química de productos naturales
DESCRIPTION
Ácido ShikimicoTRANSCRIPT
712
QPNat 01 OBTENCIÓN DE ÁCIDO SHIKÍMICO A PARTIR DE LIQUIDÁMBAR STYRACIFLUA.
Rius Alonso Carlos Antonio1
Hernández Flandes Atzin1
Gonzales Quezada Yolanda1
Mena Santos Luz María2
Alonso Salceda Nancy2
Gulias Prado Andrea2
Hernández Delgado Pamela2
Margáin Puig Evana2
RESUMEN
El ácido shikímico es un componente esencial para la síntesis del Oseltamivir, uno de los antivirales más efectivos y de aplicación oral, disponibles para el control del virus de la influenza AH1N1. Inicialmente se ha obtenido a partir del árbol de anís estrella en China, sin embargo la alta demanda que ha tenido en los últimos años ha despertado el interés de encontrar fuentes alternativas para su obtención. En este trabajo se partió del árbol Lyquidámbar Styraciflua que crece en el sur de Estados Unidos y México. El trabajo consistió en analizar las diferentes partes del árbol como son las cápsulas, semillas viables, semillas no viables, hojas verdes, hojas rojas y hojas secas. También se inició el análisis del contenido de ácido en diferentes etapas de crecimiento de las cápsulas y semillas, iniciando 15 días después de haber brotado las cápsulas hasta la maduración completa de las mismas. Esto es importante para poder determinar en que momento es el contenido más alto de ácido. Queremos reportar los resultados preliminares de estos estudios.
ABSTRACT
Shikimic acid is an essential starting material in the Oseltamivir synthesis, this is one of the most effective antiviral drugs available for the control of influenza virus AH1N1. The main source of the Shikimic acid has been the star anise from China, but in the last years the supply is very tight due to an increase in the demand, this is why the search of new alternatives for the acid is important. In this work we used the tree Lyquidámbar Sturaciflua, its grow in the southern part of USA and in Mexico. The work involved the analysis of different part of the tree; as the capsule, the non-viable seeds, the viable seeds, green leaves, red leaves, and dry leaves. Also the quantification of the acid in different steps of the tree grow was assessed starting 15 days after the develop of the capsules until the complete maturation of them. We will report the preliminary result of these studies.
1 Facultad de Química,Química Orgánica, UNAM. * [email protected]. 2 Instituto Godwin-México.
713
INTRODUCCIÓN
La Organización Mundial de la Salud alertó, en abril del 2009, la existencia de una nueva cepa del virus de la influenza, denominado AH1N1, y en junio del mismo año, debido a su propagación global, la declaró como pandemia. De acuerdo a los datos registrados por la Secretaria de Salud de nuestro país, al 14 de junio de 2010, en México se habían confirmado 72,541 casos, de los cuales 1 250 personas han fallecido.i
El fármaco que se utiliza para combatir dicha enfermedad es el oseltamivir, comercialmente conocido como Tamiflu, cuya materia prima es el ácido shikimico. Dicho ácido es importado de diversos lugares por los laboratorios Roche,ii
En la actualidad el ácido shikímico se obtiene a partir del anís estrella chino; sin embargo, su escasez ante el incremento de su demanda, a partir del año 2005 a consecuencia de la pandemia H5N1, y el consiguiente aumento de su precio, el cual se ha quintuplicado en los últimos meses, conlleva a la búsqueda de fuentes alternativas de la materia prima iii requerida en la síntesis del fármaco oseltamivir.
En este proyecto se propone la extracción del ácido shikímico a partir del árbol Liquidámbar styraciflua, el cual se produce de manera abundante y, en cualquier época del año, en gran parte de la República Mexicana iv: en la vertiente del Golfo a lo largo de la Sierra Madre Oriental desde Nuevo León y Tamaulipas, hasta el norte de Chiapas, en la vertiente del Pacífico en la Sierra Madre del Sur en Oaxaca y en la Sierra del Soconusco; específicamente en los estados de Chiapas, Distrito Federal, Hidalgo, Michoacán, Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, San Luis Potosí, Tamaulipas y Veracruz.
La Influenza
La influenza es una enfermedad viral altamente infecciosa; su nombre lo adoptó en el siglo XV Italia, de una epidemia atribuida a la "influencia de las estrellas". La primera pandemia o epidemia mundial debido a esta enfermedad se presentó en 1580. Se sabe que al menos cuatro pandemias de influenza se presentaron en el siglo XIX, y tres en el siglo XX. La pandemia de "Influenza Española" en 1918-1919 causó un número estimado de 21 a 100 millones de muertes alrededor del mundo.
Los científicos Smith, Andrews, y Laidlaw aislaron el virus de la influenza A en hurones en 1933, y posteriormente en 1936 el científico Francis repitió el experimento aislando el virus de la influenza tipo B. En 1940 Burnet descubrió que el virus de la influenza podía crecer en huevos embrionados de gallina. Esto sirvió de guía para el estudio de las características del virus y para el desarrollo de las vacunas inactivadas. La evidencia de la eficacia protectora de las vacunas inactivadas fue producida en los años 50´s.
714
Virus de la Influenza
El virus de la influenza es de cadena simple de forma helicoidal, es un virus RNA de la familia de los orthomyxovirus. Los antígenos básicos tipos A, B y C son determinados por el material nuclear. Influenza tipo A tiene subtipos que son determinados por antígenos de superficie de hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Tres tipos de hemaglutinina en humanos (H1,H2 y H3) tienen un papel en el ataque de los virus a las células. Dos tipos de neuraminidasa (N1 y N2) tienen un papel en la penetración de los virus en las células. La clasificación del virus es la siguiente:
Influenza A causa enfermedad de moderada a severa, y afecta todos los grupos de edades. El virus infecta humanos y otros animales, como los puercos y pájaros.
Influenza B generalmente causa enfermedad menos leve que el tipo A, y primordialmente afecta a los niños. La Influenza B es más estable que la influenza A, con menor inestabilidad antigénica y consecuencias en la estabilidad inmunológica. Éste afecta solo a humanos. Puede ser asociado con el síndrome de Reye.
Influenza C es raramente reportada como causa de enfermedad humana, probablemente porque la mayoría de los casos son sub-clínicos. No ha sido asociada con enfermedad epidémica.v
Influenza AH1N1
Este tipo de influenza causó un número inusual de muertes debido a que, causa una reacción de citocinas (proteínas que regulan la función de las células que las producen u otros tipos celulares) en el cuerpo. El virus (fig. 2) infecta células de pulmón, produciendo una sobre-estimulación del sistema inmune a través de la liberación de cantidades importantes de citocinas en el tejido pulmonar. Esto causa una migración importante de leucocitos hacia los pulmones, lo cual ocasiona una destrucción del tejido pulmonar y la secreción de líquido hacia los mismos, dificultando así la respiración del paciente. Debido a la naturaleza de la infección, las personas con un sistema inmune saludable y normal eran más susceptibles a la enfermedad, tales como adultos jóvenes, a diferencia de niños pequeños y ancianos. La influenza o gripe tuvo una variante muy severa y mortal denominada gripe española. Fue una enfermedad de infección viral, que causó la muerte de entre 50 y 100 millones de personas en el mundo durante 1918 y 1919. Fue causada por el virus de la gripe tipo H1N1.
715
Los virus de la gripe se muestran en tres géneros diferentes los cuales se llaman A, B y C, dependiendo de sus características antigénicas. Todos causan la enfermedad pero solamente los de tipo A son los que pueden llegar a producir epidemias. Dentro de cada género hay un apellido (H1N1) tiene que ver con la parte exterior del virus (fig. 3).
La superficie está formada fundamentalmente por dos tipos de «protuberancias»: Unas en forma de setas y otras en forma de conos.
Las que tienen forma de conos son las hemaglutininas, que son las proteínas responsables de que el virus se pegue a la célula o no. La razón por la que algunos virus se contagian es porque también se pegan a las células “objetivo” muy fácilmente. En el caso de la gripe, los “objetivos” son las células pulmonares. Para que se lleve a cabo la mutación del virus de la gripe se necesitan aproximadamente quinientos «conos» (la H, hemaglutininas, del «apellido»). Las que tienen forma de setas son las neuraminidasas, enzimas cuya misión principal es que el virus logre entrar en la célula que va a infectar. Una cosa es «pegarse» a la superficie de la célula (función de la hemaglutinina) y otra el ser capaz de penetrar la barrera de la superficie celular, que es de lo que se encargan las neuraminidasas. Se necesitan aproximadamente cien «setas» para formar el virus (la N, neuraminidasas, del «apellido»).
Fig. 2. Imagen del virus.
Fig. 3. Virus
716
Fig. 4. Oseltamivir.
