puerarin逆转 k562/ao2耐药的分子机制xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/pdf/200803216.pdf ·...
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中南大学学报(医学版)
JCentSouthUniv(MedSci) 2008,33(3)
收稿日期(Dateofreception) 20070914
作者简介(Biography) 陈进伟(1954),女,湖南长沙人,教授,主要从事血液病和风湿免疫性疾病的研究。
通讯作者(Correspondingauthor) 陈进伟,Email:jinwei73104@yahoo.com.cn
基金项目(Foundationitem) 湖南省科学技术厅科技计划资助项目(05SSY3069) ThisworkwassupportedbytheDepartmentofScience
andTechnologyofHunanProvinceofP.R.China(05SSY3069).
Puerarin逆转 K562/AO2耐药的分子机制
陈进伟,陶师,骆蓉,张广森,徐运孝
(中南大学湘雅二医院血液科,长沙 410007)
[摘要] 目的:研究黄酮类化合物 puerarin对 K562/AO2(人红白血病多药耐药细胞系)细胞耐药
逆转作用的分子机制。方法:免疫荧光染色方法检测阿霉素(ADR)和 puerarin对 K562(人红白血病细
胞系)和 K562/AO2两种细胞 NFκB活性的影响;免疫细胞化学染色方法检测 ADR和 puerarin对 K562
和 K562/AO2的 survivin表达的影响;流式细胞仪检测 ADR和 puerarin对 K562和 K562/AO2的 pgp表
达的影响。结果:经 ADR处理后的 K562细胞和 K562/AO2细胞 NFκB的活性明显高于 K562细胞空
白对照组;经 puerarin预处理后再加 ADR处理的 K562细胞中的 NFκB的活性明显低于只用 ADR处理
的 K562细胞。经 puerarin干预后的 K562/AO2细胞的 NFκB的活性明显低于未经 puerarin干预的
K562/AO2细胞;经 ADR处理后的 K562细胞和 K562/AO2细胞的 pgp,survivin表达明显高于 K562细
胞空白对照组;经 puerarin预处理后再加 ADR处理的 K562细胞中的 pgp,survivin表达明显低于未经 pu
erarin预处理的 K562细胞;经 puerarin干预后的 K562/AO2细胞的 pgp,survivin表达明显低于未经 puer
arin干预的 K562/AO2细胞。pgp和 survivin表达呈正相关。结论:NFκB的活化使 pgp和 survivin表
达增多可能是 K562细胞多药耐药形成的机制之一。Puerarin能预防和阻止 K562细胞耐药形成,并能
逆转 K562/AO2对 ADR的耐药,其机制与抑制 NFκB活性及 survivin和 pgp的表达有关。
[关键词] puerarin; K562/AO2; 多药耐药; 逆转; 分子机制
[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 16727347(2008)03021606
MolecularmechanismofreversingmultidrugresistanceofK562/AO2bypuerarin
CHENJinwei,TAOShi,LUORong,ZHANGGuangsen,XUYunxiao
(DepartmentofHematology,SecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410007,China)
Abstract: Objective TodeterminethemolecularmechanismofreversingmultidrugresistanceofK562/AO2bypuerarin.Methods EffectsofADRandpuerarinonNFκBactivityofK562,K562/AO2weretestedbyimmunoflurescence.TheexpressionofsurvivinofK562,K562/AO2wasexaminedbyimmunocytochemistry.Thepgpexpressionwasdetectedbyflowcytometry.Results TheNFκBactivityofK562wassignificantlyhigherthanthatofK562/AO2.TheNFκBactivityofK562treatedbyADRwassignificantlyhigherthanuntreated.TheNFκBactivityofK562whichwaspretreatedbypuerarinandthentreatedbyADRwasmuchlowerthanthattreatedbyADRalone.TheNFκBactivityofK562/AO2intervenedbypuerarinwaslowerthanthatunintervenedbypuerarin.ThepgpandsurvivinexpressionofK562/AO2wassignificantlyhigherthanK562.ThepgpandsurvivinexpressionofK562treatedbyADRwashigherthanthatuntreatedby
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Puerarin逆转K562/AO2耐药的分子机制 陈进伟,等
ADR.ButthepgpandsurvivinexpressionofK562whichwaspretreatedbypuerarinandthentreatedbyADRwasmuchlowerthanthatnotpretreatedbypuerarin.ThepgpandsurvivinexpressionofK562/AO2intervenedbypuerarinwaslowerthanthatunintervenedbypuerarin.Theexpressionwasnegativelycorrelatedtothedurationofintervention.Theinhibitioneffectdemonstratedtimedependence.Conclusion TheactivationofNFκBcanincreasetheexpressionofpgpandsurvivin,whichmaybepartofthemolecularmechanismofmultidrugresistanceofK562.PuerarincanpreventandstopthemultidrugresistanceinK562andreversethemultidrugresistanceofK562/AO2toADRbyinhibitingtheactivityofNFκBandtheexpressionofpgpandsurvivin.
