantele
V7, V8 şi V9 pe parcursul subculturilor S1 şi S2 şi aclimatizate după subcultura S3. Indicatorii
fiziologici au fost determinaţi după 40 zile de vegetaţie pentru materialul RX1 şi după 32 zile de
vegetaţie pentru restul plantelor.
Monitorizarea stării de vegetaţie a plantelor regenerate sănătoase s-a realizat prin:
- determinarea conţinutului de clorofilă la nivel de frunză (dispozitiv portabil SPAD 502
Chlorophyll Meter).Valorile determinate cu echipamentul utilizat au indicat suma relativă a
cantităţii de clorofilă prezentă în frunzele plantei, măsurată prin transmitanţa frunzei la două
lungimi de undă, 650 nm (roşu) şi 940 (infraroşu apropiat - NIR).
- estimarea conţinutului de antociani la nivel de frunză (dispozitiv potabil ACM 200 plus,
Antocianin Chlorophyll Meter) . Ca şi în cazul determinării conţinutului de clorofilă, valorile
indicate de aparat reprezintă suma relativă a cantităţii de antociani prezenţi în frunze, estimată
prin transmitanţa materialului vegetal măsurată la doua lungimi de undă caracteristice în cazul
analizelor de pigmenţi antocianici (510nm şi 700nm).
Rezultatele sintetizate în figura 10.2. evidenţiază efectul tratamentelor electroterapice
utilizate în variantele experimentale asupra acumulării de pigmenţi clorofilieni şi antocianici,
precum şi diferenţele care există între materialul regenerat din plante infectate cu două virusuri
diferite. În cazul plantelor regenerate provenite din materialul infectat cu PVX (izolatul 1),
varianta V8 (100mA/10minute) s-a remarcat prin valori semnificativ ridicate în ceea ce priveşte
conţinutul de clorofilă (comparativ cu martorul negativ). Plantele regenerate din materialul
infectat cu virusul PVY (izolatul 1) s-au comportat diferit, conţinutul de clorofilă fiind în cazul
variantei V8 similar cu al controalelor negative. S-a remarcat la ambele tipuri de material infectat
si tratat o scădere semnificativa a conţinutului de clorofilă faţă de martor în cazul variantei V9
(100mA/20minute). Evoluţia valorilor înregistrate pentru numărul mediu de frunze şi a lungimii
-2
-1
0
1
2
3
4
carb
oh
idra
ţi s
olu
bil
i %
s.u
.
valuesWLtargetAL
medii a plantelor a fost asemănătoare cu cea a conţinutului de clorofilă estimat în plantele
regenerate. În ceea ce priveşte conţinutul de antociani, nu au fost semnalate diferenţe
semnificative între valorile înregistrate în variantele experimentale. Faţă de martorul negativ, s-a
constatat totuşi o uşoară creştere a continutului în antociani în cazul materialului infectat iniţial
cu PVY1 (dar valorile nu au fost susţinute statistic). Spre deosebire de conţinutul de antociani,
putem remarca că monitorizarea conţinutului de clorofilă semnalează câteva modificări în
fiziologia plantelor, putând fi astfel observate efectele tratamentelor electroterapice asupra
plantulelor regenerate provenite din materialul inoculat cu virusurile PVX şi PVY (izolatul 1).
Fig.10.3 Influenţa tratamentelor electroterapice asupra dezvoltării plantelor provenite din
material biologic (din soiul Roclas) infectat cu virusurile PVY şi PVX (izolatul 1) şi regenerat
după 3 subculturi consecutive (tratat în cuva de electroforeză înainte de primele două
subculturi,inoculat pe mediu MS) şi aclimatizat în condiţii de seră. Literele indică semnificaţiile
diferenţelor dintre variante (pe fiecare coloană, pentru fiecare tip de virus) conform ANOVA şi
testului Duncan (P<0.05). (A) Conţinutul de clorofilă (unităţi ACI). (B) Continutul de antociani
(unităţi AAI).
Bibliografie
Sampol B., Bota J., Riera D., Medrano H., Flexas J., 2003 - Analysis of the virus-induced
inhibition of photosynthesis in malmsey grapevines. New Phytologist 160:403–412.
11. Diseminarea rezultatelor - CO, P1, P2
Rezultatele obţinute în cadrul proiectului au fost publicate în lucrări ştiinţifice şau expuse
în cadrul unor conferinţe internaţionale.