El oseltamivir (producido por los laboratorios Roche bajo la marca Tamiflu, fig. 4) es un pro fármaco antiviral selectivo contra el virus de la influenza.vi Éste es uno de los dos antivirales que la Organización Mundial de la Salud recomienda para el tratamiento del virus de la influenza y logra disminuir los síntomas una vez contraído el virus. Su compuesto natural, ácido shikímico, es extraído del árbol del anís estrellado (Illicium verum), planta proveniente de China.vii El anís chino estrellado es un árbol, de 4-6 m de altura, con corteza blanca y hojas lanceoladas enteras con flores amarillo-rosado y forma de estrella. Es originario de los bosques tropicales del sudeste asiático (sur de China y norte de Vietnam), se cultiva en China, Filipinas y Jamaica,viii éste es procesado de una manera
específica para poder obtener el ácido shikímico (componente esencial del Tamiflu).
El ácido shikímico se aisló por primera vez en 1885 de la planta japonesa “SHIKIMI-NOKI” Ilicium religiosum por Eijkmanix. A partir de entonces se convirtió en un compuesto muy importante, ya que, éste da lugar a la síntesis de diversos compuestos, entre los que se pueden encontrar aminoácidos aromáticos (fenilalanina y tirosina), indol (derivados del indol y el aminoácido aromático triptófano), muchos alcaloides y otros metabolitos aromáticos, taninos, flavonoides, y lignina. Hoy en día, tras una serie de estudios, se ha concluido que este ácido se puede encontrar como metabolito de muchas plantas y organismos no mamíferos, a los que otorga un patrón de oxigenaciónx. De acuerdo a la nomenclatura de compuestos orgánicos el ácido shikímico es ácido 1 carboxil 3,4,5 trihydroxil cyclohexeno. Sus propiedades físicas son: es un sólido blanco cuyo punto de fusión es de 190°Cxi. Tiene una masa molecular de 174.15 g/mol. Arbol Liquidambar Styraciflua
El Liquidámbar styraciflua (fig. 5) es un árbol proveniente de la familia liquidámbar, éste se puede encontrar desde el este de Estados Unidos, hasta el Sur de Méxicoxii.
Las características de éste árbol son:
Rápido crecimiento en forma piramidal, puede alcanzar hasta los 41 m de alturaxiii.
717
Su tronco puede llegar a medir hasta 2 m de diámetro.
Sus hojas, en forma de palma y con 5 lóbulos puntudos, tienen una longitud de 7 a 19 cm.
Su fruto es pesado y seco, mide desde 2.5 cm a 5 cm de diámetro, y contiene numerosas cápsulas que al abrirse liberan 1 o 2 pequeñas semillas cada una.
Puede crecer en cualquier tipo de suelo, pues su especie no requiere ningún tipo de
tierra específica. Crece en lugares soleados o parcialmente nublados. Es un árbol caducifolio, pues pierde la mayoría de sus hojas durante otoño, y su
follaje cambia de color verde a naranja, rojo o morado.
PARTE EXPERIMENTAL, DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO:
El proceso de extracción de ácido shikímico a nivel laboratorio se realizó, bajo las siguientes condiciones:
Temperatura de extracción: 60ºC (agitador).
Temperatura para evaporación de agua: 85°C(al vacio) (mezcla shikímico con impurezas disueltos en agua).
Tiempo total de extracción: 48 hrs.
La experimentación se realizó en el Laboratorio 204 de la División de Estudios Superiores de la Facultad de Química de la UNAM, del 25 de noviembre de 2009 al25 de junio de 2010
1. Se separaron los diferentes tipos de componentes del árbol:
Fig. 5. Árbol Liquidámbar styraciflua
718
Las estructuras utilizadas del árbol fueron:
2. Se suspendió cada uno de los componentes en agua como se indica y se mantuvo en agitación constante durante 20 horas a 60°C en un agitador magnético:
a) 30 g de los componentes con 600 ml de agua.
Semillas no viables. Hojas secas verdes (molidas). Hojas secas cafés (molidas). Hojas secas rojas (molidas). Semillas viables. Cápsulas.
Imagen 4. Componentes Separados
Imagen. 3 Cápsula Imagen 2. Hojas Imagen 1. Separación de semillas
Imagen 9. Cápsula Imagen 8. Semilla viable Imagen 7. Hoja Seca Imagen 6. Hoja Verde Imagen 5. Semilla no viable
Imagen 11. Filtración a vacío con embudo Kitasato Imagen 10. Semilla Corta en el agitador
719
Las especificaciones de los equipos e instrumentos utilizados en esta experimentación fueron:
Agitador magnético Cole-Parmer modelo 4803-00 de 115V de 60Hz, 4A.
3. El proceso de purificación consistió en los siguientes pasos: Se realizó la separación de los residuos mediante la filtración al alto vacío
utilizando un embudo Kitasato. Se agregaron 5g de carbón activado con el propósito de eliminar las impurezas
restantes y se agitó durante 15 minutos y filtró.
4. Se evaporó el agua remanente en un rotavapor hasta un volumen de 25 ml de agua.
Nota: Se colocó en la columna del rotavapor hielo con sal reduciendo la temperatura a -23°C., para evitar la fuga de agua hacia el vapor y para lograr un mejor abatimiento el punto de ebullición.
5. Se adicionó resina Amberlite (resina iónica intercambiable) para atrapar el ácido shikímico,se agitó por 15 minutos, se filtró en un embudo de filtro de vidrio poroso 40-60. Se lavo en dos ocasiones con 100 ml de agua destilada para eliminar impurezas.
resina básica + ácido sal ( neutralización)
Imagen 15. Filtración a vacío
Imagen 14. Filtración de Carbón
Imagen 13. 5g de Carbón Imagen 12. Carbón Activado
Imagen 17. Hielo y Sal Imagen 16. Carbón Activado
720
6. Se preparó una solución de 25 ml de ácido acético con 75 ml de agua y se le adicionó a la resina para recuperar el ácido shikimico.
7. Después de obtener el residuo ácido, se le agregaron 20 ml más de agua. 8. Se pesó un matraz de fondo redondo con el objetivo de que al final se calculara la
diferencia entre éste y el matraz con el producto obtenido.
9. Se evaporó el extracto ácido del ácido en el rotavapor. Durante este proceso se
cristalizó el ácido shikímico en las paredes del matraz de bola.
NOTA: En caso de que aún haya muchas impurezas se adiciona nuevamente agua con carbón activado y se filtra en el Kitasato y evapora en el rotavapor. El proceso se puede repetir 2 veces hasta obtener la pureza deseada, y que el compuesto cristalice.
Imagen 19. Adición de Resina al Imagen 18. Resina Amberlite
Imagen 21. 20 ml más de Agua Imagen 21. Filtración en Vidrio Imagen 20. Adición de Ácido
Imagen 24. Producto Final Imagen 23. Ácido en el Rota vapor y Cristalización
Imagen 22. Matraz de Fondo Redondo
721
10. El producto obtenido se analizó por medio de resonancia magnética nuclear pudiendo calcular la pureza del ácido mediante la integración de las señales correspondientes, de esta forma se comprobó que efectivamente se obtuvo la substancia deseada.
RESULTADOS
Las cantidades utilizadas tanto de la estructura de la planta como de la obtención final de ácido shikímico, así como los rendimientos y las purezas del ácido obtenidos xivfueron los siguientes:
Tabla 1. Resultados y rendimiento obtenidos.
Lo cual nos indica que la obtención de ácido shikimico a partir de Lyquidambar es factible. Encontrándose presente en las diferentes partes del árbol. Se continúa con el estudio de cantidad de liquidámbar en base a la maduración de las cápsulas y semillas.
BIBLIOGRAFÍA
i http://portal.salud.gob.mx/sites/salud/descargas/pdf/influenza/situacion_actual_epidemia_110110.pdfvisitado el 15 de junio de 2010 ii Acuerdo entre Sanofi-Avntis y Roche para la producción de ácido Shikimico iii http://www.dancewithshadows.com/pillscribe/india-taps-own-trees-for-raw-material-shikimic-acid-to-make-swine-flu-drug-oseltamivir/ iv Williams, G. & McMillan, C. (1971). Frost tolerance of Liquidambar styraciflua native to the
Estructura de la Planta Masa Inicial (g) Masa Final (g) Rendimiento (%) Pureza (%)
Semillas viables 35 0.180 0.51 95
Semillas No Viables+ viables 35 0.110 0.32 90
Semillas No viables 35 0.035 0.17 90
Cápsulas 35 0.100 0.29 95
Hojas Secas Cafés 35 0.087 0.25 75
Hojas Secas Verdes 35 0.108 0.31 95
Hojas Secas Rojas 35 0.101 0.29 95
722
United States, Mexico, and Central America. Canad. J. Bot. 49(3): 1551-1558.