Keywords: puerarin; K562/AO2; multidrugresistance; reversal; molecularmechanism
[JCentSouthUniv(MedSci),2008,33(3):021606]
白血病细胞多药耐药(multidrugresistance,
MDR)的发生严重制约着白血病的治疗。近年来
有研究发现黄酮类化合物除具有很好的心血管
疾病的治疗作用外,还具有抗肿瘤 [12]和逆转白
血病细胞株的多药耐药的作用[3]。但其作用机制
尚不十分清楚,本研究探讨了黄酮类化合物 puer
arin(普乐 林)对 人 红 白 血 病 多 药 耐 药 细 胞 系
K562/AO2耐药逆转的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂及主要仪器 Puerarin购于美
国 AlexisBiochemicals公司。人红白血病细胞株
K562由湘雅二医院血液病研究室提供。K562/
AO2耐药细胞株为阿霉素(ADR)诱导 K562/S
建立的 MDR细胞株,由中国协和医科大学血液病
研究所提供。小牛血清、RPMI1640培养液为 Hy
clon公司产品。ADR购自意大利法玛西亚普强公
司。鼠抗人 pgp单抗(JSB1)为 AlexisBiochemi
cals公司产品。FITC羊抗鼠 IgG为 ZymedLabora
tories公司产品。NFκB单抗(鼠抗人)和 survivin
单抗(鼠抗人)为美国 SantaCruz公司产品。其他
试剂为国产分析纯,流式细胞仪为美国 BD公司
产品(FACSCalibur)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 白血病亲本细胞株 K562
用含 10%小牛血清的 RPMI1640培养液在37℃,
5% CO2 条件下培养。耐药细胞株 K562/ADR
(对阿霉素耐药的人红白血病细胞株)在含 ADR
1mg/L,10%小牛血清的 RPMI1640培养液中稳
定生长,试验前两周换用无 ADR的 RPMI1640培
养液 培 养。取 K562和 K562/ADR 细 胞 用 含
10%灭活的新生牛血清的 RPMI1640培养基制成
单细胞悬液接种入 6孔培养板中,每孔 2mL,含
细胞8×104个,隔天小心吸去上清进行换液。每
天收取 1孔细胞,适当稀释,制备细胞悬液,9份
细胞悬液加 1份 0.4%台盼蓝染液,混匀,镜下计
数拒染的细胞数(活细胞数),从而算出相应的每
孔活细胞数量,以上记数操作重复 4次,取平均
值。绘制细胞生长曲线。
1.2.2 试验分组 A组:K562细胞常规培
养,不用任何干预;B组:K562细胞用 1mg/L的
ADR处 理 24h;C组:K562细 胞 用 puerarin
25μmol/L干预 24h后,1mg/L的 ADR处理72h;
D组:K562/AO2细胞常规培养,不用任何干预;
E组:K562/AO2细胞用 25μmol/L的 puerarin处
理 24h。
1.2.3 免疫荧光检测细胞株 NFκB的活化
按实验分组分别加入相应浓度药物,置 37℃,
5% CO2及饱和湿度培养箱中培养,于 24h后收
集细胞。取密度为 1×106/mL细胞悬液 10μL
制作细胞涂片,80%丙酮固定 30min,0.2%Tri
tonX100特化处理 15min,山羊血清工作液孵育
30min后弃孵育液,加1∶100稀释的一抗(NFκB
单抗),4℃过夜,再加 FITC羊抗鼠 IgG(1∶100)
孵育 30min,甘油封片。荧光显微镜下观察细胞
的免疫组织化学染色情况。
1.2.4 免疫组织细胞化学染色检测细胞株中