Lucrări ştiinţifice
1. „The chlorophyll and anthocyanin content of regenerated potato plants obtained from PVX
and PVY infected plantlets treated by combined therapies (preliminary studies)”, Carmen Liliana
Bădărău, Andreea Nistor, Florentina Stroe, Analele Universitatii din Oradea, Fascicula Biologie
TOM XXI, Issue: 2, 2015, pp. 70-75, ISSN 1224-5119 (B+)
http://www.bioresearch.ro/bioresearch/2015-2.html
2. “Molecular modeling of interaction between ribavirin and nucleic acids”, Loredana Elena
Vîjan, Carmen Mihaela Topală, Mathematics and Computers in Sciences and Industry, 2015, 58-
63, ISBN: 978-1-61804-327-6 (BDI) http://www.inase.org/library/2015/books/bypaper/MCSI/MCSI-09.pdf
3. “ATR-FTIR Vibrational Spectroscopy As A Tool To Investigate The Grapevine (Vitis Vinifera
l.) Sanitary Status” Carmen Mihaela Topală, Lavinia Diana Tătaru, Ionela-Cătălina Guţă, Elena
–Cocuţa Buciumeanu, Agriculture & Food, ISSN 1314-8591, Volume 3, 2015, 218-225
http://www.scientific-publications.net/en/article/1000674/
Capitol în cartea“Challenges in medicine, food control and environmental”, Editori Floroian
Laura, Badea Mihaela, Editura Universității Transilvania din Brașov, 2015, ISBN 978-606-19-
0591-1 (CD, editura acreditata CNCSIS). “Effects of some combined treatments of PVY infected
potato plantlets cv. Roclas “. Bădărău Carmen Liliana, Damșa Florentina, Nistor Andreea,
Capitolul 11, pag. 160-188
Participări la Conferinţe internaţionale
1. „Several effects of some electrotherapy treatments of PVX and PVY infected potato plantlets
cv. Roclas” Carmen Liliana Bădărău, Florentina Damşa, Andreea Nistor. Al 3-lea Congres
International NEEFood (Tehnologii Alimentare în Nordul si Estul Europei) “Provocări locale și globale în Știința și Tehnologia Alimentului”, 20-23 mai 2015, Brasov,
http://neefood2015.rosita.ro/
2. “Effects of some combined treatments of PVY infected potato plantlets cv. Roclas”. Carmen
Liliana Bădărău, Florentina Damşa, Andreea Nistor, A II-a Conferința internațională “New
Trends on Sensing –Monitoring-Telediagnosis for Life Sciences”, Brașov, NT-SMT-LS, 2-5
septembrie 2015, http://www.healthfoodenviron.unitbv.ro/2015/
3. “The use of in vitro chemotherapy for grapevine virus elimination”, Ionela-Cătălina Guţă,
Elena-Cocuţa Buciumeanu, Carmen Mihaela Topală and Lavinia Diana Tătaru , 6th
International
Symposium on Production and Establishment of Micropropagated Plants, Sanremo (Imperia) –
Italy, 19-24 April 2015, p.197
http://www.regflor.it/AB/LIST_OF_ABSTRACTS_PEMP2015.pdf
4. “ATR-FTIR Vibrational Spectroscopy As A Tool To Investigate The Grapevine (Vitis Vinifera
l.) Sanitary Status”, Carmen Mihaela Topală, Lavinia Diana Tătaru, Ionela-Cătălina Guţă, Elena
–Cocuţa Buciumeanu, 3rd International Conference Agriculture and Food June 1-5, 2015,
Elenite, Bulgaria.
http://www.sciencebg.net/en/conferences/agriculture-and-food/
5. “Molecular Modeling of Interaction between Ribavirin and Nucleic Acids”, Loredana Elena
Vîjan, Carmen Mihaela Topală, 2nd Int.Conf. on Mathematics and Computers in Sciences and
Industry - MCSI 2015, 17-19 august 2015, Sliema, Malta
http://www.mcsi-conf.org/index.html
6. “ATR-FTIR Study Of Thyme Oils Extracted By Supercritical Carbon Dioxide”, Carmen
Mihaela Topală and Lavinia Diana Tătaru, 19 th Romanian International Conference on
Chemistry and Chemical Engineering, 2-5 septembrie 2015, Sibiu
http://riccce19.chimie.upb.ro/doc/program.pdf
7. “UV-VIS Absorption Study of Ribavirin – DNA Interaction”- Loredana Elena Vijan, Carmen
Mihaela Topală, 19 th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical
Engineering, 2-5 septembrie 2015, Sibiu
http://riccce19.chimie.upb.ro/doc/program.pdf