V Rui Xiu et al Structural Basis of Preexisting Immunity to the 2009 H1N1 Pandemic Influenza VirusScience 16 April 2010, Vol. 328. no. 5976, pp. 357 – 360.
Vi Penelope Ward et al. Oseltamivir (Tamiflu®) and its potential for use in the event of an influenza pandemic
J. Antimicrob. Chemother. 2005 55: i5-i21; Vii Yang Xiao-yong et al Study on extracting and determination of Shikimic acid in Illicium verum Hook.f. China Condiment 2009-12 viiiManuel Miro Jodral Ed. Illicium,Pimpinella and Foeniculum, Medicinal and aromatic plants, Industrial profile, CRC press204, USA ix 1. Eijkman, J. F. Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1885, 4, 32. x Enrich, B.; Stencel, Scheuermann .M. (2008). Liquidambar styraciflua: a renewable source of shikimic acid. Tetrahedron Letters 49(5), 2503-2505 xi Bruce a Bohm Shikimic Acid (3,4,5-Trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylic Acid) Chem. Rev., 1965, 65 (4), pp 435–466 xii Johnson, R. L. Sweetgum, an American Wood. FS-266. Washington,
DC: US Department of Agriculture, Forest Service, 1985. xiiiGilman, E. F.; Watson, D. G. Liquidambar styraciflua Sweetgum.
Fact Sheet ST-358. Gainesville, FL: University of Florida, Institute of
Food and Agricultural Sciences, 1993. xiv La pureza del compuesto se realizo mediante RMN 300 MHz.
723
QPNat 02 EXTRACTOS DE AMARANTO Y SU ACCIÓN CONTRA EL COLESTEROL
Miranda Velásquez Lylia Graciela
1
Cruz Vega Delia Elva2
Oranday Cárdenas Azucena3
Rivas Morales Catalina4
Rodríguez Arzave Juan Antonio5
RESUMEN Desde muchos años se conoce que la hipercolesterolemia es uno de los factores de riesgo para enfermedades cardiovasculares como lo son la aterosclerosis y el infarto al miocardio los cuales a su vez son la principal causa de muerte en México, se estima que 180,000 personas fallecen cada año por esta causa, debido a que esta es una problemática que ha ido en aumento a pesar de los tratamientos oficiales que existen, es importante el desarrollo de alternativas de tratamiento más eficaces, seguras a la salud y accesibles a la población en general. En la presente investigación se determinó la actividad hipocolesterolémica de dos extractos de Amaranthus hypochondriacus en un modelo in vivo, utilizando ratones Balb/c hipercolesterolémicos, encontrando que el extracto metanólico a 50 mg/Kg de peso tuvo una disminución significativa en la reducción del colesterol cuando se le comparó con el control, por lo que proponemos el uso de esta planta como una alternativa de tratamiento de esta enfermedad.
ABSTRACT It is known for many years, that hypercholesterolemy is one of risk factors for chardiovascular diseases as well as the atherosclerosis and the myocardium infart which are the main causes of death in Mexico. It is considered that 180, 000 people die every year by this reason, this problematic has increased in spite of the official treatments, it is important to develop more effective alternat treatments, safe to the health, and affordable to the population. In this research was determined hypocholesterolemic activity on two extracts of Amaranthus hypochondriacus in an alive model, it was used hypercholesterolemic Balb/c mice, and it was found that the methanolic extract at 50 mg/Kg of weight had a significant decrease in the reduction of the cholesterol when it was compared with the control, for this reason we suggest the use of this plant as an alternative treatment for this disease.
1 Maestra de tiempo completo, UANL, [email protected] 2 Investigadoradora del ITESM, [email protected] 3 Maestra de tiempo completo, UANL, [email protected] 4 Maestra de tiempo completo, UANL, [email protected] 5 Maestro de tiempo completo, UANL, [email protected]
724
INTRODUCCIÓN
El colesterol es uno de los llamados nutrientes no esenciales, es decir es imprescindible pero no
hace falta ingerirlo porque el propio organismo puede sintetizarlo, de hecho se trata de uno de los
lípidos o grasas más importantes que circulan por la sangre junto con los triglicéridos (1,2). Es un
intermediario clave en la biosíntesis de un número de esteroides importantes, incluyendo los
ácidos biliares, hormonas adrenocorticales y hormonas sexuales. Tomar excesiva grasa con la
comida produce un aumento de la síntesis de lipoproteínas LDL aumentando el colesterol
circulante en la sangre y como consecuencia, es mayor la probabilidad de que se acumule en
arterias (3). En nuestros días, el número de personas cuyo nivel de colesterol en sangre excede de
los niveles normales se ha incrementado considerablemente en los últimos años. Las
enfermedades cardiovasculares se han consolidado como la primera causa de muerte en México,
son ocasionadas por diversas causas, destacando entre ellas la hipertensión arterial (4). A pesar de
los tratamientos oficiales ya establecidos, ésta es una problemática que ha ido en aumento. Se
estima que aproximadamente 180 mil personas fallecen cada año por esta causa.
En el País y en el Mundo entero se han utilizado por muchos años las plantas medicinales, desde tiempos ancestrales es conocido que las plantas tenían efectos curativos y se han utilizado para una gran variedad de padecimientos (5). En la presente investigación se estudiaron extractos de A. hypochondriacus., determinando su actividad hipocolesterolémica en un modelo in vivo. Esta planta es utilizada en la medicina tradicional mexicana como remedio potencial para disminuir niveles de colesterol.
RESULTADOS Y/O ANÁLISIS
Material Biológico:
Para la realización del presente estudio se compró el grano de amaranto que se expende en los
comercios del área metropolitana de la Ciudad de Monterrey N.L. El material vegetal se trituró y se
realizaron extracciones por la técnica de maceración a temperatura ambiente, para obtener
extractos metanólico y etanólico (6). Los extractos obtenidos se evaporaron a sequedad en un
rotavapor a presión reducida.
Ensayo “in vivo” de actividad hipocolesterolémica
Se utilizó el método propuesto por Cruz y col. (7) modificado. Se formaron grupos de 6 ratones
machos BALB/c con un peso aproximado de 25 a 28 g. Se probaron los dos extractos a dosis de 100
y 50 mg/Kg de peso en grupos de ratones que se alimentaron con una dieta rica en colesterol
725
durante 5 días. El extracto se administró diariamente por vía oral mediante sonda gástrica. Se
formaron otros dos grupos utilizados como control; uno de ellos se alimentó con la misma dieta
rica en lípidos y recibió la administración diaria del vehículo empleado para la disolución de los
extractos, este grupo se consideró como control hipercolesterolémico, el segundo grupo se
alimentó con dieta ordinaria (no enriquecida en lípidos) e igualmente recibió la administración
diaria del vehículo empleado en la formulación de los extractos, este grupo se consideró como
control negativo. Al final de los cinco días los animales se pusieron en ayuno por 12 horas. Se
colectaron muestras de sangre por punción ocular de c/ratón y se determinó el colesterol sérico
total en un analizador automatizado Beckman Coulter Synchron C x 7 Clinical System.
Identificación de metabolitos:
Se realizaron pruebas químicas los extractos obtenidos para determinar la presencia de los siguientes metabolitos secundarios: esteroides, triterpenos, sesquiterpenlactonas, flavonoides, alcaloides, cumarinas y oxhidrilos fenólicos (8).
Ensayo de letalidad sobre Artemia salina:
Se preparó una disolución acuosa de sal de mar a una concentración de 40 g/L con 1 g/L de levadura de cerveza. 100 mL de esta solución se colocaron en un recipiente parcialmente cubierto de la luz y se añadieron 100 mg de huevecillos de A. salina. Posteriormente se colocó una lámpara al lado expuesto a la luz para atraer a las larvas más fuertes. A las 24 h las larvas que emigraron hacia la luz se colocaron en un recipiente con disolución nueva para ser incubadas nuevamente por 24 h. Posteriormente se succionaron con una micropipeta 100 μl del medio salino con larvas y se depositaron en los pozos de una microplaca a los cuales se les adicionó el extracto. Para cada extracto se prepararon concentraciones de 1000, 500 y 100 mg/ml. Adicionalmente se corrieron un control negativo (solo medio salino) y un control positivo (100% de mortandad) con dicromato de potasio a 600 ppm. Las larvas sobrevivientes se contaron a las 24 horas (9).
Resultados:
En cuanto a los resultados tenemos que los rendimientos de extracción de A. hypochondriacus a partir de material vegetal seco fueron: 3.60% etanólico y 1.66% metanólico. En la determinación del colesterol sérico, los resultados obtenidos se muestran en la Figura 1, en ella podemos observar que el extracto metanólico a 50 mg/kg de peso disminuyó el colesterol 35.3% con respecto al control hipercolesterolémico y a la dosis de 100 mg/Kg no mostró dicho efecto. Por otro lado, el extracto etanólico a las mismas dosis no presento la actividad antes mencionada.