survivin的表达 按实验分组分别加入相应浓
度药物,置 37℃,5% CO2及饱和湿度培养箱中
培养,取 10μL细胞悬液作细胞涂片,干燥后浸
入 4%多聚甲醛溶液中固定 30min,加入 3%
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H2O2于玻片上,反应 2min,再加山羊血清孵育20min后弃孵育液,加一抗(survivin抗体)4℃过夜。再加相应的二抗,25min后加入的辣根酶标记链霉卵白素工作液 37℃孵育 25min,DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片,光学显微镜下观
察。细胞染成棕黄色为 survivin阳性。用彩色病理图文分析系统测定细胞株 survivin表达的灰度值,survivin表 达 越 强,细 胞 染 色 越 深,灰 度 值越小。
1.2.5 流式细胞仪检测细胞株 pgp表达 按实验分组分别加入相应浓度药物,置37℃,5%CO2及饱和湿度培养箱中培养,收集2×10
6个细
胞,用 1mL70%乙醇 4℃固定细胞60min,用1mL含 0.1%TritonX100和 5%血清的 PBS重悬细胞,样 本 组 加 入 饱 和 剂 量 pgp抗 体 JSB1(1∶20),阴 性 对 照 组 加 入 鼠 IgG1,4℃冰 箱
过 夜(14~16h),加入荧光(FITC)标记的二抗(1∶50),再加入 PBS1mL重悬细胞,用尼龙膜过滤,流式细胞仪检测荧光值,每个样品分析
10000个细胞。1.3 统计学处理 数据采用 SPSS13.0forwindows软件包进行处理,P<0.01认为差异有统计学意义。K562组,K562/AO2组及其各药物
干预组间的 pgp表达,survivin表达 A值比较采用两样本 t检验(independentsamplesttest)和完全随机设计资料的方差分 析 (onewayANOVA)。Survivin表达 A值,survivin与 pgp表达关系的研究采用直线相关分析(linercorrelation)。
2 结 果
2.1 细胞株 NFκB的活化 免疫荧光法检测细胞株 NFκB的活化结果。荧光显微镜下显示:A组的 K562细胞荧光强度弱,说明未经任何干预的 K562细胞 NFκB活化少,且主要在胞浆中表达,细胞核内表达很少(图 1A);B组经 ADR处理后的 K562细胞核内荧光强度明显增强,可见 NFκB已被活化而核内移(图 1B);经 puerarin干预后再用 ADR处理的 K562细胞(C组)细胞核内荧光强度比 K562细胞(A组)稍强,但明显弱于单独用 ADR处理组 (B组)(图 1A,1B,1C);K562/AO2细胞(D组)细胞核内荧光染色强阳性(图 1D);经 puerarin干预的 K562/AO2细胞(E组)细胞核内荧光强度较 K562/AO2细胞(D组)明显减弱(图 1D,1E)
图1 各组细胞NFκB免疫荧光强度与分布。A:K562细胞组;B:K562细胞用ADR处理24h组;C:K562细胞用 puerarin
干预24h后,ADR处理72h组;D:K562/AO2细胞组;E:K562/AO2细胞用puerarin处理24h组。
Fig.1StrengthanddistributionofimmunofluorescenceinNFκBofthe5groups.A:K562cells;B:K562cellstreatedbyADR24
h;C:K562cellstreatedbypuerarin24h,ADR72h;D:K562/AO2cells;E:K562/AO2cellstreatedbypuerarin24h.