726
Figura 1. Actividad hipocolesterolémica de extractos de A. hypochondriacus, en ratones machos Balb/c con hipercolesterolemia inducida (*p<0.01 vs. control hipercolesterolémico) Se realizó la identificación cualitativa de metabolitos secundarios en los extractos, evidenciándose
la presencia de instauraciones, carbohidratos, esteroles y alcaloides en ambos. Las pruebas para la
detección de triterpenos, sesquiterpenlactonas, cumarinas y flavonoides mostraron la ausencia de
estos metabolitos en los dos extractos (Tabla 1).
Tabla 1. Grupos funcionales presentes en extractos de A. hypochondriacus
Extracto Alcaloides Carbohidratos Esteroles Insaturaciones
Etanólico
*
*
*
*
Metanólico
*
*
*
*
Se probó la toxicidad utilizando el Ensayo de Letalidad sobre Artemia salina obteniéndose una DL50
> 1000 mg/ml para los extractos.
*
727
CONCLUSIONES
En los países occidentales se ha incrementado considerablemente la mortalidad por
padecimientos cardiovasculares, principalmente por lesión de las arterias coronarias y
específicamente en México las enfermedades cardiovasculares se han consolidado como la
principal causa de muerte (4). Existen diversos estudios con plantas medicinales que persiguen
una actividad hipocolesterolemiante (10,13). A. hypochondriacus es una planta que se aprovecha
toda, su semilla tiene un alto contenido de proteínas, vitaminas y minerales, existen reportes de A.
esculentus y A. cruentus en los cuales se evidencia la utilidad de los mismos en el control del
colesterol (14, 15). En el presente estudio se evaluó la actividad hipocolesterolémica de dos
extractos de A. hypochondriacus: metanólico y etanólico, en ratones machos Balb/c a los cuales se
les indujo a un cuadro hipercolesterolémico. El extracto metanólico solamente a la dosis de 50
mg/Kg. de peso indujo una reducción en los niveles de colesterol sérico de 35.3%, siendo esta
actividad altamente significativa con respecto al grupo control hipercolesterolémico (p < 0.01
Tukey). Por el contrario el extracto etanólico no presentó dicha actividad a las dos dosis
empleadas. Los resultados obtenidos en la determinación de los metabolitos secundarios
concuerdan con lo reportado por otros autores como responsables de actividad
hipocolesterolémica en otras especies de amaranto y en otras plantas. (16)
En el ensayo de Letalidad en Artemia salina ninguno de los extractos resultó tóxico a este
organismo a las dosis empleadas, por lo que con los resultados obtenidos se demuestra que la
planta medicinal A. hypochondriacus posee compuestos con posible actividad hipocolesterolémica
lo cual justifica el uso de esta planta en medicina tradicional. Actualmente se realiza el análisis
químico del extracto acuoso a fin de determinar los compuestos responsables de la actividad
mencionada.
BIBLIOGRAFÍA
1. Valcárcel, J. M. (2000). Las plantas medicinales. Dsalud, No 17 pg 71-4.
2. Valcárcel, J. M. (2001). Plantas para regular colesterol y triglicéridos. Dsalud, No 25 pg 36-4
3. Mahan, L. K., Escott-Stump. (1998). Nutrición y Dietoterapia de Krause. Mc. Graw-Hill. 9a. Edición, España. 525-553 pp.
4. SSA, Comunicado de prensa No. 006, 10/Enero/2002; http://www.salud.gob.mx/
5. González, M.M. (1998). Plantas Medicinales del Noreste de México. IMSS. Monterrey México. 5-6 pp.
6. Domínguez, X. A. (1973)Métodos de Investigación Fitoquímica. Primera Edición. Editorial LIMUSA. 33 pp.
7. Cruz, A., Garduño, L., Salazar, M., Martìnez, E., Dìaz, F., Chamorro, G., Tamariz, J. (2001). High Hypolipidemic Activity of Saturated Side-Chain -asarone Analogs.
728
8. Domínguez, X. A. (1982).Química Orgánica Experimental. Primera Edición. Editorial LIMUSA. 1982; 76-86.
9. Mc. Laughlin J. L., Chang Ch., Smith D. L. (1988). “Simple bioassays for the detection and isolation of bioactive natural products”. Departament of Medicinal Chemestry and Pharmacognosy. School of Pharmacy and Pharmacal Sciences. Pardue University, West Lafayette. IN 47907, USA.
11. Galati. E..M., Monforte. M.T., Forestieri. A. M., Miceli, N., Bade, A., Trovato, A. (1999). Salvadora pérsica L.: Hypolipidemic activity on experimental hypercholesterolemia in rat. Phytomedicine. 6(3): 181-185.
12. Dwivedi, S., Gupta, D., Sharma, K. (2000). Modification of coronary risk factors by medicinal plants. J. of Medicinal and Aromatic Plant Sciences. 22(1B): 616-620.
13. Abe, I., Seki, T., Noguchi, H., Kashiwada, Y. (2000). Gallolyl esters from rhubarb are potent inhibitors of squalene epoxidase, a key enzyme in cholesterol biosynthesis. Planta Medica. 66(8). 753-6.
14. Berrada, Y., Settaf, A., Baddouri, K., Cherrah, A., Hassar, M. (2000). Experimental evidence of an antihypertensive and hypocholesterolemic effect of oil of argan, Argania sideroxylon. Therapie. 55(3). 375-8.
15. Chaturvedi, A., Sarojini, G., Devi, N. L. (1993 ). Hypocholesterolemic effect of Amaranth seed (Amaranthus esculentus). Plant Foods Hum Nutr. 44(1):63-70
16. Berger, A., Gremaud, G., Baumgarther, M., Rein, D. (2003). Cholesterol lowering properties of Amaranth grain and oil in hamsters. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 73(1):39-47
17. Wang, H.X., Ng, T.,B. (1999). Natural Products with hypoglycemic, hypotensive,
hypocholesterolemic, antiatherosclerotic and antithrombotic activities. Life Sciences. 65(25): 2663‐
2677.
729
QPNat 04
CONSTITUYENTES QUÍMICOS Y ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE CUATRO ESPECIES DE LA FLORA CUBANA
Pupo Blanco Yoannia Gretel1
Malheiros Dinis de Mendonça Dina Isabel2
Herrera Isla Lidcay3
Oviedo Chávez Ibeth4
Burgueño Tapia Eleuterio4
RESUMEN
La rica diversidad florística de Cuba representa un gran potencial de compuestos bioactivos. Sin embargo, aún son limitados los estudios que proponen la integración de aspectos biológicos y químicos que avalen el empleo de antifúngicos de origen vegetal para el control de agentes causales de enfermedades destructivas en diversos cultivos hortícolas. En este trabajo se aislaron e identificaron los metabolitos secundarios mayoritarios (1-14) de los extractos no polares de flores de Lippia dulcis Trev. y Lantana camara L, de hojas de Coleus amboinicus Lour. y de planta completa de Cleome viscosa L., cuatro especies de la flora cubana seleccionadas por su potencial antifúngico en estudios realizados previamente. Se evaluó la actividad de los compuestos aislados en la germinación de esporas de los hongos Alternaria solani y Alternaria porri, y se determinó su concentración inhibitoria mínima.
ABSTRACT
The Cuban flora represents a vast source of active substances, but there are few proposals that integrate biological and chemical aspects in order to promote the use of botanical fungicides to control causal agents of destructive illness in horticultural crops. From Lippia dulcis Trev. and Lantana camara L flowers, and from Coleus amboinicus Leur. leaves and Cleome viscosa L. whole plants, four species from the Cuban flora with antifungal potential, the natural products (1-14) were isolated and identifying by spectroscopic techniques. In addition, the antifungal properties of 1-14 were evaluated against Alternaria solani and Alternaria porri using the fungi spore germination model, and it was stimated the minimun inhibitory concentration.
730
INTRODUCCIÓN
La flora cubana posee unas 1700 especies, muchas de ellas con propiedades bioactivas reconocidas en el campo de la medicina (González et al., 2007). Sin embargo, su aplicación en la agricultura ha sido muy limitada, de manera que actualmente no se emplea algún producto vegetal como alternativa al uso desmedido de fungicidas sintéticos para el control de hongos fitopatógenos foliares.
Alternaria solani (Ellis y Martin) Jones y Grout y Alternaria porri Ell. y Cif. son los agentes causantes de las enfermedades más importantes, desde el punto de vista económico, que atacan al tomate (Solanum lycopersicum L.) y a la cebolla (Allium cepa L.) en Cuba (Almándoz et al., 2004; González et al.; 2003).
1Fac. Ciencias Agrícolas. Univ. Granma, Cuba. 2Dpto. Química. Univ. Beira Interior, Portugal. 3Fac. Ciencias Agrícolas. Univ. Central de las Villas, Cuba. 4Dpto. de Química Orgánica, Postgrado en Ciencias Químico-Biológicas ENCB-IPN, México D. F.
Luego de un trabajo de prospección (Pupo, 2008) se encontró que los extractos hidroalcohólicos de las flores de Lippia dulcis Trev y de Lantana camara L., de las hojas de Coleus amboinicus Lour y de la planta completa de Cleome viscosa L. eran promisorios en la búsqueda de antifúngicos de origen botánico frente a los citados patógenos. Con el fraccionamiento biodirigido de estos extractos se determinó que las fracciones hexánica y clorofórmicas de L. dulcis, C. viscosa y C. amboinicus, así como la fracción clorofórmica de L. camara presentaron una actividad antifúngica sobresaliente, según los resultados de experimentos realizados en condiciones in vitro, semicontroladas y de campo.
Estos elementos no son suficientes para avalar el uso de estos extractos en la producción hortícola, pues según establece la Resolución Conjunta de los Ministerios de Agricultura y Salud Pública de Cuba (MINAGRI-MINSP, 2007) se debe conocer, entre otros aspectos, el ingrediente activo y la efectividad biológica. La combinación de la determinación química con el ensayo biológico proporciona un conocimiento extenso sobre el efecto de los compuestos y juega un papel decisivo en el desarrollo y modernización de las preparaciones de origen vegetal (Sharapin, 2000). El objetivo de este trabajo consistió en aislar e identificar espectroscópicamente los metabolitos secundarios principales presentes en las fracciones activas de los extractos de Lippia dulcis Trev, Lantana camara L., Coleus amboinicus Lour y de Cleome viscosa L., y determinar su actividad antifúngica.
731
RESULTADOS Y ANÁLISIS
El material vegetal se colectó en el mes de abril de 2009 en la provincia Granma, Cuba; se prepararon ejemplares que fueron depositados en la colección del laboratorio de Botánica de la Universidad de Granma (No. de depósito C 13, L 22, V 54 y V 55). El material vegetal se secó en estufa (Labolen, SL) a 35 0C, luego se molió y se tamizó el tamaño de las partículas a 2.5 mm. Los extractos se prepararon al 10% en masa a partir de 85, 170, 150 y 190 g de hojas de C. amboinicus, flores de L. dulcis, flores de L. camara y planta completa de C. viscosa, respectivamente; por el método de percolación con etanol al 70% durante siete días. El extracto hidroalcohólico se concentró en evaporador rotatorio (Kika Werke) y se fraccionó sucesivamente con hexano, cloroformo, acetato de etilo y agua destilada con el empleo de un embudo de separación de 4 L de capacidad. Las fracciones seleccionadas previamente por su actividad antifúngica fueron sometidas a un proceso de separación y purificación de los principales metabolitos secundarios.
La separación de los compuestos se realizó mediante el uso de cromatografía en columna (CC) y cromatografía de capa delgada (CCD). Para la CC se empleó como soporte sílica gel (100-200 Mesh, Aldrich-Sigma), y placas semi-preparativas de sílica gel GF (20 x 20 cm, 1500 µm de tamaño de partícula, 2 mm de espesor del adsorbente, Analtech) para la CCD. El seguimiento de la separación de los compuestos se llevó a cabo mediante CCD, con la utilización de placas analíticas de sílica gel 60 F254 (1500 µm de tamaño de partícula; 0.2 mm de espesor del adsorbente, Merck) a través de la observación de los perfiles cromatográficos bajo la luz ultravioleta (= 254 y 365 nm) y luego reveladas con una solución ácida de sulfato de cerio amoniacal y calor. Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de 1H y de 13C fueron medidos en un espectrómetro Varian, que operó a 500 y 125 MHz, respectivamente, usando tetrametilsilano (TMS) como referencia interna.
De la separación por CC con gradientes de hexano y AcOEt de la fracción clorofórmica (0.59 g) se obtuvieron 3.1 mg de 1; 4.2 mg de 2; 17.3 mg de 3 y 4.7 mg de una mezcla de 4 y 5. A partir de 2.0 g de la fracción hexánica del extracto de la misma planta se obtuvieron 191.0 mg de aceites que desde el análisis de su espectro de RMN de 1H mostró señales de una mezcla compleja de ácidos grasos, y 121.0 mg de una mezcla de 6 y 7.
De la fracción clorofórmica (4.5 g) de L. dulcis se obtuvieron 36.1 mg de 4 y 46.0 mg de 8; y a partir de los 4.7 g de la fracción hexánica se separaron 0.9 g de aceites; 5.0 mg de 9; 4.2 mg de 10 y 9.1mg de 4.
A partir 2.0 g de la fracción clorofórmica de L. camara se obtuvieron 15.3 mg de una mezcla de 11 y 12.
El trabajo de separación de la fracción clorofórmica (4.0 g) de C. viscosa condujo a 37.1 mg de 13 y 5.2 mg de 14. Mientras que desde la fracción hexánica (6.9 g) se obtuvieron 30.3 mg de 6; 5.2 mg de 13 y 69.6 mg de 14.
Todos los compuestos fueron identificados por comparación de sus datos de RMN con aquellos descritos en la literatura. 5,4´-dihidroxi-6,7-dimetoxiflavona (cirsimaritina) (1)
732
(Mesquita et al., 1986); carvacrol (2) (Exarchou et al., 2003), 5,7-dihidroxi-6,4´-dimetoxiflavona (Pectolinaringenina) (3) (Liu et al., 2007); 5-hidroxi-4´,6,7-trimetoxiflavona (salvigenina) (4) (Saednia et al., 2009); 5,4-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona (xantomicrol) (5) (Sahín et al., 2006); -sitosterol (6) (Saednia et al., 2009); estigmasterol (7) (Xie et al., 2000); 5-hidroxi-4´,3´,6,7-tetrametoxiflavona (santoflavona) (8) (Saednia et al., 2009); (+)-hernandulcín (9) y (-)-epihernandulcín (10) (Kaneda et al., 1992); 4´,5,7-trihidroxiflavona (apigenina) (11) (Exarchou et al., 2003); 4´,5-dihidroxi-7-metoxiflavona (genkuanina) (12) (Mesquita et al., 1986), 5,3´-dihidroxi-3,7,8,4',5´-pentametoxiflavona (13) (Wollenweber et al., 2007) y cleomeolide (14) (Burke et al.,1980).
OR2
R3
R4
R5
R6
R7
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7
13458
111213
H OMe OMe H OH H HH OMe H OH H HOHH OMe OMe H OMe H HOMe OMe OMe H OH H HH OMe OMe OMe OMe H HH H OH H HOH HH H OH H HOMe HOMe OH OMe OMe OMeOMe H
OH
2
HO
H
2223
67
HOH
910
6H6H
OH
O
H
14
6
OOH
R1
O
1
2
5
1'
2'
6'
4
8
65
Figura 1. Estructura química de los compuestos aislados de L. dulcis, C. viscosa y C.
amboinicus y L. camara.
733
En condiciones in vitro y mediante el uso de la técnica de gota colgante sobre portaobjetos excavados (Kumaresan et al., 2005) se evaluó el efecto de los compuestos 1-14, y de las subfracciones aceitosas de olor penetrante obtenidas de las fracciones hexánicas de los extractos de hojas de C. amboinicus y de flores de L. dulcis en la germinación de las esporas de A. solani y A. porri. Se emplearon dosis de 25, 50, 100, 200, 400 µgmL-1 y una concentración de 5 x 104 esporas mL-1. Se utilizó como control de actividad antifúngica el Zineb (etilen-bis-ditiocarbamato de zinc) a 0.2 mgmL-1
Para la preparación de las dosis se tomó 1 mg de la sustancia a evaluar y se disolvió en 5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO); con pipeta Pasteur se añadió ADE hasta completar el volumen de 2.5 mL, obteniéndose una solución madre de 0.4 mg mL-1 (400 µg mL-1) de concentración másica y 0.2% de DMSO (v/v). A partir de ésta se tomaron alícuotas de 100, 50, 25 y 12.5 µL, y se añadió agua destilada estéril hasta obtener un volumen final de 200 µL en las dosis de 200, 100, 50 y 25 µgmL-1, respectivamente. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) según Rahman et al. (2001) como la mínima concentración a la que no se observó germinación del patógeno en las muestras evaluadas. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Concentración inhibitoria mínima (CIM) de los compuestos 1-14.