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2.2 细胞株中 survivin的表达 在光学显微镜下观察各实验组细胞的 survivin的表达结果显示:K562细胞空白对照组(A组)细胞浆不着色(图 2A);经 ADR处理的 K562细胞(B组)着色和 K562/AO2细胞(D组)比较明显,survivin表达很强(图 2B,2D);经 puerarin干预后再用 ADR处理的 K562细胞(C组)着色明显较未经 puerarin干预单独用 ADR处理的 K562细胞(B组)浅(图 2B,2C)。经 puerarin干预 24h的 K562/AO2细 胞 (E组)着 色 较 未 经 puerarin干 预 的K562/AO2细胞(D组)浅(图 2D,2E)。各组均
随机选取多个细胞视野用彩色病理图文报告分
析系统进行 survivin表达的平均灰度(A)值定量分析,结果显示:经 ADR处理后的 K562细胞(B组)和 K562/AO2细 胞 (D组)survivin表 达 较K562细胞(A组)显著增强;经 puerarin干预后再用 ADR处理的 A562细胞(C组)的 survivin表达较只用 ADR处理的 A562细胞(B组)明显降低。经 puerarin干预后的 K562/AO2细胞(E组)的survivin表达较未经 puerarin干预的 K562/AO2细胞(D组)明显降低(表 1)。灰度值越高,survivin的表达越低。
图2 免疫组织化学染色检测各组细胞survivin表达。A:K562细胞组;B:K562细胞用ADR处理24h组;C:K562细胞用pu
erarin预处理24h后,ADR处理72h组;D:K562/AO2细胞组;E:K562/AO2细胞用puerarin处理24h组。
Fig.2Immunohistochemistrystainingshowingtheexpressionofsurvivinofthe5groups.A:K562cells;B:K562cellstreatedbyADR
24h;C:K562cellstreatedbypuerarin24h,ADR72h;D:K562/AO2cells;E:K562/AO2cellstreatedbypuerarin24h.
表1 ADR和 puerarin对各组细胞 survivin表达的影响
(x±s,n=5)
Tab.1 ExpressionofsurvivinintheK562,K562/AO2cell
linestreatedbyADRandpuerarin(x±s,n=5)
组别 细胞survivin表达的A值
A组(K562空白对照) 289.45±38.64
B组(K562+ADR) 152.88±15.11
C组(K562+PU+ADR) 228.64±34.23△△
D组(K562/AO2) 90.65±10.61
E组(K562/AO2+PU) 123.81±21.82##
与A组比较, P<0.01;与 B组比较,△△P<0.01;与 D
组比较,##P<0.01。PU表示puerarin
2.3 细胞株 pgp表达 流式细胞仪检测各实验组细胞 pgp表达,结果显示:K562/AO2空白对照组细胞(D组)和经 ADR处理的 K562细胞(B组)pgp表达明显高于 K562空白对照组细胞(A组);经 puerarin预处理后再用 ADR处理的 K562细胞(C组)pgp表达显著低于未经 puerarin预处 理 单 用 ADR处 理 的 K562细 胞 (B组);经 puerarin干预 24h后 K562/AO2细胞(E组)pgp表达低于未经 puerarin干预的 K562/AO2细胞(D组)pgp的表达(表2)。说明 puerarin能有效地抑制 ADR诱导 K562细胞的 pgp表达,同时也能使 K562/AO2细胞的 pgp表达下降。
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表2 各组pgp的表达(x±s,n=3)Tab.2 Expressionofpgpofthe5groups(x±s,n=3)
组别 细胞pgp阳性率(%)
A组 (K562空白对照) 3.73±0.51
B组 (K562+ADR) 87.44±4.86
C组 (K562+PU+ADR) 34.25±1.87△△
D组 (K562/AO2空白对照) 94.50±5.90