Compuestos CIM
(µgmL-1)
A. solani A. porri
1 Cirsimaritina 400 400
2 Carvacrol 100 100
3 Pectolinaringenina 400 400
4 Salvigenina 400 400
5 y 4 Xantomicrol y salvigenina 400 400
6 β-sitosterol a a
7 y 6 Estigmasterol y β-sitosterol 400 400
8 Santoflavona 25 25
9 (+)-Hernandulcín a a
734
10 (-)-Epihernandulcín a a
11 y 12 Apigenina y genkuanina 50 50
13 5,3’-Dihidroxi-3,7,8,4’,5’-pentametoxiflavona 400 400
14 Cleomeolide 200 200
Aceite De la fracción hexánica de C. amboinicus 50 50
Aceite De la fracción hexánica de L. dulcis 50 50
Leyenda: 400: La CIM es superior a la mayor dosis evaluada.
a: No se observó actividad en las dosis evaluadas.
El DMSO a 0.2% (v/v) no provocó cambios significativos en el porcentaje de germinación de las esporas, por lo que se asume que los resultados observados corresponden fundamentalmente a los compuestos evaluados.
β-sitosterol (6), (+)-hernandulcín (9) y (-)-epihernandulcín (10) no mostraron actividad antifúngica a ninguna de las dosis evaluadas. La mezcla de estigmasterol (7) y β-sitosterol (6), a 400 µg mL-1 mostró un 7 y 10% de inhibición de las esporas de A. solani y A. porri, respectivamente. Otra mezcla que ejerció mayor efecto que cada uno de los compuestos por separado fue la combinación de xantomicrol (5) y salvigenina (4); esta última a 400 µg mL-1 disminuyó el poder germinativo de las esporas de A. solani en un 25% y de A. porri en un 22%; mientras que, la mezcla evaluada a esta misma dosis, inhibió la germinación del 94% de los conidios de A. solani y la totalidad de las esporas utilizadas de A. porri. Lo anterior permite suponer que el xantomicrol es más activo que la salvigenina; y que poseen una acción conjunta de tipo sinérgico.
El flavonoide cirsimaritina (1) a la mayor dosis evaluada provocó un 20 y 24% de inhibición de la germinación de las esporas de A. solani y A. porri, respectivamente. Pectolinaringenina (3) a una dosis de 400 µgmL-1 inhibió la germinación de las esporas de A. solani en un 88%, y totalmente las de A. porri. El compuesto 5,3’-dihidroxi-3,7,8,4’,5’-pentametoxiflavona (13) evaluado a esta misma dosis impidió la germinación de la totalidad de las esporas de los dos patógenos.
Cleomeolide (14), carvacrol (2) y la mezcla de los flavonoides apigenina (11) y genkuanina (12) redujeron completamente la capacidad de germinación de las esporas de los hongos a 200, 100 y 50 µg mL-1, respectivamente. Es importante puntualizar que la mezcla apigenina-genkuanina, a 25 µg mL-1, logró inhibir más del 50% de la germinación
735
de los conidios de ambos hongos (61% en A. solani y 52% en A. porri). Los aceites de las fracciones hexánicas de los extractos de hojas de C. amboinicus y de flores L. dulcis mostraron un valor de CIM de 50 µg mL-1. La santoflavona (8) es el compuesto que mostró una mayor actividad antigerminativa, con un 100% de inhibición a la dosis de 25 µgmL-1.
Es importante mencionar algunas características distintivas en la actividad de algunos de los compuestos más activos. El diterpeno 14 mostró una extraordinaria capacidad para reducir la longitud del tubo germinativo de las esporas. A una dosis de 25 µgmL-1, aunque germinan el 90% de las esporas, la longitud de sus tubos germinativos es muy inferior a la observada en el control. El aceite de L. dulcis, la santoflavona (8) y la mezcla apigenina-genkuanina (11 y 12) provocaron daños morfológicos importantes en los conidios, como hipertrofia de algunos de sus segmentos y una coloración más oscura.
La relación concentración-inhibición de los flavonoides 1, 3, 4, 4-5, y 13 se muestra en las Figuras 2 y 3.
0
20
40
60
80
100
120
25 50 100 200 400
Concentración (µg mL-1 )
Inhib
ició
n d
e la
ger
min
ació
n
(%)
Compuesto 1
Compuesto 3
Compuesto 4
Compuestos 4y 5
Compuesto 13
Figura 2. Efecto de los flavonoides 1, 3, 4, 4-5 y 13 en la germinación de los conidios de A. solani
736
0
20
40
60
80
100
120
25 50 100 200 400
Concentración (µg mL-1 )
Inhib
ició
n d
e la
ger
min
ació
n
(%)
Compuesto 1
Compuesto 3
Compuesto 4
Compuestos 4y 5
Compuesto 13
Figura 3. Efecto de los flavonoides 1, 3, 4, 4-5 y 13 en la germinación de los conidios de A. porri.
La respuesta de los dos hongos frente a cada compuesto evaluado fue similar. Salvigenina (4) fue el flavonoide menos activo pues sólo mostró actividad a partir de los 200 µgmL-1, mientras que cirsimaritina (1) lo hizo con la mitad de esta concentración. No obstante, a 200 y 400 µgmL-1 fue semejante la inhibición de la germinación provocada por estos compuestos en ambos hongos. La pendiente de las curvas que describen el efecto de los otros flavonoides fue mucho mayor, lo que indica que los efectos de inhibición de la germinación de los conidios en estudio son dependientes de las dosis evaluadas de los compuestos. La zona de meseta observada en la curva que describe el compuesto 13 entre los 200 y 400 µgmL-1 es indicativa de que la MCI puede ser inferior a los 400 µgmL-
1.
Esta es la primera vez que el xantomicrol (5) se aisla de C. amboinicus, aunque se ha descrito de otras especies de la familia Lamiaceae (Grayer et al., 2001 y Sahín et al., 2006). También es la primera vez que la apigenina (11) y la genkuanina (12) se aislan de L. camara, aunque se han identificado como componentes en extractos de otras especies de la familia Verbenaceae (Tomás-Barberán, 1988). En cuanto a la actividad biológica de los flavonoides (1, 3-5, 8, 11-13) y del diterpeno (14), esta es la primera vez que se relaciona con actividad antifúngica.
Con respecto a las especies vegetales, además de los fitosteroles aislados de tres de las cuatro plantas estudiadas, los resultados aquí obtenidos y los referidos por otros autores indican que existe cierta similitud química entre L. dulcis, C. amboinicus y L. camara. Salvigenina (4) es un compuesto común a las dos primeras. La cirsimaritina (1) y la pectolinaringenina (3) fueron aisladas de C. amboinicus. Ono et al. (2005) refieren la existencia de estos compuestos en L. dulcis, mientras que, Romeo et al. (2004) aislaron la
flavona glucosilada 7-O--D-pectolinarigenina (derivado glucosilado del flavonoide pectolinaringenina) de plantas cubanas de L. camara. Nuestros resultados y los descritos
737
por otros autores fortalecen lo señalado por Tomás-Barberán (1988), que menciona que el patrón de los flavonoides de los géneros Lamiaceae y Verbenaceae es muy similar.
CONCLUSIONES Y/O RECOMENDACIONES
El estudio químico de las fracciones no polares de los extractos hidroalcohólicos de flores de Lippia dulcis Trev. y Lantana camara L, de hojas de Coleus amboinicus Leur. y de planta completa de Cleome viscosa L. permitió el aislamiento e identificación de ocho flavonoides (1, 3-5, 8, 11-13) y de seis terpenoides conocidos (2, 6, 7, 9, 10, 14).
Se encontraron compuestos comunes entre las plantas estudiadas: el flavonoide salvigenina (4) y los esteroles estigmasterol (7) y -sitosterol (6) se aislaron de C. amboinicus y L. dulcis; adicionalmente 6 se aisló del extracto hexánico de C.viscosa.
Los flavonoides aislados de las especies en estudio presentan similitudes estructurales, con un grupo hidroxilo en C-5, C-7 y C-4’ y diferente grado de metoxilación en otras posiciones.
Se aisló por primera vez el flavonoide xantomicrol (5) de C. amboinicus, y apigenina (11) y genkuanina (12) de L. camara.
El diterpeno cleomeolide (12) y los flavonoides (1, 3-5, 8, 11-13) mostraron actividad contra A. solani y A. porri. Siendo el más activo la santoflavona (8) que presentó una concentración inhibitoria mínima de 25 µgmL-1. También mostraron actividad antifúngica los aceites esenciales obtenidos de las fracciones hexánicas de los extractos de flores de L. dulcis y hojas de C. amboinicus.
Se recomienda determinar la composición química de los aceites esenciales obtenidos de las fracciones hexánicas de los extractos de flores de L. dulcis y hojas de C. amboinicus.
738
BIBLIOGRAFÍA
Almándoz, J.; Muiño, B. & Stefanova, M. (2004). Evaluación de nuevos fungicidas de origen químico y biológico para el control del tizón temprano, causado por Alternaria solani Sorauer. Trabajo presentado en Evento Internacional “CENSAV, 2004”. La Habana, Cuba.
Burke, A.; Chan, W. & Hanken, V. (1980). The structure of cleomeolide, an unusual biciclic diterpene from Cleome viscosa L. (Capparaceae). Tetrahedron 36, 3489-3493.
Exarchou, V.; Godejohann, M.; Van Beck, T.; Gerothanasis, J. & Vervoot, J. (2003). LC-UV-solid-phase extraction-NMR/MS combined with a cryogenic flow probe and its application to the aidentification of compounds present in Greek oregano. Analitical Chemestry 75, 6288-6294.
González, J.; Prieto, S.; García, M.; González, K. & Monteagudo, R. (2007). Perspectivas en el tratamiento de procesos virales con plantas medicinales. LabCiencia con Noticias Técnicas del Laboratorio 15 (3), 11-14
González, Y.; Santos, B.; Herrera, L.; Hernández, R. & Rojas, X. (2003). Influencia de la temperatura sobre la actividad biológica de filtrados crudos de Alternaria porri (Ellis) Ciferri. Centro Agrícola 30 (4), 21-24.
Grayer, J.; Veitch, N.; Kite, G.; Price, A. & Kokubun, T. (2001). Distribution of 8-oxigenated leaf-surface flavones in the genus Ocimum. Phytochemistry 56, 559-567.
Kaneda, N.; Lee, I.; Gupta, M.; Soejarto, D. & Kinghorn, D. (1992). (+)-4β hydroxyhernandulcin, a new sweet sesquiterpene from the leaves and flowers of Lippia dulcis. Journal of Natural Products 55 (8),1133-1141.
Kumaresan, K., Subramanian, M., Vaithiyanatan, S., Sevagaperumal, N., Gopal, C. & Dilantha, G. (2005). Broad spectrum action of phenazine against active and dormant structures of fungal pathogens and root knot nematode. Archives of Phytopathology and Plant Protection 38 (1), 69-76.
Liu, S.; Zhang, J.; Li, D.; Liu, W.; Luo, X.; Zhang, R.; Li, L. & Zhao, J. (2007). Anticancer activity and quantitative analysis of flavone of Cirsium japonicum DC'. Natural Product Research 21(10), 915-922.
Mesquita, A.; Corréa, D.; Pádua, A.; Guedes, M.& Gottieb, O. (1986). Flavonoid from four Compositae species. Phytochemistry 25 (5), 1255-1256.
MINAGRI–MINSAP (2007). Reglamento de uso de formulados plaguicidas. Resolución Conjunta. Gaceta Oficial de la República de Cuba. Año CV (16), 77-84.
739
Ono, M.; Morinaga, H.; Masuoka, Ch.; Ikeda, T.; Okawa, M.; Kinjo, J. & Nohara, J. (2005). New bisabolane–type sesquiterpenes from the aerial parts of Lippia dulcis. Chemical. Pharmaceutical. Bulletin 53 (9), 1175-1177.
Pupo, Y. (2008). Selección en condiciones in vitro de extractos vegetales promisorios para el control de Alternaria solani (E. y M.) J. y G. y Alternaria porri Ell. y Cif. Tesis en opción al grado académico de Master en Ciencias Agrícolas. Universidad de Granma. Cuba. 78pp.
Rahman, A. & Thomson, W. (2001). Bioassay techniques for drug development. Harwood Academic Publisher, USA.
Romeu, C.; Nogueiras, C. & Pino, J. (2004). Estudio químico y bioactividad de Lantana camara L. para el control de plagas. Centro Nacional de Sanidad Vegetal, La Habana, Cuba.
Saeidnia, S.; Moradi-Afrapolo, F.; Gohari, A. & Malmir, M. (2009). Cytotoxic flavonoids from Achillea talagonica Bioss. Journal of Medicinal Plants 8 (5), 52-56.
Sahín, P.; Ezer, N. & Çalis, J. (2006). Terpene and phenolic compounds from Sideritis satricta. Turkish Journal of. Chemistry 30, 495-504.
Tomás-Barberán, F.; Grayer, R.; Gil, M. & Harborne, J. (1988). Distribution of 6–hydroxy-6-methoxy, and 8-hydroxyflavone glycosides in the Labiatae, the Scrophulariacaeae and related families. Phytochemistry 27 (8), 2631-2645.
Wollenweber, E.; Valant-Vetschera, K. & Roitman, J. (2007). Chemodiversity studies on exudate flavonoids of Cleomaceae species (Brassicales). Natural Product Communications 2 (10), 997-1002.
Xie, D.; Wang, L.; Ye, H. & Li, G. (2000). Isolation and production of artemisin and stigmasterol in hairyt root cultures of Artemisia annua. Plant cell, Tissue and Organ Culture 63, 161-166.
740
QPNat 06 QUÍMICA DE LOS BAMBÚES Bambusa vulgaris var. vittata, Bambusa oldhamii Munro Y Guadua angustifolia Kunth PROVENIENTES DEL MUNICIPIO DE HUATUSCO, VERACRÚZ
Fernández García Gabriel 1
Ávila Calderón Luz Elena A2
Herrera Ferreyra Marco Antonio3
RESUMEN
En la actualidad el bambú es considerado un recurso forestal no maderable con alto potencial. Las investigaciones a esta gramínea de característica leñosa ha permitido una evolución en su aprovechamiento, de lo tradicional a nuevos usos tecnológicos e industriales. En diversos países se cataloga como madera dura que sustituye, de manera alternativa, a madera arbórea en diversas aplicaciones, generando nuevas economías y contribuyendo al ahorro y restauración de sus bosques. México es catalogado como el segundo país con mayor diversidad de bambú leñoso en Centroamérica. Sin embargo, el que menos ha estudiado este recurso en comparación a otros países. Por lo que la presente investigación esta dirigida a determinar las características químicas elementales de las especies de bambú denominadas Bambusa vulgaris var. Vittata, Bambusa oldhamii Munro y Guadua angustifolia Khunt cultivadas en el municipio Huatusco, Veracruz, con la finalidad de obtener datos relevantes para posibles usos y aprovechamiento tecnológico.
ABSTRACT
Today bamboo is considered a non-timber forest resources with high potential. Research this woody grass feature has allowed an evolution of its use, from traditional to new technological and industrial uses. In several countries is classified as hardwood replaced, alternatively, a timber tree in various applications, creating new economies and contributing to saving and restoring forests. Mexico is ranked as the second greatest diversity of woody bamboo in Central America. However, the least studied this resource compared to other countries. As this research is aimed at obtaining basic chemical characteristics of bamboo species called Bambusa vulgaris var. Vittata, Bambusa oldhamii Munro, and Guadua angustifolia Khunt grown in Huatusco Veracruz, in order to obtain relevant data for possible use and technology utilization.
1 Estudiante de maestría de la Facultad de Ingeniería en Tecnología de la Madera, Universidad Michoacana
de San Nicolás de Hidalgo. [email protected]
2 Profesora investigadora. Facultad de Ingeniería en Tecnología de la Madera. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. [email protected] 3 Profesor investigador. Facultad de Ingeniería en Tecnología de la Madera. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. [email protected]
741
INTRODUCCIÓN
El bambú es cada vez más un activo económico importante en la erradicación de la pobreza, el desarrollo económico y medioambiental. Siempre ha desempeñado un importante papel económico y cultural a través de Asia. Ahora la utilización del bambú crece rápidamente en América Latina y África. En algunos países, la transformación del bambú se ha desplazado de una gama menor de utensilios de artesanía de calidad, a productos de mayor valor añadido, como paneles laminados, tableros, pulpa, papel, esteras, casas prefabricadas, brotes de bambú comestible y tela. Esto fue señalado en marco del Encuentro para la Evaluación Global de Recursos Forestales No Maderables 2005, efectuado por la Organización de las Naciones Unidas para la agricultura y la alimentación (FAO) y la Red Internacional de Bambú y Ratán (INBAR) en Roma (Lobovikov y col. ,2007).
En Asia el bambú representa un recurso muy importante para la economía de sus países; de los 10 millones de toneladas que se producen anualmente en el mundo, la mayor parte se produce en esa región. Solamente en China se estima que el crecimiento de los bosques de bambú, anualmente es de 3.5 millones de toneladas (Sharma 1980).
En Tailandia debido a la veda total impuesta en el año 1989 a causa de la explotación de madera en los bosques del país, se ha dado impulso al aprovechamiento y comercialización de los productos forestales no maderables (PFNM) como el bambú y el ratán, gomas y resinas, plantas comestibles como setas, plantas medicinales y especias, insectos comestibles, taninos y otros cultivos que han beneficiado a las comunidades dependientes de los bosques (Soriano, 2008).