E组(K562/AO2+PU) 80.16±4.09##
与A组比较,P<0.01;与B组比较,△△P<0.01;与 D组
比较,##P<0.01。PU表示puerarin
2.4 各组细胞 survivin表达和 pgp表达的相关
性分析 对每组 survivin表达灰度值及 pgp表
达阳性率进行相关性分析,结果显示 pgp表达
高低与 survivin表达灰度值负相关(r=-0.949,
P<0.01),即 pgp表 达 与 survivin表 达 呈 正相关。
3 讨 论
临床上白血病化疗时剂量不足或化疗不能耐
受须反复用药,常引起白血病细胞耐药。如同在
实验室中用 ADR诱导 K562成 K562/AO2一样,
化疗药物在诱导细胞凋亡的同时也诱导耐药细
胞的形成。本实验用 ADR刺激 K562细胞 24h
后,NFκB明显活化并核内移。受 NFκB调控的
下游基因 pgp和 survivin在 ADR处理的 K562,
K562/AO2细胞中表达都明显增强。K562/AO2
的 NFκB更是高度活化,pgp和 survivin的表达
更为明显。实验结果与目前药物所致细胞耐药
和凋亡受阻的研究[45]完 全相符。有学者认为
ADR也是通过 caspase信号瀑布诱导细胞凋亡的,
在其活化 caspase家族的同时也可激活依赖 PI3K
的 PKB/Akt细胞存活通路而使 NFκB活化,下游抗凋亡基因的表达增强,这是 NFκB活化的主要
途径。次要途径是在 P38/MAPK信号通路激活
后使 p65磷酸化和从前体蛋白 p105形成 p50,
p50/p65异源聚体活化并进入核中发挥转录活性[6]。P38/MAPK信号通路恰恰也是 ADR诱导
细胞凋亡的一个主要通路。长期一定浓度的
ADR杀伤白血病细胞(K562)的同时也活化 NF
κB,上调下游耐药、抗凋亡基因 (pgp,survivin
等)的表达,是 K562/AO2耐药形成的机制之一。且 ADR作用的时间越长,NFκB的活化越完
全,下游抗凋亡和耐药基因更加高度表达,是白
血病化疗过程中形成白血病细胞高度耐药的一
个重要原因。
Puerarin是从传统中药葛根的根茎中提取的纯的黄酮类化合物,其主要成分为异黄酮[7]。研
究发 现 Flavopiridol等 黄 酮 类 化 合 物 可 以 促 进
TNF、阿霉素、足叶乙甙等一些因素对肿瘤细胞的毒性作用[6]。Takada等[8]研究发现,TNF可诱导
HL60细胞的 NFκB活化,并向核内转移,多种
蛋白表达增加,如 Bcl2,Mcl1,CyclinD1,VEGF,
COX2,MMP9,IAPs等。而经 Flavopiridol预处理
后,NFκB活化受到明显的影响,核内转移的
NFκB减少,其下游基因的表达也明显受到抑
制。笔者先前的研究显示 puerarin能增加 K562
和 K562/AO2细胞对 ADR的敏感性(增敏 1.42
倍),并能逆转 K562/AO2细胞的耐药(逆转倍
数为 9.43)。为研究其分子机制,本研究用 puer
arin分别干预 ADR处理的 K562细胞和 K562/
AO2,结果与 Takada等[8]和 Khoshnan等[9]的研究
结果一致。Puerarin对耐药细胞株 K562/AO2的
NFκB活化以及 pgp和 survivin的表达有明显的
抑制作用,且有高度的相关性。说明 Flavopiridol
是通过抑制 NFκB的活性,下调 pgp和 survivin
基因表达,从而逆转白血病细胞的耐药。用 puer
arin预先干预,再用 ADR刺激 K562细胞株后,其
NFκB活化及核内移较预先未加 puerarin干预的
K562细胞明显受到抑制,pgp和 survivin的表达
也明 显 减 少,但仍 高于没 有用 阿霉 素刺激的
K562细胞。推测 puerarin逆转耐药是通过抑制
NFκB活化的主要途径即 PI3K/AKT存活通路,
而不能抑制 P38/MAPK信号通 路这 一次 要途
径[8]。由此提示如果先用黄 酮 类 化 合 物阻止
PI3K/AKT这条主要存活通路,再用 ADR进行诱
导凋亡时,ADR就不能通过活化 NFκB产生抗凋
亡作用,从而预防和阻止白血病细胞耐药形成,
增强 ADR对肿瘤的杀伤作用。
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(本文编辑 郭征)
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