En México un estudio realizado en 2001 por la Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) identifica el mercado mundial de bambú, señala que los principales países exportadores de bambú, con grado de procesamiento, son China y la India. Ambos países controlan alrededor del 80 % de la producción mundial. China, Taiwan, Tailandia, Sudáfrica, Israel, Indonesia y Japón son predominantemente los que exportan el bambú como materia prima. Estados Unidos es uno de los mayores consumidores de bambú, sus importaciones alcanzan los tres millones de dólares anuales. De ellas, el 71 %, proviene de China; y el resto de Taiwan, Tailandia, Sudáfrica, Israel, Indonesia y Japón. El comercio exterior mexicano de bambú es deficitario. En 1995 las importaciones, provenientes de Taiwan, superaron a las exportaciones en casi 4 veces. Su posición es como comprador, importador de estos productos. En nuestro país, debido a que no se ha considerado al bambú como un recurso natural aprovechable, se le destruye en vez de aprovechar su potencial. Este estudio destaca a México como productor potencial, cuya situación geográfica podría favorecer comercialmente debido a la cercanía y fácil acceso a los Estados Unidos y Canadá, dos de los mayores consumidores de bambú en el ámbito mundial. (SAGARPA, 2001).
El objetivo de este trabajo es conocer las características químicas básicas de tres especies de bambú: Bambusa vulgaris var. vittata, Bambusa oldhamii Munro y Guadua
742
angustifolia Kunth cultivadas en el municipio Huatusco, Veracruz, mediante obtención de porcentaje de componentes inorgánicos (cenizas), pH, solubilidad en sosa al 1%, solubilidad mediante extracción sucesiva, determinar el contenido de holocelulosa , α-celulosa y lignina de las especies, datos relevantes para posibles usos y aprovechamiento tecnológico.
RESULTADOS
Se selecciono 3 culmos de Bambusa vulgaris var. vittata , Bambusa oldhamii Munro y Guadua angustifolia Kunth procedentes de las parcelas demostrativas de la Asociación Bambuver fueron marcados, derribados y dimensionados conforme a Norma ISO 22157 y suministrados bajo las siguientes condiciones especificadas: edad de maduración 5 años, sanas y en estado verde. Se extrajo la sección internodal mas cercana a la altura de pecho (SIMAP) (figura 1) para someterla a astillado manual y fase de molienda en molino Willey conforme a la norma T 257 om-85 (TAPPI, 2000) hasta obtener harina de madera de bambú, la cual fue tamizada para obtener partícula de 420µm, retenida en malla 60 como lo muestra la imagen 1.
Una vez obtenida la muestra, se sometió al proceso experimental mostrado en figura 2 apegado a normas ASTM (American Society for Testing and Materials) mediante una replica, reportando los primeros resultados.
Figura 1. Culmo y sección internodal más cercana a la altura del pecho. Fuente: Hidalgo 1981.
Imagen 1. Fases del proceso de astillado y molienda para obtener harina de bambú.
743
Tabla 1. Composición química básica de tres especies de bambú sometidos a la secuencia general de análisis químico de las especies maderables.
Especie
Análisis Químico
1
Bambusa Vulgaris
var.vittata
(%)
2
Bambusa
oldhamii Munro
(%)
3
Guadua
angustifolia Kunth
(%)
Contenidos de Humedad 8.2439 11.0145 15.1322
pH 6.3 5.894 5.833
Contenido de cenizas 3.75 2 2.21
Potasio 34.22 32.15 35.83
Sílice 7.46 4.56 7.69
Magnesio 0.68 6.28 0.33
Calcio 0.83 1.76 ND
Fosforo 0.32 1.73 0.81
Solubilidad a la Sosa 1.0 %
23.30 26.33
24.78
Extracción total sucesiva de extraíbles
8.99 17.29 9.88
Ciclohexano 0.33 0.44 0.57
Figura 2. Secuencia general de análisis químico de las especies.
744
Acetona 1.27 4.74 2.77
Metanol 5.28 10.12 4.26
Agua Caliente 2.10 1.98 2.27
Contenido de humedad en harina libre de extraíbles
15.64 10.56 15.77
Lignina 25.28 24.05 24.41
ND= no detectado
El contenido de cenizas representa un aproximado medible de minerales contenidos en la madera, estos componentes inorgánicos de cenizas varían de 0.8% a 9.7% con un mayor contenido en la región nodal que en el internodo. Estos consisten en sílice, cobre, zinc, hierro, potasio, calcio, magnesio, manganeso (Tamolang y col. 1980). El contenido de cenizas se mantiene en rangos bajos por realizarse el análisis de la sección internodal. Se realizó el análisis de cenizas mediante microscopio electrónico de barrido encontrando niveles predominantes en potasio, sílice, magnesio, calcio y fosforo reportados en la tabla 1.
La prueba de solubilidad en sosa al 1.0% se aplica para determinar parámetros del grado de deterioro fúngico o degradación por calor, luz u oxidación. La especie 2 reporta 26.33% siendo la de mayor sensibilidad el deterioro comparada a las otras dos especies. Chao y col. (1971) reporta 22.77 % para la misma especie.
La extracción sucesiva de extraíbles permite determinar un porcentaje de material soluble no considerado como parte de la substancia madera, y son principalmente ceras, grasas, resinas, aceites, así como taninos, gomas, materia colorante, azucares y almidones. La especie 2 presenta un mayor porcentaje de material extraíble en su fase polar con metanol (6.6 de índice de polaridad). Lo anterior puede indicar la presencia de compuestos tipo flavonoide (familia de los polifenoles) que son compuestos vegetales no nitrogenados, muchas veces estos compuestos son la respuesta adaptativa de las plantas para protegerse de los nocivos efectos de la radiación ultravioleta (Hernández, 2008).
Los rangos reportados por Tamolang (1980) para porcentajes de contenido de lignina en bambú se encuentra en 20 a 25%, manteniéndose las especies 2 y 3 dentro de este rango.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Los resultados obtenidos de este estudio buscan mostrar datos básicos de la química del bambú procedente de Huatusco Veracruz y forman parte de una investigación más robusta que considera características anatómicas, físicas y mecánicas de las especies Bambusa vulgaris var. vittata, Bambusa oldhamii Munro y Guadua agustifolia Kunth para obtener, en su análisis y relaciones, datos relevantes que permitan establecer parámetros de aprovechamiento tecnológico.
745
La integración de una red de investigación para el bambú es necesaria en nuestro país para así establecer criterios, procedimientos experimentales y bancos de información accesible que faciliten desarrollar el potencial tan amplio de este recurso.
BIBLIOGRAFÍA
ASTM (American Society for Testing and Materials). 2000. Standard test metods for evaluating propieties of wood-base fiber and particle panels meterials. D 1037-99. Mannual book of ASTM standars. Sección 4: construction. Volumen 04.10: Wood . Conshohocken, pp. 145 -156
Chao, S.C., Y.C. Ku, S.J.Lin and T.T. Pan. Measurements of fiber dimensions and analysis of chemical composition on Taiwan hardwoods. Bulletin of Taiwan For. Res. Inst., no. 14, June 1971, 26pp.
Hernández, A. 2008. Propuesta para el desarrollo de un Nuevo aprovechamiento industrial de la Guadua angustifolia Kunth mediante la utilización de sus extractos vegetales. Universidad Technological de Pereira. Colombia.
SAGARPA. 2001. El bambú estudio del mercado mundial. Dirección General de Desarrollo de Mercados pp. 5-20,
ISO 22157-1:2004 . Bamboo -- Determination of physical and mechanical properties -Parte 1: Requirements. Parte 2: Laboratory manual. International Organization for standardization. [Internet] Ginebra, Suiza. Disponible en:
<http://www.iso.org/iso/iso_catalogue/catalogue_tc/catalogue_detail.htm?csnumber=36150> [Consulta: Agosto 3, 2009]
Lobovikov, M; Paudel S; Piazza M; Ren H; Wu J. 2007. Word bamboo resourses. A thematic study prepared in the framework of the Global Forest Resources Assessment 2005. Non-wood forest products. FAO-INBAR. Roma.
Soriano, F.P. 2008. Utilización sostenible del bambú en Tailandia. Actualidad forestal tropical. Organización Internacional de maderas tropicales. OIMT. 16(2):15-17.
Tamolang, F.; Lopez, F.; Semana, J.;Casin, R.; Espiloy,Z. 1980. In Lesserd, G.;Chouinard, A. ed., Bamboo research in Asia. Procedings of workshop held in Singapore, 28-30 May 1980. International Development Research Center. Ottawa, Canadá. Pp 189-200.
Sharma, Y.M.L. 1980. Bamboo in Asia Pasific region. Bamboo research in Asia: Procedings of a workshop held in Singapore. Ottawa, Ont. Canadá. p: 99-120.